JPH08507690A - 特異的プライマー及びプローブセットを使用するhla−bタイピングの方法 - Google Patents
特異的プライマー及びプローブセットを使用するhla−bタイピングの方法Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. HLA−B対立遺伝子のエクソン2の30〜33位(番号付けは、Zemm ourとParham,1992による)の5’−GCCA−3’配列により特徴づけられる 試料中の1つ以上のHLA−B対立遺伝子をタイピング又はサブタイピングする ための方法であって、更に詳しくは、例えばB54(22)、B52(5)、B 7801、B62(15)、B75(15)、B71(70)、B72(70) 、B46、B79、B53、B5102、B5103及びB58(17)のよう な、血清学的には識別が困難であるHLA−Bタイプを識別する方法であって、 少なくとも下記の工程: (i)場合により試料中の核酸を抽出し、 (ii)HLA−B対立遺伝子のエクソン2の30〜33位の5’−GCCA− 3’配列により特徴づけられるHLA−B対立遺伝子の核酸を、下記のリスト: 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体(これらの配列変異体は、1つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び/又は挿入、及び/又は置換を含むが、3’末端に5’−GCCA−3’配 列が保存されており、かつこれらの配列変異体が上記のB25Pプライマー又は その変異体と同一のHLA−B対立遺伝子を特異的に増幅させることができる) から選択され る少なくとも1つの5’末端増幅プライマーと一緒に、上記で定義された5’末 端プライマーと同一の対立遺伝子から選択される適切な3’末端プライマー(5 ’及び3’末端プライマーは、場合により標識されている)と組合せて増幅し; そして (iii)場合により増幅中又は増幅後に標識された増幅産物を、適切な条件で 、HLA−Bエクソン2領域の15〜261領域(番号付けは、ZemmourとParha m,1992による)から選択される1つ以上の適切なプローブとハイブリダイズさ せて、 (iv)適切な洗浄条件で洗浄し、 (v)形成されたハイブリッドを検出し;そして (vi)観察されるハイブリダイゼーションパターンから存在する対立遺伝子を 推定する、 よりなることを特徴とする方法。 2. 更に、少なくとも1つの下記の3’末端増幅プライマー: 又は他の配列変異体(これらの配列変異体は、1つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び/又は挿入、及び/又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のB2 3P1プライマー又はその変異体であるB23P2若しくはB23P3と同一の HLA−B対立遺伝子を特 異的に増幅させることができ、またそのプライマーは、場合によりビオチンのよ うな検出可能な標識を与えられている) を使用することを特徴とする、請求の範囲第1項記載の方法。 3. 少なくとも1つの下記のプライマーセットの組合せ: − B25P/B23P2と組合せたB25P/B23P1、又は − B25P/B23P3と組合せたB25P/B23P1を増幅のために使 用する、請求の範囲第1項又は第2項記載の方法。 4. 選択された2つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で 行われ、増幅産物が別々にハイブリダイズされる、請求の範囲第1項〜第3項の いずれか1項記載の方法。 5. 選択された2つのプライマーセットとの増幅反応が異なる反応試験管で 行われ、増幅後に増幅産物が混合されて、一緒にハイブリダイズされる、請求の 範囲第1項〜第3項のいずれか1項記載の方法。 6. 選択されたプライマーが混合されて、増幅反応が単一の反応試験管で行 われ、その後増幅産物が一緒にハイブリダイズされる、請求の範囲第1項〜第3 項のいずれか1項記載の方法。 7. 1つ以上のハイブリダイゼーションプローブが、下記のリスト: SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SE Q ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SE Q ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、 又はその配列変異体[この配列変異体は、主にその末端(3’又は5’のいずれ か)に1つ以上のヌクレオチドの欠失、及び/又は挿入、又は幾つかの本質的で ないヌクレオチド(即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオ チド)の他のもの(イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む)による置換を含 むか、或はこの変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相 補鎖よりなるか、或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボ ヌクレオチドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴ ヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせることができ、そして このプローブは、場合により標識されている]、又は脂肪族基、NH2、SH又 はカルボキシル基を含有するその誘導体プローブから選択される、請求の範囲第 1項〜第6項のいずれか1項記載の方法。 8. 得られた増幅産物が固体支持体に固定化され、予め標識された請求の範 囲第7項記載の任意のプローブと接触させることを特徴とする、請求の範囲第1 項〜第7項のいずれか1項記載の方法。 9. 好適には増幅中又は増幅後に標識された、得られた増幅産物を、請求の 範囲第7項記載の少なくとも1つのプローブが予め固 定化された固体支持体と接触させることを特徴とする、請求の範囲第1項〜第8 項のいずれか1項記載の方法。 10. 得られた増幅産物を、膜ストリップに平行線として固定化されたオリ ゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることを特徴とする、請求の範囲 第1項〜第9項のいずれか1項記載の方法。 11. 請求の範囲第1項〜第10項のいずれか1項記載の方法によるHLA −B対立遺伝子のタイピングのため、固定化及び逆相ハイブリダイゼーション分 析への組み込み、好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線として固 定化させるための、請求の範囲第7項記載の1つ以上のプローブの使用。 12. 請求の範囲第7項記載の1つ以上のプローブが、平行線の形で支持体 の表面に結合している固体支持体、好適には膜ストリップ。 13. 公知のHLA−B対立遺伝子とは異なる新規HLA−B対立遺伝子を 検出し同定するための方法であって、下記の工程: − 請求の範囲第1項〜第10項のいずれか1項記載の方法により、生物学的 試料中に存在する核酸が属するHLA−Bタイプを決定し、 − 表2に定義されるものに対応するハイブリダイゼーションパターンを生成 しない試料を観察した場合は、決定されるべき新規HLA−B対立遺伝子の、異 常にハイブリダイズするプローブに対応する、HLA−Bエクソン2配列の部分 を配列決定する、 よりなることを特徴とする方法。 14. 請求の範囲第13項記載の方法を使用して、B72(B*1503) と非B72HLA−B対立遺伝子(B70、B71、即ち、B*1503とは異 なる対立遺伝子)を識別するための方法であって、この非B72HLA対立遺伝 子が、B*1503対立遺伝子[例えば、プローブ13(SEQ ID NO1 9)、プローブ7(SEQ ID NO13)、プローブ10(SEQ ID NO16)、プローブ18(SEQ ID NO24)、及びプローブ19(S EQ ID NO25)]にハイブリダイズする少なくとも1つのプローブとは ハイブリッドを形成しないことにより特徴付けられる方法。 15. 請求の範囲第14項記載の方法により決定される、核酸配列レベルで 未決定のB70HLA−Bタイプに対応する新規HLA−B対立遺伝子[この対 立遺伝子は、プローブ2(SEQ ID NO8)とはハイブリッドを形成する が、プローブ13(SEQ ID NO19)とはハイブリッドを形成せず、か つこの対立遺伝子は、ヌクレオチド192〜209(番号付けは、ZemmourとPar ham,1992による)の範囲の領域の少なくとも1個のヌクレオチドの位置でHL A−B対立遺伝子B*1503とは異なっている]、及びこの対立遺伝子由来の オリゴヌクレオチド断片、特にこの対立遺伝子のオリゴヌクレオチド192〜2 09の範囲の領域よりなる断片。 16. 下記のリスト: 又は次のようなこれの配列変異体、 又は他の配列変異体(これらの配列変異体は、1つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び/又は挿入、及び/又は置換を含むが、3’末端GCCA配列が保存されて おり、かつこれらの配列変異体は、上記のB25Pプライマー又はその変異体と 同一のHLA−B対立遺伝子を特異的に増幅させることができる)、 又は他の配列変異体(これらの配列変異体は、1つ以上のヌクレオチドの欠失、 及び/又は挿入、及び/又は置換を含むが、これらの配列変異体は、上記のB2 3P1プライマー又はその変異体であるB23P2若しくはB23P3と同一の HLA−B対立遺伝子を特異的に増幅させることができ、また、そのプライマー は、場合によりビオチンのような検出可能な標識物を与えられている)から選択 される少なくとも1つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーよりなる組成物。 17. 下記のプローブのリスト: SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SE Q ID NO10、SEQ ID NO11、 SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、 SEQ ID NO1 4、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO1 7、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO2 0、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO2 3、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、又はSEQ ID N O26、 又はその配列変異体[この配列変異体は、主にその末端(3’又は5’)に1つ 以上のヌクレオチドの欠失、及び/又は挿入、又は幾つかの本質的でないヌクレ オチド(即ち、対立遺伝子間を識別するために必須ではないヌクレオチド)の他 のもの(イノシンのような修飾ヌクレオチドを含む)による置換を含むか;或は この変異体は、任意の上述のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖よりな るか;或はこの変異体は、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチ ドよりなるが、この変異体のプローブは、これらが誘導されたオリゴヌクレオチ ドプローブと同じ特異性でハイブリダイズさせうるものであり、例えば、下記の プローブのリスト: SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29 、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32 、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35 、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38 、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41 、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45、SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、又はS EQ ID NO52 から選択される変異体である]から選択される少なくとも1つのオリゴヌクレオ チドプローブよりなる組成物。 18. HLA−B対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なく とも1つのHLA−B対立遺伝子をタイピングするためのキットであって、下記 の成分: − 適宜、請求の範囲第16項の任意のプライマーから選択される少なくとも 1つの増幅プライマー、 − 少なくとも1つのプローブ(このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には1つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、請求の範囲第17項の任意のプローブから選択される)、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 適宜、前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するた めの手段 よりなることを特徴とするキット。 19. HLA−B対立遺伝子を含むかもしれない生物学的試料から、少なく とも1つのHLA−B対立遺伝子をタイピングするためのキットであって、更に 詳しくは、血清学的には識別するのが困 難なHLA−Bタイプを含むかもしれない試料から、この試料中に存在するHL A−B対立遺伝子をコードするヌクレオチドの増幅に続いて、請求の範囲第1項 〜第9項のいずれか1項の方法による1つ以上のプライマーセットの組合せを使 用する、下記: − 少なくとも1つのプローブ(このプローブは、好適には固体基質上に、更 に好適には1つの同一の膜ストリップ上に固定されており、かつこのプローブは 、請求の範囲第16項の任意のプローブから選択される)、 − 緩衝液、又はこれらのプローブと増幅産物間のハイブリダイゼーション反 応を可能にする緩衝液を調製するために必要な成分、 − 前記ハイブリダイゼーションから生じるハイブリッドを検出するための手 段、 − 場合により結果を解釈し、観察されるハイブリダイゼーションパターンか ら存在する対立遺伝子を推定するための、自動走査及び解釈装置をも含む、キッ ト。
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