【発明の詳細な説明】
昆虫防除方法発明の分野
本発明は、タンパク質を植物に直接散布するかもしくはタンパク質を植物上で
微生物によって産生させるかまたはタンパク質を産生するように植物を遺伝的に
修飾することによって、植物にタンパク質を供給して植物の虫害を防除する方法
、並びに該方法に有用な微生物及び植物に関する。発明の背景
タンパク質のような天然物質の使用は、多くの害虫を防除するための公知の方
法である。例えば、鱗翅類及び鞘翅類の双方の害虫を防除するためにはバチルス
・チューリンギエンシスBacillus thuringiensis(B.
t.)の内毒素が使用されている。これらの内毒素を産生する遺伝子は、綿、タ
バコ及びトマトなどの種々の植物に導入されて発現している。しかしながら、B
.t.内毒素に感受性でない経済的に重要な害虫も何種類かは存在する。このよ
うな重要な害虫の例としては、ワタミハナゾウムシ(BWV),Anthono mus
grandis、及び、ウリハムシ(CRW),Diabrotica
spp.がある。更に、B.t.内毒素に感受性の昆虫を
防除するために別の異なる遺伝子産物を有することは、耐性管理の面から必須で
はないにしても重要である。
数種類の別の公知の殺虫性タンパク質が植物中で見出されている。これらのタ
ンパク質としては、レクチン、アミラーゼインヒビター及びプロテアーゼインヒ
ビターがある。これらは高用量で摂取されると昆虫の成長及び発育に影響を与え
るが〔Boulterら,1989;Broadway & Duffey,1
986;Czapla & Lang,1990;Gatehouseら,19
86;Heusingら,1991;Ishimoto & K.Kitamu
ra,1989;Murdockら,1990;Shukle & Murdo
ck,1983〕、B.t.タンパク質のような即効性の殺生効果を示さない。
本発明の目的は、BWV、CRWまたはその他の害虫を防除し得るタンパク質
、並びにかかるタンパク質の産生に有用な遺伝子を提供することである。本発明
の別の目的は、かかる遺伝物質を微生物及び植物細胞に挿入するための遺伝子構
築物及び挿入方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、かかる遺伝
物質を保有する形質転換微生物及び植物を提供することである。発明の概要
ジャガイモ塊茎の主要貯蔵タンパク質であるパタチンが、ウエスタンウリハム
シ(WCRW),Diabrotica virgifera、サザンウリハム
シ(SCRW),Diabrotica undecimpunctata及び
ワタミハナゾウムシ(BWV),Anthonomus grandisなどの
種々の昆虫を防除することは知見されていた。パタチンは幼虫をある程度致死さ
せ、生き残った幼虫の成長を萎縮させ、その成熟を阻止するかまたは極度に抑制
し、繁殖を完全に阻止する。これらのタンパク質は、エステラーゼ(脂質アシル
ヒドロラーゼ)活性を有することが判っており、植物に直接散布されてもよく、
または、別の方法、例えば、この酵素を産生するように形質転換された植物定着
微生物、または同様の形質転換を与えた植物によって供給されてもよい。
パタチンは、ジャガイモ〔Gaillaird,1971;Racusen,
1984;Andrewsら,1988〕及び他の植物、特にナス科植物〔Ga
nalら,1991;Vancanneytら,1989〕中に見出されるタン
パク質のファミリーである。ジャガイモ中のパ
タチンは主として塊茎中に見出されるが、他の植物器官中でも極めて低レベルで
検出される〔Hofgen &Willmitzer,1990〕。数種のパタ
チンイソ酵素のエステラーゼ基質特異性は研究されている〔Hofgen &
Willmitzer,1990;Racusen,1986〕。
パタチンをコードする遺伝子は、Migneryら,1984、Migner
yら,1988、Stiekemaら,1988及びその他の研究者によって既
に単離されている。Rosahlら,1987は、パタチンをタバコ植物に移入
し、パタチンの発現を観察した。この試験は、パタチン遺伝子が植物によって異
種発現され得ることを証明した。
パタチン遺伝子を同様に単離し、適当な形質転換ベクターカセットに挿入し、
次に該ベクターカセットを、(1)植物に散布されたときにパタチン産生遺伝子
を発現して昆虫を防除するように植物定着微生物の形質転換に使用するか、また
は、(2)植物自体が遺伝子を発現しパタチンを産生することによって昆虫によ
る攻撃を防御するように植物のゲノムに組込む。更に、昆虫防除用タンパク質を
コー
ドする1種以上のB.t.遺伝子を同時発現するように植物を形質転換または品
種改良してもよい。この結果として、(1)広範囲の有害生物から保護され及び
/または(2)ある種の有害生物に対して2つの作用モードを有する植物が与え
られ、これは耐性管理の面で重要なツールである。B.t.遺伝子を発現するよ
うに形質転換された植物の例は、1990年2月12日出願の〔Fischho
ffらの〕米国特許出願第476,661号に対応する欧州特許出願公開第0,
386,962号に開示されている。これらの文献の記載内容は本明細書に含ま
れるものとする。更に、プロテイナーゼインヒビターが他の殺虫性タンパク質の
活性と相乗作用を有することが判明しているので、ジャガイモパパインインヒビ
ター〔Rodis & Hoff,1984〕または大豆トリプシンインヒビタ
ー〔Ryan,1990参照〕をコードする遺伝子のような複数のプロテイナー
ゼインヒビター遺伝子を同時発現するように植物を形質転換または品種改良して
もよい。
上記を達成するために、本発明の1つの目的は、昆虫に摂取させる有効量の殺
虫性パタチンを供給することから成る植物の虫害防除方法を提供することである
。この方法に
よれば、パタチン遺伝子を発現するように形質転換させた植物定着微生物を作製
し、これを植物に導入し、該遺伝子を発現させ、殺虫有効量のパタチンを産生さ
せ得る。この方法ではまた、保護されるべき植物を以下のDNA分子によって遺
伝的に形質転換させてもよい。該DNA分子は、
(i)植物細胞中でRNA配列を産生させるべく機能するプロモーターと、
(ii)パタチンをコードする構造コーディング配列と、
(iii)該植物細胞中でRNA配列の3′末端にポリアデニレートヌクレオチド
を付加させるべく機能する3′非翻訳領域とから成り、該プロモーターは該構造
コーディング配列に対して異種であり、該プロモーターは該構造コーディング配
列に操作可能に結合されており、該構造コーディング配列は該非翻訳領域に操作
可能に結合されている。好ましくは植物が総タンパク質の約0.1−0.5%の
レベルのパタチンを発現するであろう。
本発明はまた、遺伝的に形質転換された昆虫耐性のトウモロコシ、綿、トマト
及びジャガイモ植物を提供する。
本文中で使用された「虫害を防除する」なる表現は、幼虫の致死、幼虫の発育
抑制(萎縮)または繁殖率の低下に
よって有益な収穫量の低下を招く昆虫の数を減少させることを意味する。本文中
で使用された「殺虫性」なる用語は、幼虫の致死、幼虫の発育抑制(萎縮)また
は繁殖率の低下によって有益な収穫量の低下を招く昆虫の数を減少させ得る特性
を意味する。
本文中で使用された「構造コーディング配列」なる表現は、DNAからmRN
Aに転写され、次いで所望のポリペプチドに翻訳されて細胞によって産生される
ポリペプチドをコードするDNA配列を意味する。
本文中で使用された「パタチン」なる用語は、後出の配列番号31によってコ
ードされたタンパク質に対して75%以上のホモロジー、好ましくは80%以上
のホモロジー、より好ましくは85%以上のホモロジーを有する植物タンパク質
を意味する。この用語はまた、単子葉植物中で改良発現が得られるように設計さ
れた合成DNA配列から産生されるタンパク質も包含する。発明の詳細な説明
パタチンは、ジャガイモ〔Gaillaird,1971;Racusen,
1984;Andrewsら,1988〕及び他の植物、特にナス科植物〔Ga
nalら,
1991;Vancanneytら,1989〕中に見出されるエステラーゼの
ファミリーである。ジャガイモ中では、パタチンは主として塊茎中に見出される
が、他の植物器官中でも極めて低レベルで検出される〔Hofgen & Wi
llmitzer,1990〕]。数種のパタチンイソ酵素のエステラーゼ基質
特異性が検討され〔Hofgen & Willmitzer,1990;Ra
cusen,1986〕、広い基質特異性を有することが判明し、これらの酵素
の基質要件が少ないことが証明された。本文中に詳細に開示された植物由来のす
べてのパタチン及びその等価物並びにその相同タンパク質を、天然DNA配列に
由来するかまたは合成DNA配列に由来するかにかかわりなく、植物の虫害を防
除するために使用することは、本発明の範囲に包含される。
ジャガイモから得られた粗パタチン調製物は市販されている。例えば、Sig
ma Chemical Company,St.Louis,MOは、Sig
maによって酸ホスファターゼ(P‐1146及びP‐3752)またはアピラ
ーゼ(A‐9149)と命名されたジャガイモタンパク質調製物を供給している
。文献(Racusen
& Foote,1980;Rarkら,1983)に記載の方法でジャガイモ
塊茎を収穫してタンパク質抽出物調製し得る。生物効果アッセイ 人工給餌バイオアッセイ
SCRW、BWV、コロラドハムシ(CPB),Leptinotarsa decemlineata
及びアワノメイガ(ECB),Ostrinia n ubilalis
の幼虫に対する活性アッセイを、Marroneら,1985
がSCRWに関して記載した寒天飼料と同様の寒天飼料上に試験サンプルを重層
することによって行った。4−5mlの10mMのHEPES,pH7.5中で
タンパク質を可溶化し、分子量カットオフ3500のチューブを用いて同じバッ
ファ中で透析することによって試験サンプルを調製した。新生幼虫を処理飼料上
で26℃で養育し、5日または6日後に致死率及び成長萎縮を評価した。P‐3
752(Sigma)のアッセイ結果を表1に示す。この粗ジャガイモ調製物は
、広いスペクトルの殺虫活性を示した。
5日間の接触後のSCRWの重量(表2)及び6日間の接触後のECBの重量
(表3)の正確な定量的測定の結果を以下に示す。P‐3752含有飼料で養育
したSCRW幼虫の体重は対照に比べて92%減量しており、ECB幼虫の体重
は対照に比べて62%減量していた。
サザンウリハムシ(SCRW)及びワタミハナゾウムシ(BWV)に対して活
性のP‐3752の殺虫成分のタンパク質的特性を、熱不安定性、硫安沈殿、分
子サイズ分別、プロテアーゼ感受性の実験で決定した。
P‐3752の効果が摂取パタチンの直接効果に起因するものであり摂食阻害
物質応答に因る間接効果でないことを確認するために、ECB及びSCRWに関
して飼料選択試験を実施した。この選択試験の結果は、P‐3752処理飼料及
びTris処理飼料のいずれに対しても顕著な偏食が生じないことを示した。T
ris処理飼料に比べてP‐3752処理飼料が忌避されるという現象は全くな
かった。
SCRWに対するP‐3752の長期間(25日)アッセイでは、第2虫齢の
幼虫を使用し、生き残った昆虫を新
しく処理した飼料に数回移転させた。試験の終了後、対照幼虫では全部が蛹化し
た。これに比べて処理幼虫ではその50%が死んでおり、残りの50%は初期体
重のわずか16%増(2.48mg対2.14mg)の体重増加を示していた。
これは、幼虫の単なる発育遅延でなく発育停止が生じたことを示す。これは昆虫
防除の見地から重要な結果を齎すものであり、幼虫が成虫期まで発育できないの
で、後代のウリハムシの数が減少するであろう。
ウエスタンウリハムシ(WCRW),Diabrotica virgife ra
については第2虫齢期の幼虫だけを実験室試験に使用できる。WCRWに対
するP‐3752試験を行うために、SCRWの第2虫齢の幼虫も用いた並行ア
ッセイを設計した。P‐3752処理したSCRW及びWCRWの第2虫齢の幼
虫は夫々、13%及び11%だけの体重増加を示した。対照では7日後に、SC
RWが474%、WCRWが200%の体重増加を示した。これは、WCRWに
対するパタチンの活性がSCRWに対するその活性とほぼ等価であることを示唆
する。
P‐3752は、タバコガ幼虫(TBW),Heliothis vires cens
、シロイチモンジヨトウ(B
AW),Spodoptera exigua、オオタバコガ幼虫,Helic overpa
zea、ワタキバガ幼虫,Pectinophora goss ypiella
及びスズメガ幼虫,Manduca sextaに対して僅かに
活性であり、これらの幼虫に対しては、SCRWに評価3の萎縮を与える濃度で
評価1−1.5の萎縮を与えた。P‐3752は、黒ヨトウムシ,Agroti s
ipsilonに対しては評価2.5の萎縮を与えた。(萎縮評価は表1に
定義)。P‐3752は、試験濃度でモモアカアブラムシ,Myzus per sicae
に不活性であった。植物組織バイオアッセイ
(1) ジャガイモ:1gの粗P‐3752を4mlの25mMのTris,p
H7.5バッファに溶解し、次に、0.2μmの膜で透析し濾過した。Trit
on(登録商標)X‐100を添加して0.1%溶液を調製した。ジャガイモの
葉を酵素調製物に浸漬させ、シャーレ内の湿潤濾紙に載せた。CPBの幼虫を加
え、プレートを27℃で3日間インキュベートした。ジャガイモの葉をP‐37
52で処理した結果、CPB幼虫の萎縮及び摂食量の減少が生
じた。アッセイ終了時点で、P‐3752処理葉に比較して対照葉の葉組織の残
存量はかなり少なかった。
(2) トウモロコシ及び綿:Black Mexicanスイートコーンカル
ス(BMS)または綿カルスを寒天プレートから取り出し、50mlの遠心管に
移した。イオン交換クロマトグラフィー(IEC)臨床用遠心機でカルスを設定
目盛8で5分間撹拌し遠心した。上清を傾瀉した。15mlのカルスペレットを
収容している50mlの管に、30mlの液体2%寒天を加えた。完全に混合後
、飼料を昆虫バイオアッセイのアッセイ箇所(assay arena)にピペ
ットで注入した。透析したP‐3752を飼料被覆層(20%容量)として添加
し、上記のようにアッセイを行った。
トウモロコシの根と苗とを切除し、これらに粗P‐3752または25mMの
Tris,pH7.5バッファを真空浸潤(Inflt.)させた。対照サンプ
ルをTrisバッファ中で組織浸漬させた。根の約10−15の試験片または苗
組織の3つの試験片を24ウエル組織培養皿のウエルに入れ、4回反復試験した
。SCRWの4匹の新生幼虫を各ウエルに添加した。アッセイ試料を26℃で4
日間イ
ンキュベートし、この時点で致死率と幼虫の平均体重とを観察した。これらのア
ッセイの結果を表4に示す。
従って、P‐3752を植物組織と同時に摂取させたとき、4種類の昆虫(S
CRW、BWV、CRB及びECB)全部に対して殺虫活性が保持されていた。
これらの給餌試験は、飼料の栄養分が植物組織(根、苗、カルスまたは葉)だけ
から構成されているアッセイにおいてパタチンが殺虫活性であることを示す。作用モード試験
以下の試験は、P‐3752の殺虫活性成分であるパタチンが昆虫自体に直接
作用すること、及び、上記実験で証
明された活性は活性成分が摂食以前の昆虫飼料に作用したためであるとは考えら
れないことを示す。飼料効果試験
1gのP‐3752を10mlの25mMのTris,pH7.6バッファに
溶解し、次いで分子量カットオフ(MWCO)12−14,000の管中でこの
同じバッファに透析した。0.2μmで濾過後、50μlのアリコートを、昆虫
添加の4日前に2つのプレート上の昆虫給餌ウエルに添加した。双方のプレート
を27℃で4日間インキュベートした。インキュベーション後、1つのプレート
を80℃で1時間加熱して酵素を失活させた。50μlのアリコートを第3プレ
ートに添加した。このように、インキュベートしたプレート、インキュベートし
加熱したプレート及びインキュベートしないプレートを用いてSCRWバイオア
ッセイを行った。
飼料のプレインキュベーション試験で得られたSCRW活性を以下に示す。
インキュベートしないP‐3752−6***
インキュベートしたP‐3752−0**
インキュベートし加熱したP‐3752−0
飼料のインキュベーション中にある程度の活性は失われたが、活性の完全な喪
失は熱処理によって生じた。このデータは、直接摂取後作用モードに一致してお
り、植物組織アッセイ及び種々の昆虫に対する変異性と総合的に考察すると、S
CRW及びその他の昆虫に対するタンパク質の活性が給餌効果によるものではな
いことを示す。タンパク質同定
P‐3752から殺虫活性成分を精製し、部分的に配列決定し、特性決定した
。(一種または複数の)活性物質は、ジャガイモの脂質アシルヒドロラーゼのフ
ァミリーであるパタチンであることが同定された。タンパク質単離
P‐3752からSCRW生物活性成分を精製するために異なる4つのプロト
コルを使用した。アニオン交換クロマトグラフィーによるSCRW活性の精製
Q‐セファロース(Pharmacia)アニオン交換クロマトグラフィー及
びMONO‐Q(HR5/5,Pharmacia)アニオン交換クロマトグラ
フィーを順次用いることによって、P‐3752からSCRW活性成分
を精製した。SCRW活性分画中のタンパク質レベルによれば、観察された評価**
の萎縮が飼料のタンパク質濃度31ppmのときに得られたことが判明した。
SDS−PAGEは、活性分画中に3つの主要タンパク質バンド(分子量42,
000、〜26,000及び〜16,000)が存在することを示した。SCRW活性の5段階精製
P‐3752からSCRW活性成分を精製するために連続する5つの精製段階
を使用した。これらの段階は、膜サイジング、硫安沈殿、Q‐セファロースIE
C、S‐セファロースIEC及びP‐200SECから成る。最も精製されたS
CRW活性分画のSDS−PAGEは分子量42,000、〜26,000及び
〜16,000にタンパク質バンドを示した。等電点電気泳動による生物活性の精製
RF3タンパク質分別装置(Rainin)を製造業者の指示通りに使用した
2段階順次処理によって、SCRW生物活性ジャガイモタンパク質を精製した。
SCRW活性分画のSDS−PAGEプロフィルは、5段階精製及びアニオン交
換精製で得られた活性分画中で観察されたプロフ
ィルに極めて類似していた。等電点電気泳動(IEF)ゲルは、pH4.6−5
.1からタンパク質が分別されることを示し、これは報告されたパタチンのpI
範囲と一致する(Racusen & Foote,1980)。
パタチンのイソ酵素を分離するために、RF3上で狭いpH範囲(pH4−5
)の継続的な等電点電気泳動を実施した。予想通り、生物活性のピークはpI4
.6−5.1のタンパク質で観察された。これらの分画は、別々のイソ酵素パタ
ーンを有し、種々の生物活性レベルを有していた。分画中の生物活性は、80−
512ppmの用量で評価*-**の萎縮を伴う致死率0からの範囲であった。生物
活性分画のあるものは主要イソ酵素を2つだけ有しており、これは生物活性のた
めにイソ酵素の複合パターンが必要でないことを示す。天然型PAGEによる精製
P‐3752を天然型条件下に電気泳動させ、(基質としてα‐ナフチルアセ
テートを用いて)エステラーゼ活性のバンドトリプレットを単離した。ゲル精製
したエステラーゼ陽性材料はSCRWに対して活性であり、評価1.5*の萎縮
を生じた。この材料はSDS−PAGEによって
分子量42,000、〜26,000及び〜16,000に主要バンドを生じ、
これは他の精製方法で既に観察されたプロフィルと一致した。この結果から、パ
タチンがジャガイモに由来の殺虫成分であることが更に確認される。アミノ酸配列
アニオン交換精製及び5段階精製で得られたSCRW活性クロマトグラフィー
分画中の全部のタンパク質バンド(分子量42,000、〜26,000及び〜
16,000)上でNH2‐末端アミノ酸配列が得られた。活性分画中の全部の
バンドについて総合的な配列データを作成した。大部分のバンドが、パタチンの
1つのイソ酵素(Stiekemaら,1988)のNH2‐末端(配列番号1
)または内部配列(配列番号7)の15個のアミノ酸の配列に対して85%を上
回るホモロジーを示した。17kDバンドの1つは、パタチンの公表されたNH2
‐末端配列の最初の8個のアミノ酸に対して75%のホモロジーを示した。他
方の17kDバンドは、公表された内部配列の最初の8個のアミノ酸に対して8
5%を上回るホモロジーを示した。これらのバンドは、パタチンのタンパク質分
解産物を示す。イソ酵素の存在は、NH2‐末端配列及び内部配列の双方
の1位及び3位のアミノ酸の変異性によってはっきりと証明される。
N末端アミノ酸配列
公表配列 :KLEEMVTVLSIDGGG (配列1)
バンド1(42kD) :XLGEMVTVLSIDGGG (配列2)
バンド2(28kD) :TLGEMVTVLSIDGGG (配列3)
バンド3(26kD) :TLGEMVTVLSIDGGG (配列4)
バンド4(24kD) :KLXEMVTVLSIDGGG (配列5)
バンド5a(17kD) : XXEEMVTV (配列6)
内部配列 (アミノ酸224位)
公表配列 :SLDYKQMLLLSLGTG (配列7)
バンド5b(17kD) : KLDYKQML (配列8)
バンド6(16kD) :SLXYKQMLLLSLGTG (配列9)
バンド7(15kD) :SLNYKQMLLLSLGTG (配列10)エステラーゼ活性
SCRW活性分画中のエステラーゼ活性を試験するためにいくつかの実験を実
施した。α‐ナフチルアセテート基質
:SDS−PAGE(10−
20%)を使用して、(5段階精製から得られた)SCRW活性分画がエステラ
ーゼ活性を示すか否かを決定した〔Racusen,1984〕。ゲルを二分し
、夫々に加熱及び非加熱のSCRW活性分画のセットを充填した。非加熱サンプ
ルでは分子量55,000の単一のエステラーゼ陽性バンドが観察された。加熱
サンプルでは出発分子量である42,000のバンドが観察され、同時に55,
000のバンドは存在しなかった。この結果は、パタチンのエステラーゼ活性の
電気泳動移動度に関する文献報告(Racusen,1984)と一致する。加
熱サンプル中で分子量55,000のバンドが観察されなかったことは、SDS
中の熱処理がエステラーゼ活性を除去することを示す。分子量55,000のバ
ンドが存在しない加熱サンプル中で出発分子量42,000のバンドはクーマシ
ー染色によって観察された。p‐ニトロフェニル基質特異性試験
p‐ニトロフェニルエステルのシリーズ(C‐2,C‐4,C‐6,C‐8,
C‐10,C‐12,C‐14及びC‐16エステル)を用いた試験によって基
質特異性を決定した。p‐NPのC‐8及びC‐10エステルは他のエ
ステルに比較して、試験した大部分のパタチンのエステラーゼ活性に対して常に
最良の基質であった。脂質エステル基質
(5段階精製で得られた)精製されたSCRW活性分画について複数の脂質に
対する加水分解能力を試験した。各脂質を溶解し、精製されたSCRW活性分画
のアリコートと共にインキュベートした。3つの溶媒展開系(Pernesら,
1980)を用いたTLC(薄層クロマトグラフィー)によってサンプルを分析
した。TLCによって4種類の脂質が顕著な修飾を示した。これらはオレオイル
リゾレシチン、ジオレオイルL‐α‐ホスファチジルコリン、1‐モノリノレノ
イル‐rac‐グリセロール及びジオレイン(Sigma)であった。これらの
脂質/活性分画の反応混合物の有機抽出物中のRf0.37の新しいTLCスポ
ットは、リノール及びオレイン脂肪酸標準との比較によって遊離脂肪酸であると
同定された。従って、SCRW活性材料はこれらの4種類の脂質エステルに対し
てエステラーゼ活性を示す。
トウモロコシの根で養育したWCRWの第3虫齢の幼虫から中腸を摘出した。
中腸脂質を抽出し、溶解し、精製し
たSCRW活性分画と共に中腸のpH(pH6.55)でインキュベートした。
上記方法を用いTLCによってサンプルを分析した。精製したSCRW活性分画
は、中腸のpHでWCRW中腸のリン脂質に対してエステラーゼ活性を示した。
これは、パタチンの殺虫活性に関する可能な作用モードを示す。パタチンの代替ソース
初期実験はいずれも、Minnesota Russet var.Kran
zジャガイモ塊茎から得られた市販の酵素調製物(Sigma)であるP‐37
52を用いて実施したので、新しいジャガイモ塊茎組織から殺虫活性パタチンを
回収できると証明することが望まれていた。本質的に文献(Racusen &
Foote,1980;Parkら,1983)に記載通りに塊茎抽出物を調
製した。3種類の市販のS.tuberosum栽培品種(Russet、De
siree及びLaChipper)と7種類の野生種(S.kurtzian um
、S.berthaultii、S.tarijense、S.acaul e
、S.demissum、S,cardiophyllum及びS.raph anifolium
、すべて
Inter‐Regional Potato Introduction S
tation,USDA,ARS,SturgeonBay,WIから入手)と
を分析した。SDS−PAGE及びウエスタンブロットアッセイによれば全部の
抽出物がパタチン陽性であり、C‐10エステラーゼアッセイによれば全部がエ
ステラーゼ陽性であり、全部がSCRWに対して殺虫活性、すなわち評価2−3
の萎縮を示した。表5参照。この結果から、複数の品種の塊茎から殺虫活性パタ
チンを単離することが可能であり、このクラス全体のタンパク質のうちの多くの
成員が殺虫性を有することを期待し得る。
S.berthaultii、S.kurtzianum及びS.tarij ense
の抽出物を追加の2つの標的昆虫CPB及びECBに対してバイオアッ
セイした。バイオアッセイデータを以下の表6にまとめる。これらの抽出物はC
PBに対する活性をほとんど示さなかったが、ECBの幼虫に対しては1×の適
用量(rate)で中程度から顕著な萎縮を示した。しかしながら、0.1×の
適用量ではECB幼虫に対する活性が全く存在しないことから判るように、これ
らのジャガイモ抽出物に対してECBの幼虫はSCRW幼虫ほど感受性ではなか
った。
9種の異なる植物のゲノムDNAのパタチン相同タンパク質をサザン分析によ
って試験した。配列番号11のα‐32P標識プローブでサザンブロットをプロー
ビングすると、別の数種の植物種中の相同配列の存在が判明した。トウモロコシ
、トマト、テンサイ、イネ及びジャガイモ中で強力なシグナルが得られた。この
実験では個々のバンドの分離はできなかった。しかしながら、スミア(smea
rs)のサイズ及びその強さはこれらの種のすべてにおいて同様であった。ズッ
キーニ、大豆及びナタネ(canola)中でも弱いシグナルが観察され、各植
物種のDNA中に少数の不連続なバンドとして出現した。キュウリ及びArab
idopsisはこの実験で使用した条件下でパタチンプローブとの検出可能な
ハイブリダイゼーションを示さなかった。この理由は恐らく、ゲルの臭化エチジ
ウム染色で観察されたように充填されたDNAが少量であったためであろう。
これらの相同タンパク質のDNA配列は、通常の知識をもつ当業者によって容
易に得ることができ、公知の手段によって植物またはその他の生物に挿入できる
。かかるタンパク質の殺虫性は、例えばバキュロウイルスまたは大腸菌
から異種発現させた後に試験するのが最良である。従って、本発明の方法に使用
し得る別のタンパク質を、公知の方法を用いて通常実験量で取得し、その後に植
物を虫害から保護するために使用してもよい。遺伝子同定
パタチンの遺伝子は複数の研究者によってクローニングされている。Mign
eryら,1984によって開示された配列はGM203と呼ばれた。これは不
完全なシグナル配列を有している。Migneryら,1988は、GM203
を取り囲み、完全なシグナル配列を含むゲノムクローンを同定しPS20と命名
した。PS20のシグナル配列とGM203のcDNAコーディング部分とを用
いて配列番号11を構築し、以後PatA+と呼ぶ。これは更に、NcoI制限
部位とEcoRI制限部位とを翻訳終止コドンの直後に含んでいる。Solanum
tuberosum cv.Russet Burbank
ジャガイモ品種Russet Burbank塊茎から20個のcDNAを単
離し、配列決定した。推定アミノ酸配列は、これらのcDNAが異なる11のパ
タチンイソ酵
素をコードしていることを示す。これらの11のタンパク質は、配列番号11の
PatA+に比較すると約82%から100%の一致を有しており、cDNAの
全長にわたって多数の位置で違いが生じている。異なる11のパタチンイソ酵素
をコードしている異なる11の代表的cDNAの配列を表7に示すように命名す
る。シグナル配列の最初の複数のコドンをコードしている5′ヌクレオチドに対
応する配列番号26及びコーディング配列の3′末端に対応する配列番号27を
プライマーとして用いたPCR手順によってcDNAを以後のクローニング操作
のために加工した。「+」の記号は、天然型シグナルコーディング配列が含まれ
ていることを示す。いくつかのcDNAは完全な天然型シグナルコーディング配
列を含まず、配列番号32及び配列番号27をプライマーとして用いた同様のP
CR手順から成熟タンパク質コーディング配列だけが得られた。成熟タンパク質
コーディング配列の存在を添え字「m」によって示す。
Solanum berthaultii
塊茎mRNAの逆転写及び上記の配列番号26及び27をプライマーとして用
いたPCRを順次行って複相のジャガイモS.berthaultiiからパタ
チンcDNAを単離した。増幅プロセスに起因する同型(duplicate)
クローンの単離を防止するために多数の独立PCR反応を行った。
合計14のパタチンcDNAを部分的に配列決定した。14のcDNA(Pa
t1からPat14まで)の全部がユニーク復ヌクレオチド配列を有すると考え
られ、これはS.berthaultii塊茎中に少なくとも14の異なるパタ
チンmRNAが存在することを示唆する。Pat3+の配列は配列番号28であ
る。Pat10+の配列は配列番号29である。推定アミノ酸配列は、14のc
DNAが少なくとも11の異なるタンパク質をコードしていることを示す。S.berthaultii
塊茎由来のcDNA配列は概して極めて類似していた。
合計367個の残基のうちの12個のアミノ酸位置だけ(3%)が配列変異性を
示した。これらの位置の各々に存在するアミノ酸残基を表8に示す。これらの位
置のうちの5つでは、ユニーク残基を有する変異クローンが1つだけ存在した。
これらの変異はmRNA間の現実の違いを反映するか、またはPCRプロセス中
に生じたエラーの結果であろう。残りの7つの位置では、より大きい変異性が存
在し、少なくとも2つのcDNAが代替アミノ酸を有していた。異なるアミノ酸
配列をもつ9グループの各々がこれらの7つの位置にユニーク残基パターンを有
していた。いくつかの場合には、
164位のThrからSerへの変異のような保存性の変異が生じていた。その
他の場合には、148位へのプロリンの導入のようなより劇的な違いが存在した
。
Solanum cardiophyllum
上記のようにsolanum cardiophyllum塊茎から単離した
mRNAを用いたPCRによって10個のcDNAクローンを作製した。各クロ
ーンの長さの少なくとも75%についてヌクレオチド配列が得られた。Pat1
7+と命名した1つのクローンの全長配列は配列
番号30で示される。配列番号31は、操作された成熟形態のPat17mであ
る。S.cardiophyllumクローンはほぼ等しかったが、ランダムな
ヌクレオチド配列変異だけが存在し、これは現実の違いまたはPCRエラーに起
因するものであろう。しかしながら54位及び519位では、複数のクローンが
等しい変異を有することが観察され、これは、これらの変異が増幅プロセスに起
因するものでないことを示唆する。これらの位置のヌクレオチドパターンは、少
なくとも4つの異なるmRNAが存在していることを示した。cDNAクローン
のこのセットでは、2つのグループのmRNAが複数回単離され、他の2つのグ
ループのmRNAは1回しか単離されなかった。
複数のS.cardiophyllumクローンの推定アミノ酸配列も極めて
類似していた。ユニークアミノ酸配列が8グループ存在し、各グループの配列は
他のグループの配列から1残基違っていた。Pat17+配列に等しいアミノ酸
配列をコードするcDNAクローンを2回回収した。他の7つのcDNA(Pa
t18+、19+、20+、21+、22+、23+及び24+)は単一のユニ
ーク残基を含んでいた。遺伝子形質転換
上述のように、パタチン遺伝子を種々の植物ソースから単離し得る。次に、こ
れらの遺伝子を1種または2種以上用いて細菌細胞または植物細胞を形質転換さ
せパタチンを産生させて本発明の方法を実施するとよい。種々のパタチン配列を
用いた操作方法を以下に説明する。パタチンcDNAの操作
異種宿主細胞中でのパタチンの発現に適したベクターにパタチン遺伝子を組み
込むためには、遺伝子の末端近傍に適正な制限部位を導入することが必要であっ
た。この突然変異誘発の最終目標は、最小の非コーディングフランキング配列を
有するタンパク質コーディング配列を含むカセットを作製し、これらのカセット
を起動するために有用な制限部位を組込むことであった。シグナルペプチドを含
むインタクトなコーディング配列の起動または成熟コーディング配列だけの起動
が得られるようにカセットを設計した。PatAmの場合には、これらのカセッ
トを作製するために2つの突然変異誘発プライマーを設計した。配列番号12に
よる突然変異誘発は、成熟タンパク質のN末端のリシンを2つのアミノ酸(メチ
オニン‐アラニン)で置換し、
NcoI部位を導入し、配列番号13による突然変異誘発は、第2の終止コドン
とEcoRI部位とを付加した。
得られた修飾配列は配列番号14のPatAmであることが同定された。他の
全部のcDNAに対しても、前述のようにPCR、及び、配列番号26及び配列
番号27のプライマー、配列番号32及び配列番号27のプライマーを用いて同
様の修飾及び制限部位の導入を行った。大腸菌中のパタチンの発現
PatAm(配列番号14)のDNAコーディング配列を、recAプロモー
ターとG10リーダ(Olinsら,1989)とを備えたpBR327(So
beronら,1980)由来の大腸菌発現ベクターpMON5766に挿入し
た。得られたベクターpMON19714を大腸菌JM101株内に起動した。
その後、ウエスタンブロット分析及びp‐ニトロフェニルC‐10エステルを用
いるエステラーゼ活性によって確認すると、この菌株はPatAmを産生してい
た。
Pat17mのDNAコーディング配列及びPatAmのDNAコーディング配
列の各々を、AraBADプロモーター(細胞をアラビノース中で増殖させると
きに誘導性)
とG10リーダとアンピシリン耐性マーカー遺伝子とを備えたpMON6235
由来の大腸菌発現ベクターに挿入した。得られたベクター、即ちPat17mを
含むpMON25213及びPatAmを含むpMON25216を大腸菌JM
101株に導入した。
パタチンは形質転換大腸菌によって発現される。しかしながら、B体(RB)
中に区画化されている。インタクトな細胞及び可溶化したRBを使用してSCR
Wアッセイを行った。結果を表9に示す。
植物定着細菌中のパタチンの発現
昆虫を防除するためには、植物定着細菌中で1種またはそれ以上のパタチンを
発現させ、次にこの細菌を植物に散布するのが望ましい。昆虫は植物で養育され
るので、植物コロナイザーによって産生されたパタチンを有毒用量で摂取する。
植物コロナイザーは、シュードモナス,Pseudomonasもしくはアグロ
バクテリウム,Agrobacterium種のように植物表面に棲息するもの
でもよく、またはクラビバクター,Clavibacter種のように植物維管
構造に棲息するものでもよい。表面コロナイザーの場合には、これらのグラム陰
性菌宿主中で複製し得る広宿主域のベクターにパタチン遺伝子を挿入し得る。か
かるベクターの例として、IncQ不適合グループのpKT231〔Bagda
sarianら,1981〕またはIncPグループのpVK100〔Knau
f,1982〕がある。内生増殖体(endophyte)の場合には、相同組
換えによってパタチン遺伝子を染色体に挿入してもよく、または、これらの内生
増殖細菌に染色体を挿入し得る適当なトランスポゾンに遺伝子を組み込んでもよ
い。バキュロウイルス中でのパタチンの発現
1992年9月4日出願の審査中の米国特許出願第07/941,363号に
記載のように、バキュロウイルスドナーベクターpMON14327にパタチン
遺伝子をNcoI/EcoRIフラグメントとしてクローニングした。上記特許
出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ドナーベクターpMON14
327は、アンピシリン耐性遺伝子と、Tn7トランスポゾンの左右のアームと
を含み、これらのアーム間にゲンタマイシン耐性遺伝子と、強力なバキュロウイ
ルスポリヘドリンプロモーターとポリリンカーとを含む。バキュロウイルスシャ
トルベクターまたはバクミド(bacmid)は、lacZ遺伝子内部のインフ
レームのミニattTn′部位とAcNPVウイルスゲノムに組換えられたカナ
マイシン耐性遺伝子とから構成されている。テトラサイクリン耐性ヘルパープラ
スミドpMON7124を用いて、パタチンまたはGUS遺伝子とマーカー遺伝
子とをウイルスゲノム(Luckowら,1993)に転位させることによって
組換えAcNPVウイルスを産生させた。表7に示した遺伝子、並びに、Pat
3+、Pat10+及びPat17+をpMON14327に挿
入した。
米国特許出願第07/941,363号及びLuckowらの手順に従って、
上記遺伝子から多量のパタチンが産生された。ウエスタンブロット分析及びp‐
ニトロフェニルC‐10エステルによるエステラーゼ活性によってパタチンの存
在を確認した。PatAm以外の各イソ酵素をSCRWバイオアッセイのために
少なくとも2倍にした。PatE+及びPatEmの発酵物は終始パタチンの発
現をほとんどまたは全く示さなかったが、他の全部のイソ酵素はバイオアッセイ
に適したレベルで発現されることが観察された。しかしながら、ジャガイモと比
較したバキュロウイルス中のパタチンタンパク質の翻訳後プロセシングの性質を
決定することはできなかった。バキュロウイルスによって発現されたイソ酵素の
抗SCRW生物活性がPat17+、PatB+、PatDm、PatIm、Pa
tL+及びPat3+で観察された。
(バキュロウイルスによって産生された)多数のイソ酵素が昆虫の成長及び発
育に与える影響を測定した。11種のRussetイソ酵素のアリコートを一緒
にして、SCRW、ECB、クロヨトウムシ及びTBWに対する1つの
バイオアッセイ用サンプルを調製した。PatDmは1.7mgしか入手できな
かったがそれ以外のイソ酵素は各10−15mgのQ‐セファロース精製アリコ
ートを使用した。この混合物を用いたアッセイによれば、TBWは100%の致
死率を示し、ECBは93%の減量を示した。従って、各イソ酵素を個別に用い
たアッセイをTBW及びECBに対して実施した。ベクター対照幼虫に比較して
、イソ酵素PatC+、PatL+及びPatImで処理した飼料で養育したT
BW及びECBの幼虫は、有意な萎縮(≧75%)及び/または致死率を示した
。PatB+及びPatDmもTBWを夫々69%及び78%萎縮させた。植物遺伝子構築
二重鎖DNAの形態で存在する植物遺伝子の発現は、RNAポリメラーゼ酵素
によって生じるDNAの1つの鎖からメッセンジャーRNA(mRNA)への転
写と、その後に核内で生じるmRNA一次転写物のプロセシングとを含む。この
プロセシングには、RNAの3′端にポリアデニレートヌクレオチドを付加する
3′非翻訳領域が関与する。DNAからmRNAへの転写は、「プロモーター」
という
通称のDNA領域によって調節される。プロモーター領域は、対応するRNA鎖
を作製するために、DNAと会合し、DNA鎖の一方を鋳型としてmRNAの転
写を開始させるシグナルをRNAポリメラーゼに与える塩基配列を含む。
植物細胞中で活性の多数のプロモーターが文献に記載されている。かかるプロ
モーターは植物または植物ウイルスから得ることができ、その非限定例としては
、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター及びオクトピンシンターゼ(OC
S)プロモーター(これらはAgrobacterium tumefacie
nsの腫瘍誘発プラスミドに保有されている)、カリフラワーモザイクウイルス
(CaMV)の19S及び35Sプロモーター、リブロース‐1,5‐ビス‐ホ
スフェートカルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO、極めて豊
富な植物ポリペプチド)に由来の光誘導プロモーター、及びゴマノハグサ(Fi
gwort)モザイクウイルス(FMV)35Sプロモーターがある。これらの
プロモーターのすべてが、植物中で発現された種々のタイプのDNA構築物を作
製するために使用されている(例えば国際特許出願WO84/02913参照)
。また、昆虫の攻撃に感受性の植物の特
定の部分だけに発現を限定させることも望み得る。例えば、発現を根に限定する
ために根特異的プロモーターを使用してもよく、または根中の活性タンパク質レ
ベルを上昇させるために根促進プロモーターを使用してもよい。根を食う昆虫に
感受性の植物にとってはこのような発現が好ましい。
ある種の植物プロモーターはまた単子葉植物中でより有効であろう。例えば、
国際特許WO91/09948に記載されたイネアクチンプロモーターはトウモ
ロコシ中での発現に有効である。欧州特許第0,342,926号に記載された
トウモロコシユビキチンプロモーターは単子葉植物中でも使用できよう。
本発明のDNA構築物(即ち、キメラ植物遺伝子)中で使用されるプロモータ
ーは、必要な場合、その調節特性を変えるように修飾されてもよい。例えば、C
aMV35Sプロモーターを、光の非存在下にssRUBISCOの発現を抑制
するssRUBISCO遺伝子の部分に結合し、葉中で活性であるが根中では活
性でないプロモーターを作製してもよい。得られたキメラプロモーターを本文中
で記載されたように使用し得る。
従って、本明細書の記載において、「CaMV35S」
プロモーターなる用語は、CaMV35Sプロモーターの変異体、例えば、オペ
レーター領域との結合、ランダムなもしくは調節された突然変異誘発、などに由
来するプロモーターを包含する。更に、プロモーターが遺伝子発現の増進を支援
する多数の[エンハンサー配列]を含むようにプロモーターを変異させてもよい
。かかるエンハンサー配列の例はKayら(1987)によって報告されている
。
選択された特定のプロモーターは、酵素のコーディング配列を十分に発現させ
て有効量のパタチンの産生を実現しなければならない。好ましいプロモーターは
CaMV E35Sプロモーター(増進CaMV35S)である。
本発明のDNA構築物によって産生されるRNAはまた、5′非翻訳リーダー
配列を含む。この配列は、遺伝子を発現するように選択されたプロモーターに由
来し、mRNAの翻訳を増進するように特異的に修飾され得る。5′非翻訳領域
はまた、ウイルスRNA、適当な真核性遺伝子または合成遺伝子配列から得るこ
ともできる。本発明は、プロモーター配列に随伴する5′非翻訳配列に由来する
非翻訳領域を有する構築物に限定されない。
上記に指摘したように、本発明のキメラ植物遺伝子の
3′非翻訳領域は、植物中でRNAの3′端にアデニレートヌクレオチドを付加
させるべく機能するポリアデニレーションシグナルを含む。好ましい3′領域の
例としては、(1)ノパリンシンターゼ(NOS)遺伝子のような、Agrob
acterium腫瘍誘発(Ti)プラスミド遺伝子のポリアデニレートシグナ
ルを含む3′転写非翻訳領域、または、(2)大豆7s貯蔵タンパク質遺伝子及
びエンドウマメssRUBISCO E9遺伝子〔Fischhoffら〕のよ
うな植物遺伝子がある。局在化
上述のパタチンカセットを含むベクターは植物細胞の細胞質または液胞中で活
性タンパク質を発現させる。パタチンの大部分または全部を植物分泌経路に方向
付けるのが望ましいであろう。これを達成するために、細菌遺伝子または植物遺
伝子に由来のシグナル配列を使用するのが有利であろうが、植物遺伝子のほうが
好ましいと予想される。かかるシグナル配列の例としては、エンドプロテイナー
ゼB遺伝子(Koehler & Ho)及びタバコPR1b遺伝子(Corn
elissenら)がある。欧州特許出願公開第0,385,962号に記載さ
れたpMON10
824は、鱗翅類に活性のB.t.kurstakiタンパク質を発現させるよ
うに設計された植物形質転換ベクターである。pMON10824中で、B.t
.k.コーディング配列は、成熟PR1bコーディング配列の10個のアミノ酸
を加えたPR1bシグナル配列に融合している。PR1bシグナルがパタチン遺
伝子に融合したベクターを作製するために、pMON10824をBglII及び
NcoIで切断し、PR1bシグナルを含む短いBglII‐NcoIフラグメン
トを単離する。結合反応では、pMON10824の短いBglII‐NcoIフ
ラグメントを、pMON19714由来の1.0kbのNcoI‐EcoRIフ
ラグメント及びBamHI‐EcoRI消化したpMON19470(Brow
nら)と混合する。この反応で、パタチンコーディング配列がPR1b遺伝子に
由来の分泌シグナルに融合し、CaMV35Sプロモーター及び単子葉植物発現
用イントロンによって駆動されるプラスミドが構築される。双子葉植物遺伝子発
現のためにも同様の反応を使用し得る。双子葉植物発現ベクターのNotI‐N
otIフラグメントを後述するような双子葉植物形質転換ベクターに挿入し、欠
損(disarmed)Agroba
caterium宿主内に起動して双子葉植物の形質転換に使用し得る。従って
、細胞外腔に分泌されるパタチンを産生する植物を作製し得る。
この単子葉植物プラスミドのNotI‐NotIフラグメントをトウモロコシ
形質転換ベクター(例えば上記のpMON18181)に挿入して、パタチンを
分泌するトウモロコシ植物を作製し得る。
パタチンが別の細胞区画である葉緑体に局在するように指令するのが有利であ
ろう。N末端に葉緑体移行ペプチド(CTP)を含ませることによってタンパク
質の葉緑体局在を指令し得る。異種タンパク質を葉緑体に局在させるように操作
されたCTPの一例としては、ArabidopsisのRUBISCO小サブ
ユニット遺伝子に由来のats1Aと呼ばれるCTPがある。B.t.k.タン
パク質の葉緑体局在化に成功するために、この移行ペプチドと、成熟RUBIS
CO配列の23個のアミノ酸とに加えて移行ペプチド開裂部位の反復をコードし
ているこの移行ペプチドの変異体を構築した。Brownらによって記載された
pMON19643は、GOX遺伝子に融合したArabidopsis at
s1A移行ペプチドを含ん
でおり、パタチンを葉緑体に局在させるベクターを構築するための基材として使
用され得る。pMON19643の完全EcoRI消化及び部分NcoI消化を
実施し、大フラグメント(4.0kb)を単離する。結合反応中に、pMON1
9714由来のNcoI‐EcoRIフラグメントをpMON19643の大フ
ラグメントと混合する。この反応で、パタチンコーディング配列が成熟RUBI
SCOの23個のアミノ酸をもつArabidopsis移行ペプチドに融合し
、CaMV E35Sプロモーターによって駆動されるプラスミドが構築される
。または、プロモーターをFMV35Sプロモーターで置換するために同様のプ
ラスミドを構築してもよい。かかるプラスミドを、欠損(disarmed)A
grobacterium宿主に移入し、双子葉植物の形質転換に使用する。ま
たは上述のように、NotI‐NotIフラグメントをトウモロコシ形質転換ベ
クターにクローニングする。その結果、葉緑体に局在するパタチンを産生する植
物が得られる。植物の形質転換及び発現
本発明の構造コーディング配列を含むキメラ植物遺伝子を、適当な任意の方法
によって植物のゲノムに挿入し得る。
適当な植物形質転換ベクターとしては、Agrobacterium tume
faciensのTiプラスミド由来のベクター、並びに、例えばHerrer
a‐Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(19
85)及びEPO出願公開第0,120,516号(Schilperoort
ら)などによって開示されたベクターがある。AgrobacteriumのT
iプラスミドまたは根誘発(Ri)プラスミドに由来の植物形質転換ベクターに
加えて、本発明のDNA構築物を植物細胞に挿入するために別の方法も使用でき
る。かかる方法としては、例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離
DNA取込みを増加させる化学物質、微粒子衝撃(macroprojecti
le bombardment)による遊離DNAのデリバリー、ウイルスまた
は花粉を用いる形質転換などがある。タバコ細胞中でのパタチンの過渡発現
双子葉植物の形質転換に特に有用なプラスミドカセットベクターはpMON1
1794である。発現カセットpMON11794は、CaMV E35Sプロ
モーターとペチュニアHsp70の5′非翻訳リーダーとNOS遺伝子
からのポリアデニレーションシグナルを含む3′未端とから成る。pMON11
794はコーディング配列挿入のためのNcoI部位及びEcoRI部位と植物
遺伝子発現カセットにフランキングするNotI‐NotI部位とを含む。
PatA+(配列番号11)、PatB+(配列番号16)、PatC+(配
列番号17)及びPatG+(配列番号22)の各々をpMON11794に挿
入して、pMON19745、pMON19742、pMON1743及びpM
ON19744を夫々作製した。これらのベクターの各々をタバコ原形質体にエ
レクトロポレートした。形質転換タバコ細胞によるパタチンの発現をウエスタン
ブロット分析によって確認した。双子葉植物の安定な形質転換
パタチン遺伝子による双子葉植物の安定な形質転換はRosahlらによって
報告されている。葉茎特異的プロモーターの調節下にパタチン遺伝子によってタ
バコを形質転換した。パタチンが発現された。
pMON19745からのNotI‐NotIフラグメントを、国際特許出願
WO92/04449にBarryらによって開示及び記載されたTiプラスミ
ドベクターで
あるpMON17227に挿入し、pMON22566を作製した。該特許出願
の記載内容は本明細書に含まれるものとする。このベクターは、形質転換植物を
選択するためにBarryによって記載されたグリホセート(glyphosa
te)耐性遺伝子を含む。同様に、配列番号16、配列番号17及び配列番号2
2を使用してベクターpMON22563、22564及び22565を夫々作
製した。
これらのベクターを欠損(disarmed)Agrobacaterium
ABIに導入し、組織培養物中のトマト外植体の形質転換に使用した。グリホ
セート耐性及び植物再生に基づいて選択後、パタチン遺伝子を発現する全植物を
回収した。パタチン遺伝子の発現はウエスタンブロット分析によって確認され、
予備結果は、総タンパク質の0.1−0.5%のレベルの発現を示す。昆虫幼虫
に関するバイオアッセイは進行中である。トウモロコシ細胞中でのパタチンの過渡発現
上述のpMON19729の1kbのNcoI‐EcoRIフラグメントをp
MON19433に挿入した。このプラスミドは、国際特許出願WO93/19
189及び1992年3月19日出願の審査中の米国特許出願07/
855,857(Brownら)に記載されており、これらの記載内容は本明細
書に含まれるものとする。得られたプラスミドpMON19731をNotIで
消化し、得られたフラグメントを、やはりBrownらによって記載されたpM
ON10081に挿入してpMON19740を作製した。このプラスミドをS
heenら,1991によって記載されたようにしてトウモロコシ葉の原形質体
にエレクトロポレートした。形質転換トウモロコシ原形質体によるパタチンの発
現はウエスタンブロット分析によって確認された。
パタチンの細胞質発現を得るために、pMON19714のNcoI‐Eco
RIフラグメントをpMON19433に挿入してpMON19730を作製し
た。pMON19730のNotIフラグメントをpMON10081に挿入し
、得られたプラスミドpMON19739をトウモロコシ葉の原形質体にエレク
トロポレートすると、原形質体がパタチンを産生することがウエスタンブロット
分析によって確認された。
標的シグナル含有及び非含有のPat17もトウモロコシ原形質体中で発現さ
れた。タンパク質Pat17+(成
熟タンパク質Pat17及び液胞を標的とするためのそれ自体のシグナル配列)
をコードする1.1KbのNcoI‐EcoRIフラグメント(配列番号30)
をpMON19648に挿入することによってpMON19761を構築した。
従って、pMON19761は、CaMV E35SプロモーターとHsp70
イントロンとPat17+遺伝子とトウモロコシ細胞中での発現用NOSターミ
ネーターとを含んでいる。
細胞質発現用ベクターを得るために、pMON19761中のPat17+配
列を、pMON25213からのPat17mタンパク質(配列番号31)をコ
ードするNcoI‐EcoRIフラグメントによって置換して、構築物pMON
25223を作製した。
pMON25224は、2つのフラグメント、即ち、pMON19643(B
rownら)のArabidopsis thaliana SSU 1a遺伝
子(Timkoら)からの原形質体移行ペプチド(CTP)を含む0.3Kbの
XbaI‐NcoIフラグメントと、pMON25213のPat17mの1K
bのNcoI‐EcoRIフラグメントとをpMON19761(XbaI‐E
co
RI)に挿入することによって作製した。従って、pMON25224は、Ca
MV E35SプロモーターとHsp70イントロンとCTP/Pat17mコ
ーディング配列とNOSターミネーターとを含む。
細胞外標的の場合には、分泌タンパク質の細胞外シグナルペプチドをコードす
るエンドプロテイナーゼBのcDNA(Koehler & Ho)の5′端を
、pMON25213からのPat17mの遺伝子に接合した。キメラ遺伝子を
含むBglII‐EcoRIフラグメントを、スプライシングオーバーラップ延長
法(Hortonら)によって作製し、pMON19761(BamHI‐Ec
oRI)に挿入してpMON25225を作製した。
これらの全部の構築物をトウモロコシ葉の原形質体にエレクトロポレートし、
Pat17mの発現をウエスタンブロット分析によって確認した。パタチン遺伝子によるトウモロコシの安定な形質転換
トウモロコシ形質転換ベクターpMON18181をpMON19653及び
pMON19643(Brownら)から構築した。この構築物は、CaMV
E35SプロモーターとHsp70イントロンとCP4グリホセート選択
マーカーとNOSターミネーターとのカセット、CaMV E35Sプロモータ
ーとHsp70イントロンとGOXグリホセート選択マーカーとNOSターミネ
ーターとのカセット、及び、パタチン遺伝子を含む遺伝子発現カセット挿入用の
単一NotI部位を含む。配列番号11及び配列番号30の各々をNotI‐N
otIフラグメントとしてpMON18181に挿入し、pMON19746及
びpMON19764を夫々作製した。
これらのベクターは、Brownらによって記載されたようにバイオリスティ
ック(biolistic)粒子銃を用いた胚形成組織培養細胞の衝撃によって
挿入した。形質転換細胞をグリホセート耐性に基づいて選択し、全植物を再生し
た。ウエスタンブロット分析、エステラーゼ活性アッセイ及び/または虫害耐性
アッセイによれば、虫害耐性植物は総タンパク質の0.2−0.5%で遺伝子を
発現していることが確認された。単子葉植物発現を向上させる合成遺伝子
コーディング配列の修飾は、Bacillus thuringiensis
のデルタ内毒素配列のような別の殺虫性タンパク質遺伝子の発現を向上させるこ
とが判明した
(Fischhoff & Perlak;WO93/07278、Ciba‐
Geigy)。従って、植物、特にトウモロコシ中のパタチン発現を向上させる
ように修飾コーディング配列を設計した。修飾したPat17+配列を配列番号
33に示す。配列番号33を含むDNA配列を合成し、pMON19470(B
rownら)のようなトウモロコシ発現カセットベクターに挿入する。トウモロ
コシ発現カセットを次にpMON18181またはトウモロコシ形質転換用選択
マーカー遺伝子を含む他のトウモロコシ植物形質転換ベクターに挿入すると、P
at17+を発現する完全トウモロコシ植物が得られるであろう。
本発明が、本発明に固有の明白な利点を伴って前記の諸目的を達成するために
極めて適当であることが上述の記載より理解されよう。いくつかの特徴及びサブ
コンビネーションが有用であり、それらは他の特徴及びサブコンビネーションか
ら独立して使用され得ることが理解されよう。このことは請求の範囲から考察す
ることができ請求の範囲に包含される。本発明の範囲を逸脱することなく本発明
の多くの実施態様が可能であろうが、本文中に記載のすべての事項は例示的であ
って限定的ではないことを理解されたい。
本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許の各々
についてそれらが参照によって本明細書に含まれると記載した通り、参照によっ
て本発明に包含される。
参照文献
配列表
配列番号:1
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:2
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:3
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:4
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:5
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:6
配列の長さ:8
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:7
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:8
配列の長さ:8
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:9
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:10
配列の長さ:15
配列の型: アミノ酸
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: ペプチド
配列
配列番号:11
配列の長さ:1171
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:12
配列の長さ:37
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
配列番号:13
配列の長さ:26
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
配列番号:14
配列の長さ:1105
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:15
配列の長さ:1106
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:16
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配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:17
配列の長さ:1175
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:18
配列の長さ:1106
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:19
配列の長さ:1172
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:20
配列の長さ:1106
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:21
配列の長さ:1109
配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:22
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配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:23
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配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:24
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配列の型: 核酸
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配列
配列番号:25
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配列の型:核酸
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トポロジー: 直鎖状
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配列
配列番号:26
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配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
配列番号:27
配列の長さ:33
配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類: 合成DNA
配列
配列番号:28
配列の長さ:1172
配列の型: 核酸
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トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:29
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配列
配列番号:30
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配列
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配列
配列番号:32
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配列の型: 核酸
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配列の種類: 合成DNA
配列
配列番号:33
配列の長さ:1164
配列の型: 核酸
鎖の数: 一本鎖
トポロジー: 直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Detailed Description of the Invention
Insect control methodField of the invention
The present invention applies the protein directly to the plant or the protein on the plant.
Plants are genetically engineered to be produced by microorganisms or produce proteins
Method of supplying protein to plant to control insect damage of plant by modification
, And microorganisms and plants useful in the method.Background of the Invention
The use of natural substances such as proteins is a well-known method for controlling many pests.
Is the law. For example, to control pests of both Lepidoptera and Coleoptera, Bacillus
・ ThuringiensisBacillus thuringiensis(B.
t. ) Endotoxin is used. The genes that produce these endotoxins are
It has been introduced and expressed in various plants such as Baco and tomato. However, B
. t. There are several economically important pests that are not susceptible to endotoxin. This
Examples of such important pests include the boll weevil (BWV),Anthono mus
grandis, And corn rootworm (CRW),Diabrotica
spp. There is. Furthermore, B. t. Insects sensitive to endotoxin
Having another different gene product to control is essential from the standpoint of resistance management.
If not, it is important.
Several other known insecticidal proteins have been found in plants. These ta
The proteins include lectins, amylase inhibitors and protease inhibitors.
There is a bitter. These affect insect growth and development when taken in high doses.
Ruger [Boulter et al., 1989; Broadway & Duffey, 1
986; Czapla & Lang, 1990; Gatehouse et al., 19
86; Heusing et al., 1991; Ishimoto & K .; Kitamu
Ra, 1989; Murdock et al., 1990; Shukle & Murdo.
ck, 1983], B.I. t. It does not show a fast-acting biocidal effect like proteins.
An object of the present invention is a protein capable of controlling BWV, CRW or other pests.
And to provide genes useful for the production of such proteins. The present invention
Another purpose of the gene structure is to insert such genetic material into microorganisms and plant cells.
It is to provide a construction and insertion method. Yet another object of the present invention is to provide such genetics.
It is to provide a transformed microorganism and a plant having a substance.Summary of the invention
Patatin, the main storage protein of potato tubers, is
Shi (WCRW),Diabrotica virgifera, Southern Uriham
SI (SCRW),Diabrotica undecimpunctataas well as
Boll Weevil (BWV),Anthonomus grandisSuch as
It has been found to control a variety of insects. Patatin kills larvae to some extent
Cause the growth of surviving larvae to atrophy and prevent or severely suppress its maturation
And stop breeding completely. These proteins are esterases (lipid acyl
Hydrolase) activity, and may be applied directly to plants,
Or another method, for example plant colonization transformed to produce this enzyme.
It may be supplied by a microorganism, or a plant which has been similarly transformed.
Patatin is potato [Gaillaird, 1971; Racusen,
1984; Andrews et al., 1988] and other plants, especially Solanaceae [Ga.
Tan et al., 1991; Vancanneyt et al., 1989].
It is a family of quality. Pas in potatoes
Tatin is found primarily in tubers, but at very low levels in other plant organs.
Detected [Hofgen & Willmitzer, 1990]. Several kinds of patterns
The esterase substrate specificity of the tin isoenzyme has been studied [Hofgen &
Willmitzer, 1990; Racusen, 1986].
The gene encoding patatin is described in Mignery et al., 1984, Migner.
Y. et al., 1988, Stiekema et al., 1988 and others.
Has been isolated. Rosahl et al., 1987 transferred patatin to tobacco plants.
Then, the expression of patatin was observed. In this test, the patatin gene varies from plant to plant.
It has been proved that the species can be expressed.
The patatin gene was similarly isolated and inserted into an appropriate transformation vector cassette,
Next, the vector cassette is used to (1) generate a patatin-producing gene when applied to plants.
To transform plant-establishing microorganisms to control insects, or
(2) the plant itself expresses a gene and produces patatin, and
It integrates into the plant's genome to protect against aggression. In addition, insect control proteins
Co
One or more types of B. t. Transform or produce plants to co-express the gene
You may improve the seed. This results in (1) protection from a wide range of pests and
And / or (2) a plant with two modes of action against certain pests
This is an important tool in resistance management. B. t. Express the gene
An example of a plant transformed in this way is [Fischho, filed on Feb. 12, 1990].
ff et al.), European Patent Application Publication No. 0, corresponding to US Patent Application No. 476,661.
No. 386,962. The descriptions of these documents are included in this specification.
Shall be provided. In addition, proteinase inhibitors are among other insecticidal proteins.
Potato papain inhibitor has been found to have a synergistic effect with activity.
Tar [Rodis & Hoff, 1984] or soybean trypsin inhibitor
-Multiple proteinases such as genes encoding [Ryan, 1990]
Transforming or breeding plants to co-express the ze inhibitor gene
Good.
To achieve the above, one object of the present invention is to provide an effective amount of killing insects to ingest.
To provide a method for controlling insect damage to plants, which comprises supplying insect patatin.
. This way
Thus, a plant-fixing microorganism transformed to express the patatin gene was prepared.
Then, this was introduced into a plant to express the gene and produce an effective insecticidal amount of patatin.
You can This method also includes the plant to be protected by the following DNA molecule:
It may be transfectively transformed. The DNA molecule is
(I) a promoter that functions to produce the RNA sequence in plant cells,
(Ii) a structural coding sequence encoding patatin,
(Iii) Polyadenylate nucleotides at the 3'end of the RNA sequence in the plant cell
And a 3'untranslated region that functions to add
Heterologous to the coding sequence, the promoter is the structural coding sequence
Operably linked to the column and the structural coding sequence is operably linked to the untranslated region.
Are combined as possible. Preferably the plant contains about 0.1-0.5% of the total protein.
Will express levels of patatin.
The present invention also relates to genetically transformed insect resistant corn, cotton, tomato.
And potato plants.
The expression "controlling insect damage" used in the text means lethal larvae and larval development.
To suppress (atrophy) or decrease the reproductive rate
This means reducing the number of insects that result in a beneficial yield loss. In the text
The term "insecticidal" as used in is used for larval lethality, larval stunting (atrophy) and
Traits that can reduce the number of insects that lead to beneficial yield loss due to reduced reproduction
Means
As used herein, the expression "structural coding sequence" refers to DNA to mRN.
Produced by cells transcribed into A and then translated into the desired polypeptide
By a DNA sequence that encodes a polypeptide.
As used herein, the term "patatin" refers to SEQ ID NO: 31 below.
75% or more homology to the loaded protein, preferably 80% or more
Plant protein having a homology of, more preferably 85% or more
Means The term is also designed for improved expression in monocots.
Also included are proteins produced from the synthesized synthetic DNA sequences.Detailed Description of the Invention
Patatin is potato [Gaillaird, 1971; Racusen,
1984; Andrews et al., 1988] and other plants, especially Solanaceae [Ga.
nal,
1991; Vancanneyt et al., 1989].
It is a family. In potato, patatin is found mainly in tubers
Is detected at extremely low levels in other plant organs [Hofgen & Wi
llmitzer, 1990]]]. Esterase substrates for several patatin isoenzymes
Specificity was investigated [Hofgen & Willmitzer, 1990; Ra.
cusen, 1986], found to have a broad substrate specificity, these enzymes
Substrate requirements have been demonstrated to be low. The plant-derived chairs disclosed in detail herein.
All patatins and their equivalents and their homologous proteins are incorporated into the natural DNA sequence.
Prevents insect damage to plants, whether derived from synthetic DNA sequences or derived
Use to remove is within the scope of the present invention.
Crude patatin preparations obtained from potatoes are commercially available. For example, Sig
ma Chemical Company, St. Louis, MO is Sig
acid phosphatase (P-1146 and P-3752) or apra by ma
Is supplying a potato protein preparation, designated as
. Literature (Racusen
& Foote, 1980; Rank et al., 1983).
The tubers may be harvested to prepare a protein extract.Biological effect assay Artificial feeding bioassay
SCRW, BWV, Colorado potato beetle (CPB),Leptinotarsa decemlineata
And Awanomeiga (ECB),Ostrinia n ubilalis
Activity assay against larvae of Marone et al., 1985.
Overlay test sample on an agar feed similar to that described for SCRW.
I went by. In 4-5 ml of 10 mM HEPES, pH 7.5
Solubilize the protein and use the same molecular weight cut-off 3500 tube in the same bag.
Test samples were prepared by dialysis in fa. Newborn larvae treated on feed
It was cultivated at 26 ° C. for 5 days or 6 days, and the mortality rate and growth atrophy were evaluated. P-3
The assay results for 752 (Sigma) are shown in Table 1. This crude potato preparation
, Showed a broad spectrum of insecticidal activity.
Weight of SCRW after 5 days of contact (Table 2) and weight of ECB after 6 days of contact
The results of accurate quantitative measurement of (Table 3) are shown below. Reared with feed containing P-3752
The weight of the SCRW larvae was 92% lower than that of the control, and the body weight of the ECB larvae was
Had 62% less weight than the control.
Active against southern corn beetle (SCRW) and boll weevil (BWV)
Of the pesticidal component of P-3752, which is heat-labile, ammonium sulfate-precipitated,
The size of the offspring was determined by a protease sensitivity experiment.
The effect of P-3752 is due to direct effect of ingested patatin
To confirm that it is not an indirect effect due to the substance response, the ECB and SCRW
Then, a feed selection test was carried out. The results of this selection test are based on P-3752 treated feed and
It was shown that no significant unbalanced diet was produced in any of the diets treated with Tris and Tris. T
There is no phenomenon that P-3752 treated feed is repelled compared to ris treated feed.
won.
A long-term (25-day) assay of P-3752 for SCRW showed that
Use larvae to refresh the surviving insects
It was transferred several times to freshly treated feed. After the end of the test, the control larvae were all pupated
It was Compared to this, 50% of the treated larvae are dead, and the remaining 50% are primary.
There was only 16% gain in weight gain (2.48 vs 2.14 mg).
This indicates that the larvae were stunted rather than merely stunted. This is an insect
It has important consequences from the standpoint of control, because the larvae cannot develop until the adult stage.
Then, the number of the root beetle in the offspring will decrease.
Western Black Beetle (WCRW),Diabrotica virgife ra
For, only second-instar larvae can be used for laboratory testing. Against WCRW
Parallel 3rd instar larvae of SCRW were also used to perform the P-3752 test.
Designed a essay. Second-instar larvae of SCRW and WCRW treated with P-3752
The worms showed weight gains of only 13% and 11%, respectively. After 7 days in control, SC
Weight gain was 474% for RW and 200% for WCRW. This is WCRW
Suggests that the activity of patatin against SCRW is almost equivalent to its activity against SCRW
To do.
P-3752 is a tobacco moth larva (TBW),Heliothis vires cens
, Shiroichimonjiyoto (B
AW),Spodoptera exigua, LarvaHelic overpa
zea, Larva of the cottonweed,Pectinophora goss ypiella
And larvaeManduca sextaSlightly against
Active and against these larvae at concentrations that give SCRW an atrophy of 3
Atrophy of rating 1-1.5 was given. P-3752 is a black weevil,Agroti s
ipsilonWas given an atrophy of 2.5. (Table 1 shows the atrophy evaluation
Definition). P-3752 is a peach aphid,Myzus per sicae
Was inactive.Plant tissue bioassay
(1) Potato: 1 g of crude P-3752 was added to 4 ml of 25 mM Tris, p.
It was dissolved in H7.5 buffer, then dialyzed against a 0.2 μm membrane and filtered. Trit
on® X-100 was added to prepare a 0.1% solution. Potato
The leaves were dipped in the enzyme preparation and placed on wet filter paper in a petri dish. Add CPB larvae
The plates were incubated at 27 ° C for 3 days. P-37 potato leaves
As a result of treatment with 52, atrophy of CPB larvae and a decrease in food intake were observed.
I started. At the end of the assay, the residual leaf tissue of the control leaves compared to the P-3752 treated leaves
The amount was quite small.
(2) Corn and cotton: Black Mexican sweet corn cal
Remove the BMS or cotton callus from the agar plate and place in a 50 ml centrifuge tube.
Moved. Ion exchange chromatography (IEC) clinical centrifuge sets callus
The mixture was stirred on the scale 8 for 5 minutes and centrifuged. The supernatant was decanted. 15 ml callus pellet
To a 50 ml tube containing 30 ml of liquid 2% agar was added. After mixing thoroughly
, Pipe the feed to the assay area of the insect bioassay (assay arena)
Injected. Add dialyzed P-3752 as a feed coating layer (20% volume)
And assayed as described above.
The corn roots and seedlings were excised and the crude P-3752 or 25 mM
Tris, pH 7.5 buffer was vacuum infiltrated (Inflt.). Contrast sump
Were soaked in Tris buffer. Approximately 10-15 test pieces or seedlings of roots
Three test pieces of tissue were placed in the wells of a 24-well tissue culture dish and repeated 4 times
. Four newborn larvae of SCRW were added to each well. Assay samples at 4 ° C for 4
A day
Incubate and observe mortality and average larval weight at this time. These a
The results of the assay are shown in Table 4.
Therefore, when P-3752 was ingested at the same time as plant tissue, four kinds of insects (S
The insecticidal activity was retained against all CRW, BWV, CRB and ECB).
These feeding tests are based on the fact that the only nutrients in the feed are plant tissues (roots, seedlings, callus or leaves).
Shows that patatin is pesticidal in an assay consisting ofWorking mode test
The following test shows that patatin, which is the insecticidal active ingredient of P-3752, directly affects the insect itself.
It works and is proved by the above experiment.
The activity revealed may be due to the active ingredient acting on the insect feed before feeding.
Indicates that it is not possible.Feed effect test
1 g of P-3752 was added to 10 ml of 25 mM Tris, pH 7.6 buffer.
Dissolve and then in a tube with a molecular weight cutoff (MWCO) of 12-14,000
Dialyzed into the same buffer. After filtration through 0.2 μm, a 50 μl aliquot was added to the insect
Added to insect-fed wells on two plates 4 days before addition. Both plates
Were incubated at 27 ° C for 4 days. After incubation, one plate
Was heated at 80 ° C. for 1 hour to inactivate the enzyme. Add a 50 μl aliquot to the third pre-plate
Added to the tray. Like this, incubate the plate, incubate
The SCRW bioreactor using heated and non-incubated plates
I made a essay.
The SCRW activity obtained in the feed pre-incubation test is shown below.
Not incubated P-3752-6***
Incubated P-3752-0**
Incubated and heated P-3752-0
Although some activity was lost during feed incubation, complete loss of activity
The loss was caused by heat treatment. This data is consistent with the post-ingestion mode of action.
Considering the plant tissue assay and variability to various insects comprehensively, S
Protein activity against CRW and other insects is not due to feeding effects
Indicate thatProtein identification
Purified insecticidal active ingredient from P-3752, partially sequenced and characterized
. The active substance (s) is a lipid acylhydrolase enzyme of potato.
It has been identified to be the patatin that is the Amily.Protein isolation
Four different protocols for purifying SCRW bioactive components from P-3752
I used col.Purification of SCRW activity by anion exchange chromatography
Q-Sepharose (Pharmacia) anion exchange chromatography and
And MONO-Q (HR5 / 5, Pharmacia) anion exchange chromatograph
S-active ingredients from P-3752 by sequentially using the fee
Was purified. According to the protein level in the SCRW active fraction, the evaluations observed**
Was found to be obtained when the protein concentration of the feed was 31 ppm.
SDS-PAGE shows three major protein bands (molecular weight 42,
000, ˜26,000 and ˜16,000).5-step purification of SCRW activity
Five consecutive purification steps to purify the SCRW active ingredient from P-3752
It was used. These steps are membrane sizing, ammonium sulfate precipitation, Q-sepharose IE
It consists of C, S-Sepharose IEC and P-200SEC. Most refined S
The SDS-PAGE of the CRW active fraction had a molecular weight of 42,000, 26,000 and 26,000.
A protein band was shown at ˜16,000.Purification of biological activity by isoelectric focusing
RF3 protein fractionator (Rainin) was used as per manufacturer's instructions
The SCRW bioactive potato protein was purified by a two-step sequential treatment.
The SDS-PAGE profile of the SCRW active fraction was purified by 5 steps and anion exchange.
Profiles observed in the active fraction obtained by recombinant purification
Was very similar to Isoelectric focusing (IEF) gel has a pH of 4.6-5.
. 1 showed that the protein was fractionated, which was the reported patatin pI
Matches the range (Racusen & Foote, 1980).
In order to separate the patatin isoenzymes, a narrow pH range (pH 4-5) was used on RF3.
) Was carried out continuously. As expected, the peak of biological activity is pI4
. It was observed with proteins 6-5.1. These fractions contain different isoenzyme patterns.
Had different levels of bioactivity. The biological activity in the fraction is 80-
Evaluated at a dose of 512 ppm*-**The mortality rate with atrophy was 0 to. Creature
Some of the active fractions have only two major isoenzymes, which are bioactive.
Therefore, we show that the complex pattern of isoenzymes is not required.Purification by natural PAGE
P-3752 was electrophoresed under native conditions, and α-naphthylacetate was used as the substrate.
A band triplet of esterase activity was isolated (using tate). Gel purification
The esterase-positive material was active against SCRW and was evaluated to be 1.5.*Atrophy
Occurred. This material is by SDS-PAGE
Major bands at molecular weights 42,000, ~ 26,000 and ~ 16,000,
This was consistent with the profiles already observed with other purification methods. From this result,
It is further confirmed that tachin is an insecticidal ingredient derived from potato.Amino acid sequence
SCRW activity chromatography obtained by anion exchange purification and 5-step purification
All protein bands in the fraction (molecular weight 42,000, ~ 26,000 and ~
16,000) on NH2The -terminal amino acid sequence was obtained. All of the active fraction
Comprehensive sequence data was created for the bands. Most of the bands are patatin
NH of one isoenzyme (Stiekema et al., 1988)2-Terminal (SEQ ID NO: 1
) Or 85% above the 15 amino acid sequence of the internal sequence (SEQ ID NO: 7)
It showed a rotating homology. One of the 17kD bands is the published NH of patatin2
-Showed 75% homology to the first 8 amino acids of the terminal sequence. other
The 17 kD band on the other hand is 8 for the first 8 amino acids of the published internal sequence.
It showed a homology of more than 5%. These bands are the components of patatin protein.
Denotes a degradant. The presence of the isoenzyme is NH2-Both terminal and internal sequences
Clearly demonstrated by the variability of the amino acids at positions 1 and 3 of
N-terminal amino acid sequence
Published sequence: KLEEMVTVLSIDGGG (Array 1)
Band 1 (42kD): XLGEMVTVLSIDGGG (Array 2)
Band 2 (28kD): TLGEMVTVLSIDGGG (Array 3)
Band 3 (26kD): TLGEMVTVLSIDGGG (Array 4)
Band 4 (24kD): KLXEMVTVLSIDGGG (Array 5)
Band 5a (17kD): XXEEMVTV (Array 6)
Internal array (224th amino acid)
Published sequence: SLDYKQMLLLSLGTG (Array 7)
Band 5b (17kD): KLDYKQML (Array 8)
Band 6 (16kD):SLXYKQMLLLSLGTG (Array 9)
Band 7 (15kD):SLNYKQMLLLSLGTG (Array 10)Esterase activity
Several experiments were performed to test the esterase activity in the SCRW activity fraction.
gave.α-naphthyl acetate substrate
: SDS-PAGE (10-
20%), the SCRW active fraction (obtained from the 5 step purification) was
It was determined whether or not it exhibited a laccase activity [Racusen, 1984]. Divide the gel in two
Each was loaded with a set of heated and unheated SCRW active fractions. Unheated sump
A single esterase-positive band with a molecular weight of 55,000 was observed in the sample. heating
In the sample, a band with a starting molecular weight of 42,000 was observed, and at the same time, 55,
There were no 000 bands. This result shows that the esterase activity of patatin
Consistent with the literature report on electrophoretic mobility (Racusen, 1984). Addition
No band with a molecular weight of 55,000 was observed in the heat sample, indicating that SDS
It is shown that heat treatment in removes esterase activity. Molecular weight of 55,000
The band with a starting molecular weight of 42,000 is coomassed in the heated sample without
-Observed by staining.p-nitrophenyl substrate specificity test
Series of p-nitrophenyl esters (C-2, C-4, C-6, C-8,
C-10, C-12, C-14 and C-16 ester)
The quality specificity was determined. The C-8 and C-10 esters of p-NP are other
For most patatins tested, the esterase activity was always
It was the best substrate.Lipid ester substrate
Purified SCRW active fraction (obtained by 5 step purification)
The ability to hydrolyze was tested. Purified SCRW active fraction by dissolving each lipid
Incubated with an aliquot of Three solvent development systems (Pernes et al.,
Analyze the sample by TLC (Thin Layer Chromatography) using 1980)
did. Four lipids showed significant modification by TLC. These are ole oil
Lysolecithin, dioleoyl L-α-phosphatidylcholine, 1-monolinoleno
Ill-rac-glycerol and diolein (Sigma). these
New TLC Spores of Rf 0.37 in Organic Extract of Reaction Mixture of Lipid / Active Fraction
Is a free fatty acid by comparison with linole and olein fatty acid standards.
Identified. Therefore, the SCRW active material is suitable for these four lipid esters.
Shows esterase activity.
The midgut was excised from WCRW third-instar larvae reared in corn roots.
Midgut lipids are extracted, dissolved and purified
Incubated at midgut pH (pH 6.55) with the SCRW active fraction.
Samples were analyzed by TLC using the method described above. Purified SCRW active fraction
Showed esterase activity on WCRW midgut phospholipids at midgut pH.
This represents a possible mode of action for the insecticidal activity of patatin.Alternative source of patatin
All initial experiments were conducted by Minnesota Russet var. Kran
P-37, a commercial enzyme preparation (Sigma) obtained from potato potato tubers
No. 52 was used, so the insecticidal activity patatin was obtained from new potato tuber tissue.
It was desired to prove that it could be recovered. In essence the literature (Racusen &
Prepare the tuber extract as described in Foote, 1980; Park et al., 1983).
Made. Three commercially available S.tuberosumCultivars (Russet, De
siree and LaChipper) and 7 wild species (S.Kurtzian um
, S.berthaultii, S.tarijense, S.acaul e
, S.demissum, S,cardiophyllumAnd S.raph anifolium
,all
Inter-Regional Potato Induction S
station, USDA, ARS, Sturgeon Bay, WI).
Was analyzed. According to SDS-PAGE and Western blot assay
The extract was patatin positive and all were found to be
Sterase positive, all insecticidal activity against SCRW, ie score 2-3
Showed atrophy. See Table 5. From this result, it was confirmed that the insecticidal activity patterns were
It is possible to isolate tin, and to analyze many of the proteins in this class.
It can be expected that the members will have insecticidal properties.
S.berthaultii, S.KurtzianumAnd S.tarij ense
Extracts from the two biomarkers against two additional target insects, CPB and ECB.
I made it. The bioassay data is summarized in Table 6 below. These extracts are C
Although it showed almost no activity against PB, 1X was suitable for larvae of ECB.
There was moderate to significant atrophy at the rate. However, 0.1 ×
As seen from the absence of any activity against ECB larvae at the applied dose, this
ECB larvae are not as susceptible to SCRW larvae to their potato extracts?
It was.
Southern analysis of patatin homologous proteins in the genomic DNA of 9 different plants.
I tested. Α-of SEQ ID NO: 1132Probe Southern blot with P-labeled probe
Bing revealed the presence of homologous sequences in several other plant species. corn
Strong signals were obtained in tomato, tomato, sugar beet, rice and potato. this
In the experiment, the individual bands could not be separated. However, smear
The size of rs) and its strength were similar in all of these species. Zut
Weak signals were also observed in kini, soybeans and rape (canola).
It appeared as a few discontinuous bands in the DNA of the species. Cucumber and Arab
idopsis is detectable with patatin probe under the conditions used in this experiment
It showed no hybridization. The reason for this is probably that
Probably due to the small amount of DNA loaded as observed with Um staining.
The DNA sequences of these homologous proteins can be found by one of ordinary skill in the art.
Easy to obtain and insert into plants or other organisms by known means
. The insecticidal properties of such proteins can be determined, for example, by baculovirus or E. coli.
Is best tested after heterologous expression from. Therefore, it is used in the method of the present invention.
Another possible protein is obtained in a routine amount using known methods and then planted.
May be used to protect items from insect damage.Gene identification
The patatin gene has been cloned by several researchers. Mign
The sequence disclosed by ery et al., 1984 was called GM203. This is not
It has a complete signal sequence. Mignery et al., 1988, GM203.
The genomic clone that surrounds and contains the complete signal sequence was identified and named PS20.
did. Uses PS20 signal sequence and GM203 cDNA coding portion
SEQ ID NO: 11 was constructed and is hereinafter referred to as PatA +. This further limits NcoI
A site and an EcoRI restriction site are included immediately after the translation stop codon.Solanum
tuberosum cv. Russet Burbank
20 cDNAs were extracted from potato cultivar Russet Burbank tubers.
Separated and sequenced. The deduced amino acid sequence has 11 sequences that differ in these cDNAs.
Tachiniso fermentation
Indicates that the element is coded. These 11 proteins are SEQ ID NO: 11
Compared to PatA +, it has about 82% to 100% concordance,
Differences occur at many locations along the length. 11 different patatin isoenzymes
The sequences of 11 different representative cDNAs encoding
It A pair of 5'nucleotides encoding the first multiple codons of the signal sequence
The corresponding SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 corresponding to the 3'end of the coding sequence
Subsequent cloning operation of cDNA by PCR procedure used as a primer
Processed for. The “+” sign includes the native signal coding sequence.
Indicates that Some cDNAs contain a complete native signal coding sequence.
Similar P using no SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 27 as primers
Only the mature protein coding sequence was obtained from the CR procedure. Mature protein
The presence of the coding sequence is indicated by the subscript "m".
Solanum Berthaultii
Reverse transcription of tuber mRNA and use of SEQ ID NOs: 26 and 27 above as primers
PCR of the two-phase potato S.berthaultiiFrom patter
Chin cDNA was isolated. Duplicate resulting from the amplification process
A number of independent PCR reactions were performed to prevent the isolation of clones.
A total of 14 patatin cDNAs were partially sequenced. 14 cDNAs (Pa
(t1 to Pat14) all have unique nucleotide sequences
This is the S.berthaultiiAt least 14 different patterns in the tuber
Suggests the presence of tin mRNA. The sequence of Pat3 + is SEQ ID NO: 28.
It The sequence of Pat10 + is SEQ ID NO: 29. The deduced amino acid sequence is 14 c.
It shows that the DNA encodes at least 11 different proteins. S.berthaultii
The tuber-derived cDNA sequences were generally quite similar.
Only 12 amino acid positions (3%) out of a total of 367 residues show sequence variability.
Indicated. The amino acid residues present at each of these positions are shown in Table 8. These ranks
In 5 of the positions there was only 1 mutant clone with a unique residue.
These mutations may reflect real differences between mRNAs or during the PCR process
It could be the result of an error that occurred in. Greater variability exists in the remaining 7 positions
Was present and at least two cDNAs had alternative amino acids. Different amino acids
Each of the 9 groups of sequences has a unique residue pattern at these 7 positions.
Was. In some cases,
A conservative mutation such as the Thr to Ser mutation at position 164 occurred. That
In other cases there were more dramatic differences such as the introduction of proline at position 148.
.
Solanum cardiophyllum
as mentioned abovesolanum cardiophyllumIsolated from tuber
Ten cDNA clones were prepared by PCR using mRNA. Each black
Nucleotide sequences were obtained for at least 75% of the length of the region. Pat1
The full length sequence of one clone named 7+ is the sequence
It is shown by the number 30. SEQ ID NO: 31 is the engineered mature form of Pat17mAnd
It S.cardiophyllumThe clones were almost equal, but random
Only nucleotide sequence variations exist, which may be due to real differences or PCR errors.
It may be due to it. However, at positions 54 and 519, multiple clones
It was observed to have equal mutations, which caused these mutations to be involved in the amplification process.
Suggest that it is not the cause. The nucleotide pattern at these positions has a small
It was shown that at least 4 different mRNAs were present. cDNA clone
In this set of, two groups of mRNAs were isolated multiple times and two other groups were isolated.
Loop mRNA was isolated only once.
Multiple S.cardiophyllumThe deduced amino acid sequence of the clone is also extremely
It was similar. There are 8 groups of unique amino acid sequences, and the sequences of each group are
It differs from the sequences of the other groups by one residue. Amino acid equivalent to Pat17 + sequence
The cDNA clone encoding the sequence was recovered twice. 7 other cDNAs (Pa
t18 +, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ and 24+) is a single unit.
Contained a sigma residue.Gene transformation
As mentioned above, the patatin gene can be isolated from various plant sources. Then this
One or more of these genes are used to transform bacterial cells or plant cells.
It is advisable to produce patatin to carry out the method of the present invention. Various patatin sequences
The operating method used is described below.Manipulation of patatin cDNA
Incorporating the patatin gene into a vector suitable for expression of patatin in heterologous host cells
In order to integrate it, it is necessary to introduce an appropriate restriction site near the end of the gene.
It was The goal of this mutagenesis is to minimize the non-coding flanking sequences.
Producing cassettes containing protein coding sequences having
Was to incorporate a useful restriction site to activate the. Contains signal peptide
Invoke intact coding sequences or only mature coding sequences
The cassette was designed so that PatAmIn the case of these cassettes
Two mutagenic primers were designed to generate Sequence number 12
Mutagenesis by means of lysine at the N-terminus of the mature protein is a two amino acid (meth)
Onine-alanine),
An NcoI site was introduced and mutagenesis with SEQ ID NO: 13 resulted in a second stop codon.
And EcoRI site were added.
The resulting modified sequence is PatA of SEQ ID NO: 14.mWas identified. other
As described above, PCR and SEQ ID NO: 26 and sequence were also applied to all cDNAs.
No. 27 primer, No. 32 and No. 27 primer were used.
Similar modifications and restriction sites were introduced.Expression of patatin in E. coli
PatAmThe DNA coding sequence of (SEQ ID NO: 14) was added to the recA promoter.
And a G10 reader (Olins et al., 1989), pBR327 (So
beron et al., 1980) and inserted into the E. coli expression vector pMON5766.
It was The obtained vector pMON19714 was activated in Escherichia coli JM101 strain.
Then use Western blot analysis and p-nitrophenyl C-10 ester
This strain was found to be PatAmIs producing
It was
Pat17mDNA coding sequence and PatAmDNA coding
Each of the rows is labeled with the AraBAD promoter (when cells are grown in arabinose
Kininiki)
And pMON6235 with G10 leader and ampicillin resistance marker gene
It was inserted into the original E. coli expression vector. The resulting vector, Pat17mTo
Including pMON25213 and PatAmContaining pMON25216 in E. coli JM
Introduced into 101 strains.
Patatin is expressed by transformed E. coli. However, B body (RB)
It is compartmentalized inside. SCR using intact cells and solubilized RB
W assay was performed. The results are shown in Table 9.
Expression of patatin in plant colonizing bacteria
To control insects, one or more patatins in plant colonizing bacteria
It is desirable to express and then spread this bacterium to plants. Insects are nurtured by plants
Therefore, the patatin produced by the plant colonizer is taken in a toxic dose.
Plant colonizers can be Pseudomonas, Pseudomonas or Aggro
Bacteria that live on the surface of plants, such as Agrobacterium sp.
Or, as in Claviobacter, Clavobacter species, plant vascular
It may be one that lives in the structure. In the case of surface colonizers, these gram shades
The patatin gene may be inserted into a broad host range vector capable of replicating in a sex host. Or
An example of such a vector is pKT231 [Bagda of the IncQ incompatibility group.
sarian et al., 1981] or pVK100 [Knau of the IncP group.
f, 1982]. In the case of an endophyte, a homologous set
The patatin gene may be inserted into the chromosome by replacement, or
The gene may be integrated into a suitable transposon that can insert the chromosome into a growing bacterium.
Yes.Expression of patatin in baculovirus
In pending US patent application Ser. No. 07 / 941,363 filed Sep. 4, 1992
Patatin was added to the baculovirus donor vector pMON14327 as described.
The gene was cloned as an NcoI / EcoRI fragment. The above patent
The description of the application is included in the present specification. Donor vector pMON14
327 is the ampicillin resistance gene and the left and right arms of the Tn7 transposon
Containing a gentamicin resistance gene between these arms and a strong baculovirus.
It contains a ruth polyhedrin promoter and a polylinker. Baculovirus sha
Toluvector or bacmid is an infectivity gene inside the lacZ gene.
Kana recombined into the Lame mini attTn 'site and the AcNPV viral genome
It is composed of a mycin resistance gene. Tetracycline resistant helper plastic
Patin or GUS gene and marker inheritance using Smid pMON7124
By transposing the offspring into the viral genome (Luckow et al., 1993)
Recombinant AcNPV virus was produced. Genes shown in Table 7 and Pat
Insert 3+, Pat10 + and Pat17 + into pMON14327
I entered.
According to the procedure of US patent application Ser. No. 07 / 941,363 and Luckow et al.
A large amount of patatin was produced from the above gene. Western blot analysis and p-
Presence of patatin by esterase activity by nitrophenyl C-10 ester
I confirmed the existence. PatAmEach non-isoenzyme for SCRW bioassay
At least doubled. PatE + and PatEmThe fermented product of
All other isoenzymes were bioassays with little or no evidence of activity
It was observed to be expressed at a level suitable for. However, compared to potatoes
The post-translational processing properties of the patatin protein in baculovirus compared
I couldn't decide. Of the isoenzyme expressed by baculovirus
Anti-SCRW biological activity is Pat17 +, PatB +, PatDm, PatIm, Pa
Observed at tL + and Pat3 +.
A large number of isoenzymes (produced by baculovirus) cause insect growth and development.
The effect on childcare was measured. Together with an aliquot of 11 Russet isoenzymes
And one for SCRW, ECB, black weevil and TBW
Samples for bioassay were prepared. PatDmCan only get 1.7mg
However, the other isoenzymes were 10-15 mg each of Q-Sepharose purified aliquot.
Used. According to the assay using this mixture, TBW is 100%
Mortality was shown and ECB showed a 93% weight loss. Therefore, use each isoenzyme individually.
Different assays were performed on TBW and ECB. Compared to vector control larvae
, Isoenzymes PatC +, PatL + and PatImT fed with feed treated with
BW and ECB larvae showed significant atrophy (> 75%) and / or mortality
. PatB + and PatDmAlso atrophied TBW by 69% and 78%, respectively.Plant gene construction
Expression of plant genes present in the form of double-stranded DNA is
Conversion of one strand of DNA into messenger RNA (mRNA)
And the subsequent processing of mRNA primary transcripts that occur in the nucleus. this
For processing, add a polyadenylate nucleotide to the 3'end of RNA
The 3'untranslated region is involved. Transcription from DNA to mRNA is a “promoter”
Say
It is regulated by the commonly known DNA region. The promoter region is the corresponding RNA strand
In order to generate
It contains a nucleotide sequence that gives RNA polymerase a signal to initiate transcription.
A number of promoters active in plant cells have been described in the literature. Such a professional
The motor can be derived from a plant or plant virus, non-limiting examples of which are:
, Nopaline synthase (NOS) promoter and octopine synthase (OC
S) promoter (these are Agrobacterium tumefacies
carried in the tumor-inducing plasmid of ns), cauliflower mosaic virus
(CaMV) 19S and 35S promoters, ribulose-1,5-bis-pho
Small subunit of sulfate carboxylase (ssRUBISCO, extremely rich
A light-inducible promoter derived from a rich plant polypeptide,
gworth) mosaic virus (FMV) 35S promoter. these
All of the promoters make different types of DNA constructs expressed in plants.
Used to manufacture (see, eg, International Patent Application WO84 / 02913)
. In addition, the characteristics of plants susceptible to insect attack
It may also be desired to limit expression to only certain parts. For example, limit expression to roots
Root-specific promoters may be used for
A root-promoting promoter may be used to raise the bell. For insects that eat roots
Such expression is preferred for susceptible plants.
Certain plant promoters will also be more effective in monocots. For example,
The rice actin promoter described in International Patent WO 91/09948 is peach.
Effective for expression in sorghum. Described in EP 0,342,926
The maize ubiquitin promoter could also be used in monocots.
Promoters used in the DNA constructs of the invention (ie, chimeric plant genes)
May be modified, if necessary, to change its regulatory properties. For example, C
The aMV35S promoter suppresses the expression of ssRUBISCO in the absence of light
It binds to the ssRUBISCO gene and is active in leaves but active in roots.
A non-sexual promoter may be produced. The obtained chimeric promoter is in the text
Can be used as described in.
Therefore, in the description of this specification, "CaMV35S"
The term promoter refers to variants of the CaMV35S promoter, such as
Due to binding to the promoter region, random or regulated mutagenesis, etc.
Includes upcoming promoters. In addition, promoters help boost gene expression
The promoter may be mutated to contain a large number of [enhancer sequences]
. Examples of such enhancer sequences are reported by Kay et al. (1987).
.
The particular promoter selected will drive full expression of the enzyme coding sequence.
To produce an effective amount of patatin. The preferred promoter is
The CaMV E35S promoter (enhanced CaMV35S).
The RNA produced by the DNA constructs of the present invention also contains a 5'untranslated leader.
Contains an array. This sequence is derived from the promoter selected to express the gene.
And can be specifically modified to enhance translation of mRNA. 5'untranslated region
May also be derived from viral RNA, appropriate eukaryotic or synthetic gene sequences.
Can also be. The invention is derived from the 5'untranslated sequence associated with the promoter sequence.
It is not limited to constructs with untranslated regions.
As pointed out above, the chimeric plant gene of the present invention
The 3'untranslated region has an adenylate nucleotide added to the 3'end of RNA in plants.
Includes a polyadenylation signal that functions to drive. Of the preferred 3'region
Examples include (1) Agrob, such as the nopaline synthase (NOS) gene.
polyadenylate signature of the Actium tumor-inducing (Ti) plasmid gene
3'transcriptional untranslated region containing a gene or (2) soybean 7s storage protein gene and
And pea ssRUBISCO E9 gene [Fischhoff et al.]
There is such a plant gene.Localization
Vectors containing the patatin cassettes described above are active in the cytoplasm or vacuole of plant cells.
Express a sex protein. Direct most or all patatin into the plant secretory pathway
It would be desirable to attach. To achieve this, bacterial genes or plant
It would be advantageous to use a signal sequence derived from a gene, but plant genes are more
Expected to be favorable. Examples of such signal sequences include endoproteinases.
ZeB gene (Koehler & Ho) and tobacco PR1b gene (Corn
Elissen et al.). Described in European Patent Application Publication No. 0,385,962
PMON10
824 is a B. elegans active in Lepidoptera. t. express the kurstaki protein
It is a plant transformation vector designed as described above. In pMON10824, B. t
. k. The coding sequence is the 10 amino acids of the mature PR1b coding sequence.
Is fused to the PR1b signal sequence. PR1b signal is patatin
To generate a vector fused to the gene, pMON10824 was digested with BglII and
A short BglII-NcoI fragment containing a PR1b signal cleaved with NcoI
To isolate. In the ligation reaction, the short BglII-NcoI fragment of pMON10824 was used.
The 1.0 kb NcoI-EcoRI fragment from pMON19714
Lagment and BamHI-EcoRI digested pMON19470 (Brow
n)). In this reaction, the patatin coding sequence was transformed into the PR1b gene.
Expression of CaMV35S promoter and monocotyledonous plant, fused to a secretory signal derived from
A plasmid driven by the intron is constructed. Dicotyledonous gene gene
A similar reaction may be used for the present. Dicot expression vector NotI-N
Insert the otI fragment into a dicot transformation vector as described below and
Lost (disarmed) Agroba
It can be used to transform dicotyledonous plants by activating it into a caterium host. Therefore
, A plant that produces patatin secreted into the extracellular space can be produced.
The NotI-NotI fragment of this monocotyledonous plant plasmid
Insert patatin into a transformation vector (for example, pMON18181 described above).
A secreting corn plant may be produced.
It is advantageous to direct patatin to localize to another cell compartment, the chloroplast
Let's do it. By including a chloroplast transit peptide (CTP) at the N-terminus,
Quality can direct chloroplast localization. Manipulate heterologous proteins to localize in the chloroplast
As an example of the CTP that was created, the RUBISCO small sub of Arabidopsis
There is a CTP called ats1A that is derived from the unit gene. B. t. k. Tan
In order to successfully localize the chloroplasts in the protein, this transition peptide and mature RUBIS were used.
Encodes a repeat of the transition peptide cleavage site in addition to the 23 amino acids of the CO sequence
A mutant of this transit peptide was constructed. Described by Brown et al.
pMON19643 is an Arabidopsis at fused to the GOX gene.
Contains s1A transit peptide
And used as a substrate to construct a vector that localizes patatin to the chloroplast.
Can be used. Complete and partial NcoI digestion of pMON19643
Perform and isolate the large fragment (4.0 kb). During the binding reaction, pMON1
The NcoI-EcoRI fragment from 9714 was used as a large fragment of pMON19643.
Mix with ragment. In this reaction, the patatin coding sequence becomes the mature RUBI.
Fused to the Arabidopsis transit peptide with 23 amino acids of SCO
Constructs a plasmid driven by the CaMV E35S promoter
. Or, to replace the promoter with the FMV35S promoter, a similar
Lasmids may be constructed. Such a plasmid is designated as disarmed A
It is introduced into a bacterium host and used for transformation of dicotyledonous plants. Well
Or the NotI-NotI fragment as described above.
Clone into As a result, plants that produce patatin localized in chloroplasts
The thing is obtained.Plant transformation and expression
A chimeric plant gene containing a structural coding sequence of the invention can be prepared by any suitable method.
Can be inserted into the genome of the plant.
Suitable plant transformation vectors include Agrobacterium tum
vectors derived from the Faciens Ti plasmid, and for example Herrer
a-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (19)
85) and EPO Application Publication No. 0,120,516 (Schillperort).
Et al.) And the like. Agrobacterium T
i-plasmid or root transformation (Ri) plasmid-derived plant transformation vector
In addition, other methods can be used to insert the DNA constructs of the invention into plant cells.
It Such methods include, for example, liposome, electroporation, release
Chemicals that increase DNA uptake, microparticle impact (macroprojecti)
delivery of free DNA by le bombardment, virus or
Is transformation using pollen.Transient expression of patatin in tobacco cells
A particularly useful plasmid cassette vector for transformation of dicotyledons is pMON1.
1794. The expression cassette pMON11794 is a CaMV E35S pro
5'untranslated leader and NOS gene of motor and petunia Hsp70
3'end containing the polyadenylation signal from pMON11
794 is a plant containing NcoI site and EcoRI site for insertion of coding sequence
NotI-NotI sites flanking the gene expression cassette.
PatA + (SEQ ID NO: 11), PatB + (SEQ ID NO: 16), PatC + (array
Insert each of column No. 17) and PatG + (SEQ ID NO: 22) into pMON11794.
Enter to pMON19745, pMON19742, pMON1743 and pM
Each ON19744 was produced. Each of these vectors was transformed into a tobacco protoplast.
Lectroporated. Western expression of patatin by transformed tobacco cells
Confirmed by blot analysis.Stable transformation of dicotyledons
Stable transformation of dicots with the patatin gene was performed by Rosahl et al.
It has been reported. The patatin gene under the control of a leaf stem-specific promoter
The Baco was transformed. Patatin was expressed.
International patent application for NotI-NotI fragment from pMON19745
Ti plasma disclosed and described by Barry et al. In WO 92/04449
By de vector
It was inserted into a certain pMON17227 to prepare pMON22566. The patent application
The description content of is included in this specification. This vector transforms transformed plants
Glyphosate described by Barry for selection.
te) contains a resistance gene. Similarly, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 2
2 is used to create the vectors pMON22563, 22564 and 22565 respectively.
Made.
These vectors have been deficient (disarmed) Agrobacterium
It was introduced into ABI and used to transform tomato explants in tissue culture. Griho
All plants expressing the patatin gene were selected after selection based on set resistance and plant regeneration.
Recovered. The expression of the patatin gene was confirmed by Western blot analysis,
Preliminary results show expression at a level of 0.1-0.5% of total protein. Insect larva
A bioassay for is in progress.Transient expression of patatin in maize cells
The 1 kb NcoI-EcoRI fragment of pMON19729 described above was
It was inserted into MON19433. This plasmid is derived from International Patent Application WO93 / 19
189 and 1992/19/1992, pending US patent application 07 /
855,857 (Brown et al.), The contents of which are described in the present specification.
Included in the book. The resulting plasmid pMON19731 was digested with NotI
Digested and the resulting fragment was transformed into pM, also described by Brown et al.
It was inserted into ON10081 to prepare pMON19740. This plasmid is S
Corn leaf protoplasts as described by heen et al., 1991.
Was electroporated. Patatin production by transformed maize protoplasts.
Present was confirmed by Western blot analysis.
To obtain cytoplasmic expression of patatin, pMON19714 NcoI-Eco
The RI fragment was inserted into pMON19433 to create pMON19730.
It was Insert NotI fragment of pMON19730 into pMON10081
The resulting plasmid pMON19739 was transformed into corn leaf protoplasts.
Western blot shows that protoplasts produce patatin when tropolated.
Confirmed by analysis.
Pat17 with and without target signal was also expressed in maize protoplasts
It was Protein Pat17 +
Maturation protein Pat17 and its own signal sequence for targeting the vacuole)
1.1 Kb NcoI-EcoRI fragment encoding SEQ ID NO: 30
Was constructed in pMON19648 to construct pMON19761.
Therefore, pMON19761 contains the CaMV E35S promoter and Hsp70.
NOS termin for expression in maize cells with intron and Pat17 + gene
Includes Noether.
To obtain the vector for cytoplasmic expression, the Pat17 + plasmid in pMON19761 was used.
Rows are Pat17 from pMON25213mThe protein (SEQ ID NO: 31)
Construct pMON, replacing by the NcoI-EcoRI fragment
25223 was produced.
pMON25224 has two fragments, namely pMON19643 (B
Arabidopsis thaliana SSU 1a inheritance of row et al.
Of 0.3 Kb containing protoplast transit peptide (CTP) from offspring (Timko et al.)
XbaI-NcoI fragment and Pat17 of pMON25213m1K
bNcoI-EcoRI fragment of pMON19761 (XbaI-E
co
RI). Therefore, pMON25224 is Ca
MV E35S promoter, Hsp70 intron and CTP / Pat17mKo
And a NOS terminator.
For extracellular targets, encodes the extracellular signal peptide of a secreted protein
Endoproteinase B cDNA (Koehler & Ho)
, Pat17 from pMON25213mJoined to the gene. Chimera gene
BglII-EcoRI fragment containing splicing overlap extension
Method (Horton et al.), PMON19761 (BamHI-Ec
oRI) to prepare pMON25225.
Electroporating all these constructs into corn leaf protoplasts,
Pat17mExpression was confirmed by Western blot analysis.Stable transformation of maize with patatin gene
The corn transformation vector pMON18181 was transformed into pMON19653 and
Constructed from pMON19643 (Brown et al.). This construct is CaMV
E35S promoter, Hsp70 intron and CP4 glyphosate selection
Cassette with marker and NOS terminator, CaMV E35S promoter
-, Hsp70 intron, GOX glyphosate selection marker and NOS termin
For insertion of a gene expression cassette containing a patatin gene
Contains a single NotI site. Each of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 30 is NotI-N
As an otI fragment, it was inserted into pMON18181 to obtain pMON19746 and
And pMON19764 were prepared respectively.
These vectors are biolisted as described by Brown et al.
By bombarding embryogenic tissue culture cells with a biolistic particle gun
Inserted. Transformed cells were selected based on glyphosate tolerance to regenerate whole plants.
It was Western blot analysis, esterase activity assay and / or insect resistance
According to the assay, insect-resistant plants carry genes at 0.2-0.5% of total protein.
It was confirmed that it was expressed.Synthetic genes that enhance monocot expression
Modifications of the coding sequence are made in Bacillus thuringiensis
To enhance the expression of another insecticidal protein gene, such as the delta endotoxin sequence of Escherichia coli.
Was found
(Fischoff &Perlak; WO93 / 07278, Ciba-
Geigy). Thus improving patatin expression in plants, especially corn
The modified coding sequence was designed as follows. SEQ ID NO:
33. A DNA sequence containing SEQ ID NO: 33 was synthesized and pMON19470 (B
insert into a maize expression cassette vector such as row. Tomoro
Koshi expression cassette is then selected for pMON18181 or maize transformation
When inserted into another corn plant transformation vector containing the marker gene, P
Complete maize plants expressing at17 + will be obtained.
In order to achieve the objects set forth above, the present invention has the obvious advantages inherent in the present invention.
It will be appreciated from the above description that it is quite suitable. Some features and subs
Combinations are useful, are they other features and sub-combinations?
It will be appreciated that they can be used independently. This is considered from the scope of claims.
Can be included within the scope of the claims. The invention without departing from the scope of the invention
While many implementations of the present invention will be possible, all matters described herein are exemplary.
It should be understood that this is not limiting.
All publications and patents mentioned in this specification refer to each individual publication or patent.
By reference, as described herein as being included herein by reference.
Included in the present invention.
References
Sequence listing
SEQ ID NO: 1
Array length: 15
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
Array
SEQ ID NO: 2
Array length: 15
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 3
Array length: 15
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 4
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Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 5
Array length: 15
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 6
Array length: 8
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 7
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Sequence type: Amino acid
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Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 8
Array length: 8
Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 9
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Sequence type: Amino acid
Topology: linear
Sequence type: Peptide
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SEQ ID NO: 10
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Sequence type: Amino acid
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SEQ ID NO: 11
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Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
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SEQ ID NO: 13
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SEQ ID NO: 14
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SEQ ID NO: 18
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SEQ ID NO: 22
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Sequence type: Nucleic acid
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SEQ ID NO: 23
Array length: 1104
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SEQ ID NO: 24
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Sequence type: Nucleic acid
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SEQ ID NO: 25
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SEQ ID NO: 26
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SEQ ID NO: 27
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Sequence type: Nucleic acid
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Sequence type: Synthetic DNA
Array
SEQ ID NO: 28
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Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: linear
Sequence type: cDNA
Array
SEQ ID NO: 29
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Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: linear
Sequence type: cDNA
Array
SEQ ID NO: 30
Array length: 1172
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
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Array
SEQ ID NO: 31
Array length: 1106
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: linear
Sequence type: cDNA
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SEQ ID NO: 32
Array length: 45
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: linear
Sequence type: Synthetic DNA
Array
SEQ ID NO: 33
Array length: 1164
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: linear
Sequence type: cDNA
Array
【手続補正書】特許法第184条の7第1項
【提出日】1994年12月8日
【補正内容】
6.前記構造コーディング配列が配列番号30または配列番号31から成ること
を特徴とする請求項5に記載の方法。
7.前記植物がトウモロコシであり、前記構造コーディング配列が単子葉植物中
での発現を増進するように合成されていることを特徴とする請求項5に記載の方
法。
8.前記構造コーディング配列が配列番号32から成ることを特徴とする請求項
7に記載の方法。
9.バチルス・チューリンギエンシスの内毒素を発現する1つ又はそれ以上の遺
伝子がゲノムに含まれていることを特徴とする請求項5に記載の方法によって生
産される植物。
10.請求項9に記載の植物によって生産される種子または種子片。[Procedure Amendment] Patent Law Article 184-7, Paragraph 1
[Submission date] December 8, 1994
[Correction content]
6. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31
The method according to claim 5, characterized in that
7. The plant is maize and the structural coding sequence is in a monocot
6. The method according to claim 5, which is synthesized so as to enhance expression in
Law.
8. 33. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 32.
7. The method according to 7.
9. One or more remains expressing Bacillus thuringiensis endotoxin
6. The method according to claim 5, wherein the gene is contained in the genome.
The plant that is produced.
10. A seed or seed piece produced by the plant of claim 9.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12R 1:19)
(C12P 21/02
C12R 1:92)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AU,BB,BG,BR,BY,CA,
CN,CZ,FI,HU,JP,KR,KZ,LK,L
V,MG,MN,MW,NO,NZ,PL,RO,RU
,SD,SI,SK,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 イザーク,バーバラ・グエンザー
アメリカ合衆国、ミズーリ・63304、セン
ト・チヤールズ、ローズモント・ドライ
ブ・5165
(72)発明者 ジエニングス,マイケル・ジラード
アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ
スターフイールド、リアルト・ドライブ・
14550、アパートメント・307
(72)発明者 レバイン,エレーン・ベアトリス
アメリカ合衆国、ミズーリ・63146、セン
ト・ルイス、イーストランド・コート・
12392
(72)発明者 パーセル,ジヨン・パトリツク
アメリカ合衆国、ミズーリ・63011、ボー
ルウイン、チヤーブレイ・ドライブ・615─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:92) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, FI, HU, JP, KR, KZ, LK, LV, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SI, SK, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Isaac, Barbara Nguyen USA, Missouri 63304, Cent Charles, Rosemont Drive 5165 (72) Inventor Jennings, Michael Gillard United States, Missouri 63017, Chesterfield, Rialto Drive 14550, Apartment 307 (72) Inventor Levine, Elaine Beatrice United States, Missouri 63146, Sent Lewis, Eastland Court 12392 (72) Inventor Purcell, Zyon Patrick, Missouri 63011, Bowlwin, Cheerbrae Drive 615