JPH08511948A - Ｃ４ｂｐ結合活性が不足しているがａｐｃ補因子活性を有するプロテインｓ欠失変異体、組成物及び治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）に有意に結合しない組み換えプロティンＳ（ＰＳ）の種々の機能性変異体、及び治療薬としての変異体の利用に関する。特に本発明は、ＡＰＣに対する補因子活性を有し、対応する成熟野生型プロテインＳのＳＨＢＧ−様ドメインの少なくとも２つの推定Ｃ４ＢＰ結合ドメインが欠如しているプロテインＳの欠失突然変異体を目的とする。そのような欠失突然変異体は特に、対応する成熟野生型ヒトプロテインＳの少なくともアミノ酸残基４０１−４５７及び５８３−６３５が欠如している。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ４ＢＰ結合活性が不足しているがＡＰＣ補因子活性を有する プロテインＳ欠失変異体、組成物及び治療法技術的分野 本発明はＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）に有意に結合しない組み換えプロ テインＳ（ＰＳ）の種々の機能性変異体及び治療薬としての変異体の利用に関す る。背景 プロテインＳ（ＰＳ）は、６３５個のアミノ酸残基を有する分子量が７５，０ ００のビタミンＫ−依存性タンパク質である。ＤｉＳｃｉｐｉｏ ｅｔ ａｌ． ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：８９９（１９７９）；Ｌｕｎｄｗａｌｌ ｅｔ ａ ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：６７１６−６７ ２０（１９８６）；Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８４：３９４−３５３（１９８７）。ヒト血漿は３４６ ｎＭのＰＳを含み、その６２％は補体タンパク質、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ ＢＰ）のβ鎖サブユニットと複合化しており、３８％はＣ４ＢＰと複合化してお らず、「遊離ＰＳ（ｆｒｅｅ ＰＳ）」と考えられる。Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７９：３２０３−３２１１（１９９２）； ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６０８２（１９９０）；及び Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：２３８４（１ ９９１）。 ＰＳは試験管内血餅形成アッセイにおいて抗凝血活性を示す。ＰＳは活性化プ ロテインＣ（ＡＰＣ）、抗凝血セリンプロテアーゼ酵素に関する抗凝血補因子活 性を示す。Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：５２２１−５２ ２４（１９８０）；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６０：２００７（１９８５）；Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ ．，２６１：７１３（１９８６）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ ．，２５６：１１１２８（１９８１）；及びＳｏｌｙｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４８８４（１９８８）。ＰＳはＡＰＣ を含まないアッセイにおいてプロトロンビナーゼ活性を阻害できるので、ＡＰＣ の不在下においも抗凝血因子であることが示され（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａ ｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６０：２９８−３０４，１９８８）、 因子Ｖａ又は因子Ｘａに結合してＡＰＣなしで抗凝血物質として機能する。Ｈｅ ｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８６：３２３８ａ，１９９２； 及びＨｅｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８６：１０４０ａ，１ ９９２。血漿において、ＰＳは高い親和力でＣ４ＢＰと可逆的に会合する（約１ 〜５ナノモルの解離定数）。遊離のＰＳのみがＡＰＣ補因子として活性であり、 Ｃ４ＢＰとのＰＳの会合はＰＳの抗凝血活性の消失を伴うことが広く受け入れ １２０２２（１９８６）；及びＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８ ：３５７−３６３（１９９１）。従ってＣ４ＢＰは有効に、ＰＳ抗凝血活性の阻 害剤である。ＰＳの抗凝血活性は、残基４６−７５を含むいわゆる「トロンビン −感受性ループ」内のアルギニン残基の切断 によっても低下させるか、又は失わせることができる。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８６：３２４１ａ（１９９２）。 ＰＳの遺伝性又は後天性欠乏症は、静脈性及び動脈性血栓症を伴うので、ＰＳ は生理学的に非常に重要な抗トロンビン因子である。Ａｌｌａａｒｔ ｅｔ ａ ｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６４：２０６（１９９０）；Ｓｉｅ ｅｔ ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６２：１０４０（１９８９）；Ｅ ｎｇｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１０６−６ ７７（１９８７）；Ｍａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ ｏｓｔ ．，５５：４４０（１９８６）；及びＳｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ，７４：２１３（１９８９）。遊離のＰＳのみが試験管内で抗凝血活 性を有するので、試験管内における血液中の遊離のＰＳの量が、唯一の関連する 生理学的抗凝血的活性種であると考えられることは、広く受け入れられている。 正常な量の合計ＰＳの場合の遊離のＰＳの不足が血栓症の何人かの患者において 記載され（Ｃｏｍｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，６７：１９８６）、汎発性血 管内凝血又は多様な炎症状態、例えば全身性エリテマトーデスにおけるＣ４ＢＰ の一時的増加による遊離のＰＳの後天性不足が過剰凝血状態（ｈｙｐｅｒｃｏａ ｇｕｌａｂｌｅ ｓｔａｔｅ）に寄与し得るということが仮定された。Ｔａｙｌ ｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８：３５７−３６３（１９９１）；Ｈｅｅ ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７３：４５５（１９８９）；Ｃｏｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，６６：３４８ａ（１９８５）；Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１４４５（１９８８）；Ｂｏｅ ｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，６９：６９２ （１９８７）；及びＤ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ ．，１０７：４２（１９８７）。さらに、ＰＳは転移性癌及び白血病にお いて重要であり、従って癌細胞増殖の阻害に治療的に用いることができることが 示唆された。Ｋｅｍｋｅｓ−Ｍａｔｔｈｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７０ ：５２９−５３４（１９９２）。 近年、霊長類動物モデルにおいて、Ｃ４ＢＰの増加が宿主応答を悪化させ、非 致死投薬量のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を致死投薬量に変換することが示された 。Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８：３５７−３６３（１９９１ ）。過剰のＰＳを与えられた動物をＣ４ＢＰで処置すると、致死の結果又は過剰 凝血応答を経験せず、かくしてＣ４ＢＰに結合していない遊離のＰＳが感染、炎 症及び過剰凝血に対する有用な治療薬であり得ることを示すことも示された。Ｔ ａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８：３５７−３６３（１９９１）。 さらにＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．は血栓症及び血栓塞栓合併症の処置のため の生体内治療法における血漿−由来ＰＳの利用を記載した。米国特許第５，１４ ３，９０１号。 Ｃ４ＢＰに対する親和力が低下した形態のＰＳは、Ｃ４ＢＰへの結合に伴う活 性の消失の危険なしで投与することができるので、有用な治療薬を与えるであろ う。 １９９２年１２月１１日のＧｌｅｎｎ Ｔ．Ｇ．Ｃｈａｎｇの論文“Ｓｔｒｕ ｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ”の３章において、プロテインＳの２種の欠失変異体が記載され、Ｃ１２７細胞 において発現された。Ｅ−変異体は第３表皮成長因子様ドメインの欠失（アミノ 酸残基Ａｓｐ−１６０−Ａｓｐ− ２０２に相当するエキソンＶＩＩの欠失）を有し、血漿系において正常なＡＰＣ 補因子活性を発現する。この活性は精製Ｃ４ＢＰの添加により阻害されることが でき、結合親和力は野生型により示されるものと類似であった。 性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）−様ドメインのＣ−末端ループの欠失 （アミノ酸残基Ａｓｐ−５８３−Ｓｅｒ−６３５に相当するエキソンＸＶの欠失 ）を有する第２の変異体（Ｌ−変異体）も血漿において正常なＡＰＣ補因子活性 を発現する。これは、プロティンＳの第３ＥＧＦ−様ドメイン及びＳＨＢＧ−様 ドメインのＣ−末端部分がプロテインＳにおけるＡＰＣ補因子活性の発現に含ま れていないことを示す。 しかしＬ−変異体はＣ４ＢＰへの結合に対する低下した親和力を示す。Ｓｅｒ ４６０に近い領域を認識するモノクローナル抗体Ｓ１２が非変性Ｌ−変異体に結 合せず、変性Ｌ−変異体によりＳ１２が認識され、突然変異体上のＳ１２−エピ トープの存在を示している故に、Ｃ−末端ループの欠失はコンホメーション変化 を引き起こし、プロテインＳ分子のＣ−末端外に位置する結合部位におけるＣ４ ＢＰに対する結合親和力の消失を生じること、及びＣ４ＢＰ結合活性の消失が、 プロテインＳのＳＨＢＧ−様ドメインのＣ−末端ループ、特にＡｓｐ−５８３− Ｓｅｒ ６３５がＣ４ＢＰとの相互作用に含まれることを自動的に意味してはい ないことがＣｈａｎｇにより示唆されている。Ｃｈａｎｇにより用いられている 残基の番号付けは、Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．，Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｅｎｆｌｏ，Ｊ．（１９８６），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，７８：２５１２−２５１６；Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．，Ｄａｃｋｏｗ ｓｋｉ，Ｗ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｓｈａ ｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｙｄｒｏ，Ｒ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，８３：６７１６−６７２０；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．，Ｎｏｒ ｍａｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｌ．（１ ９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４９−３５ 及びＰｌｏｏｓ ｖａｎ Ａｍｓｔｅｌ．Ｈ．Ｋ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚａｎｄ ｅｎ，Ａ．Ｌ．，Ｒｅｉｔｓｍａ，Ｐ．Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ． （１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２２：１８６１９０において当てられた番 号付けに基づく。 Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｊ．Ｈ．（１９９１ ）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ ６５：７１１においてＣ４ＢＰ結合部位がＳ ＨＢＧ−ドメインの中心、アミノ酸残基Ｓｅｒ−４６０の比較的近く、すなわち アミノ酸残基４２０−４３４において報告された。モノクローナル抗体Ｓ１２自 身はプロテインＳへのＣ４ＢＰの結合を妨げないので、これはＳ１２エピトープ 及びＳｅｒ−４６０領域がＣ４ＢＰへの結合に含まれないことを示した。 前記の論文の４章においてＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、第１のジスルフィド ループにおけるＧｌｕ４２４のＬｙｓへ、Ｇｌｎ−４２７のＧｌｕへ、及びＬｙ ｓ−４２９のＧｌｕへの置換を含む突然変異体を記載している。後者の突然変異 体はＣ４ＢＰに結合できず、野生型プロテインＳのＣ４ＢＰとの複合体形成を阻 害する抗−プロテインＳ抗体ＬＪ−５６を認識できなかった。これは、タンパク 質におけるＬｙｓ−４２９がＣ４ＢＰへの結合に含まれることを確証し、プロテ インＳのＳＨＢＧ −様ドメインの第１及び第２ジスルフィドループ、すなわちそれぞれ残基４０８ −４３４及び５９８−６３５の両方がＣ４ＢＰとの相互作用に含まれると結論す ることができる。 Ｎｅｌｓｏｎ及びLｏｎｇ（Ｊｏｕｒｎ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ ．２６７，ｎｒ．１２，ｐａｇｅｓ ８１４０−８１４５，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ． Ｍ．ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｌ．）は、アミノ酸残基Ｔｙｒ５７７−Ｓｅｒ６３ ５の間のＣ−末端ループの、より大きい部分の欠失がＣ４ＢＰへの結合に対する 親和力を低下させるが、この欠失はＡＰＣ補因子活性のないタンパク質を生ずる ことを例示した。△５７７−６３５の抗凝血活性の欠如に関する正しい説明は、 その完全γ−カルボキシル化の欠如であった。△５７７−６３５が完全にγ−カ ルボキシル化されない理由は明らかでなかった。ｒＨＰＳ類似体を発現する細胞 はクローンでなかったので、それは重大な切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）自身の 性質ではあり得なかった。△５７７−６３５は、おそらく通常は１０〜１１個で ある中の約８個のＧｌａ残基しか有しておらず、従ってＣａ²⁺、リン脂質、因子 Ｘａ及び／又はＡＰＣと最適に相互作用することができないため、ＡＰＣのため の補因子として機能することができなかったが、それにもかかわらず、それはそ の精製に用いられるＣａ²⁺−依存性モノクローナル抗体に結合する。これは、切 断自身が直接ＡＰＣ補因子機能を妨げるか、又はＡＰＣ補因子機能がＧｌａへの 要求において、その抗体結合より厳酷であるかのいずれかであると論証する。後 者の方がこの突然変異体の抗凝血活性の欠如に関する、ありそうな説明だと思わ れるが、残基５７７−６０７がＡＰＣ補因子を機能させる正しい立体配置をプロ テインＳに与えることも可能性である。 驚くべきことに、少なくとも残基４０１−４５７の推定Ｃ４ＢＰ結合ドメイン 及び５８３−６３５のＣ４ＢＰ結合ドメインが欠如した欠失突然変異体は、Ｃ４ ＢＰ結合活性が欠如しているが、ＡＰＣ補因子活性を保持している。さらに驚く べきことに、実際に、ＳＨＢＧ−様ドメインとして既知の完全Ｃ−末端領域の欠 失、すなわち野生型プロテインＳの約２／３の欠失が、得られる欠失突然変異体 のＡＰＣ補因子活性の消失を伴わずに得られた。残基２４３−６３５は、野生型 プロテインＳの残基１−２４２を含む、得られるミニプロテインＳ（ｍｉｎｉ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ）のＡＰＣ補因子活性を破壊せずに、除去された。 本発明は、ＡＰＣに対する補因子活性を有し、対応する成熟野生型プロテイン ＳのＳＨＢＧ−様ドメインの少なくとも２つのＣ４ＢＰ結合ドメインが欠如した プロテインＳの欠失突然変異体を目的とする。突然変異プロテインＳのＡＰＣに 対する活性は、欠失突然変異体が由来する対応する成熟野生型プロテインＳによ り示される活性の９５％以上であるのが好ましい。 本発明の好ましい実施態様において、ヒトプロテインＳから欠失突然変異体を 誘導する。配列番号（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄ ｌｉｓｔｉｎｇ）１において野 生型ヒトプロテインＳのアミノ酸配列を示す。この配列において、残基１−３７ はＧｌａドメインを含み、残基３８−４５は疎水性領域を含み、残基４６−７５ はトロンビン感受性ドメインを含み、残基７６−２４２は４つの表皮成長因子様 ドメインを含み、残基２４３−６３５はＳＨＢＧ様ドメインを含む。残基４０８ −４３４及び６００−６２５に、ＳＨＢＧ様ドメイン内に位置するジスルフィド ループを含む２つの領域がある。これらの２つのループは本明細書において前に 述 べた通り、プロテインＳがＣ４ＢＰに結合するのに必要なＣ４ＢＰドメインであ ると仮定される。従って本発明は特定の実施態様において、対応する成熟野生型 ヒトプロテインＳの少なくともアミノ酸残基４０８−４３４及び６００−６２５ が欠如した欠失突然変異ヒトプロテインＳを目的とする。従って本発明の欠失突 然変異体は、配列表ｉｄ１（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ ｉｄ １）か ら今示した欠失領域を除いたアミノ酸配列を有することができる。 本発明の欠失突然変異体は、２つの小領域自身を失うのみでなく、相互を連結 しているアミノ酸配列のいくらか、又はすべての欠失を有することもできる。ヒ トプロテインＳの場合、これは残基４０８から残基６２５の欠失を意味する。Ｃ −末端から、Ｃ−末端方向から見られる第２Ｃ４ＢＰドメインの末端までの欠失 を有することもできる。ヒトプロテインＳの場合、これは残基４０８−Ｃ−末端 残基の欠失を意味する。さらに驚くべきことに、完全なＳＨＢＧ様ドメインの欠 失でさえＡＰＣ補因子に対する活性をまだ有する欠失突然変異体を生ずることが 見いだされた。実際にそのような突然変異体はまだ、成熟野生型プロテインＳが 有するＡＰＣに対する活性の９５％以上を有している。ＳＨＢＧ−様ドメインが 成熟野生型プロテインＳの３分の２を構成しており、一般にそのような大きな欠 失は、不活性化に導くタンパク質の残りの部分におけるコンホメーション変化を 生じないとは予測されないので、これは驚くべきことである。 従って本発明は少なくともＣ４ＢＰドメインの欠失を有し、完全ＳＨＢＧ様ド メインの欠失を含むＳＨＢＧ様ドメインのアミノ酸配列におけるいずれのサイズ の欠失をもさらに含むことができる欠失突然変異プロ テインＳを目的とする。ヒト突然変異プロテインＳの場合、これは、本発明の欠 失突然変異ヒトプロテインＳに導く、少なくともアミノ酸残基４０８−４３４及 び６００−６２５の欠失を含み、場合によりさらにアミノ酸残基２４３からＣ− 末端アミノ酸残基に位置する残りのアミノ酸残基におけるいずれの長さの欠失も 含む、ｉｄ１に従うアミノ酸配列を意味する。 本発明は、 （１）試験管内凝結アッセイにおける抗凝結活性；及び （２）Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）に結合する能力の低下という望まし い性質を有する修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）欠失突然変異プロテインＳ、ｄＰｓと 命名されるミニプロテインＳにつき記載する。 抗凝結活性は、ｄＰＳが標準的試験管内ＡＰＣ補因子アッセイにおいて、プロ テインＳ不足血漿の血餅形成時間を、好ましくは少なくとも５％、より好ましく は少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも約２０〜５０％延長する能力 を有することを意味する。代表的試験管内凝結アッセイを本明細書に記載する。 本発明のｄＰｓがＣ４ＢＰに結合する能力は、ヒト血漿から精製されるＰＳ、 又は組み換えＤＮＡ法により生産されるＰＳ、すなわち野生型ＰＳとの比較にお いて測定される。血漿−精製ＰＳの調製はＤａｈｌｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ．，２０９：２００７−２０１０（１９８３）及びＳｃｈｗａ ｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１４３，９０１号により記載された。（ 引用されるすべての参照文献の記載事項は、引用することにより本明細書の内容 となる）。組み換えＰＳはＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａ ｅｍｏｓ ｔ ．，６７：５２６−５３２（１９９２）により記載されている通り、又は本明 細書に記載の通りに生産することができる。結合能力の低下（例えば結合定数と して表される）はＣ４ＢＰによる中和に対する増加した抵抗性、遊離のプロテイ ンＳの血漿量の増加、及び従って単位重量のタンパク質当たりの力価における有 効な増加に翻訳されるので、Ｃ４ＢＰへの野生型ヒト成熟ＰＡ結合と比較される 場合の、ｄＰＳがＣ４ＢＰに結合する能力の低下は、本発明において有用である ためのいずれの測定可能な結合における低下であることもできる。 Ｃ４ＢＰの結合能力における好ましい低下は、直接結合において測定され、結 合における低下として表される場合、結合容量（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉ ｔｙ）における少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましく は少なくとも約９０〜１００％の低下である。言い換えるとｄＰｓは、同等のＣ ４ＢＰ結合アッセイにおいて比較した時に野生型ヒト成熟ＰＳの約５０％以下、 好ましくは約２０％〜０％以下の結合容量を有する。ｄＰＳの結合は当該技術分 野の熟練者に既知の多様な方法により測定することができる。 本発明のｄＰＳは、好ましい場合にしても、野生型成熟ＰＳをコードするアミ ノ酸配列の対応する部分と実質的に相同である。 少なくとも１つの実施態様において、ｄＰＳは生体内における処置の方法にお いて用いられるはずなので、本来の（野生型）ヒトＰＳに実質的に相同のタンパ ク質を患者に与え、タンパク質に対する可能な有害免疫応答を制限するのが重要 である。実質的に相同とは、アミノ酸残基の少なくとも９５％、好ましくは少な くとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％が野生型ヒト成熟ＰＳをコ ードするアミノ酸配列の対 応する部分の野生型ヒト成熟ＰＳにおけると同じであり、それにより免疫系によ り検分した場合に野生型ＰＳに対してｄＰＳの全体的差を最小にすることを意味 する。 成熟野生型ヒトＰＳの完全アミノ酸残基配列を配列番号１（ＳＥＱＩＤ ＮＯ １）に示す。成熟ＰＳは、リーダーポリペプチド及びシグナル配列の切断及び 除去の後のタンパク質を言う。 ヒト以外の種からのプロテインＳが構造的、及び一次配列の点の両方で高度に 関連している限り、本発明はウシ、ラット、ウサギ、マウス、ブタ、霊長類など を含む他の哺乳類に由来する、ｄＰＳの特性を有する突然変異プロテインＳも含 む。 トロンビンは野生型プロテインＳを切断し、不活性化することが知られている ので、ＡＰＣに関する補因子活性を有し、Ｃ４ＢＰ結合活性が欠如しているのみ でなく、トロンビンに対して耐性でもある突然変異プロテインＳを生産するのは 、明らかに有利である。従って本発明は好ましくは、今記載した種々の実施態様 において、対応する成熟野生型プロテインＳのＧｌａドメインのトロンビン感受 性ループ領域における少なくとも１つの突然変異をさらに含み、該突然変異が欠 失突然変異体をトロンビン耐性とする欠失突然変異体も目的とする。 Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８６：３２４１ａ（１ ９９２）により、ＰＳをあるアルギニン残基、すなわち野生型ＰＳの残基４９、 ６０、７０において突然変異させ、抗凝結活性の消失を起こすトロンビンによる タンパク質分解的切断に対するＰＳの感受性を低下させるか、又は除去すること ができることが記載された。ＰＳ上のトロンビン−感受性切断部位は、トロンビ ン−感受性ループ領域又は Ｔ−ループ領域の残基位置４９、６０及び７０にあると同定された。かくしてこ の領域における置換はＴ−ループ突然変異と呼ばれる１種の突然変異を限定し、 それは修飾ＰＳを形成する。Ｔ−ループにおける１つ又はそれ以上の残基の置換 は、試験管内においてトロンビンに対するＰＳ感受性を低下させることが示され た。ＰＳのトロンビン切断がＰＳの抗凝結活性を不活性化する限り、トロンビン 感受性の阻害は、その血清半減期を延長することによりＰＳ活性を向上させる。 Ｔ−ループ突然変異はＰＳのＣ４ＢＰに対する結合に影響を与えるとは思われな いが、Ｔ−ループにおける突然変異はトロンビンに対する耐性を向上させる。 従って本発明は前章で記載した通り、対応する成熟野生型ヒトプロテインＳの 残基４６−７５により限定される領域に位置するトロンビン感受性ループにおけ る少なくとも１つの突然変異をさらに含むヒトプロテインＳの欠失突然変異も目 的とする。トロンビン感受性ループにおける適した突然変異位置は、対応する野 生型成熟ヒトプロテインＳのアミノ酸配列の位置４９、６０及び７０における残 基である。 かくして本発明は他の実施態様において、さらなる突然変異が１つ又はそれ以 上のＰＳアミノ酸残基位置番号４９、６０又は７０の置換を含む欠失突然変異Ｐ Ｓを含む。 トロンビン耐性を与えるために、１個の置換より複数の置換が好ましい。好ま しい置換はＲ４９Ｌ、Ｒ６０Ｌ及びＲ７０Ｉから成る群より選ばれるものである 。特に好ましい置換はＲ４９Ｌ／Ｒ６０Ｌ、Ｒ４９Ｌ／Ｒ７０Ｉ。Ｒ６０Ｌ／Ｒ ７０Ｉ及びＲ４９Ｌ／Ｒ６０Ｌ／Ｒ７０Ｉから成る群より選ばれる。三重の突然 変異体が最も好ましい。 かくして本発明の好ましいｄＰＳは、（１）Ｃ４ＢＰ結合に対応する 領域、すなわちアミノ酸残基位置４０１−４５７及び５８３−６３５の欠失、又 は残基２４３−Ｃ末端残基の欠失、ならびに（２）本明細書で挙げたＴ−ループ 領域における置換の両方を含む配列を有する。かくして好ましいｄＰＳは、本明 細書で限定した少なくともＣ４ＢＰ結合領域における欠失に加えて、トロンビン 感受性ループにおける１つ又はそれ以上の置換を有する。 本発明の他の実施態様は、さらに別の突然変異を含み、該さらに別の突然変異 は、対応する野生型成熟プロテインＳ、好ましくはヒトプロテインＳにおける表 皮成長因子様ドメイン３及び４を含む領域に位置している。そのような突然変異 は置換又は欠失突然変異体であることができる。Ｄａｈｌｂａｃｋ ｅｔ ａｌ ．１９９０ｃ（Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，Ｂ．，Ｍａｌ ｍ Ｊ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌ ｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０Ｃ；２６５ ：８１２７−８１３５）から、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２がＡＰＣ補因子活性に必要 であることが既知である。ＥＧＦ３及びＥＧＦ４は必要でないので、前記の本発 明の実施態様に加えてＥＧＦ３及びＥＧＦ４ドメイン、すなわち残基１６０−２ ４２に含まれる領域も欠如した欠失突然変異体も含むことができる。 今記載した本発明のいずれの欠失突然変異体も、ＡＰＣ補因子活性を低下させ ない修飾、すなわち付加、欠失又は置換をさらに行うことができる。例えば融合 タンパク質を作り、他のタンパク質又はポリペプチド の所望の性質を本欠失突然変異体の興味深い性質と組み合わせることができる。 本発明の欠失突然変異プロテインＳ（ｄＰＳ）は、本明細書でさらに議論する 通り、多様な治療法において用いられる。ｄＰＳは製薬学的組成物に調製するこ とができ、凝血及び他のＰＳ−媒介過程の阻害のために投与することができる。 本発明は本発明の欠失突然変異体の実施態様をコードする合成又は組み換えヌ クレオチド配列も目的とし、そのようなヌクレオチド配列を含む組み換えベクタ ーも含み、該ベクターは該ヌクレオチド配列を発現することができるのが好まし い。本発明はそのようなヌクレオチド配列を含む、及び／又はそのような組み換 えベクターを含む宿主細胞も含み、該宿主細胞は該ヌクレオチド配列上で、又は 該ベクター上でコードされる発現産物を分泌できることが好ましい。 本発明のヌクレオチド配列は、本発明の欠失突然変異プロテインＳ（ｄＰＳ） をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする。すなわち本発明のＤＮＡセグ メントはｄＰＳ構造遺伝子の存在を特徴とする。遺伝子はコドンの中断されない 線状系列として存在するのが好ましく、各コドンはｄＰＳタンパク質に存在する アミノ酸残基をコードする、すなわちイントロンを含まない遺伝子であるのが好 ましい。 １つの好ましい実施態様は、アミノ酸残基配列が２つのＣ４ＢＰ結合部位、残 基４０１−４５７及び５８３−６３５を含むアミノ酸配列の少なくとも２つの欠 失、及び好ましくは残基２４３−Ｃ末端残基の欠失を有する以外は、配列におい て野生型ＰＳタンパク質に対応するｄＰＳを限定するアミノ酸残基配列をコード するヌクレオチド配列であり、該ヌ クレオチド配列はｄＰＳを発現できるのが好ましい。 好ましいヌクレオチド配列は本質的に配列番号２に示される配列から成るアミ ノ酸残基配列をコードし、そこにおいて前記の４０１−４５７及び５８３−６３ ５の欠失は存在しない。アミノ酸配列番号２に対応するＤＮＡ配列は配列番号１ である。ＰＳヌクレオチド配列番号１は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋにも挙げられており 、受け入れ番号Ｙ００６９２を有する。翻訳後処理の後、対応するアミノ酸配列 番号２が得られる。このアミノ酸残基配列もＧｅｎ Ｂａｎｋに挙げられており 、受け入れ番号Ａ２６１５７を有する。 関連実施態様において、そのようなヌクレオチド配列はさらに、Ｒ４９Ｌ、Ｒ ６０Ｌ及びＲ７０Ｉから成る群より選ばれる置換の少なくとも１つを含み、ヌク レオチド配列はｄＰＳを発現することができる。特に好ましいヌクレオチド配列 は、Ｒ４９Ｌ／Ｒ６０Ｌ、Ｒ４９Ｌ／Ｒ７０Ｉ、Ｒ６０Ｌ／Ｒ７０Ｉ及びＲ４９ Ｌ／Ｒ６０Ｌ／Ｒ７０Ｉから成る群より選ばれる置換を有するｄＰＳをコードす るヌクレオチド配列を含む。言い換えると、１つの実施態様においてヌクレオチ ド配列は、本明細書に記載される通りの少なくとも両方のＣ４ＢＰ結合ドメイン の欠失及びＴ−ループにおける置換を有するｄＰＳをコードする。 上記のｄＰＳをコードする相同ＤＮＡ及びＲＮＡも含まれる。 ｄＰＳタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（すなわち合成オリゴヌクレ オチド）は化学的方法、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉ， ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ａ ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．，１０３：３１８５−３１９１，１９８１）のホスホト リエステル法により、又は自動合成法を用いて容易に合成することができる。さ らに、もっと大きなＤＮＡセグメントを 周知の方法、例えばＤＮＡセグメントを限定するオリゴヌクレオチドの群の合成 、ならびにそれに続くハイブリッド形成及び完全なセグメントの構築のためのオ リゴヌクレオチドの連結により容易に製造することができる。 もちろんコード配列を化学的に合成することにより、いずれの所望の修飾も、 単に本来のアミノ酸残基配列をコードする塩基を適した塩基に置換することによ り行うことができる。 さらに本発明は、少なくとも１つの本発明のヌクレオチド配列を含む組み換え ＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を含む。ｒＤＮＡは、ベクターを本発明のヌクレオチド 配列に作用的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結することにより製造することが できる。 本発明で用いられる「ベクター」という用語は、細胞において自律複製が可能 であり、他のヌクレオチド配列が作用的に連結され、付けられたセグメントの複 製をもたらすことができるＤＮＡ分子を言う。ｄＰＳ遺伝子の発現を方向付ける ことができるベクターは本明細書において「発現ベクター」と言われる。 本発明のＤＮＡセグメントを作用的に連結するベクターの選択は、当該技術分 野において周知の通り、所望の機能的性質、例えばタンパク質発現、及び形質転 換される宿主細胞に直接依存し、これらは組み換えＤＮＡ分子の構築の分野にお ける生来固有の制限である。 原核レプリコンを含むベクターも、それを用いて形質転換されたバクテリア宿 主細胞、例えばＥ．コリ中のｄＰＳ遺伝子の発現（転写及び翻訳）を方向付ける ことができる原核プロモーターを含むことができる。バクテリア宿主と適合性の プロモーター配列は典型的に、本発明のＤＮ Ａセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含むプラスミドベクターにおいて 与えられる。そのようなベクタープラスミドの典型は、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵ Ｃ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃ ａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。 真核細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベ クターも、本発明の組み換えＤＮＡ分子の形成に用いることができる。真核細胞 発現ベクターは当該技術分野において周知であり、いくつかの商業的供給源から 入手可能である。典型的にそのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿 入のための簡便な制限部位を含んで与えられる。そのようなベクターの典型はｐ ＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） 、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能なｐＸＴ１、 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ Ｃ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から受け入れ番号ＡＴＣＣ３７７２２として入 手可能なｐＪ５Ｅω、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ ３１２５５）及び同様の真核発現 ベクターである。 本発明は、本発明の組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主細胞も含 む。宿主細胞は原核又は真核であることができるが、真核細胞が好ましい。ｄＰ Ｓテンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞系が細胞培養法と適合性であり、 発現ベクターの増殖及びｄＰＳ遺伝子産物の発現と適合性であれば、制限されな い。好ましい真核宿主細胞は酵母及 び哺乳類細胞を含み、マウス、ラット、サル又はヒト繊維芽細胞株からの細胞な どの脊椎動物細胞が好ましい。好ましい真核宿主細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６ １として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣから ＣＲＬ １６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、 ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）及び同様の真核組織培養細胞株を含む。特 に好ましく、好例となるのは、Ｈｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ２６：２９１−２９８（１９７８）により記載され、ＡＴＣＣからＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ １６１６として入手可能なマウス乳癌細胞株Ｃ１２７Ｉである。 本発明の組み換えＤＮＡ分子を用いた適した細胞宿主の形質転換は周知の方法 により行われ、典型的にそれは用いられるベクターの種類に依存する。原核宿主 細胞の形質転換に関し、例えばＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，６９：２１１０（１９７２）；及びＭａｎｉａｔ ｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｍｍａｌ ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）を参照 されたい。 ｒＤＮＡｓを含むベクターを用いた脊椎動物細胞の形質転換に関し、例えばＧ ｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；Ｗｉｇ ｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６ ：１３７３−７６（１９７９）及び本明細書における説明を参照されたい。 形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９ ７５）又はＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：２０８（１９ ８５）により記載の方法などの周知の方法により同定することができる。 ｒＤＮＡの存在に関する直接アッセイに加え、成功した形質転換を、ｒＤＮＡ がｄＰＳの発現を方向付けることができる場合は周知の免疫学的方法により、又 はｄＰＳの生物活性の検出により確証することができる。 かくして形質転換された宿主細胞自身に加え、本発明はこれらの細胞の培養物 、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質）培養物、又はモノクロナール 培養物から誘導される栄養培地中の培養物も含む。培養物はｄＰＳ抗原性又は生 物活性を示すタンパク質も含むのが好ましい。 形質転換された宿主細胞の培養に有用な栄養培地は当該技術分野において周知 であり、いくつかの商業的供給源から得ることができる。宿主細胞が哺乳類細胞 である実施態様の場合、「無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）」培地を用いること ができる。好ましいのは本明細書に記載の培養条件である。 本発明の欠失突然変異ヒトプロテインＳ（ｄＰＳ）は多様な手段で生産するこ とができ、そのような生産手段は制限であると考えられるべきではない。 ｄＰＳの製造は典型的に：本発明のｄＰＳタンパク質をコードするＤＮＡセグ メントを準備し；準備されたＤＮＡセグメントを発現ベクター中に導入し；ベク ターを適合性宿主細胞中に導入し；ｄＰＳタンパク質の発現に十分な条件下で宿 主細胞を培養し；発現されたｄＰＳタンパク質を宿主細胞から回収する段階を含 む。 発現されたタンパク質が野生型ＰＳと高度に関連していれば、ｄＰＳの精製は 、細胞培養物から精製ＰＳを調製するための当該技術分野で認められた多様な方 法により行うことができる。 かくして１つの実施態様において、本明細書に記載のヌクレオチド配列を用い てｄＰＳタンパク質を製造する。別の場合、本明細書に記載のスクリーニング法 を用い、開示されている所望の性質を有するｄＰＳを与える、野生型ＰＳにおけ るアミノ酸の別の置換を同定することができる。本明細書に記載の多数の突然変 異構築物によりわかる通り、本方法により多様なｄＰＳタンパク質を製造するこ とができる。本明細書に特定的に記載されたもの以外の別の置換（突然変異）又 は欠失を容易に設計し、開示されている生物活性を有するｄＰＳを形成すること ができる。突然変異は、あらかじめ選択されたオリゴヌクレオチドを用いた試験 管内における特定部位の突然変異誘発などの多様な方法のいずれかにより導入す ることができる。 少なくとも製薬学的に許容し得る担体、及び活性成分としての本発明の欠失突 然変異プロテインＳを含む製薬学的組成物も意図されている。以下：急性血栓症 、プロテインＳ欠乏症、敗血症、炎症及び癌の危険のある患者のいずれかの処置 のための本発明の欠失突然変異プロテインＳのそのままの、又は製薬学的組成物 としての使用も本発明の範囲内に含まれる。 本発明の欠失突然変異ヒトプロテインＳ（ｄＰＳ）は典型的に、意図される用 途に適した多様な組成物形態の１つ又はそれ以上で与えられる。ｄＰＳは多様な 緩衝液及び溶液中でその生物活性を保持するが、製薬学的に許容し得る賦形剤中 で調製されるのが好ましい。特に好ましいのは、 組成物中でｄＰＳの最大の安定性及び生物活性を与える組成物である。そのよう な組成物は一般に当該技術分野において周知である。 １つの実施態様において、組成物はさらに治療的に有効量の第２の、抗凝血物 質又は血栓溶解剤として有効な活性成分を含むことができる。 ＰＳはカルシウム依存性タンパク質であるので、好ましい組成物はさらに２価 のカルシウムカチオンを典型的に生理学的量で含む。 本発明の治療的組成物は、生理学的に許容し得る担体を、活性成分としてその 中に溶解又は分散された本明細書に記載のｄＰＳの少なくとも１種と共に含む。 好ましい実施態様において、治療的組成物は、治療目的でヒト患者に投与された 場合に免疫原性でない。 本明細書で用いられる「製薬学的に許容し得る」、「生理学的に許容し得る」 という用語及びそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体及び試薬を言う場 合、互換的に用いられ、吐き気、めまい、胃の混乱（ｇａｓｔｒｉｃ ｕｐｓｅ ｔ）などの望ましくない生理学的影響を与えることなく物質をヒトに投与するこ とができることを示す。 さらに、治療的組成物は発熱物質を含まない、すなわち発熱物質に関する従来 のアッセイにおいてアッセイされた時に発熱応答を起こすことができないのが好 ましい。 その中に溶解又は分散された活性成分を含む薬理学的組成物の調製は当該技術 分野において十分理解されている。典型的にそのような組成物は無菌注射剤とし て、水性又は非水性液体溶液又は懸濁液として調製されるが、使用前に液体中の 溶液又は懸濁液とするのに適した固体の形態も調製することができる。調剤は乳 化することもできる。さらに治療的量のｄＰＳが軟膏中に、又はバンドエージな どの拡散可能なパッチ上に 存在し、薬剤を局所的に与えることができる。 さらに、必要なら組成物は少量の補助物質、例えば活性成分の効力を強化する 湿潤剤類又は乳化剤類、ｐＨ緩衝剤類などを含むことができる。 本発明の治療的組成物はその中の成分の製薬学的に許容し得る塩類を含むこと ができる。 生理学的に許容し得る担体類は当該技術分野において周知である。液体担体類 の例は、活性成分及び水に加えて無機物を含まない、あるいは生理学的ｐＨ値に おけるリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理学的食塩水、あるいは両方、例えば リン酸塩−緩衝食塩水を含む無菌水溶液である。さらに水性担体は１種以上の緩 衝塩、ならびに塩化ナトリウム及びカリウムなどの塩類、デキストロース、プロ ピレングリコール、ポリエチレングリコール及び他の溶解物を含むことができる 。 液体組成物は本明細書に記載の通り、水に加えて、又は水を除外して液相を含 むこともできる。 治療的組成物は有効量の本発明のｄＰＳを、典型的に合計治療的組成物の重量 当たりに少なくとも０．１重量％の活性タンパク質の量で含む。重量％は合計組 成物に対するｄＰＳタンパク質の重量による比率である。 Ｃ４ＢＰ結合活性の低下又は不在と組み合わされた抗凝血物質として作用する 示されているｄＰＳの能力を鑑みて、本発明のｄＰＳは、Ｃ４ＢＰにより不活性 化されないその相対的能力の故に、遊離のＰＳの血漿量が増加した有用な抗凝血 物質として機能する能力を有する。かくして本発明のｄＰＳは、ＰＳが治療的に 用いられ得る場合に野生型プロテインＳ（ＰＳ）の代わりに治療的に用いること ができる。ＰＳ、特に本発明のｄＰＳの典型的用途は、ＰＳが凝血を阻害するよ うに機能する凝血 過程、特にＣ４ＢＰが存在してＰＳを阻害する過程を含む。 本方法を実行するための代表的患者は、血栓症、炎症又は野生型ＰＳが改善的 効果を与える他の有害な生物過程に関する危険のあるヒトである。 ｄＰＳを用いる治療法に関する特に治療的に重要な凝血過程の例は、急性血栓 症（静脈性及び／又は動脈性の両方）、遺伝性又は後天性プロテインＳ欠乏症、 敗血症、炎症過程及び癌である。動脈性及び静脈性血栓症におけるＰＳの使用は 、いくつかの研究において示されている通り、特に好ましい；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２：１０２９（１９２２）；Ｔｈｏｍｍｅｎ ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｈｅｎｌｚ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．，１１９：４９３−４ ９９（１９８９）；Ｗｉｅｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，５ ８：４６１−４６８（１９９０）。 方法は、患者の組織、臓器、体液試料、例えば血液、血漿又は血清、あるいは 循環系を生体内又は試験管内において、製薬学的に有効量の本発明のｄＰＳを含 む組成物と接触させることを含む。１つの実施態様において、生体内における接 触は、本発明のｄＰＳを含む治療的有効量の生理学的に許容し得る組成物を患者 に投与することにより行われる。 かくして本発明は、治療的有効量の本発明のｄＰＳを含む組成物をヒトに投与 することを含む、ヒトにおける凝血を阻害するための方法につき記載する。 ｄＰＳの治療的有効量は、所望の効果を達成する、すなわち患者の循環系の体 液試料における凝血時間を短縮し、それにより凝血の傾向を低下させるために算 出されたあらかじめ決められた量である。生体内治療 の場合、有効量は、凝血、炎症、敗血症又はプロテインＳ欠乏症に伴う１つ又は それ以上の症状における改善により測定することができる。 かくして本発明のｄＰＳの投与のための投薬量範囲は、凝血の症状が改善され る、又は凝血の傾向が低下する所望の効果を与えるのに十分な多量の投薬量であ る。投薬量は不利な副作用、例えば過粘着性症候群、肺水腫、うっ血性心不全な どを起こす程多量であってはならない。一般に投薬量は患者の年令、状態、性別 及び疾患の程度により変化し、当該技術分野における熟練者が決定することがで きる。 投薬量は合併症のある場合にはそれぞれの医師により調節することができる。 本発明のｄＰＳの治療的有効量は典型的に、生理学的に許容し得る組成物にお いて投与された場合に、約１ナノモル（ｎＭ）〜１マイクロモル（μＭ）、好ま しくは約１０〜５００ｎＭ、最も好ましくは約５０〜２００ｎＭの血漿又は局所 的濃度を達成するのに十分な量である。 本発明のｄＰＳは注射により、又は時間をかけた漸次輸液（ｇｒａｄｕａｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）により非経口的に投与することができる。本発明のｄＰＳは 静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｌｌｙ）、経 皮的、皮膚的（ｄｅｒｍａｌｌｙ）に投与することができ、蠕動手段により与え ることができる。凝血及び炎症は本方法の好ましい標的なので、循環系への静脈 内投与が特に好ましい経路である。 ｄＰＳを用いる本方法に適用できる、ＰＳを用いた投薬量の例及び投与の経路 を記載した代表的治療法は、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，１ ４３，９０１号に記載されている。 関連する実施態様において、本発明は他の抗凝血治療と組み合わされたｄＰＳ の使用を意図している。特に活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）への補因子としての ＰＳを鑑み、好ましい実施態様は、治療的有効量のプロテインＣ（ＰＣ）チモー ゲン又はＡＰＣと組み合わされたｄＰＳ治療的組成物を用いる。ＰＣは生体内で ＡＰＣに変換されることが既知であり、従って生体内法においてＡＰＣの代わり に、又はそれと組み合わせて用いることができる。従って１つの実施態様におい て、本発明は治療的有効量のｄＰＳ及び治療的有効量のＰＣ、ＡＰＣ又は両者を 、それぞれ製薬学的に許容し得る賦形剤中で投与することを含む、凝血を阻害す る方法を意図している。本来のＰＳ及びＡＰＣを用いた代表的方法は、Ｓｃｈｗ ａｒｚ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，１４３，９０１号に記載されており、治 療目的に適した精製ＡＰＣの調製も記載されている。実施例 ：ヒトミニプロテインＳの構築及びそれらの分析 ヒト性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）様ドメインが欠如した組み換えヒ トプロテインＳ分子（ミニプロテインＳ、残基１−２４２）を構築した。切断分 子を哺乳類細胞発現系において発現させ、細胞培養培地から精製し、特性化した 。 還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で、ミニプロテインＳの分子量 を評価した。 活性化部分的トロンボプラスチン時間血餅形成アッセイ系（ａｃｔｉｖａｔｅ ｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ ｃｌｏｔｔｉ ｎｇ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用い、ミニプロテインＳは、プロテインＳ 不足血漿の活性化プロテインＣ誘導血餅形成時間を、用量依存的に延長すること ができた。 さらにミニプロテインＳを抗−プロテインＳモノクローナル抗体のパネルを用 いて精査した。 最後に、ミニプロテインＳは精製プロテインを用いた系においてＣ４ｂ−結合 タンパク質（Ｃ４ＢＰ）と相互作用せず、Ｃ４ＢＰに関する結合部位がＳＨＢＧ −様ドメインに局在したことを示唆した。実験法 材料−制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ ＢｇｌＩＩ及びＨ ｉｎｄ ＩＩＩはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓ ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはＢｅｔｈｅｓｄ ａ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＡ，ＵＳ Ａ）から得た。酵素はすべて製造者の指示に従って用いた。エシェリキア コリ （Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＣＪ２３６及びＸＬ−１ブルーはＢｉｏ −Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。ＡＰＣ、プロテインＳ 及びＣ４ＢＰ枯渇血漿は、記載の通りに調製した（Ｋｏｅｄａｍ，Ｊ．Ａ．，Ｍ ｅｉｊｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，Ｓｉｘｍａ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ． Ｎ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２，１２３６−１２４３）。 Ｃ４ＢＰ及び、Ｃ４ＢＰのα−鎖に対して方向付けられた抗−Ｃ４ＢＰモノクロ ーナル抗体８Ｃ１１は記載の通りに調製した（Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．，Ｖｌｏｏ ｓｗｉｊｋ，Ｒ．Ａ．Ａ．，Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．，Ｋａｎｔｅｒｓ，Ｄ．ａｎ ｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，２０４− ２０８）。パーオキシダーゼに共役したウサギ抗ヒトプロテインＳ ＩｇＧはＤ ａｋｏｐａｔｔｓ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から得た。モノクロー ナル抗体は記載の通りに調製した（Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．Ｈｅｓｓｉｎｇ， Ｍ．，ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ，Ｃ．，Ｍｅｉｊｅｒ−Ｈｕｉｚｉｎｇａ，Ｅ．， Ｍｅｉｊｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｐ．Ｇ．，Ｖａｎ Ｍｏｕ ｒｉｋ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．ｖｏｌ２６８，ｐ３９９３−４０００）。Ｉｓｃｏｖｅｓ Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏｓ修正培地、ペニシリン、ストレプトマイシンサルフェート、グルタミン 及び牛胎児血清はＧｉｂｃｏ（Ｐａｉｓｌｙ Ｐａｒｋ，ＵＫ）から得た。トラ シロールはＢａｙｅｒ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，ＦＲＧ）から得た。ビタミンＫ₁ （Ｋｏｎａｋｉｏｎ）はＦ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。ベクタスタチンＡＢＣキットはＶｅｃｔ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡから得 た。 部位特異的突然変異誘発−プロテイン ｃＤＮＡ配列を有する発現ベクターｐ ＭＳＶＰＳからの２８０８塩基対Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉフラグメント （Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｔ．Ｇ．，Ｐｌｏｏｓ ｖａｎ Ａｍｓｔｅｌ，Ｈ．Ｋ．， Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．，Ｒｅｉｔｓｍａ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１９９２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６ ７，５２６−５３２２１）をＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＭｇｌ ＩＩを用いた消化の 後にＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングした。以下の３６−マーをプライマー として用い：５’−ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＣＣ−３、残基２３８−２４９のアミノ 酸配列をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成させ た。位置２４３におけるコドンＴＡＡは停止コドンであり、従って組み換えタン パク質は２４２アミノ酸長である。下線を引いたヌクレオチドは変更した。部位 特異的突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４８８−４９２）に従っ て行った。プロテインＳ挿入片を有するＭ１３ｍｐ１９クローンをＣＪ２３６（ ｄｕｔ^-ｕｎｇ^-）細胞に感染させ、ウラシル−含有１本鎖ファージＤＮＡを単離 し、鋳型として用いた。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた第２鎖合成及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いた連結の後、感応（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＸＬ−１（ｄ ｕｔ⁺ｕｎｇ⁺）細胞を形質転換した。得られた個々のプラークからの１本鎖ＤＮ Ａを単離し、ジデオキシ鎖終結法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎ ａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．ａｎ ｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ７６，５４６３−５４６７）により配列決定し、配列が予想通り であることを確認した。２本鎖ファージＤＮＡをバクテリア細胞から単離し、Ｈ ｉｎｄ ＩＩＩ及びＸｂａ Ｉ消化の後にプロテインＳ挿入片を単離し、ｐＭＳ ＶＰＳ中に再クローニングした。以前に記載された通りに（Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｔ ．Ｇ．，Ｐｌｏｏｓ ｖａｎ Ａｍｓｔｅｌ，Ｈ．Ｋ．，Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｍ． ，Ｒｅｉｔｓｍａ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｕｍａ， Ｂ．Ｎ．（１９９２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７，５２６−５３２） ｐＴＺＸ−ＢＰＶのＢａｍＨ Ｉ消化の後にＢＰＶ−１ゲノムを単離し、ｐＭＳ ＶＰＳ中にクローニングした。得られたプラスミドをポリエチレングリコール沈 澱により精製し、１９９３年６ 月２４日に、ブタペスト条約に従い、Ｂａａｒｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ ｄｓのＣＢＳに、受託番号３６１９３として寄託した。 細胞培養、ＤＮＡトランスフェクション及び組み換えミニプロテインＳの精製 −Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）を以前に記載された通りに（Ｃ ｈａｎｇ，Ｇ．Ｔ．Ｇ．，Ｐｌｏｏｓ ｖａｎ Ａｍｓｔｅｌ，Ｈ．Ｋ．，Ｈｅ ｓｓｉｎｇ，Ｍ．，ＲｅｉｔＳｍａ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ．ａｎ ｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１９９２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７， ５２６−５３２）培養した。トランスフェクションのために２０μｇのプラスミ ドを用い、従来のリン酸カルシウム共沈澱法により細胞をトランスフェクション した（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．（１９８３）Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４５７）。組み換えプロテインＳを含むことが ＥＬＩＳＡにより決定された状態調節された培地を、発現の４８時間後にビタミ ンＫ₁（Ｋｏｎａｋｉｏｎ，Ｒｏｃｈｅ，５μｇ／ｍｌ）の存在下で収穫した。 組み換えプロテインＳをアニオン交換カラム（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｑ 樹脂， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で記載の通りに（Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｔ．Ｇ．，Ｐｌｏｏ ｓ ｖａｎ Ａｍｓｔｅｌ，Ｈ．Ｋ．，Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．，Ｒｅｉｔｓｍａ ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１９９ ２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７，５２６−５３２）精製した。組み換 えプロテインＳの純度及び組み込み度（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、還元１２．５ ％ゲル上のＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いた分離（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７ ０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６０８−６９５）、ならびにウサギ抗−プロテイン Ｓポリクローナル及びマウス抗−プロテインＳモノク ローナル抗体を用いたイムノブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔａ ｅｈｌｉｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，４３５０−４３５４２６）の後に判定した 。 プロテインＳアッセイ−特異的モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡを用いてプロテ インＳ抗原を決定し、２つの独立した抗−プロテインＳモノクローナル抗体のＩ ｇＧ（１３及び３Ｄ９、それぞれ５μｇ／ｍｌ）を５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐ Ｈ９．６において、４℃で終夜、ポリビニルミクロタイタープレート上にコーテ ィングした（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）。 非結合ＩｇＧの洗浄の後、ウェルを１５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＣａＣ ｌ₂を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中の１％（ｗ／ｖ）のＢＳ Ａを用い、室温で１時間遮蔽した（ｂｌｏｃｋ）。量を増加させた組み換えプロ テインＳを加え、室温で１８時間インキュベートした。結合プロテインＳを、ビ オチンと共役した抗−プロテインＳモノクローナル抗体 １８ ＩｇＧ（０．５ μｇ／ｍｌ）に１時間結合させた。ＡＢＣ試薬を加え（１００μｌ）、室温で１ 時間インキュベートした。ニトロフェニルホスフェートの加水分解をＶ_maxプレ ートリーダーを用いて４９２ｎｍにおいて測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅ ｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ） 。 ＡＰＣ補因子活性を、Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｔ．Ｇ．，Ｐｌｏｏｓ ｖａｎ Ａｍ ｓｔｅｌ，Ｈ．Ｋ．，Ｈｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．，Ｒｅｉｔｓｍａ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅ ｒｔｉｎａ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｕｍａ，Ｂ．Ｎ．（１ ９９２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７，５２６−５３２により記載され た通りに血餅形成アッセイにおいて決定した。 Ｃ４ＢＰへの組み換えプロテインＳの結合−組み換えプロテインＳとＣ４ＢＰ の間の複合体形成を、Ｃ４ＢＰ及びビオチン共役抗−プロテインＳモノクローナ ル抗体 １８を用いた感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡにより測定した 。簡単に言うと、Ｃ４ＢＰのα−鎖に向けられたモノクローナル抗体８Ｃ１１か らのＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６中で、 ４℃において終夜、ポリビニルミクロタイタープレートにコーティングした（Ｃ ｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）。非結合ＩｇＧの洗浄の後、 ウェルを１５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＣａＣｌ₂を含む５０ｍＭのＴｒｉ ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中の１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用い、室温で１時間遮蔽 し、Ｃ４ＢＰを１μｇ／ｍｌの最終濃度で２時間結合させた。量を増加させた組 み換えプロテインＳを加え、室温で１８時間インキュベートした。結合プロテイ ンＳを、前記の通りにビオチンに共役した抗−プロテインＳ ＩｇＧモノクロー ナル抗体 １８（０．５μｇ／ｍｌ）に結合させた。 トロンビンによるプロテインＳの不活性化−１ｍｌの組み換えプロテインＳ（ ５０μｇ／ｍｌ）を５０μｌのトロンビン−セファロース（１ｍｇ／ｍｌ）と共 に、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中に おいて３７℃で１時間インキュベートした。遠心によりトロンビン−セファロー スを除去し、不活性化プロテインＳを必要となるまで−２０℃で保存した。 抗−プロテインＳモノクローナル抗体へのミニプロテインＳの結合− 組み換え又はミニプロテインＳ（９００ｎｇ）をポリビニルミクロタイタープレ ート上に、５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６中において４℃で終夜コーティ ングした。種々のモノクローナル抗体からのＩｇＧ（０〜１．５μｇ／ｍｌ）を 加え、室温で２時間インキュベートした。ニトロフェニルホスフェートの加水分 解をＶ_maxプレートリーダーを用いて４９２ｎｍにおいて測定した（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ，ＵＳＡ）。結果と議論 プロテインＳのＳＨＢＧ−様ドメインの役割を研究するために、ミニプロテイ ンＳ（残基１−２４２）を構築し、Ｃ１２７細胞中で発現させた。組み換えミニ プロテインＳを生産するとＥＬＩＳＡにより決定された焦点を単離し、１細胞／ ウェルを用いてサブクローニングした。最高プロテインＳ生産クローンをミニプ ロテインＳの大規模生産に用いた。ミニプロテインＳをＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｑ カラムを用いて培養培地から精製した。還元ＳＤＳゲル上でミニプロテインＳは 、３０及び２０ｋＤという比較的低い見掛けの分子質量を有した（図１）。上部 のバンドは成熟プロテインＳ（残基１−２４２）を示し、トロンビンにより下部 のバンドに変換されることができた（残基７１−２４２）。 ＡＰＣに関する補因子活性を、プロテインＳ及びＣ４ＢＰ枯渇血清、ならびに 量を増加させたプロテインＳを用いて活性化部分的トロンボプラスチン時間系に おいて測定した。図２は、ミニプロテインＳがＡＰＣに関する補因子活性を有す ることを示し、それはトロンビンにより阻害され得る。補因子活性はモルに基づ き、野生型プロテインＳと比較して２倍低かった。これは、ミニプロテイン製造 における切断材料の量のた めであり得る。この段階で、ミニプロテインは８０％の切断材料を含んだが、野 生型プロテインＳは５０％を含んだ（図１）。この実験はさらに、ＳＨＢＧ−様 ドメインの欠失がＡＰＣ補因子活性に影響を与えないことを示し、プロテインＳ （５ＡＰＣの相互作用がおそらく、最近モノクローナル抗体とプロテインＳフラ グメントを用いてＤａｈｌｂａｃｋと ｅｂｒａｎｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｍａｌｍ，Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６５，８１２７−８１３５）、Ｎ−末端を介して起こることを示している 。 カルシウムの存在下におけるＣ４ＢＰへのミニプロテインＳの結合（図３）は 、ミニプロテインＳが野生型組み換えプロテインＳのようにはＣ４ＢＰに結合し ないことを示している。これは、ＳＨＢＧ−様ドメインがＣ４ＢＰに対する結合 部位を含むことを示唆している。それはさらに、ＳＨＢＧ−様ドメインがおそら く抗凝血系に含まれず、補体系に多く含まれることを示唆している。 ＥＬＩＳＡ系（図４）を用いると、抗体 １８はミニプロテインＳを野生型と 同様に認識するが、Ｓ７はミニプロテインＳを認識しなかった。モノクローナル 抗体１８はＥＧＦ３及びＥＧＦ４領域のエピトープに向けられているが、モノク ローナル抗体Ｓ７はアミノ酸４６０に近いＳＨＢＧ領域に向けられている。 当該技術の現状において、ヒトプロテインＳの一次構造が１９９２年１１月１ １日のＧｌｅｎｎ Ｔ．Ｇ．Ｃｈａｎｇの論文“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ”において１６頁に 描かれている。ヒトプレプロプロテインＳに 関するアミノ酸配列（１文字コード）及び１４個のイントロン（Ａ−Ｎ）の位置 が実線の矢印で示されている。プレプロリーダー配列は残基−４１から−１を含 む。実線の棒はジスルフィド結合であり；γ，γ−カルボキシクルタミン酸（Ｇ ＬＡ）；β，β−ヒドロキシアスパラギン酸又はβ−ヒドロキシアスパラギン； ＊，トロンビン−感受性ドメイン中のトロンビン−切断部位；ｏ，芳香族付着ド メインにおける芳香族残基；白いダイヤモンド形は、可能性のあるＡｓｎ−Ｘ− Ｓｅｒ／Ｔｙｒ型の炭水化物結合部位を示す。大きい数字は４つの表皮成長因子 −様ドメインの順序を示し、その後に性ホルモン結合グロブリン−様ドメインが 続く。図面への凡例 図１．イムノブロットプロテインＳのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析。組み換えプロテ インＳ（列１）又はミニプロテインＳ（列２）のアリコート（１００ｎｇ）を還 元条件下で１２．５％のＳＤＳゲル上で分離し、イモビロン膜（ｉｍｍｏｂｉｌ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上にイムノブロットした。結合タンパク質をパーオキ シダーゼに共役したウサギ抗−プロテインＳポリクローナル抗体を用いて検出し た。 図２．ＡＰＣに対するプロテインＳの補因子活性：トロンビンの影響。血餅形 成時間のプロテインＳ依存性延長を、プロテインＳ及びＣ４ＢＰ枯渇血清、ＡＰ Ｃ、カオリン及びセファリンを用い、活性化部分的トロンボプラスチン時間系に おいて測定した。量を増加させた組み換えプロテインＳ（丸）、あるいはトロン ビンで処理しない（白い記号）又は処理した（黒い記号）ミニプロテインＳ（四 角）を加えた。ＣａＣｌ₂を加えることにより血餅形成を開始し、血餅形成時間 を測定した。実験は 二重に行った。 図３．Ｃ４ＢＰへのミニプロテインＳの結合。抗−Ｃ４ＢＰモノクローナル抗 体８Ｃ１１ ＩｇＧをミクロタイターウェル上にコーティングし、Ｃ４ＢＰ（１ μｇ／ｍｌ）を捕捉した。組み換えプロテインＳ（丸）又はミニプロテインＳ（ 四角）をカルシウムの存在下で量を増加させて加えた。Ｃ４ＢＰへの結合は室温 で１８時間行った。結合プロテインＳはビオチンに共役した抗−プロテインＳ １８ ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。実験は二重に行った。 図４．種々のモノクローナル抗体へのミニプロテインＳの結合。ミクロタイタ ープレートに固定された量の野生型組み換え（ｒｅｃ）（[]，０）又はミニプロ テインＳ（ｍｉｎｉ）（△，Ｖ）をコーティングし、量を増加させた種々のモノ クローナル抗体Ｓ７（[]，Ｖ）又は１８（０，△）を室温で２時間加えた。結合 抗体を、「実験法」において記載した通りにパーオキシダーゼに共役したウサギ 抗−マウス抗体を用いて測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＤＵ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ベルテイナ，ロジール・マリア オランダ・エヌエル―2313エイチビー ラ イデン・テイベルジーゲンベークストラー ト30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＰＣに対する補因子活性を有し、対応する成熟野生型プロテインＳのＳ ＨＢＧ−様ドメインの少なくとも２つの推定Ｃ４ＢＰ結合ドメインが欠如してい るプロテインＳの欠失突然変異体。 ２．対応する成熟野生型ヒトプロテインＳの少なくともアミノ酸残基４０１− ４５７及び５８３−６３５が欠如している請求の範囲第１項に記載の欠失望突然 変異体。 ３．対応する成熟野生型ヒトプロテインＳの少なくともＣ−末端から残基４０ １のアミノ酸配列が欠如している請求の範囲第２項に記載の欠失突然変異体。 ４．対応する成熟野生型プロテインＳの完全ＳＨＢＧ−様ドメインが欠如して いる請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の欠失突然変異体。 ５．対応する成熟野生型ヒトプロテインＳの２４３を含んでそれからすべての アミノ酸残基が欠如している請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の欠失突然 変異体。 ６．対応する成熟野生型プロテインＳのトロンビン感受性ループ領域における 少なくとも１つの突然変異をさらに含み、該突然変異が欠失突然変異体をトロン ビン耐性とする請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の欠失突然変異体。 ７．トロンビン感受性ループにおける突然変異が対応する成熟野生型ヒトプロ テインＳの残基４５−７２により限定される領域に位置する請求の範囲第５項に 記載の欠失突然変異体。 ８．突然変異が位置４９、６０及び７０における残基の少なくとも１つの置換 を含む請求の範囲第６項に記載の欠失突然変異体。 ９．表皮成長因子様ドメイン３及び４における少なくとも１つの突然変異をさ らに含む請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の欠失突然変異体。 １０．請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の欠失突然変異体をコードする 合成又は組み換えヌクレオチド配列。 １１．請求の範囲第１０項に記載のヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド 配列を発現できることが好ましい組み換えベクター。 １２．請求の範囲第１０項に記載のヌクレオチド配列及び／又は請求の範囲第 １１項に記載の組み換えベクターを含み、該ヌクレオチド配列上、又は該ベクタ ー上でコードされる発現産物を分泌できるのが好ましい宿主細胞。 １３．少なくとも製薬学的に許容し得る担体及び活性成分としての請求の範囲 第１〜９項のいずれかに記載の欠失突然変異プロテインＳを含む製薬学的組成物 。 １４．急性血栓症、プロテインＳ欠乏症、敗血症、炎症及び癌に関する危険の ある患者のいずれかの処置のための製薬学的組成物における、請求の範囲第１〜 １０項のいずれかに記載の欠失突然変異プロテインＳの使用。