JPH0862220A - Highly sensitive measuring method and apparatus for sugar and polyoles - Google Patents
Highly sensitive measuring method and apparatus for sugar and polyolesInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、糖・ポリオール類の高
感度測定方法及び測定装置に関し、更に詳しくは、Ｄ−
カイロイノシトールの高感度測定方法及び測定装置に関
する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a high-sensitivity measuring method and measuring apparatus for sugars and polyols, more specifically, D-
The present invention relates to a method and apparatus for measuring chiro-inositol with high sensitivity.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、Ｄ−カイロイノシトールが糖尿病
の状態の診断に有用であるとの報告がなされている。特
にII型糖尿病におけるインスリン抵抗性の指標になると
考えられている（Larner J.et al,New Eng.J.Med.,323,
373-378(1990)等）。又、特開平4-505218号、特開平4-5
04001号では糖尿病の診断に体液(血液、尿)中のＤ−カ
イロイノシトールの測定が有用であることが示されてい
る。2. Description of the Related Art Recently, it has been reported that D-chiro-inositol is useful for diagnosing a diabetic condition. In particular, it is considered to be an index of insulin resistance in type II diabetes (Larner J. et al, New Eng. J. Med., 323,
373-378 (1990) etc.). In addition, JP-A-4-505218 and JP-A-4-5
No. 04001 shows that the measurement of D-chiro-inositol in body fluids (blood, urine) is useful for the diagnosis of diabetes.
【０００３】Ｄ−カイロイノシトールの測定方法として
はこれまでにGC-Massによる測定方法が提案されている
が、GC-Massによる測定は複雑な前処理が必要で、しか
も操作が煩雑であるために、多数の検体を処理すること
が困難であるばかりでなく、自動化も難しく、さらに極
めて高価なGC-Massの装置が必要であり、検査コストが
著しく高くなるという問題があった。As a method of measuring D-chiro-inositol, a method of measuring by GC-Mass has been proposed so far, but the method of measuring by GC-Mass requires complicated pretreatment and is complicated in operation. However, not only is it difficult to process a large number of specimens, but automation is also difficult, and an extremely expensive GC-Mass device is required, resulting in a significant increase in inspection cost.
【０００４】一方、液体クロマトグラフィによる糖類の
測定については様々な報告がなされている。この中には
ミオイノシトールを測定する方法も含まれるが、Ｄ−カ
イロイノシトールを測定する方法は報告されていない。
血液、尿、筋あるいは肝組織など生体試料中のＤ−カイ
ロイノシトールはミオイノシトールよりもその含有量が
少ない。このため、Ｄ−カイロイノシトールを測定する
には、試料の濃縮操作が必要であることが判明した。例
えば、健常者の尿中のＤ−カイロイノシトール含有量
は、１〜数μg/mlである。また、健常者の１日の尿中Ｄ
−カイロイノシトール排出量が平均80μmol/dayであ
り、II型糖尿病患者においては、平均約40μmol/dayに
なるとの報告もなされている。従って、そのような試料
の濃縮操作は煩雑であるばかりでなく、測定精度も悪化
させるという問題があった。On the other hand, various reports have been made on the measurement of sugars by liquid chromatography. Although a method for measuring myo-inositol is also included therein, a method for measuring D-chiro-inositol has not been reported.
The content of D-chiro-inositol in a biological sample such as blood, urine, muscle or liver tissue is lower than that of myo-inositol. Therefore, it was found that the concentration operation of the sample was necessary to measure D-chiro-inositol. For example, the D-chiro-inositol content in urine of a healthy person is 1 to several μg / ml. In addition, daily urine D of healthy subjects
-It is also reported that chiro-inositol excretion amount is 80 μmol / day on average, and that it is about 40 μmol / day on average in type II diabetic patients. Therefore, there is a problem that such a concentration operation of the sample is not only complicated but also the measurement accuracy is deteriorated.
【０００５】イノシトールなどのポリオール類はＵＶ領
域に吸収を持たないため、液体クロマトグラフィで通常
良く用いられているＵＶによる検出方法は利用できな
い。そのため、下記の文献ではポストカラム発蛍光法に
よる糖類測定が提案されている。Anal.Chem.1980,52,10
79-1082、J.liquid Chromatography,14(10),1929-1938
(1991)、Analyst,118,769-771(1993)等。Since polyols such as inositol have no absorption in the UV region, the UV detection method that is usually used in liquid chromatography cannot be used. Therefore, the following literature proposes the saccharide measurement by the post-column fluorescence method. Anal.Chem.1980,52,10
79-1082, J. liquid Chromatography, 14 (10), 1929-1938
(1991), Analyst, 118, 769-771 (1993), etc.
【０００６】これらの方法は検出器に示差屈折計を用い
た方法と比較すると感度は高くなっているが、微量の糖
・ポリオール類を測定するにはまだ感度不足であった。
特に、糖尿病の診断への有用性が報告されているミオイ
ノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ソルビトールな
どは血液あるいは尿などの生体試料中の含有量も低く、
濃縮操作なしに測定することは困難であった。特にＤ−
カイロイノシトールは尿中におよそ0.1〜数μg／mlとい
う極めて低い濃度しか含まれていない。この方法で測定
する場合、100倍以上に濃縮する必要がある。しかしな
がら、このような濃縮は、濃縮のバラツキによって測定
精度を低下させるばかりでなく、測定に無関係な成分も
濃縮されるためこれらが測定を妨害するという問題があ
った。Although these methods have higher sensitivity than methods using a differential refractometer as a detector, they are still insufficient in sensitivity for measuring a very small amount of sugar / polyols.
In particular, myo-inositol, D-chiro-inositol, sorbitol, etc., which have been reported to be useful for the diagnosis of diabetes, have a low content in biological samples such as blood or urine,
It was difficult to measure without concentration operation. Especially D-
Chiro-inositol is contained in urine at an extremely low concentration of about 0.1 to several μg / ml. When measuring by this method, it is necessary to concentrate 100 times or more. However, such concentration not only lowers the measurement accuracy due to variations in concentration, but also causes a problem that these components interfere with the measurement because components irrelevant to the measurement are also concentrated.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、複雑な濃縮
操作なしに高感度に糖・ポリオール類を測定する方法を
提供することを目的としている。また、本発明は、高価
な装置を用いることなく、簡便に糖・ポリオール類の高
感度測定方法及び測定装置を提供することを目的とす
る。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for measuring sugar / polyols with high sensitivity without complicated concentration operation. Another object of the present invention is to provide a high-sensitivity measuring method and measuring apparatus for sugars / polyols easily without using an expensive apparatus.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は以下
の構成により達成される。The above object of the present invention can be achieved by the following constitutions.
【０００９】１） 被検体に含まれる糖・ポリオール類
を、該糖・ポリオール類と親和性を有するカラムに吸着
して濃縮し、次いで吸着した糖・ポリオール類を溶出さ
せ、かつ硼酸と接触させてアニオン性錯イオンを形成
し、該糖・ポリオール類のアニオン性錯イオンは強アニ
オン交換カラムに対する吸着力の差により、測定目的の
糖・ポリオール類と他の糖・ポリオール類とに分離し、
分離した糖・ポリオール類を蛍光物質に変化する試薬と
反応させて、生じた蛍光物質を測定して液体試料中の微
量の糖・ポリオール類を測定することを特徴とする糖・
ポリオール類の高感度測定方法。1) The sugar / polyol contained in the analyte is adsorbed and concentrated on a column having an affinity for the sugar / polyol, and then the adsorbed sugar / polyol is eluted and brought into contact with boric acid. To form an anionic complex ion, and the anionic complex ion of the sugar / polyol is separated into the sugar / polyol to be measured and other sugar / polyols due to the difference in adsorption force to the strong anion exchange column,
Characterized by reacting the separated sugar / polyols with a reagent that changes to a fluorescent substance and measuring the generated fluorescent substance to measure a very small amount of sugar / polyols in a liquid sample.
A highly sensitive method for measuring polyols.
【００１０】２） 前記糖・ポリオール類と親和性を有
するカラムがm-アミノフェニルホウ酸を固定化したカラ
ムであることを特徴とする前記１記載の測定方法。2) The measuring method as described in 1 above, wherein the column having an affinity with the sugar / polyol is a column on which m-aminophenylboric acid is immobilized.
【００１１】３） 前記フェニルホウ酸カラムから糖・
ポリオール類を溶出させる際の溶媒が0.1〜1.0Ｍの硼酸
を含有する緩衝液であることを特徴とする前記２記載の
測定方法。3) Sugars from the phenylboric acid column
3. The measuring method according to 2 above, wherein the solvent for eluting the polyols is a buffer solution containing 0.1 to 1.0 M boric acid.
【００１２】４） 前記糖・ポリオール類を蛍光物質に
変化させる試薬が過ヨウ素酸及びアルデヒドの存在下で
蛍光物質に変化する試薬であることを特徴とする前記１
記載の測定方法。4) The reagent which converts the sugar / polyol into a fluorescent substance is a reagent which changes into a fluorescent substance in the presence of periodate and aldehyde.
The measurement method described.
【００１３】５） 前記アルデヒドの存在下で蛍光物質
に変化する試薬がグアニジノ化合物であることを特徴と
する前記１記載の測定方法。5) The measuring method according to 1 above, wherein the reagent that changes into a fluorescent substance in the presence of the aldehyde is a guanidino compound.
【００１４】６） 測定対象の糖・ポリオール類がＤ−
カイロイノシトールであることを特徴とする前記１〜５
のいずれか１項に記載の測定方法。6) The sugar / polyol to be measured is D-
1 to 5 which is chiro-inositol
The measuring method according to any one of 1.
【００１５】７） 被検体がイノシトール異性体を含む
ことを特徴とする前記６記載のＤ−カイロイノシトール
の測定方法。7) The method for measuring D-chiro-inositol as described in 6 above, wherein the analyte contains an inositol isomer.
【００１６】８） 被検体に含まれる糖・ポリオール類
を吸着する濃縮カラム、糖・ポリオール類の硼酸を含む
アニオン性錯イオンを分離する強アニオン交換カラム、
分離した糖・ポリオール類を過ヨウ素酸及びアルデヒド
の存在下で蛍光物質に変化する試薬と反応させる反応
槽、反応液を冷却する冷却槽及び生じた蛍光物質を測定
する蛍光検出器から構成される糖・ポリオール類の測定
装置。8) A concentration column for adsorbing sugars / polyols contained in the sample, a strong anion exchange column for separating anionic complex ions containing boric acid of sugars / polyols,
Consists of a reaction tank that reacts the separated sugars and polyols with a reagent that changes to a fluorescent substance in the presence of periodate and aldehyde, a cooling tank that cools the reaction liquid, and a fluorescence detector that measures the generated fluorescent substance. Measuring device for sugars and polyols.
【００１７】９） 各被検体ごとに蛍光検出器で検出さ
れた蛍光のピーク面積の合計あるいはピーク高の合計を
算出し、これが、あらかじめ確認された濃縮カラムの糖
・ポリオール類の全結合容量に相当するピーク面積ある
いはピーク高に対し一定以上を超えた場合に、警告を発
する機能を有することを特徴とする前記８記載の糖・ポ
リオール類の測定装置。9) The total peak area or the total peak height of the fluorescence detected by the fluorescence detector is calculated for each analyte, and this is used as the total binding capacity of sugar / polyols of the concentration column confirmed in advance. 9. The sugar / polyol measuring apparatus as described in 8 above, which has a function of issuing a warning when the peak area or peak height exceeds a certain level.
【００１８】本発明の、糖・ポリオール類の測定方法に
おいて、被検体は除蛋白されかつpＨが７〜９に維持さ
れていることが好ましく、更に、該除蛋白方法が検体に
水溶性亜鉛塩とアルカリ金属の水酸化物を加え、生成し
た沈殿物を除去する方法がより好ましい。In the method for measuring sugars / polyols according to the present invention, it is preferable that the analyte is deproteinized and the pH is maintained at 7 to 9. Further, the deproteinization method is a water-soluble zinc salt for the analyte. More preferable is a method of adding a hydroxide of an alkali metal and removing the formed precipitate.
【００１９】また、フェニルホウ酸カラムに糖・ポリオ
ール類を吸着させ、かつ未吸着成分を排出する際の溶媒
のpＨが７〜９であることが好ましい。Further, the pH of the solvent when adsorbing the sugar / polyols on the phenylboric acid column and discharging the unadsorbed components is preferably 7-9.
【００２０】本発明の測定対象となる糖・ポリオール類
としては、ミオイノシトール（MI），Ｄ−カイロイノシ
トール（ＤＣＩ），Scyllo-イノシトールなどのイノシ
トールの異性体、ソルビトール、グルコース、ガラクト
ースなどの糖、糖アルコール、オリゴ糖、ポリオールで
シスジオールを有するものが挙げられる。The sugars / polyols to be measured in the present invention include isomers of inositol such as myo-inositol (MI), D-chiro-inositol (DCI), Scyllo-inositol, sugars such as sorbitol, glucose and galactose, Examples include sugar alcohols, oligosaccharides, and polyols having cis diol.
【００２１】本発明の糖・ポリオール類を吸着させるカ
ラムは、被検体中の糖・ポリオール類を濃縮する役割が
ある。これらは、糖・ポリオール類に親和性を有するカ
ラムであり、m-アミノフェニル硼酸を固定化したカラム
（以下フェニル硼酸カラムとする）が好ましく用いられ
る。この方法は硼酸が弱アルカリ条件下で糖あるいはポ
リオール分子中のシス・ジオール基と可逆的な結合体を
作ることを利用した方法である。本発明の濃縮用カラム
として用いられるフェニル硼酸カラムの糖・ポリオール
類の結合容量は検出系の感度と被検体中に含まれるフェ
ニル硼酸カラムに結合可能な糖・ポリオール類の全量と
その中の測定対象の糖・ポリオール類の量比によって決
定される。被検体中に測定対象の糖・ポリオール類のみ
が含まれる場合は、検出感度だけを考慮すればよいが、
測定対象の糖・ポリオール類以外にその他の糖・ポリオ
ール類が含まれる試料の場合は、その分フェニル硼酸カ
ラムの結合容量を増加させる必要がある。一方で、フェ
ニル硼酸カラム中の液体試料の容量が増えると、次の分
離工程に送られる試料の容量が増加するため、分離工程
での隣接する糖・ポリオール類の分離が悪くなるなどの
問題が生じる。例えば、ミオイノシトールとその異性体
であるＤ−カイロイノシトールの分離が悪化するためフ
ェニル硼酸カラムは必要最小限の容量であることが好ま
しい。市販のフェニル硼酸カラムへの糖・ポリオール類
の結合容量はソルビトールの結合容量で示されており、
本発明の測定方法では５μmol〜100μmol好ましくは10
〜40μmolのソルビトールが結合できる容量のフェニル
硼酸カラムを用いることが望ましい。The column for adsorbing sugars / polyols of the present invention has a role of concentrating sugars / polyols in a sample. These are columns having an affinity for sugars / polyols, and columns in which m-aminophenylboric acid is immobilized (hereinafter referred to as phenylboric acid columns) are preferably used. This method utilizes boric acid to form a reversible conjugate with a cis-diol group in a sugar or polyol molecule under weak alkaline conditions. The binding capacity of the sugar / polyols of the phenylboric acid column used as the concentration column of the present invention is the sensitivity of the detection system and the total amount of the sugar / polyols capable of binding to the phenylboric acid column contained in the analyte and the measurement therein. It is determined by the target sugar / polyol amount ratio. When the analyte contains only sugars / polyols to be measured, it is sufficient to consider only the detection sensitivity.
In the case of a sample containing other sugars / polyols in addition to the sugar / polyols to be measured, it is necessary to increase the binding capacity of the phenylboric acid column accordingly. On the other hand, when the volume of the liquid sample in the phenylboronic acid column increases, the volume of the sample sent to the next separation step increases, which causes problems such as poor separation of adjacent sugars / polyols in the separation step. Occurs. For example, since the separation of myo-inositol and its isomer, D-chiro-inositol, deteriorates, it is preferable that the phenylboric acid column has a necessary minimum capacity. The binding capacity of sugars and polyols to a commercially available phenylboric acid column is shown by the binding capacity of sorbitol,
In the measuring method of the present invention, 5 μmol to 100 μmol, preferably 10 μmol
It is desirable to use a phenylboric acid column with a capacity capable of binding ~ 40 μmol sorbitol.
【００２２】測定する際には、まず一定量の除蛋白され
た被検体をフェニル硼酸カラムへ供給し、糖・ポリオー
ル類を吸着させる。濃縮カラムに糖類の結合容量以上の
糖・ポリオール類が供給されると結合できない糖・ポリ
オール類は排出されてしまい正確な測定ができなくな
る。そのため、本測定装置には、許容量以上の糖・ポリ
オール類が供給された場合に警告を発する機能があるこ
とが好ましい。すなわち、あらかじめ確認しておいた濃
縮カラムの糖・ポリオール類の結合可能容量に相当する
ピーク面積又はピーク高に対し、各測定ごとに蛍光検出
器で検出された蛍光の全ピーク面積の合計あるいは全ピ
ーク高の合計を算出し、これが一定以上を超えた場合
に、濃縮カラムの糖・ポリオール類の結合可能容量以上
の試料がカラムに供給されたとの警告を発する機能を有
することが好ましく、もし結合可能容量以上の試料がカ
ラムに供給された場合は、試料量を減らすか、カラム容
量を増やすなどの調整をすることによって糖・ポリオー
ル類の正確な測定を行なうことができるのである。In the measurement, first, a certain amount of deproteinized analyte is supplied to a phenylboric acid column to adsorb sugars and polyols. When sugar / polyols exceeding the binding capacity of sugars are supplied to the concentration column, sugars / polyols that cannot be bonded are discharged, and accurate measurement cannot be performed. Therefore, it is preferable that the present measuring device has a function of issuing a warning when the sugar / polyols exceeding the allowable amount are supplied. That is, with respect to the peak area or peak height corresponding to the binding capacity of sugar / polyols of the concentration column that was confirmed in advance, the total or total peak area of fluorescence detected by the fluorescence detector for each measurement was calculated. It is preferable to have a function to calculate the total peak height, and when it exceeds a certain level, give a warning that a sample exceeding the binding capacity of sugar / polyols in the concentration column has been supplied to the column. When a sample having a volume larger than the possible volume is supplied to the column, the sugar / polyol can be accurately measured by adjusting the volume of the sample or decreasing the volume of the column.
【００２３】糖・ポリオール類を濃縮カラムに吸着させ
る際は、被検体及びその吸着液は、pＨ７〜９が好まし
く、pＨ８〜8.5であることがより好ましい。硼酸を含ま
なければ緩衝剤としては特に限定されないが、10〜50mM
HEPES-NaOH pＨ８〜8.5、10〜100mMトリス-HCl pＨ８
〜8.5、10〜100mMリン酸緩衝液などが好ましい。この濃
縮カラムに吸着しない成分は次の分離用カラムとの間に
設けられた切り替えバルブによって測定系外に排出され
る。次に吸着した被検体中の糖・ポリオール類は前記の
バルブを切り替えて分離用カラムに送られる。その際の
溶出液は0.1〜1.0Ｍの硼酸を含有することが好ましい。
又、溶出液のpＨは５〜６であることが望ましい。溶出
した糖・ポリオール類は溶出液又は溶離液中の硼酸とア
ニオン性錯イオンを形成する。これを分離用の強アニオ
ン交換カラムで分離する。When the sugar / polyol is adsorbed on the concentration column, the analyte and its adsorbed liquid preferably have a pH of 7 to 9, more preferably a pH of 8 to 8.5. The buffer is not particularly limited as long as it does not contain boric acid, but 10 to 50 mM
HEPES-NaOH pH8-8.5, 10-100 mM Tris-HCl pH8
.About.8.5, 10 to 100 mM phosphate buffer and the like are preferable. The components not adsorbed on the concentration column are discharged to the outside of the measurement system by a switching valve provided between the column and the separation column. Next, the adsorbed sugar / polyols in the specimen are sent to the separation column by switching the valve. The eluate at that time preferably contains 0.1 to 1.0 M boric acid.
The pH of the eluate is preferably 5-6. The eluted sugar / polyols form an anionic complex ion with boric acid in the eluent or the eluent. This is separated by a strong anion exchange column for separation.
【００２４】分離用の強アニオン交換カラムとしては市
販されているカラムを利用することができ、TSK gel Su
gar AXG(東ソー株製)などが好ましく用いられる。A commercially available column can be used as the strong anion exchange column for separation.
Gar AXG (manufactured by Tosoh Corporation) and the like are preferably used.
【００２５】強アニオン交換カラムは60〜80℃の一定の
温度に保たれていることが好ましい。温度が高いほど隣
接ピークの分離能が向上する。強アニオン交換カラムの
溶離液は0.6〜1.0Ｍ 硼酸緩衝液 が用いられ、pＨ7.0〜
8.5の範囲が好ましく用いられる。又、強アニオン交換
カラムの流速は0.2〜0.4ml／minの範囲が好ましい。The strong anion exchange column is preferably maintained at a constant temperature of 60-80 ° C. The higher the temperature, the better the resolution of adjacent peaks. The eluent of the strong anion exchange column is 0.6 to 1.0M borate buffer, and the eluent is pH 7.0 to
The range of 8.5 is preferably used. The flow rate of the strong anion exchange column is preferably in the range of 0.2 to 0.4 ml / min.
【００２６】強アニオン交換カラムで分離された試料は
反応液と混合され反応槽内で加熱されて蛍光物質に変化
する。この反応液には過ヨウ素酸及びアルデヒドと反応
して蛍光を発する試薬が好ましく用いられる。これはカ
ラムによって分離された試料と反応液と混合し、リアク
タ内で加熱し反応させて糖・ポリオール類の存在によっ
て生じる蛍光のピークを検出する方法である。アルデヒ
ドと反応して蛍光を発する試薬としては、塩酸グアニジ
ン、酢酸グアニジンなどのグアニジノ化合物、2-シアノ
アセトアミドなどが用いられ、特に塩酸グアニジン、酢
酸グアニジンなどのグアニジノ化合物が好ましく用いら
れる。これらの試薬は、反応液に含まれる過ヨウ素酸と
糖・ポリオール類との反応によって生じたアルデヒドと
反応し蛍光物質に変化する。The sample separated by the strong anion exchange column is mixed with the reaction solution and heated in the reaction tank to change into a fluorescent substance. For this reaction solution, a reagent that emits fluorescence by reacting with periodate and aldehyde is preferably used. This is a method in which a sample separated by a column is mixed with a reaction solution, heated in a reactor and reacted to detect a fluorescence peak generated by the presence of sugars and polyols. As a reagent that reacts with an aldehyde and emits fluorescence, a guanidino compound such as guanidine hydrochloride or guanidine acetate, 2-cyanoacetamide, or the like is used, and particularly, a guanidino compound such as guanidine hydrochloride or guanidine acetate is preferably used. These reagents react with the aldehyde generated by the reaction of periodate and sugar / polyol contained in the reaction solution, and change into a fluorescent substance.
【００２７】発色液にこれらの化合物を含有させる場
合、反応液中の塩酸グアニジンは好ましくは25〜100m
M、酢酸グアニジンは10〜30mMが好ましい。又、酢酸グ
アニジンは溶解しにくいため、一度、反応液に含有させ
る緩衝液の酸性成分を添加し、酸性条件下で酢酸グアニ
ジンを添加溶解させて、その後目的のpＨに調整すると
よい。反応液の緩衝剤としてはリン酸、硼酸などが好ま
しく用いられる。発色液のpＨは６〜９が好ましい。When the color developing solution contains these compounds, the guanidine hydrochloride in the reaction solution is preferably 25 to 100 m.
M and guanidine acetate are preferably 10 to 30 mM. Since guanidine acetate is difficult to dissolve, it is advisable to once add the acidic component of the buffer solution to be contained in the reaction solution, add and dissolve guanidine acetate under acidic conditions, and then adjust to the target pH. Phosphoric acid, boric acid and the like are preferably used as the buffer for the reaction solution. The pH of the color developing solution is preferably 6-9.
【００２８】又、測定対象がポリオール類である場合は
発色液中に過ヨウ素酸を含有させる必要がある。この場
合、過ヨウ素酸は１〜20mMの濃度で含有していることが
好ましい。過ヨウ素酸はナトリウム塩などが好ましく用
いられる。When the object to be measured is a polyol, it is necessary to add periodic acid to the color developing solution. In this case, periodate is preferably contained at a concentration of 1 to 20 mM. Periodic acid is preferably a sodium salt or the like.
【００２９】発色液と混合された試料は反応槽内で加熱
反応させて蛍光物質に変えられる。反応槽内部の反応管
は、直径0.5〜1.2mm×長さ10〜20mのステンレスチュー
ブをコイル状にしたものが好ましい。テフロン製の反応
管ではノイズが多く、S/N比を低下させてしまうので好
ましくない。又、反応槽温度は130℃〜160℃であること
が好ましく、特に150℃が好ましい。The sample mixed with the color-developing solution is heated and reacted in the reaction tank to be converted into a fluorescent substance. The reaction tube inside the reaction tank is preferably a stainless steel tube having a diameter of 0.5 to 1.2 mm and a length of 10 to 20 m, which is coiled. The Teflon reaction tube is not preferable because it causes a lot of noise and reduces the S / N ratio. The reaction tank temperature is preferably 130 ° C to 160 ° C, particularly preferably 150 ° C.
【００３０】反応槽の後に接続される冷却槽には、直径
0.2〜0.6mm×長さ３〜10mのステンレスチューブが用い
られ、この冷却管は反応管よりも細い管を用いることが
特に重要である。特に直径0.25mm×長さ５mの冷却管が
好ましい。これを、氷水等の冷媒中に保持する。これに
よって、反応槽内で加熱された反応液と分離用カラムの
溶出液との混合液からのエアの発生が抑制され、ノイズ
を低下させ、感度を上げることができる。The cooling tank connected after the reaction tank has a diameter of
A stainless steel tube having a length of 0.2 to 0.6 mm and a length of 3 to 10 m is used, and it is particularly important to use a tube thinner than the reaction tube as the cooling tube. Particularly, a cooling pipe having a diameter of 0.25 mm and a length of 5 m is preferable. This is kept in a refrigerant such as ice water. As a result, generation of air from the mixed liquid of the reaction liquid heated in the reaction tank and the eluate of the separation column is suppressed, noise can be reduced, and sensitivity can be increased.
【００３１】検出には蛍光検出器を用いる。例えば、反
応液に酢酸グアニジンを用いる場合は、励起波長（Ex）
370nm、蛍光波長（Em）455nm、塩酸グアニジンを用いる
場合は、Ex 325nm , Em 400nm、あるいはEx 314nm , Em
433nmなどで測定される。A fluorescence detector is used for detection. For example, when guanidine acetate is used in the reaction solution, the excitation wavelength (Ex)
370 nm, fluorescence wavelength (Em) 455 nm, when using guanidine hydrochloride, Ex 325 nm, Em 400 nm, or Ex 314 nm, Em
Measured at 433 nm etc.
【００３２】本発明において試料は前処理される。即
ち、糖類に親和性のあるカラム（濃縮カラム）には、糖
化蛋白質・糖蛋白なども結合することができる。これら
の蛋白質が分離工程へ送られると、分離カラムの劣化を
早めるだけでなく、これらの蛋白質が結合する分、濃縮
カラムの糖類の結合容量を増やす必要がある。しかしな
がら濃縮カラムの容量を増やすと、分離工程へ送られる
試料容量が増加し次のイオン交換カラムでの分離が不十
分になるという問題が生じる。従って、測定対象の被検
体はできるだけ除蛋白されたものであることが望まし
い。In the present invention, the sample is pretreated. That is, glycated proteins, glycoproteins, etc. can also be bound to the column having an affinity for saccharides (concentration column). When these proteins are sent to the separation step, it is necessary not only to accelerate the deterioration of the separation column, but also to increase the binding capacity of saccharides in the concentration column by the amount that these proteins bind. However, if the volume of the concentration column is increased, the volume of the sample sent to the separation step will increase, and the separation in the next ion exchange column will be insufficient. Therefore, it is desirable that the analyte to be measured is deproteinized as much as possible.
【００３３】除蛋白の方法は、あらかじめ試料をSephad
ex G-25などのゲル濾過カラムで処理してもよいし、フ
ェニル硼酸カラムの前にゲル濾過のカラムを接続し、Ｕ
Ｖ検出器で蛋白質の280nmの吸光度をモニターして高分
子画分を排出した後、流路を切り替えてフェニル硼酸カ
ラムに導いてもよい。この場合、ゲル濾過の際の溶離液
はpＨ7.5〜9.5であることが好ましい。The deproteinization method is carried out by preliminarily separating the sample from Sephad.
It may be treated with a gel filtration column such as ex G-25, or a gel filtration column may be connected before the phenylboronic acid column,
It is also possible to monitor the absorbance of protein at 280 nm with a V detector to discharge the polymer fraction, and then switch the flow path to lead to the phenylboric acid column. In this case, the eluent for gel filtration is preferably pH 7.5 to 9.5.
【００３４】あるいは、限外濾過や透析という方法で低
分子画分だけを取り出して測定に用いることも可能であ
る。しかしながら、これらの方法は作業が煩雑でかつ時
間がかかるため、多量の検体を同時に処理することは困
難である。Alternatively, it is also possible to take out only the low molecular weight fraction for measurement by a method such as ultrafiltration or dialysis. However, since these methods are complicated and time-consuming, it is difficult to process a large amount of samples at the same time.
【００３５】一方、除蛋白の方法として、過塩素酸やト
リクロロ酢酸を用いる方法が知られているが、これらは
除蛋白後の上清が強酸性を示すため、中和操作が必要で
あり、又、中和後もこれらの塩濃度が高く、濃縮カラム
へ試料を吸着させる上で好ましくない。そこで、除蛋白
方法について検討した結果、水溶性亜鉛塩とアルカリ金
属による除蛋白方法が、除蛋白後のpH調製が不要で、測
定を妨害する不要な塩を含まず、多数の検体を比較的短
時間で処理することができ、さらに糖・ポリオール類の
測定感度も高く、本発明の測定方法に用いることが特に
好ましいことがわかった。On the other hand, as a method for deproteinization, a method using perchloric acid or trichloroacetic acid is known. However, since the supernatant after deproteinization shows a strong acidity, a neutralization operation is required. Further, the concentration of these salts is high even after neutralization, which is not preferable for adsorbing the sample to the concentration column. Therefore, as a result of investigating the deproteinization method, the deproteinization method using a water-soluble zinc salt and an alkali metal does not require pH adjustment after deproteinization, does not contain unnecessary salts that interfere with the measurement, and can be used for many samples. It has been found that the treatment can be carried out in a short time and the measurement sensitivity of sugars / polyols is high, and that the use in the measurement method of the present invention is particularly preferable.
【００３６】水溶性亜鉛塩とアルカリ金属による除蛋白
については特開平6-109726号などに記載されているよう
に、被検体に水溶性亜鉛塩とアルカリ金属水酸化物を加
え、室温下でミキサー等を用いてよく混和し、3000〜50
00rpmにて10分間程度遠心分離して、沈殿物を除去す
る。このようにして得られた上澄み液は、無色透明であ
り、かつ、被検体に含まれていた、糖・ポリオール類は
殆ど失われることなく、上記上澄み液に回収される。Regarding deproteinization with a water-soluble zinc salt and an alkali metal, as described in JP-A-6-109726, etc., a water-soluble zinc salt and an alkali metal hydroxide are added to a test sample and the mixture is mixed at room temperature with a mixer. Mix well, using 3000 to 50
Centrifuge at 00 rpm for about 10 minutes to remove the precipitate. The supernatant thus obtained is colorless and transparent, and sugars and polyols contained in the test substance are recovered in the above supernatant with almost no loss.
【００３７】即ち、本発明は、糖・ポリオール分子中の
シス・ジオール基を利用して濃縮用カラムに吸着させ、
検体中の測定感度以下の糖・ポリオール類を濃縮し、次
にこれらを脱着させて分離用カラムに導くことによっ
て、特別な濃縮操作なしに被検体中の微量の糖・ポリオ
ール類を測定することが可能となった。That is, according to the present invention, the cis-diol group in the sugar / polyol molecule is used for adsorption on the concentration column,
Concentration of sugars / polyols below the measurement sensitivity in a sample, then desorption of these and introducing them to a separation column to measure a very small amount of sugars / polyols in a sample without any special concentration operation. Became possible.
【００３８】次に本発明で用いられる測定装置につい
て、図面を参照して説明する。図１において、吸着液は
１ａのボトルに、溶出液は１ｂのボトルに、それぞれ入
れる。それぞれの液は、圧力ポンプＰと、切り替えバル
ブ４ａを通り、濃縮用カラム３と連結する。測定に先立
ち、切り替えバルブ４ａを吸着液側に切り替え、切り替
えバルブ４ｂは排出口５ａ側にして、吸着液側の圧力ポ
ンプを稼働させ、まず濃縮用カラムを洗滌する。次いで
サンプル圧入口２から除蛋白したサンプルを圧入し、し
ばらく、このまま吸着液を流し続け、糖・ポリオール類
以外の妨害物質を５ａから排出する。妨害物質を排出し
た後、切り替えバルブ４ａを溶出液側に、切り替えバル
ブ４ｂはアニオン交換カラム６側に変え、溶出液側の圧
力ポンプを稼働して、溶出液を濃縮用カラムに流す。こ
れにより、濃縮用カラムに吸着している、糖・ポリオー
ル類は、カラムから溶出する。溶出した糖・ポリオール
類は４ｂを通り、ミキサー11に送られる。１ｃのボトル
に入れてある溶離液は、経路にある圧力ポンプＰで送液
される。逆止弁９ａは、１ｃ側からの液のみを通す。前
述した糖・ポリオール類と溶離液はミキサー11内で混合
されアニオン交換カラム６に送液される。溶離液と溶出
液の混合比は任意であるがアニオン交換カラムに送液さ
れる混合液は0.5〜1.0Ｍの硼酸を含有し、pＨは７〜９
であることが好ましい。そのため、混合液が上記条件内
にあれば、測定の間、溶出液と溶離液と一定流量で送液
することができる。一方、アニオン交換カラムで分離さ
れた糖・ポリオール類溶出ピークは、溶離液中の硼酸濃
度が高い程、溶出時間が短縮され、ピークも鋭くなり検
出感度が高くなる。そのため、濃縮用カラムに吸着して
いた糖・ポリオール類が溶出されミキサーを通過した段
階で溶出液の送液を停止し、１ｃの溶離液のみを送液し
た方が好ましい。この時、溶出液の送液量をいきなりゼ
ロにすることも可能であるが、より好ましくは、徐々に
送液量を少なくすることが望ましい。其の際、溶出液と
溶離液の送液量の和が変動しないように溶出液の送液量
減少分、溶離液の送液量を増加させることが、アニオン
交換カラムで糖・ポリオール類を分離する上で好まし
い。溶離液又は溶出液との混合液により、アニオン交換
カラムに送液された糖・ポリオール類は、その吸着力の
差により、時系列的に溶離してくるので、１ｄに入れて
ある反応液を、経路にある圧力ポンプＰを稼働させて流
し、溶離液と混合して反応槽７にセットされている反応
管へ流す。反応液の経路にある逆止弁９ｂは、上述した
９ａと同じ働きをする。反応管を通る間に、糖・ポリオ
ール類は蛍光を発する物質になり、冷却槽８にセットさ
れている冷却管を通って冷やされ、蛍光検出器10に導か
れる。蛍光検出器により、時系列的に蛍光の強さが記録
され、糖・ポリオール類が定量できる。Next, the measuring device used in the present invention will be described with reference to the drawings. In FIG. 1, the adsorbent is put in the bottle 1a, and the eluate is put in the bottle 1b. Each liquid is connected to the concentration column 3 through the pressure pump P and the switching valve 4a. Prior to the measurement, the switching valve 4a is switched to the adsorption liquid side, the switching valve 4b is set to the discharge port 5a side, the pressure pump on the adsorption liquid side is operated, and the concentration column is first washed. Next, the deproteinized sample is press-fitted from the sample pressurizing port 2, the adsorbing liquid is kept flowing for a while, and interfering substances other than sugars and polyols are discharged from 5a. After discharging the interfering substance, the switching valve 4a is changed to the eluent side, the switching valve 4b is changed to the anion exchange column 6 side, the pressure pump on the eluent side is operated, and the eluent is flown to the concentration column. As a result, the sugar / polyols adsorbed on the concentration column are eluted from the column. The eluted sugar / polyols are sent to the mixer 11 through 4b. The eluent contained in the bottle 1c is sent by the pressure pump P in the path. The check valve 9a allows only the liquid from the 1c side to pass through. The sugar / polyols and the eluent described above are mixed in the mixer 11 and sent to the anion exchange column 6. The eluent and the eluent may be mixed at any ratio, but the mixture sent to the anion exchange column contains 0.5-1.0 M boric acid and has a pH of 7-9.
Is preferred. Therefore, if the mixed liquid is within the above conditions, the eluent and the eluent can be sent at a constant flow rate during the measurement. On the other hand, the higher the concentration of boric acid in the eluent, the shorter the elution peak of the sugar / polyol separated by the anion exchange column, the shorter the elution time becomes, and the sharper the peak becomes, the higher the detection sensitivity becomes. Therefore, it is preferable to stop the feeding of the eluate when the sugar / polyol adsorbed on the concentration column is eluted and passed through the mixer, and feed only the eluent of 1c. At this time, it is possible to suddenly bring the amount of the eluate to zero, but more preferably, it is desirable to gradually reduce the amount of the liquid to be delivered. At that time, it is possible to increase the amount of eluent delivered by the amount of eluent delivered so that the sum of the amount of eluate delivered does not fluctuate. It is preferable for separation. The sugar / polyols sent to the anion exchange column by the eluent or the mixed solution with the eluent elutes in time series due to the difference in the adsorptive power. , The pressure pump P in the path is operated and allowed to flow, and mixed with the eluent to flow into the reaction tube set in the reaction tank 7. The check valve 9b in the path of the reaction solution has the same function as 9a described above. While passing through the reaction tube, the sugar / polyol becomes a substance that emits fluorescence, is cooled through the cooling tube set in the cooling tank 8, and is guided to the fluorescence detector 10. The fluorescence intensity is recorded in a time series by the fluorescence detector, and sugars and polyols can be quantified.
【００３９】図２は、図１の濃縮用カラム系の装置がな
く、後半のアニオン交換カラム以降がセットされた装置
の模式図であり、機能は図１の後半部分と同じである。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus in which the apparatus for the concentration column system of FIG. 1 is not provided, and the anion exchange column and the latter half of the latter half are set, and the function is the same as the latter half of FIG.
【００４０】[0040]
実施例１ 図１で示される構成の測定装置を組み立て、本発明の測
定装置とし、図２で示される構成の測定装置を組みた
て、これを比較の測定装置とした。詳細な測定条件は表
１に示す。Example 1 A measuring device having the structure shown in FIG. 1 was assembled to obtain a measuring device of the present invention, and a measuring device having the structure shown in FIG. 2 was assembled to obtain a comparative measuring device. Detailed measurement conditions are shown in Table 1.
【００４１】検体の前処理 １μg／ml ＤＣＩを含む７％ HSA・PBS２mlに室温下で
水10mlを加え、更に84mg／mlの硫酸亜鉛水溶液 ２ml及
び0.6N NaOH 2.8mlを加えよく混合し、5000rpmにて10分
間遠心分離し、上澄み8.4mlを分取した。これを本発明
の試料前処理−１とする。Pretreatment of Specimen To 2 ml of 7% HSA / PBS containing 1 μg / ml DCI, 10 ml of water was added at room temperature, 2 ml of 84 mg / ml zinc sulfate aqueous solution and 2.8 ml of 0.6N NaOH were added and mixed well to 5000 rpm. After centrifugation for 10 minutes, 8.4 ml of the supernatant was collected. This is referred to as sample pretreatment-1 of the present invention.
【００４２】１μg／ml ＤＣＩを含む７％HSA・PBS２ml
に対し、30％トリクロル酢酸１mlを添加し、遠心分離し
上澄み1.5mlを分取した。これにNaOHを添加しpＨ8.5に
調整した。これを比較の前処理−１とする。2 ml of 7% HSA / PBS containing 1 μg / ml DCI
On the other hand, 1 ml of 30% trichloroacetic acid was added and centrifuged to collect 1.5 ml of the supernatant. NaOH was added thereto to adjust the pH to 8.5. This is referred to as comparison preprocessing-1.
【００４３】１μg／ml DCIを含む７％HSA・PBS１mlを
セファデックスG-25(φ10×300mm)でゲル濾過し、低分
子画分を分取した。溶媒には20mM HEPES-NaOH pＨ8.5を
用いた。これを比較の前処理−２とする。1 ml of 7% HSA / PBS containing 1 μg / ml DCI was subjected to gel filtration with Sephadex G-25 (φ10 × 300 mm) to collect a low molecular weight fraction. The solvent used was 20 mM HEPES-NaOH pH 8.5. This is referred to as comparison pre-processing-2.
【００４４】[0044]
【表１】 [Table 1]
【００４５】本発明の測定装置を用いて、本発明の試料
前処理−１及び比較の試料前処理−１，２にて処理した
被検体を各々前処理前のサンプル１mlに相当する量を用
いて測定した。(前処理はｎ＝３で行なった。)その結果
を表２に示す。Using the measuring apparatus of the present invention, the specimens treated by the sample pretreatment-1 of the present invention and the comparative sample pretreatments-1 and 2 were used in an amount corresponding to 1 ml of the sample before pretreatment. Measured. (The pretreatment was performed at n = 3.) The results are shown in Table 2.
【００４６】[0046]
【表２】 [Table 2]
【００４７】このように本発明の前処理−１は比較の前
処理−１と比較してピークが高くなった。さらに比較の
前処理−１は中和操作が必要であり、操作が煩雑であっ
た。又、比較の前処理−２は前処理での誤差が非常に大
きく、又１つ１つのサンプルの処理に時間を要した。こ
れに対し、本発明の前処理−１は簡便で正確な試料の前
処理が短時間で可能であり、感度も高く、最も好ましい
前処理方法であった。As described above, the peak of Pretreatment-1 of the present invention was higher than that of Comparative Pretreatment-1. Further, Comparative Pretreatment-1 required a neutralization operation, and the operation was complicated. In comparison pretreatment-2, the error in pretreatment was very large, and it took time to treat each sample. On the other hand, the pretreatment-1 of the present invention was the most preferable pretreatment method because the pretreatment of the sample was simple and accurate, which was possible in a short time and the sensitivity was high.
【００４８】実施例２ ＤＣＩ及びＭＩを0.1〜100μg／mlで含有する0.1M HEPE
S-NaOH pＨ8.5を検体として、実施例１の方法に準じて
測定し、DCI及びMIの最低検出感度を比較した。Example 2 0.1M HEPE containing DCI and MI at 0.1-100 μg / ml
S-NaOH pH8.5 was used as a sample and measured according to the method of Example 1 to compare the minimum detection sensitivities of DCI and MI.
【００４９】[0049]
【表３】 [Table 3]
【００５０】その結果、表３に示したように比較の測定
装置ではDCIとMIが100μg／mlではＤＣＩとＭＩが分離
され、ピークが確認できたが、ＤＣＩとＭＩが１μg／m
lではピークは検出できなかった。これに対し、本発明
の測定装置ではサンプル量を増やすことによって、ＤＣ
ＩとＭＩが0.1μg／mlまで検出することが可能であっ
た。従って、本発明の方法が低濃度の糖・ポリオール類
の測定に優れていることがわかる。As a result, as shown in Table 3, DCI and MI were separated when DCI and MI were 100 μg / ml in the comparative measuring device, and peaks were confirmed, but DCI and MI were 1 μg / m.
No peak could be detected in l. On the other hand, in the measuring device of the present invention, by increasing the sample amount, DC
It was possible to detect I and MI up to 0.1 μg / ml. Therefore, it can be seen that the method of the present invention is excellent for measuring low concentrations of sugars and polyols.
【００５１】実施例３ 標準試料としてＤＣＩ 0.1〜10μg／ml及びＭＩ 0.1〜1
0μg／ml含む0.1％HSA・PBSを本発明の前処理−１の方
法で除蛋白し、標準試料１mlに相当する量を実施例１に
示した本発明の測定装置を用いて測定し、検量線を作成
した。同様に健常人の尿試料（検体１〜５）を本発明の
前処理−１の方法で除蛋白し、尿試料１mlに相当する量
を本発明の測定装置を用いて実施例１に準じてＤＣＩ及
びＭＩを測定した。その結果、表４に示した検量線が得
られ、表５に示した通り尿中ＤＣＩ及びＭＩが測定でき
ることが確認された。Example 3 As a standard sample, DCI 0.1-10 μg / ml and MI 0.1-1
0.1% HSA / PBS containing 0 μg / ml was deproteinized by the method of Pretreatment-1 of the present invention, and an amount corresponding to 1 ml of a standard sample was measured by using the measuring apparatus of the present invention shown in Example 1 and calibrated. Created a line. Similarly, urine samples (specimens 1 to 5) of healthy people were deproteinized by the method of pretreatment-1 of the present invention, and an amount corresponding to 1 ml of urine sample was measured according to Example 1 using the measuring device of the present invention. DCI and MI were measured. As a result, the calibration curve shown in Table 4 was obtained, and it was confirmed that urinary DCI and MI can be measured as shown in Table 5.
【００５２】[0052]
【表４】 [Table 4]
【００５３】[0053]
【表５】 [Table 5]
【００５４】[0054]
【発明の効果】本発明により、複雑な濃縮操作なしに高
感度に糖・ポリオール類を測定する方法を提供すること
ができる。また、本発明は、高価な装置を用いることな
く、簡便な糖・ポリオール類の高感度測定方法及び測定
装置を提供できた。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a method for highly sensitive measurement of sugars / polyols without complicated concentration operation. Further, the present invention was able to provide a simple method and apparatus for highly sensitive measurement of sugars / polyols without using an expensive apparatus.
【図１】本発明の測定装置を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing a measuring apparatus of the present invention.
【図２】比較用の測定装置を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic view showing a measuring device for comparison.
１ａ 吸着液用ボトル １ｂ 溶出液用ボトル １ｃ 溶離液用ボトル １ｄ 反応液用ボトル ２ サンプル圧入口 ３ 濃縮用カラム ４ａ 切り替えバルブ ４ｂ 切り替えバルブ ５ａ 排出口 ５ｂ 排出口 ６ アニオン交換カラム ７ 反応槽 ８ 冷却槽 ９ａ 逆止弁 ９ｂ 逆止弁 10 蛍光検出器 11 ミキサー Ｐ 圧力ポンプ 1a Adsorbent bottle 1b Eluent bottle 1c Eluent bottle 1d Reaction liquid bottle 2 Sample pressure inlet 3 Concentration column 4a Switching valve 4b Switching valve 5a Discharge port 5b Discharge port 6 Anion exchange column 7 Reaction tank 8 Cooling tank 9a Check valve 9b Check valve 10 Fluorescence detector 11 Mixer P Pressure pump
Claims (9)
該糖・ポリオール類と親和性を有するカラムに吸着して
濃縮し、次いで吸着した糖・ポリオール類を溶出させ、
かつ硼酸と接触させてアニオン性錯イオンを形成し、該
糖・ポリオール類のアニオン性錯イオンは強アニオン交
換カラムに対する吸着力の差により、測定目的の糖・ポ
リオール類と他の糖・ポリオール類とに分離し、分離し
た糖・ポリオール類を蛍光物質に変化する試薬と反応さ
せて、生じた蛍光物質を測定して液体試料中の微量の糖
・ポリオール類を測定することを特徴とする糖・ポリオ
ール類の高感度測定方法。1. A sugar / polyol contained in a test sample,
Adsorb to a column having an affinity for the sugar / polyols and concentrate, then elute the adsorbed sugar / polyols,
In addition, it forms an anionic complex ion by bringing it into contact with boric acid, and the anionic complex ion of the sugar / polyols is different in the adsorption power to the strong anion exchange column, so that the sugar / polyols to be measured and other sugars / polyols are different. A sugar characterized in that the separated sugar / polyols are reacted with a reagent that changes into a fluorescent substance, and the resulting fluorescent substance is measured to measure a very small amount of the sugar / polyols in the liquid sample. -Highly sensitive measuring method for polyols.
カラムがm-アミノフェニルホウ酸を固定化したカラムで
あることを特徴とする請求項１記載の高感度測定方法。2. The high-sensitivity measurement method according to claim 1, wherein the column having an affinity with the sugar / polyol is a column having m-aminophenylboric acid immobilized thereon.
オール類を溶出させる際の溶媒が0.1〜1.0Ｍの硼酸を含
有する緩衝液であることを特徴とする請求項２記載の高
感度測定方法。3. The high-sensitivity measurement method according to claim 2, wherein the solvent for eluting the sugar / polyols from the phenylboric acid column is a buffer solution containing 0.1 to 1.0 M boric acid.
させる試薬が過ヨウ素酸及びアルデヒドの存在下で蛍光
物質に変化する試薬であることを特徴とする請求項１記
載の高感度測定方法。4. The high-sensitivity measuring method according to claim 1, wherein the reagent that changes the sugar / polyol into a fluorescent substance is a reagent that changes into a fluorescent substance in the presence of periodate and aldehyde.
化する試薬がグアニジノ化合物であることを特徴とする
請求項１記載の高感度測定方法。5. The high-sensitivity measuring method according to claim 1, wherein the reagent that changes into a fluorescent substance in the presence of the aldehyde is a guanidino compound.
イノシトールであることを特徴とする請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の高感度測定方法。6. The highly sensitive measurement method according to claim 1, wherein the sugar / polyol to be measured is D-chiro-inositol.
を特徴とする請求項６記載のＤ−カイロイノシトールの
高感度測定方法。7. The highly sensitive method for measuring D-chiro-inositol according to claim 6, wherein the analyte contains an inositol isomer.
着する濃縮カラム、糖・ポリオール類の硼酸を含むアニ
オン性錯イオンを分離する強アニオン交換カラム、分離
した糖・ポリオール類を過ヨウ素酸及びアルデヒドの存
在下で蛍光物質に変化する試薬と反応させる反応槽、反
応液を冷却する冷却槽及び生じた蛍光物質を測定する蛍
光検出器から構成される糖・ポリオール類の測定装置。8. A concentration column for adsorbing sugars / polyols contained in an analyte, a strong anion exchange column for separating anionic complex ions containing boric acid of sugars / polyols, and a separated periodate for sugars / polyols. And a sugar / polyol measuring device comprising a reaction tank for reacting with a reagent that changes into a fluorescent substance in the presence of aldehyde, a cooling tank for cooling the reaction liquid, and a fluorescence detector for measuring the generated fluorescent substance.
蛍光のピーク面積の合計あるいはピーク高の合計を算出
し、これが、あらかじめ確認された濃縮カラムの糖・ポ
リオール類の全結合容量に相当するピーク面積あるいは
ピーク高に対し一定以上を超えた場合に、警告を発する
機能を有することを特徴とする請求項８記載の糖・ポリ
オール類の測定装置。9. The sum of peak areas or peak heights of fluorescence detected by a fluorescence detector is calculated for each analyte, and this is calculated as the total binding capacity of sugar / polyols of the concentration column confirmed in advance. 9. The sugar / polyol measuring device according to claim 8, which has a function of issuing a warning when the peak area or peak height exceeds a certain level.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20218594A JPH0862220A (en) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | Highly sensitive measuring method and apparatus for sugar and polyoles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20218594A JPH0862220A (en) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | Highly sensitive measuring method and apparatus for sugar and polyoles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0862220A true JPH0862220A (en) | 1996-03-08 |
Family
ID=16453378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20218594A Pending JPH0862220A (en) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | Highly sensitive measuring method and apparatus for sugar and polyoles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0862220A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005093410A1 (en) * | 2004-03-29 | 2008-02-14 | シチズンホールディングス株式会社 | Optical measuring device |
| JP2016080542A (en) * | 2014-10-17 | 2016-05-16 | 森永乳業株式会社 | Polysaccharide measurement method and measurement device |
-
1994
- 1994-08-26 JP JP20218594A patent/JPH0862220A/en active Pending
Cited By (4)
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| US7583382B2 (en) | 2004-03-29 | 2009-09-01 | Citizen Holdings Co., Ltd. | Optical measurement apparatus |
| JP4742031B2 (en) * | 2004-03-29 | 2011-08-10 | シチズンホールディングス株式会社 | Optical measuring device |
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