JPH0870856A - Substantially pure microorganism capable of producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase - Google Patents
Substantially pure microorganism capable of producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenaseInfo
- Publication number
- JPH0870856A JPH0870856A JP6208387A JP20838794A JPH0870856A JP H0870856 A JPH0870856 A JP H0870856A JP 6208387 A JP6208387 A JP 6208387A JP 20838794 A JP20838794 A JP 20838794A JP H0870856 A JPH0870856 A JP H0870856A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydroxybutyrate dehydrogenase
- microorganism
- dna
- transformed
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素を生産する実質上純粋な微生物、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するＤＮＡ及び３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造
法に関する。The present invention relates to a substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, a DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, and 3-hydroxybutyrate dehydration. The present invention relates to a method for producing an enzyme.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
の存在下、基質として１モルの３−ヒドロキシ酪酸に作
用して１モルのＮＡＤを消費し、１モルのアセト酢酸及
び１モルの還元型ＮＡＤに変換する触媒作用を有し、酵
素番号Ｅ．Ｃ．１．１．１．３０として知られている
（酵素ハンドブック、第６頁、１９８２年、朝倉書店発
行）。2. Description of the Related Art Conventionally, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase is nicotinamide adenine dinucleotide (NAD).
In the presence of E. coli, it acts as a substrate on 1 mol of 3-hydroxybutyric acid, consumes 1 mol of NAD, and converts it into 1 mol of acetoacetic acid and 1 mol of reduced NAD. C. Known as 1.1.1.30 (Enzyme Handbook, page 6, 1982, published by Asakura Shoten).
【０００３】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は糖尿病の
検査におけるケトン体の１つである３−ヒドロキシ酪酸
の定量に利用される有用な酵素である。3-Hydroxybutyrate dehydrogenase is a useful enzyme used for the quantification of 3-hydroxybutyrate, which is one of the ketone bodies in the examination of diabetes.
【０００４】これまでに、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素は動物由来のものとしては例えばラット脳〔Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，９８０−９８３
（１９９０）〕、ラット肝臓〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．６８，１２２５−１２３０（１９９
０）〕、ウシ心臓〔Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．，２６２，８５−９８（１９８８）〕が報告
されている。So far, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase has been known as an animal-derived one such as rat brain [Bioc.
hem. Cell Biol. , 68,980-983
(1990)], rat liver [Biochem. Cel
l Biol. 68, 1225-2230 (199
0)], bovine heart [Arch. Biochem. Bio
phys. , 262, 85-98 (1988)] have been reported.
【０００５】また、微生物由来のものとしてはロードス
ピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｒｕｂｒｕｍ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７，
６０３−６０７（１９６２）〕、シュードモナス・レモ
イグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅ
ｉ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０，４０２３−
４０２８（１９６５）〕、マイコバクテリウム・フレイ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）〔Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０４，１２３−１２６
（１９７８）〕、パラコッカス・デニトリフィカンス
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８
３９，３００−３０７（１９８５）〕、ズーグロエア・
ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）
〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８９，６２５−６３５（１９
８１）〕、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅ
ｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４１，２９７−３００
（１９８７）〕、アゾスピリルム・ブラジレンズ（Ａｚ
ｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）〔Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，６４５−６４
９（１９９０）〕が報告されている。Further, as a microorganism-derived one, Rhodospirillum (Rhodospirillum)
rubrum) [J. Biol. Chem. , 237,
603-607 (1962)], Pseudomonas lemoigne
i) [J. Biol. Chem. , 240, 4023-
4028 (1965)], Mycobacterium phlei [J. G
en. Microbiol. , 104, 123-126
(1978)], Paracoccus denitrificans.
s) [Biochem. Biophys. Acta, 8
39, 300-307 (1985)], Zoogroea.
Lamigala (Zoogloea ramigera)
[J. Biochem. , 89, 625-635 (19
81)], Lord Pseudomonas spheroides (R
hodopseudomonas spheroid
s) [Biochem. J. , 241,297-300
(1987)], Azospirillum Brasilens (Az
ospirillum brasilense) [J.
Gen. Microbiol. , 136, 645-64
9 (1990)] has been reported.
【０００６】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の遺伝子に
関してはラットミトコンドリア（Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，
７３，１２１−１２９（１９９１））、ヒト心臓（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２２），１５４５９−
１５４６３（１９９２））、ラット肝（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７１，４０６−４１１（１
９９３））等が報告されている。Regarding the gene of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, rat mitochondria (Biol. Cell,
73, 121-129 (1991)), human heart (J.
Biol. Chem. , 267 (22), 15459-
15463 (1992)), rat liver (Bioche)
m. Cell Biol. , 71, 406-411 (1
993)) and the like have been reported.
【０００７】しかしながら、動物由来の３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素は活性の発現にリン脂質を必要とし、ま
た微生物由来の酵素はＥＤＴＡにより阻害を受け、更に
０℃における失活や３７℃、１５分間の処理で７０％失
活するなどの欠点があり、さらにまた、上記いずれの生
産株も生産性が低いことから、実用的ではなかった。そ
こで、活性発現にリン脂質を必要とせず、ＥＤＴＡによ
り阻害をうけず、３７℃で失活しない３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素の遺伝子工学による生産が望まれていた。However, animal-derived 3-hydroxybutyrate dehydrogenase requires phospholipids for expression of activity, and microorganism-derived enzyme is inhibited by EDTA, and further inactivated at 0 ° C. or 37 ° C. for 15 minutes. However, it was not practical because all of the above production strains had low productivity. Therefore, production of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, which does not require phospholipid for activity expression, is not inhibited by EDTA, and is not inactivated at 37 ° C. by genetic engineering, has been desired.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
実情のもとで、ケトン体の定量に有用で、かつ理化学的
性質において良好な３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を効
率よく生産する微生物を開発し、この微生物を用いて該
酵素を量産する方法を提供することを目的としてなされ
たものである。Under the above circumstances, the present invention is a microorganism which is useful for the determination of ketone bodies and which efficiently produces 3-hydroxybutyrate dehydrogenase excellent in physicochemical properties. , And to provide a method for mass-producing the enzyme using this microorganism.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、まず、アルカリ
ゲネス・エスピー・Ｎｏ．９８１（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｓｐ．Ｎｏ．９８１；ＦＥＲＭ ＢＰ−２５７
０）が３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を産生することを
見いだした（特願平６−１８１０４７号明細書）。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the inventors of the present invention firstly found that Alcaligenes SP No. 981 (Alcaligen
es sp. No. 981; FERM BP-257
0) produced 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (Japanese Patent Application No. 6-181047).
【００１０】しかしながら、その生産性が低いことが判
明したため、本３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素について
高純度に精製し、そのＮ末端領域のアミノ酸分析を行
い、この結果に基づき種々プローブを作成したが３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を保持するクローンを見
いだすことができなかった。However, since it was found that its productivity was low, the present 3-hydroxybutyrate dehydrogenase was purified to a high degree of purity, the amino acid analysis of its N-terminal region was carried out, and various probes were prepared based on this result. No clone could be found that carried the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene.
【００１１】さらに研究を続け、本ＩＦＯ−１３１１１
株から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する微生物
由来の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この中か
ら、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングす
ることに成功し、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクタ
ーを構築した後、例えばエッシェリヒア・コリー（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；以下Ｅ．ｃｏｌｉと略
称する）に属する微生物に導入して３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を生産する実質上純粋な形質転換微生物を作
出し、これを培地中で培養することによって、該３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素を効率よく量産することを見出
した。この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、Further research is continued and this IFO-13111
A chromosomal DNA library derived from a microorganism that produces 3-hydroxybutyrate dehydrogenase was constructed from the strain, and a gene DNA expressing the enzyme was successfully screened from the library, and then an expression vector using the DNA. After building, for example, Escherichia Collie (Es
cherichia coli; hereinafter E. coli) for producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase to produce a substantially pure transformed microorganism, which is cultured in a medium to produce the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. It was found that the enzyme can be mass-produced efficiently. The present invention has been completed based on this finding.
The present invention has been completed based on the above findings,
【００１２】[0012]
【化４】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質
的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
実質上純粋な微生物、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであ
る。更に本発明は、[Chemical 4] A substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase transformed with a recombinant plasmid having a DNA substantially consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by It is a DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme. Further, the present invention is
【００１３】[0013]
【化５】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質
的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
実質上純粋な微生物を培地に培養し、ついでその培養物
から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特
徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法であ
る。[Chemical 5] A substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase transformed with a recombinant plasmid carrying a DNA consisting essentially of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by A method for producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, which comprises collecting 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from the culture.
【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する形質
転換された微生物を作出するのに用いられる３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば
該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリ
ーの中から、スクリーニングすることによって得ること
ができる。The present invention will be described in detail below. In the present invention, a gene DNA expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, which is used to produce a transformed microorganism that produces 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, is, for example, a chromosome derived from a microorganism that produces the enzyme. It can be obtained by screening from a DNA library.
【００１５】本発明においては、前記の３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素を生産する微生物として、アルカリゲネ
ス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４７５０）またはアルカリゲネス・エスピー・Ｎｏ．
９８１（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．Ｎｏ９８１；
ＦＥＲＭ ＢＰ２５７０）が好ましく用いられる。In the present invention, as a microorganism producing the above 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, Alcaligenes faecalis IFO-13111 (FERM BP
-4750) or Alcaligenes SP No.
981 (Alcaligenes sp. No. 981;
FERM BP2570) is preferably used.
【００１６】例えば、アルカリゲネス・ファエカリスＩ
ＦＯ−１３１１１の場合、その染色体ＤＮＡライブラリ
ーから該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニング
する方法の具体例について説明すると、まず、該微生物
の染色体ＤＮＡ１００〜２０００μｇ程度を通常用いら
れている方法によって抽出した後、その１〜１０μｇ程
度を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断して、例えばクロ
ーニング用ベクターのプラスミドｐＵＣ１１９ＢａｍＨ
Ｉ部位に連結し、次いでこの組換えＤＮＡを宿主微生物
に導入して該染色体ＤＮＡのクローニングを行い、１０
4 〜１０5 クローンからなる染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。この際用いられる宿主微生物としては、組
換えＤＮＡが安定でかつ自律的に増殖可能であるもので
あれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられ
ているもの、例えばエッシェリヒア属、バチルス属に属
する微生物などが好ましく使用される。For example, Alcaligenes faecalis I
In the case of FO-13111, a specific example of the method for screening the gene DNA expressing the enzyme from the chromosomal DNA library will be described. First, about 100 to 2000 μg of the chromosomal DNA of the microorganism was extracted by a commonly used method. Then, about 1 to 10 μg thereof is partially cleaved with a restriction enzyme Sau3AI, and, for example, a plasmid pUC119BamH of a cloning vector is used.
The recombinant DNA is ligated to the I site, and then this recombinant DNA is introduced into a host microorganism to clone the chromosomal DNA.
A chromosomal DNA library consisting of 4 to 10 5 clones is prepared. The host microorganism used at this time is not particularly limited as long as the recombinant DNA is stable and can grow autonomously, and those used for ordinary gene recombination, for example, Escherichia or Bacillus. Microorganisms belonging to the category are preferably used.
【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する
微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下に組換え
ＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を
用いてもよい。またバチルス属に属する微生物の場合に
は、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを
用いることができるし、エレクトロポレーション法ある
いはマイクロインジェクション法を用いてもよい。As a method for introducing the recombinant DNA into the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, the recombinant DNA may be introduced in the presence of calcium ions, or it may be competent. The cell method may be used. Further, in the case of a microorganism belonging to the genus Bacillus, the competent cell method or the protoplast method can be used, or the electroporation method or the microinjection method may be used.
【００１８】宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有
無の選択については、組換えＤＮＡを構成するベクター
の薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微生物
を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。次い
で、前記の染色体ＤＮＡの中から、３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を発現する遺伝子をスクリーニングするわけ
であるが、この段階が本発明において非常に困難な部分
であった。Regarding the selection as to whether or not the desired recombinant DNA has been introduced into the host microorganism, the host microorganism is cultured in a selective medium based on the drug resistance marker of the vector constituting the recombinant DNA, and the host microorganism that grows is selected. Good. Then, a gene expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase is screened from the above chromosomal DNA, but this step was a very difficult part in the present invention.
【００１９】通常、遺伝子のクローニングは、コードさ
れているタンパクの部分的アミノ酸配列から推定される
ＤＮＡ配列をもとにした合成ＤＮＡプローブを用いるハ
イブリダイゼーション法によって行われる。常法に従
い、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のＮ末端領域のアミ
ノ酸配列から種々の合成ＤＮＡプローブを作製し、スク
リーニングを行ったが、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
遺伝子を保持するクローンを見い出すことは出来なかっ
た。Usually, gene cloning is carried out by a hybridization method using a synthetic DNA probe based on a DNA sequence deduced from a partial amino acid sequence of the encoded protein. According to a conventional method, various synthetic DNA probes were prepared from the amino acid sequence of the N-terminal region of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase and screened. A clone carrying the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene was found. I could not do it.
【００２０】そこで、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活
性を指標としたショットガン法によってクローニングす
ることを試みた。詳細は後述するが、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターが大腸菌内で機能す
るかどうか判らないのでベクターに付属のｌａｃプロモ
ーターの下流に外来遺伝子を挿入し、大腸菌に導入後培
地に添加したＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ（−）−チ
オガラクトピラノシド）によってｌａｃプロモーターが
機能するよう誘導をかけた。Therefore, cloning was attempted by the shotgun method using 3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity as an index. Although details will be described later, since it is not known whether the promoter of the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene functions in Escherichia coli, an exogenous gene was inserted downstream of the lac promoter attached to the vector and introduced into E. coli, and then added to the medium. The lac promoter was induced to function by IPTG (isopropyl β-D (−)-thiogalactopyranoside).
【００２１】その際、しばしばこのような誘導によって
大腸菌の生育が悪くなり目的のクローンを得ることがで
きないことから、一度ＩＰＴＧ無添加で遺伝子ライブラ
リーを作製した後、ＩＰＴＧ添加プレートにレプリカす
ることによってＩＰＴＧの悪影響を防いだ。また、メン
ブレン上にレプリカした菌体を用いて３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素活性の有無を調べるために、培地および大
腸菌由来の酵素タンパクの影響（バックグラウンドの上
昇）を避けるため、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が高
いｐＨの環境でも安定であることを利用して、アルカリ
性の緩衝液で前処理を行った。さらに、シグナルを検出
する感度を上げるため、反応液にリゾチームを加えた。
これらのことを組み合わせることによって初めて目的の
遺伝子ＤＮＡのクローニングを達成することが出来た。At that time, since the growth of Escherichia coli is often deteriorated by such induction and the desired clone cannot be obtained, it is possible to prepare a gene library without adding IPTG and then replicate it on an IPTG-added plate. Prevented the adverse effects of IPTG. In addition, in order to investigate the presence or absence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity using the bacterial cells replicated on the membrane, in order to avoid the influence of enzyme protein derived from the medium and Escherichia coli (increased background), 3-hydroxybutyrate Taking advantage of the fact that dehydrogenase is stable even in a high pH environment, pretreatment was performed with an alkaline buffer solution. Furthermore, lysozyme was added to the reaction solution in order to increase the sensitivity of detecting the signal.
Only by combining these things, cloning of the target gene DNA could be achieved.
【００２２】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む形質
転換された宿主微生物から、例えばマニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）らの方法［「モレキュラル・クローニン
グ：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）」（１９８２年）］などに従って、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素を発現するＤＮＡを含む組換えプラスミ
ド（ｐＨＢＤ１と命名した）を調製することができる。
このプラスミドの構成を示す模式図を図４に示した。Next, from the transformed host microorganism containing the gene DNA of interest, for example, Maniatis (Ma
niatis et al. ["Molecular Cloning: Cold Spring Harbor (Molecular
Cloning: ColdSpring Harbo
r) ”(1982)] and the like, and a recombinant plasmid (named pHBD1) containing DNA expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase can be prepared.
A schematic diagram showing the constitution of this plasmid is shown in FIG.
【００２３】次に、前記のようにして染色体ＤＮＡライ
ブラリーの中から、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を発
現する遺伝子ＤＮＡを選択し、それを組み込んだ発現ベ
クターを構築する。この発現用ベクターとしては、宿主
微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミド
から遺伝子組換え用として構築されたものが適してい
る。前者のファージとしては、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿
主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ
などが用いられる。Next, a gene DNA expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase is selected from the chromosomal DNA library as described above, and an expression vector incorporating it is constructed. As the expression vector, a vector constructed for gene recombination from a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is suitable. Examples of the former phage include E. coli. When E. coli is used as the host microorganism, λgt · λC, λgt · λB
Are used.
【００２４】また、プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ
を宿主微生物とする場合には、例えばｐＢＲ３２２、ｐ
ＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１
３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１
１９などが用いられる。さらに、バチルス属を宿主微生
物とする場合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用い
ればよく、サッカロミセス属を宿主微生物とする場合
は、例えばｐＹＡＣ５などを用いればよい。As the plasmid, E. coli
When using as a host microorganism, for example, pBR322, pBR322
BR325, pACYC184, pUC12, pUC1
3, pUC18, pUC19, pUC118, pUC1
19 or the like is used. Furthermore, when Bacillus is a host microorganism, for example, pHY300PLK or the like may be used, and when Saccharomyces is a host microorganism, for example, pYAC5 or the like may be used.
【００２５】これらのベクターに、３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素遺伝子ＤＮＡを組み込む方法についてはとく
に制限はなく、従来慣用されている方法を用いることが
できる。例えば適当な制限酵素を用いて、前記の３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラ
スミド及び該発現用ベクターを処理し、それぞれ３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベ
クター断片を得た後、それぞれの接着末端をアニーリン
グ後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに
よって、発現プラスミドが得られる。The method for incorporating the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene DNA into these vectors is not particularly limited, and a conventionally used method can be used. For example, using a suitable restriction enzyme, the recombinant plasmid containing the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene DNA and the expression vector are treated to obtain a DNA fragment and a vector fragment containing the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene, respectively. Then, each cohesive end is annealed and then ligated with an appropriate DNA ligase to obtain an expression plasmid.
【００２６】後述の実施例における発現プラスミドは、
前記の組換えプラスミドｐＨＢＤ１とベクタープラスミ
ドｐＵＣ１１９から得られ、ｐＨＢＤ２と命名されたも
のであり、その構成の模式図は図５に示したとおりであ
る。また、該プラスミド中のアルカリゲネス・ファエカ
リスＩＦＯ−１３１１１染色体ＤＮＡ由来（３−ＨＢＤ
Ｈ Ｇｅｎｅ）の部位の制限酵素地図は図３に示したと
おりである。The expression plasmids in the examples described below are
It was obtained from the above-mentioned recombinant plasmid pHBD1 and vector plasmid pUC119 and named pHBD2, and the schematic diagram of its constitution is as shown in FIG. In addition, the plasmid derived from Alcaligenes faecalis IFO-13111 chromosomal DNA in the plasmid (3-HBD
The restriction enzyme map of the H Gene) site is as shown in FIG.
【００２７】このようにして、構築された発現ベクター
をＥ．ｃｏｌｉに属する微生物に導入し、該宿主微生物
を形質転換させれば３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生
産する実質上純粋な微生物が得られる。発現ベクターの
導入及び選択方法については前述した方法を用いて行
う。The expression vector constructed in this manner was transformed into E. When introduced into a microorganism belonging to E. coli and transformed into the host microorganism, a substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase can be obtained. Regarding the method of introducing and selecting the expression vector, the method described above is used.
【００２８】本発明においては、前記組換えプラスミド
ｐＨＢＤ２によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに属す
る微生物は、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＨＢＤ
２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）と命名された。In the present invention, E. coli transformed with the recombinant plasmid pHBD2 is used. The microorganism belonging to E. coli is Escherichia coli DH1-pHBD.
2 (FERM BP-4749).
【００２９】このようにして得られた形質転換微生物の
培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの
栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことが
できる。炭素源としては、例えばグルコース、デンプ
ン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが挙げられ
る。窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼ
イン加水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アン
モニウム塩などが挙げられ、無機成分としては、例えば
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コ
バルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫
酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げられる。Cultivation of the thus-obtained transformed microorganism can be carried out in a medium containing nutrients such as carbon and nitrogen sources necessary for the growth of the microorganism and inorganic components. Examples of the carbon source include glucose, starch, sucrose, molasses, dextrin and the like. Examples of the nitrogen source include peptone, meat extract, casein hydrolyzate, corn steep liquor, nitrate, ammonium salt, and the like, and inorganic components such as sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, zinc, manganese, and iron. Examples thereof include salts containing cations such as and anions such as chlorine, sulfuric acid, and phosphoric acid.
【００３０】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって、通常２０〜５０℃、好ましく
は２５〜４２℃、より好ましくは３７℃近辺で、１２〜
４８時間程度培養する方法が用いられる。The culturing method is not particularly limited, and is a known method, for example, aeration and agitation culture, shaking culture, rotary culture, stationary culture, or the like, usually 20 to 50 ° C., preferably 25 to 42 ° C., and more preferably 12 ~ at around 37 ℃
A method of culturing for about 48 hours is used.
【００３１】このようにして培養を行ったのち、遠心分
離処理などの手段によって菌体を集め、次いで酵素処
理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理などによっ
て細胞を破壊して目的とする酵素を含有する抽出液を得
る。この抽出液から、該酵素を分離、精製するには、例
えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着処理な
どを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過、電気泳動法などによって精製すればよい。After culturing in this way, the cells are collected by means such as centrifugation, and then the desired enzyme is destroyed by destroying the cells by enzyme treatment, autolysis, French press, ultrasonic treatment, etc. Obtain the containing extract. To isolate and purify the enzyme from the extract, for example, salting out, desalting, adsorption / desorption treatment with an ion exchange resin, and the like, and further purification by adsorption chromatography, gel filtration, electrophoresis, etc. do it.
【００３２】この精製標品について、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素の酵素活性及び物理化学的性質を調べるこ
とによって、該形質転換微生物が３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の産生能を有することが確認された。したがっ
て、本発明において用いた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を発現する遺伝子ＤＮＡは、図１で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有し、かつその塩基配列が
図２に示す配列であることが明らかであり、特に本発明
は３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列から実質的になるＤＮＡを提供でき、上
記塩基配列の均等物も包含される。By examining the enzymatic activity and physicochemical properties of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase in this purified preparation, it was confirmed that the transformed microorganism had the ability to produce 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. It was Therefore, the gene DNA expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase used in the present invention has a base sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. 1, and the base sequence is the sequence shown in FIG. It is clear that the present invention can provide a DNA consisting essentially of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, and includes equivalents of the above nucleotide sequences.
【００３３】このようにして得られた３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素は、ＮＡＤの存在下、３−ヒドロキシ酪酸
をアセト酢酸に効果的に変換する触媒作用を有すること
から、例えば血清中のケトン体の１つである３−ヒドロ
キシ酪酸の定量など、臨床用酵素として有用である。な
お、本発明明細書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸
配列の記号は、当該分野における慣用略号に基づくもの
で、それらの例を以下に列記する。また、すべてのアミ
ノ酸はＬ体を示すものとする。The 3-hydroxybutyrate dehydrogenase thus obtained has a catalytic action for effectively converting 3-hydroxybutyrate to acetoacetate in the presence of NAD, and thus, for example, a ketone body in serum. It is useful as a clinical enzyme for quantifying 3-hydroxybutyric acid, which is one of the above. The symbols for base sequences and symbols for amino acid sequences described in the specification of the present invention are based on conventional abbreviations in the field, and examples thereof are listed below. In addition, all amino acids are L-form.
【００３４】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｙ：チミンまたはシトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミンDNA: deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine N: adenine, thymine, guanine or cytosine R: adenine or guanine Y: thymine or cytosine Ala: alanine Arg: arginine Asn: asparagine Asp: asparagine Acid Cys: Cysteine Gln: Glutamine
【００３５】Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリンGlu: Glutamic acid His: Histidine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Methionine Phe: Phenylalanine Pro: Proline Ser: Serine Thr: Threonine Trp: Tryptophan Tyr: Tyrosine Val: Valine
【００３６】[0036]
【実施例】次に、参考例及び実施例によって本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってな
んら限定されるものではない。 参考例１ 染色体ＤＮＡの分離：アルカリゲネス・ファエカリスＩ
ＦＯ−１３１１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７５０）菌株を
普通ブイヨン培地〔１８ｇ／リットル、普通ブイヨン
「栄研」（栄研化学社製）〕２００ｍｌにて３０℃で一
昼夜振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機（ト
ミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７６６
０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌した。EXAMPLES Next, the present invention will be explained in more detail by reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples. Reference Example 1 Isolation of chromosomal DNA: Alcaligenes faecalis I
After culturing the FO-13111 (FERM BP-4750) strain in 200 ml of a normal broth medium [18 g / liter, normal broth "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.)] at 30 ° C for one day with shaking, this culture solution was spun at high speed. Using a cooling centrifuge (Tomy CX-250 type), 6500 rpm (766
The cells were collected by centrifugation at 0 G) for 10 minutes.
【００３７】次いで、この菌体を５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及
び１５％シュクロースからなる溶液２０ｍｌ中に懸濁
し、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチーム
（生化学工業社製）を加え、３７℃で３０分間処理して
菌株の細胞壁を破壊した。次に、これに１０％ラウリル
硫酸ナトリウム（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加えて、
３７℃で２０分間処理した後、１００００ｒｐｍ（１２
０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して水相を回収し
た。Next, the cells were suspended in 20 ml of a solution containing 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0) and 15% sucrose, so that the final concentration was 2 mg / ml. Lysozyme (manufactured by Seikagaku Corporation) was added to and treated at 37 ° C. for 30 minutes to destroy the cell wall of the strain. Next, 1 ml of a 10% sodium lauryl sulfate (manufactured by Sigma) aqueous solution was added to this,
After processing at 37 ° C for 20 minutes, 10,000 rpm (12
(080G) and centrifuged for 10 minutes to recover the aqueous phase.
【００３８】この水相に２倍量のエタノールを静かに重
層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡをガラ
ス棒にまきつかせて分離した後、１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２０
ｍｌで溶解し、次いでこれに等量のフェノール／クロロ
ホルム（１／１）混合液を加え、撹拌した後、１０００
０ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して
水相を分取した。次に、この水相に２倍量のエタノール
を加えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴ
Ａからなる溶液２ｍｌに溶解した。The aqueous phase was gently overlaid with 2 volumes of ethanol, and the DNA was sprinkled on the glass rod while gently stirring with a glass rod to separate the DNA, and then 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0) and 1 mM were added. Solution 20 consisting of EDTA
Dissolve in ml, then add an equal volume of phenol / chloroform (1/1) mixture, stir, and
The aqueous phase was separated by centrifugation at 0 rpm (12080G) for 10 minutes. Then, twice the amount of ethanol was added to this aqueous phase and the DNA was separated again by the above-mentioned method.
0 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDT
It was dissolved in 2 ml of a solution consisting of A.
【００３９】参考例２ アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１遺伝
子ライブラリーの作製：参考例１で得られたアルカリゲ
ネス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１染色体１０μｇ
を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）０．３単位を用
い、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 及び１ｍＭのＤＴ
Ｔからなる混合物１００μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で
３０分間切断処理した。そして、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動にて約２．０〜６．０ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。Reference Example 2 Construction of Alcaligenes faecalis IFO-13111 gene library: Alcaligenes faecalis IFO-13111 chromosome 10 μg obtained in Reference Example 1
Using 0.3 unit of restriction enzyme Sau3AI (Takara Shuzo), 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 100 m
M NaCl, 10 mM MgCl 2 and 1 mM DT
Cleavage was performed at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of 100 μg / ml of a mixture consisting of T. Then, a DNA fragment of about 2.0 to 6.0 kb was recovered by 0.7% agarose gel electrophoresis.
【００４０】また、クローニングベクターｐＵＣ１１９
（宝酒造社製）５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社
製）３０単位を用い、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2
及び１ｍＭのＤＴＴから成る混合物１００μｇ／ｍｌの
存在下、３７℃で３時間切断処理した。ｐＵＣ１１９の
切断溶液は、５’末端を脱リン酸化するために、さらに
反応液にアルカリ性ホスファターゼ（宝酒造社製）１単
位を加えて６５℃で２時間処理した。The cloning vector pUC119
(Takara Shuzo Co., Ltd.) 5 μg was used with 30 units of the restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH
8.5), 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2
Cleavage was performed at 37 ° C. for 3 hours in the presence of 100 μg / ml of a mixture consisting of 1 mM and 1 mM DTT. In order to dephosphorylate the 5'end of the pUC119 cleavage solution, 1 unit of alkaline phosphatase (Takara Shuzo) was further added to the reaction solution and treated at 65 ° C for 2 hours.
【００４１】次に、前記のようにして得られた２種のＤ
ＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール／ク
ロロホルム（１／１）混合液を加えて処理した後、遠心
分離処理によって水相を分取した。次いで、この水相に
１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに２
倍量のエタノールを加えて遠心分離処理することによっ
てＤＮＡを沈澱させた後、減圧乾燥した。Next, the two types of D obtained as described above
The NA solution was mixed, and an equal amount of a phenol / chloroform (1/1) mixed solution was added to the mixed solution for treatment, and then the aqueous phase was separated by centrifugation. Then, to this aqueous phase was added 1/10 amount of 3M sodium acetate solution and further 2
The DNA was precipitated by adding twice the amount of ethanol and centrifuging, and then dried under reduced pressure.
【００４２】このＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶
解した後、６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６０μＭ
のＡＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ
４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）１００単位を用い、
１６℃で１６時間ライゲーションを行った。This DNA was treated with 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH
8.0) and 1 mM EDTA solution, and then 66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.
6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT and 660 μM
TTP in the presence of ATP (made by Boehringer Mannheim)
Using 4 units of 4DNA ligase (Takara Shuzo),
Ligation was performed at 16 ° C for 16 hours.
【００４３】次いで、これをケー・シゲサダ（Ｋ．Ｓｈ
ｉｇｅｓａｄａ）の方法［「細胞工学」第２巻、６１６
〜６２６ページ（１９８３年）］によりコンピテント細
胞としたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）
［Ｆ- 、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈ
ｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒk - 、ｍk + ）、ＳｕｐＥ４
４、ｒｅｌＡ１、λ- ］［「モレキュラル・クローニン
グ：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ）」５０４〜５０６ページ（１９８２年）］にトラン
スフォーメーションし、これをアンピシリン５０μｇ／
ｍｌ含有ＢＨＩ寒天培地にて、３７℃で一昼夜培養し、
約３００００株の形質転換微生物を得て、これを遺伝子
ライブラリーとした。Next, this is referred to as K. Sh.
igesada) [[Cell engineering] Volume 2, 616
Pp. 626 (1983)], the E. coli DH1 (ATCC33849)
[F − , recA1, endA1, gyrA96, th
i-1, hsdR17 (r k -, m k +), SupE4
4, relA1, λ -] [ "Morekyuraru Cloning: Cold Spring Harbor (Molecular
Cloning: Cold Spring Harbo
r) ”pp. 504-506 (1982)], and the amount of ampicillin 50 μg /
Incubate in BHI agar containing ml at 37 ° C for one day,
About 30,000 strains of transformed microorganisms were obtained and used as a gene library.
【００４４】実施例１ ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子含有ＤＮＡのスク
リーニング：参考例２で得た遺伝子ライブラリー、すな
わち平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上
に、ナイロンメンブレンフィルター［ハイボンド−Ｎ＋
（アマシャムジャパン社製）］を重ね、フィルター上に
該コロニー菌体の一部を移行させた後、このフィルター
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、１ｍＭのＩＰＴＧ含有
ＢＨＩ寒天培地上に菌体が上になるようにして置き、３
７℃で６時間培養した。Example 1 Screening of DNA containing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene: On the gene library obtained in Reference Example 2, that is, on ampicillin resistant colonies on plate agar medium, nylon membrane filter [HYBOND-N +] was used.
(Manufactured by Amersham Japan Co., Ltd.)] and a part of the colony cells are transferred onto the filter, and then the filter is placed on the ampicillin 50 μg / ml, 1 mM IPTG-containing BHI agar medium so that the cells are on top. Put it in 3
The cells were cultured at 7 ° C for 6 hours.
【００４５】そしてこのナイロンメンブレンを１００ｍ
Ｍのグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）で浸した濾紙
上に置き、５分間放置し、これをもう一度繰り返した。
次に、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で浸し
た濾紙上に置き、５分間放置した。これを３回繰り返し
た。And this nylon membrane is 100 m
It was placed on a filter paper soaked with M glycine-NaOH (pH 10.0), left for 5 minutes, and this was repeated once again.
Next, it was placed on a filter paper soaked with 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5) and left for 5 minutes. This was repeated 3 times.
【００４６】更に、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．５）、０．１％のリゾチーム（生化学工業社製）、
１ｍＭのＮＡＤ、５ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸、５単位
／ｍｌのジアフォラーゼ、０．０２５％のＮＢＴ及び
０．１％のトリトンＸ−１００から成る溶液を浸した濾
紙上に置き、発色（紫色）するコロニーを選択し、１株
の陽性株を得た。該コロニーを３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１−ｐＨＢＤ１と命名した。Furthermore, 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH
8.5), 0.1% lysozyme (manufactured by Seikagaku Corporation),
A solution consisting of 1 mM NAD, 5 mM 3-hydroxybutyric acid, 5 units / ml diaphorase, 0.025% NBT and 0.1% Triton X-100 is placed on the dipped filter paper to develop a color (purple). Colonies were selected and 1 positive strain was obtained. The colonies were transformed into E. coli transformants containing DNA encoding 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. col
It was named iDH1-pHBD1.
【００４７】実施例２ 組み換えプラスミドの抽出：上記実施例１で取得した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＨＢＤ１を、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養し
た後、ティー・マニアティスらの方法［「モレキュラル
・クローニング：コールド・スプリング・ハーバー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）」第８６〜９４ページ（１９８
２年）］により、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコー
ドするＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐＨＢＤ１を抽
出した。このプラスミドの構成を示す模式図を図４に示
した。Example 2 Extraction of recombinant plasmid: E. coli obtained in Example 1 above. coli DH1-pHBD1 with ampicillin 5
After culturing in a BHI medium containing 0 μg / ml at 37 ° C. for 24 hours, the method of T. Maniatis et al. [“Molecular Cloning: Cold Spring Harbor (M
olecular Cloning: Cold Spr
ing Harbor) "pp. 86-94 (198)
2 years)], a recombinant plasmid pHBD1 containing DNA encoding 3-hydroxybutyrate dehydrogenase was extracted. A schematic diagram showing the constitution of this plasmid is shown in FIG.
【００４８】該プラスミド中のアルカリゲネス・ファエ
カリスＩＦＯ−１３１１１染色体由来の部位をジデオキ
シ法［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」第２１４巻、
第１２０５〜１２１０ページ（１９８１年）］により、
塩基配列を決定し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコ
ードする全ＤＮＡが含まれていることを確認すると共
に、その全塩基配列を決定し、少なくとも図２にて示さ
れる配列を含むものであることを確認した。今回解析し
た３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素精製標品のＮ末端側ア
ミノ酸配列３０残基（図６）が完全に一致した。The site derived from the Alcaligenes faecalis IFO-13111 chromosome in the plasmid was determined by the dideoxy method ["Science", Vol.
1205--1210 (1981)],
The nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that the total DNA encoding 3-hydroxybutyrate dehydrogenase was contained, and at the same time, the total nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that it contains at least the sequence shown in FIG. confirmed. 30 residues of the amino acid sequence on the N-terminal side of the purified preparation of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase analyzed this time (FIG. 6) were completely in agreement.
【００４９】実施例３ 大腸菌内での３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性発
現：実施例２で得られたプラスミドｐＨＢＤ１の５μｇ
を制限酵素ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）それ
ぞれ１０単位を用い、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2
及び１ｍＭのＤＴＴから成る溶液５０μｇ／ｍｌで切断
し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を含む約１．
５ｋｂのＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル
電気泳動で分離回収した。Example 3 Expression of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity in E. coli: 5 μg of the plasmid pHBD1 obtained in Example 2
Using 10 units each of restriction enzymes NheI and EcoRI (manufactured by Takara Shuzo), 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH
7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2
And a solution consisting of 1 mM DTT at 50 μg / ml and containing the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene.
The 5 kb DNA fragment was separated and collected by 0.7% agarose gel electrophoresis.
【００５０】一方、Ｅ．ｃｏｌｉのベクタープラスミド
ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）５μｇを制限酵素ＸｂａＩ
及びＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用い、上記と同じ反応
溶液で切断し、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）存在下に、アルカリ性フォスファターゼ（宝酒造社
製）１単位を加え、６５℃で２時間処理した。On the other hand, E. E. coli vector plasmid pUC119 (manufactured by Takara Shuzo) was added with the restriction enzyme XbaI.
And EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and cleaved with the same reaction solution as described above, and 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.
0) In the presence, 1 unit of alkaline phosphatase (Takara Shuzo) was added, and the mixture was treated at 65 ° C. for 2 hours.
【００５１】次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、参考
例２と同様にライゲーション、トランスフォーメーショ
ンを行い、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ寒天
培地にまき、３７℃で一昼夜培養した。このようにし
て、ベクタープラスミドｐＵＣ１１９のＸｂａＩ及びＥ
ｃｏＲＩ部位に３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を
含む約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが挿入されたプ
ラスミドを得、これをプラスミドｐＨＢＤ２と命名し、
このプラスミドで常法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１
を形質転換して、形質転換微生物を取得した。Then, the above DNA solution was mixed, ligated and transformed in the same manner as in Reference Example 2, plated on BHI agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight. Thus, XbaI and E of vector plasmid pUC119
A plasmid in which a DNA fragment of about 1.5 kb containing the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene was inserted into the coRI site was obtained, which was designated as plasmid pHBD2.
With this plasmid, E. coli DH1
Was transformed to obtain a transformed microorganism.
【００５２】プラスミドｐＨＢＤ２を保持する形質転換
微生物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地に
て３７℃一昼夜培養した後、培養液を１５０００ｒｐｍ
で１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱
に、該培養液と同量の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）を加え、超音波破砕を行った。The transformed microorganism carrying the plasmid pHBD2 was cultured overnight at 37 ° C. in a BHI medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and then the culture solution was centrifuged at 15,000 rpm.
The precipitate was recovered by centrifugation for 1 minute. To this precipitate, the same amount of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.
0) was added and ultrasonic disruption was performed.
【００５３】この破砕液を適宜希釈した後、５μｌと
り、これに１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．５）５０μ
ｌ、５０ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸の１００μｌ、１０
ｍＭのＮＡＤの１００μｌ、０．２５％ニトロブルーテ
トラゾリウム ２０μｌ、１００単位／ｍｌのジアフォ
ラーゼ５０μｌ、１０％のトリトンＸ−１００を１０μ
ｌ及び水６７０μｌからなる反応液１０００μｌを加
え、３７℃で１０分間反応した後、０．１ＮのＨＣｌを
２ｍｌ加えて反応を停止し、５５０ｎｍにおける吸光度
を測定することによって、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素活性を定量した。After appropriately diluting the disrupted solution, 5 μl of the disrupted solution was added to 50 μl of 1M Tris-hydrochloric acid (pH 8.5).
l, 100 μl of 50 mM 3-hydroxybutyric acid, 10
100 μm mM NAD, 20 μl 0.25% nitroblue tetrazolium, 50 μl 100 units / ml diaphorase, 10 μl 10% Triton X-100.
After adding 1000 μl of a reaction solution consisting of 1 and 670 μl of water and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, 2 ml of 0.1N HCl was added to stop the reaction, and the absorbance at 550 nm was measured to dehydrogenate 3-hydroxybutyric acid. Enzyme activity was quantified.
【００５４】なお、比較のためにｐＵＣ１１９のみをト
ランスフォーメーションしたＥ．ｃｏｌｉの破砕液につ
いても前記と同様の処理を行い、３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素活性を測定した。For comparison, the E. coli strain in which only pUC119 was transformed was used. The same treatment as described above was performed on the disrupted liquid of E. coli, and the 3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity was measured.
【００５５】その結果、プラスミドｐＨＢＤ２を保持し
た形質転換微生物での活性は２２．４Ｕ／ｍｌであった
が、ｐＵＣ１１９を持つものの活性は検出できなかっ
た。これより、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性をも
つ形質転換体が得られていることが確認された。この形
質転換体をエッシェリヒア・コリー ＤＨ１−ｐＨＢＤ
２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＨ
ＢＤ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）と命名した。さ
らに得られた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を単離・精
製し、物理化学的性質を検討した結果は下記の通りであ
る。As a result, the activity of the transformed microorganism carrying the plasmid pHBD2 was 22.4 U / ml, but the activity of pUC119 was undetectable. From this, it was confirmed that a transformant having 3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity was obtained. This transformant was designated as Escherichia coli DH1-pHBD.
2 (Escherichia coli DH1-pH
BD2) (FERM BP-4749). The 3-hydroxybutyrate dehydrogenase thus obtained was isolated and purified, and the physicochemical properties were examined. The results are as follows.
【００５６】物理化学的性質： （１）酵素作用：基質として３−ヒドロキシ酪酸を用い
た酵素作用を以下に示す。Physicochemical properties: (1) Enzyme action: The enzyme action using 3-hydroxybutyric acid as a substrate is shown below.
【００５７】[0057]
【化６】 （２）基質特異性：３−ヒドロキシ酪酸に基質特異性を
示す。各種基質に対する特異性は表１の通りである。[Chemical 6] (2) Substrate specificity: Shows substrate specificity for 3-hydroxybutyric acid. The specificity for various substrates is shown in Table 1.
【００５８】[0058]
【表１】 [Table 1]
【００５９】（３）Ｋｍ値：１．６±０．５（ｍＭ）
（３−ヒドロキシ酪酸） ０．１２±０．００５（ｍＭ）（ＮＡＤ） （４）等電点：５．０±０．２（キャリアーアンフォラ
インを用いた電気泳動法にて） （５）分子量：６００００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−３
０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、３００００±５０
００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）(3) Km value: 1.6 ± 0.5 (mM)
(3-Hydroxybutyric acid) 0.12 ± 0.005 (mM) (NAD) (4) Isoelectric point: 5.0 ± 0.2 (by electrophoresis using carrier ampholine) (5) Molecular weight : 60000 ± 5000 (TSK G-3
Gel filtration with 000 SW), 30,000 ± 50
00 (by SDS polyacrylamide gel electrophoresis)
【００６０】（６）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜６．０の範
囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範
囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の
範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜
１１．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液を使用して、至適ｐＨを求めた。その結果、
至適ｐＨは８〜９にあった。(6) Optimum pH: 100 mM acetate buffer in the range of pH 5.0 to 6.0, 100 mM phosphate buffer in the range of pH 6.0 to 7.5, pH 7.5 to 9.0. The range is 100 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0-
For the range of 11.0, the optimum pH was determined using 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer. as a result,
The optimum pH was 8-9.
【００６１】（７）ｐＨ安定性：１００ｍＭの各種緩衝
液（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を３７
℃、６０分間処理し、その残存活性を求めた。ｐＨ４．
０〜５．０は１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０〜
６．０は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０は
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．
０は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した。その結果、ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も良好
な安定性を示した。(7) pH stability: 37 mM of various buffer solutions (3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1 U / ml) of 100 mM were used.
It was treated at 60 ° C. for 60 minutes and its residual activity was determined. pH 4.
0-5.0 is 100 mM citrate buffer, pH 5.0-
6.0 is 100 mM acetate buffer, pH 7.5-9.0 is 100 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0-11.
For 0, 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer was used. As a result, the best stability was shown in the pH range of 7.5 to 11.
【００６２】（８）至適温度：温度を２５℃〜６０℃の
範囲で変化させて至適温度を求めた結果、本酵素の至適
温度は４５〜５０℃であった。 （９）熱安定性：１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍ
ｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を測
定した結果、少なくとも３７℃まで安定であった。 （１０）金属イオンの影響：各種金属イオン（１ｍＭ）
の本酵素活性への影響について調べた結果は表２に示す
通りで、銅イオンによる強い阻害がみられた。(8) Optimum temperature: As a result of changing the temperature in the range of 25 ° C to 60 ° C to find the optimum temperature, the optimum temperature of this enzyme was 45 to 50 ° C. (9) Thermal stability: 100 mM Tris-HCl buffer (p
H8.5) (3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1 U / m
As a result of measuring the residual activity after heat treating l) for 10 minutes at each temperature, it was stable up to at least 37 ° C. (10) Effects of metal ions: Various metal ions (1 mM)
The results of examination of the effect of the enzyme on the activity of this enzyme are as shown in Table 2, and strong inhibition by copper ions was observed.
【００６３】[0063]
【表２】 [Table 2]
【００６４】（１１）ＥＤＴＡ、ＮａＮ3 の影響：ＥＤ
ＴＡ、ＮａＮ3 （１ｍＭ）の本酵素活性への阻害影響に
ついて調べた結果、影響はなかった。 上記のように発現蛋白の理化学的性質を確認し、３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素が発現されたことを確認した。(11) Effect of EDTA and NaN 3 : ED
As a result of examining the inhibitory effect of TA and NaN 3 (1 mM) on this enzyme activity, there was no effect. The physicochemical properties of the expressed protein were confirmed as described above, and it was confirmed that 3-hydroxybutyrate dehydrogenase was expressed.
【００６５】[0065]
【発明の効果】本発明によるとアルカリゲネス・ファエ
カリスＩＦＯ−１３１１１由来の染色体ＤＮＡライブラ
リーから、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を発現する遺
伝子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築され
た発現ベクターの組み換えプラスミドを例えばＥ．ｃｏ
ｌｉに属する微生物に導入することによって、得られた
形質転換微生物は効率よく３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を生産することができた。また、本発明によって、３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の全アミノ酸配列及びこの
アミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定で
きたので、該酵素の基質及び補酵素特異性の変換や耐熱
性の向上などのプロテインエンジニアリングが可能とな
った。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a gene DNA expressing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase is screened from a chromosomal DNA library derived from Alcaligenes faecalis IFO-13111, and an expression vector constructed using this is recombined. The plasmid is for example E. co
By introducing into a microorganism belonging to li, the obtained transformed microorganism was able to efficiently produce 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. Further, according to the present invention, 3
Since the entire amino acid sequence of hydroxybutyrate dehydrogenase and the nucleotide sequence of the gene DNA encoding this amino acid can be determined, protein engineering such as conversion of the substrate and coenzyme specificity of the enzyme and improvement of heat resistance is possible. became.
【００６６】配列番号：１ 配列の長さ：１５５１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アルカリゲネス・ファエカリス 株名：ＩＦＯ−１３１１１ 配列の名称：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子 配列 GCTAGCATGG GTTCTTGATT TATGGCAGAC ACCCTGTCCG CCACCTGGAA TTTTGAAAGC 60 CCTTGATTAT TCAAGGGCTT TTTTGTTTTC TGCTGCTTTG ACCGTCCTGC TCTTTCAGCA 120 TGATTTGTTT GCTGTTTTGT CACATAAGAA CGTTAAGGTA AAAGTGTCAG TAGCGGCCGA 180 TGTTCGGAAA ACTCATCCGC AACATTTTGT ATGGCCGCCT TTTCCCAGCG CAAGCCGAAG 240 TTTTAGGGGG TAATGCGCTA ATACGTGCTC CGATGGTGTT TGGCCTTGTT TTGCAAGCCT 300 TGATGATTCC GGACAAAACC AGCCCATTGC ATCTCCCGGC AGTGCGAGGC GACGAGTACA 360 CTTGGGGTTT CAGTTCTCTG TTGTCCATAC TCACGAGGTA TCT ATG CTG AAA GGT 415 Met Leu Lys Gly 1 AAA AAA GCG GTC GTA ACA GGA TCG ACC AGT GGT ATC GGT CTG GCC ATG 463 Lys Lys Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile Gly Leu Ala Met 5 10 15 20 GCC ACC GAG TTG GCA AAA GCT GGT GCA GAT GTG GTG ATC AAT GGT TTT 511 Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Asn Gly Phe 25 30 35 GGT CAG CCT GAA GAC ATC GAG CGC GAG CGC AGC ACG CTG GAG TCC AAG 559 Gly Gln Pro Glu Asp Ile Glu Arg Glu Arg Ser Thr Leu Glu Ser Lys 40 45 50 TTT GGT GTC AAA GCC TAT TAT CTG AAT GCA GAC CTG AGC GAT GCA CAG 607 Phe Gly Val Lys Ala Tyr Tyr Leu Asn Ala Asp Leu Ser Asp Ala Gln 55 60 65 GCC ACG CGC GAT TTT ATT GCC AAG GCG GCA GAG GCC CTC GGC GGT CTG 655 Ala Thr Arg Asp Phe Ile Ala Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Gly Leu 70 75 80 GAT ATT CTG GTC AAT AAT GCC GGT ATT CAA CAC ACC GCG CCT ATT GAA 703 Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr Ala Pro Ile Glu 85 90 95 100 GAG TTC CCG GTT GAT AAA TGG AAC GCC ATC ATT GCC CTG AAC CTG TCG 751 Glu Phe Pro Val Asp Lys Trp Asn Ala Ile Ile Ala Leu Asn Leu Ser 105 110 115 GCC GTA TTC CAC GGC ACC GCG GCG GCC TTG CCC ATC ATG CAA AAG CAG 799 Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Leu Pro Ile Met Gln Lys Gln 120 125 130 GGC TGG GGA CGC ATC ATC AAT ATC GCC TCG GCT CAC GGT CTG GTG GCC 847 Gly Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Val Ala 135 140 145 TCG GTG AAT AAG TCC GCT TAT GTG GCT GCC AAG CAC GGT GTG GTG GGG 895 Ser Val Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly 150 155 160 CTG ACC AAA GTG ACC GCG CTG GAA AAT GCT GGC AAG GGG ATT ACG TGC 943 Leu Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Asn Ala Gly Lys Gly Ile Thr Cys 165 170 175 180 AAC GCC ATC TGC CCG GGC TGG GTA CGT ACT CCC TTG GTG GAA AAA CAG 991 Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Arg Thr Pro Leu Val Glu Lys Gln 185 190 195 ATT GAA GCT ATC AGC CAG CAA AAA GGG ATT GAT ATT GAA GCC GCC GCT 1039 Ile Glu Ala Ile Ser Gln Gln Lys Gly Ile Asp Ile Glu Ala Ala Ala 200 205 210 CGC GAG CTG CTG GCT GAA AAA CAG CCC TCC CTG CAG TTC GTG ACT CCC 1087 Arg Glu Leu Leu Ala Glu Lys Gln Pro Ser Leu Gln Phe Val Thr Pro 215 220 225 GAG CAA TTG GGT GGT GCT GCT GTG TTC CTG TCC TCT GCC GCT GCA GAT 1135 Glu Gln Leu Gly Gly Ala Ala Val Phe Leu Ser Ser Ala Ala Ala Asp 230 235 240 CAA ATG ACA GGT ACG ACG CTA AGC CTG GAT GGC GGC TGG ACA GCA CGC 1183 Gln Met Thr Gly Thr Thr Leu Ser Leu Asp Gly Gly Trp Thr Ala Arg 245 250 255 260 TAATCGCTGT CAGAGCGTAT TGTGTAGATA ACAGATAAAG GGCTTGGCCC TTTGTCTGTT 1243 TGGATTGAAA GGATATAGGC GCATGTTGTT ATTGCTCTCG CCAGCCAAAA AGCTGGATTA 1303 CGATTCCCCT GTACGCACGG AGCTGGAGAC TCAGCCGCTG TTTGTGGAGC AGGCGCAAGG 1363 CTTGATTGAT ATTTTGCGCA CTCAGTCCGA AGAGGATATT GCTGGCTTGA TGAAGCTGAG 1423 CGACGATCTG GCGCGTTTGA ATGTCCAGCG TTACCAGGAG TGGGAGCCCA AGTTTGACCG 1483 CTCCAATGCG CGTCAGGCCA TTCTGGCGTT CAATGGCGAT GTGTATGAAG GCATGGCTGC 1543 CACGGATC 1551SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1551 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: genomic DNA Origin organism name: Alcaligenes faecalis Strain name: IFO- name of 13111 sequences: 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase gene sequences GCTAGCATGG GTTCTTGATT TATGGCAGAC ACCCTGTCCG CCACCTGGAA TTTTGAAAGC 60 CCTTGATTAT TCAAGGGCTT TTTTGTTTTC TGCTGCTTTG ACCGTCCTGC TCTTTCAGCA 120 TGATTTGTTT GCTGTTTTGT CACATAAGAA CGTTAAGGTA AAAGTGTCAG TAGCGGCCGA 180 TGTTCGGAAA ACTCATCCGC AACATTTTGT ATGGCCGCCT TTTCCCAGCG CAAGCCGAAG 240 TTTTAGGGGG TAATGCGCTA ATACGTGCTC CGATGGTGTT TGGCCTTGTT TTGCAAGCCT 300 TGATGATTCC GGACAAAACC AGCCCATTGC ATCTCCCGGC AGTGCGAGGC GACGAGTACA 360 CTTGGGGTTT CAGTTCTCTG TTGTCCATAC TCACGAGGTA TCT ATG CTG AAA GGT 415 Met Leu Lys Gly 1 AAA AAA GCG GTC GTA ACA GGA TCG ALC GGA TCG Aly GLA Tly Alys Gly Leu Ala Met 5 10 15 20 GCC ACC GAG TTG GCA AAA GCT GGT GCA GAT GTG GTG ATC AAT GGT TTT 511 Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Asn Gly Phe 25 30 35 GGT CAG CCT GAA GAC ATC GAG CGC GAG CGC AGC ACG CTG GAG TCC AAG 559 Gly Gln Pro Glu Asp Ile Glu Arg Glu Arg Ser Thr Leu Glu Ser Lys 40 45 50 TTT GGT GTC AAA GCC TAT TAT CTG AAT GCA GAC CTG AGC GAT GCA CAG 607 Phe Gly Val Lys Ala Tyr Tyr Leu Asn Ala Asp Leu Ser Asp Ala Gln 55 60 65 GCC ACG CGC GAT TTT ATT GCC AAG GCG GCA GAG GCC CTC GGC GGT CTG 655 Ala Thr Arg Asp Phe Ile Ala Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Gly Leu 70 75 80 GAT ATT CTG GTC AAT AAT GCC GGT ATT CAA CAC ACC GCG CCT ATT GAA 703 Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr Ala Pro Ile Glu 85 90 95 100 GAG TTC CCG GTT GAT AAA TGG AAC GCC ATC ATT GCC CTG AAC CTG TCG 751 Glu Phe Pro Val Asp Lys Trp Asn Ala Ile Ile Ala Leu Asn Leu Ser 105 110 115 GCC GTA TTC CAC GGC ACC GCG GCG GCC TTG CCC ATC ATG CAA AAG CAG 799 Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Leu Pro Ile Met Gln Lys Gln 120 125 130 GGC TGG GGA CGC ATC ATC AAT ATC GCC TCG GCT CAC GGT CTG GTG GCC 847 Gly Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Val Ala 135 140 145 TCG GTG AAT AAG TCC GCT TAT GTG GCT GCC AAG CAC GGT GTG GTG GGG 895 Ser Val Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly 150 155 160 CTG ACC AAA GTG ACC GCG CTG GAA AAT GCT GGC AAG GGG ATT ACG TGC 943 Leu Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Asn Ala Gly Lys Gly Ile Thr Cys 165 170 175 180 AAC GCC ATC TGC CCG GGC TGG GTA CGT ACT CCC TTG GTG GAA AAA CAG 991 Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Arg Thr Pro Leu Val Glu Lys Gln 185 190 195 ATT GAA GCT ATC AGC CAG CAA AAA GGG ATT GAT ATT GAA GCC GCC GCT 1039 Ile Glu Ala Ile Ser Gln Gln Lys Gly Ile Asp Ile Glu Ala Ala Ala 200 205 210 CGC GAG CTG CTG GCT GAA AAA CAG CCC TCC CTG CAG TTC GTG ACT CCC 1087 Arg Glu Leu Leu Ala Glu Lys Gln Pro Ser Leu Gln Phe Val Thr Pro 215 220 225 GAG CAA TTG GGT GGT GCT GCT GTG TTC CTG TCC TCT GCC GCT GCA GAT 1135 Glu Gln Leu Gly Gly Ala Ala Val Phe Leu Ser Ser Ala Ala Ala Asp 230 235 240 CAA ATG ACA GGT ACG ACG CTA AGC CTG GAT GGC GGC TGG ACA GCA CGC 1183 Gln Met Thr Gly Thr Thr Leu Ser Leu Asp Gly Gly Trp Thr Ala Arg 245 250 255 260 TAATCGCTGT CAGAGCGTAT TGTGTAGATA ACAG GGCTTGGCCC TTTGTCTGTT 1243 TGGATTGAAA GGATATAGGC GCATGTTGTT ATTGCTCTCG CCAGCCAAAA AGCTGGATTA 1303 CGATTCCCCT GTACGCACGG AGCTGGAGAC TCAGCCGCTG TTTGTGGAGC AGGCGCAAGG 1363 CTTGATTGAT ATTTTGCGCA CTCAGTCCGA AGAGGATATT GCTGGCTTGA TGAAGCTGAG 1423 CGACGATCTG GCGCGTTTGA ATGTCCAGCG TTACCAGGAG TGGGAGCCCA AGTTTGACCG 1483 CTCCAATGCG CGTCAGGCCA TTCTGGCGTT CAATGGCGAT GTGTATGAAG GCATGGCTGC 1543 CACGGATC 1551
【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：３０アミノ酸残基 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：アルカリゲネス・ファエカリス 株名：ＩＦＯ−１３１１１ 配列の名称：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素Ｎ末端アミ
ノ酸 配列 Met Leu Lys Gly Lys Lys Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Leu Ala Met Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp 20 25 30SEQ ID NO: 2 Sequence length: 30 amino acid residues Sequence type: amino acid Sequence type: peptide Origin organism name: Alcaligenes faecalis Strain name: IFO-13111 Sequence name: 3-hydroxybutyrate dehydrogenase N-terminal amino acid sequence Met Leu Lys Gly Lys Lys Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Leu Ala Met Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp 20 25 30
【図１】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列
を示す図である。FIG. 1 shows the amino acid sequence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase.
【図２】図１のアミノ酸をコードする３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the base sequence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene DNA encoding the amino acid of FIG.
【図３】プラスミドｐＨＢＤ２におけるアルカリゲネス
・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１由来の染色体ＤＮＡ
の制限酵素地図である。FIG. 3: Chromosomal DNA from Alcaligenes faecalis IFO-13111 in plasmid pHBD2
Is a restriction enzyme map of.
【図４】プラスミドｐＨＢＤ１の構造を示す模式図であ
る。FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pHBD1.
【図５】プラスミドｐＨＢＤ２の構造を示す模式図であ
る。FIG. 5 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pHBD2.
【図６】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素精製標品のＮ末
端側アミノ酸配列を示す図である。FIG. 6 is a view showing an amino acid sequence on the N-terminal side of a purified preparation of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase.
【図７】本発明で用いた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
遺伝子発現プラスミドの構築の流れを示す模式図であ
る。FIG. 7 is a schematic diagram showing the flow of construction of a 3-hydroxybutyrate dehydrogenase gene expression plasmid used in the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/04 C12R 1:19)
Claims (10)
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質的にな
るＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形質転換
された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する実質上
純粋な微生物。1. A 3-hydroxybutyrate dehydrogenase transformed by a recombinant plasmid carrying a DNA consisting essentially of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by 1-260 shown in SEQ ID NO: 1. A substantially pure microorganism that produces.
物である請求項１記載の微生物。2. The microorganism according to claim 1, which is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
ラスミドｐＨＢＤ２によって形質転換されたものである
請求項２記載の微生物。3. The microorganism according to claim 2, wherein the microorganism belonging to the genus Escherichia is transformed with the plasmid pHBD2.
された微生物が、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＨ
ＢＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）である請求項３記
載の微生物。4. A microorganism transformed with the plasmid pHBD2 is Escherichia coli DH1-pH.
The microorganism according to claim 3, which is BD2 (FERM BP-4749).
酸配列をコードする塩基配列から実質的になるＤＮＡ。5. A DNA consisting essentially of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase.
求項６記載のＤＮＡ。7. The base sequence is: The DNA according to claim 6, which is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by:
的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物
から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特
徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。8. The following amino acid sequence: A substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase transformed with a recombinant plasmid carrying a DNA consisting essentially of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by A method for producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, which comprises collecting 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from the culture.
ＨＢＤ２によって形質転換された微生物である請求項８
記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。9. The transformed microorganism is the plasmid p.
A microorganism transformed by HBD2.
A method for producing the described 3-hydroxybutyrate dehydrogenase.
換された微生物が、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐ
ＨＢＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）である請求項９
記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。10. A microorganism transformed with the plasmid pHBD2 is Escherichia coli DH1-p.
HBD2 (FERM BP-4749).
A method for producing the described 3-hydroxybutyrate dehydrogenase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20838794A JP3578415B2 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20838794A JP3578415B2 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870856A true JPH0870856A (en) | 1996-03-19 |
| JP3578415B2 JP3578415B2 (en) | 2004-10-20 |
Family
ID=16555427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20838794A Expired - Fee Related JP3578415B2 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Substantially pure microorganism producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3578415B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0957171A2 (en) * | 1998-04-08 | 1999-11-17 | Roche Diagnostics GmbH | Recombinant microbial 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase,process for their preparation and use |
| US10508267B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-12-17 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from alcaligenes faecalis as well as methods and uses involving the same |
| US10704029B2 (en) | 2016-02-09 | 2020-07-07 | Roche Diabetes Care, Inc. | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides as well as methods and uses involving the same |
-
1994
- 1994-09-01 JP JP20838794A patent/JP3578415B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0957171A2 (en) * | 1998-04-08 | 1999-11-17 | Roche Diagnostics GmbH | Recombinant microbial 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase,process for their preparation and use |
| EP0957171A3 (en) * | 1998-04-08 | 2001-09-12 | Roche Diagnostics GmbH | Recombinant microbial 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase,process for their preparation and use |
| US10508267B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-12-17 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from alcaligenes faecalis as well as methods and uses involving the same |
| US10704029B2 (en) | 2016-02-09 | 2020-07-07 | Roche Diabetes Care, Inc. | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides as well as methods and uses involving the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3578415B2 (en) | 2004-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4348563B2 (en) | Modified flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase | |
| WO2010053161A1 (en) | Modified flavin-adenine-dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase | |
| JP5408125B2 (en) | Filamentous flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH) | |
| US5137821A (en) | Gene and process of making glucose-6-phosphate dehydrogenase | |
| JP3251976B2 (en) | Substantially pure microorganism producing myo-inositol dehydrogenase | |
| JPWO2003091430A1 (en) | Glucose dehydrogenase β subunit and DNA encoding the same | |
| JPH0880196A (en) | Dna fragment containing tannase gene, novel recombinant plasmid, production of tannase and promotor | |
| JPH09154581A (en) | Substantially pure microorganism capable of producing uricase | |
| JPH0870856A (en) | Substantially pure microorganism capable of producing 3-hydroxybutyrate dehydrogenase | |
| JP2016208916A (en) | Mutant protein having flavine adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase activity | |
| JP4036667B2 (en) | Novel glucose dehydrogenase and gene encoding the same | |
| JP2000135079A (en) | 1,5-anhydroglucitol dehydrogenase | |
| JP2942564B2 (en) | DNA having genetic information of lactate oxidase and use thereof | |
| JP3132618B2 (en) | Stabilized modified protein | |
| JP2729045B2 (en) | Sarcosine oxidase and method for producing the same | |
| JP3201483B2 (en) | Substantially pure microorganism producing 3α-hydroxysteroid dehydrogenase | |
| JP3775873B2 (en) | A substantially pure microorganism producing fructosylamine oxidase | |
| JP2706223B2 (en) | Use of DNA having genetic information of pyruvate oxidase | |
| JP2009165417A (en) | New hydrogen peroxide-forming type nadh oxidase and dna encoding the same | |
| JP2593481B2 (en) | DNA having genetic information of sarcosine oxidase and use thereof | |
| US7618800B2 (en) | Glycerol kinase, which has high resistance against preservative | |
| JP3424939B2 (en) | Substantially pure microorganisms producing monoglyceride lipase | |
| JPH10248572A (en) | Modified sarcosine oxidase and its use | |
| JP3743535B2 (en) | Modified sarcosine oxidase | |
| US20050214917A1 (en) | Thermo-stable lactate oxidase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031224 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040204 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040204 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040707 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040712 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100723 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110723 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110723 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120723 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130723 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |