JPH08510639A - Encapsulation of conjugates and nucleic acids for enhanced cellular uptake and gene expression and targeting - Google Patents

Encapsulation of conjugates and nucleic acids for enhanced cellular uptake and gene expression and targeting

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JPH08510639A
JPH08510639A JP6523517A JP52351794A JPH08510639A JP H08510639 A JPH08510639 A JP H08510639A JP 6523517 A JP6523517 A JP 6523517A JP 52351794 A JP52351794 A JP 52351794A JP H08510639 A JPH08510639 A JP H08510639A
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マッケリゴット、サンドラ・ガートルード
アモス、マイケル・デービッド
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、細胞表面リガンド／タンパク質／転写因子および抗体と結合したＤＮＡ／ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチドの徐放による遺伝的物質の生細胞への取込みと組込みを促進する他の分子と結合もしくは共存する核酸のカプセル化法である。該カプセル化法に用いる組成物が開示される。   (57) [Summary] The present invention relates to a nucleic acid that binds to or coexists with other molecules that promote the uptake and integration of genetic material into living cells by sustained release of DNA / RNA or oligonucleotide bound to cell surface ligands / proteins / transcription factors and antibodies. Is the encapsulation method. Compositions for use in the encapsulation method are disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 細胞取込みと遺伝子発現の促進と標的化をもたらす接合体と 核酸のカプセル化 発明の分野 この発明は、生分解性で徐放性のポリマー極微粒子内でタンパク質、抗体もし くは他の分子と接合化もしくは結合した核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌク レオチドもしくはこれらの誘導体）の徐放に関する。この本発明は、遺伝的形質 転換のためのカプセル化遺伝子の使用にも関する。 発明の背景 バイオテクノロジーにおける律速段階の一つは、細胞もしくは組織内への遺伝 的物質の挿入段階である。従来から既知の方法によっては、動植物の生細胞内へ の遺伝的物質（genetic material）の制御された取込みと組込みの促進によっ て外因性遺伝子を有効に発現させるのに満足すべき手段は得られていない。 特異的細胞内への外因性核酸の取込みを改良するために多数の研究がなされて いる。特異的細胞内への核酸の取込みの促進を可能にするいくつかの分子とレセ プターが知られている。例えば、アシアログリコプロテインは肝臓細胞内への取 込みを促進し［ウー（Wu）ら、Ｊ．Biol．Chem．、第２６２巻、第４４２９頁〜 第４４３２頁（１９８７年）参照］、トランスフェリン−ポリリシンアデノウイ ルスは上皮細胞内への取込みを促進し［クリエル（Curiel）ら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．ＵＳＡ、第８８巻、第８８５０頁〜第８８５４頁（１９９１年）参照 ］、また、ヘルペスウイルスのようなウイルス粒子は中性細胞内へ輸送される［ ゲラー（Geller）ら、Science、第２４１巻、第１６６７頁〜１６６９頁（１９ ８８年）参照］。特異的細胞リガンドと結合する抗体も特異的細胞と組織への取 込みを促進する。さらに、レセプターリガンドを有するリポソームは、ＤＡＮを 細胞内へ輸送するのに用いられている［マローン（Malone）ら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．ＵＳＡ、第８６巻、第６０７７頁〜６０８１頁（１９８９年）参照］ 。これらの好ましい特異的な取込み分子は特異的な細胞表面レセプターと結合し 、レセプタ ー仲介エンドサイトーシス経路によって内在化される。 核酸の取込みとその後の細胞による発現の促進を助長する種々の化学的修飾法 が核酸について提案されている。フケット（Huckett）らによれば、次のことが 示されている［Biochem．Pharmacol．、第４０巻、第２５３頁〜第２６３頁（１ ９９０年）参照］。即ち、ＤＡＮを、インスリンに架橋結合して化学的に修飾さ れたアルブミンに非共有結合的に結合させると、３分子複合体はインスリンレセ プターによってＨepＧ２細胞と結合し、次いでレセプター仲介によるエンドサイ トーシスによって該細胞内に取込まれた後、核内へ輸送され、mＲＮＡ転写とタ ンパク質翻訳の態様で発現される。最近、染色体の特異的部位への取込みを標的 にする分子が同定されている。さらに、転写を促進するＤＡＮ結合タンパク質お よびその他の分子も知られている。 これらの方法に欠如しているのは、上記の諸成分を分解から保護する手段であ る。この問題の解決策は、該成分を保護するだけでなく、カプセル化された核酸 とリガンドの徐放を可能にするものである。 遺伝子輸送法 遺伝的物質を生細胞内へ輸送するための既知のテクノロジーには、化学的取込 み法、レトロウイルス感染法および粒子衝撃を含む物理的挿入法が包含される。 これらの方法のうちの一部の方法は、本明細書において提案されるように、カプ セル化された核酸と接合体の使用によって改良することができる。植物、動物、 微生物細胞および生存動物に対するＤＡＮの粒子仲介衝撃法が報告されている［ フィッツパトリック−マクエリゴット（Fitzpatrick−McElligott）、Bio／Tech nology）第１０巻、第１０３６頁〜第１０４０頁（１９９２年）、クライン（Kl ein）ら、Bio／Technology、第１０巻、第２８６頁〜第２９１頁（１９９２年） およびウイリアムス（Williams）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、第８８ 巻、第２７２６頁〜第２７３０頁（１９９１年）参照］。 現在知られている方法には、一定の場合には望ましくない遺伝的物質が永久生 殖系列内へ組込まれるという欠点がある。レトロウイルス仲介遺伝子の転移の場 合のように、遺伝子が生殖系列の細胞内へ組込まれると、通常、該遺伝子は該細 胞が死滅するまで該細胞内に存在する。永久的な遺伝子置換を必要としない患者 はレトロウイルス遺伝子療法によって治療することはできない。その他の点は安 全である。レトロウイルスは癌ウイルスであり、一般的なヒトの集団に使用する ことは本来的に危険である。 現在、一部の疾患の処置に対しては、タンパク質を注入する方法が採用されて いる。タンパク質注入法は一様な効用をもたらさず、注入直後は潜在的に毒性投 与量となる（その後の服量は毒性をもたらすには不十分な量となる）。遺伝的物 質の徐放によりタンパク質とペプチドの持続的生産と送給を可能にする体細胞の 形質転換法が必要となる。 生分解性極微粒子 徐放送給系として薬剤類を含有する生分解性極微粒子を使用する技術も知られ ている。米国特許第４,３８９,３３０号および同第４,５４２,０２５号各明細書 には種々の極微粒子もしくはマイクロカプセルおよびこれらの調製法と使用法が 開示されている。 ヨーロッパ特許出願第２４８,５３１号公開明細書には、ウイルスの複製に対 する潜在的なインヒビターと言われているインターフェロンの生産を誘発させる ためのマイクロカプセルであって、ＲＮＡおよび／またはＤＡＮまたはアンチセ スン（antisense）ＲＮＡを封入したマイクロカプセルが開示されている。しか しながら、該公開明細書には、細胞の細胞内細胞質への取込みと輸送のための方 法は開示されていない。従って、該公開明細書に略述されている方法は、遺伝的 物質と遺伝子発現の利用に適用するには不十分である。 遺伝的物質のカプセル化によって、ヌクレオチドをその放出前の酵素分解から 保護することができる。遺伝子の徐放による生産物発現の制御によって、生物体 の致死率は低下する。 発明の概要 この発明は、標的細胞に対して核酸を徐放するのに適した極微粒子組成物であ っ て、下記成分（a）と（b）を含有する粒径１〜５００ミクロンの極微粒子組成物 に関する: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の合成もしくは天然のＤＡＮも しくはＲＮＡを含有する核酸であって、該核酸の核への取込みもしくは輸送また は細胞内での発現を促進する次の群から選択される促進物質と化学結合によって 複合した核酸［該核酸の含有量は、成分（b）の重量に対して約０.０００１〜５ ０重量％である］;糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、ペプチド、 ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有細胞リガンド、糖脂 質、ペプチドグリカン、レクチン、脂肪酸、リン脂質、トリグリセリド、ステロ イドホルモン、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは 二本鎖ＤＡＮおよび挿入剤、並びに、 （b）次の群から選択される生体適合性で生分解性のポリマーマトリックスで あって、上記の核酸成分（a）をカプセル化するポリマーマトリックス;ポリ−d, Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合d,Ｌ−乳酸とグリコール酸 とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、コポリオキサレート 、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸− カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワックス。 本発明には、標的細胞に対して核酸を徐放するのに適した極微粒子組成物であ って、下記の成分（a）〜（c）を含有する粒径１〜５００ミクロンの極微粒子組 成物も包含される: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の合成もしくは天然のＤＡＮも しくはＲＮＡを含有する核酸［該核酸の含有量は下記の成分（c）の重量に対し て約０.０００１〜５０重量％である］、 （b）核酸成分（a）の標的細胞への取込みもしくは標的細胞の核への輸送を促 進する次の群から選択される促進物質;糖タンパク質、リポタンパク質、核 タンパク質、ペプチド、ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質 含有細胞リガンド、糖脂質、炭水化物、スフィンゴ脂質、ペプチドグリカン、レ クチン、脂肪酸、ガングリオシド、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール 、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＤＡＮおよび挿入剤、並 びに （c）次の群から選択される生分解性で生体適合性のポリマーマトリックスで あって、上記の共存する核酸成分（a）と促進物質（b）をカプセル化するポリマ ーマトリックス;ポリ−d,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合d ,Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリ マー、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン ）、ポリ（グリコール酸−カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワッ クス。 上記第一の態様の場合、促進物質は核酸と直接的に結合して複合体を形成する が、第二の態様の場合には、促進物質はポリマーマトリックス内に核酸と共存す る。上記のいずれの極微粒子組成物にも、極微粒子のコアとして不活性粒子、例 えば、タングステン粒子、金粒子、白金粒子、フェライト粒子、ポリスチレン粒 子またはラテックス粒子等を配合してもよい。 本発明には、動植物の細胞もしくは組織へ挿入されて遺伝子を発現するのに有 効なサイズを有する核酸の調製法であって、上記のいずれかの極微粒子組成物を 含有する生体適合性で生分解性の徐放性極微粒子を形成させる過程を含む該核酸 の調製法も包含される。 上記の核酸の調製法は、核酸含有ポリマーマトリックスを促進物質で被覆する 過程をさらに含んでいてもよく、これにより、核酸の細胞内への取込みまたは核 酸の核への輸送を促進することができる。 本発明には、植物もしくは動物の細胞内へ外因性もしくは内因性遺伝子を徐放 して遺伝子発現をもたらすための方法であって、次の過程（a）〜（c）を含む該 遺伝子の徐放方法も包含される: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の遺伝的構築物を生体適合性で 生分解性のポリマーマトリックスでカプセル化することによって極微粒子組成物 を形成させ、 （b）標的細胞内へ該極微粒子組成物を徐放させるのに適した投与具内に該極 微粒子組成物を包含させ、 （c）ポリマーマトリックスの分解によって該極微粒子組成物を植物もしくは 動物の体内へ放出させ、該極微粒子組成物内に包含される遺伝的構築物と標的細 胞の核を相互作用させる。 本発明においては、極微粒子を注入法、粒子衝撃法およびその他の方法によっ て培養中もしくは生存中の動物もしくは植物の細胞もしくは組織へ直接的に輸送 させる方法を用いる。 図面の簡単な説明 図１は、ＤＡＰＩ（４',６−ジアミジジノ−２−フェニルインドール）で染色 した遺伝的物質とタングステン極微粒子（粒径:＞１μm）を有するマイクロカプ セルを示す。黒い矢印は青色のＤＡＰＩで染色した遺伝的物質を示し、白い矢印 は暗色のタングステンコアを示す。 図２は、マイクロカプセル化した極微粒子の粒度分布と表面特性を示す走査型 電子顕微鏡写真である。該極微粒子はタングステン粒子、プラスミドＤＡＮおよ びニシンの***のＤＡＮを含有する。 図３は、所定の時間に採取した試料溶液中へ放出後の増幅遺伝子を表示するア ガロースゲルを示す。レーン（lane）１はサイズマーカーを示す。レーン２には ＤＡＮは含まれない。レーン３〜７は溶液中へ放出した１時間後、３時間後、４ 時間後、５．５時間後および７時間後の増幅遺伝子を示す。レーン８は７２時間 後の測定可能な放出を示す。レーン９はプラスミドＤＡＮからの増幅されたβ− ガラクトシダーゼコーディング領域（coding region）を示す。 図４は、植物細胞中でのβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現を示す。マイクロ カプセル化した遺伝的物質を用いる衝撃処理に付してから４日後カリフラワーの 組織を、Ｘ−グルクロン酸（酵素基質）を含有する反応緩衝液中に入れた。図中 の矢印は、マイクロカプセル化した遺伝子による植物細胞内での予期された青色 に染色された遺伝子発現を例示する。 図５は、形質転換された動物細胞の安定なクローンを示す。図中の白い矢印は 該クローンを示す。シナハムスター（Chinese hamster）の卵巣細胞を、β−ガ ラクトシダーゼとネオマイシン耐性コーディング配列を含む遺伝子構築物を用い る衝撃処理に付した。衝撃後の該細胞をネオマイシン耐性に対する選択処理に４ 週間付した。生存細胞はネオマイシン耐性、即ち、導入された遺伝子の活性を示 す。各細胞が移植遺伝子（transgene）を有するこれらの細胞は増殖してクロー ンを形成する。クローンの全細胞はβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、他の遺伝 子構築物は導入されたプラスミドＤＡＮ中に存在する。いくつかのクローンが選 択培地中に４週間放置後に観察された。 図６は、ネオマイシン培地中での選択処理に４週間付した後の３つのクローン 中の増幅遺伝子（レーン３〜９）を表示するアガロースゲルを示す。レーン１は 分子量のサイズマーカーを示す。レーン２はプラスミドＤＡＮからの増幅された β−ガラクトシダーゼコーディング領域［正のコントロールマーカー（control marker）］を示す。レーン３〜９は形質転換されたクローンからの増幅ＤＡＮ を示す。ＤＡＮの増幅はポリメラーゼ連鎖反応によっておこなった。ブライマー は、β−ガラクトシダーゼコーディング領域内の配列が増幅されるように設計し た。レーン１０は、外因性ＤＡＮを用いる衝撃処理に付さなかったＣＨＯ細胞か らのＤＡＮを含む。レーン１１はβ−galＤＡＮを含まない負のコントロールで ある。 発明の詳細な説明 本明細書で提案される発明は、ヒトおよびその他の動植物の細胞内細胞質へ遺 伝情報を所定の期間にわたって安全かつ効果的に徐放する方法に関する。本発明 によるこの方法においては、核酸は細胞リガンドと共に、既知の方法、即ち、非 毒性で生分解性のポリマーマトリックスでカプセル化することによって動植物の 細胞内へ郵送される。この方法によれば、動物、微生物および植物の細胞や組織 内における取込みの制御と遺伝子発現の遅延を可能にすることによって、遺伝子 工学において懸案となっていた問題が解決される。さらに、本発明によれば、カ プセル化された核酸とリガンドを酵素分解から保護する。遺伝的物質の徐放によ れば、遺伝子生産物の発現の制御によって生物体の致死率は低下する。遺伝的物 質を生細胞内へ輸送する既知の技術と併用することにより、本発明は該既知技術 の有効性を増大させることができる。非常に重要なことには、本発明は、生殖系 列の組込みを伴うことなく、体細胞の遺伝的形質転換を可能にする実用上極めて 有用な方法を提供する。遺伝的物質の徐放による体細胞の形質転換によって、タ ンパク質とペプチドの持続的な生産と細胞への輸送が可能となる。 本発明においては、遺伝子発現生産物と移植遺伝子を有する生物体を得る目的 および遺伝子治療の目的のために、プロモーターおよび／または特異的ヌクレオ チド配列の調節領域とコーディング領域を含むカプセル化した遺伝的物質を使用 する。 以下に説明する生物学的用語と遺伝子学的用語の定義は、本発明を理解する上 において有用である。 「投与」という用語は、本発明による核酸含有極微粒子を、例えば、非経口的 （静脈内、筋肉内または皮下）な経路によるいずれかの供給法または粒子供給法 によって動物へ供給することを意味する。 「動物」という用語は通常の生物学的な意味で使用するものであり、処置する のに十分な体長を有する全ての動物種、特にヒト、食用動物、哺乳類全般、鳥類 、ペットおよび魚類等が包含される。 「生体適合性」という用語は、人体等に対して毒性がなく、体組織内において 癌や炎症を発生させない特性を意味する。 「生分解性」という用語は、身体の生理的過程により分解して身体から容易に 排出されて体内に過度に蓄積しない生成物を生成するポリマー材料の特性を意味 する。生分解生成物も、ポリマーマトリックスが身体と適合性があるという意味 での生体適合性がなければならない。 病気について用いる「制御する」および「抑制する」という用語は、病気の予 防、治療、進行阻止またはその他の病理学的に有益な効果をもたらすことを意味 する。 本発明によるマイクロカプセルに関して用いる「徐放」という用語は、マイク ロカプセルポリマーマトリックスから核酸活性成分が、処置対象への投与が持続 的もしくは遅延的におこなわれるような延長期間にわたって放出されることを意 味する。徐放期間は１〜５００日間、好ましくは３〜６０日間である。 「ＤＮＡ配列」は、４種のＤＮＡモノマー、即ち、アデニン、グアニン、シト シンおよびチミンのヌクレオチドのいずれかの組合せから成る線状配列であって 、遺伝情報、例えば、アミノ酸に対するコード、プロモーター、制御エレメント （エンハンサー、核認識エレメント等）またはその他の遺伝子生産物をコードす る配列である。特異的ＤＮＡ配列は、既知の特異的機能、例えば、特定のポリペ プチドもしくは特定の遺伝形質をコードする機能または特定の表現型の発現に作 用する機能等を有する配列である。 「外因性遺伝的物質」は、特異的な生殖細胞または遺伝的に形質転換される特 定の接合体を形成する配偶子から得られないか、またはこれらの一部を自然には 形成しない遺伝的物質である。 「遺伝子」は、タンパク質生産物をコードするか、または転写を制御するか、 もしくは転写に作用し、少なくとも１つのＤＮＡ配列を有する遺伝的物質の独立 的に機能する最小単位である。 「投与具（dosing device）」は、極微粒子を動物もしくは植物の細胞内へ導 入もしくは投与するためのビヒクルである。 「遺伝的物質」は、精製もしくは未変性の単数もしくは複数のＤＮＡ配列、例 えば、染色体の一部もしくは全体、天然に存在するかまたは合成的もしくは半合 成的に調製されるＤＮＡ配列、単数もしくは複数の遺伝子および遺伝子キメラ、 例えば、異なるＤＮＡ配列の結合によって形成されるものを構成するＤＮＡ配列 を有する物質である。 「表現型発現」は、生産物、例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質の生産 に おいてもたらされるか、または接合体もしくは生物体の自然表現型の発現を変化 させる単数もしくは複数のＤＮＡ配列のコードの発現である。 「食用動物」という用語は、ヒトもしくは他の動物の食料中のタンパク源とし て消費される動物を意味する。代表的な食用動物としては、ウシ亜科の動物（例 えば、ウシ）、羊科の動物（ovine animals）（例えば、羊）、豚科の動物（例 えば、豚）、家禽（例えば、ニワトリおよび七面鳥）およびウサギ等が例示され る。 「病気」は、種（species）の体内もしくは体外の存在物によって引き起こさ れる病気を意味する。病気は局所的なもの、例えば、腫瘍等であってもよく、あ るいは全身に及ぶもの、例えば、ウイルス性疾患等であってもよい。本発明にお いて特に重要な病気は癌およびウイルス性疾患である。「病気の場所（locale） 」という用語は局所的病気に関するものであって、病気の発生部位を意味する。 「マイクロカプセル」または「極微粒子」という用語は、活性剤（この場合に は遺伝的物質）を溶液状もしくは結晶形態で含有する貯蔵型粒子または固体を意 味する。活性剤は、粒子のマトリックスとなるポリマー中に分散もしくは溶解さ せるか、または貯蔵のために外壁となるポリマー内に包含させる。 組成物−遺伝的物質 本発明は、外因性で、多くの場合はキメラ的な遺伝的構築物を動植物の細胞内 へ徐放させることに関する。通常、この種の遺伝子構築物には、タンパク質もし くは生産物を転写するためのコーディング領域と共に調節配列が含まれる。調節 領域は転写するのに十分なプロモーター配列および生産物の終結を示すターミネ ーター配列であってもよい。一般に、本発明による方法と組成物において有用な 核酸は組換え核酸または合成核酸である。本発明においては、ヨーロッパ特許出 願第２４８,５３１号公開明細書に開示されている癌やウイルス性の病気の抑制 のためのインターフェロン誘発機構は利用しない。 組成物−接合体（conjugates） 促進物質は核への取込みもしくは輸送または細胞内での核酸の発現を促進する 物質であって、次の群から選択される:糖タンパク質、リポタンパク質、核タン パク質、ペプチド、ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有 細胞リガンド、糖脂質、ペプチドグリカン、レクチン、脂肪酸、リン脂質、トリ グリセリド、ステロイドホルモン、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮ Ａ、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡおよび挿入剤。核酸の含有量は、カプセル化す るポリマーマトリックス成分（b）の重量に基づいて約０.０００１〜５０重量％ である。 好ましい態様においては、新しい遺伝情報を有する核酸は、遺伝子の発現が要 求される細胞型に高い特異性を有する細胞表面レセプターに結合するリガンドと 接合する。リガンドはいくつかの方法によってＤＮＡと結合させることができる 。レセプター仲介エンドサイトーシスによる遺伝子転移は、ＤＮＡ結合部分に共 有結合的に連結した細胞表面レセプターに対する結合性リガンドから成る２官能 性分子接合体を形成させることによっておこなわれる。このようなリガンドは、 特異的細胞に対して標的化されることができる。例えば、肝細胞を標的化するた めには、ガラクトース末端（アシアロー）糖タンパク質であるアシアロオロソム コイドリガンドをポリ−Ｌ−リシンと共有結合的に連結させる。この接合体はプ ラスミドと２:１のモル比で複合させる。アシアロ糖タンパク質は、肝細胞型に 特有の細胞表面アシアロ糖タンパク質レセプターによって認識される［ウーら、 Ｊ．Biol．Chem．、第２６２巻、第１６９８５頁〜第１６９８７頁（１９８８年 ）参照］。細胞表面レセプターが該リガンドを認識すると、ＤＮＡ結合領域と複 合化した外因性ＤＮＡは細胞内へ共輸送される。 別のＤＮＡ接合法は、ＤＮＡと複合化したポリカチオントランスフェリン接合 体を用いて遺伝子を細胞内へ導入する。代表的な複合体形成反応においては、ト ランスフェリン−ポリリシンまたはトランスフェリン−プロタミン接合体１０μ gをＨ2Ｏ２５０μＬに加えた溶液を、プラスミドＤＮＡ３μgを０.３Ｍ ＮaＣl 溶液２５０μＬに加えた溶液中に撹拌下で添加する。室温で３０分間経過後、複 合体が生成し、該複合体はマイクロカプセル化することができる。天然の鉄輸送 タンパク質であるトランスフェリンをＤＮＡ結合性のポリカチオンであるポリリ シンまたはプロタミンと結合させることによって、タンパク質接合体が形成され る。該タンパク質接合体は正常なトランスフエリンサイクルにおいて核酸と結合 し、該核酸をエンドサイトーシスによって細胞内へ輸送する［ワーグナー（Wagn er）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ．、第８７巻、第３４１０頁〜第３４ １４頁（１９９０年）参照］。マイクロカプセル化処理をしない場合には、リポ ソーム内へのエンドサイトーシスとリポソーム酵素であるプロテアーゼとヌクレ アーゼによってＤＮＡは加水分解されて破壊される。 本発明方法によれば、複合体を生分解性ポリマーマトリックス内にカプセル化 することによってＤＮＡと接合体が保護される。さらに、複合体をクロロキノン もしくはアデノウイルスと共にカプセル化することによってリソソームの破壊が 促進され、無傷のＤＮＡを細胞内の細胞質コンパートメント（compartment）内 へ放出させて核へ接近させることが可能となる。 ＤＮＡとリガンドとの非共有結合的な複合化は、塩基性Ｎ−アシル尿素部分が 形成される条件下において、タンパク質を水溶性カルボジイミド、即ちＮ−エチ ル−Ｎ';（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＣＤＩ）を用 いて修飾することによっておこなわれる。得られるＮ−アシル尿素タンパク質は ＤＮＡのホスホジエステル骨格と塩橋を形成する［ハケットら、Biochemical Ph armacology、第４０巻、第２５３頁〜第２６３頁（１９９０年）参照］。別の方 法としては、核酸の５'−末端の修飾によって、アルデヒド修飾タンパク質と結 合し得るヒドラジド中間体を形成させる方法が挙げられる［ゴシュ（Ghosh）ら 、Anal．Biochem．、第１７８巻、第４３頁〜第５１頁（１９８９年）参照］。 ３'−末端および／または５'−末端あるいは個々の核酸塩基の種々の化学的修 飾法がＤＮＡについておこなわれている。導入される化学的部分としては次の蛍 光性基が挙げられる:アクリジン誘導体;バトフェナントロリン−Ru（II）複合体 ;ダンシル、マンシル、アエダンス−ｄＵＴＰ。一般的には、これらの部分はチ オ結合もしくはアミノ結合を介して末端のヒドロキシル基もしくはホスフェート 基または特異的な塩基と結合する。ＤＮＡに結合されている他の分子としては挿 入 剤（例えば、アクリジン、フェナジウム）、光化学的に活性化された架橋剤（例 えば、ソラレン）もしくは切断剤（例えば、メチルポルフィリンＸXI）、アルキ ル化剤（例えば、クロロアルキルアミノアリール）、レドックス活性核酸切断基 （例えば、１０−Ｃｕ（II）−フェナントロリン）が挙げられる。 ビオチンで標識化したＤＮＡ末端は、細胞表面と核膜輸送タンパク質の認識を 可能にするアビジン−ビオチン複合体を介して抗体もしくは酵素と複合体を形成 し得る。この種の輸送分子はＤＮＡの取込みを促進する。 親油性部分、例えば、コレステロールや長鎖アルキル基は一般的には３'−末 端または５'−末端に結合する［レトシンガー（Letsinger）ら、ＰＮＡＳ、第８ ６巻、第６５５３頁（１９８９年）参照］。ＤＮＡ含有リポソームは、ＤＮＡ３ ０μgおよびＮ−［１−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリ メチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とジオレオイルホスファチジルエ タノールアミンを含有する無血清培地１００μＬを混合することによって調製さ れる［ナーベル（Nabel）ら、Science、第２４９巻、第１２８５頁〜第１２８８ 頁（１９９０年）参照］。このような親油性修飾によりＤＮＡの疎水性が増大し 、これによって細胞膜を通る取込みが促進される。 本発明方法によれば、ＤＮＡ接合体を生分解性ポリマーマトリックス内にマイ クロカプセル化することによって、複合体とその成分の保護および複合体の徐放 が可能となる。 方法−マイクロカプセル化 マトリックスポリマーの組成を調整することによって、薬剤の放出速度を予め 決定し、特定の用途に適合させることができる［ルイス（Lewis）、「薬剤輸送 系としとての生分解性ポリマー」（チャシン（Ｍ．Chasin）およびランガー（Ｒ ．Langer）編）、１９９０年参照］。遺伝的物質は、マトリックスの分解に伴い 長時間にわたって動物体内へ放出させて利用することができ、該マトリックスは 非露出遺伝子が効果をもたらす前に分解するのを防止する。本発明方法において 用いるポリマーは生分解性であるので、カプセル化された全ての遺伝的物質は動 物体内へ放 出させることができる。ヒトまたは動物の標的細胞は、レセプター仲介エンドサ イトーシスによって核酸−リガンド接合体を取込み、該核酸は核まで輸送され、 発現される。作用の持続時間はポリマー組成、ポリマー対薬剤比およびミクロス フェアのサイズを調整することによって制御される。 本発明によれば、選択されるミクロスフェアのタイプに応じて３０〜６０日か ら２５０日以上の期間にわたって作用の持続時間を変化できるという利点が得ら れる。この輸送系によれば、持続的に輸送される核酸含有製剤を用いることによ って新しい遺伝情報をヒトもしくは他の動物の体内へ導入し、永続的もしくは一 時的な遺伝子発現を促進し、および／または存在する細胞配列を破壊させること ができる。 本発明による組成物は、核酸を内包する生体適合性で生分解性のポリマーマト リックスを有する極微粒子（マイクロカプセル）であり、該極微粒子は常套法に よって調製される。この極微粒子は常套のいずれのタイプのものであってもよく 、他の薬学的に有効な成分、例えば、抗生物質、ワクチンおよび／または他の常 套の添加剤を含有していてもよい。本発明による製剤は、極微粒子マトリックス 中に分散された核酸を含有する。 本発明によるマイクロカプセルの好ましい構造は次の米国特許の明細書に記載 されている:第４,３８９,３３０号、第４,９１９,９２９号および第４,５３０, ８４０号。本発明によるマイクロカプセルはポリマー、好ましくは脂肪族ポリエ ステル、例えば、乳酸もしくはグリコール酸のホモポリマーもしくはコポリマー から形成される。他の分解性ポリマー、例えば、ポリカプロラクトン、ポリジオ キソネン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物および天然のポリマー（アルブミ ン、カゼインおよびワックス等を含む）等を用いてもよい。極微粒子に配合され る核酸の量は、通常、ポリマーに対して０.００００５〜７５重量％、好ましく は０.０００１〜５０重量％である。 「重量％」は、ポリマーの重量部に対する核酸の重量部の百分率を意味する。 例えば、１０重量％は、ポリマー９０重量部あたり核酸を１０重量部配合する場 合 を意味する。 本発明において用いる極微粒子のポリマーマトリックス材料は生体適合性で生 分解性のポリマー物質でなければならない。適当なポリマーマトリックス材料と しては次のものが例示される:ポリ−d,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコ ール酸、混合d,Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール 酸とのコポリマー、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カ プロラクトン）、ポリ（グリコール酸−カプロラクトン）、カゼイン、アルブミ ンおよびワックス。 ポリマーマトリックス材料の分子量はかなり重要である。この分子量（ＭＷ） は、満足すべきポリマー皮膜を形成するのに十分な値にすべきである。即ち、該 ポリマーの分子量は、ポリマーが良好な皮膜形成剤になるのに適切な値にすべき である。通常、満足すべき分子量は５０００ダルトン以上である。種々の皮膜形 成性ポリマーコンパウンドの分子量は既知の方法によって容易に決定される。ポ リマーの分子量は分解速度においても、組成、純度および光学的形態等と共に、 重要な役割を果たす。一般に、ＭＷが大きければ大きいほど、分解速度は遅くな る。約５０００〜５０００００の平均分子量が好ましい。 核酸はポリマーマトリックスを通る浸出（leaching）によって極微粒子から放 出される。この場合、核酸はポリマーが著しく分解する前またはポリマーの分解 と同時に放出される。ポリマー材料を適当な選択することによって、２段階の放 出特性を示す極微粒子製剤を調製することができる。ポリマーの選択と核酸／ポ リマー比の調整は多段階放出パターンを得る場合に有用である。 本発明による極微粒子生成物は、注入用組成物に用いるのに許容される粒径１ μm〜５００μmの極微粒子を製造し得るいずれの方法によっても調製することが できる。一般に、マイクロカプセルの製造法は主要な調製原理によって次の４種 に分類される:（１）水性相と有機相の分離、溶融分散および噴霧乾燥の各工程 を含む相分離法、（２）界面重合、現場重合および化学蒸着の各工程を含む界面 反応法、（３）溶媒抽出法および（４）流動床噴霧コーティング、マルチオリフ ィスもし くはシングルオリフィスによる遠心コーティング、静電コーティングおよび物理 的蒸着の各工程を含む物理的方法。 好ましい製造法は米国特許第４,９１９,９２９号明細書に記載された方法であ る。相分離法は、この用語が意味するように、異なる溶解度特性に依存するもの であり、該溶解度特性に起因して、壁もしくは殻形成性マトリックス材料は溶液 もしくは分散液から分離し、微粒子状または小滴状の被カプセル化物質に沈着す る。この相分離自体は物理的な方法（例えば、非溶媒の添加または温度変化）ま たは化学的な方法（例えば、pＨの変化）によっておこなってもよい。 有機相の分離法（米国特許第４,９１９,９２９号明細書参照）においては、通 常は、溶液中に核酸を加えた分散液もしくはエマルションまたは高分子量ポリマ ーを有機溶媒に加えた分散液もしくはエマルションを用いる。この混合物に、高 分子量ポリマーを溶液から分離させて懸濁状治療剤を被覆した殻としての捕集を 可能にする非溶媒もしくは液状ポリマーを添加する。溶媒で膨潤した状態の殻は 、非溶媒をさらに添加することによって硬化させるか、または、殻を強化して遮 断性を改良する別の方法によって硬化させることにより、その核酸透過率と分解 速度によって放出を制御する。 一般的には、上記の有機相分離法においては、疎油性抗原の水性溶液もしくは 水性懸濁液を適当なマトリックスポリマーの非水性溶液に添加し、該混合物を撹 拌することによって油中水型エマルションを生成させる。薬剤は水に対する溶解 度に応じて、水性相中には０.１〜５０％の濃度で存在していてもよく、また、 全混合物中には０.１〜２０重量％の濃度で存在していてもよい。外部有機相は マトリックスポリマーを５〜１０％含有していてもよい。しかしながら、通常は 、内部相（水性溶液または懸濁液）中の薬剤対ポリマーの比は２:１〜１:４であ る。 水性相分離法（米国特許第４，９１９，９２９号明細書参照）においては、ポ リマーの水性溶液もしくは分散液中に水不溶性治療剤を加えた分散液もしくはエ マルションを用いる。ポリマーはゲル粒子として分離し、該ゲル粒子は治療剤の 外側に沈着して殻を形成する。該殻が硬化して極微粒子が分離する。水性相分離 法の なかで最も一般的な方法であるコアセルベーション法（米国特許第４,９１９,９ ２９号明細書参照）においては、粒子状または小滴状であってもよい水溶性治療 剤を、通常は、水中でイオン化される親水性コロイドの水性ゾル中に分散させ、 反対電荷を有する第二のゾルを添加し、該混合物を水による希釈、塩の添加、p Ｈの調整、温度変化またはこれらのいずれかの組合せ処理に付すことによってゲ ルを生成させる。コアセルベーションの適当な条件は、当業者によれば常套の試 行によって容易に決定することができる。何故ならば、種々の有用なポリマーは 入手源や分離法もしくは調製法によって、物理的特性および化学的特性の点でか なり相違するからである。コアセルベーションの範囲は、２種のポリマーの溶液 もしくはゾルの濃度、温度およびpＨを変化させ、ゲル化に必要な条件を求める ことによって決定される。これらの測定結果から、所定の温度とpＨにおける相 溶性の領域とコアセルベーションの範囲を示す三相図を作成する。この三相図に よれば、ゲル化に対する濃度、温度およびpＨの影響が明らかになる。 極微粒子の各々の調製法においては、注意深い条件設定が必要であり、カプセ ル化される物質の種類に応じてある程度異なる条件が要求される。例えば、撹拌 の度合は、エマルション小滴のサイズに影響を及ぼす。撹拌速度が高くなると該 小滴のサイズは小さくなる。小滴の表面特性に関しては、小滴の外側にマトリッ クス材料を確実に沈着させてマイクロカプセル化に関与しない粒子の生成を最小 限にするために手順を変更させてもよい。希釈工程で添加する水の量は臨界的な ものではないが、一般的には、比較的大きな小滴をカプセル化する場合に安定な エマルションを維持するためには比較的多量の水が必要となる。 上記の相分離法は別の調製法、即ち、核酸の安定なエマルションもしくは懸濁 液を生成させる最初の工程をマトリックス材料溶液中に核酸を分散させることに よっておこなう調製法に適合させてもよい。該エマルションを非溶媒中へ撹拌下 で添加することによってポリマー被覆材料を沈殿させることによって極微粒子を 形成させる。 別のタイプの相分離法は溶融分散マイクロカプセル化法である（米国特許第４ , ９１９,９２９号明細書参照）。熱融解性のワックス状被覆材、好ましくは低融 点ワックス、例えば、グリセロールジステアレート等を、該ワックスと核酸が識 別し得るほどには溶解しないシリコーン油もしくはフルオロカーボンのような不 活性液体中に懸濁させる。該混合物を激しく撹拌しながら加熱することによって 、ワックスを溶融乳化させる。核酸は粉末化し、所望の範囲のサイズに選別し、 次いでワックス状被覆材を高剪断撹拌によって分散させる。溶融ワックスは核酸 を被覆することによって、ワックス状液体で被覆された極微粒子を形成する。生 成した極微粒子は撹拌の続行による冷却によって固化する。固化した極微粒子は 濾取した後、前述のようにして乾燥する。 他のマイクロカプセル形成法は界面マイクロカプセル化法である（米国特許第 ４,９１９,９２９号明細書参照）。この方法は、２種の反応物を反応界面へ一緒 に導き、該反応界面において該反応物（通常はモノマー）の重縮合をおこなわせ 、不溶性のポリマー薄膜を形成させる。このカプセル化法において該反応界面を 形成させる一つの方法は、縮合ポリマーを形成する一方の反応物と核酸を、第二 の反応物含有連続相中へ分散もしくは乳化させる方法である。 さらに別のマイクロカプセル化法は溶媒抽出法である（米国特許第４,９１９, ９２９号明細書参照）。この方法においては、適当な溶媒中にポリマーマトリッ クス材料を溶解させた溶液中に所望の核酸を添加する。核酸はポリマー材料用溶 媒に可溶性であってもよく、あるいは不溶性であってもよい。所望により、該溶 媒中に添加することによって第二の媒体中に溶解もしくは分散させてもよい。 この溶媒中の混合成分は連続相加工媒体中に乳化させる（該加工媒体は、該成 分含有微小滴の分散液が連続相媒体中に形成されるような媒体である）。この連 続相加工媒体（通常は、水である）および有機溶媒は非混和性でなければならな い。非水性媒体、例えば、キシレン、トルエン、合成油および天然油を連続相加 工媒体として使用してもよい。通常は、界面活性剤を連続相加工媒体中に添加す ることによって、極微粒子の凝集を防止すると共に、エマルション中の溶媒微小 滴のサイズを制御する。好ましい界面活性剤分散媒体は、ポリ（ビニルアルコー ル）を 水中に１〜１０重量％分散させた混合物である。この分散液は該混合物を機械的 に撹拌することによって調製される。エマルションはまた、活性剤と壁形成物質 を含有する溶液の小滴を連続相加工媒体中に添加することによって形成させても よい。エマルション調製時の温度は特に臨界的ではないが、極微粒子のサイズと 質および連続相中の薬剤の溶解度に影響を及ぼす。もちろん、連続相中の核酸は 出来るだけ小さくするのが望ましい。該温度は、溶媒もしくは加工媒体が加工中 に過度に高い粘性を帯びるか、または固化するほどの低温であってはならず、ま た、媒体が過度に蒸発するか、もしくは核酸が分解するほどの高温であってはな らない。従って、分散加工は安定な操作条件が維持されるいずれかの温度、好ま しくは、選択される薬剤や賦形剤の種類に応じて、約３０〜６０℃の温度でおこ なう。 溶媒抽出によって形成される分散液は安定なエマルションである。この分散液 から、有機溶媒と非混和性の液体は、溶媒除去工程の第一段階において部分的に 除去される。溶媒は周知の方法、例えば、加熱法、減圧法またはこれらの併用に よって容易に除去することができる。微小滴から溶媒を蒸発させる温度は臨界的 ではないが、核酸を分解させるような高温にすべきではなく、また、溶媒の蒸発 速度が壁形成材中に欠陥がもたらされるほど高くならないような温度にすべきで ある。一般的には、最初の溶媒除去段階においては、溶媒の５〜７５％、好まし くは１〜２５％が除去される。 最初の溶媒除去段階の後、溶媒に非混和性の液状媒体中に分散された極微粒子 は、常套のいずれかの分離手段によって該液状媒体から分離させる。例えば、液 状媒体は極微粒子からデカンテーションによって分離させてもよく、あるいは、 極微粒子の分散液を濾過処理に付してもよい。所望により、常套の分離法を適宜 併用してもよい。 連続加工媒体からマイクロカプセルを分離させた後、マイクロカプセルに含ま れる残存溶媒は抽出によって除去する。この第二の溶媒除去段階においては、最 初の溶媒除去段階において用いた媒体と同じ連続相加工媒体（該媒体には界面活 性剤を添加してもよい）または別の液状媒体中に懸濁させる。抽出媒体はマイク ロカプセルから残存溶媒を除去するが、マイクロカプセルは溶解させない。抽出 過程においては、溶解した溶媒を含有する抽出媒体を除去し、新鮮な抽出溶媒で 取り替えなければならない。この操作は連続的におこなうのが最良である。所定 の工程における抽出媒体の適当な置換速度は当業者によって容易に決定される。 極微粒子から大部分の溶媒を除去した後、マイクロカプセルは風乾させるか、あ るいは、常套の乾燥法、例えば、真空乾燥法または乾燥剤を用いる方法等によっ て乾燥させる。 さらにまた別のカプセル化法は物理的マイクロカプセル化法である（米国特許 第４,９１９,９２９号明細書参照）。物理的マイクロカプセル化法は、所定物質 の粒子もしくは小滴を、共軸的もしくは逐次的に配設されたオリフィスを有する 装置内において、被覆材料の溶融物もしくは溶液としての液状フィルムで連続的 に被覆することによって特徴付けられる。液状被覆物は標準的な冷却法または溶 媒蒸発法によって硬化される。 液状または固体状の芯材を液状マトリックス材中を通過させる工程を含むマイ クロカプセル化法は物理的マイクロカプセル化法に包含される。芯材の流れは適 当な手段によって分断させて液体で被覆された小滴もしくは粒子を形成させ、得 られた被覆粒子を冷却処理またはその他の処理に付すことによって該粒子の壁材 を固化させる。例えば、被カプセル化物質の水溶液を溶融グリセロールジステア レートの流れの中へ急激に吸い出させ、この混合物を微細なノズルを通して押出 す。ノズルから出現する液状の流れは小滴に分断される（各々の小滴は、液状ワ ックスによって被覆された水性のコアから成る）。これらの小滴が空気中を落下 すると、殻が冷却固化して極微粒子が得られる。この方法の変形法においては、 回転部材によって遠心力を発生させ、芯材を該遠心力によって殻形成性液体中へ 吐出させる。 上述のマイクロカプセル化法およびその他のマイクロカプセル化法の多くの変 形法を利用してもよい。当業者には明らかなように、全ての被カプセル化物質に 適用できる特定の方法および一組の設定条件はなく、特定の核酸を用いて所望の 結果を得るための最適な条件と有効な方法は選択すべきである。水溶性核酸は相 分離法によってカプセル化される。脂質または有機溶媒に可溶性の核酸は溶媒抽 出法によってマイクロカプセル化される。 遺伝的物質含有極微粒子の好ましい調製法においては、相分離法により、ポリ マーマトリックス材を適当な有機溶媒に溶解させた溶液を調製する。この溶液に 、核酸を水に懸濁または溶解させた状態または微粒子状で添加する。ポリマーマ トリックス材に対する非溶媒を分散液に撹拌下でゆっくりと添加することによっ てポリマー材料を核酸の周囲にゆっくりと沈殿させ、極微粒子を形成させる。該 極微粒子は、ポリマーマトリックス材料に対する第二の非溶媒を添加することに よってさらに硬化させ、次いで、濾取した後、乾燥させる。 本発明による極微粒子状生成物は一般的には球状粒子であるが、不ぞろいな形 態を有する粒子であってもよい。極微粒子のサイズは、粒径がサブミクロン〜ミ リメーターの範囲にわたって変化させることができるが、標準的な規格の注射針 または他の常套法によって投与する核酸製剤の場合には、粒径が１〜５００μm のものが好ましい。本発明の別の態様においては、マトリックス材を含有する有 形ヌクレオチド物質は、極微粒子以外の形態、例えば、ロッド（rod）、ウェフ ァー（wafer）、矩形状フィルムまたはブロック等の形態を有していてもよい。 いずれの場合にも、核酸物質はマトリックス材全体に分布させる。マトリックス 材中に分散させる核酸の量は、マトリックス材中に包含される核酸が長時間にわ たって放出されたとき、所望の治療反応が誘発されるのに十分な量である。これ らの有形物は被処置動物の皮下へ移植するのに特に適している。 動物に対する核酸の投与量は被処置動物の種類、標的遺伝子配列、病気、処置 時間、動物の年令および所望の処置の程度等によって左右される。 被処置動物もしくは動物群への投与に先立って、極微粒子は薬学的に許容され る液状ビヒクル中に分散させ、該分散液を動物の所望の部位へ注入する。 サイズまたは種類の異なる極微粒子を適宜混合することによって、核酸を動物 に多段階的に供給するか、および／または異種核酸を異なる時点で動物に供給す るか、もしくは核酸混合物を動物に同時に供給することができる。動物に一般的 に投与される他の生物学的活性剤を核酸製剤と適宜混合してもよい。例えば、マ イクロカプセル形態または常套の非カプセル形態の抗生物質、駆虫剤、ワクチン またはいずれかの所望の活性剤等を核酸と適宜混合した後、本発明方法によって 動物に投与してもよい。 方法−供給 好ましい態様においては、核酸を包含するマイクロカプセルを、該マイクロカ プセルが活性遺伝子を動物体内で連続的または間欠的に放出するように、一回で ヒトもしくは他の動物に投与し、これによって反復的注入は不要となる。マイク ロカプセル化された遺伝子は、注入、移植または直接的衝撃によって動物へ供給 することができる。これらの方法により、遺伝子を生きた動物へ直接的に導入す ることができる。好ましい方法においては、遺伝子とそのプロモーターおよび金 、タングステン、白金、フェライト、ポリスチレンまたはラテックスの粒子を内 包するマイクロカプセルは組織内への衝撃によって供給される。粒子衝撃法は米 国特許第４,９４５,０５０号明細書に開示されている。しかしながら、本発明は 粒子衝撃法には限定されない。この種の極微粒子の供給は種々の方法、例えば、 直接的な注入法、レセプター仲介エンドサイトーシス、粒子衝撃法、皮下もしく は筋肉内への移植法または経口投与法等によっておこなうことができる。 用 途 本発明は、動物、植物および微生物の細胞の遺伝的形質転換並びに合成もしく は天然の核酸の輸送による新しい遺伝的物質の導入と核酸含有生分解性ポリマー 極微粒子の徐放による遺伝子発現の改変に関する。本発明は広範囲の用途を有し ており、例えば、動植物の品種改良、病気の診断と処置およびタンパク質の生産 等において有用である。核酸と共にカプセル化した化合物は外来遺伝子の発現、 遺伝子療法および遺伝子活性の抑制に用いることができる。この技法が適用でき る用途を以下に例示する。 １．ヒトの遺伝子療法 筋ジストロフィーは、カプセル化したジストロフィン遺伝子を筋膜下の筋組織 内へ移植することによって治療することができる。遺伝子の取込みは、遺伝子を 筋小胞体または筋切断端を通して輸送することによっておこなわれる。カプセル 化遺伝子の直接的な注入もしくは衝撃によって、筋肉細胞内への遺伝子の取込み を促進することができる。外因性の欠損遺伝子のノックアウトによって、新たに 発現される遺伝子の効果を改善することができる。取込みは、マイクロカプセル 化した遺伝子に結合したリガンドを用いておこなわれる。 ２．癌の治療 転移性癌の治療は、シトキンに対する遺伝子または癌細胞を死滅させる遺伝子 を挿入することによっておこなわれる。リンパ細胞に湿潤する腫瘍内への遺伝子 の直接挿入法は完成されている｛フィッツパトリック−マクエリゴット、Ｂio／ Ｔech．、第１０巻、第１０３６頁〜第１０４０頁（１９９２年）参照］。プロ モーター／レギュレーターのエンハンサー領域とコーディング領域を有するカプ セル化遺伝子構築物は中実腫瘍（solid tumor）内へ挿入される。シトキン遺伝 子を受容し、リンパ細胞を湿潤する腫瘍（ＴＩＬ）細胞は別の転移性部位へ循環 する。細胞内で生産されるタンパク質は、この部位の癌細胞を冒す。培養物（cu lture）内へ遺伝子を挿入し、増殖した細胞を体内へ再注入する。カプセル化に よって遺伝子の分解は防止される。 ３．形質転換動物の生産 動物の体内へ新たな遺伝情報を導入することによって、外来タンパク質または 変性天然タンパク質を発現させることができる。形質転換した飼育動物の従来の 生産法に比べて、この方法によれば重要な利点が得られる。乳腺に特異的なプロ モーターによって誘導される組換えタンパク質をコードする遺伝子を、妊娠した 雌牛の生体内へこの方法によって注入する。この遺伝子は発育性上皮細胞内に取 り込まれ、授乳期間中に発現する。この処置期間はわずかに数週間であるが、常 套の形質転換法によって雌牛の体内で組換えタンパク質を発現させるためには最 低３０カ月は必要である。 ４．遺伝的免疫処置 以下の実施例は、抗原応答を誘発する外来タンパク質を発現させるために、生 きた動物の体内へ遺伝子を挿入する新規な方法（生体内法）を例証する。ＨＩＶ ウイルスに対するコートタンパク質用プロモーター配列／カプセル化遺伝子は、 実際のウイルスを用いることなく、ウイルスの抗原性部分の生産を可能にする細 胞内へ挿入することができる。これによって、レトロウイルスが複製される危険 性が除去される。レトロウイルスベクターがかなりの危険性を有することがいく つかの文献において報告されている。この種のベクターは組換え不全ウイルスか ら成るが、再活性化されて感染をもたらすことができる［テミン（Temin）、Hum an Gene Therapy、第１巻、第１１１頁〜第１２３頁（１９９０年）参照］。 レトロウイルスベクターは潜在的な問題（発癌性および発病性）およびベクター の繁殖に用いることができるヘルパー配列による相同組換えを有する。この改良 により、応答能のある感染ウイルスから免れることができる。 ５．遺伝的免疫処置 アクチンプロモーターによって誘導されるＢ型肝炎ウイルス用配列を有するＤ ＮＡは相分離法によってマイクロカプセル化される。充填率がそれそれ５％およ び１％の１gバッチおよび２.５gバッチにおいて、ポリラクチドとポリグリコリ ド（ＰＬＧＡ）（６５:３５）の混合物を用いて、プラスミドＤＮＡ２５mgをカ プセル化する。ミクロスフェア製剤をニワトリの胸部の筋肉内へ注入する。１週 間後、２週間後、４週間後および８週間後において、採血し、抗−ＨＢＶ抗体の タイターを決定する。ＨＢＶＳＡに対する細胞仲介免疫反応を、マクロファージ と抗原の存在下で剌激されたニワトリＷＢＣからのリンフォカイン分泌物の分析 によって評価する。 ６．相同組換えによる遺伝子ノックアウト 代謝の先天性エラーの原因となる欠陥細胞遺伝子の代替遺伝子をコードするＤ ＮＡ構築物を、相同組換えによる組込みのために処理する。該構築物を、欠陥遺 伝子が発現する細胞内へ取り込まれるリガンドと接合させる。該接合体をマイク ロカプセル化した後、患者の体内へ注入することによって、標的細胞内へ取り込 まれて欠陥遺伝子をノックアウトしてエラーのない配列で代替させるのに十分な 新規遺伝子のコピーを形成させる。ノックアウト／代替療法の適用例はＡ型血友 病の治療である。Ａ型血友病は、血液凝固因子VIII遺伝子の欠陥によってもたら されるＸ染色体に関連する血液凝固疾患である。新たな因子VIII遺伝子は、マイ クロカプセル化した因子VIII遺伝子／アシアログリコプロテイン接合体i.p.の注 入による欠陥配列の代替に利用し得る。この場合、該遺伝子は門脈循環によって 吸収され、肝臓へ輸送された後、組み換えられて発現する。 実施例 以下、本発明を実施例によって説明するが、これらの実施例は例示的なもので あって、本発明を限定するものではない。 この明細書で用いる単位の意義は次の通りである: 「sec」:秒、「min」:分、「h」:時、「d」:日、「mL」:ミリリットルおよび「g 」:グラム。 実施例１ 生分解性ポリマーを用いるプラスミドＤＮＡのマイクロカプセル化 以下の３つの実施例においては、相分離法によってマイクロカプセル化したプ ラスミドＤＮＡとタングステンマイクロキャリア粒子を使用した。これらの実施 例においては次の２種のプラスミドを用いた。 （１）pＭＨ４０［イー・アイ・デュポン・ドゥ・ネムール・アンド・カンパ ニー（E．I．du Pond de Nemours and Company）製農芸用品；ウィルミン トン、デラウェアナ州］;該プラスミドは７.３キロベースの長さを有し、ＳＶ− ４０ウイルス３'スライス部位を有するカリフラワーのモザイクウイルスプロモ ーターによって誘導されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含有する。 （２）pＲＣ／ＣＭＶ／β−gal［インビトロゲン社（InVitrogen）製プラスミ ド; サンディエゴ、カリフォルニア州］;該プラスミドは１１.６キロベースの長さを 有し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子および抗生物質カナマイシンとＧ４１８に対 する耐性を付与するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼIIに関するコーデ ィング領域を含有する。 遺伝子発現はシトメガロウイルスプロモーターによって誘導させた。いずれの プラスミドも完全ウイルス性ゲノムを有しておらず、また、非感染性である。 マイクロカプセル化のために、プラスミドpＭＨ−４０ＤＮＡ［１０mＭトリス （pＨ７.４）と１mＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）含有緩衝液５００μＬに５００μgまた は２０００μg添加した試料］またはプラスミドpＲＣ／ＣＭＶ／β-gal ＤＮＡ ［１０mＭトリス（（pＨ７.４）と１mＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）含有緩衝液５００μ Ｌに５００μg添加した試料］およびニシン***ＤＮＡ［ベーリンガー・マンハ イム社（Boehringer Mannheim）製;インディアナポリス、インディアナ州］の ＴＥ溶液（５０mg／mＬ）５００μＬを、６５℃の振盪型水浴内において３０min インキュベートすることによって混合を促進させた。 ラクチドとグリコリドのモノマー組成が６５:３５のカプセル化用生分解性ポ リマー（dl−ＰＬＧＡ）［メディソーブ・テクノロジーズ社（Medisorb Techno logies Ｉnc.）製;シンシナティ、オハイオ州］をねじ込キャップ付ガラス管（ ５０mＬ）内へ所定量入れ、酢酸エチル３１.７gに溶解させた。この溶液にＭ− １７タングステンマイクロキャリア［バイオラド社（Ｂiorad）製;リッチモンド 、カリフォルニア州］０.７５gを添加し、該内容物を激しく撹拌した後、０℃に 冷却した水ジャケット付反応容器（３００mＬ）内へ移した。該反応容器へ酢酸 エチルをさらに４３.７g添加した後、ＤＮＡ溶液１mＬを１ccシリンジと１８ゲ ージ針を用いてゆっくりと添加しながらプローブ音波処理をおこなった。この音 波処理は、テクマー社（Tekmar）製のＴＭ３７５型装置を用いておこなった。音 波処理を３０secおこなった後、流動度３６０で粘度１０００csのシリコーン油 ［ドウ・コーニング社（Dow Corning）製;イサカ、ニューヨーク州］７４gを２ minで添加し、この混合物を室温において、２.５リットルのヘプタン［ケムピュ ア社（Chempure） 製Ｍ１３８ＫＢＪＢ］中へ直ちに加えることによってクエンチ処理に付した。３ .５h後、固形分を０.２μmのフィルターを用いて捕集し、ヘプタンで洗浄した後 、真空オーブン内で少なくとも３dの間乾燥した。これらのマイクロスフェアは 湿気と３０℃以上の温度に対して過敏なため、４℃で乾燥保存した。 光学顕微鏡写真（図１）は、黒い矢印で示す蛍光標識化ＤＮＡがマイクロカプ セル化され得ることを示す。極微粒子に添加されたタングステンコアは白い矢印 で示す。走査型電子顕微鏡写真（図２）は、カプセル化後の極微粒子の粒径分布 が１〜２５０μmであることを示す。粒子の表面は滑らかで、相互付着した粒子 を有する。衝撃作用とスクリーンへの衝突によって、粒子はより小さな成分に分 解される。これらの結果から明らかなように、ＤＮＡは、細胞や組織へ挿入する のに有効なサイズのマイクロカプセル内に包含させることができる。高密度のタ ングステンコアは、粒子衝撃に必要な密度をもたらす。しかしながら、本発明は 粒子衝撃に限定されず、直接的な注入や移植用のサイズや形態の異なるものも調 製できる。 実施例２ マイクロカプセル化後のプラスミドＤＮＡの放出と同定 この実施例においては、マイクロカプセルからのＤＮＡの経時的放出について 説明する。マイクロカプセル５０mgをクロロホルムとイソアミルアルコールの２ ４:１混合溶媒５００μＬ中に溶解させることによってマイクロカプセル化ＤＮ Ａを回収し、直ちに該ＤＮＡを室温においてＴＥ緩衝液を用いて抽出した。水性 相中のＤＮＡを、−２０℃において１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（p Ｈ５.２）と２容量の１００％エタノールを添加することによって沈殿させた。 回収されたＤＮＡの完全性（integrity）を臭化エチジウム／アガロースゲルを 用いる電気泳動法によって分析し、ＵＶ照射によって可視化した。この方法によ ってマイクロスフェアから回収されたプラスミドＤＮＡの同一性は、制限エンド ヌクレアーゼＥco Ｒ１を用いる消化によって確認した。プラスミドＤＮＡ（１ ０μg）を、Ｅco Ｒ１ ２０ユニットを用いる３７℃での切断処理に一夜付した 。プラスミド pＭＨ４０は、臭化エチジウムで染色した０.７％アガロースゲルを用いて分析し 、写真撮影した。Ｅco Ｒ１を用いてpＭＨ４０を切断することによって、予想さ れた長さ（３.３キロベースおよび４.０キロベース）の２種のフラグメントが得 られた。プラスミドpＲＣ／ＣＭＶ／β−galは２つのＥco Ｒ１制限部位と１つ のＢam ＨＩ部位を有する。プラスミドＤＮＡ（１０μg）を、Ｅco Ｒ１または Ｂam ＨＩ５０ユニットを用いる３７℃での切断処理に一夜付した。消化後、切 断されたＤＮＡを、臭化エチジウムを用いて染色した０.７％アガロースゲルを 用いて分析し、写真撮影した。該ＤＮＡをＥco Ｒ１で切断することによって予 想された長さを有する２種のフラグメントが得られたが、Ｂam ＨＩを用いて切 断することによって１種の制限フラグメントが得られた。 ＤＮＡの生体外での徐放について分析した。バッチ２３３のマイクロスフェア ５０mgまたはモノマー組成が６５:３５の前記ポリマー製の非充填マイクロスフ ェア（対照）をＴＥ緩衝液２５mＬに懸濁させ、振盪型水浴中において３７℃で インキュベートした。１h、３h、６h、２４h、４８hおよび７２h経過後に試料（ ５００μＬ）を採取し、貯留し、１／１０容量の酢酸ナトリウム（pＨ５.２）の 添加によって沈殿物を生成させ、該沈澱物を−２０℃で凍結させた。沈殿したＤ ＮＡは、４℃で２０００gの条件下での遠心分離処理に２０min付すことによって ペレット化した後、−２０℃の７０％エタノールを用いて洗浄して残存塩を除去 し、次いで、ＤＮＡスピードバク（Speedvac）内で１０min乾燥した。該ペレッ トはＴＥ緩衝液中に再懸濁させた後、ＵＶ分光測定法によって定量した。生体外 での溶解分析によって回収されたpＭＨ４０含有ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応 によって分析した。ＤＮＡを３'および５'プライマー、アンプリタク（Amplitaq ）［パーキン−エルマー社（Perkin−Elmer）製;シータス、ノーウォーク、カリ フォルニア州］２.５ユニット、並びに緩衝液［１０mＭトリス（pＨ８.３）、５ ０mＭ ＫＣlおよび２mＭ ＭgＣl2含有緩衝液］中にdＮＴＰsを２mＭ含有する溶 液と混合した後、４８０型ＤＮＡサーマルサイクラー（thermal cycler）（パ ーキン−エルマー社製）を用いる１０回、１５回、２０回および２５回のＰＣＲ サイクルに付した。単サ イクルは９４℃で１minの処理、４２℃で１minの処理および７４℃で３minの処 理から成る。ＰＣＲで増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法と臭化エチジ ウム染色法によって分析したところ、単一の６２５bpＤＮＡフラグメントが増幅 され、ＤＮＡが経時的に放出されたことが判明した（図３参照）。以上の結果か ら明らかなように、マイクロカプセル化と放出過程においてＤＮＡの同一性は完 全に保持された。 実施例３ カプセル化ＤＮＡを供給した植物細胞内での遺伝子発現 粒径０.５μmのタングステンコアと共にマイクロカプセル化したＤＮＡを組織 内へ衝突させた。ＤＮＡはニシンの***ＤＮＡ７５％とβ−グルクロニダーゼプ ラスミド（pＭＨ４０）２５％から成る。タングステンとＤＮＡを包含するマイ クロスフェア（５mg）を、氷冷した７０％エタノール０.０７５mＬへの懸濁と氷 上での音波処理によって調製した。前述のようにして、pＭＨ４０ ＤＮＡを１ μg／μＬに希釈することによって、粒径１.０μmのタングステンマイクロキャ リア上に沈澱させた。この操作は、簡単に言えば次の通りである。マイクロキャ リア６０mgを１００％エタノール１mＬで洗浄し、音波処理に３０sec付し、１２ ０００gでの遠心分離処理に付し、殺菌蒸留水１mLで洗浄し、さらに音波処理に 付した後、遠心分離処理に付した。上澄み液をデカントした後、殺菌蒸留水０. ５mＬをマイクロキャリアに添加した。マイクロキャリア懸濁液２５μＬを殺菌 処理した別のマイクロ遠心分離管（１.５mＬ）内へ移し、これにpＭＨ４０プラ スミドＤＮＡのＴＥ溶液１０μＬ、２.５Ｍ ＣaＣl2２５μＬおよび０.１Ｍス ペルミジン［シグマ社（Sigma）製；セントルイス、ミズリー州］１０μＬを渦 状攪拌下で添加した。室温で１０minインキュベートした後、沈澱したＤＮＡを 含むマイクロキャリアを１００００gの条件下での遠心分離に２min付すことによ ってペレット化し、上澄み液を除去した。該ペレットを１００％エタノール０. ２５mＬに再懸濁させ、音波処理に短時間付し、さらに１００００gの条件下での 遠心分離処理に付してペレット化し、該ペレットを１００％エタノール６０μＬ 中に再懸濁させた。 カリフラワーの茎への衝撃は、調製した粒子１５μＬをカプトンのマクロキャ リアディスク（Kapton macrocarrier disc）上へ塗布してエタノールを蒸発させ ることによって実施した。衝撃は、バイオリスティックＰＤＳ−１０００−ＨＥ 粒子供給系（Biolistic ＰＤＳ−１０００−ＨＥ particle delivery system） ［バイオラド社製；ヘラクレス、カリフォルニア州］を使用し、２７インチＨg の減圧下、２０００p.s.i.の破壊ディスク圧の条件下でおこなった。 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子発現は衝撃処理したカリフラワーの組 織内で分析した。該組織は、照射下において室温で１８hインキュベートし、次 いで、暗闇で６hインキュベートした後、３７℃の暗闇で２４hの染色処理に付し た。バイオシンス社（Biosynth）（スタード、スイス）製のアッセイ溶液［０. １nＭ Ｎa2ＨＰＯ4（pＨ７.０）、０.５mＭ Ｋ3Ｆe（ＣＮ）6、０.５mＭ Ｋ4 Ｆe（ＣＮ）6・３Ｈ2Ｏ、１０mＭ Ｎa2ＥＤＴＡおよび０.５mg／mＬ Ｘ−glu ナトリウム塩を含有する溶液］を使用した。 この結果によれば、カリフラワー組織内での移植遺伝子（transgene）の活性 発現は、マイクロカプセル化したＤＮＡを用いた衝撃処理から４日後に認められ た（図４参照）。このマイクロカプセルはβ−グルクロニダーゼ標識遺伝子を含 有した。衝撃処理をおこなわないか、またはＤＮＡを用いない衝撃処理をおこな った組織片（対照）は青色の染色反応を示さなかった。従って、カプセル化した 外因性遺伝子は植物細胞内へ供給されて組織の遅延した形質転換をもたらしたこ とになる。即ち、植物における遺伝子発現は、完全なカリフラワーに挿入された リポーター遺伝子β−グルクロニダーゼの徐放を利用することによって例証され た。 実施例４ マイクロカプセル化遺伝子を用いる動物細胞内での安定な遺伝子発現 プラスミドpＲＣ／ＣＭＶ／β−galとタングステンマイクロキャリア粒子を相 分離法によってマイクロカプセル化した。マイクロカプセル化の条件は、下記の 点以外は、実施例１に詳述した条件と同様である。１０mＭ トリス（pＨ７.４ ）５００μＬにＤＮＡ５００μgを添加した。反応容器内へ酢酸エチル４４.４g を添 加し、また、シリコーン油は７４gではなく、６７.９g添加した。衝撃処理のた めに、前述のようにして、pＲＣ／ＣＭＶ／β−gal ＤＮＡを１μg／μＬの濃 度に希釈し、粒径１.０μmのタングステンマイクロキャリア上に沈澱させた。こ の処理を略述すれば次の通りである。マイクロキャリア６０mgの１００％エタノ ール１mＬで洗浄し、３０secの音波処理に付し、１２０００gの条件下での遠心 分離処理に付した後、殺菌蒸留水１mＬで洗浄した。上澄み液をデカントした後 、殺菌蒸留水０.５mＬを添加した。次いで、マイクロキャリア懸濁液２５μＬを 別のマイクロ遠心分離管（１.５mＬ）内へ移し、これに渦流状の攪拌下において 、pＭＨ４０プラスミドＤＮＡのＴＥ溶液１０μＬ、２.５Ｍ ＣaＣl2溶液２５ μＬおよび０.１Ｍスペルミジン溶液（シグマ社製）１０μＬを添加した。４℃ で１０min保持した後、表面上にＤＮＡが沈澱したマイクロキャリアを１０００ ０gで２minの遠心分離処理にし、上澄み液を除去した。得られたペレットを１０ ０％エタノール０.２５mＬ中に再懸濁させ、短時間の音波処理に付した後、１０ ０００gの条件下での遠心分離処理に付して再びペレット化し、該ペレットを１ ００％エタノール６０μＬ中に再懸濁させた。 タングステンとＤＮＡを保有するマイクロスフェア（５mg）を、氷冷した７０ ％エタノール０.０７５mＬに懸濁させた後、氷上での音波処理に付した。融合性 ＣＨＯ細胞の衝撃処理は、上記のようにして調製した粒子１５μＬをカプトンの マイクロキャリアディスク上に塗布してエタノールを蒸発させた後でおこなった 。衝撃処理は、バイオリスティックＰＤＳ−１０００−ＨＥ粒子供給系（バイオ ラド社製）を使用し、１５インチＨgの減圧下、ガス圧１３５０p.s.i．の条件下 でおこなった。衝撃処理をおこなった後、細胞を培地内へ戻し、Ｇ−４１８抗体 を使用しない標準的な条件下において２日間増殖させ、次いで増殖細胞をＧ−４ １８含有培地内における選択処理に６〜８週間付した。Ｇ−４１８含有培地内で の増殖を６週間おこなった後、衝撃処理に付した培養物中には形質転換された細 胞の生きたコロニーが観察された（図５参照）。ニシンの***ＤＮＡとタングス テン微粒子のみを含有するマイクロカプセルを用いて衝撃処理をおこなった対照 培養 物には生きたコロニーは観察されなかった。以上の結果から明らかなように、マ イクロカプセル化した遺伝的物質を動物細胞内へ挿入すると、培養動物細胞を安 定に形質転換させることができる。 衝撃処理に付して選択したＣＨＯ細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を分 析した。β−ガラクトシダーゼ酵素活性を分析するための染色は、リン酸塩で緩 衝化した生理的食塩水（ＰＢＳ）中にグルタルアルデヒドを０.０５％含有する 溶液を入れたペトリ皿上で５min固定することによっておこない、固定液をＰＢ Ｓで３回すすぐことによって除去した後、細胞はＸ−gal溶液の添加によって染 色させ、次いで２〜６hインキュベートした。このＸ−gal溶液は１０mＭ ＮaＰ Ｏ4、３mＭ Ｋ3Ｆe（ＣＮ）6、３mＭ Ｋ4Ｆe（ＣＮ）6・３Ｈ2Ｏ、１Ｍ Ｍg ＳＯ4、１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＭgＣl2および０.２％ Ｘ−galから成る。 遺伝子の挿入を示す別の証拠は、β−ガラクトシダーゼ活性を分析するための染 色後に観察される青色の呈色である（図５参照）。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の組込みは、Ｇ−４１８耐性ＣＨＯ細胞クローン から精製したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した（図６参照）。クロー ン（図５参照）は、前述のようにしてバッチ２３１マイクロスフェアを用いる衝 撃処理に付した後、希釈し、Ｇ−４１８含有培地を保有する平底組織培養板の９ ６個のウェル内において３〜４週間平板培養して増大させることによって製造し た。ＤＮＡは、ストラタジーン（Stratagene）ＤＮＡ分離キットを用いて該クロ ーンから分離した。ＰＣＲは、１回の反応あたり２μgのクローンＤＮＡを用い て前記のようにしておこなった。これらの結果により、β−ガラクトシダーゼ遺 伝子がクローンのゲノムＤＮＡ内へ組み込まれたことが判明した（図６参照）。 実施例５ 接合体のカプセル化およびレセプター仲介エンドサイト−シスによる 遺伝子伝達 遺伝子伝達は、例えば、ＤＮＡに接合したポリリシン−アシアログリコプロテ インまたはトランスフェリン−ポリリシンを用いるレセプター仲介エンドサイト −シス経路によっておこなってもよい。この経路による遺伝子伝達法においては 、ＤＮＡ結合性部分に連結した細胞表面レセプターに対する同族部分から成る二 官能性分子接合体を使用した。しかしながら、一部の標的細胞の場合には、この 方法による遺伝子伝達は制限される。この制限は、種々の酵素（リソソーム酵素 、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ等）による分解に起因する。酵素分解からＤ ＮＡを効果的に保護するためには、接合体とそのＤＮＡのカプセル化がここでは 提案される。このカプセル化による１つの付加的な利点は、リソソームを分解す る選択された向リソソーム性剤（lysosomatropic agent）をマイクロカプセル内 へ包含させ得ることである。この種の向リソソーム性剤としてはクロロキン［ゼ ンケ（Zenke）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.、第８７巻、第３６５５頁〜第３６ ５９頁（１９９０年）参照］およびアデノウイルス［キュリエル（Curiel）ら、 Proc．Natl．Acad．Sci.、第８８巻、第８８５０頁〜第８８５４頁（１９９１年 ）参照］等が例示される。 トランスフェリン−ポリ（Ｌ−リシン）−ＤＮＡコンプレックスは、コテン（ Cotten）らの方法［Proc．Natl．Acad．Sci.、第８７巻、第４０３３頁〜第４０ ３７頁（１９９０年）参照］およびゼンケらの上記文献に記載の方法に従って調 製した。特異的連結反応は、トランスフェリンの炭水化物部分の修飾によってお こなった。ラウス肉腫ウイルス長期反復エンハンサー／プロモーターの制御下に おいてフォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼを含有するＤ ＮＡプラスミドpＲＳＶＬ［デウェット（DeWet）ら、Mol．Cell Biol.、第７巻 、第７２５頁〜第７３７頁（１９８７年）参照］をリポーター遺伝子として用い た。接合体−ＤＮＡコンプレックスは、pＲＳＶＬ ＤＮＡ６μgをＨＢＳ［１５ ０mＭ ＮaＣl／２０mＭ Ｈepes（pＨ７.３）］３５０μＬで希釈し、これに、 ＨＢＳ１５０μＬに希釈したhＴfpＬ１９０Ｂ １２μgを添加することによって 調製した。コンプレックスは室温で３０min保持することによって形成させた。 アデノウイルスd１３１２、即ち、Ｅla領域内で欠失された複製不全菌株［ジョ ーンズおよびシェンク、Proc．Natl．Acad．Sci.、第７６巻、第３６６５頁〜 第３６６９頁（１９７９年）参照］は、キューリエルらの文献［Proc．Natl．Ac ad．Sci.、第８８巻、第８８５０頁〜第８８５４頁（１９９１年）］に記載の方 法に従って調製した。クロロキンは１００μＭの濃度でマイクロカプセル内に包 含させることができた。 ＤＮＡ−接合体のマイクロカプセル化は、プラスミドpＲＳＶＬ−ルシフェラ ーゼＤＮＡ接合体５００μgを１０mＭトリス（pＨ７.４）５００μＬに希釈して 使用する以外は、実施例１に記載のようにしておこなった。アデノウイルスd１ ３１２またはクロロキン（１００μＭ）をカプセル化過程中に包含させることが できた。マイクロカプセル化したＤＮＡ−接合体の効果についての評価は、生体 外での細胞系、例えば、ヒトの白血病細胞系［コテンら、Proc．Natl．Acad．Sc i.、第８７巻、第４０３３頁〜第４０３７頁（１９９０年）参照］または確立さ れた条件下で増殖されたヒーラー細胞［キリエルら、Proc．Natl．Acad．Sci.、 第８８巻、第８８５０頁〜第８８５４頁（１９９１年）参照］についておこなう ことができた。マイクロカプセル化したＤＮＡ接合体を培養細胞に直接添加し、 ３７℃で４８hおよび７２hインキュベートした後、ルシフェラーゼ遺伝子発現の ために該細胞を収集した。これらの結果を、マイクロカプセル化しないＤＮＡ− 接合体を用いた遺伝子発現の結果と比較した。 ＤＮＡに接合させたポリリシン−アシアログリコプロテイン［ウーおよびウー 、J．Biol．Chem.、第２６３巻、第１４６２１頁〜第１４６２４頁（１９９８年 ）参照］を用いた生体内の肝臓細胞を標的化した。ＤＮＡ（pＳＶ２ ＣＡＴプ ラスミド）とポリリシン−アシアログリコプロテインの接合法はウーらの該文献 に記載の通りである。このＤＮＡ接合体は、ポリ−Ｌ−リシンをガラクトーゼ− 末端（アシアロ−）グリコプロテイン［アシアロオロソムコイド（ＡsＯＲ）］ に共有結合させることによって調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミド［ピアス化学社（Pierce Chem．Co.）製］を用い て、ポリ−Ｌ−リシン（シグマ社製）をＡsＯＲと２:１のモル比で結合させた［ ウーら、J．Biol．Chem.、第２６４巻、第１６９８５頁〜第１６９８７頁（１９ ８９年）参照］。Ｄ ＮＡとの複合体は、接合体とＤＮＡを２:１のモル比で結合させることによって 形成させた［ウーら、J．Biol．Chem.、第２６３巻、第１４６２１頁〜第１４６ ２４頁（１９８８）参照］。試料は２５℃で１hインキュベートした後、分子量 限界３５００の膜［スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社（Spectrum Medical Industries）製、カルフォルニア州］と０.１５Ｍの生理的食塩水を 用いる透析処理に２４h付した。透析後、全試料を０.２μm膜［ミリポア社（Mil lipore Corp.）製］を用いる濾過処理に付すことによって沈澱物を含まない複 合体を得た。 接合体のカプセル化は実施例１に記載のようにしておこなう。分子接合体と向 リソソーム性剤は相分離法により、ポリラクチドをポリグリコリドのコポリマー （ＰＬＧＡ）１g中にカプセル化した。６５％ポリ乳酸と３５％ポリグリコール 酸との混合物を含む生分解性ポリマー（dl−ＰＬＧＡ）［メジソーブ・テクノロ ジーズ社製；シンシナティ、オハイオ州］を５０mＬのねじ込キャップを有する ガラス管に所定量入れ、酢酸エチル３０gに溶解させ、０℃に冷却した水ジャケ ット具有反応容器（３００mL）内に移した。反応容器内へ酢酸エチルをさらに４ ５g添加し、この混合試料を、ＴＥ緩衝液［１０mＭトリス（pＨ７.４）、０.１m Ｍ ＥＤＴＡ］中に接合体２５mg含有するＤＮＡ溶液１mＬを１ccシリンジと１ ８ゲージ針を用いてゆっくりと添加しながら音波処理に付した（テクマー社製Ｔ Ｍ３７５型装置を使用）。音波処理を３０secおこなった後、ドウ・コーニング 社製シリコーン油（流動度３６０、粘度１０００cs）７５gを２minかけて添加し 、直ちに該混合物をヘプタン（ケムピュア社製、Ｍ１３８ ＫＢＪＳ）２.５Ｌ 中における攪拌下でのクエンチング処理（室温）に付した。３.５h後、固体状物 質を０.２μmフィルター上に収集し、ヘプタンで洗浄した後、真空下で少なくと も３d乾燥した。マイクロカプセルの粒径は１〜２５０μmであった。マイクロス フェアは湿気と３０℃以上の温度に対して極めて敏感なため、４℃で乾燥保存し た。 生体内での取込みは、カプセル化したpＳＶ２ ＣＡＴ ＤＮＡ １mgを殺菌 食塩水に加えた溶液をスプラグ・ドウリー（Sprague−Dawley）ラットの筋肉内 ま たは静脈内へ注射することによって調べた。ウーらの文献に記載の方法により、 組織試料のＣＡＴ活性を２４〜７２hにわたってモニターした［J．Biol．Chem. 、第２６４巻、第１６９８５頁〜第１６９８７頁（１９８９年）参照］。 ＤＮＡと接合体がマイクロカプセルによって保護されるため、上記の手順に従 えば、遺伝子発現が改良される。ＤＮＡの徐放により、遺伝子の伝達効果が長く 発揮され、遺伝子発現が長期間にわたっておこなわれる。 実施例６ カプセル化した接合化ＤＮＡを用いる鶏卵中での組換えタンパク質の生産 プラスミドＤＮＡをバクテリア中で増幅させ、精製後、制限エンドヌクレアー ゼを用いる酵素消化によって線状化した。オボアルブミンプロモーターにより誘 導されたヒト成長ホルモン（hＧＨ）をコードする遺伝子を有する線状プラスミ ドを、ハッケット（Huckett）らの方法［Biochem．Pharmacol.、第４０巻、第２ ５３頁〜第２６３頁（１９９０年）参照］に従い、ジスクシンイミジルスベレー トを用いる架橋によってニワトリのインスリンと接合させた。この分子接合体を 相分離法により、ポリラクチドとポリグリコリドコポリマー（ＰＬＧＡ）１g中 にカプセル化した。６５％ポリ乳酸と３５％ポリグリコール酸との混合物を含む 生分解性ポリマー（dl−ＰＬＧＡ）（メジソソープ・テクノロジーズ社製）を５ ０mＬのねじ込キャップを有するガラス管に所定量入れ、酢酸エチル３０gに溶解 させ、０℃に冷却した水ジャケット具有反応容器（３００mＬ）内に移した。反 応容器内へ酢酸エチルをさらに４５g添加し、この混合試料を、ＴＥ緩衝液［１ ０mＭトリス（pＨ７.４）、０.１mＭ ＥＤＴＡ］中に接合体２５mg含有するＤ ＮＡ溶液１mＭを１ccシリンジと１８ゲージ針を用いてゆっくりと添加しながら 音波処理に付した（テクマー社製、ＴＭ３７５型装置を使用した）。音波処理を ３０secおこなった後、ドウ・コーニング社製シリコーン油（流動度３６０、粘 度１０００cs）７５gを２minかけて添加し、直ちに該混合物をヘプタン（ケムピ ュア社製、Ｍ１３８ ＫＢＪＳ）２.５Ｌ中における攪拌下でのクエンチング処 理（室温）に付した。３.５h後、固体状物質を０.２μmフィルター上に収集し、 ヘプタンで洗浄した後、真空下で 少なくとも３d乾燥した。マイクロスフェアの粒径は１〜２５０μmであった。こ れらのマイクロスフェアは湿気と３０℃以上の温度に対して極めて敏感なため、 ４℃で乾燥保存した。 ＣＭＣ注射用ビヒクルに懸濁させたマイクロスフェア丸薬を、生後２５週間後 のレグホン種の産卵性雌鶏の腹膜内へ注射した後、各卵中の成長ホルモンの濃度 をＥＬＩＳＡによって測定した。接合されたプラスミド−インスリン複合体は腹 膜腔内へ放出され、卵管上皮細胞の基底表面へ輸送され、該細胞に取り込まれて hＧＨ遺伝子を発現させるものと考えられる。該ホルモンは卵管腔内へ分泌され 、鶏卵中に取り込まれる。 実施例７ 遺伝的免疫処置 外来抗原に対する免疫反応の発生には、通常は精製タンパク質を動物の体内へ 注入することが必要である。十分なタンパク質の分離は困難であり、時間浪費で ある。本発明によれば、カプセル化された遺伝子が注入法または粒子衝撃法によ って皮膚または筋肉内へ直接挿入される。この方法はユニークな予防接種法また は抗体生産法である。 ヒト成長ホルモン（hＧＨ）のマウス（ＩＣＲ種）への接種を、ヒトのβ−ア クチンプロモーター［リーヴィット（Leavitt）ら、Molec．Cell Biol.、第４ 巻、第１９６１頁〜第１９６９頁（１９８４年）参照］またはシトメグロウイル ス（ＣＭＶ）プロモーター［ボスハルト（Boshart）ら、Ce11、第４１巻、第５ ２１頁〜第５３０頁（１９８５年）参照］の転写調節下において、hＧＨ含有マ イクロカプセルを用いておこなった。粒子衝撃用マイクロカプセルには、濃密物 （好ましくは金またはタングステン）の不活性粒子をさらに含有させた。濃密物 粒子は運動量を高め、動物細胞内への侵入を可能とする。不活性粒子を用いるカ プセル化法は実施例１に記載の通りであるが、この実施例のカプセル化法は、h ＧＨ遺伝子とヒトβ−アクチンもしくはＣＭＶのプロモーターを用いる点で相違 する。マイクロカプセルは、手で保持できるタイプのバイオリスティック系を用 いて推進させた ［タング（Tang）ら、Nature、第３５６巻、第１５２頁〜第１５４頁（１９９２ 年）参照］。あるいは、hＧＨ遺伝子含有マイクロカプセルの丸薬をマウスのい くつかの部位の筋肉内へ直接注入した。 hＧＨに対する抗体の生産は、尾から採血した血清中の免疫沈降物（125Ｉ−標 識化hＧＨ）の容量を分析することによってモニターした。hＧＨに対する抗体の 量は、血清１μＬを125Ｉ−標識化hＧＨ（ＤuＰont−ＮＥＮ、８４〜８８μＣim Ｌ-1；１１３〜１１６μＣi mg-1）１μＬと共に室温で１hインキュベートする ことによって測定した。タンパク質Ａアガロースビーズ（ピアス社製）４μＬを 添加し、得られたスラリーを４℃で１２〜１８hインキュベートした。該ビーズ を遠心分離処理によってペレット化し、リン酸塩で緩衝化した生理的食塩水（Ｐ ＢＳ）で十分に洗浄した後、保持された計数／分（cpm）を測定した。測定値は 、血清１μＬあたりの沈澱したhＧＨの量（ng）に正規化した。遺伝的免疫処理 したマウスの血清中のhＧＨに対する抗体はウェスタンブロット分析法によって 検出した［タングら、Nature、第３５６巻、第１５２頁〜第１５４頁（１９９２ 年）参照］。 本発明は上述の特定の実施態様や実施例に限定されず、後述の請求の範囲に含 まれるこれらの実施態様等の全ての変形態様等が本発明に包含される。Detailed Description of the Invention           Conjugates that promote and target cell uptake and gene expression           Nucleic acid encapsulation                                Field of the invention   This invention is designed to allow proteins and antibodies to be incorporated into biodegradable, sustained-release polymer nanoparticles. Or nucleic acids conjugated or bound to other molecules (DNA, RNA, synthetic oligonucleotides Leotide or derivatives thereof). This invention is a genetic trait It also relates to the use of encapsulated genes for conversion.                                Background of the Invention   One of the rate-limiting steps in biotechnology is the inheritance of cells or tissues. This is the step of inserting the target substance. Depending on the method known so far, By promoting controlled uptake and integration of the genetic material of Therefore, there is no satisfactory means for effectively expressing exogenous genes.   Numerous studies have been conducted to improve the uptake of exogenous nucleic acids into specific cells There is. Several molecules and receptors that enable the uptake of nucleic acids into specific cells. Putter is known. For example, asialoglycoprotein is taken up by liver cells. Promotes entanglement [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, pp. 4429- P. 4432 (1987)], transferrin-polylysine adenowi Rus promotes uptake into epithelial cells [Curiel et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 8850 to 8854 (1991). ], And viral particles such as herpesvirus are transported into neutral cells []. Geller, et al., Science, Volume 241, pp. 1667-1669 (19 1988)]]. Antibodies that bind to specific cell ligands can also be taken up by specific cells and tissues. Promote crowding. In addition, liposomes with receptor ligands It has been used for intracellular delivery [Malone et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 6077-6081 (1989)]. . These preferred specific uptake molecules bind to specific cell surface receptors , Receptor -Mediated by the endocytic pathway.   Various methods of chemical modification to facilitate uptake of nucleic acids and subsequent expression by cells. Have been proposed for nucleic acids. According to Huckett et al. Shown [Biochem. Pharmacol. , 40, 253 to 263 (1 990)]]. That is, DAN is chemically modified by cross-linking to insulin. When bound non-covalently to bound albumin, the trimolecular complex forms an insulin receptor. Binding to HepG2 cells by a heptaprotein and then receptor-mediated endocytosis. After being taken up into the cell by torsis, it is transported into the nucleus where mRNA transcription and It is expressed in the form of protein translation. Recently, targeted uptake into specific regions of chromosomes Have been identified. Furthermore, DAN-binding proteins that promote transcription And other molecules are also known.   What is lacking in these methods is a means of protecting the above components from degradation. It The solution to this problem is not only to protect the component, but also to encapsulate the nucleic acid. It enables the sustained release of the ligand.   Gene transfer method   Known techniques for transporting genetic material into living cells include chemical uptake. Methods, physical infection methods including particle bombardment, retrovirus infection methods and particle bombardment. Some of these methods are capped as proposed herein. It can be improved by the use of cellized nucleic acids and conjugates. Plants, animals, Particle-mediated bombardment of DAN on microbial cells and live animals has been reported [ Fitzpatrick-McElligott, Bio / Tech nology) Volume 10, pp. 1036-1040 (1992), Klein (Kl Ein) et al., Bio / Technology, Vol. 10, 286-291 (1992). And Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88th Vol., Pp. 2726-2730 (1991)].   Currently known methods involve the permanent generation of unwanted genetic material in certain cases. It has the drawback of being incorporated into the breeding line. Field of retrovirus-mediated gene transfer When a gene is integrated into a cell of the germ line, as in The cell remains in the cell until death. Patients who do not require permanent gene replacement Cannot be treated by retroviral gene therapy. Other points are cheap Is all. Retroviruses are oncoviruses and are used by the general human population Things are inherently dangerous.   At present, the method of injecting protein is adopted for the treatment of some diseases. There is. The protein infusion method does not provide uniform efficacy and is potentially toxic immediately after infusion. Doses (subsequent doses are insufficient to cause toxicity). Genetic material Of somatic cells that enable sustained production and delivery of proteins and peptides by sustained release of quality A transformation method is needed.   Biodegradable ultrafine particles   There is also known a technique of using biodegradable ultrafine particles containing drugs as a sustained delivery system. ing. US Pat. Nos. 4,389,330 and 4,542,025 Contains various ultrafine particles or microcapsules and their preparation and use. It has been disclosed.   European Patent Application No. 248,531 describes virus replication. Induces the production of interferon, which is said to be a potential inhibitor Microcapsules for RNA and / or DAN or antiserum Microcapsules encapsulating antisense RNA are disclosed. Only However, the publication describes a method for the uptake and transport of cells into the intracellular cytoplasm. The law has not been disclosed. Therefore, the method outlined in the publication is Inadequate to apply to the use of substances and gene expression.   Encapsulation of genetic material allows nucleotides to be released from enzymatic degradation prior to their release. Can be protected. By controlling the product expression by sustained release of the gene, the organism The mortality rate of is reduced.                                Summary of the invention   This invention provides an ultrafine particle composition suitable for sustained release of nucleic acid to target cells. What And an ultrafine particle composition containing the following components (a) and (b) and having a particle size of 1 to 500 microns Regarding:   (A) also includes synthetic or natural DAN that is exogenous or endogenous to the target cell Or RNA-containing nucleic acid, the uptake or transport of the nucleic acid into the nucleus or Promotes intracellular expression by chemical bond with a promoter selected from the following group Complex nucleic acid [content of the nucleic acid is about 0.0001 to 5 relative to the weight of component (b)] 0% by weight]; glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, peptides, Hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, protein-containing cell ligands, glycolipids Quality, peptidoglycan, lectin, fatty acid, phospholipid, triglyceride, sterol Id hormone, cholesterol, single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or Double-stranded DAN and intercalating agent, and   (B) with a biocompatible and biodegradable polymer matrix selected from the group And a polymer matrix encapsulating the nucleic acid component (a) above; poly-d, L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d, L-lactic acid and glycolic acid Copolymer with L-lactic acid and glycolic acid, copolyoxalate , Polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone), poly (glycolic acid- Caprolactone), casein, albumin and wax.   The present invention provides an ultrafine particle composition suitable for sustained release of nucleic acid to target cells. Therefore, a set of ultrafine particles having a particle size of 1 to 500 microns containing the following components (a) to (c) Products are also included:   (A) also includes synthetic or natural DAN that is exogenous or endogenous to the target cell Or a nucleic acid containing RNA [the content of the nucleic acid is based on the weight of the following component (c)] About 0.0001 to 50% by weight],   (B) Promotes the uptake of nucleic acid component (a) into the target cell or transport to the nucleus of the target cell Promoters selected from the following advancing groups; glycoproteins, lipoproteins, nuclei Protein, peptide, hormone, antibody, growth factor, nucleic acid binding factor, protein Cellular ligands, glycolipids, carbohydrates, sphingolipids, peptidoglycans, Cutin, fatty acid, ganglioside, phospholipid, triglyceride, cholesterol Single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or double-stranded DAN and intercalating agents, Bini   (C) with a biodegradable, biocompatible polymer matrix selected from: Therefore, a polymer encapsulating the coexisting nucleic acid component (a) and promoter (b) described above. -Matrix; poly-d, L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d , A copolymer of L-lactic acid and glycolic acid, a copolymer of L-lactic acid and glycolic acid Mer, copolyoxalate, polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone) ), Poly (glycolic acid-caprolactone), casein, albumin and whey Cous.   In the case of the first aspect, the facilitator directly binds to the nucleic acid to form a complex. However, in the second aspect, the facilitator coexists with the nucleic acid within the polymer matrix. It In any of the above ultrafine particle compositions, inert particles as the core of the ultrafine particles, eg For example, tungsten particles, gold particles, platinum particles, ferrite particles, polystyrene particles Children or latex particles may be blended.   The present invention provides for expression of a gene when it is inserted into cells or tissues of animals and plants. A method for preparing a nucleic acid having an effective size, comprising using the composition of any one of the above ultrafine particles. The nucleic acid comprising the step of forming biocompatible and biodegradable sustained-release ultrafine particles containing the same. The method of preparing is also included.   The method of preparing nucleic acids described above involves coating a nucleic acid-containing polymer matrix with an enhancer. The process may further comprise the process of incorporating nucleic acid into the cell or into the nucleus. It can facilitate the transport of acids to the nucleus.   The present invention provides sustained release of exogenous or endogenous genes into the cells of plants or animals. A method for producing a gene expression, which comprises the following steps (a) to (c): Methods for sustained release of genes are also included:   (A) Biocompatible biotransformation of exogenous or endogenous genetic constructs to target cells Ultrafine particle composition by encapsulation with a biodegradable polymer matrix To form   (B) The polar particles are provided in an administration device suitable for sustained release of the ultrafine particle composition into target cells. Including a particulate composition,   (C) The composition of the ultrafine particle composition is treated with a plant or The genetic construct and target microparticles that are released into the body of an animal and are contained within the ultrafine particle composition. Interact with the nucleus of the cell.   In the present invention, the ultrafine particles are injected by the injection method, the particle impact method and other methods. Transport directly to cells or tissues of living or living animals or plants Method is used.                             Brief description of the drawings   Figure 1 is stained with DAPI (4 ', 6-diamididino-2-phenylindole) Microcaps with abundant genetic material and ultrafine tungsten particles (particle size:> 1 μm) Indicates a cell. Black arrow indicates genetic material stained with blue DAPI, white arrow Indicates a dark tungsten core.   FIG. 2 is a scanning type showing the particle size distribution and surface characteristics of microencapsulated ultrafine particles. It is an electron micrograph. The ultrafine particles are tungsten particles, plasmid DAN and And DAN of herring sperm.   FIG. 3 shows an expression of the amplified gene after being released into the sample solution collected at a predetermined time. Shows a galose gel. Lane 1 shows a size marker. In lane 2 DAN is not included. Lanes 3-7 show 1 hour, 3 hours and 4 hours after release into the solution. Amplified genes after hours, 5.5 hours and 7 hours are shown. 72 hours in lane 8 Later measurable release is shown. Lane 9 is amplified β-from plasmid DAN. The galactosidase coding region is shown.   FIG. 4 shows the expression of β-glucuronidase gene in plant cells. micro Of the cauliflower 4 days after being subjected to impact treatment with encapsulated genetic material Tissues were placed in reaction buffer containing X-glucuronic acid (enzyme substrate). In the figure The arrow indicates the expected blue color in plant cells due to the microencapsulated gene. 2 illustrates the gene expression stained with.   Figure 5 shows stable clones of transformed animal cells. The white arrow in the figure The clone is shown. The Chinese hamster ovary cells were Using a gene construct containing lactosidase and neomycin resistance coding sequences Subject to shock treatment. The cells after impact were subjected to selection treatment for resistance to neomycin. Attached for a week. Viable cells show neomycin resistance, ie, the activity of the introduced gene. You These cells, each carrying a transgene, proliferate and clot. Form All cells of the clone show β-galactosidase activity and The child construct is present in the introduced plasmid DAN. Some clones selected It was observed after being left in the selective medium for 4 weeks.   Figure 6 shows 3 clones after 4 weeks of selection in neomycin medium. Figure 9 shows an agarose gel displaying the amplified genes in (lanes 3-9). Lane 1 The size marker of molecular weight is shown. Lane 2 was amplified from plasmid DAN β-galactosidase coding region [positive control marker (control   marker)] is shown. Lanes 3-9 are amplified DAN from transformed clones. Is shown. Amplification of DAN was performed by polymerase chain reaction. Bremer Is designed to amplify sequences within the β-galactosidase coding region. It was Lane 10 is CHO cells not subjected to shock treatment with exogenous DAN Including DAN. Lane 11 is a negative control containing no β-galDAN is there.                             Detailed Description of the Invention   The invention proposed herein is applied to the intracellular cytoplasm of humans and other animals and plants. The present invention relates to a method of slowly and safely releasing transmitted information over a predetermined period. The present invention In this method, the nucleic acid is associated with the cell ligand in a known manner Of animals and plants by encapsulating with a toxic and biodegradable polymer matrix It will be mailed into the cell. According to this method, cells and tissues of animals, microorganisms and plants are By controlling internal uptake and delaying gene expression within Problems that were pending in engineering are solved. Further, according to the present invention, Protects encapsulated nucleic acids and ligands from enzymatic degradation. By sustained release of genetic material If so, the lethality of the organism is reduced by controlling the expression of the gene product. Genetic material In combination with known techniques for transporting quality into living cells, the present invention provides The effectiveness of can be increased. Very importantly, the present invention Very practically possible to allow genetic transformation of somatic cells without row integration Provide a useful method. Transformation of somatic cells by sustained release of genetic material It enables continuous production of proteins and peptides and their delivery to cells.   In the present invention, the purpose of obtaining an organism having a gene expression product and a transferred gene And for the purpose of gene therapy, promoters and / or specific nucleos Uses encapsulated genetic material containing regulatory and coding regions for tide sequences To do.   The definitions of biological and genetic terms set forth below are for the understanding of the present invention. Is useful in.   The term “administering” refers to the administration of a nucleic acid-containing microparticle according to the invention, eg parenterally. Any method of delivery or particle delivery by the route (intravenous, intramuscular or subcutaneous) Means feeding to animals by.   The term "animal" is used in its normal biological sense to treat All animal species with sufficient body length, especially humans, food animals, mammals in general, and birds , Pets and fish are included.   The term "biocompatible" means that it is not toxic to the human body and A property that does not cause cancer or inflammation.   The term "biodegradable" means that the body's physiological processes allow it to be broken down and easily removed from the body. Means the property of polymeric materials to produce products that are excreted and do not accumulate excessively in the body To do. Biodegradation products also mean that the polymer matrix is compatible with the body Must be biocompatible in.   The terms "controlling" and "suppressing" as used in relation to a disease are used to predict the disease. Meaning of preventing, treating, arresting or other pathologically beneficial effects To do.   The term "sustained release" as used in connection with the microcapsules according to the invention means Nucleic acid active ingredient from the capsule polymer matrix is continuously administered to the target It is intended to be released over an extended period of time, which may be delayed or delayed. To taste. The sustained release period is 1 to 500 days, preferably 3 to 60 days.   "DNA sequence" refers to four types of DNA monomers, namely adenine, guanine, and cytosine. A linear sequence consisting of any combination of syn and thymine nucleotides, , Genetic information, eg codes for amino acids, promoters, regulatory elements (Enhancers, nuclear recognition elements, etc.) or other gene products Is an array. A specific DNA sequence can be a known specific function, such as a specific polypeptide. Designed for expression of a particular phenotype or a function encoding a peptide or a particular genetic trait. This is an array having functions to be used.   "Exogenous genetic material" is a specific germ cell or genetically transformed feature. Not obtained from gametes that form a constant zygote, or some of these naturally It is a genetic material that does not form.   A "gene" encodes a protein product or controls transcription, Or independent of genetic material that acts on transcription and has at least one DNA sequence Is the smallest unit that works properly.   A “dosing device” is a device that guides ultrafine particles into the cells of animals or plants. Vehicle for entry or administration.   “Genetic material” means purified or native DNA sequence (s), eg, For example, part or all of a chromosome, naturally occurring or synthetic or semi-synthetic. Synthetically prepared DNA sequences, single or multiple genes and gene chimeras, For example, a DNA sequence that constitutes what is formed by the joining of different DNA sequences. Is a substance having   "Phenotypic expression" refers to the production of a product, eg, a polypeptide or protein. To Effected or altered the expression of the natural phenotype of the zygote or organism. Expression of the code for the DNA sequence or sequences that causes it.   The term "edible animal" refers to the source of protein in human or other animal food. Means an animal that is consumed by Typical food animals include animals of the bovine subfamily (eg Eg cows, ovine animals (eg sheep), pigs (eg. Examples include pigs), poultry (eg chickens and turkeys) and rabbits. It   "Disease" is caused by the presence of species inside or outside the species. Means an illness. The disease may be local, for example a tumor, It may be a whole body, for example, a viral disease or the like. In the present invention Particularly important diseases are cancer and viral diseases. "Illness (locale) The term "refers to local illness and means the site of illness origin.   The term "microcapsules" or "microparticles" refers to the active agent (in this case Means a storable particle or solid containing genetic material) in solution or in crystalline form. To taste. The active agent is dispersed or dissolved in the polymer that is the matrix of the particles. Or contained within a polymer that provides an outer wall for storage.   Composition-genetic material   The present invention provides exogenous, often chimeric, genetic constructs for the intracellular production of plants and animals. Regarding sustained release to. Usually, this type of genetic construct contains a protein Regulatory sequences are included, as well as coding regions for transcribing the product. Adjustment The region is a promoter sequence sufficient to transcribe and terminator sequences that terminate the product. It may be a heater array. Generally useful in the methods and compositions of the present invention. The nucleic acid is a recombinant nucleic acid or a synthetic nucleic acid. European patent issued in the present invention Suppression of cancer and viral diseases disclosed in Japanese Patent Application No. 248,531 Does not utilize the interferon induction mechanism for.   Compositions-conjugates   Promoters promote nuclear uptake or transport or intracellular expression of nucleic acids A substance selected from the following group: glycoprotein, lipoprotein, nuclear protein Contains proteins, peptides, hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, proteins Cell ligand, glycolipid, peptidoglycan, lectin, fatty acid, phospholipid, bird Glycerides, steroid hormones, cholesterol, single-chain or double-chain RN A, single-stranded or double-stranded DNA and intercalating agent. Nucleic acid content is About 0.0001 to 50% by weight based on the weight of the polymer matrix component (b) Is.   In a preferred embodiment, the nucleic acid having the new genetic information requires gene expression. A ligand that binds to a cell surface receptor with high specificity for the desired cell type To join. Ligands can be bound to DNA by several methods . Gene transfer by receptor-mediated endocytosis is associated with the DNA binding site. Bifunctional consisting of binding ligands for cell surface receptors covalently linked It is performed by forming a sex molecule conjugate. Such ligands are It can be targeted to specific cells. For example, targeting hepatocytes The first is the galactose-terminated (asialo) glycoprotein, asialoorosom. Cooid ligand is covalently linked to poly-L-lysine. This zygote is Complex with rasmid in a 2: 1 molar ratio. Asialoglycoprotein Recognized by a unique cell surface asialoglycoprotein receptor [Wu et al. J. Biol. Chem. 262, pp. 16985 to 16987 (1988) )reference]. When the cell surface receptor recognizes the ligand, it binds to the DNA binding region. The combined exogenous DNA is co-transported into the cell.   Another DNA conjugation method is polycation transferrin conjugation complexed with DNA. The body is used to introduce the gene into cells. In a typical complex formation reaction, Lanceferrin-polylysine or transferrin-protamine conjugate 10μ g to H2The solution added to 250 μL of O was added with 3 μg of plasmid DNA to 0.3 M NaCl. Add under stirring into the solution added to 250 μL of solution. After 30 minutes at room temperature, A coalescence is formed and the complex can be microencapsulated. Natural iron transport Transferrin, a protein, is replaced with polylyl, a polycation that binds to DNA. By binding with syn or protamine, a protein conjugate is formed. It The protein conjugate binds to nucleic acid in the normal transferrin cycle And transport the nucleic acid into the cell by endocytosis [Wagner (Wagn er) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 87, 3410-34 See page 14 (1990)]. If you do not perform microencapsulation, Endosome endocytosis and liposomal enzymes protease and nuclei DNA is hydrolyzed and destroyed by ase.   According to the method of the present invention, the complex is encapsulated within a biodegradable polymer matrix. By doing so, the DNA and the conjugate are protected. In addition, the complex is chloroquinone Or by encapsulating with adenovirus, destruction of lysosomes Promoted and intact DNA in the cytoplasmic compartment of the cell It is possible to release it to and approach the nucleus.   Non-covalent conjugation of DNA with a ligand requires a basic N-acyl urea moiety. Under the conditions formed, the protein is treated with a water-soluble carbodiimide, namely N-ethyl. Ru-N '; (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (CDI) It is done by modifying it. The resulting N-acyl urea protein is Forms a salt bridge with the phosphodiester skeleton of DNA [Hackett et al., Biochemical Ph armacology, 40, 253-263 (1990)]. Another person As a method, the aldehyde-modified protein is linked to the 5'-end of the nucleic acid by modification. There is a method for forming a compatible hydrazide intermediate [Ghosh et al. , Anal. Biochem. , 178, pp. 43-51 (1989)].   Various chemical modifications of the 3'-end and / or the 5'-end or individual nucleobases. The decoration method is performed on DNA. The following firefly is introduced as the chemical part. Photosensitive groups include: acridine derivatives; batophenanthroline-Ru (II) complex Dancil, Mancil, Aedans-dUTP. Generally, these parts are Terminal hydroxyl group or phosphate via an amino or amino bond It binds to groups or specific bases. Other molecules bound to DNA are Entering Agents (eg acridine, phenadium), photochemically activated crosslinkers (eg For example, psoralen) or a cleaving agent (eg, methylporphyrin XXI), alkyne Agent (eg, chloroalkylaminoaryl), redox-active nucleic acid cleaving group (For example, 10-Cu (II) -phenanthroline).   Biotin-labeled DNA ends recognize cell surface and nuclear membrane transport proteins. Complexes with antibodies or enzymes via the avidin-biotin complex that enables You can This type of transport molecule facilitates DNA uptake.   Lipophilic moieties, such as cholesterol and long chain alkyl groups, are commonly 3'-terminal. Bind to the end or 5'-end [Letsinger et al., PNAS, No. 8 6, page 6553 (1989)]. DNA-containing liposomes are DNA3 0 μg and N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-tri Methyl-ammonium chloride (DOTMA) and dioleoylphosphatidyl ester Prepared by mixing 100 μL of serum-free medium containing tanolamine [Nabel et al., Science, Vol. 249, pp. 1285-1288. Page (1990)]. Such lipophilic modification increases the hydrophobicity of DNA. , Which facilitates uptake through the cell membrane.   According to the method of the present invention, the DNA conjugate is incorporated into the biodegradable polymer matrix. Chroroencapsulation protects the complex and its components and provides sustained release of the complex. Becomes possible.   Method-Microencapsulation   By adjusting the composition of the matrix polymer, the release rate of the drug is preset. Can be determined and adapted to a particular application [Lewis, "Drug Transport Biodegradable Polymer as a System "(M. Chasin and Langer (R ． Langer) ed.), 1990]. Genetic material is associated with the degradation of the matrix It can be released into the animal body for a long period of time and can be used. Prevents unexposed genes from breaking down before they have an effect. In the method of the present invention The polymer used is biodegradable so that all encapsulated genetic material is mobile. Release into the object Can be issued. Human or animal target cells are Uptake of the nucleic acid-ligand conjugate by itosis, the nucleic acid is transported to the nucleus, Expressed. Duration of action depends on polymer composition, polymer to drug ratio and micros Controlled by adjusting the size of the fair.   According to the invention, 30-60 days, depending on the type of microspheres selected. Have the advantage of varying the duration of action over a period of 250 days or more. Be done. According to this delivery system, a nucleic acid-containing preparation that is continuously delivered is used. To introduce new genetic information into the human or other animal body, Promoting temporal gene expression and / or disrupting existing cellular sequences Can be.   The composition according to the present invention comprises a biocompatible, biodegradable polymer matrix containing a nucleic acid. It is a very fine particle (microcapsule) having a lix, and the ultrafine particle is produced by a conventional method. Therefore, it is prepared. The ultrafine particles may be of any conventional type. , Other pharmaceutically active ingredients such as antibiotics, vaccines and / or other It may contain conventional additives. The preparation according to the present invention has an ultrafine particle matrix. Contains nucleic acid dispersed therein.   Preferred structures of microcapsules according to the invention are described in the specifications of the following US patents: Has been: No. 4,389,330, No. 4,919,929 and No. 4,530, No. 840. The microcapsules according to the invention are polymers, preferably aliphatic polyesters. Steals, eg homopolymers or copolymers of lactic acid or glycolic acid Formed from. Other degradable polymers, such as polycaprolactone, polydio Xonene, polyorthoesters, polyanhydrides and natural polymers (albumy (Including wax, casein, wax, etc.) and the like. Blended with ultrafine particles The amount of nucleic acid is usually 0.00005-75% by weight, preferably Is 0.0001 to 50% by weight.   "Wt%" means the percentage of parts by weight of nucleic acid to parts by weight of polymer. For example, 10% by weight means that when 10 parts by weight of nucleic acid is mixed with 90 parts by weight of polymer. Combined Means   The ultrafine polymer matrix material used in the present invention is biocompatible and raw. It must be a degradable polymeric material. With a suitable polymer matrix material The following are exemplified: poly-d, L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycol Acid, mixed d, copolymer of L-lactic acid and glycolic acid, L-lactic acid and glycol Copolymers with acids, copolyoxalates, polycaprolactones, poly (lactic acid-capsules) Prolactone), poly (glycolic acid-caprolactone), casein, albumi And wax.   The molecular weight of the polymer matrix material is quite important. This molecular weight (MW) Should be sufficient to form a satisfactory polymer film. That is, the The molecular weight of the polymer should be appropriate for the polymer to be a good film former Is. Generally, a satisfactory molecular weight is 5000 Daltons or more. Various film types The molecular weight of the forming polymer compound is easily determined by known methods. Po The molecular weight of the limer also depends on the composition, purity, optical morphology, etc. of the decomposition rate. Play an important role. In general, the larger the MW, the slower the decomposition rate. It An average molecular weight of about 5,000 to 500,000 is preferred.   Nucleic acid is released from the microparticles by leaching through the polymer matrix. Will be issued. In this case, the nucleic acid may be degraded before the polymer is significantly degraded or the polymer is degraded. It is released at the same time. By choosing the polymer material appropriately, a two-step release is possible. It is possible to prepare an ultrafine particle formulation exhibiting release characteristics. Polymer selection and nucleic acids / po Adjusting the limer ratio is useful in obtaining a multi-step release pattern.   The ultrafine particle product according to the present invention has an acceptable particle size of 1 for use in injectable compositions. It can be prepared by any method capable of producing ultrafine particles of μm to 500 μm. it can. Generally, the following four types of microcapsules are manufactured according to the main preparation principle. Are classified into: (1) Separation of aqueous and organic phases, melt dispersion and spray drying Separation method including (2) interfacial polymerization, in-situ polymerization and chemical vapor deposition Reaction method, (3) solvent extraction method and (4) fluidized bed spray coating, multi-orifice Ms. Centrifugal coating with single orifice, electrostatic coating and physical Physical method including the steps of selective vapor deposition.   The preferred method of manufacture is that described in US Pat. No. 4,919,929. It Phase separation methods, as the term implies, rely on different solubility properties. And due to the solubility characteristics, the wall or shell forming matrix material is a solution Alternatively, it is separated from the dispersion liquid and deposited on the encapsulated substance in the form of fine particles or droplets. It This phase separation itself may be a physical method (eg addition of non-solvent or temperature change). Alternatively, it may be carried out by a chemical method (for example, change of pH).   In the method of separating the organic phase (see US Pat. No. 4,919,929), the Usually it is a dispersion or emulsion of nucleic acid in solution or a high molecular weight polymer. Use a dispersion or emulsion prepared by adding the solvent to an organic solvent. High to this mixture The molecular weight polymer is separated from the solution and collected as a suspension-coated therapeutic agent shell. Add a non-solvent or liquid polymer that allows. The shell swollen with the solvent Harden by adding more non-solvent, or strengthen the shell and shield. By curing by another method that improves shearability, its nucleic acid permeability and degradation Release is controlled by velocity.   Generally, in the above organic phase separation method, an aqueous solution of oleophobic antigen or The aqueous suspension is added to a non-aqueous solution of the appropriate matrix polymer and the mixture is stirred. A water-in-oil emulsion is formed by stirring. The drug dissolves in water Depending on the degree, it may be present in the aqueous phase in a concentration of 0.1 to 50%, and It may be present in the total mixture in a concentration of 0.1 to 20% by weight. The external organic phase is It may contain 5 to 10% of a matrix polymer. However, usually , The ratio of drug to polymer in the internal phase (aqueous solution or suspension) is 2: 1 to 1: 4. It   In the aqueous phase separation method (see US Pat. No. 4,919,929), the A dispersion or solution of a water-insoluble therapeutic agent in an aqueous solution or dispersion of limer. Use Marshon. The polymer separates as gel particles, the gel particles of the therapeutic agent It deposits on the outside to form a shell. The shell hardens and the ultrafine particles separate. Aqueous phase separation Legal The most common method among them is the coacervation method (US Pat. No. 4,919,9). 29)), a water-soluble treatment which may be in the form of particles or droplets The agent is usually dispersed in an aqueous sol of hydrophilic colloid which is ionized in water, A second sol of opposite charge is added and the mixture is diluted with water, salt added, p By adjusting the H, changing the temperature, or subjecting it to any combination of these. To generate Appropriate conditions for coacervation are determined by those skilled in the art according to routine trials. It can be easily determined by line. Because various useful polymers are In terms of physical and chemical properties, depending on the source and the method of separation or preparation. Because it will be different. The range of coacervation is a solution of two polymers Or, change the sol concentration, temperature and pH to determine the conditions necessary for gelation. It is decided by. From these measurement results, the phase at a given temperature and pH Draw a three-phase diagram showing the soluble region and coacervation range. In this three-phase diagram It reveals the effect of concentration, temperature and pH on gelation.   Careful condition setting is necessary for each method of preparing ultrafine particles, and Conditions that differ to some extent are required depending on the type of substance to be converted. For example, stirring Influences the size of the emulsion droplets. When the stirring speed becomes higher, The droplet size is smaller. For the surface properties of the droplet, the matrix outside the droplet should be To ensure the deposition of compact materials and minimize the generation of particles not involved in microencapsulation The procedure may be changed to limit the time. The amount of water added in the dilution process is critical Not stable, but generally stable when encapsulating relatively large droplets. A relatively large amount of water is required to maintain the emulsion.   The above-mentioned phase separation method is an alternative method, namely a stable emulsion or suspension of nucleic acids. The first step in producing the liquid was to disperse the nucleic acid in the matrix material solution. Therefore, it may be adapted to the preparation method to be performed. Stirring the emulsion into a non-solvent Ultrafine particles by precipitating the polymer coating material by adding Let it form.   Another type of phase separation method is the melt dispersion microencapsulation method (US Pat. No. 4). , 919,929). Heat-melting waxy coating, preferably low melting A point wax, such as glycerol distearate, is identified by the wax and nucleic acids. Insoluble materials such as silicone oils or fluorocarbons are not Suspend in active liquid. By heating the mixture with vigorous stirring , Melt and emulsify the wax. Nucleic acid is pulverized and sorted into the desired size range, The waxy coating is then dispersed by high shear agitation. Molten wax is nucleic acid To form ultrafine particles coated with a waxy liquid. Living The formed ultra fine particles are solidified by cooling by continuing stirring. The solidified ultrafine particles After being filtered off, it is dried as described above.   Another microcapsule formation method is the interfacial microencapsulation method (US Pat. 4, 919,929). This method brings two reactants together at the reaction interface. To cause polycondensation of the reaction product (usually a monomer) at the reaction interface. Form an insoluble polymer film. In this encapsulation method, the reaction interface is One method of forming is by reacting one of the reactants forming a condensation polymer with a nucleic acid, Is a method of dispersing or emulsifying in the reactant-containing continuous phase.   Yet another microencapsulation method is the solvent extraction method (US Pat. No. 4,919, 929). In this method, the polymer matrix is placed in a suitable solvent. The desired nucleic acid is added to the solution in which the cup material is dissolved. Nucleic acid is a polymer material It may be soluble or insoluble in the medium. If desired, It may be dissolved or dispersed in the second medium by being added to the medium.   The mixed components in this solvent are emulsified in a continuous phase processing medium (the processing medium is Such a medium in which a dispersion of minute droplets is formed in a continuous phase medium). This series The sequel processing medium (usually water) and the organic solvent must be immiscible Yes. Continuous addition of non-aqueous media such as xylene, toluene, synthetic oils and natural oils You may use it as an engineering medium. Usually, a surfactant is added to the continuous phase processing medium. This prevents the aggregation of ultrafine particles and reduces the amount of solvent in the emulsion. Control the size of the drops. A preferred surfactant dispersion medium is poly (vinyl alcohol). Le) It is a mixture of 1 to 10% by weight dispersed in water. This dispersion makes the mixture mechanical It is prepared by stirring. Emulsions are also active agents and wall-forming substances. Formed by adding a droplet of a solution containing Good. The temperature during the emulsion preparation is not particularly critical, but it depends on the size of the ultrafine particles. It affects the quality and solubility of the drug in the continuous phase. Of course, the nucleic acids in the continuous phase It is desirable to make it as small as possible. The temperature is during processing by the solvent or processing medium. Must not be too viscous or cold enough to solidify. Also, the medium should not be so hot that it evaporates excessively or nucleic acids decompose. No. Therefore, dispersion processing is preferred at any temperature where stable operating conditions are maintained. More preferably, it is performed at a temperature of about 30 to 60 ° C, depending on the type of drug or excipient selected. Nau.   The dispersion formed by solvent extraction is a stable emulsion. This dispersion Therefore, liquids that are immiscible with the organic solvent are partially absorbed in the first stage of the solvent removal process. To be removed. Solvents are well known in the art, for example, heating method, depressurizing method or a combination thereof. Therefore, it can be easily removed. The temperature at which the solvent evaporates from the microdroplets is critical However, the temperature should not be so high as to decompose the nucleic acid, and the solvent should not evaporate. The temperature should be such that the velocity is not high enough to cause defects in the wall former. is there. Generally, in the first solvent removal step, 5-75% of the solvent, preferably In fact, 1 to 25% is removed.   Ultrafine particles dispersed in a solvent immiscible liquid medium after the initial solvent removal step Are separated from the liquid medium by any conventional separation means. For example, liquid The particulate medium may be separated from the ultrafine particles by decantation, or The dispersion of ultrafine particles may be subjected to a filtration treatment. If desired, use conventional separation methods You may use together.   Included in microcapsules after separating microcapsules from continuous processing media The residual solvent that is removed is removed by extraction. In this second solvent removal step, The same continuous phase processed media as used in the first solvent removal step The sexing agent may be added) or suspended in another liquid medium. Mike is the extraction medium The residual solvent is removed from the capsules, but the microcapsules are not dissolved. Extraction In the process, the extraction medium containing dissolved solvent is removed and fresh extraction solvent is used. I have to replace it. This operation is best done continuously. Predetermined Appropriate replacement rates for the extraction medium in the step are easily determined by those skilled in the art. After removing most of the solvent from the ultrafine particles, air dry the microcapsules or Or a conventional drying method such as a vacuum drying method or a method using a desiccant. To dry.   Yet another encapsulation method is the physical microencapsulation method (US Patent (See No. 4,919,929). The physical microencapsulation method is based on the specified substance Particles or droplets, with orifices arranged coaxially or sequentially Continuously in the device as a liquid film as a melt or solution of the coating material It is characterized by coating. Liquid coatings should be standard It is cured by the medium evaporation method.   A process including the step of passing a liquid or solid core material through a liquid matrix material. The black encapsulation method is included in the physical microencapsulation method. Suitable flow of core material Can be disrupted by suitable means to form liquid-coated droplets or particles, The wall material of the coated particles obtained by subjecting the coated particles to a cooling treatment or other treatment. To solidify. For example, an aqueous solution of the material to be encapsulated is melted with glycerol disteare It is sucked rapidly into the rate stream and the mixture is extruded through a fine nozzle. You The liquid stream emerging from the nozzle is broken into droplets (each droplet is Consisting of an aqueous core covered by a socks). These droplets fall in the air Then, the shell is cooled and solidified to obtain ultrafine particles. In a variation of this method, A centrifugal force is generated by the rotating member, and the core material is moved into the shell-forming liquid by the centrifugal force. Discharge.   The microencapsulation method described above and many other variations of the microencapsulation method. You may also use the form method. As will be appreciated by those skilled in the art, all encapsulated materials There is no specific method and set of conditions that can be applied, and the desired Optimal conditions and effective methods for obtaining results should be selected. Water-soluble nucleic acid It is encapsulated by the separation method. Nucleic acids soluble in lipids or organic solvents should be It is microencapsulated by the delivery method.   In a preferred method for preparing ultrafine particles containing genetic material, phase separation method A solution is prepared by dissolving the marmatrix material in a suitable organic solvent. In this solution The nucleic acid is added in a state of being suspended or dissolved in water or in the form of fine particles. Polymer By slowly adding the non-solvent for the Trix material to the dispersion under stirring. To slowly precipitate the polymeric material around the nucleic acid, forming ultrafine particles. The Ultrafine particles in adding a second non-solvent to the polymer matrix material Thus it is further cured, then filtered off and dried.   The ultrafine product according to the invention is generally spherical particles, but of irregular shape. It may be a particle having a state. The size of the ultrafine particles varies from submicron to Can be varied over the range of the remeter, but standard needle Alternatively, in the case of a nucleic acid preparation to be administered by another conventional method, the particle size is 1 to 500 μm. Are preferred. In another aspect of the invention, a matrix material is included. The nucleotide-shaped material may be in a form other than ultrafine particles, such as a rod or a wafer. It may have a form such as a wafer, a rectangular film or a block. In either case, the nucleic acid material is distributed throughout the matrix material. matrix The amount of nucleic acid dispersed in the material depends on the amount of nucleic acid contained in the matrix material over a long period of time. When released, it is in an amount sufficient to elicit the desired therapeutic response. this These tangible objects are particularly suitable for subcutaneous implantation in treated animals.   The amount of nucleic acid administered to an animal depends on the type of animal to be treated, target gene sequence, disease, and treatment. It depends on the time, the age of the animal and the degree of treatment desired.   Ultrafine particles are pharmaceutically acceptable prior to administration to the treated animal or groups of animals. In a liquid vehicle, and the dispersion is injected into the animal at the desired site.   Nucleic acid can be transferred to animals by mixing ultrafine particles of different sizes or types. Feeding the animal in multiple steps and / or feeding the heterologous nucleic acid to the animal at different times. Alternatively, the nucleic acid mixture can be fed to the animals simultaneously. Common to animals Other biologically active agents to be administered to the can be optionally mixed with the nucleic acid formulation. For example, Antibiotics, antiparasitics, vaccines in the form of black capsules or conventional non-encapsulated forms Alternatively, after appropriately mixing any desired active agent or the like with the nucleic acid, the method of the present invention It may be administered to animals.   Method-Supply   In a preferred embodiment, the microcapsules containing the nucleic acid are In order for the psel to release the active gene continuously or intermittently in the animal body, Administered to humans or other animals, which eliminates the need for repeated infusions. Microphone B Encapsulated genes are delivered to animals by injection, transplantation or direct impact can do. These methods allow for direct gene transfer into live animals. Can be In a preferred method, the gene and its promoter and gold With tungsten, platinum, ferrite, polystyrene or latex particles The encapsulating microcapsules are delivered by impact into the tissue. Particle impact method is rice It is disclosed in Japanese Patent No. 4,945,050. However, the present invention It is not limited to the particle bombardment method. There are various methods for supplying ultrafine particles of this type, for example, Direct injection, receptor-mediated endocytosis, particle bombardment, subcutaneous or Can be performed by intramuscular transplantation or oral administration.                                   Usage   The present invention is directed to the genetic transformation and synthesis of animal, plant and microbial cells. Introduction of new genetic material by natural nucleic acid transport and biodegradable polymer containing nucleic acid It relates to modification of gene expression by sustained release of ultrafine particles. The present invention has a wide range of applications For example, animal and plant breeding, disease diagnosis and treatment and protein production. It is useful in etc. The compound encapsulated with the nucleic acid expresses a foreign gene, It can be used for gene therapy and suppression of gene activity. This technique can be applied The following are examples of applications.   1.Human gene therapy   Muscular dystrophy is a process of encapsulating the dystrophin gene in the subfascial muscle tissue. It can be treated by transplantation into the body. Gene uptake It is carried out by transport through the sarcoplasmic reticulum or muscle cutting ends. capsule Uptake of genes into muscle cells by direct injection or shock of activated genes Can be promoted. Knockout of an exogenous defective gene The effect of the expressed gene can be improved. Microcapsules are incorporated It is performed using a ligand bound to the gene that has been modified.   2.Cancer treatment   Genes for cytokin or genes that kill cancer cells are used to treat metastatic cancer. Is done by inserting. Genes in the tumor that infiltrate lymphoid cells The direct insertion method has been completed {Fitzpatrick-Mcarygott, Bio / Tech. , 10: 1036-1040 (1992)]. Professional A cap having a motor / regulator enhancer region and a coding region The cell-forming gene construct is inserted into a solid tumor. Cytokin inheritance Tumor (TIL) cells that receive pups and infiltrate lymphocytes circulate to another metastatic site To do. Proteins produced intracellularly affect cancer cells at this site. Culture (cu lture) and then reinject the proliferated cells into the body. For encapsulation Therefore, gene degradation is prevented.   3.Production of transformed animals   By introducing new genetic information into the animal's body, Denatured native proteins can be expressed. Conventional transformation of transformed domestic animals This method offers significant advantages over the production method. Mammary specific pro Pregnant with a gene encoding a recombinant protein induced by a motor It is injected into cows in vivo by this method. This gene is taken up in developing epithelial cells. It is incorporated and develops during lactation. This treatment period is only a few weeks, but is usually It is best to express recombinant protein in cow body by conventional transformation method. A low 30 months is needed.   4.Genetic immunization   The following example demonstrates that in order to express a foreign protein that elicits an antigen response, A novel method (in vivo method) of inserting a gene into the body of an animal that comes is illustrated. HIV The promoter sequence for the coat protein / encapsulated gene for the virus is A cell that allows the production of the antigenic part of the virus without the use of the actual virus. Can be inserted into the cell. This can cause retrovirus replication Sex is removed. Retroviral vectors can carry considerable risk Reported in some documents. Is this kind of vector a recombinant defective virus? It can be reactivated and lead to infection [Temin, Hum an Gene Therapy, Vol. 1, pp. 111-123 (1990)]. Retroviral vectors have potential problems (carcinogenic and pathogenic) and vectors Having a homologous recombination with a helper sequence that can be used for breeding. This improvement Protects against responsive infectious viruses.   5.Genetic immunization   D having a sequence for hepatitis B virus induced by actin promoter NA is microencapsulated by the phase separation method. Filling rate is 5% And 1% batches of 1% and 2.5 g of polylactide and polyglycol 25 mg of plasmid DNA was prepared using a mixture of PLGA (65:35). Convert to psel. The microsphere formulation is injected intramuscularly in the chest of chickens. One week Blood was collected at intervals of 2 weeks, 4 weeks, and 8 weeks, and the blood was collected for anti-HBV antibody. Determine the titer. Cell-mediated immune response to HBVSA, macrophages Of lymphokine excretion from chicken WBC stimulated in the presence of erythrocyte and antigen Evaluate by.   6.Gene knockout by homologous recombination   D encoding an alternative gene for a defective cell gene that causes an inborn error of metabolism The NA construct is processed for integration by homologous recombination. The structure is It is conjugated with a ligand that is taken up into the cell where the gene is expressed. The joined body is a microphone After encapsulation, inject it into the target cell by injecting it into the patient's body Enough to knock out the defective gene and replace it with an error-free sequence. Form a copy of the new gene. Knockout / alternative therapy is applied to type A hemophilia Treatment of the disease. Type A hemophilia is caused by a defect in the blood coagulation factor VIII gene Is a blood coagulation disease associated with X chromosome. The new Factor VIII gene Injection of black-encapsulated Factor VIII gene / asialoglycoprotein conjugate i.p. It can be used as a substitute for a defective array by insertion. In this case, the gene is It is absorbed, transported to the liver, and then recombined and expressed.                                   Example   Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but these examples are merely illustrative. However, this does not limit the present invention.   The meaning of the units used in this specification are as follows: "Sec": seconds, "min": minutes, "h": hours, "d": days, "mL": milliliters and "g" ": Gram.                                 Example 1   Microencapsulation of plasmid DNA using biodegradable polymer   In the following three examples, phase-separated microencapsulated pellets were used. Lasmid DNA and tungsten microcarrier particles were used. Implementation of these The following two types of plasmids were used in the examples.   (1) pMH40 [Eye DuPont de Nemours and Campa Agricultural products made by Nie (EI du Pond de Nemours and Company); Wilmin Ton, Delaware]; the plasmid has a length of 7.3 kilobases and is SV- 40 virus 3'slice site cauliflower mosaic virus promo It contains the β-glucuronidase gene induced by the enzyme.   (2) pRC / CMV / β-gal [Plasmid manufactured by InVitrogen] De; San Diego, CA]; the plasmid has a length of 11.6 kilobases Of the β-galactosidase gene and the antibiotics kanamycin and G418. For neomycin phosphotransferase II that confers resistance to It contains a wing area.   Gene expression was driven by the cytomegalovirus promoter. Which The plasmid also does not have a complete viral genome and is non-infectious.   For microencapsulation, plasmid pMH-40DNA [10 mM Tris (PH 7.4) and 500 mM of buffer containing 1 mM EDTA (TE). Is a sample added with 2000 μg] or plasmid pRC / CMV / β-gal DNA [500 mM buffer containing 10 mM Tris ((pH 7.4) and 1 mM EDTA (TE)] L sample of 500 μg] and herring sperm DNA [Boehringer Manha Made by Im (Boehringer Mannheim); Indianapolis, Indiana] 500 μL of TE solution (50 mg / mL) in a shaking water bath at 65 ° C. for 30 min Mixing was facilitated by incubating.   Encapsulating biodegradable polymer with a monomer composition of lactide and glycolide of 65:35. Limmer (dl-PLGA) [Medisorb Technology manufactured by Logies Inc.); Cincinnati, OH] Glass tube with screw cap ( A predetermined amount was put into 50 mL) and dissolved in 31.7 g of ethyl acetate. M- 17 Tungsten Micro Carrier [Manufactured by Biorad; Richmond , CA] 0.75 g, and vigorously stirring the contents before Transferred into a cooled water jacketed reaction vessel (300 mL). Acetic acid to the reaction vessel After adding 43.7 g of ethyl, add 1 mL of the DNA solution to the 1 cc syringe and 18 gauge. Probe sonication while slowly adding using a needle. This sound The wave treatment was carried out using a TM375 type device manufactured by Tekmar. sound After 30 seconds of wave treatment, silicone oil with flow rate of 360 and viscosity of 1000cs 2 from 74 g of Dow Corning; Ithaca, NY This mixture was added at room temperature with 2.5 liters of heptane [Chempy. A company (Chempure) Quenched by immediate addition into M138KBJB. Three After 0.5 h, the solid content was collected using a 0.2 μm filter and washed with heptane , Dried in a vacuum oven for at least 3d. These microspheres Due to its sensitivity to moisture and temperatures above 30 ° C, it was stored dry at 4 ° C.   The photomicrograph (Fig. 1) shows that the fluorescence-labeled DNA indicated by the black arrow is microcapped. It shows that it can be made into cells. The white arrow shows the tungsten core added to the ultrafine particles. Indicate. Scanning electron micrograph (Fig. 2) shows the particle size distribution of ultrafine particles after encapsulation. Is 1 to 250 μm. The surface of the particles is smooth and the particles adhere to each other. Having. The impacting action and the impact on the screen divide the particles into smaller components. Be understood. As is clear from these results, DNA inserts into cells and tissues. It can be included in microcapsules of effective size. High density Angsten cores provide the density required for particle bombardment. However, the present invention Not limited to particle bombardment, it can also be prepared for different sizes and morphologies for direct injection and implantation. Can be manufactured.                                 Example 2   Release and identification of plasmid DNA after microencapsulation   In this example, the release of DNA from microcapsules over time is described. explain. 50 mg of microcapsules with chloroform and isoamyl alcohol Microencapsulated DN by dissolving in 500 μL of 4: 1 mixed solvent A was recovered and the DNA was immediately extracted with TE buffer at room temperature. aqueous The DNA in the phase was mixed with 1/10 volume of 3M sodium acetate solution (p H5.2) and precipitated by adding 2 volumes of 100% ethanol. Check the integrity of the recovered DNA on an ethidium bromide / agarose gel. It was analyzed by the electrophoretic method used and visualized by UV irradiation. By this method The identity of the plasmid DNA recovered from the microspheres was Confirmed by digestion with the nuclease Eco R1. Plasmid DNA (1 0 μg) was subjected to digestion with Eco R1 20 units at 37 ° C. overnight. . Plasmid pMH40 was analyzed using a 0.7% agarose gel stained with ethidium bromide. , Took a picture. Predicted by cleaving pMH40 with Eco R1 Two fragments of different lengths (3.3 and 4.0 kilobases) were obtained. Was done. The plasmid pRC / CMV / β-gal contains two Eco R1 restriction sites and one Has a Bam HI site. Plasmid DNA (10 μg) was added to Eco R1 or Cleavage treatment at 37 ° C. with a Bam HI50 unit was overnight. After digestion, cut The cut DNA was stained with ethidium bromide on a 0.7% agarose gel. Used for analysis and photographed. Prediction by cutting the DNA with Eco R1 Two fragments were obtained with the expected length, which were excised using Bam HI. By cutting, one restriction fragment was obtained.   In vitro sustained release of DNA was analyzed. Batch 233 Microspheres 50 mg or 65:35 monomer composition of the above polymer unfilled microspheres (Control) is suspended in 25 mL of TE buffer, and the mixture is shaken in a water bath at 37 ° C. Incubated. After 1h, 3h, 6h, 24h, 48h and 72h, the sample ( 500 μL) was collected, pooled and stored in 1/10 volume of sodium acetate (pH 5.2). A precipitate formed upon addition and was frozen at -20 ° C. Precipitated D NA was obtained by subjecting it to a centrifugation treatment at 4 ° C. and 2000 g for 20 min. After pelletization, wash with -20 ° C 70% ethanol to remove residual salts And then dried in a DNA Speedvac for 10 min. The perette Was resuspended in TE buffer and quantified by UV spectroscopy. In vitro PMH40-containing DNA recovered by lysis analysis at Analyzed by The DNA was labeled with 3'and 5'primers, Amplitaq (Amplitaq ) [Perkin-Elmer (Perkin-Elmer); Cetus, Norwalk, Cali Fornia] 2.5 units and buffer [10 mM Tris (pH 8.3), 5 0 mM KCl and 2 mM MgCl2Buffer solution containing 2 mM of dNTPs After mixing with the liquid, 480 DNA thermal cycler (pack PCR, 10 times, 15 times, 20 times, and 25 times using PCR Cycled. Simple Eggles are treated at 94 ° C for 1 min, 42 ° C for 1 min and 74 ° C for 3 min. It consists of reason. DNA amplified by PCR was subjected to agarose gel electrophoresis and ethibromidis. A single 625 bp DNA fragment amplified when analyzed by Um staining It was found that the DNA was released over time (see FIG. 3). Is the above result As is clear from the above, the DNA identity is not perfect during the microencapsulation and release processes. Held in full.                                 Example 3             Gene expression in plant cells supplied with encapsulated DNA   Organize microencapsulated DNA with a 0.5 μm particle size tungsten core I made it collide inside. DNA consists of 75% herring sperm DNA and β-glucuronidase It consists of 25% of rasmid (pMH40). My including tungsten and DNA Suspend the crossspheres (5 mg) in 0.075 mL of ice-cold 70% ethanol and ice. Prepared by sonication above. As described above, pMH40 DNA was Diluted to μg / μL to obtain a tungsten microcapsule with a particle size of 1.0 μm. Precipitated on the rear. This operation is simply as follows. Micro Wash 60 mg of rear with 1 mL of 100% ethanol and sonicate for 30 sec. Centrifuge at 000g, wash with 1mL of sterile distilled water, and sonicate Then, it was subjected to a centrifugal separation treatment. After decanting the supernatant, sterilized distilled water 0. 5 mL was added to the microcarriers. Sterilize 25 μL of microcarrier suspension Transfer to another treated microcentrifuge tube (1.5 mL), and add pMH40 TE solution of Sumid DNA 10 μL, 2.5M CaCl225 μL and 0.1 M Vortex 10 μL of permidine [Sigma, St. Louis, Missouri] Was added under agitation. After incubating at room temperature for 10 minutes, the precipitated DNA is The microcarriers containing are subjected to centrifugation under conditions of 10000 g for 2 min. And pelletized, and the supernatant was removed. The pellet is treated with 100% ethanol. Resuspend in 25 mL, sonicate briefly, and under 10,000 g conditions Pelletized by centrifugation, and the pellet was added to 60 μL of 100% ethanol. Resuspended in.   For the impact on the stem of cauliflower, 15 μL of the prepared particles was Apply it on the rear disc (Kapton macrocarrier disc) to evaporate the ethanol. It was carried out by Impact is biolistic PDS-1000-HE Particle delivery system (Biolistic PDS-1000-HE particle delivery system) 27 inches Hg using [BioRad; Hercules, CA] Under a reduced pressure of 2000 p.s.i. and a breaking disc pressure of 2000 p.s.i.   β-glucuronidase (GUS) gene expression is a set of shock-treated cauliflower Analyzed by Oriuchi. The tissue was incubated for 18 h at room temperature under irradiation and then Then, after incubating for 6 h in the dark, it was subjected to a staining process for 24 h in the dark at 37 ° C. It was Assay solution from Biosynth (Stard, Switzerland) [0. 1nM Na2HPOFour(PH 7.0), 0.5 mM K3Fe (CN)6, 0.5 mM KFour Fe (CN)6・ 3H2O, 10 mM Na2EDTA and 0.5 mg / mL X-glu Solution containing sodium salt] was used.   According to this result, the activity of the transgene in the cauliflower tissue Expression was observed 4 days after impact treatment with microencapsulated DNA (See FIG. 4). This microcapsule contains a β-glucuronidase marker gene. I had. Do not perform shock treatment or shock treatment without using DNA. The obtained tissue piece (control) did not show a blue staining reaction. Therefore, encapsulated Exogenous genes have been delivered into plant cells resulting in delayed transformation of tissues. Becomes That is, gene expression in plants was inserted into the complete cauliflower Illustrated by utilizing sustained release of the reporter gene β-glucuronidase It was                                 Example 4       Stable gene expression in animal cells using microencapsulated genes   Plasmid pRC / CMV / β-gal and tungsten microcarrier particles It was microencapsulated by a separation method. The conditions for microencapsulation are as follows. Except for the points, the conditions are the same as those detailed in the first embodiment. 10 mM Tris (pH 7.4) ) 500 μg of DNA was added to 500 μl. 44.4 g of ethyl acetate in the reaction vessel With In addition, 67.9 g of silicone oil was added instead of 74 g. Impact processing For this purpose, pRC / CMV / β-gal DNA was concentrated at 1 μg / μL as described above. It was diluted with water and precipitated on a tungsten microcarrier having a particle size of 1.0 μm. This The processing of is outlined as follows. Microcarrier 60mg 100% ethanol Wash with 1 mL of water, sonicate for 30 sec, and centrifuge at 12000 g After being subjected to a separation treatment, it was washed with 1 mL of sterilized distilled water. After decanting the supernatant Then, 0.5 mL of sterilized distilled water was added. Then 25 μL of microcarrier suspension Transfer to another microcentrifuge tube (1.5 mL) and vortex it under vortexing. , 10 μL of TE solution of pMH40 plasmid DNA, 2.5M CaCl2Solution 25 μL and 10 μL of 0.1 M spermidine solution (manufactured by Sigma) were added. 4 ° C After holding for 10 min at 1000 ° C, microcarriers with DNA precipitated on the surface The mixture was centrifuged at 0 g for 2 minutes, and the supernatant was removed. 10 pellets obtained Resuspend in 0.25 mL of 0% ethanol, sonicate for a short time and then 10 Centrifuge at 000 g to pellet again and pellet Resuspended in 60 μL of 00% ethanol.   Microspheres containing tungsten and DNA (5 mg) were chilled on ice The suspension was suspended in 0.075 mL of ethanol and then sonicated on ice. Fusion The CHO cells were bombarded with 15 μL of the particles prepared as described above in Kapton. It was done after coating on a microcarrier disc and evaporation of ethanol. . The impact treatment is performed by the biolistic PDS-1000-HE particle supply system (Bio Rad Co., Ltd.) under a reduced pressure of 15 inches Hg and a gas pressure of 1350 p.s.i. Under the conditions It was done in. After the shock treatment, the cells are returned to the medium and the G-418 antibody is added. For 2 days under standard conditions without the use of G-4 Selection treatment in 18-containing medium was allowed for 6-8 weeks. In G-418-containing medium After 6 weeks of growth, the transformed cells were transformed into shock-treated cultures. Viable colonies of cells were observed (see Figure 5). Herring sperm DNA and tangs Controls with impact treatment using microcapsules containing only ten fine particles culture No live colonies were observed on the object. As is clear from the above results, Inserting the genetic material encapsulated in black into the animal cells will stabilize the cultured animal cells. Can be routinely transformed.   The β-galactosidase activity in CHO cells selected by shock treatment was analyzed. Was analyzed. Staining for assaying β-galactosidase enzyme activity was performed slowly with phosphate. Containing 0.05% glutaraldehyde in shocked physiological saline (PBS) Fix it on the Petri dish containing the solution for 5 minutes. After removal by rinsing 3 times with S, cells were stained by addition of X-gal solution. Colored and then incubated for 2-6 h. This X-gal solution is 10 mM NaP OFour3 mM K3Fe (CN)63 mM KFourFe (CN)6・ 3H2O, 1M Mg SOFour, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2And 0.2% X-gal. Another line of evidence for gene insertion is staining for assaying β-galactosidase activity. It is a blue coloration observed after coloring (see FIG. 5).   Incorporation of the β-galactosidase gene resulted in G-418 resistant CHO cell clones. It was confirmed by PCR analysis of the genomic DNA purified from (see Figure 6). Claw (See FIG. 5) is a buffer using batch 231 microspheres as described above. 9 of a flat bottom tissue culture plate containing G-418-containing medium after being subjected to a shock treatment and diluted. Produced by plating and expanding in 6 wells for 3-4 weeks It was The DNA was cloned using the Stratagene DNA Separation Kit. Separated from the ground. PCR used 2 μg of cloned DNA per reaction And performed as described above. These results show that β-galactosidase It was found that the gene was integrated into the genomic DNA of the clone (see Figure 6).                                 Example 5       By zygote encapsulation and receptor-mediated endocytosis                               Gene transfer   Gene transfer is performed, for example, by polylysine-asialoglycoprotease conjugated to DNA. Receptor-mediated endosites using in- or transferrin-polylysine -May be by the cis pathway. In this method of gene transfer , A cognate moiety for a cell surface receptor linked to a DNA binding moiety. A functional molecular conjugate was used. However, in the case of some target cells, this Gene transfer by the method is limited. This restriction is due to various enzymes (lysosomal enzymes , Protease, nuclease, etc.). From enzymatic degradation D In order to effectively protect NA, encapsulation of the conjugate and its DNA here Be proposed. One additional benefit of this encapsulation is that it degrades lysosomes. Selected lysosomatropic agent in microcapsules Can be included. Chloroquine [Ze Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3655-36. 59 (1990)] and adenovirus [Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 8850-885 (1991) ) Reference] etc. are illustrated.   The transferrin-poly (L-lysine) -DNA complex is Cotten) et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 87, pp. 4033-40. Page 37 (1990)] and the method described by Zenke et al., Supra. Made. The specific ligation reaction depends on the modification of the carbohydrate moiety of transferrin. I'm sorry Under control of the Rous sarcoma virus long-term repeat enhancer / promoter D containing Photinus pyralis luciferase NA plasmid pRSVL [DeWet et al., Mol. Cell Biol., Volume 7 , Pp. 725-737 (1987)] as the reporter gene. It was The zygote-DNA complex contained 6 μg of pRSVL DNA in HBS [15 0 mM NaCl / 20 mM Hepes (pH 7.3)] 350 μL and diluted to By adding 12 μg of hTfpL190B diluted to 150 μL of HBS Prepared. Complexes were formed by holding at room temperature for 30 minutes. Adenovirus d1312, a replication-defective strain deleted in the Ela region [J. Jones and Schenk, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 76, p. 3665- See page 3669 (1979)] in the article by Curiel et al. [Proc. Natl. Ac ad. Sci., Vol. 88, pp. 8850 to 8854 (1991)]. Prepared according to the method. Chloroquine was encapsulated in microcapsules at a concentration of 100 μM. Could be included.   Microencapsulation of DNA-conjugates was performed on the plasmid pRSVL-lucifera. 500 μg of the DNA-conjugated DNA was diluted to 500 μL of 10 mM Tris (pH 7.4). The procedure was as described in Example 1, except that it was used. Adenovirus d1 312 or chloroquine (100 μM) can be included during the encapsulation process. did it. Evaluation of the effect of microencapsulated DNA-conjugates was performed in vivo. External cell lines, such as the human leukemia cell line [Coten et al., Proc. Natl. Acad. Sc i., 87, 4033-4037 (1990)] or established Cells grown under controlled conditions [Kyiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 8850 to 8854 (1991)]. I was able to. The microencapsulated DNA conjugate was directly added to the cultured cells, Of luciferase gene expression after incubation for 48 h and 72 h at 37 ° C. The cells were collected for These results show that DNA-without microencapsulation The results were compared with the results of gene expression using the zygote.   Polylysine-asialoglycoprotein conjugated to DNA [Woo and Wu , J. Biol. Chem., Vol. 263, pp. 14621 to 14624 (1998. ) Reference] to target liver cells in vivo. DNA (pSV2 CAT (Lasmid) and the polylysine-asialoglycoprotein conjugation method is described in Wu et al. As described in. This DNA-conjugate binds poly-L-lysine to galactose- Terminal (asialo-) glycoprotein [asialoorosomucoid (AsOR)] Was prepared by covalently binding to. 1-ethyl-3- (3-dimethylamido Nopropyl) carbodiimide [manufactured by Pierce Chem. Co.] Then, poly-L-lysine (manufactured by Sigma) was combined with AsOR at a molar ratio of 2: 1 [. Wu et al. Biol. Chem., 264, 16985-16987 (19 1989)]]. D The complex with NA is formed by binding the conjugate and DNA at a molar ratio of 2: 1. Formed [Wu et al., J. Biol. Chem., Vol. 263, pp. 14621-146. 24 (1988)]. After incubating the sample at 25 ℃ for 1 h, 3500 membrane limit [Spectrum Medical Industries (Spectrum   Medical Industries), California] and 0.15M saline The dialysis treatment used was given for 24 hours. After dialysis, all samples were 0.2μm membrane [Millipore manufactured by Lipore Corp.). Got united.   Encapsulation of the conjugate is performed as described in Example 1. Molecular conjugate and orientation The lysosomal agent is a polylactide-polyglycolide copolymer prepared by phase separation. (PLGA) encapsulated in 1 g. 65% polylactic acid and 35% polyglycol Biodegradable polymer (dl-PLGA) containing a mixture with acid [Medisorb Technoro Made by Zees; Cincinnati, Ohio] with 50 mL screw cap Put a specified amount in a glass tube, dissolve in 30 g of ethyl acetate, and cool to 0 ° C with water jacket. It was transferred into a reaction vessel (300 mL) with a cup. Add 4 more ethyl acetate into the reaction vessel. 5 g was added, and the mixed sample was mixed with TE buffer [10 mM Tris (pH 7.4), 0.1 m 1 mL of a DNA solution containing 25 mg of the conjugate in M EDTA] and 1 cc syringe Sonicated while slowly added using an 8-gauge needle (Teckmer T M375 type device is used). After sonication for 30 seconds, Dow Corning Add 75 g of silicone oil (fluidity 360, viscosity 1000 cs) made by the same company over 2 minutes Immediately, add 2.5 L of the mixture to heptane (M138 KBJS, manufactured by ChemPure). It was subjected to quenching treatment (room temperature) under stirring in. After 3.5 h, solid The quality was collected on a 0.2 μm filter, washed with heptane and then at least under vacuum. Also dried 3d. The particle size of the microcapsules was 1-250 μm. Micros The fair is extremely sensitive to moisture and temperatures above 30 ° C, so keep it dry at 4 ° C. It was   For uptake in vivo, sterilize 1 mg of encapsulated pSV2 CAT DNA Intramuscular solution of Sprague-Dawley rat in saline solution Well Or by intravenous injection. By the method described in Wu et al. The CAT activity of tissue samples was monitored for 24-72 h [J. Biol. Chem. , 264, pp. 16985 to 16987 (1989)].   Follow the above procedure as the DNA and conjugate are protected by the microcapsules. For example, gene expression is improved. Sustained release of DNA prolongs gene transfer effect It is exerted and gene expression is carried out for a long period of time.                                 Example 6    Production of recombinant protein in chicken eggs using encapsulated conjugated DNA   Amplification of plasmid DNA in bacteria and purification followed by restriction endonuclease Linearized by enzymatic digestion with ze. Induced by ovalbumin promoter Linear plasmid containing a gene encoding a derived human growth hormone (hGH) The method of Huckett et al. [Biochem. Pharmacol., Volume 40, Volume 2 Pp. 53-263 (1990)], according to It was conjugated with chicken insulin by cross-linking with chicken. This molecular conjugate In 1 g of polylactide and polyglycolide copolymer (PLGA) by phase separation method Encapsulated in. Contains a mixture of 65% polylactic acid and 35% polyglycolic acid Biodegradable polymer (dl-PLGA) (manufactured by Medisoth Technologies) 5 Put a predetermined amount into a glass tube with a 0 mL screw cap and dissolve in 30 g of ethyl acetate. And transferred to a reaction vessel (300 mL) equipped with a water jacket cooled to 0 ° C. Anti Further, 45 g of ethyl acetate was added to the reaction container, and the mixed sample was mixed with TE buffer [1. D containing 25 mg of the conjugate in 0 mM Tris (pH 7.4), 0.1 mM EDTA] While slowly adding 1 mM of NA solution using 1 cc syringe and 18 gauge needle It was subjected to a sonication treatment (manufactured by Techmer, TM375 type device was used). Sonication After 30 seconds, dow Corning silicone oil (fluidity 360, viscosity 75 g (1000 cs) was added over 2 minutes and the mixture was immediately added to heptane (Kempi). Quenching treatment under stirring in 2.5 L of Mure KBJS, manufactured by Hughes Co., Ltd. (At room temperature). After 3.5 h, collect the solid material on a 0.2 μm filter, After washing with heptane, under vacuum Dry for at least 3d. The particle size of the microspheres was 1-250 μm. This Because these microspheres are extremely sensitive to moisture and temperatures above 30 ° C, It was dried and stored at 4 ° C.   Microsphere pills suspended in CMC injection vehicle 25 weeks after birth Of growth hormone in each egg after intraperitoneal injection in egg-laying hens of Leghorn Was measured by ELISA. The conjugated plasmid-insulin complex is abdominal It is released into the membrane space, transported to the basal surface of oviductal epithelial cells, and taken up by the cells. It is considered to express the hGH gene. The hormone is secreted into the fallopian tube cavity , Incorporated into chicken eggs.                                 Example 7                               Genetic immunization   To generate an immune response to a foreign antigen, purified protein is usually introduced into the animal body. It is necessary to inject. Sufficient protein separation is difficult and time consuming is there. According to the present invention, the encapsulated gene can be injected or particle bombarded. It is inserted directly into the skin or muscle. This method is a unique vaccination method Is an antibody production method.   Inoculation of human growth hormone (hGH) into mice (ICR strains) was Kuching promoter [Leavitt et al., Molec. Cell Biol., 4th Vol., Pp. 1961-1969 (1984)] or sitomeglow CMV promoter [Boshart et al., Ce11, Volume 41, Volume 5] 21-p. 530 (1985)]. It was performed using a black capsule. Microcapsules for particle impact contain dense materials Inert particles (preferably gold or tungsten) were also included. Dense matter The particles enhance momentum and allow entry into animal cells. Power using inert particles The capsuleization method is as described in Example 1, but the encapsulation method of this Example is h Difference in using GH gene and human β-actin or CMV promoter To do. Microcapsules use a type of biolistic system that can be held by hand. And promoted [Tang et al., Nature, 356, 152-154 (1992). Year)]. Alternatively, the microcapsules containing the hGH gene should be used in mice. Injected directly into the muscle at some sites.   The production of antibodies against hGH was determined by immunoprecipitation in serum collected from the tail (125I-mark Monitored hGH) by analyzing the volume. of antibodies to hGH The amount is 1 μL of serum125I-labeled hGH (DuPont-NEN, 84-88 μCim L-1113-116 μCi mg-1) Incubate with 1 μL for 1 h at room temperature It was measured by 4 μL of protein A agarose beads (Pierce) The resulting slurry was incubated at 4 ° C. for 12-18 h. The beads Were pelleted by centrifugation and phosphate buffered saline (P After extensive washing with (BS), the retained counts / min (cpm) were measured. The measured value is , And was normalized to the amount of precipitated hGH (ng) per 1 μL of serum. Genetic immune processing Antibodies to hGH in the serum of isolated mice were analyzed by Western blot analysis. Detected [Tang et al., Nature, 356, pp. 152-154 (1992). Year)].   The present invention is not limited to the particular embodiments and examples described above, and is covered by the scope of the claims below. All modifications and the like of these embodiments and the like are included in the present invention.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．標的細胞に対して核酸を徐放するのに適した極微粒子組成物であって、下 記の成分（a）と（b）を含有する粒径１〜５００ミクロンの極微粒子組成物: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の合成もしくは天然のＤＮＡも しくはＲＮＡを含有する核酸であって、該核酸の核への取込みもしくは輸送また は細胞内での発現を促進する次の群から選択される促進物質と化学結合によって 複合した核酸［該核酸の含有量は、成分（b）の重量に対して約０.０００１〜５ ０重量％である］；糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、ペプチド、 ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有細胞リガンド、糖脂 質、ペプチドグリカン、レクチン、脂肪酸、リン脂質、トリグリセリド、ステロ イドホルモン、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは 二本鎖ＤＮＡおよび挿入剤、並びに （b）次の群から選択される生体適合性で生分解性のポリマーマトリックスで あって、上記の核酸成分（a）をカプセル化するポリマーマトリックス；ポリ−d ,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合d,Ｌ−乳酸とグリコール 酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、コポリオキサレー ト、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸 −カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワックス。 ２．標的細胞に対して核酸を徐放するのに適した極微粒子組成物であって、下 記の成分（a）〜（c）を含有する粒径１〜５００ミクロンの極微粒子組成物: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の合成もしくは天然のＤＮＡも しくはＲＮＡを含有する核酸［該核酸の含有量は下記の成分（c）の重量に対し て約０.０００１〜５０重量％である］、 （b）核酸成分（a）の標的細胞への取込みもしくは標的細胞の核への輸送を促 進する次の群から選択される促進物質；糖タンパク質、リポタンパク質、核タン パク質、ペプチド、ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有 細胞リガンド、糖脂質、炭水化物、スフィンゴ脂質、ペプチドグリカン、 レクチン、脂肪酸、ガングリオシド、リン脂質、トリグリセリド、コレステロー ル、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡおよび挿入剤、 並びに （c）次の群から選択される生分解性で生体適合性のポリマーマトリックスで あって、上記の共存する核酸成分（a）と促進物質（b）をカプセル化するポリマ ーマトリックス；ポリ−d,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合 d,Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリ マー、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン ）、ポリ（グリコール酸−カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワッ クス。 ３．極微粒子のコアとして不活性粒子をさらに含有する請求項１記載の極微粒 子組成物。 ４．不活性粒子がタングステン粒子、金粒子、白金粒子、フェライト粒子、ポ リスチレン粒子またはラテックス粒子である請求項２記載の極微粒子組成物。 ５．ヒト以外の動物および植物の細胞もしくは組織へ挿入されて遺伝子を発現 するのに有効なサイズを有する核酸の調製法であって、下記の成分（a）と（b） を含有し、生体適合性で生分解性の粒径１〜５００ミクロンの徐放性極微粒子を 形成させることを含む該核酸の調製法: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の合成もしくは天然のＤＮＡも しくはＲＮＡを含有する核酸であって、該核酸の核への取込みもしくは輸送また は細胞内での発現を促進する次の群から選択される促進物質と化学結合によって 複合した核酸［該核酸の含有量は、成分（b）の重量に対して約０.０００１〜５ ０重量％である］；糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、ペプチド、 ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有細胞リガンド、糖脂 質、ペプチドグリカン、レクチン、脂肪酸、リン脂質、トリグリセリド、ステロ イドホルモン、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは 二本鎖ＤＮＡおよび挿入剤、並びに （b）次の群から選択される生体適合性で生分解性のポリマーマトリックスで あって、上記の核酸成分（a）をカプセル化するポリマーマトリックス；ポリ−d ,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合d,Ｌ−乳酸とグリコール 酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、コポリオキサレー ト、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸 −カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワックス。 ６．動物および植物の細胞もしくは組織へ挿入されて遺伝子を発現するのに有 効なサイズを有する核酸の調製法であって、下記の成分（a）〜（c）を含有し、 生体適合性で生分解性の粒径１〜５００ミクロンの徐放性極微粒子を形成させる ことを含む該核酸の調製法: （a）標的細胞に対して外因性の合成もしくは天然のＤＮＡもしくはＲＮＡを 含有する核酸［該核酸の含有量は下記の成分（c）の重量に対して約０.０００１ 〜５０重量％である］、 （b）核酸成分（a）の標的細胞への取込みもしくは標的細胞の核への輸送を促 進する次の群から選択される促進物質；糖タンパク質、リポタンパク質、核タン パク質、ペプチド、ホルモン、抗体、成長因子、核酸結合因子、タンパク質含有 細胞リガンド、糖脂質、炭水化物、スフィンゴ脂質、ペプチドグリカン、レクチ ン、脂肪酸、ガングリオシド、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール、一 本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡおよび挿入剤、並びに （c）次の群から選択される生分解性で生体適合性のポリマーマトリックスで あって、上記の共存する核酸成分（a）と促進物質（b）をカプセル化するポリマ ーマトリックス；ポリ−d,Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、混合 d,Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリマー、Ｌ−乳酸とグリコール酸とのコポリ マー、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（乳酸−カプロラクトン ）、ポリ（グリコール酸−カプロラクトン）、カゼイン、アルブミンおよびワッ クス。 ７．核酸の細胞内への取込みもしくは核酸の核への輸送を促進する次の群から 選択される促進物質を用いて核酸含有ポリマーマトリックスを被覆する請求項５ または６記載の方法：タンパク質、挿入剤、核酸、脂質および炭水化物。 ８．植物もしくは動物の細胞内へ外因性もしくは内因性遺伝子を徐放して遺伝 子発現をもたらすための方法であって、次の過程（a）〜（c）を含む該遺伝子の 徐放方法: （a）標的細胞に対して外因性もしくは内因性の遺伝的構築物を生体適合性で 生分解性のポリマーマトリックスでカプセル化することによって極微粒子組成物 を形成させ、 （b）標的細胞内へ該極微粒子組成物を徐放させるのに適した投与具内に該極 微粒子組成物を包含させ、 （c）ポリマーマトリックスの分解によって、該極微粒子組成物を植物もしく は動物の体内へ放出させ、該極微粒子組成物内に包含される遺伝的構築物と標的 細胞の核を相互作用させる。 ９．極微粒子組成物を非経口的方法、局所的方法、経口的方法または粒子送給 法によって植物もしくは動物の体内へ放出させる請求項８記載の方法。[Claims]   1. An ultrafine particle composition suitable for sustained release of a nucleic acid to a target cell, comprising: An ultrafine particle composition containing the components (a) and (b) described above and having a particle size of 1 to 500 μm:   (A) also includes synthetic or natural DNA that is exogenous or endogenous to the target cell Or RNA-containing nucleic acid, the uptake or transport of the nucleic acid into the nucleus or Promotes intracellular expression by chemical bond with a promoter selected from the following group Complex nucleic acid [content of the nucleic acid is about 0.0001 to 5 relative to the weight of component (b)] 0% by weight]; glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, peptides, Hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, protein-containing cell ligands, glycolipids Quality, peptidoglycan, lectin, fatty acid, phospholipid, triglyceride, sterol Id hormone, cholesterol, single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or Double-stranded DNA and intercalating agent, and   (B) with a biocompatible and biodegradable polymer matrix selected from the group A polymer matrix encapsulating the nucleic acid component (a) above; poly-d , L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d, L-lactic acid and glycol Copolymer with acid, copolymer of L-lactic acid and glycolic acid, copolyoxalate Polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone), poly (glycolic acid) -Caprolactone), casein, albumin and wax.   2. An ultrafine particle composition suitable for sustained release of a nucleic acid to a target cell, comprising: An ultrafine particle composition containing the components (a) to (c) and having a particle size of 1 to 500 μm:   (A) also includes synthetic or natural DNA that is exogenous or endogenous to the target cell Or a nucleic acid containing RNA [the content of the nucleic acid is based on the weight of the following component (c)] About 0.0001 to 50% by weight],   (B) Promotes the uptake of nucleic acid component (a) into the target cell or transport to the nucleus of the target cell Accelerating substances selected from the following groups; glycoproteins, lipoproteins, nuclear proteins Contains proteins, peptides, hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, proteins Cell ligand, glycolipid, carbohydrate, sphingolipid, peptidoglycan, Lectins, fatty acids, gangliosides, phospholipids, triglycerides, cholesterol Single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or double-stranded DNA and intercalating agent, And   (C) with a biodegradable, biocompatible polymer matrix selected from: Therefore, a polymer encapsulating the coexisting nucleic acid component (a) and promoter (b) described above. -Matrix; poly-d, L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d, L-lactic acid / glycolic acid copolymer, L-lactic acid / glycolic acid copolymer Mer, copolyoxalate, polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone) ), Poly (glycolic acid-caprolactone), casein, albumin and whey Cous.   3. The ultrafine particles according to claim 1, further comprising inert particles as a core of the ultrafine particles. Child composition.   4. Inert particles include tungsten particles, gold particles, platinum particles, ferrite particles, The ultrafine particle composition according to claim 2, which is styrene particles or latex particles.   5. Gene expression when inserted into cells or tissues of non-human animals and plants A method for preparing a nucleic acid having an effective size, comprising the following components (a) and (b) Containing biodegradable biodegradable sustained release ultrafine particles with a particle size of 1 to 500 microns A method of preparing the nucleic acid comprising forming:   (A) also includes synthetic or natural DNA that is exogenous or endogenous to the target cell Or RNA-containing nucleic acid, the uptake or transport of the nucleic acid into the nucleus or Promotes intracellular expression by chemical bond with a promoter selected from the following group Complex nucleic acid [content of the nucleic acid is about 0.0001 to 5 relative to the weight of component (b)] 0% by weight]; glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, peptides, Hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, protein-containing cell ligands, glycolipids Quality, peptidoglycan, lectin, fatty acid, phospholipid, triglyceride, sterol Id hormone, cholesterol, single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or Double-stranded DNA and intercalating agent, and   (B) with a biocompatible and biodegradable polymer matrix selected from the group A polymer matrix encapsulating the nucleic acid component (a) above; poly-d , L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d, L-lactic acid and glycol Copolymer with acid, copolymer of L-lactic acid and glycolic acid, copolyoxalate Polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone), poly (glycolic acid) -Caprolactone), casein, albumin and wax.   6. Used to express genes when inserted into animal or plant cells or tissues A method for preparing a nucleic acid having an effective size, comprising the following components (a) to (c): Formation of biocompatible and biodegradable sustained release ultrafine particles with a particle size of 1-500 microns A method for preparing the nucleic acid comprising:   (A) exogenous synthetic or natural DNA or RNA to the target cell Containing nucleic acid [The content of the nucleic acid is about 0.0001 relative to the weight of the following component (c). ~ 50% by weight],   (B) Promotes the uptake of nucleic acid component (a) into the target cell or transport to the nucleus of the target cell Promoters selected from the following group of advancing; glycoproteins, lipoproteins, nuclear proteins Contains proteins, peptides, hormones, antibodies, growth factors, nucleic acid binding factors, proteins Cell ligand, glycolipid, carbohydrate, sphingolipid, peptidoglycan, lecti , Fatty acid, ganglioside, phospholipid, triglyceride, cholesterol, Single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or double-stranded DNA and intercalating agent, and   (C) with a biodegradable, biocompatible polymer matrix selected from: Therefore, a polymer encapsulating the coexisting nucleic acid component (a) and promoter (b) described above. -Matrix; poly-d, L-lactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolic acid, mixed d, L-lactic acid / glycolic acid copolymer, L-lactic acid / glycolic acid copolymer Mer, copolyoxalate, polycaprolactone, poly (lactic acid-caprolactone) ), Poly (glycolic acid-caprolactone), casein, albumin and whey Cous.   7. From the following groups that promote the uptake of nucleic acids into cells or the transport of nucleic acids into the nucleus: 6. A nucleic acid containing polymer matrix is coated with a facilitator of choice. Or the method according to 6: protein, intercalating agent, nucleic acid, lipid and carbohydrate.   8. Sustained release of exogenous or endogenous genes into plant or animal cells A method for effecting offspring expression, which comprises the steps of (a)-(c) Sustained release method:   (A) Biocompatible biotransformation of exogenous or endogenous genetic constructs to target cells Ultrafine particle composition by encapsulation with a biodegradable polymer matrix To form   (B) The polar particles are provided in an administration device suitable for sustained release of the ultrafine particle composition into target cells. Including a particulate composition,   (C) By decomposing the polymer matrix, the ultrafine particle composition is treated as a plant or Is released into the body of an animal, and the genetic construct and target contained within the ultrafine particle composition. Allow the nuclei of cells to interact.   9. Ultrafine particle composition for parenteral, topical, oral or particle delivery The method according to claim 8, which is released into the body of a plant or animal by the method.
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