JPH0870859A - 動物細胞培養用の無血清培地、および生理活性ペプチドまたは蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】工業的物質生産に使用可能な動物細胞培養用の
無血清培地およびそれを用いる製造法を確立する。 【構成】無機鉄化合物または低分子量の有機鉄化合物、
シクロデキストリンおよび非イオン性界面活性剤を含有
してなる動物細胞培養用の無血清培地、およびそれを用
いる生理活性ペプチドまたは蛋白質の製造法、ならび
に、ｔ−ｇＤ−ＩＬ−２産生能を有する新規マウスミエ
ローマ細胞。 【効果】本発明の動物細胞培養用の無血清培地は、安価
で、成分組成が明らかであり、ロット間の差がなく均一
であるため、動物細胞培養による生理活性ペプチドまた
は蛋白質の工業的生産に極めて有利に使用できる。特
に、天然には微量にしか存在しないため大量取得が困難
な生理活性ペプチドまたは蛋白質の製造に広く応用する
ことができ、これらの大量供給が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞を大量培養す
るための無血清培地、これを用いた生理活性ペプチドま
たは蛋白質の製造法、および、その産生細胞株に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞、とりわけ遺伝子組換え動物細
胞の大量培養は、例えばインターフェロン、エリスロポ
イエチン、ティシュープラスミノーゲンアクティベータ
ー、顆粒球コロニー刺激因子、神経成長因子などの生理
活性ペプチドまたは蛋白質、さらに各種ウイルスに対す
るワクチン用の抗原、イムノグロブリン可変領域(Idiot
ype)−顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ
−ＣＳＦ)融合蛋白質(Idiotype／ＧＭ−ＣＳＦ）（M. T
ao およびR. Levy、ネイチャー(Nature)、第３６２巻、
第７５５頁(１９９３)）、t−gＤ−ＩＬ−２融合蛋白質
（S. Hinumaら、フェブスレターズ(FEBS Letters)、第
２８８巻、第１３８頁(１９９１)）などの生理活性ペプ
チドまたは蛋白質の製造にとって極めて重要な技術であ
る。生理活性ペプチドまたは蛋白質を生産するための宿
主細胞としては、ヒトバーキットリンパ腫（Namalwa)細
胞やマウス骨髄腫細胞（マウスミエローマＳp２／Ｏ−
Ａｇ１４、マウスミエローマＸ６３Ａｇ８−６５３)な
どの浮遊性細胞とチャイニーズハムスター卵巣由来のＣ
ＨＯ細胞、ベイビーハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞、
ヒト子宮頸部癌由来のHeLa細胞、マウス乳癌由来のＣ−
１２７細胞、マウス線維芽細胞(ＮＩＨ／３Ｔ３）など
の接着性細胞の両方が用いられ、とりわけ従来からＣＨ
Ｏ細胞が汎用されている。ＣＨＯ細胞などの接着性細胞
に対しては通常ローラーボトル培養やマイクロキャリア
ー培養、さらにホローファイバー、セラミックマトリッ
クスあるいはガラス布などの固定化床に細胞を付着させ
て培養する固定化培養法が採られている。しかし、工業
的に有用物質を大量生産するためには、操作面やスケー
ルアップの点から接着培養より浮遊培養の方が有利であ
る。そこで、ＣＨＯ細胞を浮遊培養できるように馴化さ
せる方法（M. Murataら、ジャーナル オブ ファーメ
ンテーション テクノロジー(J. Ferment. Techno
l.）、第６６巻、第５０１頁(１９８８)）や本来浮遊性
であるNamalwa 細胞を用いる方法（H. Yanagiら、ジャ
ーナル オブ ファーメンテーション アンド バイオ
エンジニアリング(J. Ferment. Bioeng.）、第６８巻、
第２５７頁(１９８９)； M. Okamoto ら、バイオテクノ
ロジー(Bio／Technology）、June、第５５０頁(１９９
０)）； S. Hosoiら、サイトテクノロジー(Cytotechnol
ogy）、第７巻、第２５頁(１９９１)）が、近年、注目
されている。宿主細胞としてミエローマ細胞を用いる発
現系も知られているが（特開昭６３−４４８９７；特開
昭６３−１２６４８３)、この細胞を用いて実際に生理
活性ペプチドまたは蛋白質を大量に効率よく生産した例
は比較的少ない〔D. Broadら、サイトテクノロジー(Cyt
otechnology）、第５巻、第４７頁(１９９１)〕。

【０００３】一般に動物細胞はその増殖時に血清が必要
とされており、血清を含まない培地（以下、無血清培地
と称することもある）中では全く増殖できないか、増殖
が不十分なことが多い。しかし、血清は高価である上に
ロット間の品質差が大きく、また成分の不明な蛋白質性
の物質を多く含むために、生産された目的の生理活性ペ
プチドまたは蛋白質の精製を妨害する。特に医薬品の場
合、血清を含んだ培地（以下、血清培地と称することも
ある）を用いると、血清由来の不純物の除去に関する煩
雑な試験が安全性評価のために必要となる。従って、動
物細胞を使用して工業的に物質生産を行う場合には、血
清培地には問題点が多く、実用的な無血清培地の開発が
望まれている。これまでに、血液凝固第VIII因子産生Ｃ
ＨＯ細胞用の無血清培地として、特開平４−３１６４８
４にＡＳＦ−１０４培地にプルロニックＦ68およびジメ
チル−α−シクロデキストリンを添加した培地が開示さ
れているが、この培地を使用する場合は「まず、10％血
清を含んだ培地で対象となる細胞を8〜24時間培養し、
（第３頁右欄第２行〜３行）」と記載されているとお
り、１０％血清含有培地で細胞を前培養する必要があ
り、完全に無血清条件下での培養とはならない。また、
カルチャーディッシュ上の小スケールのしかも静置培養
での例が記載されているのみで、工業的物質生産には程
遠い培養法である。一方、マウスハイブリドーマ培養用
の無血清培地として、特開平４−５１８９１、特開平３
−１８０１７５には、ＩＴＥＳ（インスリン、トランス
フェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム）
中のトランスフェリンの代わりに無機鉄化合物を加えた
培地が開示されているが、これらの場合においても、テ
ィシュカルチャーフラスコでの小スケールの静置培養で
の例が記載されているに過ぎず、また、これらの培地が
遺伝子組換え用の宿主として汎用されるＣＨＯ細胞の培
養に適用できるか否かは不明である。以上のように、動
物細胞による生理活性ペプチドまたは蛋白質の工業的生
産に有用な、安価でかつ生産性の高い工業用無血清培地
は未だ提供されていないのが実情である。

【０００４】ところで、動物細胞の培養によって有用物
質を効率よく生産するためには、一般に細胞を高密度で
長期間、連続的に培養する方法が有利であると言われて
いる。実際、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマや
遺伝子導入マウスミエローマなどの浮遊性細胞の培養に
は、新鮮培地を培養槽内に供給し、老廃物を含んだ培養
上清液を培養槽外にハーベストして長期間、連続的に培
養する高密度浮遊灌流培養法が試みられている（K. Kit
anoら、アプライド マイクロバイオロジーアンド バ
イオテクノロジー(Appl. Microbiolo. Biotech.）、第
２４巻、第２８２ 頁(１９８６)； Y. Takazawa および
M. Tokashiki、サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y）、第２巻、第９５頁(１９８９)）。他方、バッチ培
養法は、培養の再現性に優れており、製品の恒常性を確
保するのに工業生産上有利な培養法と言える。また、バ
ッチ培養では、灌流培養に比べて培養槽以外の付帯設備
も少なくて済むので培養プロセスを簡略化でき、スケー
ルアップも容易であるなどの利点がある。このようなバ
ッチ培養の利点を生かし、かつ生産性を高める手段とし
て培地成分をフィードして培養するフェッドバッチ培養
法も試みられている（ミエローマ細胞を無血清培地で培
養 M. Rhodes およびJ. Birch、バイオテクノロジー（B
io／Technology）、第６巻、第５１８頁(１９８８)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、動物細
胞を無血清培地を使用し大量培養による効率的な生理活
性ペプチドまたは蛋白質製造法の開発が望まれている
が、このような製造法は未だ充分に確立されていない。
例えば、ヒトＮＴ−３生産のためには、ヒトＮＴ−３遺
伝子導入ＣＨＯ細胞を用いる方法が特開平５−１０３６
７５に開示されているが、該方法においては５％ウシ胎
児血清を含む培地で培養した後、培養途中で市販の無血
清培地に交換する方法が採られている。また、ガン細胞
由来イムノグロブリン分子の可変領域（Idiotype）と顆
粒球・マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)
との融合蛋白質(Idiotype／ＧＭ−ＣＳＦ）を動物細胞
で発現させ、それをＢ細胞リンパ腫に対するワクチンと
して利用しようとする研究（M.Tao および R. Levy、ネ
イチャー(Nature)、第３６２巻、第７５５頁(１９９
３)）においては、製造基材としての動物細胞種Ｐ３Ｘ
６３Ａg８.６５３ Plasmacytoma cell line が明らかに
されている程度で、工業上有利な製造法に関する言及ま
ではなされていない。また、抗単純ヘルペスウイルス剤
として開発が期待されているt−gＤ−ＩＬ−２融合蛋白
質に関しては、目的の遺伝子を導入したＣＨＯ−ＨＤＬ
−１−５細胞あるいはマウスミエローマＳp−neo−ＨＤ
Ｌ−２４５細胞を用いる方法が特開平４−１１７３９９
に開示されているが、単に「無血清培地ＡＳＦ１０４培
地（味の素社製）で培養し」と記載されているのみで、
具体的な培養方法に関しては一切言及されておらず、発
現を確認するだけの目的で実験室レベルでの培養を行っ
たに過ぎず、工業的生産には程遠いものである。有用な
生理活性ペプチドまたは蛋白質を工業的に大量生産する
ためには、まず、工業的物質生産に満足して使用できる
無血清培地の開発が重要な課題である。そのために、求
められる無血清培地の条件としては、(１)安価であるこ
と、(２)成分組成が明らかであり、ロット間の差がなく
均一であること、さらには（３）静置培養のみならず長
時間の撹拌培養や灌流培養に使用できることなどが挙げ
られる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物細
胞、例えば抗ヘルペスウイルス剤であるt−gＤ−ＩＬ−
２融合蛋白質を生産する遺伝子組換えマウスミエローマ
細胞やＮＴ−３産生ＣＨＯ細胞を用いて、目的とする生
理活性ペプチドまたは蛋白質を大量生産する方法につい
て検討を行い、その結果、安価で、成分組成が明らかで
ありロット間の差がなく均一である工業用無血清培地の
開発に成功し、さらに検討して本発明を完成するに到っ
た。すなわち、本発明は、（１）無機または有機鉄化合
物、シクロデキストリンおよび非イオン性界面活性剤を
基礎培地に含有せしめてなる動物細胞培養用の無血清培
地、（２）インスリン、エタノールアミンまたはその誘
導体、および亜セレン酸またはその塩をさらに含有して
なる上記１記載の培地、（３）無機または有機鉄化合物
が、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸第一鉄、硝酸鉄、ク
エン酸鉄、シュウ酸鉄または乳酸鉄のいずれか１種また
は２種以上の組み合わせである上記１または２記載の培
地、（４）非イオン性界面活性剤が、プルロニック系界
面活性剤である上記１または２記載の培地、（５）デキ
サメサゾン、蛋白質加水分解物およびアミノ酸類のうち
少なくとも１種類を補添してなる上記１または２記載の
培地、（６）蛋白質加水分解物が、ポリペプトン、ラク
トアルブミン加水分解物、バクトトリプトンおよびカザ
ミノ酸のいずれか１種または２種以上の組み合わせであ
る上記５記載の培地、（７）塩化第二鉄、α−シクロデ
キストリン、プルロニック系界面活性剤、インスリン、
エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウムおよびポリペ
プトンを含有してなる上記１または２記載の培地、
（８）動物細胞が、マウスミエローマ細胞またはチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞である上記１または２記載の
培地、（９）上記１、２、３、４、５、６または７記載
の培地を用いて動物細胞を培養し、生理活性ペプチドま
たは蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする該生理活性ペプチドまたは蛋白質の製造法、
（１０）動物細胞が、マウスミエローマ細胞またはチャ
イニーズハムスター卵巣細胞である上記９記載の製造
法、（１１）培養が浮遊撹拌培養である上記９記載の製
造法、（１２）生理活性ペプチドまたは蛋白質が、ホル
モン、鎮痛物質、増殖因子、サイトカイン、酵素、神経
伝達因子、レセプター、抗体またはワクチン用の抗原で
ある上記９記載の製造法、（１３）増殖因子が、神経成
長因子（ＮＧＦ）ファミリーに属するものである上記１
２記載の製造法、（１４）生理活性ペプチドまたは蛋白
質が、ホルモン、鎮痛物質、増殖因子、サイトカイン、
酵素、神経伝達因子、レセプター、抗体またはワクチン
用の抗原から選択された同種または異種間の融合蛋白質
である上記９記載の製造法。（１５）融合蛋白質が、単
純ヘルペスウイルスの外被糖蛋白とインターロイキン−
２からなる融合蛋白質である上記１４記載の製造法、
（１６）t−gＤ−ＩＬ−２産生能を有するマウスミエロ
ーマ細胞Ｓp２／０−２２−３２−３４株、に関するも
のである。

【０００７】本発明における動物細胞培養用の無血清培
地は、無機鉄化合物または低分子量の有機鉄化合物、シ
クロデキストリンおよび非イオン性界面活性剤を含有す
ることを特徴とするものである。即ち、該無血清培地
は、各種基礎培地に上記の各成分を添加してなり、化学
的に含有成分が明らかになっている物質によって構成さ
れている培地である。

【０００８】基礎培地としては、血清を添加することに
よって動物細胞の培養が可能となる公知の無血清培地を
使用することができ、例えば、イーグルＭＥＭ培地（H.
Eagle、サイエンス（Science）、第１３０巻、第４３２
頁（１９５９））、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）培地（R.DulbeccoおよびG.Freeman、バイロロジ
ー（Virology）、第８巻、第３９６頁（１９５９））、
イスコフ培地（N. Iscove アンド F. Melchers、 ジャ
ーナル エクスペリメンタル メソッズ（J. Exp. Me
d.）、第１４７巻、第９２３頁(１９７８)）、ハムＦ１
２培地（R. G. Ham、 プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Nat. A
cad. Sci.、）、第５３巻、第２８８頁(１９６５)）、
Ｌ−１５培地（A. Leibovitz、 アメリカン ジャーナ
ル オブ ハイジーン（Amer. J. Hyg.）、第７８巻、
第１７３頁(１９６３)）、ＲＰＭＩ １６４０培地（G.
E. Moore ら、ザ ジャーナル オブ ザ アメリカン
メディカル アソシエイション（J. A. M. A.）、第１
９９巻、第５１９頁(１９６７)）、Ｅ−ＲＤＦ培地（極
東製薬）、ＵＣ−１０２培地（日水製薬）、ＵＣ−２１
２培地（日水製薬）、ダイゴＴ培地（日本製薬、特開昭
６０−１４５０８８号）、ＴＬ−２培地（Y. Shintani
ら、アプライド マイクロバイオロジー アンド バイ
オテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.）、第
２７巻、第５３３頁(１９８８)）、およびこれらを適当
な比率で混合した培地が挙げられる。とりわけ、Ｅ−Ｒ
ＤＦ培地、ダイゴＴ培地、ＴＬ−２培地などがより好ま
しく用いられる。

【０００９】以下、本発明における無血清培地を特徴づ
ける成分について、詳細に述べる。なお、本文中に示す
各種成分の添加量は、最終の液体培地１L分の基礎培地
粉末に、添加する該成分の添加質量を表すものとする。
使用の際には、これらを水に溶解し１L とすることによ
り本発明の動物細胞培養用の無血清培地として調製す
る。無機鉄化合物としては、塩化第二鉄、塩化第一鉄、
硫酸第一鉄、硝酸鉄などが、また低分子量の有機鉄化合
物としては、非蛋白質性の低分子量の有機鉄化合物が好
ましく、例えば、クエン酸鉄、シュウ酸鉄、乳酸鉄など
が挙げられ、鉄供与体としての目的で、１種または２種
以上が用いられる。とりわけ、無機鉄化合物が好まし
く、中でも塩化第二鉄や硫酸第一鉄がより好ましく用い
られる。例えば、鉄イオンとして約１８〜３７０μmo
l、好ましくは約３５〜８０μmolを添加するとよい。具
体的には例えば、塩化第二鉄（６水加物）の場合、約５
〜１００mg好ましくは約１０〜２０mgを添加するとよ
い。

【００１０】シクロデキストリンとしては、α−シクロ
デキストリン、β−シクロデキストリンまたはγ−シク
ロデキストリンのいずれを用いてもよい。とりわけ、α
−シクロデキストリンがより好ましく用いられる。ま
た、該シクロデキストリンにメチル化等の化学修飾を施
した誘導体も、同様に用いられる。具体的には例えば、
α−シクロデキストリンの場合、約１〜５g好ましくは
約１.５〜３gを添加するとよく、またβ−シクロデキス
トリンの場合、約１００〜５００mg好ましくは約２００
〜３００mgを添加するとよい。非イオン性界面活性剤と
しては、細胞に毒性を示さないものならばいずれでもよ
く、ポリエーテル系非イオン性界面活性剤などが好まし
く挙げられる。例えば、プロピレンオキシド（propylen
e oxide）とエチレンオキシド（ethylene oxide）のコ
ポリマー（co-polymer）であるプルロニック系界面活性
剤、具体的には例えば、プルロニックＦ６８、Ｆ８８、
Ｆ７７、Ｐ６５（いずれも、旭電化工業株式会社製な
ど）などが挙げられ、とりわけ、プルロニックＦ６８が
より好ましく用いられる。これら非イオン性界面活性剤
は、動物細胞の細胞膜に作用し、その透過性を変化させ
ることにより細胞の受ける生成物阻害の影響を減じる等
の効果が考えられる。非イオン性界面活性剤は一般に、
約０.２５〜３g好ましくは約０.５〜２gを添加するとよ
い。

【００１１】本発明における動物細胞培養用の無血清培
地には、上記の成分以外に、インスリン、エタノールア
ミンまたはその誘導体、亜セレン酸またはその塩を添加
することも好ましい。インスリンとしては、天然のイン
スリン、または合成法や遺伝子組換え手法を用いて製造
したインスリンが挙げられ、また、インスリン作用を有
する物質、例えばインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−I）
なども包含する。具体的には例えば、インスリンの場
合、約０.５〜２０mg好ましくは約１〜５mgを添加する
とよい。ＩＧＦ−Iの場合、約０.０１〜０.１mg好まし
くは約０.０２〜０.０５mgを添加するとよい。エタノー
ルアミンまたはその誘導体としては、エタノールアミ
ン、エタノールアミン塩酸塩、ホスホエタノールアミン
などが挙げられる。例えば、エタノールアミンに換算し
て、約８〜８０μmol、好ましくは約１６〜３２μmolを
添加するとよい。具体的には例えば、エタノールアミン
を約０.５〜５mg、好ましくは約１〜２mgを添加すると
よい。亜セレン酸またはその塩としては、亜セレン酸、
亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン
酸バリウムなどが挙げられる。例えば、セレンイオンと
して約５X１０^-3〜６０X１０^-3μmol、好ましくは約１
５X１０^-3〜３０X１０^-3μmolを添加するとよい。具体
的には例えば、亜セレン酸ナトリウムの場合、約１〜１
０μg、好ましくは約３〜５μgを添加するとよい。

【００１２】本発明における動物細胞培養用の無血清培
地には、前記の成分以外に、さらにデキサメサゾン、蛋
白質加水分解物およびアミノ酸のうち少なくとも１種類
を補添しても良い。デキサメサゾンの場合、約０.５〜
４mg好ましくは約１〜２mgを添加するとよい。デキサメ
サゾンがより好ましいが、その代わりとしては、ヒドロ
コルチゾン、デキサメサゾン、トリヨードチロニン、プ
ロスタグランジンなどのホルモン類を添加することもで
きる。蛋白質加水分解物としては、ポリペプトン、ラク
トアルブミン加水分解物、バクトトリプトンおよびカザ
ミノ酸などが挙げられ、これらを１種または２種以上の
組み合わせで用いることができる。具体的には例えば、
ポリペプトン約０.２５〜３g好ましくは約０.５〜１.５
gを添加するとよい。

【００１３】アミノ酸類としては、天然蛋白質の構成ア
ミノ酸ならばいずれでもよく、通常それらを適当な割合
で添加して用いられる。具体的にはアルギニン、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グ
リシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジ
ン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ
ン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、
グルタミン酸、アラニンなどのアミノ酸類が挙げられ
る。使用する基礎培地により添加量は異なるが、その基
礎培地中のアミノ酸を補強する目的で、例えば、アルギ
ニン約１００〜８００mg好ましくは約４００mg、アスパ
ラギン約１５〜１５０mg好ましくは約１００mg、アスパ
ラギン酸約１０〜８０mg好ましくは約６０mg、システイ
ン約２０〜１５０mg好ましくは約９０mg、グルタミン約
１５０〜１０００mg好ましくは約６００mg、グリシン約
１０〜４０mg好ましくは約２０mg、ヒスチジン約２０〜
８０mg好ましくは約５０mg、イソロイシン約１０〜１７
０mg好ましくは約１２０mg、ロイシン約１５〜１７０mg
好ましくは約１１０mg、リジン約４０〜２００mg好まし
くは約１５０mg、メチオニン約５〜６０mg好ましくは約
３０mg、フェニルアラニン約５〜８０mg好ましくは約４
０mg、プロリン約２０〜８０mg好ましくは約４０mg、セ
リン約１０〜２００mg好ましくは約１００mg、スレオニ
ン約２０〜３００mg好ましくは約１００mg、トリプトフ
ァン約２〜４０mg好ましくは約２０mg、チロシン約５〜
１００mg好ましくは約３０mg、バリン約１０〜１５０mg
好ましくは約１００mgを添加するとよい。

【００１４】本発明における動物細胞培養用の無血清培
地には、前記の成分以外に、さらに糖類を添加すること
もできる。この場合の好ましい糖類としては、グルコー
ス、マンノース、フラクトース、キシロースなどの単糖
類、シュークロースなどの二糖類などが挙げられ、とり
わけ、グルコースやマンノースがより好ましく用いられ
る。これらの糖類は、初発培地に添加または／および培
養途中で添加してもよい。本発明における動物細胞培養
用の無血清培地は、上記に挙げた各成分を予め混合して
おき組成物として保存し、培養に用いる際、適宜に水に
溶解して用いることができ、また、培養毎に各成分を水
に溶解して用いてもよい。動物細胞が外来遺伝子を導入
し形質転換したものである場合、本発明における動物細
胞培養用の無血清培地には、前記の成分以外に、該形質
転換の際に使用した選択マーカーに応じて、選択薬剤で
あるメソトレキセート、ミコフェノール酸またはネオマ
イシン誘導体であるＧ４１８などの薬剤を添加しても良
い。

【００１５】本発明で用いられる動物細胞としては、浮
遊性細胞または接着性細胞のいずれも対象となり得る。
浮遊性細胞としては、例えばヒトバーキットリンパ腫
（Namalwa)細胞やマウスミエローマ細胞であるＳp２／
Ｏ−Ａｇ１４やＸ６３Ａｇ８−６５３などが挙げられ
る。接着性細胞としては、例えばチャイニーズハムスタ
ー卵巣由来のＣＨＯ細胞、ベイビーハムスター腎臓由来
のＢＨＫ細胞、ヒト子宮頸部癌由来のHeLa細胞、マウス
乳癌由来のＣ−１２７細胞、マウス線維芽細胞であるＮ
ＩＨ／３Ｔ３やBALB3T3、さらにアフリカミドリザル腎
臓由来のVerotsＳ３などが挙げられる。また、これら本
来接着性である細胞を特願平６−１０４２２１号などに
記載の公知の方法で浮遊馴化した細胞も挙げられる。中
でも、マウスミエローマ細胞や浮遊馴化したＣＨＯ細胞
がより好ましく用いられる。本発明製造法に用いる生理
活性ペプチドまたは蛋白質産生の動物細胞は、既に樹立
されている該性状の公知株を用いてもよい。また、必要
に応じて上記の生理活性ペプチドまたは蛋白質をコード
する遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により上記の動物
細胞に導入することによって得られる。目的の生理活性
ペプチドまたは蛋白質の高発現株を親株として用いるこ
とは当然有利である。本発明製造法に用いる生理活性ペ
プチドまたは蛋白質産生の動物細胞としては、浮遊撹拌
培養可能な細胞がとりわけ好ましく用いられる。

【００１６】本発明製造法に用いる生理活性ペプチドま
たは蛋白質産生の動物細胞は、ヒトゲノムライブラリー
あるいはヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングに
よって、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡ
からポリメラーゼ チェーンリアクション（ＰＣＲ）法
によってあるいは化学合成により得られた目的の生理活
性ペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子を取得し、
これに必要に応じ適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４
０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、サイトメガロウイルスのプロモーターなど）、プロ
モーター−プレープロあるいはプロモーター−シグナル
（例えばＩＬ−２遺伝子のシグナルなど）を接続し、こ
れを適当なベクターに挿入し、得られたベクターを用い
て上記の動物細胞を形質転換することにより得ることも
できる。このようにして得られた動物細胞株の例とし
て、具体的には例えば、t−gＤ−ＩＬ−２産生株とし
て、マウスミエローマ細胞Ｓp−neo−ＨＤＬ−２４５株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１０）、および、その高生産株
であるＳp２／０−２２−３２−３４株（ＩＦＯ−５０
４４２、ＮＩＢＨ Ｐ−１４４０１）などが、また、Ｎ
ＧＦファミリーに属する蛋白質産生株では、例えばＮＧ
Ｆ産生株としては後述の実施例で用いられているＮＧＦ
−２（ＮＴ−３）産生ＣＨＯ−Ｎ２−１株およびＣＨＯ
−Ｎ２−１ ＳＦ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２４）など
が挙げられる。

【００１７】本発明における生理活性ペプチドまたは蛋
白質の製造法は、上述のような動物細胞培養用の無血清
培地を用いることに特徴があり、目的とする生理活性ペ
プチドまたは蛋白質は、動物細胞によって生産され得る
ものであれば特に限定されない。本発明の製造法によっ
て有利に生産し得るものとしては、例えば、ホルモン、
鎮痛物質、増殖因子、サイトカイン、酵素、神経伝達因
子、レセプター、抗体、ワクチン用の抗原など、および
これらの活性型誘導体または融合蛋白質が挙げられる。
具体的には例えば、ホルモンとしては、黄体形成ホルモ
ン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放
出ホルモン（ＴＲＨ）、インスリン、ソマトスタチン、
成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン
（ＡＣＴＨ）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、バソプレシン、バ
ソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑
誌、第５４巻第５号第６７６〜６９１頁（１９７８）〕
など｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモ
ン（ＰＴＨ）、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、
パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテン
シン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（ＨＣＧ）、セルレイン、モチリンなどが挙げられ
る。

【００１８】鎮痛物質としては、エンケファリン、エン
ケファリン誘導体〔米国特許第４２７７３９４号、ヨー
ロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕、エンド
ルフィン、ディノルフィン、キョウトルフィンなどが挙
げられる。増殖因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）
ファミリー（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ−２（ＮＴ−３
とも呼ばれる）、ＮＴ−４、ＮＴ−５など)、上皮細胞
増殖因子（ＥＧＦ)、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）フ
ァミリー（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＮＴ−２、ＨＳＴ−
１、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６など）、ソマトメジン、Ｔ
細胞成長因子などが挙げられる。サイトカインとして
は、例えば、インターフェロン（α型、β型、γ型）、
インターロイキン類（ＩＬ−１、−２、−３、−４、−
５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１
２、−１３など）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＣＭ−
ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）、エリスロポイエチン、サイモポイエチン、サイモ
シンなどが挙げられる。酵素としては、例えば、ウロキ
ナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクチベータ、カ
リクレインなどが挙げられる。神経伝達因子としては、
例えば、ボムベシン、ニューロテンシン、ブラジキニ
ン、サブスタンスＰなどが挙げられる。レセプターとし
ては、例えば、ソマトスタチンレセプター、ＬＨ−ＲＨ
（黄体化ホルモン放出ホルモン）レセプター、ＧＨ−Ｒ
Ｈ（成長ホルモン放出ホルモン）レセプター、ＣＲＨ
（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）レセプター、Ｔ
ＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）レセプターな
どが挙げられる。

【００１９】抗体としては、抗原刺激の結果、免疫応答
によって生体内に産生される蛋白質で、免疫原（抗原）
と特異的に結合する活性をもつものをいう。即ち、蛋白
質、多糖類、核酸、脂質など種々の生理活性物質のうち
で抗原性を示す物質またはその集合体から成るもの（例
えば、ウイルス粒子、花粉、室内塵など）と、特異的に
結合する活性を有する蛋白質であればいずれでもよい。
具体的には、例えばマウス抗体やヒト抗体、さらにはマ
ウス／ヒト・キメラ抗体、ヒト型化抗体、一本鎖抗体、
単一ドメイン抗体、二重特異性抗体やトキシン融合抗体
などが挙げられる。またそれらの組合せとして得られる
例えば、マウス／ヒト・キメラ二重特異性抗体、ヒト型
化二重特異性抗体、一本鎖二重特異性抗体などが挙げら
れる。その具体例としては、抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗
原モノクロナール抗体、抗破傷風毒素モノクロナール抗
体、抗腫瘍関連抗原モノクロナール抗体などが挙げられ
る。キメラ抗体の具体例としては、マウス／ヒト・キメ
ラ抗ヒトフィブリン（以下、ＦＩＢと略記する）特異抗
体、マウス／ヒト・キメラ抗ヒト・ウロキナーゼ（以
下、ＵＫと略記する）抗体、マウス／ヒト・キメラ抗Ｆ
ＩＢ／抗ＵＫ二重特異性抗体〔特開平5-76385〕などが
挙げられる。また特にこれら抗体を構成する断片の中
で、抗原との結合能を保持するＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、
Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄＡｂ断片などが、活性型を高収量で得
られる抗体蛋白として好ましく挙げられる。

【００２０】ワクチン用の抗原（蛋白またはポリペプチ
ド）としては例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳ
Ｖ）、水痘帯状ほう疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）をはじめとするヘルペスウイルス
の抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞
白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）をはじめとするレトロ
ウイルスの抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＳ）をはじめ
とするヘパドナウイルスの抗原、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ、ＨＥＶ）、日本脳炎ウイルスをはじめとす
るトガウイルスの抗原、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を
はじめとするピコルナウイルスの抗原、インフルエンザ
ウイルスをはじめとするオルソミキソウイルスの抗原、
パルボウイルスの抗原、パポパウイルスの抗原、アデノ
ウイルスの抗原、ボックスウイルスの抗原、レオウイル
スの抗原、パラミキソウイルスの抗原、ラプドウイルス
の抗原、アレナウイルスの抗原、コロナウイルスの抗原
などの動物を宿主とするウイルスの抗原、マラリア抗原
などの病原性原虫の抗原、百日咳菌抗原などの病原性細
菌などが挙げられる。具体例としては、単純ヘルペスウ
イルス（ＨＳＶ）１型または２型の表面抗原gＤあるい
はgＢ、水痘帯状ほう疹ウイルス（ＶＺＶ）の表面抗原g
pＩあるいはgpIII、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の
gag抗原あるいはenv抗原、成人Ｔ細胞白血病ウイルス
（ＨＴＬＶ−１）のgag抗原あるいはenv抗原、Ｃ型ウイ
ルス（ＨＣＶ）のＣ抗原、Ｍ抗原あるいはＥ抗原、Ｂ型
肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＣ抗原（ＨＢc抗原）、Ｌ蛋
白、Ｍ蛋白あるいはＳ蛋白（ＨＢs）などが挙げられ
る。

【００２１】本発明の生理活性ペプチドまたは蛋白質の
製造法は、天然には微量にしか存在しないため大量取得
が困難な生理活性ペプチドまたは蛋白質の生産にも好ま
しく適用できる。また、本発明の製造法は、天然型の生
理活性ペプチド若しくは蛋白質またはその活性型誘導体
（ムテイン）のような非天然型生理活性ペプチド若しく
は非天然型蛋白質、およびそれらを結合させて得られる
融合蛋白質のいずれにも用いることができ、その立体構
造や糖鎖の有無が生理活性の発現に重要な要因となるた
め動物細胞を用いて生産することが望ましい生理活性ペ
プチドまたは蛋白質の製造に特に有利に用いることがで
きる。

【００２２】本発明における融合蛋白質とは、先に述べ
た生理活性ペプチドまたは蛋白質から選択される同種ま
たは異種のものを遺伝子工学的に結合させたものであ
る。すなわち、ホルモン、鎮痛物質、増殖因子、サイト
カイン、酵素、神経伝達因子、レセプター、抗体、ワク
チン用の抗原など、およびこれらの活性型誘導体または
ムテインから選択される同種または異種のものを結合さ
せたものである。具体的には例えば、ワクチン用の抗原
とサイトカインとを結合させたもの、モノクローナル抗
体と成長因子を結合させたもの、成長因子とサイトカイ
ンを結合させたもの、サイトカイン同士を結合させたも
の、成長因子と毒素を結合させたものなどが挙げられ
が、なかでも本発明はワクチン用の抗原とサイトカイン
とを結合させたものの製造に好ましく用いられる。具体
的な例として、t−gＤ−ＩＬ−２融合蛋白質が挙げられ
る。本発明の製造法は、このような融合蛋白質を生産す
るために作製された形質転換体の培養にも好適である。
高産生クローン選択のためのクローニングの方法は公知
であり、例えばコロニー分離法、マイクロウェル法（日
本生化学会編・新生化学実験講座１８、細胞培養技術第
１２〜１３頁(１９９０)、東京化学同人）などが挙げら
れる。

【００２３】以上のようにして得られた生理活性ペプチ
ドまたは蛋白質産生株を用いて、目的の生理活性ペプチ
ドまたは蛋白質を大量に生産するために無血清培地で大
量培養を実施する。この時の培養装置としては、通気手
段、撹拌手段、温度調節手段、pＨ制御ならびに溶存酸
素（ＤＯ）制御手段など培養に必要な部材が必要に応じ
て具備された公知の浮遊撹拌培養槽（日本生化学会編・
新生化学実験講座１、タンパク質VI合成および発現第２
８２頁、第２８６頁(１９９２)、東京化学同人；日本生
化学会編・新生化学実験講座１８、細胞培養技術第３１
３〜３２３頁(１９９０)、東京化学同人）などが用いら
れる。またエアーリフト式培養槽（J.R. Birch ら、ト
レンズ イン バイオテクノロジー（Trends in Biotec
hnol.）第３巻、第１６２頁(１９８５)も用いられる。
培養法としては、バッチ培養、フィード培養（フェッド
・バッチ培養）、灌流培養などが挙げられる。フィード
培養においては、培地の濃厚液および／または糖の濃厚
液、より好ましくは糖液のみを培養液中に培養途中１回
または培養期間中、連続的または間欠的にフィードして
培養液中における栄養分の枯渇を防ぎ、細胞を生存状態
に保ちつつ生産を持続させることが可能である。フィー
ドする糖としては、グルコースまたはマンノースが用い
られる。フィード培養を実施するためには、培養槽に連
結してフィード液の貯槽、フィード液の供給手段が施さ
れる。フィードの開始は、通常、菌体が対数増殖期に達
した時点、通常培養開始直後〜６日目、好ましくは約３
日目から行われる。バッチ培養では、培地調製時に糖を
１〜１０g/L、好ましくは３〜５g/L添加する方法が採ら
れる。灌流培養においては、培養槽に、培養液中の細胞
と培養上清液との分離手段、培養上清液の排出手段およ
び新鮮培地の供給手段が施される。培養液中の細胞と培
養上清液との分離手段としては、例えばフィルターによ
る分離法、コーン型細胞沈殿管や重力沈降管など細胞の
沈降を利用した分離法、または遠心分離法などの公知の
分離手段が挙げられる。例えば、これらの分離手段が培
養槽に施された培養システムを用い、公知の方法で連続
的に培養上清液を排出して新鮮培地と交換する方法など
が好ましく用いられる。培養上清液の排出と新鮮培地の
供給すなわち培地交換は、通常、対数増殖期から静止期
までの期間、通常、培養開始後約２〜１０日目、好まし
くは約３〜７日目から行われ、培地の交換速度は細胞密
度の増加とともに徐々に増加させることが好ましい。具
体的には例えば、培養１日当たり培養液量の約１０〜２
００％、とりわけ約５０〜１５０％交換することが好ま
しくい。

【００２４】培養時の温度は通常約３０〜４０℃、好ま
しくは３７℃付近、撹拌回転数は約２０〜１００rpm、
好ましくは３０rpm付近、pＨは約６〜８、好ましくは７
付近、ＤＯは約０.５〜５ppm、好ましくは１.５ppm付近
にそれぞれ調節される。目的とする生理活性ペプチドま
たは蛋白質は、培養途中で抜き取って得られる培養液か
ら、または培養終了後に回収する培養液から、採取され
る。

【００２５】本発明製造法により、細胞内または細胞外
に生成、蓄積した生理活性ペプチドまたは蛋白質を分
離、精製するには自体公知の分離、精製法を適切に組み
合わせて実施すればよい。これらの公知の分離、精製法
としては、塩析、硫安沈殿および溶媒沈殿法などの溶解
度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、およびＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主とし
て分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方
法、例えば抗体カラムおよびＣu²⁺カラムなどのメタル
キレートカラム、逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。

【００２６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳述するが、
本発明がこれに限定されるものではない。なお、後述の
実施例中で使用したｔ−ｇＤ−ＩＬ−２産生マウスミエ
ローマ細胞Ｓｐ−ｎｅｏ−ＨＤＬ−２４５株は、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１０として寄託されてい
る。また、実施例１２で得られたt−gＤ−ＩＬ−２高産
生クローンＳp２／Ｏ−２２−３２−３４株は、平成６
年４月１３日より財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＯ ５０４４２として、また平成６年６月２９
日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４４０１とし
て寄託されている。

【００２７】実施例１．１L分のＥ−ＲＤＦ培地粉末
（極東製薬）に、塩化第二鉄（６水加物）１０mg、α−
シクロデキストリン２.２g、プルロニックＦ68 １gを
添加し、さらにインスリン１０mg、エタノールアミン
１.５mg、亜セレン酸ナトリウム４μg、デキサメサゾン
１mg、ポリペプトン１g を添加した培地を調製し、これ
を水に溶解して１L の無血清培地とした。Ｓp−neo−Ｈ
ＤＬ−２４５株の凍結保存バイアル１本を液体窒素保存
容器より取り出して、３７°Ｃで急速解凍し、約９mlの
上記無血清培地と混合して遠心分離した。遠心上清液を
を捨て、残った細胞を約５０mlの上記無血清培地に再懸
濁（生細胞数が約１X１０⁵個/ml）してＦ７５フラスコ
に入れ、２.５％炭酸ガスインキュベーター中で３７°
Ｃ、一夜培養した。翌日、培地を新鮮な上記無血清培地
に交換し、３７°Ｃ、２日間培養した。増殖してきた細
胞を遠心分離して集め、上記無血清培地５０mlを分注し
た１２５ml容エルレンマイヤーフラスコに、０.８×１
０⁵細胞／mlとなるように植え込んだ。３７℃の回転振
盪機中でｐＨを中性付近に補正しながら、培養３日目に
グルコースを３g/L分フィードして８日間培養した。な
お、上記無血清培地において塩化第二鉄（６水加物）無
添加の培地を用い、比較実験として同様の培養を行っ
た。その結果、塩化第二鉄添加のものは良く増殖し、培
養３日目に９X１０⁵個/ml、培養５日目に２５X１０⁵個/
mlの細胞数に到達したが、無添加のものは増殖が極めて
悪く培養３日目に２X１０⁵個/mlとなり、それ以降細胞
が死滅した。〔表１〕のt−gＤ−ＩＬ−２の生産量に示
されるように、安価な無機の鉄化合物である塩化第二鉄
の添加により増殖および産生能が増大することが分かっ
た。

【００２８】

【表１】 実施例２．インスリンの添加効果 t−gＤ−ＩＬ−２産生Ｓp−neo−ＨＤＬ−２４５細胞
を、５０mlの無血清培地を分注した１２５ml容エルレン
マイヤーフラスコに０.８×１０⁵細胞／mlなるように植
え込んだ。本実験では、１L分のＥ−ＲＤＦ培地粉末
（極東製薬）に、塩化第二鉄（６水加物）１０mg、エタ
ノールアミン１.５mg、亜セレン酸ナトリウム４μg、α
−シクロデキストリン２.２g、プルロニックＦ68 １g、
デキサメサゾン１mg、ポリペプトン１g を添加した培地
を調製し、これを水に溶解して１Lの無血清培地とし
た。これにインスリンまたはインスリン様増殖因子Ｉ
（ＩＧＦ−I）を〔表２〕に示す濃度で添加したもの、
または無添加のものを使用した。３７℃の回転振盪機中
でｐＨを中性付近に補正しながら、培養３日目にグルコ
ースを３g/L分フィードして８日間培養したところ、イ
ンスリン１mg/L以上添加のものとＩＧＦ−I ２５μg/L
添加のものはより良く増殖し、無添加のものに比べ増殖
速度がより速く、最高到達密度も高くなった。t−gＤ−
ＩＬ−２の生産量は、〔表２〕に示すように、１mg/Lの
インスリン添加のもの（以下、Ｅ−ＲＤＦ−４培地と称
する）とＩＧＦ−I ２５μg/L添加のものはほぼ同等で
あった。すなわち、上記組成の培地を用いる場合、イン
スリンは一般に用いられる添加量の約１／５〜１／１０
量で良いことが分かった。

【００２９】

【表２】 実施例３．撹拌大量培養によるt−gＤ−ＩＬ−２の生産 t−gＤ−ＩＬ−２産生Ｓp−neo−ＨＤＬ−２４５細胞
を、約１００mlのＥ−ＲＤＦ−４無血清培地を分注した
１２５ml容テクネ・スピナーフラスコに生細胞数が約１
×１０⁵／mlなるように移植し、３７℃、３日間撹拌培
養した。増殖してきた細胞をさらに５００ml容テクネ・
スピナーフラスコ、３L容テクネ・スピナーフラスコに
順次移植して撹拌培養した。３L容テクネ・スピナーフ
ラスコで対数増殖期後期まで培養した培養液全量（約３
L）を、約１７LのＥ−ＲＤＦ−４培地を仕込んだ５０L
容攪拌培養槽に移植し、３７℃、攪拌回転数３０rpmで
培養を開始した。培養３日目にグルコースを３g/L分フ
ィードし、ｐＨは７.０付近、溶存酸素は１.５ppm付近
にコントロールして７日間培養した結果、約２４mg/Lの
t−gＤ−ＩＬ−２が生産された。この時の培養経過を
〔図１〕に示した。この結果、本発明の無血清培地は、
動物細胞の大量培養に、前培養、本培養を通して使用で
きることがわかった。

【００３０】実施例４．t−gＤ−ＩＬ−２の単離精製 実施例３で得られた培養終了液１９Lを遠心分離し、培
養上清液１８.４Lを得た。これに硫酸アンモニウムを２
０％飽和になるように加えた後、あらかじめ２０％飽和
硫酸アンモニウムと０.１mＭ(p−アミジノフェニル)メ
タンスルフォニルフルオライドを含む２０mＭトリス−
塩酸緩衝液(pＨ７.５)で平衡化したブチル−トヨパール
６５０Ｍカラム(１０×４cm）に付加し、同一緩衝液で
洗浄後、５％飽和硫酸アンモニウムと０.１mＭ（p−ア
ミジノフェニル）メタンスルフォニルフルオライドを含
む２０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ７.５)で溶出し、t−
gＤ−ＩＬ−２を含む画分２.１Lを集めた。この溶出画
分を、あらかじめ０.１mＭ（p−アミジノフェニル）メ
タンスルフォニルフルオライドを含む２０mＭリン酸緩
衝液(pＨ６.３)で平衡化したトリスアクリルＧＦ０５カ
ラム（１５×７０cm）に付加し、同一緩衝液で溶出して
t−gＤ−ＩＬ−２を含む画分２.４Lを集めた。この溶出
画分を、あらかじめ０.１mＭ（p−アミジノフェニル）
メタンスルフォニルフルオライドを含む２０mＭリン酸
緩衝液(pＨ６.３)で平衡化したスーパーＱ−トヨパール
６５０Ｍカラム（５×15cm）に付加して同一緩衝液で洗
浄後、同一緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を０〜４００
mＭに上げる直線濃度勾配溶出法で溶出し、t−gＤ−Ｉ
Ｌ−２の主溶出画分２１０mlを集めた。この画分をダイ
アフローセル(ＰＭ−１０膜、アミコン社製) で濃縮し
て得られた濃縮液３５mlを、あらかじめ１５０mＭ塩化
ナトリウムを含む２５mＭ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ
６.５)で平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム
（５×90cm）に付加し、同一緩衝液で溶出してt−gＤ−
ＩＬ−２精製標品１２０ml(５２mg)を得た。

【００３１】本精製標品を用いてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（分離用ゲル:１０〜２０％グラジ
エントゲル; 還元条件：１０％２−メルカプトエタノー
ル、１００℃、５分；染色：クマシーブリリアントブル
ーＲ２５０)を行った結果、〔図２〕に示すように、単
一のバンドが得られた。また、本精製標品のアミノ酸組
成分析の結果を〔表３〕に、Ｎ−末端アミノ酸配列分析
の結果を〔表４〕に、Ｃ末端アミノ酸分析の結果を〔表
５〕にそれぞれ示した。これらの蛋白化学的分析の結
果、ここで得られた精製標品は塩基配列から予想される
ものと良く一致した。

【００３２】

【表３】

【００３３】

【表４】

【００３４】

【表５】

【００３５】実施例５．クローニングによるt−gＤ−Ｉ
Ｌ−２高産生クローン株の選択 Ｓp−neo−ＨＤＬ−２４５株から高産生クローン株を選
択する目的で、限界希釈培養法によるクローニングを２
回繰り返した。すなわち、培養フラスコから培養液を採
取して遠心分離し、細胞を集めてクローニング用培地
（ＡＳＦ−１０４培地に１％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）と
４mg/Lのネオマイシン誘導体Ｇ４１８を添加）に懸濁
し、細胞数が１ml当たり５個となるよう同じ培地で希釈
した。この液を０.１mlずつ、約１５枚の９６ウェルプ
レートの各ウェルに分注し、２.５％炭酸ガスインキュ
ベーター中で３７℃、１５日間培養した。細胞の生育が
認められたウェルを選択し、新鮮なクローニング用培地
０.１mlを追加した。さらに５日間培養した後、０.５ml
のＡＳＦ−１０４無血清培地（Ｇ４１８ ４mg/L添加）
を分注した２４ウェルプレートに移植した。移植量は
０.１mlを標準として生育状況に応じて適宜増減させ
た。２.５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、３
日間培養した後、各ウェルの培養液を１００μl ずつ採
取し、新しい２４ウェルプレートに継代した。残りはさ
らに２日間培養を継続した後、t−gＤ−ＩＬ−２の産生
量をＥＩＡにより測定した。比較的高い生産性を示すク
ローンを２４個選び、３日目に継代したプレートから細
胞を１２ウェルプレート、Ｆ25 フラスコ、Ｆ75 フラス
コおよび１５０フラスコへとＥ−ＲＤＦ−４培地（Ｇ４
１８４００μg/L添加）で順次継代して培養した。更
に、これら２４個のクローンを１２５ml容テクネ・スピ
ナーフラスコに１×１０⁵/mlで移植し、Ｅ−ＲＤＦ−４
培地（Ｇ４１８ ４００μg/L添加）で攪拌培養して最
も生産性の高いクローンを選択した。

【００３６】次に更に高産生クローンを選択するため
に、同様な方法でクローニングと選抜を行い、最終的に
安定な高産生クローンＳp２／Ｏ−２２−３２−３４株
を選定した。このようにして得られたＳp２／Ｏ−２２
−３２−３４株を、振盪フラスコで培養し、その生産性
を比較した。すなわち、細胞を５０mlの無血清培地を分
注した１２５ml容エルレンマイヤーフラスコに０.８×
１０⁵細胞／mlなるように植え込んだ。 高産生クロー
ン株の生産性評価の無血清培地には、１L分のダイゴＴ
培地粉末（日本製薬）に、アミノ酸（アルギニン４００
mg、アスパラギン１００mg、アスパラギン酸６０mg、シ
ステイン９０mg、グルタミン６００mg、グリシン２０m
g、ヒスチジン５０mg、イソロイシン１２０mg、ロイシ
ン１１０mg、リジン１５０mg、メチオニン３０mg、フェ
ニルアラニン４０mg、プロリン４０mg、セリン１００m
g、スレオニン１００mg、トリプトファン２０mg、チロ
シン３０mg、バリン１００mg）、インスリン１mg、塩化
第二鉄（６水加物）１０mg、エタノールアミン１.５m
g、亜セレン酸ナトリウム４μg、α−シクロデキストリ
ン２.２g、プルロニックＦ68 １g、デキサメサゾン１m
g、ポリペプトン１g添加した培地を調製し、これを水に
溶解して１Lの無血清培地（以下、Ｅ−Ｔ−４培地と称
する）とし、これにグルコースを４gを添加したものを
使用した。３７℃の回転振盪機中でｐＨを中性付近に補
正しながら８日間培養したところ、Ｓp２／Ｏ−２２−
３２−３４株では約１０２mg/L（３回平均）のt−gＤ−
ＩＬ−２が生産された。なお、比較のために元株である
Ｓp−neo−ＨＤＬ−２４５株を同様に培養した場合のt
−gＤ−ＩＬ−２の生産性は、約２４mg/L（３回平均）
であった。従って、元株に比べt−gＤ−ＩＬ−２の生産
性が約２.４倍上昇した高産生クローン株が取得できた
ことになる。

【００３７】実施例６. ＣＨＯ細胞の培養によるヒトＮ
Ｔ−３の生産 ヒトＮＴ−３産生ＣＨＯ−Ｎ２−１株（岩根ら、特開平
５−１０３６７５）の無血清浮遊攪拌馴化株ＣＨＯ−Ｎ
２−１ ＳＦ(ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２４）を、５種類の
無血清培地（表中の記載参照）を各５０mlずつ分注した
１２５ml容エルレンマイヤーフラスコに、生細胞数が約
１×１０⁵/mlなるように移植した。３７℃の回転振盪機
(１００rpm)中で、ｐＨを中性付近に調整しながら１６
日間培養し、経時的に培養液上清中のＮＴ−３量を酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）〔新谷ら、バイオケミカル アン
ド バイオフィジカル リサーチ コミュニケイション
（ＢＢＲＣ）、第１９４巻、第１５００頁(１９９３)〕
により測定したところ、〔表６〕に示すような結果が得
られた。すなわち、優れた培地として一般に広く用いら
れているＡＳＦ−１０４培地やＣＯＳＭＥＤＩＵＭ−０
０１培地などに比べて、本発明のＥ−ＲＤＦ−４培地や
Ｅ−Ｔ−４培地は、ヒトＮＴ−３産生ＣＨＯ細胞におい
ても有利に利用できることが証明された。

【００３８】

【表６】

【００３９】実施例７．灌流培養によるt−gＤ−ＩＬ−
２の大量生産 実施例４で得られたＳp２／Ｏ−２２−３２−３４株を
約１００mlのＥ−Ｔ−４培地（グルコース４g/l添加）
を分注した125ml容テクネ・スピナーフラスコに生細胞
数が約１×１０⁵／mlとなるように移植し、３７℃、３
日間撹拌培養した。増殖してきた細胞をさらに500ml容
テクネ・スピナーフラスコに生細胞数が約１×１０⁵／m
lとなるように移植し、３７℃で対数増殖期の後期まで
培養した。増殖してきた細胞を、約１LのＥ−Ｔ−４培
地（グルコース４g/l添加）を仕込んだ２L容ジャー・フ
ァーメンターに約１×１０⁵／mlの播種密度で移植し、
３７℃、撹拌回転数40rpmで培養を開始した。培養４日
目からＥ−Ｔ−４培地（グルコース４g/l添加）を用い
て、約70％の培地交換速度（培養液量１Lに対する培養
１日当たりの培地交換比率）で灌流を開始し、細胞密度
が高くなるにつれて培地交換速度を徐々に約150％まで
増加させた。培養液のpHは7.0付近、溶存酸素（ＤＯ）
は1.5ppm付近にコントロールして培養した。その結果、
35日間の培養で、全細胞数が約４×１０⁷／mlの密度ま
で増殖し、積算量として約1500mgのt−gＤ−ＩＬ−２が
生産された。

【００４０】

【発明の効果】本発明の動物細胞培養用の無血清培地
は、（１）安価である点、（２）成分組成が明らかであ
り、ロット間の差がなく均一である点、また、（３）血
清を添加することなく前培養、本培養を通して、動物細
胞の培養に使用できる点、さらに、（４）静置培養のみ
ならず撹拌培養（バッチ培養、フェド・バッチ培養な
ど）または長期間の灌流培養も可能である点など各種の
生理活性ペプチドまたは蛋白質の工業的生産に極めて有
利に使用できる。該無血清培地の特徴の一つは、血清由
来の鉄供与体を使用せず、無機または非蛋白質性の低分
子の有機鉄化合物を使用することにあり、これによって
安価に培地を供給でき、しかも生産性も良好である。該
無血清培地を用いた動物細胞培養による工業生産によっ
て、具体的には例えば、老人性痴呆症への応用が期待さ
れるＮＧＦ、ＮＴ−３などのＮＧＦファミリーに属する
もの、単純ヘルペスウイルスに対する免疫原性の強いワ
クチンとしてその開発が期待される融合蛋白質t−gＤ−
ＩＬ−２などの大量供給が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３によるt−gＤ−ＩＬ−２産生Ｓp−neo
−ＨＤＬ−２４５細胞の大量培養経過を示す。

【図２】実施例４で得られたt−gＤ−ＩＬ−２精製標品
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示
す。

【符号の説明】

Ｍは分子量マーカーを、Ａは実施例４で得られたt−gＤ
−ＩＬ−２の精製標品を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/02 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 9282−4Ｂ Ｈ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】無機または有機鉄化合物、シクロデキスト
   リンおよび非イオン性界面活性剤を基礎培地に含有せし
   めてなる動物細胞培養用の無血清培地。
2. 【請求項２】インスリン、エタノールアミンまたはその
   誘導体、および亜セレン酸またはその塩をさらに含有し
   てなる請求項１記載の培地。
3. 【請求項３】無機または有機鉄化合物が、塩化第二鉄、
   塩化第一鉄、硫酸第一鉄、硝酸鉄、クエン酸鉄、シュウ
   酸鉄または乳酸鉄のいずれか１種または２種以上の組み
   合わせである請求項１または２記載の培地。
4. 【請求項４】非イオン性界面活性剤が、プルロニック系
   界面活性剤である請求項１または２記載の培地。
5. 【請求項５】デキサメサゾン、蛋白質加水分解物および
   アミノ酸類のうち少なくとも１種類を補添してなる請求
   項１または２記載の培地。
6. 【請求項６】蛋白質加水分解物が、ポリペプトン、ラク
   トアルブミン加水分解物、バクトトリプトンおよびカザ
   ミノ酸のいずれか１種または２種以上の組み合わせであ
   る請求項５記載の培地。
7. 【請求項７】塩化第二鉄、α−シクロデキストリン、プ
   ルロニック系界面活性剤、インスリン、エタノールアミ
   ン、亜セレン酸ナトリウムおよびポリペプトンを含有し
   てなる請求項１または２記載の培地。
8. 【請求項８】動物細胞が、マウスミエローマ細胞または
   チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１または
   ２記載の培地。
9. 【請求項９】請求項１、２、３、４、５、６または７記
   載の培地を用いて動物細胞を培養し、生理活性ペプチド
   または蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とする該生理活性ペプチドまたは蛋白質の製造法。
10. 【請求項１０】動物細胞が、マウスミエローマ細胞また
    はチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項９記載
    の製造法。
11. 【請求項１１】培養が浮遊撹拌培養である請求項９記載
    の製造法。
12. 【請求項１２】生理活性ペプチドまたは蛋白質が、ホル
    モン、鎮痛物質、増殖因子、サイトカイン、酵素、神経
    伝達因子、レセプター、抗体またはワクチン用の抗原で
    ある請求項９記載の製造法。
13. 【請求項１３】増殖因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）フ
    ァミリーに属するものである請求項１２記載の製造法。
14. 【請求項１４】生理活性ペプチドまたは蛋白質が、ホル
    モン、鎮痛物質、増殖因子、サイトカイン、酵素、神経
    伝達因子、レセプター、抗体またはワクチン用の抗原か
    ら選択された同種または異種間の融合蛋白質である請求
    項９記載の製造法。
15. 【請求項１５】融合蛋白質が、単純ヘルペスウイルスの
    外被糖蛋白とインターロイキン−２からなる融合蛋白質
    である請求項１４記載の製造法。
16. 【請求項１６】t−gＤ−ＩＬ−２産生能を有するマウス
    ミエローマ細胞Ｓp２／０−２２−３２−３４株。