【発明の詳細な説明】
ＲＮＡを含む凍結乾燥組成物
本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む凍結乾燥組成物及び該組成物の製造法に
関する。本発明はさらに、核酸の検出法における該組成物の使用及び該組成物を
含む核酸の検出用テストキットに関する。
ＲＮＡはかなり過敏であり且つ比較的不安定な物質であることが知られている
。溶液中のＲＮＡは多かれ少なかれ急速に劣化しやすい。特にＲＮアーゼによる
分解はＲＮＡ調製物を取り扱う際の重要問題である。この遍在エンザイム（ＲＮ
アーゼは指先、ほこりなどの中に存在する）は熱安定性であり、その酵素活性を
得るのに補因子を必要としない。これは、ＲＮＡ調製物中のＲＮアーゼの不活性
化を困難にする。ＲＮアーゼを含まないＲＮＡを得るいくつかの単離法（Sambro
ok J.，Fritch E．F.及びManiatis T.（1989）Molecular Cloning：A Laborator
y Manual，第２版，第１巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor；Ausubel，F．M.ら編（1990）Current Protocols in Molecular Biol
ogy，第１巻，Green/Wiley-interscience．New York）があるが、精製又は単離
、即ちＲＮＡ
の可溶化という最終段階でＲＮアーゼの混入を回避するための予防処置を講じる
必要がある。一般的な方法は、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水中
でＲＮＡを可溶化することである（Chomczynski P．（1992），Solubilization
in formamide protects RNA from degradation，Nucleic Acid Research，第20
巻（14））。しかし、可溶化ＲＮＡは試料の取り扱い及び貯蔵の間に偶発的に汚
染されやすい。さらに、水に溶解したＲＮＡ試料の長期貯蔵には、分解を回避す
るために温度を-70℃まで低くする必要がある。代替案として、ＤＥＰＣ処理し
た水の代わりにホルムアミド中でＲＮＡを可溶化することも可能である。ホルム
アミドは、ＲＮＡをＲＮアーゼによる分解から効果的に保護し、-20℃での長期
貯蔵を可能にする。しかし、ＲＮＡ調製物を、輸送及び２〜８℃又はそれ以上の
温度での貯蔵を可能にする妥当な貯蔵寿命を有する実用製品にするためには、上
記方法では不十分である。
従って、容易に長期保存し得且つ取り扱い易い安定なＲＮＡ含有組成物が要望
されている。
本発明は凍結乾燥ＲＮＡ含有粒子を提供する。
凍結乾燥法がＲＮＡに有害な作用を及ぼすことなく且つ
全ての可能な不活性化プロセスを実質的に遅延させることが見いだされた。凍結
乾燥ＲＮＡにより、その構造を変化させることなく長期間保存し得る安定な製品
を得ることができる。従って、本発明の凍結乾燥ＲＮＡ含有組成物は、例えば、
現在使用されているＲＮＡ含有試薬溶液の極めて有用な代替物である。本発明の
粒子は乾燥体であり、従って種々の分解プロセスに対して殆ど悲感受性である。
本発明は、多様なＲＮＡに用いることが可能である。様々な長さのＲＮＡ配列
を凍結乾燥し得る。長さが例えば、数百〜数千の範囲で変化するヌクレオチドの
全てのＲＮＡ配列を本発明の凍結乾燥組成物に配合することが可能である。
本発明の凍結乾燥粒子は種々の粒状形態で存在し得る。驚くべきことには、該
粒子は、例えば、層状で凍結乾燥される物質より高い安定性を有し且つ極めて可
溶性である。これらの凍結乾燥粒子中のＲＮＡは、２〜８℃から37℃までの温度
で少なくとも１年間の貯蔵の間にも安定である。ＲＮＡは球状粒子の形態で凍結
乾燥するのが好ましい。
球状凍結乾燥粒子〔アキュスフェア又はリオスフェア（accuspheres又はlyosp
heres）〕がPriceら（US3,655,83
8明細書）から公知である。これらの球状ビーズは免疫反応用の物質を含んでい
る。生物学的に活性な物質を含むリオスフェアは、例えば、USP3,932,943明細書
及び他の多くの特許明細書から公知となっている。リオスフェアの利点は、その
粒子の均一性、製品の取り扱い易さ、凍結乾燥プロセスが速いこと、凍結乾燥プ
ロセスの間の分解が少ないこと及び溶解特性が改良されていることである。
リオスフェアは、ＲＮＡ水溶液の液滴を凍結乾燥することにより形成し得る。
所望サイズの液滴を得るために、該溶液を、氷浴中（例えば、DT2,140,747、EP8
1913又はUS3,928,566の各明細書に開示されている）、液体窒素中（例えばJ59 1
69,504明細書）に、又は冷却ドラム（例えばUSP3892876明細書）又は冷却プレー
ト（例えばUS4,501,719明細書）上に噴霧し得る。種々の他の方法も当業におい
て周知である。
本発明の凍結乾燥粒子は、ＲＮＡの他に、安定剤、例えばスクロース、マンニ
トール、デキストラン、ソルビトール及びグリセロールのようなポリヒドロキシ
化合物を含んでいてよい。
本発明の凍結乾燥粒子は、核酸検出法における診断試薬
として特に有用である。核酸を検出するための診断法は通常、臨床試料から単離
した核酸を増幅することを含む。本発明の凍結乾燥粒子の場合に用い得る増幅技
術のうちの一つは、ＮＡＳＢＡ、即ち、欧州特許出願EP0,329,822に開示されて
いる「核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）」である。この技術を用いて、大量
のＲＮＡを合成し得る。
標的配列の増幅を含む、核酸配列を検出するための診断法において、試料に内
部対照配列（internal control sequence）を添加す場合がある。そのような方
法が、同時係属で且つ本出願人所有の出願であるPCT/EP93/02284明細書に記載さ
れている。該明細書に記載の方法に用いられている内部対照配列は、標的配列か
ら区別し得る核酸配列を含み、該核酸配列は標的配列と同一の増幅試薬を用いて
増幅し得る。
これらの「内部対照配列」は本発明の凍結乾燥粒子に配合し得、PCT/EP93/022
84明細書に記載の方法に用いるのに好適である。
試料中の核酸の定量法にも凍結乾燥粒子を用いることができる。
標的核酸に対応する既知数の核酸配列分子を未知数の標
的核酸配列を含む試料に添加することを用いる核酸の定量法が、EP525882の下に
公開された同時係属で且つ本出願人所有の欧州特許出願明細書に記載されている
。該明細書に記載の方法は、既知量の明確に規定された突然変異体配列を添加し
た未知濃度の野生型標的核酸を含む試料から核酸を増幅するという原理に基づい
ている。増幅は、標的及び突然変異体配列にハイブリダイズし得る１つのプライ
マーセットを用いて行われる。EP525882に記載の競合増幅は、固定量の試料と段
階希釈した突然変異体配列、又は段階希釈した試料と固定量の突然変異体配列を
用いて行うことができる。この場合も、上記定量法の実施に必要とされるプライ
マー及びプローブを含み得る凍結乾燥粒子に突然変異体配列を配合物してもよい
。それぞれが被検体である核酸から区別可能であり且つ被検体である核酸と共増
幅し得る、それぞれ異なる量の種々の核酸構築物からなる試料に添加することを
含む、試料中の被検体である核酸の定量法が、同時係属で且つ本出願人所有のPC
T/EP94/02295明細書に記載されている。用いられた全てのＲＮＡ配列を、それぞ
れの量で本発明の凍結乾燥粒子に配合し得ることは明らかである。
本発明の凍結乾燥粒子は球体の形態で形成するのが好ましい。本発明の球状粒
子は、１種以上の安定剤を含むＲＮＡ溶液を調製する段階、該溶液から好ましく
は該溶液を液体窒素中に滴下することにより凍結乾燥粒子を形成する段階、液滴
をそれらが完全に凍結するまで液体窒素中に保持する段階、及び該液滴を凍結乾
燥する段階からなる方法により形成するのが好ましい。
本発明の凍結乾燥粒子は、適当なエンザイム、プライマー及びプローブのよう
な使用する検出法に用いられる他の試薬と共に、核酸の検出又は定量用テストキ
ットに組み込むことが可能である。
実施例実施例１：ＲＮＡ含有凍結乾燥粒子の形成
Ａ．用いられた全ての化学物質は試薬等級１の品質を有するものであった。水中
の15w/w％のサッカロース、５w/w％のマンニトール及び５w/w％のデキストラン
Ｔ４０を用いて安定剤混合物を調製した（該サッカロースはSigma社から、マン
ニトールはBaker社から、デキストランＴ４０はFarmacia社から入手した）。別
に、濃縮ＲＮＡストックをＤＥＰＣ処理水で100倍希釈してＲＮＡ溶液を調製し
た。5
0mlの安定剤溶液を50mlのＲＮＡ溶液と混合した。リオスフェアは以下の方法で
ＲＮＡ／安定剤溶液から形成した：
50μlのＲＮＡ／安定剤混合物を沸騰窒素中に滴下した。球体をそれらが完全
に凍結するまで液体窒素中に保持した。凍結球体を凍結乾燥して、残留含水量が
２w/w％以下であり且つ凍結球体と実質的に同一の粒径を有する球体を得た。こ
のようにして形成されたアキュスフェアは1.22×107個のＲＮＡ分子を含んでい
た。
Ｂ．あるいは、ＲＮＡ含有凍結乾燥粒子を以下の方法で形成することもできる：
アキュスフェア１個につき各種のＲＮＡからなる1012個の分子を含む600個の
アキュスフェアを形成するためにＲＮＡ溶液混合物を調製した。該溶液は、それ
ぞれが９mlの３種の異なるＲＮＡ（合計27ml）からなるものであった。該ＲＮＡ
溶液は1.5Mの塩化ナトリウム（該塩化ナトリウムはJanssen Chimicaから入手し
た）を含んでいた。Ａ.に用いたものと同じ安定剤を乾燥成分としてＲＮＡ混合
物に加えた。ＲＮＡ混合物を含む管に、2.25gのサッカロース、0.75gのマンニト
ール及び0.75gのデキストランＴ４０を加えた。ＲＮＡ／安定剤混合物に、最終
容量が30mlになるまで
水を加えた。
Ａ.に記載のようにして凍結乾燥した。
Ｃ．同様にＲＮＡを含む凍結乾燥粒子も以下の方法で形成し得る：
アキュスフェア１個につき7.6×104個のＲＮＡ分子を含む600個のアキュスフ
ェアを形成するためにＲＮＡ溶液を調製した。3.0gのスクロース、1.0gのマンニ
トール及び1.0gのデキストランＴ４０を40.0mlの水に溶解した。30mlのスクロー
ス／マンニトール／デキストランＴ４０含有溶液に、１μl当たり106個のＲＮＡ
分子を含むＲＮＡストック溶液45μlを加えた。
Ａ.に記載のようにして凍結乾燥した。実施例２：ＲＮＡ含有凍結乾燥粒子の安定性
凍結乾燥球体としてのＲＮＡの安定性を、本発明による凍結乾燥球体及び独立
の基準物質に由来するＲＮＡを用いるＮＡＳＢＡ反応の増幅効率を比較すること
によって試験した。凍結乾燥球体を、実施例１の“Ａ”項に述べたようにして製
造した。基準物質の野生型（ＷＴ）は、電子顕微
粒子／ｍｌと定量された、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生成させたＨ
ＩＶ−１細胞系である（Ｉａｙｎｅ等，１９９２）。この基準物質を溶解緩衝液
で稀釈し、７，３００ＲＮＡ分子／μｌを含有する単一使用１００μｌアリコー
トとして−７０℃で貯蔵した。
この安定性試験において試験した凍結乾燥球体は、２〜８℃、２０〜２５℃及
び３５〜３８℃で貯蔵した四つの異なるバッチのＲＮＡ球体であった。
安定性の測定には次のプロトコルを用いた。
稀釈した基準物質の１０μｌアリコートを９００μｌの溶解緩衝液に添加し、
混合した。乾燥したＲＮＡ球体を５５０μｌの溶離緩衝液（ｐＨ８．５の１ｍｍ
ｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ）で稀釈し、３種のＲＮＡ即ちＱａ、Ｑｂ及びＱｃの
濃度をそれぞれ溶離緩衝液５０μｌ当たり１，０００，０００、１００，０００
及び１０，０００ＲＮＡ分子とした。Ｑａ、Ｑｂ及びＱｃは、約１，０００〜１
，５００ヌクレオチドの長さを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡ配列である。
溶解ＲＮＡ球体の５０μｌアリコートを溶解緩衝液管に添加し、混合した。Ｂｏ
ｏｍ等が述べている単離操作（Ｒ．Ｂｏｏｍ，Ｓｏｌ ＣＪＡ，Ｊ．ｖａｎ ｄ
ｅｒ Ｎｏｏｒｄａａ等，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ
ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，ｐｐ．
４９５−５０３，１９９０）を用いてＲＮＡ試験対象（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ
）及びＷＴ基準物質を単離した。Ｋｉｅｖｉｔｓ等が述べている方法（Ｔ．Ｋｉ
ｅｖｉｔｓ，Ｂ．ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ，Ｐ．Ｌｅｎｓ等，“ＮＡＳＢＡTM ｉｓ
ｏｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｖｉｒ． Ｍｅｔｈ．３５
，ｐｐ．２７３−２８６，１９９１）を多少改良したものによっ
て増幅を実現した。
試料中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出は電気化学ルミネセンス原理に基づく（Ｇ
．Ｆ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｈ．Ｐ．Ｓｈａｈ，Ｊ．Ｈ．Ｋｅｎｔｅｎ，Ｊ．Ｌ
ｅｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．Ｋａｍｉｎ，Ｊ．Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｍ．
Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ａ．Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｂ．Ｔａｌｌｅｙ等，“Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ
ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，”Ｃｌｉ ｎ．Ｃｈｅｍ．３７
，ｐｐ．１５３４−１５３９，１９９１；Ｊ．Ｈ．Ｋｅｎｔ
ｅｎ，Ｓ．Ｇｕｄｉｂａｎｄｅ，Ｊ．Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｊ．Ｗｉｌｌｅｙ，Ｂ．Ｃ
ｕｒｆｍａｎ，Ｅ．Ｏ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｊ．Ｍａｓｓｅｙ，“Ｉｍｐｒｏｖｅ
ｄ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ
ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ：ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ａｓｓａｙｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８，ｐｐ．８７３−
８７９，１９９２）。
増幅物（ＷＴ、Ｑａ、Ｑｂ及びＱｃ）を分離するべく増幅試料のアリコートを
、各々前記増幅物のうちの一つに特異的である４種のハイブリダイゼーション液
に添加した。この例では各増幅物をビーズーオリゴ（即ち固相として機能するス
トレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合させたビ
オチン−オリゴ）、及びルテニウムで標識したプローブとハイブリダイズさせた
。
ハイブリダイズした増幅物／プローブ複合体を保持する磁気ビーズを磁石によ
って電極の表面に捕捉した。前記電極に印加される電圧が電気化学ルミネセンス
（ＥＣＬ）反応を惹起する。ハイブリダイズしたルテニウム標識プローブによっ
て発せられる光は増幅物の量に比例する。４種の増幅物の相対量に基づく計算に
よって、ＷＴ基準物質の量が明らかとなる。
ＷＴ基準ＲＮＡの量を上述のプロトコルに従って決定した。結果を表１に示す
。
ＲＮＡ球体を１４週間以下の期間にわたりいずれの試験温度で貯蔵しても、定
量的ＮＡＳＢＡアッセイにおける通常の変動以外の甚だしいＲＮＡ減少は観察さ
れない（表１）。
このような結果は、バッチ毎の、及び毎日の変動に関わりなく、様々な経過時
間及び温度において計算したＷＴ基準物質量に球体中のＱａ、Ｑｂ及びＱｃ Ｒ
ＮＡの量の減少を示唆する甚だしい増大は起こらないことを示している。
実施例３：凍結乾燥粒子の安定性（２）
実施例１のプロトコルＣに従って製造した、約１，５００ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ
合成ＲＮＡ配列を含有するアキュスフィア（ａｃｃｕｓｐｈｅｒｅ
ｓ）を２００μｌの溶離緩衝液（ｐＨ８．５の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ）に溶解
させた。得られた溶液２０μｌを９ｍｌの溶解緩衝
液（５Ｍチオシアン酸グアニジン、１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｈ６．４の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ）に添加した。その
後、７０μｌの活性シリカ（０．１Ｎ ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍｌサイズ選択懸濁
液）を溶解混合物に添加して核酸と結合させた。シリカを洗浄及び乾燥後、核酸
を１００μｌの溶離緩衝液中に溶出させた。
核酸増幅はＫｉｅｖｉｔｓ等が述べているようにして実施するが、その際次の
ような改良を行なう。
反応混合物の最終量は２５μｌとし、その際ｐＨ８．５の４０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、４０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭの各
ｄＮＴＰ、２ｍＭの各ＮＴＰ、１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．１μｇ／μｌ
ＢＳＡ、０．２μｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、８．０ｕ ＡＭＶ−Ｒ
Ｔ、０．１ｕ ＲＮアーゼＨ、及び４０．０ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含
有させる。一つのプライマーはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を有する。各
増幅反応のために８μｌの単離ＲＮＡを用いた（約２００分子のＲＮＡを含む）
。増幅反応は遠心用マイクロ試験管内で、４１℃で９０分間行なう。増幅
生成物を酵素結合ゲルアッセイ（ＥＬＧＡ）によって分析する。増幅したＲＮＡ
を、配列特異的ＨＲＰ ５′−標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる溶液中
非放射性ハイブリダイゼーションによって検出する。ハイブリダイゼーション後
、ハイブリダイズしなかったプローブを相同ハイブリダイゼーション生成物から
ゲル電気泳動によって分離した。未結合ＨＲＰプローブ及びハイブリダイゼーシ
ョン生成物はポリアクリルアミドゲル中で、ゲルをＨＲＰ基質溶液中でインキュ
ベートすることにより直接可視化した。
上述の操作を、４℃、２０〜２５℃及び３５〜３８℃で貯蔵した三つの異なる
凍結乾燥ＲＮＡ調製物に適用した。
上記ＥＬＧＡ検出を用いたところ、８ヵ月（バッチ３）及び１年（バッチ１及
び２）の貯蔵後にシグナル間の相違は観察されなかった。この結果を、−７０℃
で貯蔵した（実施例２に述べた）基準ＲＮＡを用いて確認した。基準ＲＮＡと凍
結乾燥ＲＮＡとの同時単離、同時増幅及び検出後、基準ＲＮＡ及び凍結乾燥ＲＮ
ＡのＥＣＬ比間に甚だしい相違は見出されず、このことは本発明によるＲＮＡ含
有アキュスフィアが４℃、２０〜２５℃及び３５〜３８℃で貯蔵された場合に安
定であることを示している。実施例４：ゲルマーカーＲＮＡ含有凍結乾燥粒子の安定性
ゲルマーカーＲＮＡを含有する、実施例１のプロトコルＢに従って製造したア
キュスフィアを２５μｌのＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ及びプロテアーゼを含有しな
い水に溶解させた。得られた溶液に、２５μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）５′−標識オリゴヌクレオチドプローブ溶液を添加する。配列特異的な
前記オリゴヌクレオチドとゲルマーカーＲＮＡとのハイブリダイゼーションを４
１℃で１５分間生起させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなか
ったプローブを相同ハイブリダイゼーション生成物からゲル電気泳動によって分
離した。未結合ＨＲＰプローブ及びハイブリダイゼーション生成物はポリアクリ
ルアミドゲル中で、ゲルをＨＲＰ基質溶液（テトラメチルベンジジン；ＴＭＢ）
中でインキュベートすることにより直接可視化した。
三つの異なるゲルマーカーＲＮＡアキュスフィアの各ロットを、長期安定性試
験において先に述べたようにして分析した。最初の二つのバッチは、ゲルマーカ
ーＲＮＡアキュスフィアを４℃で５２週間貯蔵してもＲＮＡ分解の兆候を
示さない。第三のバッチを３６週間後に試験したが、やはり予測どおりの、分解
を伴わないゲルパターンを示した。ＲＮＡの分解が起こっていれば、ゲル中に見
出された個別バンドに替わってＲＮＡ汚点（ｓｍｅａｒｓ）が現われることによ
り示唆されたはずである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a lyophilized composition containing ribonucleic acid (RNA) and a method for producing the composition. The invention further relates to the use of the composition in a method for detecting nucleic acid and a test kit for detecting nucleic acid containing the composition. RNA is known to be a fairly hypersensitive and relatively unstable substance. RNA in solution is more or less prone to rapid degradation. In particular, degradation by RNase is an important issue when handling RNA preparations. This ubiquitous enzyme (RNase is present in fingertips, dust, etc.) is thermostable and does not require cofactors to obtain its enzymatic activity. This makes inactivation of RNase in RNA preparations difficult. Several isolation methods for obtaining RNase-free RNA (Sambro ok J., Fritch EF and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2nd Edition, Volume 1, Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; Ausubel, F.M. et al., Ed. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, Green / Wiley-interscience. New York). Preventive measures must be taken to avoid RNase contamination at the final step of RNA solubilization. A common method is to solubilize RNA in water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC) (Chomczynski P. (1992), Solubilization in formamide protects RNA from degradation, Nucleic Acid Research, Volume 20 (14)). . However, solubilized RNA is subject to accidental contamination during sample handling and storage. Furthermore, long-term storage of RNA samples dissolved in water requires lowering the temperature to -70 ° C to avoid degradation. Alternatively, RNA can be solubilized in formamide instead of DEPC treated water. Formamide effectively protects RNA from degradation by RNase and allows long-term storage at -20 ° C. However, the above method is not sufficient for making RNA preparations into practical products with reasonable shelf life allowing transport and storage at temperatures of 2-8 ° C. or higher. Therefore, there is a need for a stable RNA-containing composition that can be easily stored for a long period of time and is easy to handle. The present invention provides freeze-dried RNA-containing particles. It has been found that the lyophilization method does not have a deleterious effect on RNA and substantially delays all possible inactivation processes. Lyophilized RNA makes it possible to obtain a stable product that can be stored for a long period of time without changing its structure. Therefore, the freeze-dried RNA-containing composition of the present invention is, for example, a very useful alternative to the RNA-containing reagent solution currently used. The particles of the present invention are dry and therefore almost immune to various degradation processes. The present invention can be used for various RNAs. RNA sequences of various lengths can be lyophilized. It is possible to incorporate into the lyophilized composition of the present invention all RNA sequences of nucleotides which vary in length, for example from hundreds to thousands. The lyophilized particles of the present invention can exist in various granular forms. Surprisingly, the particles are, for example, more stable than layers of lyophilized material and are very soluble. The RNA in these lyophilized particles is stable during storage for at least one year at temperatures from 2-8 ° C to 37 ° C. RNA is preferably lyophilized in the form of spherical particles. Spherical lyophilized particles (accuspheres or lyosp heres) are known from Price et al. (US 3,655,838). These spherical beads contain substances for immune reaction. Riospheres containing biologically active substances are known, for example, from US Pat. No. 3,932,943 and many other patent specifications. The advantages of lyospheres are their particle homogeneity, easy handling of the product, fast freeze-drying process, low degradation during the freeze-drying process and improved dissolution properties. The lyospheres can be formed by lyophilizing drops of an aqueous RNA solution. To obtain droplets of the desired size, the solution is placed in an ice bath (eg as disclosed in DT 2,140,747, EP8 1913 or US 3,928,566) in liquid nitrogen (eg J59 1 69,504). Paper) or on a cooling drum (eg USP3892876) or on a cooling plate (eg US4,501,719). Various other methods are well known in the art. In addition to RNA, the lyophilized particles of the invention may contain stabilizers, for example polyhydroxy compounds such as sucrose, mannitol, dextran, sorbitol and glycerol. The freeze-dried particles of the present invention are particularly useful as a diagnostic reagent in nucleic acid detection methods. Diagnostic methods for detecting nucleic acids typically involve amplifying nucleic acids isolated from clinical samples. One of the amplification techniques that can be used in the case of the lyophilized particles of the present invention is NASBA, ie “Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)” disclosed in European Patent Application EP 0,329,822. Large quantities of RNA can be synthesized using this technique. In diagnostic methods for detecting nucleic acid sequences, including amplification of target sequences, an internal control sequence may be added to the sample. Such a method is described in co-pending and applicant-owned application PCT / EP93 / 02284. The internal control sequences used in the methods described herein include nucleic acid sequences that are distinguishable from the target sequence, which nucleic acid sequence can be amplified using the same amplification reagents as the target sequence. These "internal control sequences" may be incorporated into the lyophilized particles of the present invention and are suitable for use in the method described in PCT / EP93 / 02284. Lyophilized particles can also be used in the method for quantifying nucleic acids in a sample. A method for quantifying nucleic acids using the addition of a known number of nucleic acid sequence molecules corresponding to a target nucleic acid to a sample containing an unknown number of target nucleic acid sequences is disclosed in EP525882, a co-pending and applicant-owned European patent. It is described in the application specification. The method described therein is based on the principle of amplifying nucleic acid from a sample containing an unknown concentration of wild-type target nucleic acid spiked with a known amount of a well-defined mutant sequence. Amplification is performed with one primer set that is capable of hybridizing to the target and mutant sequences. The competitive amplification described in EP525882 can be performed with a fixed amount of sample and serially diluted mutant sequence, or with serially diluted sample and fixed amount of mutant sequence. Again, the mutant sequence may be incorporated into lyophilized particles which may contain the primers and probes required to carry out the above quantitation method. Nucleic acid that is the analyte in the sample, including addition to samples that are different from each other and that can be co-amplified with the nucleic acid that is the analyte, and that each consist of different amounts of different nucleic acid constructs Is described in co-pending and applicant's owned PC T / EP 94/02295 specification. It is clear that all the RNA sequences used can be incorporated into the lyophilized particles according to the invention in respective amounts. The freeze-dried particles of the present invention are preferably formed in the form of spheres. The spherical particles of the present invention include the steps of preparing an RNA solution containing one or more stabilizers, forming lyophilized particles from the solution, preferably by dropping the solution into liquid nitrogen. Are preferably kept in liquid nitrogen until completely frozen, and the droplets are freeze-dried. The lyophilized particles of the present invention can be incorporated into a test kit for detecting or quantifying nucleic acids, along with other reagents used in the detection method used, such as appropriate enzymes, primers and probes. Examples Example 1: Formation of lyophilized particles containing RNA All chemicals used were of reagent grade 1 quality. Stabilizer mixtures were prepared with 15 w / w% sucrose, 5 w / w% mannitol and 5 w / w% dextran T40 in water (the saccharose from Sigma, mannitol from Baker, dextran T40 from Farmacia. Obtained from the company). Separately, the concentrated RNA stock was diluted 100-fold with DEPC-treated water to prepare an RNA solution. 50 ml of stabilizer solution was mixed with 50 ml of RNA solution. The lyospheres were formed from the RNA / stabilizer solution in the following manner: 50 μl of RNA / stabilizer mixture was added dropwise to boiling nitrogen. The spheres were kept in liquid nitrogen until they were completely frozen. The frozen spheres were freeze-dried to obtain spheres having a residual water content of 2 w / w% or less and having substantially the same particle size as the frozen spheres. The acuspheres thus formed contained 1.22 × 10 7 RNA molecules. B. Alternatively, RNA-containing lyophilized particles can be formed by the following method: RNA solution mixture is prepared to form 600 acuspheres containing 10 12 molecules of each RNA per acusphere. did. The solution consisted of 9 ml each of 3 different RNAs (27 ml total). The RNA solution contained 1.5 M sodium chloride (the sodium chloride was obtained from Janssen Chimica). The same stabilizer used in A. was added to the RNA mixture as a dry ingredient. To the tube containing the RNA mixture was added 2.25 g sucrose, 0.75 g mannitol and 0.75 g dextran T40. Water was added to the RNA / stabilizer mixture until the final volume was 30 ml. Lyophilized as described in A .. C. Similarly, lyophilized particles containing RNA can be formed in the following manner: An RNA solution was prepared to form 600 acuspheres containing 7.6 × 10 4 RNA molecules per acusphere. 3.0 g sucrose, 1.0 g mannitol and 1.0 g dextran T40 were dissolved in 40.0 ml water. To 30 ml of sucrose / mannitol / dextran T40 containing solution, 45 μl of RNA stock solution containing 10 6 RNA molecules per μl was added. Lyophilized as described in A .. Example 2: Stability of RNA-containing lyophilized particles By comparing the stability of RNA as lyophilized spheres with the amplification efficiency of the NASBA reaction using lyophilized spheres according to the invention and RNA derived from an independent reference substance. Tested. Lyophilized spheres were prepared as described in Example 1, section "A". Wild type (WT) of reference material is electron microscopic In vitro generated HIV-1 cell line quantified as particles / ml (Iayne et al., 1992). This reference material was diluted with lysis buffer and stored at -70 ° C in single-use 100 µl aliquots containing 7,300 RNA molecules / µl. The lyophilized spheres tested in this stability study were four different batches of RNA spheres stored at 2-8 ° C, 20-25 ° C and 35-38 ° C. The following protocol was used to measure stability. A 10 μl aliquot of diluted reference material was added to 900 μl of lysis buffer and mixed. The dried RNA spheres were diluted with 550 μl of elution buffer (1 mMol / l Tris / HCl, pH 8.5) and the concentrations of the three RNAs, Qa, Qb and Qc, were 1,000 / 50 μl of elution buffer respectively. 000, 100,000 and 10,000 RNA molecules. Qa, Qb and Qc are in vitro synthetic RNA sequences having a length of about 1,000 to 1,500 nucleotides. A 50 μl aliquot of lysed RNA spheres was added to the lysis buffer tube and mixed. Isolation procedure described by Boom et al. (R. Boom, Sol CJA, J. van der Noordaa et al., "Rapid and simple method of purifying of nucleic acids," J. Clin . RNA calibrators and WT standards were isolated using -503, 1990). Method (T.Ki evits the like are mentioned Kievits, B.van Gemen, P.Lens, etc., "NASBA TM is othermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection," J.Vir. Meth .35 , pp. 273-286 , 1991), with some improvements. Detection of HIV-1 RNA in a sample is based on the electrochemiluminescence principle (GF Blackburn, HP Shah, JH Kenten, JL eland, RA Kamin, J. Link. , J.Peterman, M. J.Powell, A.Shah , D.B.Talley , etc., "Electro ch emiluminescence detection for develo pment of immunoassays and DNA probe assays for clinical diagnostics," Cli n.Chem.37, pp. 1534-1539, 1991; JH Kenten, S. Gudibande, J. Link, J. J. Willey, B. Curman, E. O. Ma. or, R.J.Massey, "Improve d electrochemiluminescent label for DNA probe assays: rapid quantitative assays of HIV-1 polymerase chain rea ction products," Clin.Chem.38, pp.873- 879,1992). Aliquots of the amplified samples were added to separate four amplificates (WT, Qa, Qb and Qc) to four hybridization solutions, each specific for one of the amplificates. In this example, each amplificate was hybridized with a bead oligo (ie, biotin-oligo bound to streptavidin-coated magnetic beads that act as a solid phase) and a ruthenium labeled probe. Magnetic beads holding the hybridized amplificate / probe complex were captured on the surface of the electrode by a magnet. The voltage applied to the electrodes causes an electrochemiluminescence (ECL) reaction. The light emitted by the hybridized ruthenium-labeled probe is proportional to the amount of amplified product. Calculations based on the relative amounts of the four amplificates reveal the amount of WT reference material. The amount of WT reference RNA was determined according to the protocol described above. The results are shown in Table 1. When RNA spheres were stored at any test temperature for a period of 14 weeks or less, no significant RNA reduction other than the usual variation in quantitative NASBA assays was observed (Table 1). These results suggest a significant decrease in the amount of Qa, Qb and Qc RNA in the sphere with respect to the calculated WT reference amount at various elapsed times and temperatures, regardless of batch-to-batch and daily variations. It shows that no increase occurs. Example 3: Stability of lyophilized particles (2) 200 μl of elution buffer (accuspheres) containing about 1,500 nucleotides of in vitro synthesized RNA sequence prepared according to Protocol C of Example 1 ( It was dissolved in 10 mM Tris / HCl (pH 8.5). 20 μl of the resulting solution was added to 9 ml of lysis buffer (5 M guanidine thiocyanate, 1% (v / v) Triton X-100, 20 mM EDTA, 50 mM Tris / HCl in H6.4). Then 70 μl of activated silica (1 mg / ml size selective suspension in 0.1 N HCl) was added to the lysis mixture to bind the nucleic acids. After washing and drying the silica, the nucleic acid was eluted in 100 μl of elution buffer. Nucleic acid amplification is performed as described by Kievits et al., With the following improvements. The final volume of the reaction mixture was 25 μl, with 40 mM Tris / HCl, 12 mM MgCl 2 , 40 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs, 2 mM NTPs, 15% (v / v) DMSO, pH 8.5. Contains 0.1 μg / μl BSA, 0.2 μl of each oligonucleotide primer, 8.0 u AMV-RT, 0.1 u RNase H, and 40.0 u T7 RNA polymerase. One primer has a T7 RNA polymerase recognition site. 8 μl of isolated RNA was used for each amplification reaction (containing approximately 200 molecules of RNA). The amplification reaction is carried out at 41 ° C. for 90 minutes in a micro test tube for centrifugation. Amplification products are analyzed by enzyme linked gel assay (ELGA). Amplified RNA is detected by non-radioactive hybridization in solution with a sequence-specific HRP 5'-labeled oligonucleotide probe. After hybridization, unhybridized probe was separated from homologous hybridization products by gel electrophoresis. Unbound HRP probe and hybridization products were visualized directly in polyacrylamide gels by incubating the gels in HRP substrate solution. The above procedure was applied to three different lyophilized RNA preparations stored at 4 ° C, 20-25 ° C and 35-38 ° C. Using the ELGA detection described above, no difference between signals was observed after storage for 8 months (batch 3) and 1 year (batch 1 and 2). The results were confirmed using reference RNA (described in Example 2) stored at -70 ° C. After co-isolation, co-amplification and detection of reference RNA and freeze-dried RNA, no significant difference was found between the ECL ratios of reference RNA and freeze-dried RNA, which means that RNA-containing acuspheres according to the present invention were It is shown to be stable when stored at 20-25 ° C and 35-38 ° C. Example 4: Stability of lyophilized particles containing gel marker RNA Acuspheres containing gel marker RNA, prepared according to protocol B of Example 1, were dissolved in 25 μl of RNase, DNase and protease free water. . To the resulting solution is added 25 μl of horseradish peroxidase (HRP) 5′-labeled oligonucleotide probe solution. Hybridization of the sequence-specific oligonucleotide with the gel marker RNA occurs at 41 ° C. for 15 minutes. After hybridization, unhybridized probe was separated from homologous hybridization products by gel electrophoresis. Unbound HRP probe and hybridization products were visualized directly in polyacrylamide gels by incubating the gels in HRP substrate solution (tetramethylbenzidine; TMB). Each lot of three different gel marker RNA Accuspheres was analyzed as previously described in the long term stability study. The first two batches show no sign of RNA degradation when the gel marker RNA acusphere is stored at 4 ° C for 52 weeks. The third batch was tested after 36 weeks and again showed the expected gel pattern without degradation. Should RNA degradation occur, it would have been suggested by the appearance of RNA smears in place of the individual bands found in the gel.
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(72)発明者 キエフイツ，テイム
オランダ国、5262・イクス・ベー・フユフ
ト、フアン・ミエルトストラート・20─────────────────────────────────────────────────── ───
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(72) Inventor Kievitsu, Tame
The Netherlands, 5262 Iks Behyuhu
Juan Juan Miertstraat 20