JPH08507692A - Insect control method - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 主として幼虫の成長を萎縮させ、これによって成熟及び繁殖を阻止する昆虫防除パタチン。これらのタンパク質の１種またはそれ以上をコードする遺伝子を、植物定着微生物または植物の形質転換ベクターにクローニングし、これによって虫害を防除する方法が提供される。   (57) [Summary] An insect control patatin that primarily atrophies the growth of larvae and thereby prevents maturation and reproduction. Methods are provided for cloning genes encoding one or more of these proteins into plant-establishing microorganisms or plant transformation vectors, thereby controlling insect damage.

Description

【発明の詳細な説明】 昆虫防除方法発明の分野 本発明は、タンパク質を植物に直接散布するかもしくはタンパク質を植物上で 微生物によって産生させるかまたはタンパク質を産生するように植物を遺伝的に 修飾することによって、植物にタンパク質を供給して植物の虫害を防除する方法 、並びに該方法に有用な微生物及び植物に関する。発明の背景 タンパク質のような天然物質の使用は、多くの害虫を防除するための公知の方 法である。例えば、鱗翅類及び鞘翅類の双方の害虫を防除するためにはバチルス ・チューリンギエンシスＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ． ｔ．）の内毒素が使用されている。これらの内毒素を産生する遺伝子は、綿、タ バコ及びトマトなどの種々の植物に導入されて発現している。しかしながら、Ｂ ．ｔ．内毒素に感受性でない経済的に重要な害虫も何種類かは存在する。このよ うな重要な害虫の例としては、ワタミハナゾウムシ（ＢＷＶ），Ａｎｔｈｏｎｏ ｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ、及び、ウリハムシ（ＣＲＷ），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｐ．がある。更に、Ｂ．ｔ．内毒素に感受性の昆虫を 防除するために別の異なる遺伝子産物を有することは、耐性管理の面から必須で はないにしても重要である。 数種類の別の公知の殺虫性タンパク質が植物中で見出されている。これらのタ ンパク質としては、レクチン、アミラーゼインヒビター及びプロテアーゼインヒ ビターがある。これらは高用量で摂取されると昆虫の成長及び発育に影響を与え るが〔Ｂｏｕｌｔｅｒら，１９８９；Ｂｒｏａｄｗａｙ ＆ Ｄｕｆｆｅｙ，１ ９８６；Ｃｚａｐｌａ ＆ Ｌａｎｇ，１９９０；Ｇａｔｅｈｏｕｓｅら，１９ ８６；Ｈｅｕｓｉｎｇら，１９９１；Ｉｓｈｉｍｏｔｏ ＆ Ｋ．Ｋｉｔａｍｕ ｒａ，１９８９；Ｍｕｒｄｏｃｋら，１９９０；Ｓｈｕｋｌｅ ＆ Ｍｕｒｄｏ ｃｋ，１９８３〕、Ｂ．ｔ．タンパク質のような即効性の殺生効果を示さない。 本発明の目的は、ＢＷＶ、ＣＲＷまたはその他の害虫を防除し得るタンパク質 、並びにかかるタンパク質の産生に有用な遺伝子を提供することである。本発明 の別の目的は、かかる遺伝物質を微生物及び植物細胞に挿入するための遺伝子構 築物及び挿入方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、かかる遺伝 物質を保有する形質転換微生物及び植物を提供することである。発明の概要 ジャガイモ塊茎の主要貯蔵タンパク質であるパタチンが、ウエスタンウリハム シ（ＷＣＲＷ），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、サザンウリハム シ（ＳＣＲＷ），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ及び ワタミハナゾウムシ（ＢＷＶ），Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓなどの 種々の昆虫を防除することは知見されていた。パタチンは幼虫をある程度致死さ せ、生き残った幼虫の成長を萎縮させ、その成熟を阻止するかまたは極度に抑制 し、繁殖を完全に阻止する。これらのタンパク質は、エステラーゼ（脂質アシル ヒドロラーゼ）活性を有することが判っており、植物に直接散布されてもよく、 または、別の方法、例えば、この酵素を産生するように形質転換された植物定着 微生物、または同様の形質転換を与えた植物によって供給されてもよい。 パタチンは、ジャガイモ〔Ｇａｉｌｌａｉｒｄ，１９７１；Ｒａｃｕｓｅｎ， １９８４；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９８８〕及び他の植物、特にナス科植物〔Ｇａ ｎａｌら，１９９１；Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら，１９８９〕中に見出されるタン パク質のファミリーである。ジャガイモ中のパ タチンは主として塊茎中に見出されるが、他の植物器官中でも極めて低レベルで 検出される〔Ｈｏｆｇｅｎ ＆Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，１９９０〕。数種のパタ チンイソ酵素のエステラーゼ基質特異性は研究されている〔Ｈｏｆｇｅｎ ＆ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，１９９０；Ｒａｃｕｓｅｎ，１９８６〕。 パタチンをコードする遺伝子は、Ｍｉｇｎｅｒｙら，１９８４、Ｍｉｇｎｅｒ ｙら，１９８８、Ｓｔｉｅｋｅｍａら，１９８８及びその他の研究者によって既 に単離されている。Ｒｏｓａｈｌら，１９８７は、パタチンをタバコ植物に移入 し、パタチンの発現を観察した。この試験は、パタチン遺伝子が植物によって異 種発現され得ることを証明した。 パタチン遺伝子を同様に単離し、適当な形質転換ベクターカセットに挿入し、 次に該ベクターカセットを、（１）植物に散布されたときにパタチン産生遺伝子 を発現して昆虫を防除するように植物定着微生物の形質転換に使用するか、また は、（２）植物自体が遺伝子を発現しパタチンを産生することによって昆虫によ る攻撃を防御するように植物のゲノムに組込む。更に、昆虫防除用タンパク質を コー ドする１種以上のＢ．ｔ．遺伝子を同時発現するように植物を形質転換または品 種改良してもよい。この結果として、（１）広範囲の有害生物から保護され及び ／または（２）ある種の有害生物に対して２つの作用モードを有する植物が与え られ、これは耐性管理の面で重要なツールである。Ｂ．ｔ．遺伝子を発現するよ うに形質転換された植物の例は、１９９０年２月１２日出願の〔Ｆｉｓｃｈｈｏ ｆｆらの〕米国特許出願第４７６，６６１号に対応する欧州特許出願公開第０， ３８６，９６２号に開示されている。これらの文献の記載内容は本明細書に含ま れるものとする。更に、プロテイナーゼインヒビターが他の殺虫性タンパク質の 活性と相乗作用を有することが判明しているので、ジャガイモパパインインヒビ ター〔Ｒｏｄｉｓ ＆ Ｈｏｆｆ，１９８４〕または大豆トリプシンインヒビタ ー〔Ｒｙａｎ，１９９０参照〕をコードする遺伝子のような複数のプロテイナー ゼインヒビター遺伝子を同時発現するように植物を形質転換または品種改良して もよい。 上記を達成するために、本発明の１つの目的は、昆虫に摂取させる有効量の殺 虫性パタチンを供給することから成る植物の虫害防除方法を提供することである 。この方法に よれば、パタチン遺伝子を発現するように形質転換させた植物定着微生物を作製 し、これを植物に導入し、該遺伝子を発現させ、殺虫有効量のパタチンを産生さ せ得る。この方法ではまた、保護されるべき植物を以下のＤＮＡ分子によって遺 伝的に形質転換させてもよい。該ＤＮＡ分子は、 （ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーターと、 （ii）パタチンをコードする構造コーディング配列と、 （iii）該植物細胞中でＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニレートヌクレオチド を付加させるべく機能する３′非翻訳領域とから成り、該プロモーターは該構造 コーディング配列に対して異種であり、該プロモーターは該構造コーディング配 列に操作可能に結合されており、該構造コーディング配列は該非翻訳領域に操作 可能に結合されている。好ましくは植物が総タンパク質の約０．１−０．５％の レベルのパタチンを発現するであろう。 本発明はまた、遺伝的に形質転換された昆虫耐性のトウモロコシ、綿、トマト 及びジャガイモ植物を提供する。 本文中で使用された「虫害を防除する」なる表現は、幼虫の致死、幼虫の発育 抑制（萎縮）または繁殖率の低下に よって有益な収穫量の低下を招く昆虫の数を減少させることを意味する。本文中 で使用された「殺虫性」なる用語は、幼虫の致死、幼虫の発育抑制（萎縮）また は繁殖率の低下によって有益な収穫量の低下を招く昆虫の数を減少させ得る特性 を意味する。 本文中で使用された「構造コーディング配列」なる表現は、ＤＮＡからｍＲＮ Ａに転写され、次いで所望のポリペプチドに翻訳されて細胞によって産生される ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。 本文中で使用された「パタチン」なる用語は、後出の配列番号３１によってコ ードされたタンパク質に対して７５％以上のホモロジー、好ましくは８０％以上 のホモロジー、より好ましくは８５％以上のホモロジーを有する植物タンパク質 を意味する。この用語はまた、単子葉植物中で改良発現が得られるように設計さ れた合成ＤＮＡ配列から産生されるタンパク質も包含する。発明の詳細な説明 パタチンは、ジャガイモ〔Ｇａｉｌｌａｉｒｄ，１９７１；Ｒａｃｕｓｅｎ， １９８４；Ａｎｄｒｅｗｓら，１９８８〕及び他の植物、特にナス科植物〔Ｇａ ｎａｌら， １９９１；Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら，１９８９〕中に見出されるエステラーゼの ファミリーである。ジャガイモ中では、パタチンは主として塊茎中に見出される が、他の植物器官中でも極めて低レベルで検出される〔Ｈｏｆｇｅｎ ＆ Ｗｉ ｌｌｍｉｔｚｅｒ，１９９０〕］。数種のパタチンイソ酵素のエステラーゼ基質 特異性が検討され〔Ｈｏｆｇｅｎ ＆ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，１９９０；Ｒａ ｃｕｓｅｎ，１９８６〕、広い基質特異性を有することが判明し、これらの酵素 の基質要件が少ないことが証明された。本文中に詳細に開示された植物由来のす べてのパタチン及びその等価物並びにその相同タンパク質を、天然ＤＮＡ配列に 由来するかまたは合成ＤＮＡ配列に由来するかにかかわりなく、植物の虫害を防 除するために使用することは、本発明の範囲に包含される。 ジャガイモから得られた粗パタチン調製物は市販されている。例えば、Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯは、Ｓｉｇ ｍａによって酸ホスファターゼ（Ｐ‐１１４６及びＰ‐３７５２）またはアピラ ーゼ（Ａ‐９１４９）と命名されたジャガイモタンパク質調製物を供給している 。文献（Ｒａｃｕｓｅｎ ＆ Ｆｏｏｔｅ，１９８０；Ｒａｒｋら，１９８３）に記載の方法でジャガイモ 塊茎を収穫してタンパク質抽出物調製し得る。生物効果アッセイ 人工給餌バイオアッセイ ＳＣＲＷ、ＢＷＶ、コロラドハムシ（ＣＰＢ），Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ 及びアワノメイガ（ＥＣＢ），Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎ ｕｂｉｌａｌｉｓ の幼虫に対する活性アッセイを、Ｍａｒｒｏｎｅら，１９８５ がＳＣＲＷに関して記載した寒天飼料と同様の寒天飼料上に試験サンプルを重層 することによって行った。４−５ｍｌの１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５中で タンパク質を可溶化し、分子量カットオフ３５００のチューブを用いて同じバッ ファ中で透析することによって試験サンプルを調製した。新生幼虫を処理飼料上 で２６℃で養育し、５日または６日後に致死率及び成長萎縮を評価した。Ｐ‐３ ７５２（Ｓｉｇｍａ）のアッセイ結果を表１に示す。この粗ジャガイモ調製物は 、広いスペクトルの殺虫活性を示した。 ５日間の接触後のＳＣＲＷの重量（表２）及び６日間の接触後のＥＣＢの重量 （表３）の正確な定量的測定の結果を以下に示す。Ｐ‐３７５２含有飼料で養育 したＳＣＲＷ幼虫の体重は対照に比べて９２％減量しており、ＥＣＢ幼虫の体重 は対照に比べて６２％減量していた。 サザンウリハムシ（ＳＣＲＷ）及びワタミハナゾウムシ（ＢＷＶ）に対して活 性のＰ‐３７５２の殺虫成分のタンパク質的特性を、熱不安定性、硫安沈殿、分 子サイズ分別、プロテアーゼ感受性の実験で決定した。 Ｐ‐３７５２の効果が摂取パタチンの直接効果に起因するものであり摂食阻害 物質応答に因る間接効果でないことを確認するために、ＥＣＢ及びＳＣＲＷに関 して飼料選択試験を実施した。この選択試験の結果は、Ｐ‐３７５２処理飼料及 びＴｒｉｓ処理飼料のいずれに対しても顕著な偏食が生じないことを示した。Ｔ ｒｉｓ処理飼料に比べてＰ‐３７５２処理飼料が忌避されるという現象は全くな かった。 ＳＣＲＷに対するＰ‐３７５２の長期間（２５日）アッセイでは、第２虫齢の 幼虫を使用し、生き残った昆虫を新 しく処理した飼料に数回移転させた。試験の終了後、対照幼虫では全部が蛹化し た。これに比べて処理幼虫ではその５０％が死んでおり、残りの５０％は初期体 重のわずか１６％増（２．４８ｍｇ対２．１４ｍｇ）の体重増加を示していた。 これは、幼虫の単なる発育遅延でなく発育停止が生じたことを示す。これは昆虫 防除の見地から重要な結果を齎すものであり、幼虫が成虫期まで発育できないの で、後代のウリハムシの数が減少するであろう。 ウエスタンウリハムシ（ＷＣＲＷ），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅ ｒａ については第２虫齢期の幼虫だけを実験室試験に使用できる。ＷＣＲＷに対 するＰ‐３７５２試験を行うために、ＳＣＲＷの第２虫齢の幼虫も用いた並行ア ッセイを設計した。Ｐ‐３７５２処理したＳＣＲＷ及びＷＣＲＷの第２虫齢の幼 虫は夫々、１３％及び１１％だけの体重増加を示した。対照では７日後に、ＳＣ ＲＷが４７４％、ＷＣＲＷが２００％の体重増加を示した。これは、ＷＣＲＷに 対するパタチンの活性がＳＣＲＷに対するその活性とほぼ等価であることを示唆 する。 Ｐ‐３７５２は、タバコガ幼虫（ＴＢＷ），Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓ ｃｅｎｓ 、シロイチモンジヨトウ（Ｂ ＡＷ），Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、オオタバコガ幼虫，Ｈｅｌｉｃ ｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ワタキバガ幼虫，Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓ ｙｐｉｅｌｌａ 及びスズメガ幼虫，Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに対して僅かに 活性であり、これらの幼虫に対しては、ＳＣＲＷに評価３の萎縮を与える濃度で 評価１−１．５の萎縮を与えた。Ｐ‐３７５２は、黒ヨトウムシ，Ａｇｒｏｔｉ ｓ ｉｐｓｉｌｏｎに対しては評価２．５の萎縮を与えた。（萎縮評価は表１に 定義）。Ｐ‐３７５２は、試験濃度でモモアカアブラムシ，Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒ ｓｉｃａｅ に不活性であった。植物組織バイオアッセイ （１） ジャガイモ：１ｇの粗Ｐ‐３７５２を４ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ，ｐ Ｈ７．５バッファに溶解し、次に、０．２μｍの膜で透析し濾過した。Ｔｒｉｔ ｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００を添加して０．１％溶液を調製した。ジャガイモの 葉を酵素調製物に浸漬させ、シャーレ内の湿潤濾紙に載せた。ＣＰＢの幼虫を加 え、プレートを２７℃で３日間インキュベートした。ジャガイモの葉をＰ‐３７ ５２で処理した結果、ＣＰＢ幼虫の萎縮及び摂食量の減少が生 じた。アッセイ終了時点で、Ｐ‐３７５２処理葉に比較して対照葉の葉組織の残 存量はかなり少なかった。 （２） トウモロコシ及び綿：Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎスイートコーンカル ス（ＢＭＳ）または綿カルスを寒天プレートから取り出し、５０ｍｌの遠心管に 移した。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）臨床用遠心機でカルスを設定 目盛８で５分間撹拌し遠心した。上清を傾瀉した。１５ｍｌのカルスペレットを 収容している５０ｍｌの管に、３０ｍｌの液体２％寒天を加えた。完全に混合後 、飼料を昆虫バイオアッセイのアッセイ箇所（ａｓｓａｙ ａｒｅｎａ）にピペ ットで注入した。透析したＰ‐３７５２を飼料被覆層（２０％容量）として添加 し、上記のようにアッセイを行った。 トウモロコシの根と苗とを切除し、これらに粗Ｐ‐３７５２または２５ｍＭの Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５バッファを真空浸潤（Ｉｎｆｌｔ.）させた。対照サンプ ルをＴｒｉｓバッファ中で組織浸漬させた。根の約１０−１５の試験片または苗 組織の３つの試験片を２４ウエル組織培養皿のウエルに入れ、４回反復試験した 。ＳＣＲＷの４匹の新生幼虫を各ウエルに添加した。アッセイ試料を２６℃で４ 日間イ ンキュベートし、この時点で致死率と幼虫の平均体重とを観察した。これらのア ッセイの結果を表４に示す。 従って、Ｐ‐３７５２を植物組織と同時に摂取させたとき、４種類の昆虫（Ｓ ＣＲＷ、ＢＷＶ、ＣＲＢ及びＥＣＢ）全部に対して殺虫活性が保持されていた。 これらの給餌試験は、飼料の栄養分が植物組織（根、苗、カルスまたは葉）だけ から構成されているアッセイにおいてパタチンが殺虫活性であることを示す。作用モード試験 以下の試験は、Ｐ‐３７５２の殺虫活性成分であるパタチンが昆虫自体に直接 作用すること、及び、上記実験で証 明された活性は活性成分が摂食以前の昆虫飼料に作用したためであるとは考えら れないことを示す。飼料効果試験 １ｇのＰ‐３７５２を１０ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．６バッファに 溶解し、次いで分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１２−１４，０００の管中でこの 同じバッファに透析した。０．２μｍで濾過後、５０μｌのアリコートを、昆虫 添加の４日前に２つのプレート上の昆虫給餌ウエルに添加した。双方のプレート を２７℃で４日間インキュベートした。インキュベーション後、１つのプレート を８０℃で１時間加熱して酵素を失活させた。５０μｌのアリコートを第３プレ ートに添加した。このように、インキュベートしたプレート、インキュベートし 加熱したプレート及びインキュベートしないプレートを用いてＳＣＲＷバイオア ッセイを行った。 飼料のプレインキュベーション試験で得られたＳＣＲＷ活性を以下に示す。 インキュベートしないＰ‐３７５２−６^*** インキュベートしたＰ‐３７５２−０^** インキュベートし加熱したＰ‐３７５２−０ 飼料のインキュベーション中にある程度の活性は失われたが、活性の完全な喪 失は熱処理によって生じた。このデータは、直接摂取後作用モードに一致してお り、植物組織アッセイ及び種々の昆虫に対する変異性と総合的に考察すると、Ｓ ＣＲＷ及びその他の昆虫に対するタンパク質の活性が給餌効果によるものではな いことを示す。タンパク質同定 Ｐ‐３７５２から殺虫活性成分を精製し、部分的に配列決定し、特性決定した 。（一種または複数の）活性物質は、ジャガイモの脂質アシルヒドロラーゼのフ ァミリーであるパタチンであることが同定された。タンパク質単離 Ｐ‐３７５２からＳＣＲＷ生物活性成分を精製するために異なる４つのプロト コルを使用した。アニオン交換クロマトグラフィーによるＳＣＲＷ活性の精製 Ｑ‐セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換クロマトグラフィー及 びＭＯＮＯ‐Ｑ（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換クロマトグラ フィーを順次用いることによって、Ｐ‐３７５２からＳＣＲＷ活性成分 を精製した。ＳＣＲＷ活性分画中のタンパク質レベルによれば、観察された評価^** の萎縮が飼料のタンパク質濃度３１ｐｐｍのときに得られたことが判明した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、活性分画中に３つの主要タンパク質バンド（分子量４２， ０００、〜２６，０００及び〜１６，０００）が存在することを示した。ＳＣＲＷ活性の５段階精製 Ｐ‐３７５２からＳＣＲＷ活性成分を精製するために連続する５つの精製段階 を使用した。これらの段階は、膜サイジング、硫安沈殿、Ｑ‐セファロースＩＥ Ｃ、Ｓ‐セファロースＩＥＣ及びＰ‐２００ＳＥＣから成る。最も精製されたＳ ＣＲＷ活性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量４２，０００、〜２６，０００及び 〜１６，０００にタンパク質バンドを示した。等電点電気泳動による生物活性の精製 ＲＦ３タンパク質分別装置（Ｒａｉｎｉｎ）を製造業者の指示通りに使用した ２段階順次処理によって、ＳＣＲＷ生物活性ジャガイモタンパク質を精製した。 ＳＣＲＷ活性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィルは、５段階精製及びアニオン交 換精製で得られた活性分画中で観察されたプロフ ィルに極めて類似していた。等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルは、ｐＨ４．６−５ ．１からタンパク質が分別されることを示し、これは報告されたパタチンのｐＩ 範囲と一致する（Ｒａｃｕｓｅｎ ＆ Ｆｏｏｔｅ，１９８０）。 パタチンのイソ酵素を分離するために、ＲＦ３上で狭いｐＨ範囲（ｐＨ４−５ ）の継続的な等電点電気泳動を実施した。予想通り、生物活性のピークはｐＩ４ ．６−５．１のタンパク質で観察された。これらの分画は、別々のイソ酵素パタ ーンを有し、種々の生物活性レベルを有していた。分画中の生物活性は、８０− ５１２ｐｐｍの用量で評価^*-**の萎縮を伴う致死率０からの範囲であった。生物 活性分画のあるものは主要イソ酵素を２つだけ有しており、これは生物活性のた めにイソ酵素の複合パターンが必要でないことを示す。天然型ＰＡＧＥによる精製 Ｐ‐３７５２を天然型条件下に電気泳動させ、（基質としてα‐ナフチルアセ テートを用いて）エステラーゼ活性のバンドトリプレットを単離した。ゲル精製 したエステラーゼ陽性材料はＳＣＲＷに対して活性であり、評価１．５^*の萎縮 を生じた。この材料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって 分子量４２，０００、〜２６，０００及び〜１６，０００に主要バンドを生じ、 これは他の精製方法で既に観察されたプロフィルと一致した。この結果から、パ タチンがジャガイモに由来の殺虫成分であることが更に確認される。アミノ酸配列 アニオン交換精製及び５段階精製で得られたＳＣＲＷ活性クロマトグラフィー 分画中の全部のタンパク質バンド（分子量４２，０００、〜２６，０００及び〜 １６，０００）上でＮＨ₂‐末端アミノ酸配列が得られた。活性分画中の全部の バンドについて総合的な配列データを作成した。大部分のバンドが、パタチンの １つのイソ酵素（Ｓｔｉｅｋｅｍａら，１９８８）のＮＨ₂‐末端（配列番号１ ）または内部配列（配列番号７）の１５個のアミノ酸の配列に対して８５％を上 回るホモロジーを示した。１７ｋＤバンドの１つは、パタチンの公表されたＮＨ₂ ‐末端配列の最初の８個のアミノ酸に対して７５％のホモロジーを示した。他 方の１７ｋＤバンドは、公表された内部配列の最初の８個のアミノ酸に対して８ ５％を上回るホモロジーを示した。これらのバンドは、パタチンのタンパク質分 解産物を示す。イソ酵素の存在は、ＮＨ₂‐末端配列及び内部配列の双方 の１位及び３位のアミノ酸の変異性によってはっきりと証明される。 Ｎ末端アミノ酸配列 公表配列 ：ＫＬＥＥＭＶＴＶＬＳＩＤＧＧＧ （配列1） バンド1（42kD） ：ＸＬＧＥＭＶＴＶＬＳＩＤＧＧＧ （配列2） バンド2（28kD） ：ＴＬＧＥＭＶＴＶＬＳＩＤＧＧＧ （配列3） バンド3（26kD） ：ＴＬＧＥＭＶＴＶＬＳＩＤＧＧＧ （配列4） バンド4（24kD） ：ＫＬＸＥＭＶＴＶＬＳＩＤＧＧＧ （配列5） バンド5a（17kD） ： ＸＸＥＥＭＶＴＶ （配列6） 内部配列 （アミノ酸224位） 公表配列 ：ＳＬＤＹＫＱＭＬＬＬＳＬＧＴＧ （配列7） バンド5b（17kD） ： ＫＬＤＹＫＱＭＬ （配列8） バンド6（16kD） ：ＳＬＸＹＫＱＭＬＬＬＳＬＧＴＧ （配列9） バンド7（15kD） ：ＳＬＮＹＫＱＭＬＬＬＳＬＧＴＧ （配列10）エステラーゼ活性 ＳＣＲＷ活性分画中のエステラーゼ活性を試験するためにいくつかの実験を実 施した。α‐ナフチルアセテート基質 ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０− ２０％）を使用して、（５段階精製から得られた）ＳＣＲＷ活性分画がエステラ ーゼ活性を示すか否かを決定した〔Ｒａｃｕｓｅｎ，１９８４〕。ゲルを二分し 、夫々に加熱及び非加熱のＳＣＲＷ活性分画のセットを充填した。非加熱サンプ ルでは分子量５５，０００の単一のエステラーゼ陽性バンドが観察された。加熱 サンプルでは出発分子量である４２，０００のバンドが観察され、同時に５５， ０００のバンドは存在しなかった。この結果は、パタチンのエステラーゼ活性の 電気泳動移動度に関する文献報告（Ｒａｃｕｓｅｎ，１９８４）と一致する。加 熱サンプル中で分子量５５，０００のバンドが観察されなかったことは、ＳＤＳ 中の熱処理がエステラーゼ活性を除去することを示す。分子量５５，０００のバ ンドが存在しない加熱サンプル中で出発分子量４２，０００のバンドはクーマシ ー染色によって観察された。ｐ‐ニトロフェニル基質特異性試験 ｐ‐ニトロフェニルエステルのシリーズ（Ｃ‐２，Ｃ‐４，Ｃ‐６，Ｃ‐８， Ｃ‐１０，Ｃ‐１２，Ｃ‐１４及びＣ‐１６エステル）を用いた試験によって基 質特異性を決定した。ｐ‐ＮＰのＣ‐８及びＣ‐１０エステルは他のエ ステルに比較して、試験した大部分のパタチンのエステラーゼ活性に対して常に 最良の基質であった。脂質エステル基質 （５段階精製で得られた）精製されたＳＣＲＷ活性分画について複数の脂質に 対する加水分解能力を試験した。各脂質を溶解し、精製されたＳＣＲＷ活性分画 のアリコートと共にインキュベートした。３つの溶媒展開系（Ｐｅｒｎｅｓら， １９８０）を用いたＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）によってサンプルを分析 した。ＴＬＣによって４種類の脂質が顕著な修飾を示した。これらはオレオイル リゾレシチン、ジオレオイルＬ‐α‐ホスファチジルコリン、１‐モノリノレノ イル‐ｒａｃ‐グリセロール及びジオレイン（Ｓｉｇｍａ）であった。これらの 脂質／活性分画の反応混合物の有機抽出物中のＲｆ０．３７の新しいＴＬＣスポ ットは、リノール及びオレイン脂肪酸標準との比較によって遊離脂肪酸であると 同定された。従って、ＳＣＲＷ活性材料はこれらの４種類の脂質エステルに対し てエステラーゼ活性を示す。 トウモロコシの根で養育したＷＣＲＷの第３虫齢の幼虫から中腸を摘出した。 中腸脂質を抽出し、溶解し、精製し たＳＣＲＷ活性分画と共に中腸のｐＨ（ｐＨ６．５５）でインキュベートした。 上記方法を用いＴＬＣによってサンプルを分析した。精製したＳＣＲＷ活性分画 は、中腸のｐＨでＷＣＲＷ中腸のリン脂質に対してエステラーゼ活性を示した。 これは、パタチンの殺虫活性に関する可能な作用モードを示す。パタチンの代替ソース 初期実験はいずれも、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｕｓｓｅｔ ｖａｒ．Ｋｒａｎ ｚジャガイモ塊茎から得られた市販の酵素調製物（Ｓｉｇｍａ）であるＰ‐３７ ５２を用いて実施したので、新しいジャガイモ塊茎組織から殺虫活性パタチンを 回収できると証明することが望まれていた。本質的に文献（Ｒａｃｕｓｅｎ ＆ Ｆｏｏｔｅ，１９８０；Ｐａｒｋら，１９８３）に記載通りに塊茎抽出物を調 製した。３種類の市販のＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ栽培品種（Ｒｕｓｓｅｔ、Ｄｅ ｓｉｒｅｅ及びＬａＣｈｉｐｐｅｒ）と７種類の野生種（Ｓ．ｋｕｒｔｚｉａｎ ｕｍ 、Ｓ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ、Ｓ．ｔａｒｉｊｅｎｓｅ、Ｓ．ａｃａｕｌ ｅ 、Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ、Ｓ，ｃａｒｄｉｏｐｈｙｌｌｕｍ及びＳ．ｒａｐｈ ａｎｉｆｏｌｉｕｍ 、すべて Ｉｎｔｅｒ‐Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｏｔａｔｏ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓ ｔａｔｉｏｎ，ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，ＳｔｕｒｇｅｏｎＢａｙ，ＷＩから入手）と を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイによれば全部の 抽出物がパタチン陽性であり、Ｃ‐１０エステラーゼアッセイによれば全部がエ ステラーゼ陽性であり、全部がＳＣＲＷに対して殺虫活性、すなわち評価２−３ の萎縮を示した。表５参照。この結果から、複数の品種の塊茎から殺虫活性パタ チンを単離することが可能であり、このクラス全体のタンパク質のうちの多くの 成員が殺虫性を有することを期待し得る。 Ｓ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ、Ｓ．ｋｕｒｔｚｉａｎｕｍ及びＳ．ｔａｒｉｊ ｅｎｓｅ の抽出物を追加の２つの標的昆虫ＣＰＢ及びＥＣＢに対してバイオアッ セイした。バイオアッセイデータを以下の表６にまとめる。これらの抽出物はＣ ＰＢに対する活性をほとんど示さなかったが、ＥＣＢの幼虫に対しては１×の適 用量（ｒａｔｅ）で中程度から顕著な萎縮を示した。しかしながら、０．１×の 適用量ではＥＣＢ幼虫に対する活性が全く存在しないことから判るように、これ らのジャガイモ抽出物に対してＥＣＢの幼虫はＳＣＲＷ幼虫ほど感受性ではなか った。 ９種の異なる植物のゲノムＤＮＡのパタチン相同タンパク質をサザン分析によ って試験した。配列番号１１のα‐³²Ｐ標識プローブでサザンブロットをプロー ビングすると、別の数種の植物種中の相同配列の存在が判明した。トウモロコシ 、トマト、テンサイ、イネ及びジャガイモ中で強力なシグナルが得られた。この 実験では個々のバンドの分離はできなかった。しかしながら、スミア（ｓｍｅａ ｒｓ）のサイズ及びその強さはこれらの種のすべてにおいて同様であった。ズッ キーニ、大豆及びナタネ（ｃａｎｏｌａ）中でも弱いシグナルが観察され、各植 物種のＤＮＡ中に少数の不連続なバンドとして出現した。キュウリ及びＡｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓはこの実験で使用した条件下でパタチンプローブとの検出可能な ハイブリダイゼーションを示さなかった。この理由は恐らく、ゲルの臭化エチジ ウム染色で観察されたように充填されたＤＮＡが少量であったためであろう。 これらの相同タンパク質のＤＮＡ配列は、通常の知識をもつ当業者によって容 易に得ることができ、公知の手段によって植物またはその他の生物に挿入できる 。かかるタンパク質の殺虫性は、例えばバキュロウイルスまたは大腸菌 から異種発現させた後に試験するのが最良である。従って、本発明の方法に使用 し得る別のタンパク質を、公知の方法を用いて通常実験量で取得し、その後に植 物を虫害から保護するために使用してもよい。遺伝子同定 パタチンの遺伝子は複数の研究者によってクローニングされている。Ｍｉｇｎ ｅｒｙら，１９８４によって開示された配列はＧＭ２０３と呼ばれた。これは不 完全なシグナル配列を有している。Ｍｉｇｎｅｒｙら，１９８８は、ＧＭ２０３ を取り囲み、完全なシグナル配列を含むゲノムクローンを同定しＰＳ２０と命名 した。ＰＳ２０のシグナル配列とＧＭ２０３のｃＤＮＡコーディング部分とを用 いて配列番号１１を構築し、以後ＰａｔＡ＋と呼ぶ。これは更に、ＮｃｏＩ制限 部位とＥｃｏＲＩ制限部位とを翻訳終止コドンの直後に含んでいる。Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ．Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ ジャガイモ品種Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ塊茎から２０個のｃＤＮＡを単 離し、配列決定した。推定アミノ酸配列は、これらのｃＤＮＡが異なる１１のパ タチンイソ酵 素をコードしていることを示す。これらの１１のタンパク質は、配列番号１１の ＰａｔＡ＋に比較すると約８２％から１００％の一致を有しており、ｃＤＮＡの 全長にわたって多数の位置で違いが生じている。異なる１１のパタチンイソ酵素 をコードしている異なる１１の代表的ｃＤＮＡの配列を表７に示すように命名す る。シグナル配列の最初の複数のコドンをコードしている５′ヌクレオチドに対 応する配列番号２６及びコーディング配列の３′末端に対応する配列番号２７を プライマーとして用いたＰＣＲ手順によってｃＤＮＡを以後のクローニング操作 のために加工した。「＋」の記号は、天然型シグナルコーディング配列が含まれ ていることを示す。いくつかのｃＤＮＡは完全な天然型シグナルコーディング配 列を含まず、配列番号３２及び配列番号２７をプライマーとして用いた同様のＰ ＣＲ手順から成熟タンパク質コーディング配列だけが得られた。成熟タンパク質 コーディング配列の存在を添え字「ｍ」によって示す。 Ｓｏｌａｎｕｍ ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ 塊茎ｍＲＮＡの逆転写及び上記の配列番号２６及び２７をプライマーとして用 いたＰＣＲを順次行って複相のジャガイモＳ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉからパタ チンｃＤＮＡを単離した。増幅プロセスに起因する同型（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ） クローンの単離を防止するために多数の独立ＰＣＲ反応を行った。 合計１４のパタチンｃＤＮＡを部分的に配列決定した。１４のｃＤＮＡ（Ｐａ ｔ１からＰａｔ１４まで）の全部がユニーク復ヌクレオチド配列を有すると考え られ、これはＳ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ塊茎中に少なくとも１４の異なるパタ チンｍＲＮＡが存在することを示唆する。Ｐａｔ３＋の配列は配列番号２８であ る。Ｐａｔ１０＋の配列は配列番号２９である。推定アミノ酸配列は、１４のｃ ＤＮＡが少なくとも１１の異なるタンパク質をコードしていることを示す。Ｓ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ 塊茎由来のｃＤＮＡ配列は概して極めて類似していた。 合計３６７個の残基のうちの１２個のアミノ酸位置だけ（３％）が配列変異性を 示した。これらの位置の各々に存在するアミノ酸残基を表８に示す。これらの位 置のうちの５つでは、ユニーク残基を有する変異クローンが１つだけ存在した。 これらの変異はｍＲＮＡ間の現実の違いを反映するか、またはＰＣＲプロセス中 に生じたエラーの結果であろう。残りの７つの位置では、より大きい変異性が存 在し、少なくとも２つのｃＤＮＡが代替アミノ酸を有していた。異なるアミノ酸 配列をもつ９グループの各々がこれらの７つの位置にユニーク残基パターンを有 していた。いくつかの場合には、 １６４位のＴｈｒからＳｅｒへの変異のような保存性の変異が生じていた。その 他の場合には、１４８位へのプロリンの導入のようなより劇的な違いが存在した 。 Ｓｏｌａｎｕｍ ｃａｒｄｉｏｐｈｙｌｌｕｍ 上記のようにｓｏｌａｎｕｍ ｃａｒｄｉｏｐｈｙｌｌｕｍ塊茎から単離した ｍＲＮＡを用いたＰＣＲによって１０個のｃＤＮＡクローンを作製した。各クロ ーンの長さの少なくとも７５％についてヌクレオチド配列が得られた。Ｐａｔ１ ７＋と命名した１つのクローンの全長配列は配列 番号３０で示される。配列番号３１は、操作された成熟形態のＰａｔ１７_mであ る。Ｓ．ｃａｒｄｉｏｐｈｙｌｌｕｍクローンはほぼ等しかったが、ランダムな ヌクレオチド配列変異だけが存在し、これは現実の違いまたはＰＣＲエラーに起 因するものであろう。しかしながら５４位及び５１９位では、複数のクローンが 等しい変異を有することが観察され、これは、これらの変異が増幅プロセスに起 因するものでないことを示唆する。これらの位置のヌクレオチドパターンは、少 なくとも４つの異なるｍＲＮＡが存在していることを示した。ｃＤＮＡクローン のこのセットでは、２つのグループのｍＲＮＡが複数回単離され、他の２つのグ ループのｍＲＮＡは１回しか単離されなかった。 複数のＳ．ｃａｒｄｉｏｐｈｙｌｌｕｍクローンの推定アミノ酸配列も極めて 類似していた。ユニークアミノ酸配列が８グループ存在し、各グループの配列は 他のグループの配列から１残基違っていた。Ｐａｔ１７＋配列に等しいアミノ酸 配列をコードするｃＤＮＡクローンを２回回収した。他の７つのｃＤＮＡ（Ｐａ ｔ１８＋、１９＋、２０＋、２１＋、２２＋、２３＋及び２４＋）は単一のユニ ーク残基を含んでいた。遺伝子形質転換 上述のように、パタチン遺伝子を種々の植物ソースから単離し得る。次に、こ れらの遺伝子を１種または２種以上用いて細菌細胞または植物細胞を形質転換さ せパタチンを産生させて本発明の方法を実施するとよい。種々のパタチン配列を 用いた操作方法を以下に説明する。パタチンｃＤＮＡの操作 異種宿主細胞中でのパタチンの発現に適したベクターにパタチン遺伝子を組み 込むためには、遺伝子の末端近傍に適正な制限部位を導入することが必要であっ た。この突然変異誘発の最終目標は、最小の非コーディングフランキング配列を 有するタンパク質コーディング配列を含むカセットを作製し、これらのカセット を起動するために有用な制限部位を組込むことであった。シグナルペプチドを含 むインタクトなコーディング配列の起動または成熟コーディング配列だけの起動 が得られるようにカセットを設計した。ＰａｔＡ_mの場合には、これらのカセッ トを作製するために２つの突然変異誘発プライマーを設計した。配列番号１２に よる突然変異誘発は、成熟タンパク質のＮ末端のリシンを２つのアミノ酸（メチ オニン‐アラニン）で置換し、 ＮｃｏＩ部位を導入し、配列番号１３による突然変異誘発は、第２の終止コドン とＥｃｏＲＩ部位とを付加した。 得られた修飾配列は配列番号１４のＰａｔＡ_mであることが同定された。他の 全部のｃＤＮＡに対しても、前述のようにＰＣＲ、及び、配列番号２６及び配列 番号２７のプライマー、配列番号３２及び配列番号２７のプライマーを用いて同 様の修飾及び制限部位の導入を行った。大腸菌中のパタチンの発現 ＰａｔＡ_m（配列番号１４）のＤＮＡコーディング配列を、ｒｅｃＡプロモー ターとＧ１０リーダ（Ｏｌｉｎｓら，１９８９）とを備えたｐＢＲ３２７（Ｓｏ ｂｅｒｏｎら，１９８０）由来の大腸菌発現ベクターｐＭＯＮ５７６６に挿入し た。得られたベクターｐＭＯＮ１９７１４を大腸菌ＪＭ１０１株内に起動した。 その後、ウエスタンブロット分析及びｐ‐ニトロフェニルＣ‐１０エステルを用 いるエステラーゼ活性によって確認すると、この菌株はＰａｔＡ_mを産生してい た。 Ｐａｔ１７_mのＤＮＡコーディング配列及びＰａｔＡ_mのＤＮＡコーディング配 列の各々を、ＡｒａＢＡＤプロモーター（細胞をアラビノース中で増殖させると きに誘導性） とＧ１０リーダとアンピシリン耐性マーカー遺伝子とを備えたｐＭＯＮ６２３５ 由来の大腸菌発現ベクターに挿入した。得られたベクター、即ちＰａｔ１７_mを 含むｐＭＯＮ２５２１３及びＰａｔＡ_mを含むｐＭＯＮ２５２１６を大腸菌ＪＭ １０１株に導入した。 パタチンは形質転換大腸菌によって発現される。しかしながら、Ｂ体（ＲＢ） 中に区画化されている。インタクトな細胞及び可溶化したＲＢを使用してＳＣＲ Ｗアッセイを行った。結果を表９に示す。 植物定着細菌中のパタチンの発現 昆虫を防除するためには、植物定着細菌中で１種またはそれ以上のパタチンを 発現させ、次にこの細菌を植物に散布するのが望ましい。昆虫は植物で養育され るので、植物コロナイザーによって産生されたパタチンを有毒用量で摂取する。 植物コロナイザーは、シュードモナス，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓもしくはアグロ バクテリウム，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のように植物表面に棲息するもの でもよく、またはクラビバクター，Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ種のように植物維管 構造に棲息するものでもよい。表面コロナイザーの場合には、これらのグラム陰 性菌宿主中で複製し得る広宿主域のベクターにパタチン遺伝子を挿入し得る。か かるベクターの例として、ＩｎｃＱ不適合グループのｐＫＴ２３１〔Ｂａｇｄａ ｓａｒｉａｎら，１９８１〕またはＩｎｃＰグループのｐＶＫ１００〔Ｋｎａｕ ｆ，１９８２〕がある。内生増殖体（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）の場合には、相同組 換えによってパタチン遺伝子を染色体に挿入してもよく、または、これらの内生 増殖細菌に染色体を挿入し得る適当なトランスポゾンに遺伝子を組み込んでもよ い。バキュロウイルス中でのパタチンの発現 １９９２年９月４日出願の審査中の米国特許出願第０７／９４１，３６３号に 記載のように、バキュロウイルスドナーベクターｐＭＯＮ１４３２７にパタチン 遺伝子をＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングした。上記特許 出願の記載内容は本明細書に含まれるものとする。ドナーベクターｐＭＯＮ１４ ３２７は、アンピシリン耐性遺伝子と、Ｔｎ７トランスポゾンの左右のアームと を含み、これらのアーム間にゲンタマイシン耐性遺伝子と、強力なバキュロウイ ルスポリヘドリンプロモーターとポリリンカーとを含む。バキュロウイルスシャ トルベクターまたはバクミド（ｂａｃｍｉｄ）は、ｌａｃＺ遺伝子内部のインフ レームのミニａｔｔＴｎ′部位とＡｃＮＰＶウイルスゲノムに組換えられたカナ マイシン耐性遺伝子とから構成されている。テトラサイクリン耐性ヘルパープラ スミドｐＭＯＮ７１２４を用いて、パタチンまたはＧＵＳ遺伝子とマーカー遺伝 子とをウイルスゲノム（Ｌｕｃｋｏｗら，１９９３）に転位させることによって 組換えＡｃＮＰＶウイルスを産生させた。表７に示した遺伝子、並びに、Ｐａｔ ３＋、Ｐａｔ１０＋及びＰａｔ１７＋をｐＭＯＮ１４３２７に挿 入した。 米国特許出願第０７／９４１，３６３号及びＬｕｃｋｏｗらの手順に従って、 上記遺伝子から多量のパタチンが産生された。ウエスタンブロット分析及びｐ‐ ニトロフェニルＣ‐１０エステルによるエステラーゼ活性によってパタチンの存 在を確認した。ＰａｔＡ_m以外の各イソ酵素をＳＣＲＷバイオアッセイのために 少なくとも２倍にした。ＰａｔＥ＋及びＰａｔＥ_mの発酵物は終始パタチンの発 現をほとんどまたは全く示さなかったが、他の全部のイソ酵素はバイオアッセイ に適したレベルで発現されることが観察された。しかしながら、ジャガイモと比 較したバキュロウイルス中のパタチンタンパク質の翻訳後プロセシングの性質を 決定することはできなかった。バキュロウイルスによって発現されたイソ酵素の 抗ＳＣＲＷ生物活性がＰａｔ１７＋、ＰａｔＢ＋、ＰａｔＤ_m、ＰａｔＩ_m、Ｐａ ｔＬ＋及びＰａｔ３＋で観察された。 （バキュロウイルスによって産生された）多数のイソ酵素が昆虫の成長及び発 育に与える影響を測定した。１１種のＲｕｓｓｅｔイソ酵素のアリコートを一緒 にして、ＳＣＲＷ、ＥＣＢ、クロヨトウムシ及びＴＢＷに対する１つの バイオアッセイ用サンプルを調製した。ＰａｔＤ_mは１．７ｍｇしか入手できな かったがそれ以外のイソ酵素は各１０−１５ｍｇのＱ‐セファロース精製アリコ ートを使用した。この混合物を用いたアッセイによれば、ＴＢＷは１００％の致 死率を示し、ＥＣＢは９３％の減量を示した。従って、各イソ酵素を個別に用い たアッセイをＴＢＷ及びＥＣＢに対して実施した。ベクター対照幼虫に比較して 、イソ酵素ＰａｔＣ＋、ＰａｔＬ＋及びＰａｔＩ_mで処理した飼料で養育したＴ ＢＷ及びＥＣＢの幼虫は、有意な萎縮（≧７５％）及び／または致死率を示した 。ＰａｔＢ＋及びＰａｔＤ_mもＴＢＷを夫々６９％及び７８％萎縮させた。植物遺伝子構築 二重鎖ＤＮＡの形態で存在する植物遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素 によって生じるＤＮＡの１つの鎖からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転 写と、その後に核内で生じるｍＲＮＡ一次転写物のプロセシングとを含む。この プロセシングには、ＲＮＡの３′端にポリアデニレートヌクレオチドを付加する ３′非翻訳領域が関与する。ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写は、「プロモーター」 という 通称のＤＮＡ領域によって調節される。プロモーター領域は、対応するＲＮＡ鎖 を作製するために、ＤＮＡと会合し、ＤＮＡ鎖の一方を鋳型としてｍＲＮＡの転 写を開始させるシグナルをＲＮＡポリメラーゼに与える塩基配列を含む。 植物細胞中で活性の多数のプロモーターが文献に記載されている。かかるプロ モーターは植物または植物ウイルスから得ることができ、その非限定例としては 、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター及びオクトピンシンターゼ（ＯＣ Ｓ）プロモーター（これらはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓの腫瘍誘発プラスミドに保有されている）、カリフラワーモザイクウイルス （ＣａＭＶ）の１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター、リブロース‐１，５‐ビス‐ホ スフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、極めて豊 富な植物ポリペプチド）に由来の光誘導プロモーター、及びゴマノハグサ（Ｆｉ ｇｗｏｒｔ）モザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターがある。これらの プロモーターのすべてが、植物中で発現された種々のタイプのＤＮＡ構築物を作 製するために使用されている（例えば国際特許出願ＷＯ８４／０２９１３参照） 。また、昆虫の攻撃に感受性の植物の特 定の部分だけに発現を限定させることも望み得る。例えば、発現を根に限定する ために根特異的プロモーターを使用してもよく、または根中の活性タンパク質レ ベルを上昇させるために根促進プロモーターを使用してもよい。根を食う昆虫に 感受性の植物にとってはこのような発現が好ましい。 ある種の植物プロモーターはまた単子葉植物中でより有効であろう。例えば、 国際特許ＷＯ９１／０９９４８に記載されたイネアクチンプロモーターはトウモ ロコシ中での発現に有効である。欧州特許第０，３４２，９２６号に記載された トウモロコシユビキチンプロモーターは単子葉植物中でも使用できよう。 本発明のＤＮＡ構築物（即ち、キメラ植物遺伝子）中で使用されるプロモータ ーは、必要な場合、その調節特性を変えるように修飾されてもよい。例えば、Ｃ ａＭＶ３５Ｓプロモーターを、光の非存在下にｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現を抑制 するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の部分に結合し、葉中で活性であるが根中では活 性でないプロモーターを作製してもよい。得られたキメラプロモーターを本文中 で記載されたように使用し得る。 従って、本明細書の記載において、「ＣａＭＶ３５Ｓ」 プロモーターなる用語は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの変異体、例えば、オペ レーター領域との結合、ランダムなもしくは調節された突然変異誘発、などに由 来するプロモーターを包含する。更に、プロモーターが遺伝子発現の増進を支援 する多数の［エンハンサー配列］を含むようにプロモーターを変異させてもよい 。かかるエンハンサー配列の例はＫａｙら（１９８７）によって報告されている 。 選択された特定のプロモーターは、酵素のコーディング配列を十分に発現させ て有効量のパタチンの産生を実現しなければならない。好ましいプロモーターは ＣａＭＶ Ｅ３５Ｓプロモーター（増進ＣａＭＶ３５Ｓ）である。 本発明のＤＮＡ構築物によって産生されるＲＮＡはまた、５′非翻訳リーダー 配列を含む。この配列は、遺伝子を発現するように選択されたプロモーターに由 来し、ｍＲＮＡの翻訳を増進するように特異的に修飾され得る。５′非翻訳領域 はまた、ウイルスＲＮＡ、適当な真核性遺伝子または合成遺伝子配列から得るこ ともできる。本発明は、プロモーター配列に随伴する５′非翻訳配列に由来する 非翻訳領域を有する構築物に限定されない。 上記に指摘したように、本発明のキメラ植物遺伝子の ３′非翻訳領域は、植物中でＲＮＡの３′端にアデニレートヌクレオチドを付加 させるべく機能するポリアデニレーションシグナルを含む。好ましい３′領域の 例としては、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のような、Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニレートシグナ ルを含む３′転写非翻訳領域、または、（２）大豆７ｓ貯蔵タンパク質遺伝子及 びエンドウマメｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子〔Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆら〕のよ うな植物遺伝子がある。局在化 上述のパタチンカセットを含むベクターは植物細胞の細胞質または液胞中で活 性タンパク質を発現させる。パタチンの大部分または全部を植物分泌経路に方向 付けるのが望ましいであろう。これを達成するために、細菌遺伝子または植物遺 伝子に由来のシグナル配列を使用するのが有利であろうが、植物遺伝子のほうが 好ましいと予想される。かかるシグナル配列の例としては、エンドプロテイナー ゼＢ遺伝子（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ）及びタバコＰＲ１ｂ遺伝子（Ｃｏｒｎ ｅｌｉｓｓｅｎら）がある。欧州特許出願公開第０，３８５，９６２号に記載さ れたｐＭＯＮ１０ ８２４は、鱗翅類に活性のＢ．ｔ．ｋｕｒｓｔａｋｉタンパク質を発現させるよ うに設計された植物形質転換ベクターである。ｐＭＯＮ１０８２４中で、Ｂ．ｔ ．ｋ．コーディング配列は、成熟ＰＲ１ｂコーディング配列の１０個のアミノ酸 を加えたＰＲ１ｂシグナル配列に融合している。ＰＲ１ｂシグナルがパタチン遺 伝子に融合したベクターを作製するために、ｐＭＯＮ１０８２４をＢｇｌII及び ＮｃｏＩで切断し、ＰＲ１ｂシグナルを含む短いＢｇｌII‐ＮｃｏＩフラグメン トを単離する。結合反応では、ｐＭＯＮ１０８２４の短いＢｇｌII‐ＮｃｏＩフ ラグメントを、ｐＭＯＮ１９７１４由来の１．０ｋｂのＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフ ラグメント及びＢａｍＨＩ‐ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＯＮ１９４７０（Ｂｒｏｗ ｎら）と混合する。この反応で、パタチンコーディング配列がＰＲ１ｂ遺伝子に 由来の分泌シグナルに融合し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及び単子葉植物発現 用イントロンによって駆動されるプラスミドが構築される。双子葉植物遺伝子発 現のためにも同様の反応を使用し得る。双子葉植物発現ベクターのＮｏｔＩ‐Ｎ ｏｔＩフラグメントを後述するような双子葉植物形質転換ベクターに挿入し、欠 損（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ａｇｒｏｂａ ｃａｔｅｒｉｕｍ宿主内に起動して双子葉植物の形質転換に使用し得る。従って 、細胞外腔に分泌されるパタチンを産生する植物を作製し得る。 この単子葉植物プラスミドのＮｏｔＩ‐ＮｏｔＩフラグメントをトウモロコシ 形質転換ベクター（例えば上記のｐＭＯＮ１８１８１）に挿入して、パタチンを 分泌するトウモロコシ植物を作製し得る。 パタチンが別の細胞区画である葉緑体に局在するように指令するのが有利であ ろう。Ｎ末端に葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）を含ませることによってタンパク 質の葉緑体局在を指令し得る。異種タンパク質を葉緑体に局在させるように操作 されたＣＴＰの一例としては、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＲＵＢＩＳＣＯ小サブ ユニット遺伝子に由来のａｔｓ１Ａと呼ばれるＣＴＰがある。Ｂ．ｔ．ｋ．タン パク質の葉緑体局在化に成功するために、この移行ペプチドと、成熟ＲＵＢＩＳ ＣＯ配列の２３個のアミノ酸とに加えて移行ペプチド開裂部位の反復をコードし ているこの移行ペプチドの変異体を構築した。Ｂｒｏｗｎらによって記載された ｐＭＯＮ１９６４３は、ＧＯＸ遺伝子に融合したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｔ ｓ１Ａ移行ペプチドを含ん でおり、パタチンを葉緑体に局在させるベクターを構築するための基材として使 用され得る。ｐＭＯＮ１９６４３の完全ＥｃｏＲＩ消化及び部分ＮｃｏＩ消化を 実施し、大フラグメント（４．０ｋｂ）を単離する。結合反応中に、ｐＭＯＮ１ ９７１４由来のＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＭＯＮ１９６４３の大フ ラグメントと混合する。この反応で、パタチンコーディング配列が成熟ＲＵＢＩ ＳＣＯの２３個のアミノ酸をもつＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ移行ペプチドに融合し 、ＣａＭＶ Ｅ３５Ｓプロモーターによって駆動されるプラスミドが構築される 。または、プロモーターをＦＭＶ３５Ｓプロモーターで置換するために同様のプ ラスミドを構築してもよい。かかるプラスミドを、欠損（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に移入し、双子葉植物の形質転換に使用する。ま たは上述のように、ＮｏｔＩ‐ＮｏｔＩフラグメントをトウモロコシ形質転換ベ クターにクローニングする。その結果、葉緑体に局在するパタチンを産生する植 物が得られる。植物の形質転換及び発現 本発明の構造コーディング配列を含むキメラ植物遺伝子を、適当な任意の方法 によって植物のゲノムに挿入し得る。 適当な植物形質転換ベクターとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のベクター、並びに、例えばＨｅｒｒｅｒ ａ‐Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂｅｖａｎ（１９８３）、Ｋｌｅe（１９ ８５）及びＥＰＯ出願公開第０，１２０，５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ら）などによって開示されたベクターがある。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ ｉプラスミドまたは根誘発（Ｒｉ）プラスミドに由来の植物形質転換ベクターに 加えて、本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入するために別の方法も使用でき る。かかる方法としては、例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離 ＤＮＡ取込みを増加させる化学物質、微粒子衝撃（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉ ｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）による遊離ＤＮＡのデリバリー、ウイルスまた は花粉を用いる形質転換などがある。タバコ細胞中でのパタチンの過渡発現 双子葉植物の形質転換に特に有用なプラスミドカセットベクターはｐＭＯＮ１ １７９４である。発現カセットｐＭＯＮ１１７９４は、ＣａＭＶ Ｅ３５Ｓプロ モーターとペチュニアＨｓｐ７０の５′非翻訳リーダーとＮＯＳ遺伝子 からのポリアデニレーションシグナルを含む３′未端とから成る。ｐＭＯＮ１１ ７９４はコーディング配列挿入のためのＮｃｏＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位と植物 遺伝子発現カセットにフランキングするＮｏｔＩ‐ＮｏｔＩ部位とを含む。 ＰａｔＡ＋（配列番号１１）、ＰａｔＢ＋（配列番号１６）、ＰａｔＣ＋（配 列番号１７）及びＰａｔＧ＋（配列番号２２）の各々をｐＭＯＮ１１７９４に挿 入して、ｐＭＯＮ１９７４５、ｐＭＯＮ１９７４２、ｐＭＯＮ１７４３及びｐＭ ＯＮ１９７４４を夫々作製した。これらのベクターの各々をタバコ原形質体にエ レクトロポレートした。形質転換タバコ細胞によるパタチンの発現をウエスタン ブロット分析によって確認した。双子葉植物の安定な形質転換 パタチン遺伝子による双子葉植物の安定な形質転換はＲｏｓａｈｌらによって 報告されている。葉茎特異的プロモーターの調節下にパタチン遺伝子によってタ バコを形質転換した。パタチンが発現された。 ｐＭＯＮ１９７４５からのＮｏｔＩ‐ＮｏｔＩフラグメントを、国際特許出願 ＷＯ９２／０４４４９にＢａｒｒｙらによって開示及び記載されたＴｉプラスミ ドベクターで あるｐＭＯＮ１７２２７に挿入し、ｐＭＯＮ２２５６６を作製した。該特許出願 の記載内容は本明細書に含まれるものとする。このベクターは、形質転換植物を 選択するためにＢａｒｒｙによって記載されたグリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａ ｔｅ）耐性遺伝子を含む。同様に、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号２ ２を使用してベクターｐＭＯＮ２２５６３、２２５６４及び２２５６５を夫々作 製した。 これらのベクターを欠損（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ａｇｒｏｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩに導入し、組織培養物中のトマト外植体の形質転換に使用した。グリホ セート耐性及び植物再生に基づいて選択後、パタチン遺伝子を発現する全植物を 回収した。パタチン遺伝子の発現はウエスタンブロット分析によって確認され、 予備結果は、総タンパク質の０．１−０．５％のレベルの発現を示す。昆虫幼虫 に関するバイオアッセイは進行中である。トウモロコシ細胞中でのパタチンの過渡発現 上述のｐＭＯＮ１９７２９の１ｋｂのＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメントをｐ ＭＯＮ１９４３３に挿入した。このプラスミドは、国際特許出願ＷＯ９３／１９ １８９及び１９９２年３月１９日出願の審査中の米国特許出願０７／ ８５５，８５７（Ｂｒｏｗｎら）に記載されており、これらの記載内容は本明細 書に含まれるものとする。得られたプラスミドｐＭＯＮ１９７３１をＮｏｔＩで 消化し、得られたフラグメントを、やはりＢｒｏｗｎらによって記載されたｐＭ ＯＮ１００８１に挿入してｐＭＯＮ１９７４０を作製した。このプラスミドをＳ ｈｅｅｎら，１９９１によって記載されたようにしてトウモロコシ葉の原形質体 にエレクトロポレートした。形質転換トウモロコシ原形質体によるパタチンの発 現はウエスタンブロット分析によって確認された。 パタチンの細胞質発現を得るために、ｐＭＯＮ１９７１４のＮｃｏＩ‐Ｅｃｏ ＲＩフラグメントをｐＭＯＮ１９４３３に挿入してｐＭＯＮ１９７３０を作製し た。ｐＭＯＮ１９７３０のＮｏｔＩフラグメントをｐＭＯＮ１００８１に挿入し 、得られたプラスミドｐＭＯＮ１９７３９をトウモロコシ葉の原形質体にエレク トロポレートすると、原形質体がパタチンを産生することがウエスタンブロット 分析によって確認された。 標的シグナル含有及び非含有のＰａｔ１７もトウモロコシ原形質体中で発現さ れた。タンパク質Ｐａｔ１７＋（成 熟タンパク質Ｐａｔ１７及び液胞を標的とするためのそれ自体のシグナル配列） をコードする１．１ＫｂのＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメント（配列番号３０） をｐＭＯＮ１９６４８に挿入することによってｐＭＯＮ１９７６１を構築した。 従って、ｐＭＯＮ１９７６１は、ＣａＭＶ Ｅ３５ＳプロモーターとＨｓｐ７０ イントロンとＰａｔ１７＋遺伝子とトウモロコシ細胞中での発現用ＮＯＳターミ ネーターとを含んでいる。 細胞質発現用ベクターを得るために、ｐＭＯＮ１９７６１中のＰａｔ１７＋配 列を、ｐＭＯＮ２５２１３からのＰａｔ１７_mタンパク質（配列番号３１）をコ ードするＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメントによって置換して、構築物ｐＭＯＮ ２５２２３を作製した。 ｐＭＯＮ２５２２４は、２つのフラグメント、即ち、ｐＭＯＮ１９６４３（Ｂ ｒｏｗｎら）のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＳＳＵ １ａ遺伝 子（Ｔｉｍｋｏら）からの原形質体移行ペプチド（ＣＴＰ）を含む０．３Ｋｂの ＸｂａＩ‐ＮｃｏＩフラグメントと、ｐＭＯＮ２５２１３のＰａｔ１７_mの１Ｋ ｂのＮｃｏＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメントとをｐＭＯＮ１９７６１（ＸｂａＩ‐Ｅ ｃｏ ＲＩ）に挿入することによって作製した。従って、ｐＭＯＮ２５２２４は、Ｃａ ＭＶ Ｅ３５ＳプロモーターとＨｓｐ７０イントロンとＣＴＰ／Ｐａｔ１７_mコ ーディング配列とＮＯＳターミネーターとを含む。 細胞外標的の場合には、分泌タンパク質の細胞外シグナルペプチドをコードす るエンドプロテイナーゼＢのｃＤＮＡ（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ）の５′端を 、ｐＭＯＮ２５２１３からのＰａｔ１７_mの遺伝子に接合した。キメラ遺伝子を 含むＢｇｌII‐ＥｃｏＲＩフラグメントを、スプライシングオーバーラップ延長 法（Ｈｏｒｔｏｎら）によって作製し、ｐＭＯＮ１９７６１（ＢａｍＨＩ‐Ｅｃ ｏＲＩ）に挿入してｐＭＯＮ２５２２５を作製した。 これらの全部の構築物をトウモロコシ葉の原形質体にエレクトロポレートし、 Ｐａｔ１７_mの発現をウエスタンブロット分析によって確認した。パタチン遺伝子によるトウモロコシの安定な形質転換 トウモロコシ形質転換ベクターｐＭＯＮ１８１８１をｐＭＯＮ１９６５３及び ｐＭＯＮ１９６４３（Ｂｒｏｗｎら）から構築した。この構築物は、ＣａＭＶ Ｅ３５ＳプロモーターとＨｓｐ７０イントロンとＣＰ４グリホセート選択 マーカーとＮＯＳターミネーターとのカセット、ＣａＭＶ Ｅ３５Ｓプロモータ ーとＨｓｐ７０イントロンとＧＯＸグリホセート選択マーカーとＮＯＳターミネ ーターとのカセット、及び、パタチン遺伝子を含む遺伝子発現カセット挿入用の 単一ＮｏｔＩ部位を含む。配列番号１１及び配列番号３０の各々をＮｏｔＩ‐Ｎ ｏｔＩフラグメントとしてｐＭＯＮ１８１８１に挿入し、ｐＭＯＮ１９７４６及 びｐＭＯＮ１９７６４を夫々作製した。 これらのベクターは、Ｂｒｏｗｎらによって記載されたようにバイオリスティ ック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子銃を用いた胚形成組織培養細胞の衝撃によって 挿入した。形質転換細胞をグリホセート耐性に基づいて選択し、全植物を再生し た。ウエスタンブロット分析、エステラーゼ活性アッセイ及び／または虫害耐性 アッセイによれば、虫害耐性植物は総タンパク質の０．２−０．５％で遺伝子を 発現していることが確認された。単子葉植物発現を向上させる合成遺伝子 コーディング配列の修飾は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ のデルタ内毒素配列のような別の殺虫性タンパク質遺伝子の発現を向上させるこ とが判明した （Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ ＆ Ｐｅｒｌａｋ；ＷＯ９３／０７２７８、Ｃｉｂａ‐ Ｇｅｉｇｙ）。従って、植物、特にトウモロコシ中のパタチン発現を向上させる ように修飾コーディング配列を設計した。修飾したＰａｔ１７＋配列を配列番号 ３３に示す。配列番号３３を含むＤＮＡ配列を合成し、ｐＭＯＮ１９４７０（Ｂ ｒｏｗｎら）のようなトウモロコシ発現カセットベクターに挿入する。トウモロ コシ発現カセットを次にｐＭＯＮ１８１８１またはトウモロコシ形質転換用選択 マーカー遺伝子を含む他のトウモロコシ植物形質転換ベクターに挿入すると、Ｐ ａｔ１７＋を発現する完全トウモロコシ植物が得られるであろう。 本発明が、本発明に固有の明白な利点を伴って前記の諸目的を達成するために 極めて適当であることが上述の記載より理解されよう。いくつかの特徴及びサブ コンビネーションが有用であり、それらは他の特徴及びサブコンビネーションか ら独立して使用され得ることが理解されよう。このことは請求の範囲から考察す ることができ請求の範囲に包含される。本発明の範囲を逸脱することなく本発明 の多くの実施態様が可能であろうが、本文中に記載のすべての事項は例示的であ って限定的ではないことを理解されたい。 本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許の各々 についてそれらが参照によって本明細書に含まれると記載した通り、参照によっ て本発明に包含される。 参照文献 配列表 配列番号:1 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:2 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:4 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:5 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:6 配列の長さ:8 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:7 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:8 配列の長さ:8 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:9 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:10 配列の長さ:15 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列 配列番号:11 配列の長さ:1171 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:37 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 合成DNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:26 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 合成DNA 配列 配列番号:14 配列の長さ:1105 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:15 配列の長さ:1106 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:16 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:17 配列の長さ:1175 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:18 配列の長さ:1106 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:19 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:20 配列の長さ:1106 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:21 配列の長さ:1109 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:22 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:23 配列の長さ:1104 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:24 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:25 配列の長さ:1175 配列の型:核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:26 配列の長さ:33 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 合成DNA 配列 配列番号:27 配列の長さ:33 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 合成DNA 配列 配列番号:28 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:29 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:30 配列の長さ:1172 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:31 配列の長さ:1106 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:32 配列の長さ:45 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 合成DNA 配列 配列番号:33 配列の長さ:1164 配列の型: 核酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 Detailed Description of the Invention Insect control methodField of the invention   The present invention applies the protein directly to the plant or the protein on the plant. Plants are genetically engineered to be produced by microorganisms or produce proteins Method of supplying protein to plant to control insect damage of plant by modification , And microorganisms and plants useful in the method.Background of the Invention   The use of natural substances such as proteins is a well-known method for controlling many pests. Is the law. For example, to control pests of both Lepidoptera and Coleoptera, Bacillus ・ ThuringiensisBacillus  thuringiensis(B. t. ) Endotoxin is used. The genes that produce these endotoxins are It has been introduced and expressed in various plants such as Baco and tomato. However, B ． t. There are several economically important pests that are not susceptible to endotoxin. This Examples of such important pests include the boll weevil (BWV),Anthono mus   grandis, And corn rootworm (CRW),Diabrotica   spp. There is. Furthermore, B. t. Insects sensitive to endotoxin Having another different gene product to control is essential from the standpoint of resistance management. If not, it is important.   Several other known insecticidal proteins have been found in plants. These ta The proteins include lectins, amylase inhibitors and protease inhibitors. There is a bitter. These affect insect growth and development when taken in high doses. Ruger [Boulter et al., 1989; Broadway & Duffey, 1 986; Czapla & Lang, 1990; Gatehouse et al., 19 86; Heusing et al., 1991; Ishimoto & K .; Kitamu Ra, 1989; Murdock et al., 1990; Shukle & Murdo. ck, 1983], B.I. t. It does not show a fast-acting biocidal effect like proteins.   An object of the present invention is a protein capable of controlling BWV, CRW or other pests. And to provide genes useful for the production of such proteins. The present invention Another purpose of the gene structure is to insert such genetic material into microorganisms and plant cells. It is to provide a construction and insertion method. Yet another object of the present invention is to provide such genetics. It is to provide a transformed microorganism and a plant having a substance.Summary of the invention   Patatin, the main storage protein of potato tubers, is Shi (WCRW),Diabrotica  virgifera, Southern Uriham SI (SCRW),Diabrotica  undecimpunctataas well as Boll Weevil (BWV),Anthonomus  grandisSuch as It has been found to control a variety of insects. Patatin kills larvae to some extent Cause the growth of surviving larvae to atrophy and prevent or severely suppress its maturation And stop breeding completely. These proteins are esterases (lipid acyl Hydrolase) activity, and may be applied directly to plants, Or another method, for example plant colonization transformed to produce this enzyme. It may be supplied by a microorganism, or a plant which has been similarly transformed.   Patatin is potato [Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews et al., 1988] and other plants, especially Solanaceae [Ga. Tan et al., 1991; Vancanneyt et al., 1989]. It is a family of quality. Pas in potatoes Tatin is found primarily in tubers, but at very low levels in other plant organs. Detected [Hofgen & Willmitzer, 1990]. Several kinds of patterns The esterase substrate specificity of the tin isoenzyme has been studied [Hofgen & Willmitzer, 1990; Racusen, 1986].   The gene encoding patatin is described in Mignery et al., 1984, Migner. Y. et al., 1988, Stiekema et al., 1988 and others. Has been isolated. Rosahl et al., 1987 transferred patatin to tobacco plants. Then, the expression of patatin was observed. In this test, the patatin gene varies from plant to plant. It has been proved that the species can be expressed.   The patatin gene was similarly isolated and inserted into an appropriate transformation vector cassette, Next, the vector cassette is used to (1) generate a patatin-producing gene when applied to plants. To transform plant-establishing microorganisms to control insects, or (2) the plant itself expresses a gene and produces patatin, and It integrates into the plant's genome to protect against aggression. In addition, insect control proteins Co One or more types of B. t. Transform or produce plants to co-express the gene You may improve the seed. This results in (1) protection from a wide range of pests and And / or (2) a plant with two modes of action against certain pests This is an important tool in resistance management. B. t. Express the gene An example of a plant transformed in this way is [Fischho, filed on Feb. 12, 1990]. ff et al.), European Patent Application Publication No. 0, corresponding to US Patent Application No. 476,661. No. 386,962. The descriptions of these documents are included in this specification. Shall be provided. In addition, proteinase inhibitors are among other insecticidal proteins. Potato papain inhibitor has been found to have a synergistic effect with activity. Tar [Rodis & Hoff, 1984] or soybean trypsin inhibitor -Multiple proteinases such as genes encoding [Ryan, 1990] Transforming or breeding plants to co-express the ze inhibitor gene Good.   To achieve the above, one object of the present invention is to provide an effective amount of killing insects to ingest. To provide a method for controlling insect damage to plants, which comprises supplying insect patatin. . This way Thus, a plant-fixing microorganism transformed to express the patatin gene was prepared. Then, this was introduced into a plant to express the gene and produce an effective insecticidal amount of patatin. You can This method also includes the plant to be protected by the following DNA molecule: It may be transfectively transformed. The DNA molecule is (I) a promoter that functions to produce the RNA sequence in plant cells, (Ii) a structural coding sequence encoding patatin, (Iii) Polyadenylate nucleotides at the 3'end of the RNA sequence in the plant cell And a 3'untranslated region that functions to add Heterologous to the coding sequence, the promoter is the structural coding sequence Operably linked to the column and the structural coding sequence is operably linked to the untranslated region. Are combined as possible. Preferably the plant contains about 0.1-0.5% of the total protein. Will express levels of patatin.   The present invention also relates to genetically transformed insect resistant corn, cotton, tomato. And potato plants.   The expression "controlling insect damage" used in the text means lethal larvae and larval development. To suppress (atrophy) or decrease the reproductive rate This means reducing the number of insects that result in a beneficial yield loss. In the text The term "insecticidal" as used in is used for larval lethality, larval stunting (atrophy) and Traits that can reduce the number of insects that lead to beneficial yield loss due to reduced reproduction Means   As used herein, the expression "structural coding sequence" refers to DNA to mRN. Produced by cells transcribed into A and then translated into the desired polypeptide By a DNA sequence that encodes a polypeptide.   As used herein, the term "patatin" refers to SEQ ID NO: 31 below. 75% or more homology to the loaded protein, preferably 80% or more Plant protein having a homology of, more preferably 85% or more Means The term is also designed for improved expression in monocots. Also included are proteins produced from the synthesized synthetic DNA sequences.Detailed Description of the Invention   Patatin is potato [Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews et al., 1988] and other plants, especially Solanaceae [Ga. nal, 1991; Vancanneyt et al., 1989]. It is a family. In potato, patatin is found mainly in tubers Is detected at extremely low levels in other plant organs [Hofgen & Wi llmitzer, 1990]]]. Esterase substrates for several patatin isoenzymes Specificity was investigated [Hofgen & Willmitzer, 1990; Ra. cusen, 1986], found to have a broad substrate specificity, these enzymes Substrate requirements have been demonstrated to be low. The plant-derived chairs disclosed in detail herein. All patatins and their equivalents and their homologous proteins are incorporated into the natural DNA sequence. Prevents insect damage to plants, whether derived from synthetic DNA sequences or derived Use to remove is within the scope of the present invention.   Crude patatin preparations obtained from potatoes are commercially available. For example, Sig ma Chemical Company, St. Louis, MO is Sig acid phosphatase (P-1146 and P-3752) or apra by ma Is supplying a potato protein preparation, designated as . Literature (Racusen & Foote, 1980; Rank et al., 1983). The tubers may be harvested to prepare a protein extract.Biological effect assay Artificial feeding bioassay   SCRW, BWV, Colorado potato beetle (CPB),Leptinotarsa  decemlineata And Awanomeiga (ECB),Ostrinia  n ubilalis Activity assay against larvae of Marone et al., 1985. Overlay test sample on an agar feed similar to that described for SCRW. I went by. In 4-5 ml of 10 mM HEPES, pH 7.5 Solubilize the protein and use the same molecular weight cut-off 3500 tube in the same bag. Test samples were prepared by dialysis in fa. Newborn larvae treated on feed It was cultivated at 26 ° C. for 5 days or 6 days, and the mortality rate and growth atrophy were evaluated. P-3 The assay results for 752 (Sigma) are shown in Table 1. This crude potato preparation , Showed a broad spectrum of insecticidal activity.   Weight of SCRW after 5 days of contact (Table 2) and weight of ECB after 6 days of contact The results of accurate quantitative measurement of (Table 3) are shown below. Reared with feed containing P-3752 The weight of the SCRW larvae was 92% lower than that of the control, and the body weight of the ECB larvae was Had 62% less weight than the control.   Active against southern corn beetle (SCRW) and boll weevil (BWV) Of the pesticidal component of P-3752, which is heat-labile, ammonium sulfate-precipitated, The size of the offspring was determined by a protease sensitivity experiment.   The effect of P-3752 is due to direct effect of ingested patatin To confirm that it is not an indirect effect due to the substance response, the ECB and SCRW Then, a feed selection test was carried out. The results of this selection test are based on P-3752 treated feed and It was shown that no significant unbalanced diet was produced in any of the diets treated with Tris and Tris. T There is no phenomenon that P-3752 treated feed is repelled compared to ris treated feed. won.   A long-term (25-day) assay of P-3752 for SCRW showed that Use larvae to refresh the surviving insects It was transferred several times to freshly treated feed. After the end of the test, the control larvae were all pupated It was Compared to this, 50% of the treated larvae are dead, and the remaining 50% are primary. There was only 16% gain in weight gain (2.48 vs 2.14 mg). This indicates that the larvae were stunted rather than merely stunted. This is an insect It has important consequences from the standpoint of control, because the larvae cannot develop until the adult stage. Then, the number of the root beetle in the offspring will decrease.   Western Black Beetle (WCRW),Diabrotica  virgife ra For, only second-instar larvae can be used for laboratory testing. Against WCRW Parallel 3rd instar larvae of SCRW were also used to perform the P-3752 test. Designed a essay. Second-instar larvae of SCRW and WCRW treated with P-3752 The worms showed weight gains of only 13% and 11%, respectively. After 7 days in control, SC Weight gain was 474% for RW and 200% for WCRW. This is WCRW Suggests that the activity of patatin against SCRW is almost equivalent to its activity against SCRW To do.   P-3752 is a tobacco moth larva (TBW),Heliothis  vires cens , Shiroichimonjiyoto (B AW),Spodoptera  exigua, LarvaHelic overpa   zea, Larva of the cottonweed,Pectinophora  goss ypiella And larvaeManduca  sextaSlightly against Active and against these larvae at concentrations that give SCRW an atrophy of 3 Atrophy of rating 1-1.5 was given. P-3752 is a black weevil,Agroti s   ipsilonWas given an atrophy of 2.5. (Table 1 shows the atrophy evaluation Definition). P-3752 is a peach aphid,Myzus  per sicae Was inactive.Plant tissue bioassay (1) Potato: 1 g of crude P-3752 was added to 4 ml of 25 mM Tris, p. It was dissolved in H7.5 buffer, then dialyzed against a 0.2 μm membrane and filtered. Trit on® X-100 was added to prepare a 0.1% solution. Potato The leaves were dipped in the enzyme preparation and placed on wet filter paper in a petri dish. Add CPB larvae The plates were incubated at 27 ° C for 3 days. P-37 potato leaves As a result of treatment with 52, atrophy of CPB larvae and a decrease in food intake were observed. I started. At the end of the assay, the residual leaf tissue of the control leaves compared to the P-3752 treated leaves The amount was quite small. (2) Corn and cotton: Black Mexican sweet corn cal Remove the BMS or cotton callus from the agar plate and place in a 50 ml centrifuge tube. Moved. Ion exchange chromatography (IEC) clinical centrifuge sets callus The mixture was stirred on the scale 8 for 5 minutes and centrifuged. The supernatant was decanted. 15 ml callus pellet To a 50 ml tube containing 30 ml of liquid 2% agar was added. After mixing thoroughly , Pipe the feed to the assay area of the insect bioassay (assay arena) Injected. Add dialyzed P-3752 as a feed coating layer (20% volume) And assayed as described above.   The corn roots and seedlings were excised and the crude P-3752 or 25 mM Tris, pH 7.5 buffer was vacuum infiltrated (Inflt.). Contrast sump Were soaked in Tris buffer. Approximately 10-15 test pieces or seedlings of roots Three test pieces of tissue were placed in the wells of a 24-well tissue culture dish and repeated 4 times . Four newborn larvae of SCRW were added to each well. Assay samples at 4 ° C for 4 A day Incubate and observe mortality and average larval weight at this time. These a The results of the assay are shown in Table 4.   Therefore, when P-3752 was ingested at the same time as plant tissue, four kinds of insects (S The insecticidal activity was retained against all CRW, BWV, CRB and ECB). These feeding tests are based on the fact that the only nutrients in the feed are plant tissues (roots, seedlings, callus or leaves). Shows that patatin is pesticidal in an assay consisting ofWorking mode test   The following test shows that patatin, which is the insecticidal active ingredient of P-3752, directly affects the insect itself. It works and is proved by the above experiment. The activity revealed may be due to the active ingredient acting on the insect feed before feeding. Indicates that it is not possible.Feed effect test   1 g of P-3752 was added to 10 ml of 25 mM Tris, pH 7.6 buffer. Dissolve and then in a tube with a molecular weight cutoff (MWCO) of 12-14,000 Dialyzed into the same buffer. After filtration through 0.2 μm, a 50 μl aliquot was added to the insect Added to insect-fed wells on two plates 4 days before addition. Both plates Were incubated at 27 ° C for 4 days. After incubation, one plate Was heated at 80 ° C. for 1 hour to inactivate the enzyme. Add a 50 μl aliquot to the third pre-plate Added to the tray. Like this, incubate the plate, incubate The SCRW bioreactor using heated and non-incubated plates I made a essay.   The SCRW activity obtained in the feed pre-incubation test is shown below. Not incubated P-3752-6^*** Incubated P-3752-0^** Incubated and heated P-3752-0   Although some activity was lost during feed incubation, complete loss of activity The loss was caused by heat treatment. This data is consistent with the post-ingestion mode of action. Considering the plant tissue assay and variability to various insects comprehensively, S Protein activity against CRW and other insects is not due to feeding effects Indicate thatProtein identification   Purified insecticidal active ingredient from P-3752, partially sequenced and characterized . The active substance (s) is a lipid acylhydrolase enzyme of potato. It has been identified to be the patatin that is the Amily.Protein isolation   Four different protocols for purifying SCRW bioactive components from P-3752 I used col.Purification of SCRW activity by anion exchange chromatography   Q-Sepharose (Pharmacia) anion exchange chromatography and And MONO-Q (HR5 / 5, Pharmacia) anion exchange chromatograph S-active ingredients from P-3752 by sequentially using the fee Was purified. According to the protein level in the SCRW active fraction, the evaluations observed^** Was found to be obtained when the protein concentration of the feed was 31 ppm. SDS-PAGE shows three major protein bands (molecular weight 42, 000, ˜26,000 and ˜16,000).5-step purification of SCRW activity   Five consecutive purification steps to purify the SCRW active ingredient from P-3752 It was used. These steps are membrane sizing, ammonium sulfate precipitation, Q-sepharose IE It consists of C, S-Sepharose IEC and P-200SEC. Most refined S The SDS-PAGE of the CRW active fraction had a molecular weight of 42,000, 26,000 and 26,000. A protein band was shown at ˜16,000.Purification of biological activity by isoelectric focusing   RF3 protein fractionator (Rainin) was used as per manufacturer's instructions The SCRW bioactive potato protein was purified by a two-step sequential treatment. The SDS-PAGE profile of the SCRW active fraction was purified by 5 steps and anion exchange. Profiles observed in the active fraction obtained by recombinant purification Was very similar to Isoelectric focusing (IEF) gel has a pH of 4.6-5. ． 1 showed that the protein was fractionated, which was the reported patatin pI Matches the range (Racusen & Foote, 1980).   In order to separate the patatin isoenzymes, a narrow pH range (pH 4-5) was used on RF3. ) Was carried out continuously. As expected, the peak of biological activity is pI4 ． It was observed with proteins 6-5.1. These fractions contain different isoenzyme patterns. Had different levels of bioactivity. The biological activity in the fraction is 80- Evaluated at a dose of 512 ppm^*-**The mortality rate with atrophy was 0 to. Creature Some of the active fractions have only two major isoenzymes, which are bioactive. Therefore, we show that the complex pattern of isoenzymes is not required.Purification by natural PAGE   P-3752 was electrophoresed under native conditions, and α-naphthylacetate was used as the substrate. A band triplet of esterase activity was isolated (using tate). Gel purification The esterase-positive material was active against SCRW and was evaluated to be 1.5.^*Atrophy Occurred. This material is by SDS-PAGE Major bands at molecular weights 42,000, ~ 26,000 and ~ 16,000, This was consistent with the profiles already observed with other purification methods. From this result, It is further confirmed that tachin is an insecticidal ingredient derived from potato.Amino acid sequence   SCRW activity chromatography obtained by anion exchange purification and 5-step purification All protein bands in the fraction (molecular weight 42,000, ~ 26,000 and ~ 16,000) on NH₂The -terminal amino acid sequence was obtained. All of the active fraction Comprehensive sequence data was created for the bands. Most of the bands are patatin NH of one isoenzyme (Stiekema et al., 1988)₂-Terminal (SEQ ID NO: 1 ) Or 85% above the 15 amino acid sequence of the internal sequence (SEQ ID NO: 7) It showed a rotating homology. One of the 17kD bands is the published NH of patatin₂ -Showed 75% homology to the first 8 amino acids of the terminal sequence. other The 17 kD band on the other hand is 8 for the first 8 amino acids of the published internal sequence. It showed a homology of more than 5%. These bands are the components of patatin protein. Denotes a degradant. The presence of the isoenzyme is NH₂-Both terminal and internal sequences Clearly demonstrated by the variability of the amino acids at positions 1 and 3 of                     N-terminal amino acid sequence Published sequence: KLEEMVTVLSIDGGG  (Array 1) Band 1 (42kD): XLGEMVTVLSIDGGG  (Array 2) Band 2 (28kD): TLGEMVTVLSIDGGG  (Array 3) Band 3 (26kD): TLGEMVTVLSIDGGG  (Array 4) Band 4 (24kD): KLXEMVTVLSIDGGG  (Array 5) Band 5a (17kD): XXEEMVTV  (Array 6)                     Internal array  (224th amino acid) Published sequence: SLDYKQMLLLSLGTG  (Array 7) Band 5b (17kD): KLDYKQML  (Array 8) Band 6 (16kD):SLXYKQMLLLSLGTG  (Array 9) Band 7 (15kD):SLNYKQMLLLSLGTG  (Array 10)Esterase activity   Several experiments were performed to test the esterase activity in the SCRW activity fraction. gave.α-naphthyl acetate substrate : SDS-PAGE (10- 20%), the SCRW active fraction (obtained from the 5 step purification) was It was determined whether or not it exhibited a laccase activity [Racusen, 1984]. Divide the gel in two Each was loaded with a set of heated and unheated SCRW active fractions. Unheated sump A single esterase-positive band with a molecular weight of 55,000 was observed in the sample. heating In the sample, a band with a starting molecular weight of 42,000 was observed, and at the same time, 55, There were no 000 bands. This result shows that the esterase activity of patatin Consistent with the literature report on electrophoretic mobility (Racusen, 1984). Addition No band with a molecular weight of 55,000 was observed in the heat sample, indicating that SDS It is shown that heat treatment in removes esterase activity. Molecular weight of 55,000 The band with a starting molecular weight of 42,000 is coomassed in the heated sample without -Observed by staining.p-nitrophenyl substrate specificity test   Series of p-nitrophenyl esters (C-2, C-4, C-6, C-8, C-10, C-12, C-14 and C-16 ester) The quality specificity was determined. The C-8 and C-10 esters of p-NP are other For most patatins tested, the esterase activity was always It was the best substrate.Lipid ester substrate   Purified SCRW active fraction (obtained by 5 step purification) The ability to hydrolyze was tested. Purified SCRW active fraction by dissolving each lipid Incubated with an aliquot of Three solvent development systems (Pernes et al., Analyze the sample by TLC (Thin Layer Chromatography) using 1980) did. Four lipids showed significant modification by TLC. These are ole oil Lysolecithin, dioleoyl L-α-phosphatidylcholine, 1-monolinoleno Ill-rac-glycerol and diolein (Sigma). these New TLC Spores of Rf 0.37 in Organic Extract of Reaction Mixture of Lipid / Active Fraction Is a free fatty acid by comparison with linole and olein fatty acid standards. Identified. Therefore, the SCRW active material is suitable for these four lipid esters. Shows esterase activity.   The midgut was excised from WCRW third-instar larvae reared in corn roots. Midgut lipids are extracted, dissolved and purified Incubated at midgut pH (pH 6.55) with the SCRW active fraction. Samples were analyzed by TLC using the method described above. Purified SCRW active fraction Showed esterase activity on WCRW midgut phospholipids at midgut pH. This represents a possible mode of action for the insecticidal activity of patatin.Alternative source of patatin   All initial experiments were conducted by Minnesota Russet var. Kran P-37, a commercial enzyme preparation (Sigma) obtained from potato potato tubers No. 52 was used, so the insecticidal activity patatin was obtained from new potato tuber tissue. It was desired to prove that it could be recovered. In essence the literature (Racusen &   Prepare the tuber extract as described in Foote, 1980; Park et al., 1983). Made. Three commercially available S.tuberosumCultivars (Russet, De siree and LaChipper) and 7 wild species (S.Kurtzian um , S.berthaultii, S.tarijense, S.acaul e , S.demissum, S,cardiophyllumAnd S.raph anifolium ,all Inter-Regional Potato Induction S station, USDA, ARS, Sturgeon Bay, WI). Was analyzed. According to SDS-PAGE and Western blot assay The extract was patatin positive and all were found to be Sterase positive, all insecticidal activity against SCRW, ie score 2-3 Showed atrophy. See Table 5. From this result, it was confirmed that the insecticidal activity patterns were It is possible to isolate tin, and to analyze many of the proteins in this class. It can be expected that the members will have insecticidal properties.   S.berthaultii, S.KurtzianumAnd S.tarij ense Extracts from the two biomarkers against two additional target insects, CPB and ECB. I made it. The bioassay data is summarized in Table 6 below. These extracts are C Although it showed almost no activity against PB, 1X was suitable for larvae of ECB. There was moderate to significant atrophy at the rate. However, 0.1 × As seen from the absence of any activity against ECB larvae at the applied dose, this ECB larvae are not as susceptible to SCRW larvae to their potato extracts? It was.   Southern analysis of patatin homologous proteins in the genomic DNA of 9 different plants. I tested. Α-of SEQ ID NO: 11³²Probe Southern blot with P-labeled probe Bing revealed the presence of homologous sequences in several other plant species. corn Strong signals were obtained in tomato, tomato, sugar beet, rice and potato. this In the experiment, the individual bands could not be separated. However, smear The size of rs) and its strength were similar in all of these species. Zut Weak signals were also observed in kini, soybeans and rape (canola). It appeared as a few discontinuous bands in the DNA of the species. Cucumber and Arab idopsis is detectable with patatin probe under the conditions used in this experiment It showed no hybridization. The reason for this is probably that Probably due to the small amount of DNA loaded as observed with Um staining.   The DNA sequences of these homologous proteins can be found by one of ordinary skill in the art. Easy to obtain and insert into plants or other organisms by known means . The insecticidal properties of such proteins can be determined, for example, by baculovirus or E. coli. Is best tested after heterologous expression from. Therefore, it is used in the method of the present invention. Another possible protein is obtained in a routine amount using known methods and then planted. May be used to protect items from insect damage.Gene identification   The patatin gene has been cloned by several researchers. Mign The sequence disclosed by ery et al., 1984 was called GM203. This is not It has a complete signal sequence. Mignery et al., 1988, GM203. The genomic clone that surrounds and contains the complete signal sequence was identified and named PS20. did. Uses PS20 signal sequence and GM203 cDNA coding portion SEQ ID NO: 11 was constructed and is hereinafter referred to as PatA +. This further limits NcoI A site and an EcoRI restriction site are included immediately after the translation stop codon.Solanum   tuberosum  cv. Russet  Burbank   20 cDNAs were extracted from potato cultivar Russet Burbank tubers. Separated and sequenced. The deduced amino acid sequence has 11 sequences that differ in these cDNAs. Tachiniso fermentation Indicates that the element is coded. These 11 proteins are SEQ ID NO: 11 Compared to PatA +, it has about 82% to 100% concordance, Differences occur at many locations along the length. 11 different patatin isoenzymes The sequences of 11 different representative cDNAs encoding It A pair of 5'nucleotides encoding the first multiple codons of the signal sequence The corresponding SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 corresponding to the 3'end of the coding sequence Subsequent cloning operation of cDNA by PCR procedure used as a primer Processed for. The “+” sign includes the native signal coding sequence. Indicates that Some cDNAs contain a complete native signal coding sequence. Similar P using no SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 27 as primers Only the mature protein coding sequence was obtained from the CR procedure. Mature protein The presence of the coding sequence is indicated by the subscript "m". Solanum Berthaultii   Reverse transcription of tuber mRNA and use of SEQ ID NOs: 26 and 27 above as primers PCR of the two-phase potato S.berthaultiiFrom patter Chin cDNA was isolated. Duplicate resulting from the amplification process A number of independent PCR reactions were performed to prevent the isolation of clones.   A total of 14 patatin cDNAs were partially sequenced. 14 cDNAs (Pa (t1 to Pat14) all have unique nucleotide sequences This is the S.berthaultiiAt least 14 different patterns in the tuber Suggests the presence of tin mRNA. The sequence of Pat3 + is SEQ ID NO: 28. It The sequence of Pat10 + is SEQ ID NO: 29. The deduced amino acid sequence is 14 c. It shows that the DNA encodes at least 11 different proteins. S.berthaultii The tuber-derived cDNA sequences were generally quite similar. Only 12 amino acid positions (3%) out of a total of 367 residues show sequence variability. Indicated. The amino acid residues present at each of these positions are shown in Table 8. These ranks In 5 of the positions there was only 1 mutant clone with a unique residue. These mutations may reflect real differences between mRNAs or during the PCR process It could be the result of an error that occurred in. Greater variability exists in the remaining 7 positions Was present and at least two cDNAs had alternative amino acids. Different amino acids Each of the 9 groups of sequences has a unique residue pattern at these 7 positions. Was. In some cases, A conservative mutation such as the Thr to Ser mutation at position 164 occurred. That In other cases there were more dramatic differences such as the introduction of proline at position 148. . Solanum cardiophyllum   as mentioned abovesolanum  cardiophyllumIsolated from tuber Ten cDNA clones were prepared by PCR using mRNA. Each black Nucleotide sequences were obtained for at least 75% of the length of the region. Pat1 The full length sequence of one clone named 7+ is the sequence It is shown by the number 30. SEQ ID NO: 31 is the engineered mature form of Pat17_mAnd It S.cardiophyllumThe clones were almost equal, but random Only nucleotide sequence variations exist, which may be due to real differences or PCR errors. It may be due to it. However, at positions 54 and 519, multiple clones It was observed to have equal mutations, which caused these mutations to be involved in the amplification process. Suggest that it is not the cause. The nucleotide pattern at these positions has a small It was shown that at least 4 different mRNAs were present. cDNA clone In this set of, two groups of mRNAs were isolated multiple times and two other groups were isolated. Loop mRNA was isolated only once.   Multiple S.cardiophyllumThe deduced amino acid sequence of the clone is also extremely It was similar. There are 8 groups of unique amino acid sequences, and the sequences of each group are It differs from the sequences of the other groups by one residue. Amino acid equivalent to Pat17 + sequence The cDNA clone encoding the sequence was recovered twice. 7 other cDNAs (Pa t18 +, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ and 24+) is a single unit. Contained a sigma residue.Gene transformation   As mentioned above, the patatin gene can be isolated from various plant sources. Then this One or more of these genes are used to transform bacterial cells or plant cells. It is advisable to produce patatin to carry out the method of the present invention. Various patatin sequences The operating method used is described below.Manipulation of patatin cDNA   Incorporating the patatin gene into a vector suitable for expression of patatin in heterologous host cells In order to integrate it, it is necessary to introduce an appropriate restriction site near the end of the gene. It was The goal of this mutagenesis is to minimize the non-coding flanking sequences. Producing cassettes containing protein coding sequences having Was to incorporate a useful restriction site to activate the. Contains signal peptide Invoke intact coding sequences or only mature coding sequences The cassette was designed so that PatA_mIn the case of these cassettes Two mutagenic primers were designed to generate Sequence number 12 Mutagenesis by means of lysine at the N-terminus of the mature protein is a two amino acid (meth) Onine-alanine), An NcoI site was introduced and mutagenesis with SEQ ID NO: 13 resulted in a second stop codon. And EcoRI site were added.   The resulting modified sequence is PatA of SEQ ID NO: 14._mWas identified. other As described above, PCR and SEQ ID NO: 26 and sequence were also applied to all cDNAs. No. 27 primer, No. 32 and No. 27 primer were used. Similar modifications and restriction sites were introduced.Expression of patatin in E. coli   PatA_mThe DNA coding sequence of (SEQ ID NO: 14) was added to the recA promoter. And a G10 reader (Olins et al., 1989), pBR327 (So beron et al., 1980) and inserted into the E. coli expression vector pMON5766. It was The obtained vector pMON19714 was activated in Escherichia coli JM101 strain. Then use Western blot analysis and p-nitrophenyl C-10 ester This strain was found to be PatA_mIs producing It was   Pat17_mDNA coding sequence and PatA_mDNA coding Each of the rows is labeled with the AraBAD promoter (when cells are grown in arabinose Kininiki) And pMON6235 with G10 leader and ampicillin resistance marker gene It was inserted into the original E. coli expression vector. The resulting vector, Pat17_mTo Including pMON25213 and PatA_mContaining pMON25216 in E. coli JM Introduced into 101 strains.   Patatin is expressed by transformed E. coli. However, B body (RB) It is compartmentalized inside. SCR using intact cells and solubilized RB W assay was performed. The results are shown in Table 9. Expression of patatin in plant colonizing bacteria   To control insects, one or more patatins in plant colonizing bacteria It is desirable to express and then spread this bacterium to plants. Insects are nurtured by plants Therefore, the patatin produced by the plant colonizer is taken in a toxic dose. Plant colonizers can be Pseudomonas, Pseudomonas or Aggro Bacteria that live on the surface of plants, such as Agrobacterium sp. Or, as in Claviobacter, Clavobacter species, plant vascular It may be one that lives in the structure. In the case of surface colonizers, these gram shades The patatin gene may be inserted into a broad host range vector capable of replicating in a sex host. Or An example of such a vector is pKT231 [Bagda of the IncQ incompatibility group. sarian et al., 1981] or pVK100 [Knau of the IncP group. f, 1982]. In the case of an endophyte, a homologous set The patatin gene may be inserted into the chromosome by replacement, or The gene may be integrated into a suitable transposon that can insert the chromosome into a growing bacterium. Yes.Expression of patatin in baculovirus   In pending US patent application Ser. No. 07 / 941,363 filed Sep. 4, 1992 Patatin was added to the baculovirus donor vector pMON14327 as described. The gene was cloned as an NcoI / EcoRI fragment. The above patent The description of the application is included in the present specification. Donor vector pMON14 327 is the ampicillin resistance gene and the left and right arms of the Tn7 transposon Containing a gentamicin resistance gene between these arms and a strong baculovirus. It contains a ruth polyhedrin promoter and a polylinker. Baculovirus sha Toluvector or bacmid is an infectivity gene inside the lacZ gene. Kana recombined into the Lame mini attTn 'site and the AcNPV viral genome It is composed of a mycin resistance gene. Tetracycline resistant helper plastic Patin or GUS gene and marker inheritance using Smid pMON7124 By transposing the offspring into the viral genome (Luckow et al., 1993) Recombinant AcNPV virus was produced. Genes shown in Table 7 and Pat Insert 3+, Pat10 + and Pat17 + into pMON14327 I entered.   According to the procedure of US patent application Ser. No. 07 / 941,363 and Luckow et al. A large amount of patatin was produced from the above gene. Western blot analysis and p- Presence of patatin by esterase activity by nitrophenyl C-10 ester I confirmed the existence. PatA_mEach non-isoenzyme for SCRW bioassay At least doubled. PatE + and PatE_mThe fermented product of All other isoenzymes were bioassays with little or no evidence of activity It was observed to be expressed at a level suitable for. However, compared to potatoes The post-translational processing properties of the patatin protein in baculovirus compared I couldn't decide. Of the isoenzyme expressed by baculovirus Anti-SCRW biological activity is Pat17 +, PatB +, PatD_m, PatI_m, Pa Observed at tL + and Pat3 +.   A large number of isoenzymes (produced by baculovirus) cause insect growth and development. The effect on childcare was measured. Together with an aliquot of 11 Russet isoenzymes And one for SCRW, ECB, black weevil and TBW Samples for bioassay were prepared. PatD_mCan only get 1.7mg However, the other isoenzymes were 10-15 mg each of Q-Sepharose purified aliquot. Used. According to the assay using this mixture, TBW is 100% Mortality was shown and ECB showed a 93% weight loss. Therefore, use each isoenzyme individually. Different assays were performed on TBW and ECB. Compared to vector control larvae , Isoenzymes PatC +, PatL + and PatI_mT fed with feed treated with BW and ECB larvae showed significant atrophy (> 75%) and / or mortality . PatB + and PatD_mAlso atrophied TBW by 69% and 78%, respectively.Plant gene construction   Expression of plant genes present in the form of double-stranded DNA is Conversion of one strand of DNA into messenger RNA (mRNA) And the subsequent processing of mRNA primary transcripts that occur in the nucleus. this For processing, add a polyadenylate nucleotide to the 3'end of RNA The 3'untranslated region is involved. Transcription from DNA to mRNA is a “promoter” Say It is regulated by the commonly known DNA region. The promoter region is the corresponding RNA strand In order to generate It contains a nucleotide sequence that gives RNA polymerase a signal to initiate transcription.   A number of promoters active in plant cells have been described in the literature. Such a professional The motor can be derived from a plant or plant virus, non-limiting examples of which are: , Nopaline synthase (NOS) promoter and octopine synthase (OC S) promoter (these are Agrobacterium tumefacies carried in the tumor-inducing plasmid of ns), cauliflower mosaic virus (CaMV) 19S and 35S promoters, ribulose-1,5-bis-pho Small subunit of sulfate carboxylase (ssRUBISCO, extremely rich A light-inducible promoter derived from a rich plant polypeptide, gworth) mosaic virus (FMV) 35S promoter. these All of the promoters make different types of DNA constructs expressed in plants. Used to manufacture (see, eg, International Patent Application WO84 / 02913) . In addition, the characteristics of plants susceptible to insect attack It may also be desired to limit expression to only certain parts. For example, limit expression to roots Root-specific promoters may be used for A root-promoting promoter may be used to raise the bell. For insects that eat roots Such expression is preferred for susceptible plants.   Certain plant promoters will also be more effective in monocots. For example, The rice actin promoter described in International Patent WO 91/09948 is peach. Effective for expression in sorghum. Described in EP 0,342,926 The maize ubiquitin promoter could also be used in monocots.   Promoters used in the DNA constructs of the invention (ie, chimeric plant genes) May be modified, if necessary, to change its regulatory properties. For example, C The aMV35S promoter suppresses the expression of ssRUBISCO in the absence of light It binds to the ssRUBISCO gene and is active in leaves but active in roots. A non-sexual promoter may be produced. The obtained chimeric promoter is in the text Can be used as described in.   Therefore, in the description of this specification, "CaMV35S" The term promoter refers to variants of the CaMV35S promoter, such as Due to binding to the promoter region, random or regulated mutagenesis, etc. Includes upcoming promoters. In addition, promoters help boost gene expression The promoter may be mutated to contain a large number of [enhancer sequences] . Examples of such enhancer sequences are reported by Kay et al. (1987). .   The particular promoter selected will drive full expression of the enzyme coding sequence. To produce an effective amount of patatin. The preferred promoter is The CaMV E35S promoter (enhanced CaMV35S).   The RNA produced by the DNA constructs of the present invention also contains a 5'untranslated leader. Contains an array. This sequence is derived from the promoter selected to express the gene. And can be specifically modified to enhance translation of mRNA. 5'untranslated region May also be derived from viral RNA, appropriate eukaryotic or synthetic gene sequences. Can also be. The invention is derived from the 5'untranslated sequence associated with the promoter sequence. It is not limited to constructs with untranslated regions.   As pointed out above, the chimeric plant gene of the present invention The 3'untranslated region has an adenylate nucleotide added to the 3'end of RNA in plants. Includes a polyadenylation signal that functions to drive. Of the preferred 3'region Examples include (1) Agrob, such as the nopaline synthase (NOS) gene. polyadenylate signature of the Actium tumor-inducing (Ti) plasmid gene 3'transcriptional untranslated region containing a gene or (2) soybean 7s storage protein gene and And pea ssRUBISCO E9 gene [Fischhoff et al.] There is such a plant gene.Localization   Vectors containing the patatin cassettes described above are active in the cytoplasm or vacuole of plant cells. Express a sex protein. Direct most or all patatin into the plant secretory pathway It would be desirable to attach. To achieve this, bacterial genes or plant It would be advantageous to use a signal sequence derived from a gene, but plant genes are more Expected to be favorable. Examples of such signal sequences include endoproteinases. ZeB gene (Koehler & Ho) and tobacco PR1b gene (Corn Elissen et al.). Described in European Patent Application Publication No. 0,385,962 PMON10 824 is a B. elegans active in Lepidoptera. t. express the kurstaki protein It is a plant transformation vector designed as described above. In pMON10824, B. t ． k. The coding sequence is the 10 amino acids of the mature PR1b coding sequence. Is fused to the PR1b signal sequence. PR1b signal is patatin To generate a vector fused to the gene, pMON10824 was digested with BglII and A short BglII-NcoI fragment containing a PR1b signal cleaved with NcoI To isolate. In the ligation reaction, the short BglII-NcoI fragment of pMON10824 was used. The 1.0 kb NcoI-EcoRI fragment from pMON19714 Lagment and BamHI-EcoRI digested pMON19470 (Brow n)). In this reaction, the patatin coding sequence was transformed into the PR1b gene. Expression of CaMV35S promoter and monocotyledonous plant, fused to a secretory signal derived from A plasmid driven by the intron is constructed. Dicotyledonous gene gene A similar reaction may be used for the present. Dicot expression vector NotI-N Insert the otI fragment into a dicot transformation vector as described below and Lost (disarmed) Agroba It can be used to transform dicotyledonous plants by activating it into a caterium host. Therefore , A plant that produces patatin secreted into the extracellular space can be produced.   The NotI-NotI fragment of this monocotyledonous plant plasmid Insert patatin into a transformation vector (for example, pMON18181 described above). A secreting corn plant may be produced.   It is advantageous to direct patatin to localize to another cell compartment, the chloroplast Let's do it. By including a chloroplast transit peptide (CTP) at the N-terminus, Quality can direct chloroplast localization. Manipulate heterologous proteins to localize in the chloroplast As an example of the CTP that was created, the RUBISCO small sub of Arabidopsis There is a CTP called ats1A that is derived from the unit gene. B. t. k. Tan In order to successfully localize the chloroplasts in the protein, this transition peptide and mature RUBIS were used. Encodes a repeat of the transition peptide cleavage site in addition to the 23 amino acids of the CO sequence A mutant of this transit peptide was constructed. Described by Brown et al. pMON19643 is an Arabidopsis at fused to the GOX gene. Contains s1A transit peptide And used as a substrate to construct a vector that localizes patatin to the chloroplast. Can be used. Complete and partial NcoI digestion of pMON19643 Perform and isolate the large fragment (4.0 kb). During the binding reaction, pMON1 The NcoI-EcoRI fragment from 9714 was used as a large fragment of pMON19643. Mix with ragment. In this reaction, the patatin coding sequence becomes the mature RUBI. Fused to the Arabidopsis transit peptide with 23 amino acids of SCO Constructs a plasmid driven by the CaMV E35S promoter . Or, to replace the promoter with the FMV35S promoter, a similar Lasmids may be constructed. Such a plasmid is designated as disarmed A It is introduced into a bacterium host and used for transformation of dicotyledonous plants. Well Or the NotI-NotI fragment as described above. Clone into As a result, plants that produce patatin localized in chloroplasts The thing is obtained.Plant transformation and expression   A chimeric plant gene containing a structural coding sequence of the invention can be prepared by any suitable method. Can be inserted into the genome of the plant. Suitable plant transformation vectors include Agrobacterium tum vectors derived from the Faciens Ti plasmid, and for example Herrer a-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (19) 85) and EPO Application Publication No. 0,120,516 (Schillperort). Et al.) And the like. Agrobacterium T i-plasmid or root transformation (Ri) plasmid-derived plant transformation vector In addition, other methods can be used to insert the DNA constructs of the invention into plant cells. It Such methods include, for example, liposome, electroporation, release Chemicals that increase DNA uptake, microparticle impact (macroprojecti) delivery of free DNA by le bombardment, virus or Is transformation using pollen.Transient expression of patatin in tobacco cells   A particularly useful plasmid cassette vector for transformation of dicotyledons is pMON1. 1794. The expression cassette pMON11794 is a CaMV E35S pro 5'untranslated leader and NOS gene of motor and petunia Hsp70 3'end containing the polyadenylation signal from pMON11 794 is a plant containing NcoI site and EcoRI site for insertion of coding sequence NotI-NotI sites flanking the gene expression cassette.   PatA + (SEQ ID NO: 11), PatB + (SEQ ID NO: 16), PatC + (array Insert each of column No. 17) and PatG + (SEQ ID NO: 22) into pMON11794. Enter to pMON19745, pMON19742, pMON1743 and pM Each ON19744 was produced. Each of these vectors was transformed into a tobacco protoplast. Lectroporated. Western expression of patatin by transformed tobacco cells Confirmed by blot analysis.Stable transformation of dicotyledons   Stable transformation of dicots with the patatin gene was performed by Rosahl et al. It has been reported. The patatin gene under the control of a leaf stem-specific promoter The Baco was transformed. Patatin was expressed.   International patent application for NotI-NotI fragment from pMON19745 Ti plasma disclosed and described by Barry et al. In WO 92/04449 By de vector It was inserted into a certain pMON17227 to prepare pMON22566. The patent application The description content of is included in this specification. This vector transforms transformed plants Glyphosate described by Barry for selection. te) contains a resistance gene. Similarly, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 2 2 is used to create the vectors pMON22563, 22564 and 22565 respectively. Made.   These vectors have been deficient (disarmed) Agrobacterium   It was introduced into ABI and used to transform tomato explants in tissue culture. Griho All plants expressing the patatin gene were selected after selection based on set resistance and plant regeneration. Recovered. The expression of the patatin gene was confirmed by Western blot analysis, Preliminary results show expression at a level of 0.1-0.5% of total protein. Insect larva A bioassay for is in progress.Transient expression of patatin in maize cells   The 1 kb NcoI-EcoRI fragment of pMON19729 described above was It was inserted into MON19433. This plasmid is derived from International Patent Application WO93 / 19 189 and 1992/19/1992, pending US patent application 07 / 855,857 (Brown et al.), The contents of which are described in the present specification. Included in the book. The resulting plasmid pMON19731 was digested with NotI Digested and the resulting fragment was transformed into pM, also described by Brown et al. It was inserted into ON10081 to prepare pMON19740. This plasmid is S Corn leaf protoplasts as described by heen et al., 1991. Was electroporated. Patatin production by transformed maize protoplasts. Present was confirmed by Western blot analysis.   To obtain cytoplasmic expression of patatin, pMON19714 NcoI-Eco The RI fragment was inserted into pMON19433 to create pMON19730. It was Insert NotI fragment of pMON19730 into pMON10081 The resulting plasmid pMON19739 was transformed into corn leaf protoplasts. Western blot shows that protoplasts produce patatin when tropolated. Confirmed by analysis.   Pat17 with and without target signal was also expressed in maize protoplasts It was Protein Pat17 + Maturation protein Pat17 and its own signal sequence for targeting the vacuole) 1.1 Kb NcoI-EcoRI fragment encoding SEQ ID NO: 30 Was constructed in pMON19648 to construct pMON19761. Therefore, pMON19761 contains the CaMV E35S promoter and Hsp70. NOS termin for expression in maize cells with intron and Pat17 + gene Includes Noether.   To obtain the vector for cytoplasmic expression, the Pat17 + plasmid in pMON19761 was used. Rows are Pat17 from pMON25213_mThe protein (SEQ ID NO: 31) Construct pMON, replacing by the NcoI-EcoRI fragment 25223 was produced.   pMON25224 has two fragments, namely pMON19643 (B Arabidopsis thaliana SSU 1a inheritance of row et al. Of 0.3 Kb containing protoplast transit peptide (CTP) from offspring (Timko et al.) XbaI-NcoI fragment and Pat17 of pMON25213_m1K bNcoI-EcoRI fragment of pMON19761 (XbaI-E co RI). Therefore, pMON25224 is Ca MV E35S promoter, Hsp70 intron and CTP / Pat17_mKo And a NOS terminator.   For extracellular targets, encodes the extracellular signal peptide of a secreted protein Endoproteinase B cDNA (Koehler & Ho) , Pat17 from pMON25213_mJoined to the gene. Chimera gene BglII-EcoRI fragment containing splicing overlap extension Method (Horton et al.), PMON19761 (BamHI-Ec oRI) to prepare pMON25225.   Electroporating all these constructs into corn leaf protoplasts, Pat17_mExpression was confirmed by Western blot analysis.Stable transformation of maize with patatin gene   The corn transformation vector pMON18181 was transformed into pMON19653 and Constructed from pMON19643 (Brown et al.). This construct is CaMV E35S promoter, Hsp70 intron and CP4 glyphosate selection Cassette with marker and NOS terminator, CaMV E35S promoter -, Hsp70 intron, GOX glyphosate selection marker and NOS termin For insertion of a gene expression cassette containing a patatin gene Contains a single NotI site. Each of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 30 is NotI-N As an otI fragment, it was inserted into pMON18181 to obtain pMON19746 and And pMON19764 were prepared respectively.   These vectors are biolisted as described by Brown et al. By bombarding embryogenic tissue culture cells with a biolistic particle gun Inserted. Transformed cells were selected based on glyphosate tolerance to regenerate whole plants. It was Western blot analysis, esterase activity assay and / or insect resistance According to the assay, insect-resistant plants carry genes at 0.2-0.5% of total protein. It was confirmed that it was expressed.Synthetic genes that enhance monocot expression   Modifications of the coding sequence are made in Bacillus thuringiensis To enhance the expression of another insecticidal protein gene, such as the delta endotoxin sequence of Escherichia coli. Was found (Fischoff &Perlak; WO93 / 07278, Ciba- Geigy). Thus improving patatin expression in plants, especially corn The modified coding sequence was designed as follows. SEQ ID NO: 33. A DNA sequence containing SEQ ID NO: 33 was synthesized and pMON19470 (B insert into a maize expression cassette vector such as row. Tomoro Koshi expression cassette is then selected for pMON18181 or maize transformation When inserted into another corn plant transformation vector containing the marker gene, P Complete maize plants expressing at17 + will be obtained.   In order to achieve the objects set forth above, the present invention has the obvious advantages inherent in the present invention. It will be appreciated from the above description that it is quite suitable. Some features and subs Combinations are useful, are they other features and sub-combinations? It will be appreciated that they can be used independently. This is considered from the scope of claims. Can be included within the scope of the claims. The invention without departing from the scope of the invention While many implementations of the present invention will be possible, all matters described herein are exemplary. It should be understood that this is not limiting.   All publications and patents mentioned in this specification refer to each individual publication or patent. By reference, as described herein as being included herein by reference. Included in the present invention.                                 References Sequence listing SEQ ID NO: 1 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 2 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 3 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 4 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 5 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 6 Array length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 7 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 8 Array length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 9 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 10 Array length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Array SEQ ID NO: 11 Array length: 1171 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 12 Array length: 37 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: Synthetic DNA Array SEQ ID NO: 13 Array length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: Synthetic DNA Array SEQ ID NO: 14 Array length: 1105 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 15 Array length: 1106 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 16 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 17 Array length: 1175 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 18 Array length: 1106 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 19 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 20 Array length: 1106 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 21 Array length: 1109 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 22 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 23 Array length: 1104 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 24 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 25 Array length: 1175 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 26 Array length: 33 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: Synthetic DNA Array SEQ ID NO: 27 Array length: 33 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: Synthetic DNA Array SEQ ID NO: 28 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 29 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 30 Array length: 1172 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 31 Array length: 1106 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array SEQ ID NO: 32 Array length: 45 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: Synthetic DNA Array SEQ ID NO: 33 Array length: 1164 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: cDNA Array

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９４年１２月８日 【補正内容】 ６．前記構造コーディング配列が配列番号３０または配列番号３１から成ること を特徴とする請求項５に記載の方法。 ７．前記植物がトウモロコシであり、前記構造コーディング配列が単子葉植物中 での発現を増進するように合成されていることを特徴とする請求項５に記載の方 法。 ８．前記構造コーディング配列が配列番号３２から成ることを特徴とする請求項 ７に記載の方法。 ９．バチルス・チューリンギエンシスの内毒素を発現する１つ又はそれ以上の遺 伝子がゲノムに含まれていることを特徴とする請求項５に記載の方法によって生 産される植物。 １０．請求項９に記載の植物によって生産される種子または種子片。[Procedure Amendment] Patent Law Article 184-7, Paragraph 1 [Submission date] December 8, 1994 [Correction content] 6. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 The method according to claim 5, characterized in that 7. The plant is maize and the structural coding sequence is in a monocot 6. The method according to claim 5, which is synthesized so as to enhance expression in Law. 8. 33. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 32. 7. The method according to 7. 9. One or more remains expressing Bacillus thuringiensis endotoxin 6. The method according to claim 5, wherein the gene is contained in the genome. The plant that is produced. 10. A seed or seed piece produced by the plant of claim 9.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 イザーク，バーバラ・グエンザー アメリカ合衆国、ミズーリ・63304、セン ト・チヤールズ、ローズモント・ドライ ブ・5165 (72)発明者 ジエニングス，マイケル・ジラード アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ スターフイールド、リアルト・ドライブ・ 14550、アパートメント・307 (72)発明者 レバイン，エレーン・ベアトリス アメリカ合衆国、ミズーリ・63146、セン ト・ルイス、イーストランド・コート・ 12392 (72)発明者 パーセル，ジヨン・パトリツク アメリカ合衆国、ミズーリ・63011、ボー ルウイン、チヤーブレイ・ドライブ・615─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:92) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, FI, HU, JP, KR, KZ, LK, LV, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SI, SK, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Isaac, Barbara Nguyen USA, Missouri 63304, Cent Charles, Rosemont Drive 5165 (72) Inventor Jennings, Michael Gillard United States, Missouri 63017, Chesterfield, Rialto Drive 14550, Apartment 307 (72) Inventor Levine, Elaine Beatrice United States, Missouri 63146, Sent Lewis, Eastland Court 12392 (72) Inventor Purcell, Zyon Patrick, Missouri 63011, Bowlwin, Cheerbrae Drive 615

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．有効量の殺虫性パタチンを昆虫に摂取させるべく供給することを特徴とする 植物摂食昆虫による植物の虫害防除方法。 ２．植物に散布された後に前記パタチンを産生する植物定着微生物によって前記 パタチンが供給されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．植物の親細胞を予め遺伝的に形質転換することによって前記植物に組込まれ たパタチン遺伝子の発現によって前記パタチンが供給されることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ４．前記植物が、綿、トウモロコシ、トマトまたはジャガイモであることを特徴 とする請求項３に記載の方法。 ５．殺虫有効量のパタチンを発現する遺伝的に形質転換された昆虫耐性植物の生 産方法であって、 （ａ）植物細胞のゲノムに、 （ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーターと、 （ii）パタチンをコードする構造コーディング配列と、 （iii）前記植物細胞中でＲＮＡ配列の３′末端にポリアデ ニレートヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳領域とから成り、前 記プロモーターが前記構造コーディング配列に対して異種であり、前記プロモー ターが前記構造コーディング配列に操作可能に結合し、該構造コーディング配列 が前記非翻訳領域に操作可能に結合している組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換された植物細胞を獲得し、 （ｃ）形質転換された植物細胞から、殺虫有効量のパタチンを発現する遺伝的に 形質転換された植物を再生する段階から成り、前記プロモーターが前記構造コー ディング配列に対して異種であり、前記植物が綿、トウモロコシ、トマト及びジ ャガイモから選択されることを特徴とする方法。 ６．前記構造コーディング配列が配列番号３０または配列番号３１から成ること を特徴とする請求項５に記載の方法。 ７．前記植物がトウモロコシであり、前記構造コーディング配列が単子葉植物中 での発現を増進するように合成されていることを特徴とする請求項５に記載の方 法。 ８．前記構造コーディング配列が配列番号３２から成ることを特徴とする請求項 ７に記載の方法。 ９．請求項５に記載の方法によって生産される植物。 １０．バチルス・チューリンギエンシスの内毒素を発現する１つまたはそれ以上 の遺伝子がゲノムに含まれていることを特徴とする請求項９に記載の植物。 １１．請求項９に記載の植物によって産生される種子または種子片。[Claims] 1. Characterized by supplying an effective amount of insecticidal patatin for ingestion by insects A method for controlling insect damage of a plant by a plant feeding insect. 2. Said plant-fixing microorganisms producing said patatin after being applied to the plant The method according to claim 1, wherein patatin is supplied. 3. Integrated into the plant by previously genetically transforming the plant's parental cells The patatin is supplied by expression of the patatin gene. The method according to claim 1. 4. The plant is cotton, corn, tomato or potato. The method according to claim 3, wherein 5. Production of Genetically Transformed Insect-Resistant Plants Expressing Insecticidally Effective Amounts of Patatin The method of delivery, (A) In the genome of plant cells, (I) a promoter that functions to produce the RNA sequence in plant cells, (Ii) a structural coding sequence encoding patatin, (Iii) Polyadene was added to the 3'end of the RNA sequence in the plant cell. Consists of a 3'untranslated region that functions to add a nilate nucleotide, Said promoter is heterologous to said structural coding sequence, said promoter Is operably linked to said structural coding sequence, said structural coding sequence Inserts a recombinant double stranded DNA molecule operatively linked to said untranslated region, (B) obtaining transformed plant cells, (C) Genetically expressing an effective insecticidal amount of patatin from transformed plant cells. Regenerating the transformed plant, wherein the promoter is the structural codon Heterologous to the Ding sequence and the plants are cotton, corn, tomato and A method characterized in that it is selected from potatoes. 6. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 The method according to claim 5, characterized in that 7. The plant is maize and the structural coding sequence is in a monocot 6. The method according to claim 5, which is synthesized so as to enhance expression in Law. 8. 33. The structural coding sequence consists of SEQ ID NO: 32. 7. The method according to 7. 9. A plant produced by the method according to claim 5. 10. One or more expressing Bacillus thuringiensis endotoxin 10. The plant according to claim 9, wherein the gene is included in the genome. 11. A seed or seed piece produced by the plant of claim 9.