JPH0851979A - Method for reverse transcription of rna and its use - Google Patents
Method for reverse transcription of rna and its useInfo
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- JPH0851979A JPH0851979A JP6187620A JP18762094A JPH0851979A JP H0851979 A JPH0851979 A JP H0851979A JP 6187620 A JP6187620 A JP 6187620A JP 18762094 A JP18762094 A JP 18762094A JP H0851979 A JPH0851979 A JP H0851979A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いたＲＮＡの逆転写反応に関し、特に熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を飛躍的に上昇させる
緩衝液を使用したＲＮＡの逆転写方法、該方法を利用す
る特定標的ＲＮＡの増幅法ならびに特定標的ＲＮＡの検
出法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a reverse transcription reaction of RNA using a thermostable DNA polymerase, and more particularly to a reverse transcription of RNA using a buffer which dramatically increases the reverse transcription activity of the thermostable DNA polymerase. The present invention relates to a method, a method for amplifying a specific target RNA using the method, and a method for detecting a specific target RNA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】逆転写反応とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼとして特徴付けられるＤＮＡポリメラーゼの
一種である逆転写酵素を用いて、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ
転写物を合成する反応である。当初から、逆転写酵素は
ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写されるために使用され、この
ｃＤＮＡは更に種々に操作するためのベクターにクロー
ン化され得る。2. Description of the Related Art A reverse transcription reaction is a process in which a reverse transcriptase, which is a type of DNA polymerase characterized as an RNA-dependent DNA polymerase, is used to convert DNA from an RNA template.
It is a reaction that synthesizes a transcript. From the beginning, reverse transcriptase was used to transcribe mRNA into cDNA, which can be cloned into vectors for further manipulation.
【０００３】アビアン・ミエロブラストシス・ウイルス
(Avian myeloblastosis virus)由来のAMV 逆転写酵素
が、初期のころから広く使用された酵素であった（Verm
a,1977,Biochem. Biophys. Acta 473:1)。該酵素は、Ｒ
ＮａｓｅＨ活性を有するから逆転写反応により生成した
ｃＤＮＡが断片化ｃＤＮＡとなる原因となり、完全長の
ｃＤＮＡの収率低下をもたらしていた。次いでＲＮａｓ
ｅＨ活性の比較的低いモロニー・ムリーン・ロイケミア
・ウイルス(Moloney murine leukemia virus) 由来のMM
LV逆転写酵素等が用いられるようになってきた。Avian Myeloblastosis virus
AMV reverse transcriptase derived from (Avian myeloblastosis virus) has been widely used since the early days (Verm
a, 1977, Biochem. Biophys. Acta 473: 1). The enzyme is R
Since it has NaseH activity, it causes the cDNA generated by the reverse transcription reaction to become fragmented cDNA, resulting in a decrease in the yield of full-length cDNA. Then RNas
MM derived from Moloney murine leukemia virus with relatively low eH activity
LV reverse transcriptase and the like have come to be used.
【０００４】一方、大腸菌等の中温微生物から単離され
たＤＮＡポリメラーゼは、広く研究されている（Bessma
n et al,1957,J.Biol.Chem.,33:171-177または Buttin
& Kornberg,1966,J.Biol.Chem.,241:5419-5427) 。E.co
liＤＮＡポリメラーゼＩ(PolＩ)はニック・トラスレー
ション、シーケンシング、第２ｃＤＮＡ合成等多くの用
途に有用である。いくつかの研究室では、ある種のＤＮ
Ａポリメラーゼはin vitroにおけるＲＮＡの逆転写反応
が可能であることを示している（Karkas,1973,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,71:1035-1039 およびWittig & Wittig,
1978,Nucleic.Acids Res.,5:1165-1178)。Gulatiらは、
E.coliのPol ＩがオリゴｄＴをプライマーとして使用し
て、Ｑβウイルス性ＲＮＡを転写するために使用され得
ることを見出した。Wittig & Wittigは、E.coliのPol
ＩがオリゴｄＡを用いて酵素的に延長されたｔＲＮＡを
逆転写するために使用され得ることを見出した。しかし
ながら、Gulatiらが示したように、必要な酵素量及び小
さいｃＤＮＡ生成物は、E.coliのPol Ｉの逆転写酵素活
性が実質的な価値をほとんどもたないことを示唆してい
る。On the other hand, DNA polymerases isolated from mesophilic microorganisms such as Escherichia coli have been widely studied (Bessma).
n et al, 1957, J. Biol. Chem., 33: 171-177 or Buttin
& Kornberg, 1966, J. Biol. Chem., 241: 5419-5427). E.co
LiDNA Polymerase I (PolI) is useful for many applications such as nick-tracing, sequencing, second cDNA synthesis. In some labs, some kind of DN
A polymerase has been shown to be capable of reverse transcription of RNA in vitro (Karkas, 1973, Proc. Nat.
l.Acad.Sci.USA, 71: 1035-1039 and Wittig & Wittig,
1978, Nucleic. Acids Res., 5: 1165-1178). Gulati et al.
We have found that E. coli Pol I can be used to transcribe Qβ viral RNA using oligo dT as a primer. Wittig & Wittig is Pol of E.coli
It has been found that I can be used to reverse transcribe enzymatically extended tRNA with oligo dA. However, as shown by Gulati et al., The amount of enzyme required and the small cDNA product suggest that the reverse transcriptase activity of E. coli Pol I has little substantial value.
【０００５】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、たとえば
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲと略す
る)(Saiki,1985,Science,230:1350-1354) によるＤＮＡ
増幅の実施におけるような、短時間において93〜95℃に
加温された場合に不活性化されることはない。これと対
象的に、この昇温下、従来記述されている逆転写酵素や
E.coliのPol Ｉ等は、不活性化される。また、従来から
公知である逆転写酵素やE.coliのPol Ｉ等を用いて、逆
転写反応を行う場合、通常、45℃以下で行う。これは上
述の様に酵素の不活性化が起こるためである。しかしな
がら、鋳型となるＲＮＡが高次構造を取り、部分的に２
本鎖を形成している場合、そこで合成が停止することが
ある。The thermostable DNA polymerase is, for example, a DNA obtained by polymerase chain reaction (abbreviated as PCR) (Saiki, 1985, Science, 230: 1350-1354).
It is not inactivated when heated to 93-95 ° C for a short period of time, as in the case of performing amplification. In contrast to this, at this elevated temperature, reverse transcriptase and
Pol I etc. of E. coli are inactivated. Further, when a reverse transcription reaction is performed using a conventionally known reverse transcriptase, Pol I of E. coli or the like, it is usually performed at 45 ° C. or lower. This is because the enzyme is inactivated as described above. However, the template RNA adopts a higher-order structure and partially
When forming a single strand, the synthesis may stop there.
【０００６】これらの問題を解決するために熱安定性の
優れた逆転写酵素が望まれていた。Myers らは、反応緩
衝液に塩化マンガンを用いることにより、熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼが逆転写活性をもつこと示した（Myers
& Gelfand,1991,Biochemistry,30(31):7661-7666、特開
表 5-505105 号公報）。しかしながら熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼの逆転写活性は、従来のAMV逆転写酵素やMML
V逆転写酵素に比べて非常に低く、ｃＤＮＡ合成後のＰ
ＣＲ等による増幅が必要とされていた。また最初のｃＤ
ＮＡ合成の活性の低さは、増幅後の検出感度にも大きな
問題となっている。In order to solve these problems, a reverse transcriptase having excellent thermostability has been desired. By using manganese chloride as a reaction buffer, Myers et al.
It was shown that A polymerase has reverse transcription activity (Myers
& Gelfand, 1991, Biochemistry, 30 (31): 7661-7666, JP-A 5-505105). However, the reverse transcription activity of thermostable DNA polymerases is comparable to that of conventional AMV reverse transcriptase and MML.
Very low compared to V reverse transcriptase, P after cDNA synthesis
Amplification by CR etc. was required. Also the first cd
The low activity of NA synthesis poses a serious problem in detection sensitivity after amplification.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を飛躍的に上
昇させる方法を提供することである。The object of the present invention is to provide a method for dramatically increasing the reverse transcriptase activity of a thermostable DNA polymerase.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである逆転写反応緩衝液を用いることに
よって、上記課題が解決されることを見出して、本発明
を完成させるに至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve these problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by using a reverse transcription reaction buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. The inventors have found that they can be solved and have completed the present invention.
【０００９】すなわち本発明はＲＮＡ鋳型を含む試料
に、該鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドであるプライ
マー、４種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェー
トおよび逆転写活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼを塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭである緩衝溶液中に
て作用させ、前記ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃ
ＤＮＡ配列を形成することを特徴とするＲＮＡの逆転写
方法である。That is, the present invention provides a sample containing an RNA template with a primer which is an oligonucleotide complementary to the template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity at a chloride ion concentration of 0. It is allowed to act in a buffer solution having a concentration of 10 mM, and c complementary to the sequence of the RNA template
It is a reverse transcription method of RNA characterized by forming a DNA sequence.
【００１０】また本発明はＲＮＡ鋳型を含む試料に、該
鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドであるプライマー、
４種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートおよ
び逆転写活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを塩
素イオン濃度が、０〜１０ｍＭである緩衝溶液中にて高
温で作用させ、前記ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的な
ｃＤＮＡ配列を形成することを特徴とするＲＮＡの逆転
写方法である。The present invention also provides a sample containing an RNA template, a primer which is an oligonucleotide complementary to the template,
Four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates and a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity were allowed to act at a high temperature in a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, and were complementary to the sequence of the RNA template. It is a method of reverse transcription of RNA characterized by forming a cDNA sequence.
【００１１】また本発明は下記工程を含むことを特徴と
する特定標的ＲＮＡ分子の検出方法である。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温にて作用させ、
ＲＮＡ鋳型のの配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形
成させ、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを変性
して単鎖分子にし、（ｃ）該ｃＤＮＡの存在を検出用プ
ローブを用いて検出する。The present invention also provides a method for detecting a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. At high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template is formed, (b) the cDNA formed in step (a) is denatured into a single-stranded molecule, and (c) the presence of the cDNA is used as a detection probe. Use to detect.
【００１２】本発明は下記工程を含むことを特徴とする
特定標的ＲＮＡ分子を鋳型とする増幅方法である。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温にて作用させ、
ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成
させ、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを鋳型と
し、オリゴヌクレオチドをプライマーとし、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて増幅用緩衝液中で増幅反応を
行う。The present invention is an amplification method using a specific target RNA molecule as a template, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. At high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template is formed, (b) the cDNA formed in step (a) is used as a template, the oligonucleotide is used as a primer, and the thermostability D
The amplification reaction is carried out in the amplification buffer using NA polymerase.
【００１３】また本発明は下記工程を含むことを特徴と
する特定標的ＲＮＡ分子の検出方法である。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温で作用させ、Ｒ
ＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成さ
せ、 （ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを鋳型とし、オ
リゴヌクレオチドをプライマーとし、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼを使用して増幅用緩衝液中で増幅反応を行
う。 （ｃ）工程（ｂ）で増幅されたｃＤＮＡを変性して単鎖
分子にし、 （ｄ）該ｃＤＮＡの存在を検出用プローブにより検出す
る。The present invention also provides a method for detecting a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. R at high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the NA template is formed, and (b) the cDNA formed in step (a) is used as a template, the oligonucleotide is used as a primer, and a thermostable DNA polymerase is used to provide an amplification buffer. Amplification reaction is performed in the liquid. (C) The cDNA amplified in step (b) is denatured into a single-stranded molecule, and (d) the presence of the cDNA is detected by a detection probe.
【００１４】本発明はＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌク
レオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝液を含んでなＲＮＡ逆転写
反応用試薬キットである。The present invention is for RNA reverse transcription reaction comprising an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. It is a reagent kit.
【００１５】本発明はＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌク
レオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝液、検出用プローブおよび
検出用緩衝液を含んでな特定ＲＮＡ分子検出用試薬キッ
トである。The present invention provides an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, a detection probe and a detection buffer solution. A reagent kit for detecting a specific RNA molecule, which comprises:
【００１６】本発明はＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌク
レオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝液、増幅用プライマーおよ
び増幅用緩衝液を含んでなる特定ＲＮＡ分子増幅用試薬
キットである。The present invention relates to an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, an amplification primer and an amplification buffer solution. A reagent kit for amplifying a specific RNA molecule, which comprises:
【００１７】本発明はＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌク
レオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝溶液、増幅用プライマー、
増幅用緩衝液、ＤＮＡ検出用プローブおよびＤＮＡ検出
用緩衝液を含んでなる特定ＲＮＡ分子検出用試薬キット
である。The present invention comprises an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, an amplification primer,
A reagent kit for detecting a specific RNA molecule, which comprises an amplification buffer, a DNA detection probe, and a DNA detection buffer.
【００１８】本発明のＲＮＡ鋳型を含む試料とは、遺伝
子性または感染性疾患の診断用の試料である。ＲＮＡ鋳
型はたとえばウイルスまたは細菌核酸調製物等の生物由
来の核酸調製物中に含まれていてもよい。該調製物は細
胞破砕物およびその他の成分、精製全ＲＮＡまたは精製
ｍＲＮＡを含んでもよいし、試料中の異種ＲＮＡ分子の
母集団または特定の標的ＲＮＡ分子であってもよい。本
発明の使用に適したＲＮＡは、特定の標的ＲＮＡを含む
と予想される生物学的試料に含まれていてもよい。該生
物学的試料はたとえば血液試料または生組織試料等のＲ
ＮＡが試料の微小部分であるような異種的試料であって
もよい。該ＲＮＡ標的は特定の疾患または感染性物質の
指示物質であってもよい。The sample containing the RNA template of the present invention is a sample for diagnosing a genetic or infectious disease. The RNA template may be included in a nucleic acid preparation of biological origin, such as a viral or bacterial nucleic acid preparation. The preparation may include cell debris and other components, purified total RNA or purified mRNA, or may be a population of heterologous RNA molecules or a particular target RNA molecule in a sample. RNA suitable for use in the present invention may be contained in a biological sample suspected of containing a particular target RNA. The biological sample is, for example, an R sample such as a blood sample or a living tissue sample.
It may be a heterogeneous sample where NA is a small part of the sample. The RNA target may be an indicator of a particular disease or infectious agent.
【００１９】本発明で用いるＲＮＡ鋳型に相補的なオリ
ゴヌクレオチドは、ＲＮＡ鋳型に対して充分に相補的で
あり、該ＲＮＡ鋳型にアニールし、第一のｃＤＮＡ合成
の開始のために使用され得る。該オリゴヌクレオチド
は、熱安定性酵素の存在下、伸長生成物の合成を開始す
るために充分な長さを有する。該オリゴヌクレオチド
は、オリゴ(dT)等のオリゴヌクレオチドであってもよ
い。長さは、６〜100 ヌクレオチド、好ましくは10〜30
ヌクレオチドの長さが使用され得る。このオリゴヌクレ
オチドは、例えばＡＢＩ社（Applied Biosystems Inc.)
のＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミダ
イト法により合成できる。他にもリン酸トリエステル
法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等いかな
る方法で合成してもよい。また、生物学的起源から、例
えば制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよ
い。The oligonucleotides complementary to the RNA template used in the present invention are sufficiently complementary to the RNA template that they anneal to the RNA template and can be used to initiate the first cDNA synthesis. The oligonucleotide is of sufficient length to prime the synthesis of extension products in the presence of thermostable enzymes. The oligonucleotide may be an oligonucleotide such as oligo (dT). The length is 6 to 100 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides.
Nucleotide lengths can be used. This oligonucleotide can be prepared, for example, by ABI (Applied Biosystems Inc.).
Can be synthesized by the phosphoamidite method using DNA synthesizer type 391. Alternatively, any method such as the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, the thiophosphite method may be used. It may also be isolated from biological sources, for example from restriction endonuclease digests.
【００２０】本発明で用いる逆転写活性を有する熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを鋳型としてデオキシ
リボヌクレオチドの重合化を触媒的に行い、核酸鎖に相
補的なプライマー伸張生成物を形成する酵素を指す。こ
こで有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ類は、２本鎖核
酸の変性を生じさせるために必要な温度で、必要な時間
処理した場合にも不可逆的に不活性化されない。酵素の
不可逆的不活性化とは、酵素活性の実質的欠損を指す。
この時の必要な温度は一般的に90〜100 ℃であり、時間
は一般的に１秒〜１０分間である。The thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity used in the present invention refers to an enzyme which catalytically polymerizes deoxyribonucleotide using RNA as a template to form a primer extension product complementary to a nucleic acid chain. . The thermostable DNA polymerases useful herein are not irreversibly inactivated when treated at the temperature required to cause denaturation of double-stranded nucleic acids and for the time required. Irreversible inactivation of an enzyme refers to a substantial loss of enzyme activity.
The temperature required at this time is generally 90 to 100 ° C., and the time is generally 1 second to 10 minutes.
【００２１】本発明で用いる逆転写活性を有する熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは、50℃以上の温度において、デ
オキシリボヌクレオチドの重合反応を触媒し、核酸鋳型
に相補的なプライマー伸張生成物を形成することがで
き、50℃以上で最大活性を有する。好ましくは60〜80℃
で至適活性を有する。The thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity used in the present invention can catalyze the polymerization reaction of deoxyribonucleotides at a temperature of 50 ° C. or higher to form a primer extension product complementary to a nucleic acid template. It has a maximum activity above 50 ° C. Preferably 60-80 ° C
Has optimal activity at
【００２２】逆転写活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼとしては、サーマス・サーモフィラスが産生する
TthＤＮＡポリメラーゼまたは該遺伝子を組み込んだ組
換宿主細胞から精製されるr-Tth ＤＮＡポリメラーゼが
挙げられる。The thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity is produced by Thermus thermophilus.
Examples include Tth DNA polymerase or r-Tth DNA polymerase purified from recombinant host cells incorporating the gene.
【００２３】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの供
給源から入手可能である。該酵素は、天然蛋白質または
組換蛋白質のいずれであってもよい。Thermostable DNA polymerases are available from many sources. The enzyme may be either a native protein or a recombinant protein.
【００２４】本発明では、Tth ＤＮＡポリメラーゼおよ
びr-Tth ＤＮＡポリメラーゼが例示されているが、本発
明はこれらの酵素に限定されるものではない。報告され
ている他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも、ここに記述
される方法の実施に有用性が見いだされるであろう。こ
れらの例は、好熱細菌であるサーマス・サーモフィラ
ス、サーマス・アクアティカス、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス、サーモシホ・アフリカナス、サーモトガ
・マリチーマ、サーマスＳＰＳ１７種、サーマス・フラ
バス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンスお
よびサーマス・ルーバーからなる群から選ばれた細菌由
来のＤＮＡポリメラーゼまたはこれらの遺伝子を組み込
んだ組換宿主細胞から精製されるＤＮＡポリメラーゼな
どが挙げられる。In the present invention, Tth DNA polymerase and r-Tth DNA polymerase are exemplified, but the present invention is not limited to these enzymes. Other reported thermostable DNA polymerases will also find utility in practicing the methods described herein. Examples of these are the thermophilic bacteria Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus, Thermosiho africanus, Thermotoga maritima, Thermus SPS17 species, Thermus flavus, Thermus lacteus, Thermus. Examples thereof include a DNA polymerase derived from a bacterium selected from the group consisting of Rubens and Thermus louver, or a DNA polymerase purified from a recombinant host cell incorporating these genes.
【００２５】好熱古細菌から単離される熱安定性ポリメ
ラーゼとしては、例えばデサルフロコッカス・モビリ
ス、メタノバクテリウム・サーモオートロフィカム、メ
タノサーマス・フェルビダス、パイロコッカス・フリオ
ウス、ピロディクチウム・オクルタム、サルホロブス・
アシドカルダリウス、サルホロブス・ソルファタリカ
ス、サーモコッカス・リトラリスおよびサーモプラズマ
・アシドフィリウムからなる群から選ばれた細菌から抽
出されるＤＮＡポリメラーゼまたはこれらの遺伝子を組
み込んだ組換宿主細胞から精製されるＤＮＡポリメラー
ゼなどが挙げられる。The thermostable polymerases isolated from thermophilic archaea include, for example, Desalflococcus mobilis, Methanobacterium thermoautorophicum, Methanothermus fervidus, Pyrococcus frius, Pyrodictium occultum, Sarpholobus
Purified from a DNA polymerase extracted from a bacterium selected from the group consisting of Acidocardarius, Sulfolobus solfataricus, Thermococcus litoralis and Thermoplasma acidophilium or a recombinant host cell incorporating these genes DNA polymerase etc. are mentioned.
【００２６】修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
は、天然酵素の蛋白質分解により、または天然酵素をコ
ードする遺伝子を切断した遺伝子から産生されてもよ
い。これらの酵素類は、それからＲＮＡ鋳型を使用し
て、デオキシリボヌクレオチドトリフォスフェートを重
合する限り、本発明の実施に有用である。The modified thermostable DNA polymerase may be produced by proteolysis of the natural enzyme or from a gene cleaved from the gene encoding the natural enzyme. These enzymes are useful in the practice of the invention as long as they then use RNA templates to polymerize deoxyribonucleotide triphosphates.
【００２７】本発明の緩衝溶液は１価陽イオンおよび２
価陽イオンを含むが、塩素イオン濃度は０〜１０ｍＭで
あることが必要である。塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭ
である緩衝溶液において、供給される１価陽イオンは、
カリウムイオン(K+ ) またはナトリウムイオン(Na + )
であり、その濃度は、１〜１００ｍＭであり、好ましく
は５０〜１００ｍＭの間における濃度である。従来はこ
れらの金属イオンは、塩化カリウムまたは塩化ナトリウ
ムとして供給されるが、本発明では塩素イオン濃度を０
〜１０ｍＭとするためには、これら以外の金属塩でもっ
て供給される。好ましくは酢酸カリウムまたはホウ酸カ
リウムあるいは酢酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウム
が挙げられる。The buffer solution of the present invention comprises a monovalent cation and 2
Although it contains a cation, the chloride ion concentration must be 0 to 10 mM. Chloride concentration is 0-10 mM
In the buffer solution, the monovalent cation supplied is
Potassium ion (K + ) or sodium ion (Na + )
And the concentration is from 1 to 100 mM, preferably between 50 and 100 mM. Conventionally, these metal ions are supplied as potassium chloride or sodium chloride, but in the present invention, the chloride ion concentration is 0.
In order to adjust to 10 mM, metal salts other than these are supplied. Preference is given to potassium acetate or potassium borate or sodium acetate or sodium borate.
【００２８】ＲＮＡ逆転写のために供給される２価陽イ
オンは、マンガンイオン(Mn2+ ) であり、濃度は０．０
１〜５０ｍＭ、好ましくは０．５〜１６ｍＭの間におけ
る濃度である。従来は塩化マンガンとして供給される
が、本発明では塩素イオン濃度を０〜１０ｍＭとするた
めには、これ以外の金属塩を使用する。好ましくは酢酸
マンガンまたはホウ酸マンガンが挙げられる。The divalent cation supplied for RNA reverse transcription is manganese ion (Mn 2+ ), and its concentration is 0.0
The concentration is between 1 and 50 mM, preferably between 0.5 and 16 mM. Conventionally, it is supplied as manganese chloride, but in the present invention, other metal salts are used in order to adjust the chloride ion concentration to 0 to 10 mM. Preferably, manganese acetate or manganese borate is used.
【００２９】デオキシリボヌクレオチドトリフォスフェ
ートは、dATP,dCTP,dGTP,dTTP(dNTP) のジナトリウムま
たはリチウム塩等の塩溶液として添加される。本発明に
おいては、各々１μＭ〜５ｍＭの最終濃度が好適であ
り、好ましくは０．１〜３．５ｍＭが良い。またｄＮＴ
Ｐはマンガンイオンの濃度により至適濃度が異なる。例
えばマンガンイオンが 2, 3, 4, 6, 8, 12mMの時、dNTP
は、0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4mMが好ましいが、こ
れらにより濃度を規定するものではない。Deoxyribonucleotide triphosphate is added as a salt solution such as a disodium or lithium salt of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (dNTP). In the present invention, a final concentration of 1 μM to 5 mM is preferable, and 0.1 to 3.5 mM is preferable. Also dNT
The optimum concentration of P varies depending on the concentration of manganese ions. For example, when manganese ion is 2, 3, 4, 6, 8, 12 mM, dNTP
Is preferably 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 or 2.4 mM, but the concentration is not specified by these.
【００３０】緩衝剤としては、ＴＡＰＳ、ビシン、ＢＴ
Ｐ、トリス−酢酸、ＴＥＡ−酢酸などが挙げられる。ト
リス−塩酸またはＴＥＡ−塩酸などの塩素イオンを含む
緩衝剤は０〜１０ｍＭの範囲になる量にて使用すること
ができる。ｐＨは８．０〜９．０の範囲、好ましくは
８．５である。緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭ、好ま
しくは５〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭ
である。ｃＤＮＡ合成の後、増幅反応を行うために、２
価陽イオンとして、マグネシウムイオン(Mg2+ ) を含ん
でいてもよい。その濃度は、０〜５０ｍＭ、好ましくは
０〜１６ｍＭの間における濃度である。従来では塩化マ
ンガンとして供給されるが、本発明では塩素イオン濃度
を０〜１０ｍＭとするためには、これ以外の金属塩が好
ましい。好ましくは酢酸マグネシウムまたはホウ酸マグ
ネシウムを使用する。As buffers, TAPS, bicine, BT
P, tris-acetic acid, TEA-acetic acid and the like. A buffer containing chloride ions such as Tris-hydrochloric acid or TEA-hydrochloric acid can be used in an amount of 0 to 10 mM. The pH is in the range of 8.0 to 9.0, preferably 8.5. The concentration of the buffer is 1 to 100 mM, preferably 5 to 50 mM, more preferably 10 to 20 mM.
Is. In order to carry out the amplification reaction after cDNA synthesis, 2
Magnesium ions (Mg 2+ ) may be contained as the valent cations. Its concentration is between 0 and 50 mM, preferably between 0 and 16 mM. Conventionally, it is supplied as manganese chloride, but in the present invention, other metal salts are preferable in order to set the chloride ion concentration to 0 to 10 mM. Preferably magnesium acetate or magnesium borate is used.
【００３１】本発明のＲＮＡの逆転写方法は、ＲＮＡ鋳
型を含む試料に、該鋳型に相補的なオリゴヌクレオチド
であるプライマー、４種のデオキシリボヌクレオチドト
リホスフェートおよび逆転写活性を有する熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼを塩素イオン濃度が、０〜１０ｍＭであ
る緩衝溶液中にて高温度にて作用させ、前記ＲＮＡ鋳型
の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成する。塩素
イオン濃度が１０ｍＭを越えると、反応効率が低下す
る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの反応は５０〜８０℃
で行うことが好ましい。The method for reverse transcription of RNA of the present invention comprises a sample containing an RNA template, a primer which is an oligonucleotide complementary to the template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates and a thermostable DN having reverse transcription activity.
A polymerase is allowed to act at a high temperature in a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM to form a cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template. If the chloride ion concentration exceeds 10 mM, the reaction efficiency decreases. The reaction of thermostable DNA polymerase is 50-80 ° C.
It is preferable to carry out.
【００３２】本発明のＲＮＡ逆転写反応用試薬キット
は、ＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌクレオチド、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオチ
ドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭ
である緩衝液を含む。好ましい組成例は、以下の通りで
ある。 緩衝剤 １０〜２０ｍＭ 酢酸カリウムまたはホウ酸カリウム ５０〜１００ｍＭ 酢酸マンガンまたはホウ酸マンガン ５〜１６ｍＭ 酢酸マグネシウムまたはホウ酸マグネシウム ０〜１６ｍＭ ｄＮＴＰ ０．８〜３．０ｍＭ 好ましい緩衝剤はＴＡＰＳ、ビシンまたはＢＴＰなどで
ある。該試薬キットはさらに酢酸ナトリウムまたはホウ
酸ナトリウムおよび／または酢酸カリウムまたはホウ酸
カリウムを含むことが好ましい。The reagent kit for RNA reverse transcription reaction of the present invention comprises an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a chloride ion concentration of 0 to 10 mM.
The buffer solution is A preferred composition example is as follows. Buffering agent 10 to 20 mM Potassium acetate or potassium borate 50 to 100 mM Manganese acetate or manganese borate 5 to 16 mM Magnesium acetate or magnesium borate 0 to 16 mM dNTP 0.8 to 3.0 mM Preferred buffering agent is TAPS, bicine or BTP. Is. The reagent kit preferably further contains sodium acetate or sodium borate and / or potassium acetate or potassium borate.
【００３３】本発明のＲＮＡ分子の検出方法は、上記逆
転写方法により生成したｃＤＮＡを変性して単鎖分子に
し、検出用プローブを使用して該ｃＤＮＡの存在を検出
する。すなわち本発明は下記工程を含むことを特徴とす
る特定標的ＲＮＡ分子の検出方法である。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝溶液中にて高温にて作用さ
せ、ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を
形成させ、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを変
性して単鎖分子にし、（ｃ）該ｃＤＮＡの存在を検出プ
ローブにより検出する。ｃＤＮＡの検出法としては、固
相法あるいは液相法などがあるが、特に限定されない。In the method for detecting an RNA molecule of the present invention, the cDNA produced by the above reverse transcription method is denatured into a single-stranded molecule, and the presence of the cDNA is detected using a detection probe. That is, the present invention is a method for detecting a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. In a buffer solution at a high temperature to form a cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template, and (b) denaturing the cDNA formed in step (a) into a single-stranded molecule, (C) The presence of the cDNA is detected by a detection probe. The method for detecting cDNA includes a solid phase method and a liquid phase method, but is not particularly limited.
【００３４】本発明の特定ＲＮＡ分子検出用試薬キット
は、ＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌクレオチド、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオチ
ドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭ
である緩衝溶液およびｃＤＮＡを検出する検出用プロー
ブを含む。好ましい試薬キットはＲＮＡ鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４
種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート類、少
なくとも１〜１００ｍＭの緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭ
の酢酸マンガンおよび１０〜１０００ｍＭの酢酸カリウ
ムを含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭである緩衝液お
よび検出用プローブおよびＤＮＡ検出用緩衝液を含んで
なるＲＮＡ検出用試薬キットである。検出用プローブと
しては、標識を有するプローブが好ましく、標識として
は放射性物質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素、蛍光物質
などが挙げられる。プローブと標識との結合にはビオチ
ン、アビジンなどを用いてもよい。酵素標識の場合、核
酸の検出は酵素と色素基質、化学発光基質または蛍光基
質との反応を一般的な光度測定、化学発光測定または蛍
光光度測定モニターリングによって測定される。ｃＤＮ
Ａ検出用プローブを使用する緩衝液は、トリス−塩酸緩
衝液などが好ましい。The reagent kit for detecting a specific RNA molecule of the present invention comprises an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a chloride ion concentration of 0 to 10 mM.
And a detection probe for detecting cDNA. Preferred reagent kits include oligonucleotides complementary to RNA template, thermostable DNA polymerase, 4
Deoxyribonucleotide triphosphates, at least 1-100 mM buffer, 0.01-50 mM
Is a reagent kit for RNA detection comprising a buffer solution containing manganese acetate of 10 to 1000 mM potassium acetate and a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, a detection probe, and a DNA detection buffer solution. The probe for detection is preferably a probe having a label, and examples of the label include radioactive substances, enzymes such as β-galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase, and fluorescent substances. Biotin, avidin or the like may be used for binding the probe to the label. In the case of enzyme labels, the detection of nucleic acids is measured by standard photometric, chemiluminescent or fluorometric monitoring of the reaction of the enzyme with dye substrates, chemiluminescent or fluorescent substrates. cDN
The buffer solution using the A detection probe is preferably Tris-hydrochloric acid buffer solution or the like.
【００３５】本発明のＲＮＡ分子の増幅方法は、上記逆
転写方法により生成したｃＤＮＡを鋳型とし、増幅反応
を行う。増幅方法はＰＣＲ法（特公平4-67957 号公報、
特公平4-67960 号公報) に限らず、ＮＡＳＢＡ法 (特開
平2-5864号公報、特表平4-501057号公報、WO91/02828)
、ＴＡＳ法 (特表平2-500565号公報、特表平2-501532
号公報) など従来公知の方法を適用することができる。
すなわち本発明の特定標的ＲＮＡ分子を鋳型とする増幅
方法は下記工程を含む。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有するＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度が０〜１
０ｍＭである緩衝溶液中にて作用させ、ＲＮＡ鋳型の配
列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成させ、（ｂ）工
程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを鋳型とし、増幅緩衝溶
液中でオリゴヌクレオチドをプライマーとし、熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅反応を行う。In the method for amplifying an RNA molecule of the present invention, an amplification reaction is carried out using the cDNA produced by the above reverse transcription method as a template. The amplification method is the PCR method (Japanese Patent Publication No. 4-67957).
Not limited to Japanese Patent Publication No. 4-67960), NASBA method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-5864, Japanese Patent Publication No. 4-501057, WO91 / 02828)
, TAS method (Japanese Patent Publication No. 2-500565, Japanese Patent Publication No. 2-501532)
It is possible to apply a conventionally known method such as the Japanese patent publication).
That is, the amplification method using the specific target RNA molecule of the present invention as a template includes the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a DNA polymerase having a reverse transcription activity are added with a chloride ion concentration of 0 to 1
It is allowed to act in a buffer solution of 0 mM to form a cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template, and (b) the cDNA formed in step (a) is used as a template, and the oligonucleotide is used in an amplification buffer solution. Is used as a primer and an amplification reaction is performed using a thermostable DNA polymerase.
【００３６】増幅用プライマーとしては、形成されたｃ
ＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであれ
ばよく、逆転写反応に使用したプライマーと同じでも、
異なっていてもよい。増幅用緩衝液としては酢酸マグネ
シウムまたはホウ酸マグネシウムなどのマグネシウムイ
オンを含むことが好ましい。As the amplification primer, the formed c
Any oligonucleotide that hybridizes with DNA may be used, even if it is the same as the primer used for the reverse transcription reaction
It may be different. The amplification buffer preferably contains magnesium ions such as magnesium acetate or magnesium borate.
【００３７】本発明のＲＮＡ分子の増幅方法は、前記工
程（ａ）における塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭである
緩衝液と、工程（ｂ）の増幅反応に用いられる緩衝液と
が同じであることが好ましい。また前記工程（ａ）にお
ける熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと工程（ｂ）の増幅反
応に用いられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとが同じ酵
素であることが好ましい。In the method for amplifying an RNA molecule of the present invention, the buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM in the step (a) and the buffer solution used in the amplification reaction in the step (b) are the same. Is preferred. Further, it is preferable that the thermostable DNA polymerase in the step (a) and the thermostable DNA polymerase used in the amplification reaction in the step (b) are the same enzyme.
【００３８】本発明のＲＮＡ分子の増幅用試薬キットは
ＲＮＡ鋳型に相補的なオリゴヌクレオチド、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオチドト
リホスフェート類、塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭであ
る緩衝液、増幅用プライマーおよび増幅用緩衝液を含ん
でなる。好ましい増幅用試薬キットはＲＮＡ鋳型に相補
的なオリゴヌクレオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、４種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート
類、少なくとも１〜１００ｍＭの緩衝剤、０．０１〜５
０ｍＭの酢酸マンガンまたはホウ酸マンガンおよび１０
〜１０００ｍＭの酢酸カリウムまたはホウ酸カリウムを
含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭである緩衝液、増幅
用プライマーおよび酢酸マグネシウムまたはホウ酸マグ
ネシウムを含む増幅用緩衝液を含んでなる。The reagent kit for amplifying an RNA molecule of the present invention comprises an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable D
It comprises NA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, an amplification primer and an amplification buffer solution. A preferred amplification reagent kit is an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four deoxyribonucleotide triphosphates, at least 1-100 mM buffer, 0.01-5.
0 mM manganese acetate or manganese borate and 10
It comprises a buffer having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM containing potassium acetate or potassium borate of ˜1000 mM, an amplification primer and an amplification buffer containing magnesium acetate or magnesium borate.
【００３９】本発明の特定標的ＲＮＡ分子の検出方法
は、上記増幅方法により増幅されたＲＮＡまたはＤＮＡ
を検出することもできる。該検出法は前記工程（ａ）に
おけるオリゴヌクレオチドが、工程（ｂ）の増幅反応に
用いられるオリゴヌクレオチドと同じものであることが
好ましい。また前記工程（ａ）における塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液が、工程（ｂ）の増幅反応
に用いられる緩衝液と同じ緩衝液であることが好まし
い。さらに前記工程（ａ）における熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼが工程（ｂ）の増幅反応に用いられる熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼと同じ酵素であってもよい。The method for detecting a specific target RNA molecule of the present invention comprises RNA or DNA amplified by the above amplification method.
Can also be detected. In the detection method, the oligonucleotide in step (a) is preferably the same as the oligonucleotide used in the amplification reaction in step (b). Further, it is preferable that the buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM in the step (a) is the same as the buffer solution used in the amplification reaction of the step (b). Further, the thermostable DNA polymerase in the step (a) may be the same enzyme as the thermostable DNA polymerase used in the amplification reaction in the step (b).
【００４０】[0040]
【発明の効果】本発明では逆転写活性を有する熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを塩素イオン濃度が０〜１０ｍＭで
ある緩衝液中にて作用させて、逆転写酵素活性を飛躍的
に上昇させることにより、昇温して行う逆転写反応を効
率的に行えるようになった。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, a thermostable DNA polymerase having a reverse transcriptase activity is allowed to act in a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM to dramatically increase the reverse transcriptase activity. It has become possible to efficiently carry out the reverse transcription reaction which is carried out at an elevated temperature.
【００４１】[0041]
【実施例】次に、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 参考例１ オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成
した。 第１オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは腸炎
ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct Haemolysin)遺伝
子の 483番目から 504番目のヌクレオチド配列と相補的
な配列を有する（配列番号１）。手法はＡＢＩ社マニュ
アルに従い、0.2 μM スケールで実施した。各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃で一夜実施
した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムにて実施した。Next, the present invention will be described in detail with reference to examples. Reference Example 1 Synthesis of Oligonucleotide An oligonucleotide having the following sequence was synthesized by a phosphoamidite method using ABI DNA Synthesizer Model 391. First oligonucleotide: This oligonucleotide has a sequence complementary to the nucleotide sequences from 483 to 504 of Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haemolysin) gene (SEQ ID NO: 1). The method was performed on a 0.2 μM scale according to the ABI manual. Deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C overnight. Purification was carried out by FPLC manufactured by Pharmacia on an anion exchange column.
【００４２】参考例２ （１）リンカーアームオリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて下記配列のリンカーアームオリゴヌク
レオチドを合成した。 リンカーアームオリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドは腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct Haemo
lysin)遺伝子の 102番目から 125番目のヌクレオチド配
列と相同な配列を有し、特表昭60-500717 号公報に記載
された合成法により、デオキシウリジンから化学合成し
た５位にリンカーアームを有するウリジンを、114 番目
のチミンと置換してある。（配列番号２）。手法はＡＢ
Ｉ社マニュアルに従い、0.2 μM スケールで実施した。
合成されたリンカーアームオリゴヌクレオチドの脱保護
はアンモニア水で50℃で一夜実施した。精製はファルマ
シア社製FPLCで陰イオン交換カラムにて実施した。Reference Example 2 (1) Synthesis of Linker Arm Oligonucleotide A linker arm oligonucleotide having the following sequence was synthesized by the phosphoamidite method using ABI DNA Synthesizer Model 391. Linker arm oligonucleotide: This oligonucleotide is a Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct Haemo)
lysin) has a sequence homologous to the nucleotide sequence from the 102nd to the 125th nucleotide and has a linker arm at the 5th position chemically synthesized from deoxyuridine by the synthetic method described in JP-A-60-500717. Has been replaced with the 114th thymine. (SEQ ID NO: 2). Method is AB
According to the manual of Company I, it was carried out on a 0.2 μM scale.
Deprotection of the synthesized linker arm oligonucleotide was carried out with aqueous ammonia at 50 ° C. overnight. Purification was carried out with an anion exchange column using FPLC manufactured by Pharmacia.
【００４３】（２）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献 (Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年）に従って
行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を 0.2
M 炭酸水素ナトリウム 12.5 μlに溶解し、ここへ10mg/
ml スベリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μl を加
えて室温、２分間反応させた。反応液を1mM 酢酸ソーダ
（pH5.0)で平衡化したSephadex G-25 （ファルマシア
社）カラム（1cm φx30cm)でゲル濾過して過剰のＤＳＳ
を除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオ
リゴヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性
ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(100mM N
aHCO 3 、3M NaCl)に溶解したもの）と室温、16時間反応
させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プロー
ブを得た。得られた標識プローブは、ファルマシア社製
FPLCで陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プロ
ーブを含む画分を集め、セントリコン30K （アミコン
社）を用いて限外濾過法により濃縮した。(2) Enzyme of linker oligonucleotide
Labeling with alkaline phosphatase The above linker oligonucleotide and its linker
Binding to alkaline phosphatase through the
According to the dedication (Nucleic Acids Res .; 14: 6115, 1986)
I did. Linker oligonucleotide 1.5 A260To 0.2
M Dissolve in 12.5 μl of sodium hydrogen carbonate and add 10 mg /
Add 25 μl of ml disuccinimidyl suberate (DSS)
Then, the mixture was reacted at room temperature for 2 minutes. Add 1 mM sodium acetate to the reaction mixture.
Sephadex G-25 (Pharmacia) equilibrated at (pH 5.0)
Excess DSS by gel filtration with a column (1 cm φx30 cm)
Was removed. Linker activated with the terminal amino group
2 times more alkaline than the lygonucleotide in molar ratio
Phosphatase (Boehringer Mannheim, (100 mM N
aHCO 3, 3M NaCl) at room temperature for 16 hours
Allowing alkaline phosphatase labeled nucleic acid probe
I got a boo. The obtained labeled probe is manufactured by Pharmacia.
Purified with FPLC using an anion exchange column. Sign professional
The fractions containing the tubes are collected and sent to Centricon 30K (Amicon
Company) and was concentrated by the ultrafiltration method.
【００４４】参考例３ テンプレートＲＮＡの合成 プラスミド pTI12（Gene,93(1990)9-15)のEcoRI 断片
を、ブルースクリオプトSK + EcoRI 切断部位にT7 RNA
ポリメラーゼのプロモーターとTDH遺伝子が順方向にな
るように組み込んだプラスミドを、制限酵素SalIで切断
したものを鋳型とし、T7 RNAポリメラーゼにより合成し
た。Reference Example 3 Synthesis of template RNA The EcoRI fragment of the plasmid pTI12 (Gene, 93 (1990) 9-15) was added to the T7 RNA at the cleavage site of Bruce Crypt SK + EcoRI.
A plasmid into which the promoter of the polymerase and the TDH gene were integrated in the forward direction was cleaved with the restriction enzyme SalI and used as a template to synthesize with T7 RNA polymerase.
【００４５】実施例１ 熱安定性逆転写反応 操作（ａ）:参考例１のオリゴヌクレオチド40pmol、参
考例３のRNA を下記の塩素濃度が異なる各種反応液10μ
l に加え、60℃に30分間保温した。 反応液 1 (塩素イオン 0mM) 10mM TAPS (pH8.5) 75mM CH3COOK 8mM Mn(CH3COO)2 6mM Mg(CH3COO)2 2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP Tth DNA ポリメラーゼ 2.5 単位 反応液 2 (塩素イオン 25mM) 10mM TAPS (pH8.5) 50mM CH3COOK 25mM KCl 8mM Mn(CH3COO)2 6mM Mg(CH3COO)2 2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP Tth DNA ポリメラーゼ 2.5 単位 反応液 3 (塩素イオン 50mM) 10mM TAPS (pH8.5) 25mM CH3COOK 50mM KCl 8mM Mn(CH3COO)2 6mM Mg(CH3COO)2 2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP Tth DNA ポリメラーゼ 2.5 単位 反応液 4 (塩素イオン 75mM) 10mM TAPS (pH8.5) 75mM KCl 8mM Mn(CH3COO)2 6mM Mg(CH3COO)2 2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP Tth DNA ポリメラーゼ 2.5 単位 反応液 5 (塩素イオン 100mM) 10mM TAPS (pH8.5) 75mM KCl 0.5mM Mn(CH3COO)2 7.5mM MnCl2 1mM Mg(CH3COO)2 5mM MgCl2 2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP Tth DNA ポリメラーゼ 2.5 単位Example 1 Thermostable Reverse Transcription Reaction Operation (a): Oligonucleotide 40 pmol of Reference Example 1 and RNA of Reference Example 3 were mixed with 10 μl of various reaction solutions having different chlorine concentrations below.
In addition, the mixture was kept at 60 ° C for 30 minutes. Reaction solution 1 (chlorine ion 0 mM) 10 mM TAPS (pH8.5) 75 mM CH 3 COOK 8 mM Mn (CH 3 COO) 2 6 mM Mg (CH 3 COO) 2 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP Tth DNA polymerase 2.5 unit reaction solution 2 (Chloride ion 25mM) 10mM TAPS (pH8.5) 50mM CH 3 COOK 25mM KCl 8mM Mn (CH 3 COO) 2 6mM Mg (CH 3 COO) 2 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP Tth DNA polymerase 2.5 unit reaction solution 3 (Chloride 50mM) 10mM TAPS (pH8.5) 25mM CH 3 COOK 50mM KCl 8mM Mn (CH 3 COO) 2 6mM Mg (CH 3 COO) 2 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP Tth DNA polymerase 2.5 unit reaction solution 4 (Chloride 75mM) 10mM TAPS (pH8.5) 75mM KCl 8mM Mn (CH 3 COO) 2 6mM Mg (CH 3 COO) 2 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP Tth DNA polymerase 2.5 units Reaction solution 5 (Chloride 100mM) 10mM TAPS (pH8.5) 75mM KCl 0.5mM Mn (CH 3 COO) 2 7.5mM MnCl 2 1mM Mg (CH 3 COO) 2 5mM MgCl 2 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP Tth DNA polymerase 2.5 units
【００４６】操作（ｂ）:上記反応液の温度を37℃に下
げ、リボヌクレアーゼ H (東洋紡績製) を2.5単位加
え、30分間保温した。 操作（ｃ）:各反応液１μlをナイロン膜（Hybond N+ 、
アマシャム社）上に滴下し、乾燥させた。 操作（ｄ）:上記膜をハイブリダイゼーションバック(BR
L社) に移し、プレハイブリダイゼーションバッファー
（5xSSC 、0.5%ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニルピ
ロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム）を加えてポリシ
ーラーでシールし、50℃、15分間プレハイブリダイゼー
ションを行った。 操作（ｅ）：プレハイブリダイゼーションバッファーを
捨て、参考例２のアルカリホスファターゼ標識オリゴヌ
クレオチドを 10pmol/ml含むプレハイブリダイゼーショ
ンバッファーを加えてポリシーラーでシールし、50℃、
15分間ハイブリダイゼーションを行った。 操作（ｆ）：膜をポリバッグから取り出し、洗浄液１
（2xSSC 、1%ドデシル硫酸ナトリウム）で50℃、10分間
振とう洗浄した。更に洗浄液２（1xSSC 、0.5% TritonX
-100）で室温、10分間振とう洗浄した。最後に洗浄液３
（1xSSC ）で室温５分間振とう洗浄した。 操作（ｇ）：膜を新しいハイブリダイゼーションバッグ
に移し、基質液（0.1M Tris-HCl 、0.1M NaCl 、0.1M M
gCl2、0.3mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/ml
ブロムクロロインドフェリールホスフェート(pH7.5))を
入れ、ポリシーラーでシールし、37℃で１時間インキュ
ベートした。 操作（ｈ）：膜をポリバッグから取り出し、蒸留水で洗
浄の後、乾燥させた。 操作（ｉ）：アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫
色色素のスポットを色彩色差計CR-221(Minolta Co. Lt
d.)により、色差を測定した。その結果を図１に示す。
横軸は反応液中の塩素イオン濃度、縦軸は色彩色差計の
値を示す。図１から明らかなように、塩素イオンが少な
いほど逆転写反応の効率は高くなった。Operation (b): The temperature of the reaction solution was lowered to 37 ° C., 2.5 units of ribonuclease H (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was added, and the mixture was kept warm for 30 minutes. Operation (c): Add 1 μl of each reaction solution to a nylon membrane (Hybond N + ,
Amersham) and dried. Operation (d): Hybridization back (BR
(Company L), prehybridization buffer (5xSSC, 0.5% bovine serum albumin, 0.5% polyvinylpyrrolidone, 1% sodium dodecyl sulfate) was added and sealed with a policyr, and prehybridization was performed at 50 ° C for 15 minutes. . Operation (e): The prehybridization buffer was discarded, a prehybridization buffer containing 10 pmol / ml of the alkaline phosphatase-labeled oligonucleotide of Reference Example 2 was added, and the mixture was sealed with a policyr at 50 ° C.
Hybridization was performed for 15 minutes. Operation (f): Remove the membrane from the plastic bag and wash solution 1
(2xSSC, 1% sodium dodecyl sulfate) was washed by shaking at 50 ° C for 10 minutes. Furthermore, cleaning solution 2 (1xSSC, 0.5% TritonX
-100) at room temperature for 10 minutes with shaking. Lastly cleaning liquid 3
Washing with (1xSSC) at room temperature for 5 minutes with shaking. Procedure (g): The membrane was transferred to a new hybridization bag and the substrate solution (0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.1MM) was added.
gCl 2 , 0.3 mg / ml nitroblue tetrazolium, 0.3 mg / ml
Bromchloroindoferryl phosphate (pH 7.5) was added, and the mixture was sealed with a policyr and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Operation (h): The membrane was taken out of the plastic bag, washed with distilled water, and then dried. Operation (i): A spot of purple dye generated by alkaline phosphatase was measured using a colorimeter CR-221 (Minolta Co. Lt.
The color difference was measured according to d.). The result is shown in FIG.
The horizontal axis shows the chlorine ion concentration in the reaction solution, and the vertical axis shows the value of the colorimeter. As is clear from FIG. 1, the efficiency of the reverse transcription reaction increased as the chloride ion content decreased.
【００４７】[0047]
配列番号：1 配列の長さ：22 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct H
aemolysin)遺伝子の483 番目から504 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTACCACTC TCATATGCTT CT 22SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 22 Sequence Type: Nucleic Acid Topology: Single Strand Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence Features Location: 1..22 Characterization Method: S Other Features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct H
aemolysin) gene has a sequence complementary to the nucleotide sequence from the 483rd nucleotide to the 504th nucleotide. Sequence ACTACCACTC TCATATGCTT CT 22
【００４８】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..24 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct H
aemolysin)遺伝子の102番目から125 番目のヌクレオチ
ド配列と相同な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GAUGAGATAT TGTT 24SEQ ID NO: 2 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid synthetic DNA Sequence features Location: 1..24 Features Method of determining S: Other features: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct H
aemolysin) gene, which has a sequence homologous to the 102nd to 125th nucleotide sequences. Sequence CCCCGGTTCT GAUGAGATAT TGTT 24
【図１】実施例１における反応液中の塩素イオン濃度と
色彩色素計により測定した色差との関係を示す。FIG. 1 shows the relationship between the chlorine ion concentration in the reaction liquid and the color difference measured by a color pigment meter in Example 1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/567 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:07） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/567 // (C12N 9/12 C12R 1:01) (C12N 9/12 C12R 1:07) )
Claims (34)
的なオリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオ
キシリボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活
性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて作用させ、前記Ｒ
ＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成す
ることを特徴とするＲＮＡの逆転写方法。1. A sample containing an RNA template, a primer which is an oligonucleotide complementary to the template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates and a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity, and a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. R in the buffer solution
A method for reverse transcription of RNA, which comprises forming a cDNA sequence complementary to the sequence of NA template.
的なオリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオ
キシリボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活
性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを塩素イオン濃
度が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温で作用させ、
前記ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を
形成することを特徴とするＲＮＡの逆転写方法。2. A sample containing an RNA template, a primer which is an oligonucleotide complementary to the template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity, and a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. At high temperature in the buffer solution
A method for reverse transcription of RNA, which comprises forming a cDNA sequence complementary to the sequence of said RNA template.
は感染性疾患の診断用の試料であることを特徴とする請
求項１または２に記載のＲＮＡの逆転写方法。3. The method for reverse transcription of RNA according to claim 1 or 2, wherein the sample containing the RNA template is a sample for diagnosing a genetic or infectious disease.
メラーゼが好熱細菌由来のＤＮＡポリメラーゼまたは好
熱古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴と
する請求項２に記載のＲＮＡの逆転写方法。4. The method for reverse transcription of RNA according to claim 2, wherein the thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity is a DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium or a DNA polymerase derived from a thermophilic archaea. .
サーマス・アクアティカス、バチルス・ステアロサーモ
フィラス、サーモシホ・アフリカナス、サーモトガ・マ
リチーマ、サーマスＳＰＳ１７種、サーマス・フラバ
ス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンスおよ
びサーマス・ルーバーからなる群から選ばれた細菌であ
ることを特徴とする請求項４記載のＲＮＡの逆転写方
法。5. The thermophilic bacterium is Thermus thermophilus,
A bacterium selected from the group consisting of Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus, Thermosiho africanus, Thermotoga maritima, Thermus SPS17 species, Therma flavus, Therma lacteus, Therma rubens and Therma louver The method for reverse transcription of RNA according to claim 4, wherein the method is reverse transcription.
リス、メタノバクテリウム・サーモオートロフィカム、
メタノサーマス・フェルビダス、パイロコッカス・フリ
オウス、ピロディクチウム・オクルタム、サルホロブス
・アシドカルダリウス、サルホロブス・ソルファタリカ
ス、サーモコッカス・リトラリスおよびサーモプラズマ
・アシドフィリウムからなる群から選ばれた細菌である
ことを特徴とする請求項４記載のＲＮＡの逆転写方法。6. The thermophilic archaea are desalhulococcus mobilis, methanobacterium thermoautorophicum,
It is characterized by being a bacterium selected from the group consisting of Methanothermus fervidus, Pyrococcus frius, Pyrodictium occultum, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Thermococcus litoralis, and Thermoplasma acidophilum. The reverse transcription method of RNA according to claim 4.
徴とする請求項２記載のＲＮＡの逆転写方法。7. The method for reverse transcription of RNA according to claim 2, wherein the reaction temperature is 50 to 80 ° C.
衝液がマンガンイオン及び／またはマグネシウムイオン
を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の
ＲＮＡの逆転写方法。8. The method of reverse transcription of RNA according to claim 1, wherein the buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM contains manganese ions and / or magnesium ions.
ウ酸マンガンからなることを特徴とする請求項８に記載
のＲＮＡの逆転写方法。9. The method for reverse transcription of RNA according to claim 8, wherein the manganese ion comprises manganese acetate or manganese borate.
ムまたはホウ酸マグネシウムからなることを特徴とする
請求項８に記載のＲＮＡの逆転写方法。10. The method for reverse transcription of RNA according to claim 8, wherein the magnesium ion comprises magnesium acetate or magnesium borate.
緩衝液がマンガンイオン及び／またはマグネシウムイオ
ンの他に、さらにナトリウムイオンおよび／またはカリ
ウムイオンを含有することを特徴とする請求項１または
２に記載のＲＮＡの逆転写方法。11. The buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM further contains sodium ion and / or potassium ion in addition to manganese ion and / or magnesium ion. The reverse transcription method of RNA as described.
たはホウ酸ナトリウムからなることを特徴とする請求項
１１に記載のＲＮＡの逆転写方法。12. The method for reverse transcription of RNA according to claim 11, wherein the sodium ion comprises sodium acetate or sodium borate.
ホウ酸カリウムからなることを特徴とする請求項１１に
記載のＲＮＡの逆転写方法。13. The method for reverse transcription of RNA according to claim 11, wherein the potassium ion comprises potassium acetate or potassium borate.
衝液、ＢＴＰ緩衝液、トリス−酢酸緩衝液またはＴＥＡ
−酢酸緩衝液であることを特徴とする請求項１または請
求項２に記載のＲＮＡの逆転写方法。14. The buffer solution is TAPS buffer solution, bicine buffer solution, BTP buffer solution, Tris-acetate buffer solution or TEA.
-The method for reverse transcription of RNA according to claim 1 or 2, which is an acetate buffer.
緩衝液が１〜１００ｍＭの緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭ
の酢酸マンガンまたはホウ酸マンガンおよび１０〜１０
００ｍＭの酢酸カリウムまたはホウ酸カリウムを含むこ
とを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＲＮＡ
の逆転写方法。15. A buffer having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM and a buffer of 1 to 100 mM, 0.01 to 50 mM.
Of manganese acetate or manganese borate and 10 to 10
RNA according to claim 1 or claim 2, characterized in that it contains 00 mM potassium acetate or potassium borate.
Reverse transcription method.
標的ＲＮＡ分子の検出方法。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温度で作用させ、
ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成
させ、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを変性し
て単鎖分子にし、（ｃ）該ｃＤＮＡの存在を検出用プロ
ーブを用いて検出する。16. A method for detecting a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. At high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template is formed, (b) the cDNA formed in step (a) is denatured into a single-stranded molecule, and (c) the presence of the cDNA is detected using a detection probe. To detect.
標的ＲＮＡ分子の増幅方法。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温にて作用させ、
ＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成
させ、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを鋳型と
し、オリゴヌクレオチドをプライマーとし、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを使用して増幅反応緩衝液中で増幅反
応を行う。17. A method for amplifying a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. At high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the RNA template is formed, (b) the cDNA formed in step (a) is used as a template, the oligonucleotide is used as a primer, and the thermostability D
The amplification reaction is performed in amplification reaction buffer using NA polymerase.
度が０〜１０ｍＭである緩衝液が、工程（ｂ）の増幅反
応に用いられる緩衝液と同じであることを特徴とする請
求項１７に記載の特定標的ＲＮＡ分子を鋳型とする増幅
方法。18. The buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM in the step (a) is the same as the buffer solution used in the amplification reaction of the step (b). A method of amplification using the specific target RNA molecule as a template.
Ａポリメラーゼが工程（ｂ）の増幅反応に用いられる熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼと同じ酵素であることを特徴
とする請求項１７に記載の特定標的ＲＮＡ分子を鋳型と
する増幅方法。19. The thermostable DN in step (a).
18. The amplification method using a specific target RNA molecule as a template according to claim 17, wherein A polymerase is the same enzyme as the thermostable DNA polymerase used in the amplification reaction of step (b).
標的ＲＮＡ分子の検出方法。 （ａ）試料中の特定標的ＲＮＡ分子に、鋳型に相補的な
オリゴヌクレオチドであるプライマー、４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートおよび逆転写活性を
有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、塩素イオン濃度
が０〜１０ｍＭである緩衝液中にて高温で作用させ、Ｒ
ＮＡ鋳型の配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成さ
せ、 （ｂ）工程（ａ）で形成されたｃＤＮＡを鋳型とし、オ
リゴヌクレオチドをプライマーとし、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼを使用して増幅反応緩衝液中で増幅反応を行
う。 （ｃ）工程（ｂ）で増幅されたｃＤＮＡを変性して単鎖
分子にし、 （ｄ）該ｃＤＮＡの存在を検出用プローブを用いて検出
する。20. A method for detecting a specific target RNA molecule, which comprises the following steps. (A) To a specific target RNA molecule in a sample, a primer which is an oligonucleotide complementary to a template, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity are added at a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. R at high temperature in a buffer solution
A cDNA sequence complementary to the sequence of the NA template is formed, and (b) the cDNA formed in step (a) is used as a template, an oligonucleotide is used as a primer, and an amplification reaction buffer is prepared using a thermostable DNA polymerase. Amplification reaction is performed in the liquid. (C) The cDNA amplified in step (b) is denatured into a single-stranded molecule, and (d) the presence of the cDNA is detected using a detection probe.
オチドが、工程（ｂ）の増幅反応に用いられるオリゴヌ
クレオチドと同じものであることを特徴とする請求項２
０に記載の特定標的ＲＮＡ分子の検出方法。21. The oligonucleotide in step (a) is the same as the oligonucleotide used in the amplification reaction in step (b).
The method for detecting a specific target RNA molecule according to 0.
度が０〜１０ｍＭである緩衝液が、工程（ｂ）の増幅反
応に用いられる緩衝液と同じ緩衝液であることを特徴と
する請求項２０に記載の特定標的ＲＮＡ分子の検出方
法。22. The buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM in the step (a) is the same as the buffer solution used in the amplification reaction in the step (b). The method for detecting a specific target RNA molecule according to 1.
Ａポリメラーゼが工程（ｂ）の増幅反応に用いられる熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼと同じ酵素であることを特徴
とする請求項２０に記載の特定標的ＲＮＡ分子の検出方
法。23. Thermally stable DN in step (a)
21. The method for detecting a specific target RNA molecule according to claim 20, wherein A polymerase is the same enzyme as the thermostable DNA polymerase used in the amplification reaction of step (b).
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が
０〜１０ｍＭである緩衝液を含んでなＲＮＡ逆転写反応
用試薬キット。24. A reagent for RNA reverse transcription reaction comprising an oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, and a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM. kit.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、１〜１００ｍＭの
緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭの酢酸マンガンまたはホウ
酸マンガンおよび１０〜１０００ｍＭの酢酸カリウムま
たはホウ酸カリウムを含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍ
Ｍである緩衝液であることを特徴とする請求項２４に記
載のＲＮＡ逆転写反応用試薬キット。25. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four deoxyribonucleotide triphosphates, 1-100 mM buffer, 0.01-50 mM manganese acetate or borate and 10 Chloride concentration including potassium acetate or potassium borate of ~ 1000mM is 0 ~ 10m
The reagent kit for RNA reverse transcription reaction according to claim 24, which is a buffer solution of M.
チド、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼまたは組換えＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼ、０．８〜３．０ｍＭの４種のデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類および１０〜２
０ｍＭの緩衝剤、５〜１６ｍＭの酢酸マンガンまたはホ
ウ酸マンガンおよび５０〜１０００ｍＭの酢酸カリウム
またはホウ酸カリウムを含む塩素イオン濃度が０〜１０
ｍＭである緩衝液からなることを特徴とする請求項２４
に記載のＲＮＡ逆転写反応用試薬キット。26. An oligonucleotide complementary to an RNA template, Tth DNA polymerase or recombinant TthD.
NA polymerase, 0.8-3.0 mM of four deoxyribonucleotide triphosphates and 10-2
Chloride concentration including 0 mM buffer, 5-16 mM manganese acetate or manganese borate and 50-1000 mM potassium acetate or potassium borate, 0-10.
25. A buffer solution comprising mM.
The reagent kit for RNA reverse transcription reaction according to 1.
液、ＢＴＰ緩衝液、トリス−酢酸緩衝液またはＴＥＡ−
酢酸緩衝液であることを特徴とする請求項２４に記載の
ＲＮＡ逆転写反応用試薬キット。27. The buffer is TAPS buffer, bicine buffer, BTP buffer, Tris-acetate buffer or TEA-.
The reagent kit for RNA reverse transcription reaction according to claim 24, which is an acetate buffer.
トリウムおよび／または酢酸カリウムまたはホウ酸カリ
ウムを含むことを特徴とする請求項２４に記載のＲＮＡ
逆転写反応用試薬キット。28. The RNA according to claim 24, further comprising sodium acetate or sodium borate and / or potassium acetate or potassium borate.
Reverse transcription reaction reagent kit.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が
０〜１０ｍＭである緩衝液、検出用プローブおよびＤＮ
Ａ検出用緩衝液を含んでなるＲＮＡ検出用試薬キット。29. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, a detection probe and DN.
A reagent kit for RNA detection comprising a buffer for A detection.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、１〜１００ｍＭの
緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭの酢酸マンガンまたはホウ
酸マンガンおよび１０〜１０００ｍＭの酢酸カリウムま
たはホウ酸カリウムを含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍ
Ｍである緩衝液および検出用プローブおよびＤＮＡ検出
用緩衝液を含んでなるＲＮＡ検出用試薬キット。30. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four deoxyribonucleotide triphosphates, 1-100 mM buffer, 0.01-50 mM manganese acetate or borate and 10 Chloride concentration including potassium acetate or potassium borate of ~ 1000mM is 0 ~ 10m
An RNA detection reagent kit comprising a buffer solution of M, a detection probe, and a DNA detection buffer solution.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が
０〜１０ｍＭである緩衝液、増幅用プライマーおよび増
幅用緩衝液を含んでなるＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅
用試薬キット。31. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, an amplification primer and an amplification buffer solution. A reagent kit for DNA amplification, which comprises RNA as a template.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、１〜１００ｍＭの
緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭの酢酸マンガンまたはホウ
酸マンガンおよび１０〜１０００ｍＭの酢酸カリウムま
たはホウ酸カリウムを含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍ
Ｍである緩衝液、増幅用プライマーおよび増幅用緩衝液
を含んでなるＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅用試薬キッ
ト。32. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four deoxyribonucleotide triphosphates, 1-100 mM buffer, 0.01-50 mM manganese acetate or borate and 10 Chloride concentration including potassium acetate or potassium borate of ~ 1000mM is 0 ~ 10m
A reagent kit for DNA amplification using RNA as a template, which comprises a buffer solution of M, a primer for amplification, and a buffer solution for amplification.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、塩素イオン濃度が
０〜１０ｍＭである緩衝液、増幅用プライマー、増幅用
緩衝液、ＤＮＡ検出用プローブおよびＤＮＡ検出用緩衝
液を含んでなるＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ検出用試薬キ
ット。33. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, a buffer solution having a chloride ion concentration of 0 to 10 mM, an amplification primer, an amplification buffer solution, A DNA detection reagent kit using RNA as a template, which comprises a DNA detection probe and a DNA detection buffer.
チド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリ
ボヌクレオチドトリホスフェート類、１〜１００ｍＭの
緩衝剤、０．０１〜５０ｍＭの酢酸マンガンまたはホウ
酸マンガンおよび１０〜１０００ｍＭの酢酸カリウムま
たはホウ酸マンガンを含む塩素イオン濃度が０〜１０ｍ
Ｍである緩衝液、増幅用プライマー、増幅用緩衝液、Ｄ
ＮＡ検出用プローブおよびＤＮＡ検出用緩衝液を含んで
なるＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ検出用試薬キット。34. An oligonucleotide complementary to an RNA template, a thermostable DNA polymerase, four deoxyribonucleotide triphosphates, 1-100 mM buffer, 0.01-50 mM manganese acetate or borate and 10 Chloride concentration including ~ 1000mM potassium acetate or manganese borate 0 ~ 10m
M buffer, amplification primer, amplification buffer, D
A DNA detection reagent kit using RNA as a template, which comprises a NA detection probe and a DNA detection buffer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6187620A JPH0851979A (en) | 1994-08-09 | 1994-08-09 | Method for reverse transcription of rna and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6187620A JPH0851979A (en) | 1994-08-09 | 1994-08-09 | Method for reverse transcription of rna and its use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0851979A true JPH0851979A (en) | 1996-02-27 |
Family
ID=16209301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6187620A Pending JPH0851979A (en) | 1994-08-09 | 1994-08-09 | Method for reverse transcription of rna and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0851979A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500054A (en) * | 2004-05-27 | 2008-01-10 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | Method for direct detection of diagnostic RNA |
| CN110846724A (en) * | 2019-12-03 | 2020-02-28 | 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 | Method and kit for constructing mRNA chain specific library |
| CN114144188A (en) * | 2019-05-21 | 2022-03-04 | 台湾地区“中央研究院” | Method for amplifying and detecting ribonucleic acid (RNA) fragments |
-
1994
- 1994-08-09 JP JP6187620A patent/JPH0851979A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500054A (en) * | 2004-05-27 | 2008-01-10 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | Method for direct detection of diagnostic RNA |
| JP2012034705A (en) * | 2004-05-27 | 2012-02-23 | E I Du Pont De Nemours & Co | Method for direct detection of diagnostic rna |
| CN114144188A (en) * | 2019-05-21 | 2022-03-04 | 台湾地区“中央研究院” | Method for amplifying and detecting ribonucleic acid (RNA) fragments |
| CN110846724A (en) * | 2019-12-03 | 2020-02-28 | 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 | Method and kit for constructing mRNA chain specific library |
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