【発明の詳細な説明】
発明の名称：肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに
対する抗体及びＨＣＶの検出方法
本発明は肝炎Ｃ型ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド、及
び該ペプチドをコードする核酸配列に係る。
本発明はＨＣＶに対する抗体にも係る。
本発明は更に、試験流体中のＨＣＶ又は抗ＨＣＶの検出方法と、該検出方法を
実施するための免疫化学試薬及びテストキットにも係る。
肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）は、ＮＡＮＢ肝炎（非Ａ非Ｂ）の原因物質の１種
として認められている９．４ｋｂの１本鎖ポリアデニル化ＲＮＡウイルスである
。ＨＣＶは急性及び慢性肝疾患を誘発し、肝細胞癌に関与する。
肝細胞癌は、公知肝炎ウイルス、即ち肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂ型
ウイルス（ＨＢＶ）及び肝炎δ型ウイルス（ＨＤＶ）に起因するものや、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）に起因
する肝炎を含む他の形態のウイルス関連肝疾患から区別される。疎水性プロット
及び配列相同に基づく実証に
よると、ＨＣＶはフラビウイルス科と遠縁にあると思われる（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：３８１，１９９１
）。
非Ａ非Ｂ肝炎は輸血を受けた個体で最初に同定された。ヒトからチンパンジー
への伝播及びチンパンジーにおける連続継代の結果、非Ａ非Ｂ肝炎は伝播性感染
物質に起因することが立証された。
疫学的実証によると、非Ａ非Ｂ肝炎は水伝染性疫学型、血液又は注射針に関連
する型、及び散発発生（集団獲得）型の３種が存在すると考えられる。ＨＣＶの
ウイルスゲノムは、広範な翻訳後プロセッシングを受ける約３０１０アミノ酸の
ポリプロテインをコードする。ウイルス構造領域は非構造領域の上流に位置し、
高度に保存された１９ｋＤａヌクレオキャプシドタンパク質と、２つの広範にグ
リコシル化されたエンベロープポリペプチドｇｐ３３（Ｅ１）及びｇｐ７２（Ｅ
２／ＮＳ１）を含むと推定される。最近の研究によると、Ｅ２／ＮＳ１のＮ末端
領域ではほぼ全部のＨＣＶ単離株間に実質的な配列不均一性が存在することが示
されており、ＨＣＶエンベロープのこの領域は強い免疫選択下にあると考えられ
る。膜結合２３ｋＤのタンパク
質であるＮＳ２と、ウイルスヘリカーゼに対応し、ＮＳタンパク質のプロセッシ
ングに関与すると現在考えられているＮ末端セリンプロテアーゼドメインを含み
得る約６０ｋＤａの可溶性タンパク質であるＮＳ３を含む種々の推定非構造タン
パク質がＨＣＶポリプロテインの残余からプロセッシングされる。ＮＳ４タンパ
ク質の機能は現時点では解明されていないが、該タンパク質は免疫優性抗体結合
部位を含む５−１−１フラグメントを含み（Ｋｕｏ Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２，１９９１；Ｃｅｒｉｎｏ Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ４７：２６９２
）、ＮＳ５はウイルスレプリカーゼを含む。臨床研究によると、
ＨＣＶに暴露後、ＮＳ３のＣ末端とＮＳ４タンパク質の一部を含む組換えタンパ
ク質である抗ｃ１００−３への血清変換から数週間前にウイルス核タンパク質及
びＮＳ３の保存領域に対する抗体が出現し得ることが報告されている。
従って、高度に保存されたＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質及びＮＳ３を
組み込んだ血清アッセイは、急性ＨＣＶ感染の有用な診断マーカーになると期待
される。
ＨＣＶ感染の種々の段階で確実な診断を可能にする特異的且つ高感度の方法を
開発するためには、この型の免疫優
性ウイルスエピトープを同定することが極めて重要である。
本発明の目的は、ＨＣＶ感染の診断及びモニターに有用な小さいペプチドを提
供することである。
推定ＨＣＶ ＮＳ３抗原の少なくとも一部をコードする長い組換え抗原はＨＣ
Ｖに対する抗体に対して反応性であるが、上記に要約したような実質的な欠点を
有する。小さい合成ペプチドはこれらの欠点を解決できるが、十分に免疫反応性
ではない。本発明の目的は、小さい合成ペプチドの利点を有するように十分小さ
く且つＨＣＶに対する抗体に対して免疫反応性であるように十分大きい長さを有
するペプチドを提供することである。
推定ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子によりコードされる領域からの小さいペプチド（１
２量体）はＨＣＶに対する抗体を検出するためには特に有用でないことが判明し
た。大きいポリペプチドは融合タンパク質として容易に発現できず、内因性タン
パク分解を受け易く、偽陽性反応の可能性が高いので非実用的である。大きいポ
リペプチドは更に合成しにくく、精製しにくく、感染性であり得る。
本発明では、長さと免疫反応性を考慮した最適合成を形成するＨＣＶ ＮＳ３
−ゲノムの領域が同定される。
本発明の別の目的は、ＨＣＶ特異的ＮＳ−３抗原配列を含むペプチドを提供す
ることである。
本発明は、配列番号６、７、８、９及び１０に示す配列群とその組み合わせ、
又はＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記配列群のフラグメントも
しくは前記配列群の類似体から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む
。
推定ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子の全部ではないとしてもほとんどをカバーする抗原
をコードする組換えクローンからのＤＮＡフラグメントから構成されるライブラ
リーを構築することができる。これらのフラグメントは約５０〜３００ヌクレオ
チドの寸法であり、適当な読み取り枠内で発現されると、約１７〜１００アミノ
酸のＨＣＶポリペプチドをコードした。こうして、１７〜１００アミノ酸の任意
の可能なフラグメントを少なくとも１回含むために十分相違する組換え体を含む
ライブラリーを構築することができる。プローブとしての適当な抗体及び格別反
応性のペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して、格別反応性の抗原を発現す
る組換え体を選択することができる。
本発明のペプチドは、ＨＣＶゲノムの推定ＮＳ３領域に
位置する。
本発明のペプチドは、ＨＣＶ抗体に対して格別免疫化学的に反応性であること
が判明した。この反応性の利点は、本発明のペプチドの１種以上を使用すると、
大きい組換えフラグメントを使用した場合に比較して免疫アッセイの特異性が高
いという点である。別の利点は、前記ペプチドの１種以上を使用すると、免疫ア
ッセイの感度が増加するという点である。
本発明は更に、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記ペプチドの
フラグメントを含む。
本明細書中で使用する「フラグメント」なる用語は、本発明のペプチドのサブ
配列を含むアミノ酸配列を意味する。該フラグメントは、ＨＣＶ ＮＳ３抗原の
１個以上の免疫原決定基を有するペプチドである。フラグメントは特に、ＤＮＡ
には制限エンドヌクレアーゼ、ポリペプチドにはプロテアーゼを使用して前駆物
質分子の酵素切断により生成することができる。他の方法としては、フラグメン
トの化学的合成又はＤＮＡフラグメントによるポリペプチドフラグメントの発現
も利用できる。
配列番号６〜１０のペプチドの類似体又は誘導体も本発
明に含まれる。
「類似体」なる用語は例えば、ペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、
アセチル化、リン酸化等を意味する。
請求の範囲には明記しないが、該当ペプチドの免疫化学活性に影響しない限り
、ＨＣＶの種々の単離株の株間変異の結果として、本発明のペプチド中の数個の
アミノ酸が欠失していてもよいし、他のアミノ酸又はアミノ酸類似体もしくは誘
導体を挿入してもよいし、これらのアミノ酸等で置換してもよいことは自明であ
る。
更に、これらのペプチドの類似体は、ペプチドの酸付加塩、ペプチドのアミド
（特にＣ末端アミド）、エステル（特にＣ末端エステル）、Ｎ−アシル誘導体（
特にＮ末端アシル誘導体、特にＮ−アセチル誘導体）も意味する。
本発明のペプチドの製造は、公知有機化学ペプチド合成法の１種を応用するか
、又は組換えＤＮＡ技術を使用して実施することができる。後者方法によると、
該当ペプチドの１種以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む適切なベクタ
ーを用いて組換えポリペプチドを発現させ、ベクターを適切な宿主に導入するこ
とにより所望のペプチドを製造する。
有機化学ペプチド合成法は、均一相内又は所謂固相を使用して縮合反応により
必要なアミノ酸のカップリングを行うとみなされる。縮合反応は次のように実施
することができる。
ａ）縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基又は他の保護された反応基を有す
る化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び他の保護された反応基を
有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合；
ｂ）活性化カルボキシル基及び遊離又は他の保護された反応基を有する化合物
（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び遊離又は他の保護された反応基を
有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合。
カルボキシル基の活性化は特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、
無水物、イミダゾリド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェニルエステル）に変
換することにより実施することができる。
上記縮合反応のための最も一般的な方法は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−３（Ｇｒｏ
ｓｓ，Ｅ．及び
Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているようなカルボジイミド法、アジ
ド法、混合酸無水物法及び活性化エステル類を使用する方法である。
あるいは、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。
例えば、ペプチドを反復配列に（縦列に）組み込んでもよいし、（著しく大き
い）タンパク質又はポリペプチドの成分として製造してもよい。この目的では、
本発明のペプチドをコードする特定核酸配列を有するポリヌクレオチドを組換え
ＤＮＡの成分として使用することができる。
本発明のペプチドをコードするこの型のポリヌクレオチド、及びこのポリヌク
レオチドを同様に組み込んだ組換えＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
本発明は更に、上記ペプチドの少なくとも１種を含む免疫化学試薬にも関する
。
本発明の「免疫化学試薬」は、本発明の１種以上のペプチドと適切な支持体又
は標識物質を含み得る。
使用可能な支持体は例えば、微量試験ウェルもしくはキュベット、管もしくは
毛管、膜、フィルター、試験ストリッ
プの内壁又は、粒子（例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもし
くはゾル粒子としての金属化合物、ＢＳＡもしくはＫＬＨ等のキャリヤータンパ
ク質）の表面である。
使用可能な標識物質は特に、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金
属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。
本発明は更に、本発明のペプチドをコードする核酸配列、好ましくは配列番号
１、２、３、４、５に示すＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む核酸配列を包含す
る。
本明細書中に使用する「核酸配列」なる用語は、リボ核酸配列及びデオキシリ
ボ核酸配列の両者を含めた任意長のヌクレチオドのポリマー形態を意味する。原
則として、この用語は分子の一次構造を意味する。即ち、この用語は２本鎖及び
１本鎖ＤＮＡ、２本鎖及び１本鎖ＲＮＡ、並びにその改変形を含む。
本発明の核酸配列は、天然ではこのような配列が会合又は結合しない種々の複
製実施ＤＮＡ配列と連結することができ、適切な宿主の形質転換に使用可能な所
謂組換えベクター分子を構成する。有用な組換えベクター分子は好まし
くは例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はウイルスに由来する
。
本発明の核酸配列をクローニングするために使用可能な特定のベクター又はク
ローニングベクターは当業者に公知であり、特にプラスミドベクター（例えばｐ
ＢＲ３２２、、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）
、バクテリオファージ（例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及びＭ１３
に由来するファージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４０、アデノウイル
ス又はポリオーマウイルス）を挙げることができる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．
Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏ
ｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉ
ｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ
．ら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２４，１９９０も参照されたい）。
本発明の組換えベクター分子の構築に使用する方法は当業者に公知であり、特に
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。
例えば、両方の遺伝子及び所望のクローニングベクターが相補ＤＮＡ末端を生
成するのと同一の制限酵素で切断されていると、本発明の核酸配列をクローニン
グベクターに容易に挿入することができる。
本発明の組換えベクター分子は更に、所望の形質転換細胞を選択するために使
用可能な１種以上のマーカー活性（例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及
びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドと同様の、例えばｐＢＲ３２２における
アンピシリン及びテトラサイクリン耐性）を含み得る。
本発明は更に、対応する核酸配列の発現により本発明のペプチドを産生するこ
とが可能な、上記核酸配列又は組換え発現ベクター分子で形質転換された宿主細
胞も含む。
適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列又はこのような核酸配
列を含む組換えベクター分子により形質転換させることができ且つ、所望により
前記核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させるために使用可能
な微生物又は細胞である。宿主細胞は例えば細菌
（例えば大腸菌、枯草菌及びプソイドモナス種）等の原核起源でもよいし、酵母
（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は高等真核細
胞（例えば昆虫、植物又は、ＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）等の真核起源でもよい。昆虫細胞はＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系を含む（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂ
ｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４７−５５，１９８８）。真核クローニング
系における本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情報は、Ｅｓｓｅ
ｒ，Ｋ．ら（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６）に記載されている。
一般に、本発明で有用な組換えベクター分子を構築するためには原核細胞が好
適である。例えば、ＤＨ５α又はＭＣ１０６１ｋ等の大腸菌Ｋ１２株が特に有用
である。
発現のためには、本発明の核酸配列を発現ベクターに導入する。即ち前記配列
を発現調節配列に作動的に連結する。このような調節配列は、プロモーター、エ
ンハンサー、オペレーター、インデューサー、リボソーム結合部位等を含み得る
。従って、本発明は発現調節配列に作動的に連結し
た上記ペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクター分子を提供するもの
であり、該ベクター分子は、形質転換宿主細胞において該ベクター分子に含まれ
るＤＮＡ配列を発現させることが可能である。
当然のことながら、クローニングベクターの選択された部位に挿入されたヌク
レオチド配列は、形質転換宿主が少なくとも１個の免疫原決定基を有するポリペ
プチドを産生する限り、本発明のペプチドをコードする完全核酸配列のフラグメ
ントしか含まないと理解されたい。
宿主が細菌であるとき、有用な発現調節配列の例としては、Ｔｒｐプロモータ
ー及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，
４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，
Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５，１９７８）；外層膜タンパク質プロモーター（
Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，７７１−
７７５，１９８２）；バクフリオファージｋプロモーター及びオペレーター（Ｒ
ｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，４６７７−４６８
８，１９８３）；α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、
終結配列並びに、選択された宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び調節配列が
挙げられる。宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現調節配列としては例えばα
交配因子が挙げられる。昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスのポリヘドリン
又はｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳
動物起源である場合には、有用な発現調節配列としては例えばＳＶ−４０プロモ
ーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７
，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ２９６，３９−４２，１９８２）又は熱衝撃プロモーター（Ｖｏ
ｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４９４
９−５３，１９８５）が挙げられる。あるいは、ＨＣＶ中に存在する発現調節配
列も利用できる。発現を最大にするためには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，４７３，１９７９）も参
照されたい。
本発明の別の目的は、ＨＣＶウイルスのＮＳ３タンパク
質と特異的に反応し、臨床試料中のＨＣＶの有無を検出するための免疫診断試験
で特に有用な新規モノクローナル抗体を提供することである。
モノクローナル抗体を産生する細胞系の製造は、例えばエプスタイン−バール
ウイルスによる形質転換、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｋｏｈｌｅｒ
及びＭｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成する方
法を考案した（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：５１１−５１９））、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換法、
ヒトもしくはマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系である融合パートナーとヒ
トＢリンパ球との直接融合、又はＥＢＶ形質転換細胞系と前記骨髄腫細胞系との
直接融合により実施することができる。
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）はヒトＢリンパ球を形質転換及び不
滅化することが可能である。エプスタイン−バールウイルスを使用すると、骨髄
腫パートナー細胞の必要なしに不滅化したヒトＢリンパ球を得ることができる。
エプスタイン−バールウイルスは種々の起源から
得られる。最も一般に使用されるＥＢＶ源はＢ９５−８マーモセット細胞系であ
る。Ｂ９５−８細胞系はエプスタイン−バールウイルスを培地中に自然放出する
。
種々の細胞型が、ＥＢＶ形質転換細胞のクローニングのための良好な支持細胞
層を提供すると示唆されている。最も一般に使用されているのは末梢単核血球（
ＰＢＭＣ）及び繊維芽細胞である。
ＰＢＭＣは単球、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（５〜１０％）から構成される。
すべてのＢリンパ球が適正な特異性の抗体を提供する訳ではないので、ＰＢＭＣ
を適当な細胞について増菌すると有利である。ＥＢＶ形質転換細胞に対して細胞
毒性Ｔ細胞が生成されないようにするためには、洗浄したヒツジ赤血球で細胞を
処理することにより、（例えばＥＢＶ産生Ｂ９５−８細胞系からの上清による）
ＥＢＶ感染前にＴリンパ球を除去する（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｖｏｌ．Ｉ，
ａ ｐｒａｃｔｉｃｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈ”, Ｃａｔｔｙ Ｄ編，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国，１９８８，第４章）。
不滅化Ｂ細胞系により産生される抗体は、以下の要件：
１）抗体分泌の経時的安定性（＞６カ月）、
２）ただ１つのＩｇＧ（Ｈ及びＬ）機能細胞の分泌、
３）少なくとも２回の順次サブクローニング手順後の抗体分泌の特異性及び安定
性（親系と同一の特異性及び遺伝子表現型でＩｇＧを分泌するコロニーの増殖１
００％)
を満足する場合にモノクローナル抗体であるとみなすことができる。
本発明は更に、試験流体（被験液）中のＨＣＶに対する抗体の検出方法に係り
、該方法によると、本発明のペプチドを試験流体と接触させ、ペプチドと試験流
体中の抗体との間で形成された免疫複合体を検出する。
ペプチドと試験流体中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出し、
この検出により試験流体中のＨＣＶに対する抗体の存在を確認し、これを判定す
ることができる。
使用する免疫化学試薬の種類及び他の特性に依存して、実施される免疫化学反
応は所謂サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応であり得る。
試験流体中のＨＣＶの検出に特に適切な方法は、標識物貫を備える本発明のペ
プチドと（試験流体中に存在する）ＨＣＶ抗原との間の競合反応を利用し、ペプ
チド及び抗原
を固相に結合したＨＣＶに対する抗体と競合させる。支持体に被覆した抗体は例
えば本発明のモノクローナル抗体であり得る。
本発明は更に、サンプル中の肝炎Ｃ型ウイルスの検出方法に係り、該方法は、
サンプルを本発明のモノクローナル抗体と接触させる段階と、モノクローナル抗
体と肝炎Ｃ型抗原との間で形成された免疫複合体を検出する段階とを含む。
試験サンプル中のＨＣＶの検出のために例えばサンドイッチ反応を実施する際
には、使用するテストキットは、例えば微量試験ウェルの内壁である固体支持体
に被覆した本発明のモノクローナル抗体と、結合体としての標識モノクローナル
抗体又はそのフラグメントを含む。
ＨＣＶの検出に使用可能なイムノアッセイの別の例は、標識化試薬としてヒト
モノクローナル抗体を使用する阻害アッセイである。固相上の抗原とこの試薬と
の結合を、テストサンプル中の抗体により競合させることができる。
上述のように、本発明のモノクローナル抗体は診断に非常に適しており、中和
性のこの抗体は受動免疫療法に非常に有用である。
本発明は更に、イムノアッセイを実施するためのテストキットに係り、該テス
トキットは少なくとも１種の本発明の免疫化学試薬を含む。
本発明のテストキットは、上記免疫化学試薬を必須成分として含む。この免疫
化学試薬は、本発明の抗体又はペプチドを含み得る。本発明の種々の免疫化学試
薬の組み合わせ、例えば固体支持体に被覆したペプチドとラベル（標識）を備え
る抗体の組み合わせを含むテストキットは当然本発明の範囲に含まれる。
ＨＣＶ抗体を検出するためにサンドイッチ反応を実施する際には、テストキッ
トは例えば固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）に被覆した本発明のペプ
チドと、本発明の標識ペプチド又は標識抗抗体を含み得る。別のサンドイッチ反
応試験形式はＨＣＶ抗原の検出であり、本発明のモノクローナル抗体を固体支持
体に被覆し、モノクローナル抗体を結合体として使用する。
例えばサンドイッチ反応は、酵素イムノアッセイに関する本出願人の米国特許
即ちＲＥ３１．００６及びＲＥ３２．６９６（Ｓｃｈｕｕｒｓら）に記載されて
いる。
競合反応を実施するためには、テストキットは固体支持
体に被覆した本発明のペプチドと、ＨＣＶに対する標識化抗体、好ましくは前記
ペプチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。
凝集反応では、テストキットは粒子又はゾルに被覆した本発明のペブチドを含
み得る免疫化学試薬を含む。
テストキットの別の態様は例えば、固体支持体に被覆したＨＣＶに対する抗体
上の結合部位を被検出ＨＣＶ抗原と競合させる競合反応における免疫化学試薬と
しての本発明の標識化ペプチドの使用である。
ＮＡＮＢ肝炎病害の予防及び／又は治療における適切な医薬剤形で使用可能な
本発明のペプチド又はそのフラグメントも本発明に含まれる。こうしてこのよう
なペプチド又はそのフラグメントを活性成分として使用して得られるワクチンの
製造は、当業者により実施することができる。実施例 実施例１：λｇｔ−１１ライブラリーの構築及びスクリーニング
特定プライマーを使用するＰＣＲにより、ＨＣＶのＮＳ−３遺伝子の一部をコ
ードする配列（ヌクレオチド３５７３〜４８９０）を増幅した。出発材料は、原
型ＨＣＶ株を
感染させたチンパンジー血清からｒｔ−ＰＣＲにより構築したクローンから得た
。ＰＣＲ産物を電気溶離によりＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル（８％ＰＡＧＥ
）から単離した。このＰＣＲ材料の一部（８０μｌのうちの２０μｌ）を制御条
件下で（１ｍＭ ＭｎＣｌ2、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び
ＤＮＡｓｅ−１（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ２６３５単位／ｍｇ、最終濃度：０
．６単位）を含有する最終容量２５μｌ中、２５℃で１０〜６０分間）消化した
。フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール中で消化を停止し、抽出し
た。ＤＮＡｓｅ消化はニックトランスレーションにより制御した。適当な５０〜
２００ｂｐの長さを有するフラグメントを拡散により８％ＰＡＧＥ後に単離した
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。配列番号６のペプチド
をコードするポリヌクレオチドに販売業者（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の推奨に従っ
てオリゴ−ｄＧでテーリングした。末端ＥｃｏＲ１部位を結合したポリＣをプラ
イマーとして使用してテーリング産
物でＰＣＲを実施した。ＥｃｏＲ１消化及びフェノール抽出後、産物をλｇｔ−
１１アームにクローニングし、販売業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により詳述されてい
るように大腸菌にトランスフェクトした。λｇｔ１１−プライマーを使用してラ
イブラリーでＰＣＲを行った結果、挿入フラグメントの長さに一致する長さを有
するスミアが明らかになった。ヒトモノクローナル抗体（１：５０）を用いる標
準手順を使用してデュプロフィルター（ｄｕｐｌｏ ｆｉｌｔｅｒ）上でライブ
ラリーをスクリーニングし、抗体の反応をアルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗
ヒトＩｇＧでの反応を検出した。陽性ファージを再スクリーニングしてその内容
が陽性であることを確認した後、インサートをベクターｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（
Ｐｒｏｍｅｇａ）に移入した。市販キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｔ７−配列決
定キット）を販売業者の推奨に従って使用してこのベクターにおけるインサート
を配列決定した。
抗βガラクトシダーゼアフィニティーカラムを使用する標準手順により、上述
のように得られた組換え体によりコードされるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質を精製した。これらの精製抗原をＥＬＩＳＡプレートに被覆し、非
Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清と反応させた。このＥＬＩＳＡを使用して、本発明者
らはこれらの患者血清と正常ヒト血清対照とを区別することができた（表１）。
この手順を以下に詳述する。
配列番号６の本発明のペプチドを１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）中
に濃度７．５μｇ／ｍｌで溶解し、前記ペプチド溶液１３５μｌをＮＵＮＣマイ
クロタイタープレートの各ウェルに入れた。ペプチドとマイクロタイタープレー
トとの結合は、４℃で一晩行った。
次いでプレートを０．２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．２Ｍ ＮａＣｌ中
の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）の溶液で５分間室温でブロックし
た。次にプレートを０．２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．２Ｍ ＮａＣｌで
１回、０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で２回、２５０μｌ／ウェルの割合
で洗浄し、乾燥した。非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスに特異的な抗体を判定するために、
ウェルにピペット分配（１００μｌ／ウェル）したサンプル希釈剤（リン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）／２０％正常ヤギ血清／１％ Ｔｒｉｔｏｎ×１００）で
血清サンプルを希釈し、１時間３７℃でインキュベートした。ウェルをＰＢ
Ｓ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）で洗浄後、サンプル希釈剤で希
釈したペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル、３７℃で１時間）で標識したヤ
ギ抗ヒト免疫グロブリンで結合ヒト抗体を検出した。プレートをＰＢＳ／０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）で４回洗浄した。ＴＭＢをペルオキシダー
ゼ酵素の基質として加え（１００μｌ／ウェル）、室温で３０分間反応させた。
２Ｍ Ｈ2ＳＯ4 １００μｌを各ウェルに加えることにより、反応を停止した。
Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ マイクロエリザリーダーで４５０ｎｍで黄色
を読み取った。
非Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清では陽性結果が得られ、２０人の正常ヒト血清の
結果は陰性であった（表１）。
対照として２種の非関連ペプチドで手順を繰り返すことができる。いずれの場
合も、正常ヒト血清及びＮＡＮＢＨ患者からの血清サンプルで得られる特異的認
識に有意差は観察できない。上記結果から、本発明の前記ポリペプチドがＨＣＶ
抗体と免疫化学的に高反応性であり、診断テストキットで単独又は組み合わせて
使用できるという結論は正しいと思われる。
上記組換えＤＮＡ法を使用して、配列番号７、８、９及
び１０の配列による本発明のペプチドを製造した。上記と同一の構成を使用して
イムノアッセイで前記ペプチドを試験した。
非Ａ非Ｂ肝炎患者からの血清では特異的認識は陽性であり、２０人の正常ヒト
血清の結果は陰性であった（表１）。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１４８
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源
生物名：大腸菌
株名：ＪＭ１０１
配列
配列番号：２
配列の長さ：１５８
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源
生物名：大腸菌
株名：ＪＭ１０１
配列
配列番号：３
配列の長さ：１６４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源
生物名：大腸菌
株名：ＪＭ１０１
配列
配列番号：４
配列の長さ：１４８
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源
生物名：大腸菌
株名：ＪＭ１０１
配列
配列番号：５
配列の長さ：６８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
起源
生物名：大腸菌
株名：ＪＭ１０１
配列
配列番号：６
配列の長さ：４９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
フラグメント型：中間部フラグメント
配列
配列番号：７
配列の長さ：５２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：ＮＯ
配列
配列番号：８
配列の長さ：５４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：ＮＯ
配列
配列番号：９
配列の長さ：４８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：ＮＯ
配列
配列番号：１０
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Description: Title of the invention: Hepatitis C virus (HCV) nonstructural-3-peptide, antibody against the peptide and method for detecting HCV The present invention immunochemically reacts with an antibody against hepatitis C virus. It relates to peptides and nucleic acid sequences encoding the peptides. The present invention also relates to antibodies to HCV. The invention further relates to a method for detecting HCV or anti-HCV in a test fluid, and immunochemical reagents and test kits for carrying out the method. Hepatitis C virus (HCV) is a 9.4 kb single-stranded polyadenylated RNA virus recognized as one of the causative agents of NANB hepatitis (non-A non-B). HCV induces acute and chronic liver disease and is involved in hepatocellular carcinoma. Hepatocellular carcinoma is caused by known hepatitis viruses, namely, hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV) and hepatitis delta virus (HDV), cytomegalovirus (CMV) or Epstein-Barr virus. It is distinguished from other forms of virus-related liver disease, including hepatitis due to (EBV). HCV appears to be distantly related to the Flaviviridae family based on hydrophobicity plots and sequence homology ( Houghton M. et al., Hepatology, 14: 381, 1991 ). Non-A non-B hepatitis was first identified in transfused individuals. As a result of human-to-chimpanzee transmission and serial passage in chimpanzees, non-A non-B hepatitis has been demonstrated to be due to a transmissible infectious agent. Epidemiological evidence suggests that there are three types of non-A, non-B hepatitis: water-borne epidemiologic type, blood or needle-related type, and sporadic (population-acquired) type. The viral genome of HCV encodes a polyprotein of approximately 3010 amino acids that undergo extensive post-translational processing. The viral structural region is located upstream of the non-structural region and contains a highly conserved 19 kDa nucleocapsid protein and two extensively glycosylated envelope polypeptides gp33 (E1) and gp72 (E2 / NS1). Presumed. Recent studies have shown that there is substantial sequence heterogeneity between nearly all HCV isolates in the N-terminal region of E2 / NS1, which region of the HCV envelope is subject to strong immunoselection. It is believed that there is. A variety of putative non-proteins, including a membrane-bound 23-kD protein, NS2, and an approximately 60-kDa soluble protein, NS3, which corresponds to the viral helicase and may contain an N-terminal serine protease domain that is presently believed to be involved in NS protein processing. Structural proteins are processed from the rest of the HCV polyprotein. Although the function of the NS4 protein has not been elucidated at this time, the protein contains a 5-1-1 fragment containing an immunodominant antibody binding site ( Kuo G. et al., Science 244: 362, 1991; Cerino A. et al., J. Immunol., 147 : 2692 ), NS5 contains a viral replicase. According to a clinical study, after exposure to HCV, several weeks before seroconversion to a recombinant protein containing the C-terminus of NS3 and a portion of the NS4 protein, anti-c100-3, antibodies to viral nucleoprotein and conserved regions of NS3 were shown. Have been reported to occur. Therefore, serum assays incorporating the highly conserved HCV nucleocapsid protein and NS3 are expected to be useful diagnostic markers for acute HCV infection. The identification of this type of immunodominant viral epitope is extremely important for developing specific and sensitive methods that allow a reliable diagnosis at various stages of HCV infection. It is an object of the present invention to provide small peptides that are useful in diagnosing and monitoring HCV infection. Long recombinant antigens encoding at least part of the putative HCV NS3 antigen are reactive to antibodies to HCV, but have substantial drawbacks as summarized above. Small synthetic peptides can overcome these drawbacks, but are not immunoreactive enough. It is an object of the present invention to provide peptides that are small enough to have the advantages of small synthetic peptides and large enough to be immunoreactive with antibodies to HCV. It was found that small peptides (12 dimers) from the region encoded by the putative HCV NS3 gene are not particularly useful for detecting antibodies to HCV. Large polypeptides are impractical because they cannot be easily expressed as fusion proteins, are susceptible to endogenous proteolysis, and have a high probability of false positive reactions. Large polypeptides are more difficult to synthesize, harder to purify, and can be infectious. In the present invention, the region of the HCV NS3-genome that forms the optimal synthesis considering length and immunoreactivity is identified. Another object of the present invention is to provide peptides containing HCV-specific NS-3 antigen sequences. The present invention relates to a sequence group shown in SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 and 10 and combinations thereof, or a fragment of the sequence group or an analogue of the sequence group which is immunochemically reactive with an HCV antibody. It includes peptides having selected amino acid sequences. Libraries can be constructed consisting of DNA fragments from recombinant clones encoding antigens that cover most, if not all, of the putative HCV NS3 gene. These fragments were about 50-300 nucleotides in size and, when expressed in the proper reading frame, encoded HCV polypeptides of about 17-100 amino acids. In this way, a library can be constructed containing recombinants that are sufficiently different to contain any possible fragment of 17-100 amino acids at least once. Appropriate antibodies as probes and DNA sequences encoding exceptionally reactive peptides can be used to select for recombinants expressing exceptionally reactive antigens. The peptides of the present invention map to the putative NS3 region of the HCV genome. The peptides of the invention were found to be exceptionally immunochemically reactive with HCV antibodies. The advantage of this reactivity is that the use of one or more of the peptides according to the invention leads to a higher specificity of the immunoassay compared to the use of large recombinant fragments. Another advantage is that the use of one or more of said peptides increases the sensitivity of the immunoassay. The invention further comprises fragments of said peptides which are immunochemically reactive with HCV antibodies. The term "fragment" as used herein means an amino acid sequence which comprises a subsequence of a peptide of the invention. The fragment is a peptide having one or more immunogenic determinants of the HCV NS3 antigen. Fragments can be generated especially by enzymatic cleavage of precursor molecules using restriction endonucleases for DNA and proteases for polypeptides. Alternatively, chemical synthesis of fragments or expression of polypeptide fragments by DNA fragments can be used. Also included in the invention are analogs or derivatives of the peptides of SEQ ID NOs: 6-10. The term "analog" refers to, for example, post-expression modifications of the peptide, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. Although not specified in the claims, several amino acids in the peptides of the invention have been deleted as a result of inter-strain mutations of various isolates of HCV, as long as they do not affect the immunochemical activity of the peptide in question. It is obvious that other amino acids or amino acid analogs or derivatives may be inserted, and these amino acids may be substituted. Furthermore, analogs of these peptides include acid addition salts of peptides, amides of peptides (especially C-terminal amides), esters (especially C-terminal esters), N-acyl derivatives (especially N-terminal acyl derivatives, especially N-acetyl derivatives). ) Also means. The production of the peptides of the present invention can be carried out by applying one of the known organic chemical peptide synthesis methods or by using recombinant DNA technology. According to the latter method, the recombinant polypeptide is expressed using an appropriate vector containing a polynucleotide sequence encoding one or more of the peptide of interest, and the desired peptide is produced by introducing the vector into an appropriate host. Organic chemical peptide synthesis methods are considered to carry out the coupling of the required amino acids by a condensation reaction using a homogeneous phase or a so-called solid phase. The condensation reaction can be carried out as follows. a) a compound having a free carboxyl group or other protected reactive group (amino acid, peptide) in the presence of a condensing agent, and a compound having a free amino group and another protected reactive group (amino acid, peptide) Condensation; b) a compound (amino acid, peptide) having an activated carboxyl group and a free or other protected reactive group with a compound (amino acid, peptide) having a free amino group and a free or other protected reactive group Condensation. The activation of the carboxyl groups is carried out in particular by converting the carboxyl groups into acid halides, azides, anhydrides, imidazolides or activated esters (eg N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole or p-nitrophenyl ester). can do. The most common method for the above condensation reaction is The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Gross, E. and Meienhofer, J. Ed.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.), carbodiimide method, azide method, mixed acid anhydride method and activation. This is a method using an ester. Alternatively, the peptides of the invention are produced using recombinant DNA technology. For example, the peptides may be incorporated into the repeat sequence (tandem) or may be produced as a component of a (significantly larger) protein or polypeptide. For this purpose, a polynucleotide having a specific nucleic acid sequence encoding the peptide of the present invention can be used as a component of recombinant DNA. This type of polynucleotide encoding the peptide of the present invention and recombinant DNA in which the polynucleotide is similarly incorporated are also included in the scope of the present invention. The invention further relates to immunochemical reagents containing at least one of the above peptides. The "immunochemical reagent" of the present invention may include one or more peptides of the present invention and a suitable support or labeling substance. Supports which can be used are, for example, micro test wells or cuvettes, tubes or capillaries, membranes, filters, inner walls of test strips or particles (for example latex particles, red blood cells, dye sols, metal compounds as metal sols or sol particles, BSA). Or a carrier protein such as KLH). Labeling substances which can be used are in particular radioisotopes, fluorescent compounds, enzymes, dye sols, metal sols or metal compounds as sol particles. The present invention further includes nucleic acid sequences encoding the peptides of the invention, preferably nucleic acid sequences comprising at least a portion of the DNA sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5. The term "nucleic acid sequence" as used herein refers to a polymeric form of nucleotides of any length, including both ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid sequences. In principle, this term refers to the primary structure of the molecule. That is, the term includes double-stranded and single-stranded DNA, double-stranded and single-stranded RNA, and modified forms thereof. The nucleic acid sequences of the present invention may be ligated to a variety of replicative DNA sequences with which such sequences are not naturally associated or linked, forming so-called recombinant vector molecules which can be used to transform a suitable host. Useful recombinant vector molecules are preferably derived from eg plasmids, bacteriophages, cosmids or viruses. Specific vectors or cloning vectors that can be used to clone the nucleic acid sequences of the present invention are known to those of skill in the art, in particular plasmid vectors (eg pBR322, various pUC, pGEM and Bluescript plasmids), bacteriophages (eg kgt-Wes, Charon 28 and M13 derived phage), or viral vectors (eg SV40, adenovirus or polyomavirus) (Rodriquez, RL and DT Denhardt, Ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, JA, et al., Arch. Virol. 110 , 1-24, 1990). The methods used to construct the recombinant vector molecules of the present invention are known to those of skill in the art and are particularly described by Maniatis, T .; (Molecular Cloning A Lab Manual, 2nd Edition; Cold Spring Harb or Laboratory, 1989). For example, the nucleic acid sequence of the present invention can be easily inserted into a cloning vector if both genes and the desired cloning vector are cut with the same restriction enzymes that generate complementary DNA ends. The recombinant vector molecule of the present invention further comprises one or more marker activities that can be used to select for the desired transformants (eg ampicillin resistance in pUC8 and α-peptide of β-galactosidase, eg in pBR322). Ampicillin and tetracycline resistance). The invention further includes host cells transformed with the above nucleic acid sequences or recombinant expression vector molecules, which are capable of producing the peptides of the invention by expression of the corresponding nucleic acid sequences. A suitable host cell can be transformed with a nucleic acid sequence encoding a polypeptide or a recombinant vector molecule containing such a nucleic acid sequence and, optionally, to express said polypeptide encoded by said nucleic acid sequence. Microorganisms or cells that can be used for. The host cells may be of prokaryotic origin, such as bacteria (eg E. coli, Bacillus subtilis and Pseudomonas spp.), Yeast (eg Saccharomyces cerevisiae) or higher eukaryotic cells (eg insects, plants or HeLa cells and Chinese hamster ovary (C HO). ), E.g., mammalian cells including cells). Insect cells include the Sf9 cell line of Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Bio-technology 6 , 47-55, 1988). Information regarding cloning and expression of the nucleic acid sequences of the invention in eukaryotic cloning systems can be found in Esser, K. et al. (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986). Generally, prokaryotes are preferred for constructing the recombinant vector molecules useful in the present invention. For example, E. coli K12 strains such as DH5α or MC1061k are particularly useful. For expression, the nucleic acid sequence of the invention is introduced into an expression vector. That is, the sequence is operably linked to an expression control sequence. Such regulatory sequences may include promoters, enhancers, operators, inducers, ribosome binding sites and the like. Accordingly, the present invention provides a recombinant vector molecule comprising a nucleic acid sequence encoding said peptide operably linked to an expression control sequence, said vector molecule being contained in said vector molecule in a transformed host cell. It is possible to express a DNA sequence. It will be appreciated that the nucleotide sequence inserted at the selected site of the cloning vector will be the complete nucleic acid encoding the peptide of the invention as long as the transformed host produces a polypeptide having at least one immunogenic determinant. It should be understood that it only includes fragments of the sequence. When the host is a bacterium, examples of useful expression control sequences include Trp promoter and operator (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8 , 4057, 1980); lac promoter and operator (Chang et al., Nature 275 , 615, 615). 1978); Outer membrane protein promoters (Nakamura, K. and Inouge, M., EMBO J. 1 , 771-775, 1982); Bakfriophage k promoter and operator (Remaut, E., et al., Nucl. Acids Res. 11 , 4677-4688, 1983); [alpha] -amylase (Bacillus subtilis) promoter and operator, termination sequences, and other expression enhancing and regulatory sequences compatible with the host cell of choice. When the host cell is yeast, useful expression control sequences include, for example, the α mating factor. In the case of insect cells, the baculovirus polyhedrin or p10 promoter can be used (Smith, GE et al., Mol. Cell. Biol. 3 , 2156-65, 1983). When the host cell is of mammalian origin, useful expression control sequences include, for example, the SV-40 promoter (Berman, PW et al., Science 222 , 524-527, 1983), the metallothionein promoter (Brinster, R. et al. L., Nature 296 , 39-42, 1982) or a heat shock promoter (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 , 494 9-53, 1985). Alternatively, expression control sequences present in HCV can be utilized. See also Roberts and Lauer (Methods in Enzymology 68 , 473, 1979) for maximizing expression. Another object of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody which specifically reacts with the NS3 protein of HCV virus and is particularly useful in immunodiagnostic tests for detecting the presence or absence of HCV in clinical samples. For the production of cell lines producing a monoclonal antibody, for example, transformation with Epstein-Barr virus, the Kohler and Milstein method (Kohler and Milstein, devised a method of forming a hybridoma producing a monoclonal antibody (G. Kohler and C. Milstein, 1975, Nature 256 : 495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6 : 511-519)), direct transformation of B lymphocytes with oncogene DNA, in human or mouse-human hybrid myeloma cell lines. Direct fusion of a fusion partner with human B lymphocytes or direct fusion of an EBV transformed cell line with the myeloma cell line described above. Epstein-Barr virus (EBV) is capable of transforming and immortalizing human B lymphocytes. Epstein-Barr virus can be used to obtain immortalized human B lymphocytes without the need for myeloma partner cells. Epstein-Barr virus is obtained from a variety of sources. The most commonly used source of EBV is the B95-8 marmoset cell line. The B95-8 cell line spontaneously releases Epstein-Barr virus into the medium. Various cell types have been suggested to provide good feeder layers for the cloning of EBV transformed cells. The most commonly used are peripheral mononuclear blood cells (PBMC) and fibroblasts. PBMC are composed of monocytes, T lymphocytes and B lymphocytes (5-10%). Since not all B lymphocytes provide the antibody with the proper specificity, it is advantageous to enrich PBMC for appropriate cells. To prevent the generation of cytotoxic T cells against EBV transformed cells, treatment of the cells with washed sheep red blood cells (eg, with supernatant from an EBV producing B95-8 cell line) T lymphocytes are removed before ("Antibodies Vol. I, a practicable approach", Catty D, IRL Press, Oxford, England, 1988, Chapter 4). Antibodies produced by immortalized B cell lines have the following requirements: 1) stability of antibody secretion over time (> 6 months), 2) secretion of only one IgG (H and L) functional cell, 3) at least A monoclonal antibody if it meets the specificity and stability of antibody secretion after two sequential subcloning procedures (100% growth of colonies secreting IgG with the same specificity and gene phenotype as the parental line). Can be considered The present invention further relates to a method for detecting an antibody to HCV in a test fluid (test solution), which comprises contacting a peptide of the present invention with a test fluid to form between the peptide and the antibody in the test fluid. Detected immune complexes. The presence of an immune complex formed between the peptide and the antibody in the test fluid can be detected, and this detection can confirm and determine the presence of the antibody to HCV in the test fluid. Depending on the type of immunochemical reagent used and other properties, the immunochemical reaction performed can be a so-called sandwich reaction, agglutination reaction, competition reaction or inhibition reaction. A particularly suitable method for the detection of HCV in a test fluid utilizes the competitive reaction between a peptide of the invention with a label penetrant and the HCV antigen (present in the test fluid) to solidify the peptide and antigen. Compete with the antibody to HCV bound to. The antibody coated on the support can be, for example, the monoclonal antibody of the present invention. The invention further relates to a method of detecting hepatitis C virus in a sample, the method comprising contacting the sample with a monoclonal antibody of the invention and an immunity formed between the monoclonal antibody and the hepatitis C antigen. Detecting the complex. When carrying out, for example, a sandwich reaction for the detection of HCV in a test sample, the test kit used is, for example, the monoclonal antibody of the invention coated on a solid support, which is the inner wall of the microtest well, and as a conjugate. Labeled monoclonal antibody or fragment thereof. Another example of an immunoassay that can be used to detect HCV is an inhibition assay that uses a human monoclonal antibody as a labeling reagent. The binding between the antigen on the solid phase and this reagent can be competed by the antibody in the test sample. As mentioned above, the monoclonal antibody of the present invention is very suitable for diagnosis, and the neutralizing antibody is very useful for passive immunotherapy. The invention further relates to a test kit for performing an immunoassay, which test kit comprises at least one immunochemical reagent of the invention. The test kit of the present invention contains the immunochemical reagent as an essential component. The immunochemical reagent may include an antibody or peptide of the invention. Test kits comprising a combination of various immunochemical reagents of the invention, for example a peptide coated on a solid support and an antibody with a label, are of course included in the scope of the invention. When carrying out a sandwich reaction to detect an HCV antibody, the test kit comprises, for example, a peptide of the present invention coated on a solid support (for example, the inner wall of a micro test well) and a labeled peptide or a labeled anti-antibody of the present invention. May be included. Another sandwich reaction test format is the detection of HCV antigen, where the monoclonal antibody of the invention is coated on a solid support and the monoclonal antibody is used as the conjugate. For example, the sandwich reaction is described in Applicant's US patents for enzyme immunoassays, RE 31.006 and RE 32.696 (Schuurs et al.). To carry out the competitive reaction, the test kit may comprise a peptide of the invention coated on a solid support and a labeled antibody against HCV, preferably a monoclonal antibody against said peptide. For agglutination reactions, the test kit contains immunochemical reagents that may include the peptides of the invention coated on particles or sols. Another aspect of the test kit is, for example, the use of the labeled peptide of the invention as an immunochemical reagent in a competitive reaction in which a binding site on an antibody to HCV coated on a solid support competes with an HCV antigen to be detected. Also included in the present invention are the peptides of the present invention or fragments thereof that can be used in suitable pharmaceutical dosage forms in the prevention and / or treatment of NANB hepatitis diseases. The production of vaccines thus obtained using such peptides or fragments thereof as active ingredient can be carried out by the person skilled in the art. Examples Example 1: Construction and screening of λgt-11 library A sequence (nucleotides 3573-4890) encoding part of the NS-3 gene of HCV was amplified by PCR using specific primers. The starting material was obtained from a clone constructed by rt-PCR from chimpanzee serum infected with the prototype HCV strain. PCR products were isolated from TBE-polyacrylamide gels (8% PAGE) by electroelution. A portion of this PCR material (20 μl out of 80 μl) under controlled conditions (1 mM MnCl 2 , 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) and DNAse-1 (Worthington 2635 units / mg, final concentration: 0.6 units). ) In a final volume of 25 μl at 25 ° C. for 10-60 minutes). Digestion was stopped in phenol / chloroform-isoamyl alcohol and extracted. DNAse digestion was controlled by nick translation. Fragments with the appropriate length of 50-200 bp were isolated by diffusion after 8% PAGE (J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory ,. 1989). The polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 6 was tailed with oligo-dG according to the manufacturer's (GIBCO / BRL) recommendations. PCR was performed on the tailing product using poly C linked to the terminal EcoR1 site as a primer. After EcoR1 digestion and phenol extraction, the product was cloned into the λgt-11 arm and transfected into E. coli as detailed by the vendor (Promega). PCR with the library using the λgt11-primer revealed smears with a length that matched the length of the insert. The library was screened on a duplo filter using standard procedures with human monoclonal antibody (1:50) to detect antibody reaction with alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG. After rescreening the positive phage and confirming that the content was positive, the insert was transferred into the vector pGEM7Zf (+) (Promega). The insert in this vector was sequenced using a commercial kit (Pharmacia T7-Sequencing Kit) according to the vendor's recommendations. The recombinantly encoded β-galactosidase fusion protein obtained as described above was purified by standard procedures using an anti-β-galactosidase affinity column. These purified antigens were coated on ELISA plates and reacted with sera from non-A non-B hepatitis patients. Using this ELISA, we were able to distinguish these patient sera from normal human serum controls (Table 1). This procedure is detailed below. The peptide of the present invention of SEQ ID NO: 6 was dissolved in 100 mM phosphate buffer solution (pH 9.6) at a concentration of 7.5 μg / ml, and 135 μl of the peptide solution was placed in each well of a NUNC microtiter plate. Binding of peptides to microtiter plates was performed overnight at 4 ° C. The plates were then blocked with a solution of 0.05% Tween 20® in 0.2M Tris (pH 7.4) /0.2M NaCl for 5 minutes at room temperature. The plates were then washed once with 0.2 M Tris (pH 7.4) /0.2 M NaCl, twice with 0.04 M Tris (pH 7.4) at a rate of 250 μl / well and dried. To determine antibodies specific for non-A non-B hepatitis virus, sample diluent (phosphate buffered saline (PBS) / 20% normal goat serum / 1% Triton) pipetted into wells (100 μl / well). Serum samples were diluted x 100) and incubated for 1 hour at 37 ° C. After the wells were washed with PBS / 0.05% Tween 20 (registered trademark), the bound human antibody was bound with a goat anti-human immunoglobulin labeled with peroxidase (100 μl / well, 1 hour at 37 ° C.) diluted with a sample diluent. Detected. Plates were washed 4 times with PBS / 0.05% Tween 20®. TMB was added as a substrate for the peroxidase enzyme (100 μl / well) and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μl of 2M H 2 SO 4 to each well. Yellow color was read at 450 nm on an Organon Teknika microelisa reader. Positive results were obtained with sera from non-A, non-B hepatitis patients and negative results with 20 normal human sera (Table 1). The procedure can be repeated with two unrelated peptides as a control. In any case, no significant difference can be observed in the specific recognition obtained with normal human serum and serum samples from NANBH patients. From the above results, it is believed that the above-mentioned polypeptide of the present invention is immunochemically highly reactive with HCV antibodies and can be used alone or in combination in a diagnostic test kit. The recombinant DNA method was used to produce the peptides of the invention according to the sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10. The peptides were tested in an immunoassay using the same configuration as above. Specific recognition was positive in sera from non-A, non-B hepatitis patients, and negative results in 20 normal human sera (Table 1). Sequence Listing SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 148 Sequence Type: Nucleic Acid Chain Number: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: DNA (Genome) Hypothetical Sequence: NO Antisense: NO Origin Biological Name : Escherichia coli strain name: JM101 sequence SEQ ID NO: 2 Sequence length: 158 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-strand topology: Linear Sequence type: DNA (genomic) Hypothetical sequence: NO Antisense: NO Origin Biological name: E. coli Strain name: JM101 Sequence SEQ ID NO: 3 Sequence length: 164 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-stranded topology: Linear array type: DNA (genomic) Hypothetical sequence: NO Antisense: NO Origin organism name: E. coli Strain name: JM101 Sequence SEQ ID NO: 4 Sequence length: 148 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-strand topology: Linear sequence type: DNA (genomic) Hypothetical sequence: NO Antisense: NO Origin Biological name: E. coli Strain name: JM101 Sequence SEQ ID NO: 5 Sequence length: 68 Sequence type: Nucleic acid chain number: 1 Strand topology: Linear sequence type: DNA (genome) Origin organism name: Escherichia coli strain name: JM101 sequence SEQ ID NO: 6 Sequence length: 49 Sequence type: Number of amino acid chains: Single-stranded topology: Linear sequence type: Peptide hypothetical sequence: NO Antisense: NO Fragment type: Intermediate fragment sequence SEQ ID NO: 7 Sequence length: 52 Sequence type: Number of amino acid chains: Single-stranded topology: Linear sequence type: Peptide hypothetical sequence: NO sequence SEQ ID NO: 8 Sequence length: 54 Sequence type: Number of amino acid chains: Single-stranded topology: Linear sequence type: Peptide hypothetical sequence: NO sequence SEQ ID NO: 9 Sequence length: 48 Sequence type: Number of amino acid chains: Single-stranded topology: Linear sequence type: Peptide hypothetical sequence: NO sequence SEQ ID NO: 10 Sequence length: 22 Sequence type: Number of amino acid chains: Single-stranded topology: Linear sequence type: Peptide sequence
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ
21/08 9358−4Ｂ
Ｃ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 9284−4Ｃ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ
33/576 Ｚ 8310−2Ｊ
33/577 Ｂ 8310−2Ｊ
(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12N 15/09 C12P 21/02 C 9282-4B 21/08 9358-4B C12Q 1/70 9453-4B // A61K 39/395 S 9284-4C G01N 33/53 D 8310-2J 33/576 Z 8310-2J 33/577 B 8310-2J (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 5/00 B C12R 1:91)