JPH08503844A - トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発 - Google Patents
トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発Info
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Abstract
(57)【要約】
表皮に核酸カセットを発現させるためのケラチンK1ベクター。このクターは、5’フランキング配列、ケラチンK1プロモーター、転写されるが翻訳されない5’領域及び最初のイントロン及びイントロン/エキソン境界を該核酸カセットの発現のための連続性及び位置関係をもってすべて含有するケラチンK1遺伝子の5’フランキング領域を含有する。K1ケラチン遺伝子の3’フランキング領域は、転写されるが翻訳されない3’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コード化DNAを含有する調節配列を含有する。3’フランキング領域と5’フランキング領域とは核酸カセットを挿入するための種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するポリリンカーによって結合されている。核酸カセットは、タンパク質、ポリペプチド又はアンチセンスRNAを発現するために使用できる配列をコードしている。ベクターはインビボ及びex vivoの両者で表皮細胞に挿入できる。さらに、これはトランスジェニック動物又は表皮のバイオリアクターを作成するために使用できる。このベクターは皮膚癌、創傷治癒、外科的切開、乾癬及び癌などの種々の疾患を処置するための遺伝子治療に有用であることが見いだされた。
Description
【発明の詳細な説明】
トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発
本発明は国立衛生研究所(NIH)に与えられたHD25479、AI302
83及びCA52607の下、米国政府の許可に部分的に支持されている。さら
に、本研究はナショナル・カンサー・インスティチュート、癌病態部門、細胞発
癌及び腫瘍促進の研究所、NIHにて部分的に行われた。政府は本発明について
特定の権利を有している。
発明の分野
本発明はトランスジェニック動物の表皮細胞にポリペプチドを発現させるため
に使用される発現ベクターに関する。より詳細には、K1ケラチン遺伝子プロモ
ーター、その5’フランキング領域、転写されるが翻訳されないその5’領域、
その最初のイントロン及びイントロン/エキソン境界、転写されるが翻訳されな
いその3’領域、遺伝子の天然の転写終止領域を含有するその隣接非コード化D
NA、及びその3’フランキング領域を含有するベクターに関する。
発明の背景
マウスの生殖細胞系(germline)に遺伝子が安定に導入できることから、ヒト
疾患の動物モデルを作成するうえで見通しが大きく開かれた[Palmiter及びBrin
ster,Ann.Rev.Genet.,Vol.20,pp.465-499(1986)]。このような動物モデ
ルの必要性は増大しており、それは、ヒトウイルスの発現を抑制し又はヒト疾患
を引き起こす突然変異遺伝子の効果を相殺するように精巧に設計された新たな薬
剤が開発されていることから明らかである。これらの新規な治療剤の効能評価は
現在のところ、インビトロモデルに限定されており、これは供給経路の評価がで
きず、又はインビボの疾患過程、例えば疾患の進行に対する血液供給、無傷の免
疫系、体液性及び細胞性成長制御及び物理的障壁に影響することが知られている
他の因
子の評価ができない。さらに、ヒト障害を処置するために遺伝子治療を利用でき
る見込みは現実のものとなりつつある。従って、ヒト疾患の動物モデルはこれら
のアプローチの治療潜在力を評価するうえで有用であろう。表皮は他の扁平上皮
のための一般的モデルとして役立ち、またそのアクセスの容易性から病態現象の
顕微鏡観察及び治療潜在力を評価することができるので、その表皮は動物モデル
の開発のための魅力的な組織である。トランスジェニック動物の表皮に対する遺
伝子発現に特異的に標的化するベクターの開発が本発明の対象である。
表皮は継続して再生する層状の扁平上皮である。分化した上皮細胞は基底細胞
層に位置する増殖性細胞の後代(子孫)であり、ゆっくりとサイクルする自己更
生(セルフ−リニュウ)性の幹細胞、増殖性であるが更生しない通過増幅細胞、
及び有糸***後に成熟する表皮細胞、から構成される増殖単位で再生プロセスが
起こることを示す実質的な証拠が存在する[Iversenら,Cell Tissue Kinet.,V
ol.1.,pp.351-367(1968);MacKenzieら,Nature,Vol.226,pp.653-655
(1970);Christophersら,J.Invest.Dermatol.,Vol.56,pp.165-170(19
71);Potten,In Stem Cells:Their Identification and Characterization,
pp.200-232(1983);Cotsarelisら,Cell,Vol.61,pp.1329-1337(1990)
]。成熟過程(ターミナル分化)は、表皮細胞が細胞周期から外れ、基底層から
有輔層に移行する時に開始される。有棘層が顆粒層に移行し、角質層が形成され
て終了するように、成熟は続行される。形態学的及び生化学的研究により、ター
ミナル分化は段階的に起こることが示された。[Matoltsy,J.Invest.Dermato
l.,Vol.65,pp.127-142(1975)]。ケラチンK5及びK14は基底表皮細胞
の主要な産物である[Woodcock-Mitchellら,J.Cell Biol.,Vol.95,pp.580
-588(1982)]。10nmフィラメント(介在性フィラメント[IF])に組み立
てられるこれらのタンパク質は微小管(チューブリン)及び微小フィラメント(
アクチン)と共に、表皮細胞の細胞骨格を形成している[Steinert,P.M.ら,
Cell,Vol.42,pp.411-419(1985)]。分化及び有輔層への移行に対するコミ
ットメントに関連する最近の変化のひとつは他のケラチンの分化−特異的な対(
K1及びK10)の誘導である。K1及びK10を含有するIFは有輔層細胞の
主要な産物としてK5及びK14を含有する
ものと換わる[Woodcock-Mitchellら,J.Cell Biol.,Vol.95,pp.580-588(
1982);Roopら,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.Vol.80.pp.716-720(1
983);Schweizerら,Cell,Vol.37,pp.159-170(1984)]。顆粒層では、他
の高分子量である非IFタンパク質が合成され、それはフィラグリン(filaggri
n)にプロセッシングされ、ケラチンフィラメントの凝集及びジスルフィド結合
の形成を促進すると考えられる[Dale,B.A.ら,Nature,Vol.276,pp.729-
731(1978);Harding,C.R.ら,J.Mol.Biol.,Vol.170,pp.651-673(19
83)]。表皮細胞成熟の最終段階では、トランスグルタミナーゼが(γ−グルタ
ミル)リジン・イソペプチドの形成によってインボラクリン(involucrin)及び
ロリクリン(loricrin)の架橋を触媒し、原形質膜の真下に位置する角質化した
難溶性のエンベロープとなる[Rice及びGreen,Cell Vol.II,pp.417-422(19
77)Mehrelら,Cell Vol.61,pp.1103-1112(1990)]。
表皮細胞に発現される主要なケラチンをコードする遺伝子又はcDNAはクロ
ーンされている:K5[Lerschら,Mol.and Cell Biol.,Vol.8,pp.486-493
(1988)]、K14[Marchukら,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,Vol.82
,pp.1609-1613(1985);Knappら,J.Biol.Chem,Vol.262,pp.938-945(
1987);Roopら,Cancer Res.,Vol.48,pp.3245-3252(1988)]、K1[Stei
nertら,J.Biol.Chem,Vol.260,pp.7142-7149(1985)]、及びK10[Kri
egら,J.Biol.Chem,Vol.260,pp.5867−5870(1985)]。ノーザン・ブロッ
ト分析及びin situハイブリダイゼーション研究により、増殖している基底層で
はケラチン遺伝子K5及びK14が主として転写され、ケラチン遺伝子K1及び
K10の転写は有輔層への細胞移行として誘導されることが示された[Lerschら
,Mol.and Cell Biol.,Vol.8,pp.486-493(1988);Knappら,J.Biol.Ch
em,Vol.262,pp.938-945(1987);Roopら,Cancer Res.,Vol.48,pp.324
5-3252(1988)]。ラット[Haydockら,J.Biol.Chem,Vol.261,pp.12520-1
2525(1986)]及びマウス[Rothnagelら,J.Biol.Chem,Vol.262,pp.1564
3-15648(1987)]フィラグリンをコードする遺伝子は現在、同定されており、i
n situハイブリダイゼーション実験によって、この遺伝子の転写は顆粒層に限定
されることが確かめられている[Rothnagelら,J.Biol.Chem,Vol.262,pp.
15643-15648(1987);Fischerら,J.Invest.Dermatol.,Vol.88,pp.661-6
64(1
987)]。現在までのところ、ロリクリンが、in situハイブリダイゼーションに
よって分子レベルで研究されている角質化エンベロープの成分をコードする唯一
の遺伝子であり、この遺伝子の転写体は顆粒層に限定されている[Mehrel,ら,
Cell,Vol.61,pp.1103-1112(1990)]。
表皮における遺伝子発現の説明から、表皮に標的化するために選択される多く
の候補遺伝子が明らかになると思われる。しかし、これは当て嵌まらない。表皮
の増殖コンパートメントに発現されるケラチンK5及びK14は表皮ばかりでな
く、すべての扁平上皮にて発現される。さらに、これらの遺伝子は発育の初期に
発現されるが[Dala及びHolbrook,In:Current Topics in Developmental Biol
ogy,pp.127-155(1987)]、これは子宮内における致死の原因となり得る。癌
及び乾癬などの過増殖性疾患の動物モデルを作成するには、増殖能力を有する細
胞における基底コンパートメントでの発現が必要となる可能性が最も高いため、
有糸***後に発現される遺伝子、例えばケラチンK1及びK10、並びにフィラ
グリン及び細胞エンベロープの成分(インボルクリン及びロリクリン)をコード
するものはこの基本から排除されよう。しかし、本発明により、ヒトケラチン遺
伝子K1(HK1)の12kb断片がトランスジェニック・マウスにおける組織及
び発育特異的な発現を調節する配列を含有していることが証明された。この断片
は、表皮の基底細胞コンパートメントのある種の細胞におけるHK1遺伝子の発
現を導く分化特異的な発現の負の制御に関与する配列を欠いている。HK1遺伝
子の調節要素は内生マウスK1遺伝子の発現パターンを完全には模擬できないが
、以下の理由から遺伝子発現を標的化するのに理論的に適している:(1)発現
は表皮のみで起こり、他の扁平上皮では起こらない;(2)発現は発育の後期段
階(15日)で起こるので、子宮内における致死をもたらさないと考えられる;
(3)発現は増殖能を有する大きな比率の基底細胞にて起こる。
発明の概要
本発明は表皮にて核酸配列を発現するためのケラチンK1を目的とする。
本発明のさらなる目的は、腫瘍遺伝子を含有するケラチンK1ベクターである
。
また、本発明の別の目的は、形質導入された表皮細胞にてタンパク質、ポリペ
プチド及びアンチセンスRNAを調製するためのバイオリアクターである。
また、本発明は表皮細胞にケラチンK1ベクターを形質導入するためのインビ
ボ方法を目的とする。
さらに、本発明はケラチンK1表皮ベクターを含有するトランスジェニック動
物を提供する。
また、本発明は癌を研究するためのトランスジェニック動物を提供する。
また、本発明はヒフ潰瘍を処置する方法に関する。
また、本発明は創傷治癒又は外科的切開を治癒させる増強方法に関する。
また、本発明は乾癬を処置する方法に関する。
また、本発明はヒフ癌を処置する方法に関する。
さらに、本発明はケラチンK1表皮ベクターを使用するワクチン接種(予防接
種)法に関する。
このように、上記の多くの目的を達成するに当たり、本発明は1つの態様とし
て、以下のケラチンK1ベクターを提供する:表皮にて核酸カセットを発現する
ためのケラチンK1ベクターであって、ケラチンK1プロモーター、転写される
が翻訳されない5’領域、及び最初のイントロン及びイントロン/エキソン境界
を核酸カセットの発現のための連続性(配列)及び位置関係にそのすべてを含有
する5’フランキング配列であるケラチンK1遺伝子の5’フランキング領域;
調節配列を含有するケラチンK1遺伝子の3’フランキング領域であって、転写
されるが翻訳されない3’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コード化D
NAを含有する3’フランキング領域;並びに5’フランキング領域と3’フラ
ンキング隣接とを結ぶ、種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するポリリンカ
ーであって核酸カセットを挿入するための位置をさらに提供するポリリンカー、
を含有するベクター。
本発明の特定の態様として、ケラチンK1ベクターは約1.2kbの5’フラン
キング領域及び約3.9kbの3’フランキング領域を有する。
本発明の別の態様では、18kb Eco RV断片由来の5’フランキング配列約
8.0kbが上記のベクターの末端に付加されたものを提供する。
別の態様では、ヒトK1ケラチン遺伝子内にビタミンD3調節要素を同定し、
それをケラチンK1ベクターの発現を抑制するために利用する。
本発明の特定の態様では、ケラチンK1ベクターを表皮細胞の形質導入に使用
し、バイオリアクターを作成する。このバイオリアクターにより、種々のタンパ
ク質、ポリペプチド及びRNA群が調製される。さらに、このベクターはトラン
スジェニック動物を作成するためにも使用できる。トランスジェニック動物は癌
、薬物反応及び処置の研究に使用することができる。
ケラチンK1ベクターはまた、種々の疾患、例えば創傷、外科的切開、乾癬、
ヒト潰瘍及びヒト癌を処置するために使用することができ、またワクチンを調製
するためにも使用できる。
現在の好ましい本発明の態様を説明する以下の記載から、本発明のさらなる目
的、特徴及び利点は明らかであろうが、これらは添付の図面と共に開示を目的と
して記載するものに過ぎない。
図面の簡単な説明
第1図は、ヒトケラチンK1遺伝子(HK1)及びその調節配列から誘導され
る発現ベクターの模式図である。
第2図は、大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼをコードするレポーター
遺伝子を利用する、トランスジェニックマウスにおけるHK1ベクターのインビ
ボ発現の特性を示している。
第3図は、ビタミンD3の存在下、HK1遺伝子(HK1.NRE)由来の新
規な負の調節要素によるSV40プロモーターの抑制を示している。
第4図は、Harveyネズミ肉腫ウイルスのv−rasHaタンパク質のコード化配
列を含有するHK1ベクターの模式図である。
第5図は、FBJ/FBRキメラプラスミド由来のv−fosタンパク質のコ
ード化配列を含有するHK1ベクターの模式図である。
第6図は、ヒトポピローマウイルス18由来のE6及びE7タンパク質のコー
ド化配列を含有するHK1発現ベクターの模式図である。
第7図は、TGF−αのコード化配列を含有するHK1ベクターの模式図であ
る。
第8図は、ヒト免疫不全ウイルス由来のトランス調節タンパク質tatのコー
ド化配列を含有するHK1ベクターの模式図である。
第9図は、HK1遺伝子を含有する18kb Eco RV断片の模式図である。
第10図は、分化した表皮細胞に発現を制限させる付加的な5’フランキング
配列を含有するHK1ベクターの誘導体の模式図である。
図面は必ずしも一定の比率で描いているわけでなく、本発明の特徴を大きさの
点で誇張している場合があり、明瞭さ及び簡潔さの観点から図を示している。
発明の詳しい説明
本明細書に開示している発明には本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、
種々の置換及び修飾を施すことのできることは当業者には容易に理解されよう。
本明細書に使用している「形質転換(された)」なる用語は、遺伝子移動の機
序によって細胞の特性(発現される表現型)に変化を誘導する方法及びメカニズ
ムを意味し、それによりDANが細胞に導入されるとその細胞は特定の遺伝子産
物を発現し、又は内生遺伝子産物の発現を変化させる形態になる。
本明細書に使用している「形質導入」なる用語は、DNA発現ベクターを細胞
に導入する方法を意味する。種々の形質導入の方法が可能であり、例えばマイク
ロインジェクション、CaPO4、リポフェクション(ライソゾーム融合)、遺
伝子銃及びDNAベクター運搬体の使用などである。ヒトケラチンK1ベクター
は上記の種々の方法によって表皮細胞に形質導入することができる。
本明細書に使用している「DNAベクター運搬体」なる用語は、DNAベクタ
ーに結合し、そして表皮細胞に取り込まれ得る分子を意味する。DNA運搬体は
DNAと非共有結合的に結合できる分子複合体であり、細胞膜を介してDNAを
運搬することができる。必ずしも必須でないが、その運搬体は核膜を介してもD
NAを運搬するものが好ましい。
一時的トランスフェクション、一時的形質導入、又は一時的に形質転換すると
いう語句に関連して使用している「一時的」なる用語は、表皮細胞に遺伝子を導
入し、特定のタンパク質、ポリペプチド、及びRNAを発現させるが、導入され
た遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれないので一定期間の後には細胞から排
除されることを意味する。一時的発現は一時的トランスフェクションの際の遺伝
子産物の発現に関連する。さらに、一時的とは細胞への安定なトランスフェクシ
ョン又は形質導入を意味し、そこでは細胞は死滅しヒフから抜け落ちる。従って
、形質転換細胞は導入遺伝子の発現のために一時的に利用可能であるのみである
。
安定なトランスフェクション、安定な形質導入又は安定に形質転換された、に
て使用している「安定」なる用語は、標的細胞の染色体への遺伝子の導入であっ
て、その遺伝子が組み込まれ、その細胞内の遺伝子材料の永久的な成分になるこ
とを意味する。安定な形質導入後の遺伝子発現は永久的に細胞の特性を改変し、
安定な形質転換を導くことができる。エピソーム形質転換は、導入遺伝子が宿主
細胞染色体に組み込まれず、むしろ染色体外要素として複製する、安定な形質転
換の変異である。これにより、明らかに安定な細胞の形質転換特性を導くことが
できる。上記のように、ヒフを介して体から抜け落ちる表皮細胞では、安定な形
質転換が、細胞が喪失するので一時的な形質転換になる場合がある。
本明細書にて使用している「核酸カセット」なる用語は、表皮細胞に組込むこ
とのできるタンパク質、ポリペプチド又はRNAを発現できる目的の遺伝子材料
を意味する。核酸カセットはケラチンK1ベクター内に位置的かつ配列的に配向
させ、カセット内の核酸がRNA又はアンチセンスRNAに転写され、要すれば
形質転換表皮細胞にてタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得るようにする。
その核酸カセット内の配列に基づき、種々のタンパク質及びポリペプチドが形質
転換表皮細胞にて発現され得る。これらの発現され得るタンパク質又はポリペプ
チドにはホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプタ
ー、薬物、腫瘍抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、細菌抗原及び腫瘍遺伝子など
がある。これらの化合物を具体的に例示すれば、プロインスリン、インスリン、
成長ホルモン、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子II、インスリ
ン成長因子結合タンパク質、表皮成長因子、TGF−α、皮膚成長因子PDGF
、血管形成因子、例えば酸フィブロブラスト(線維芽細胞)及び塩基性フィブロ
ブラスト成長因子及びアンジオゲニン、マトリックスタンパク質、例えばIV型
コラーゲン、VII型コラーゲン、ラミニン(laminin)、ニドゲン(nidogen)
、及びウイルス、細菌及び寄生虫由来の免疫応答を誘起させるのに使用できるタ
ンパク質、などを挙げることができる。
さらに、核酸カセットは、ウイルス腫瘍遺伝子、内生プロト腫瘍遺伝子及び活
性化プロト腫瘍遺伝子を包含する「トランスフォーミング遺伝子」をコードする
ことができる。「腫瘍遺伝子」なる用語は、癌の原因となる遺伝子を意味し、こ
れにはウイルス性及び細胞性腫瘍遺伝子の両者が包含され、その多くは齧歯類及
び/又はヒトにとって内生のDNA配列と相同的である。腫瘍遺伝子なる用語に
は、ウイルス配列及びその相同的内生配列の両者が包含される。トランスフォー
ミング遺伝子の幾つかの例を以下の第1表に列記する:
ケラチンK1ベクターを使用して表皮細胞に組込まれる遺伝子材料には、表皮
細胞に通常は見いだされないDNA、表皮細胞に通常に見いだされるが物理的に
有意なレベルでは発現されないDNA、表皮細胞に通常に見いだされ物理的に望
ましいレベルで通常発現されるDNA、表皮細胞に発現するよう修飾できる他の
DNA、及びこれらの組合わせ体などが包含される。
本明細書にて使用している「ケラチンK1ベクター」又は「HK1ベクター」
なる用語は、核酸配列を表皮細胞にて発現させるのに有用であるベクター意味す
る。ケラチンK1ベクターは、プロモーター、最初のイントロン及びイントロン
/エキソン境界が核酸カセットが発現される配列及び位置関係でそのすべてを包
含するケラチンK1遺伝子の5’フランキング領域:ケラチンK1遺伝子の3’
フランキング配列;及びポリリンカー、が包含される。ポリリンカーは種々の制
限エンドヌクレアーゼ部位を包含している。このポリリンカーは5’フランキン
グ領域と3’フランキング配列とをつなぐものであり、さらに核酸カセットの挿
入位置を提供している。
ヒトケラチンK1遺伝子の3’フランキング領域の配列は調節要素を含有して
おり、これはケラチンK1ベクターの調製に使用される。これは配列番号1に示
す。ケラチンK1ベクターは、配列番号1の1から1246ヌクレオチドからな
る5’フランキング領域を有している;調節配列を含有する3’フランキング配
列は配列番号1の6891から10747ヌクレオチドからなる;及びポリリン
カーは配列番号2の2351から2376ヌクレオチドからなる[HK1発現ベ
クター]。
ケラチンK1ベクターは約1.2kbの5’フランキング領域、約1.0kbの
イントロン及びイントロン/エキソン境界、及び約3.9kbの3’フランキング
配列を有している。
ケラチンK1ベクターのリンカー及びポリリンカー内に見いだされる制限エン
ドヌクレアーゼ部位は、核酸カセットの挿入を許す制限エンドヌクレアーゼであ
ればよい。好ましい態様では、それらは通常、BamHI、KpnI、ClaI、Not
I、XmaI及びBglIIからなる群の中から選択される。
表皮細胞にケラチンK1ベクターを導入する方法が種々あることは当業者なら
ば、容易に理解できよう。ベクターはインビボ又はエクスビボ(ex vivo)のい
ずれによっても導入することができる。挿入の態様はある程度、挿入のために利
用できる方法を決定する。インビボ挿入は遺伝子治療にとって好ましい。この操
作では、表皮細胞を形質転換するに充分な時間、ヒトケラチンK1ベクターを表
皮細胞に接触させる。
本発明の1つの態様にはバイオリアクターが包含される。バイオリアクターは
、ケラチンK1ベクターを含有する形質転換された表皮細胞を含む。ベクターを
表皮細胞に挿入すれば、表皮細胞は核酸カセットを発現し、目的のタンパク質、
ポリペプチド又はアンチセンスRNAを産生する。これはインビボ又はex vivo
のいずれによっても行うことができる。核酸カセットにコードされ、それによっ
て発現され得る化合物はバイオリアクターによって製造することができる。
ケラチンK1ベクターを表皮細胞にex vivo導入するための1つの方法には、
選択マーカーを有するベクターの同時トランスフェクションが包含される。選択
マーカーは、形質転換された細胞を選択するために使用する。次いで、本明細書
に記載のいずれかの方法によって細胞を使用することができる。
本発明の別の態様は、トランスジェニック動物を作成するための方法であって
、ヒトケラチンK1ベクターを動物の胚に挿入する工程を包含する方法である。
トランスジェニック動物には、そのベクターが胚又はあらゆる子孫に挿入されて
いる得られる動物が包含され得る。本明細書にて使用している子孫なる用語は、
トランスジェニック動物の直接の子孫、及び継承する子孫のあらゆる子孫を包含
する意である。従って、当業者ならば、核酸カセットが異なる遺伝子を使用して
2
つの異なるトランスジェニック動物を作成したなら、得られる子孫の中には2つ
又はそれ以上の導入配列を含有するものがあることは容易に理解されよう。当業
者ならば、交尾の制御によって多重ベクターを有するトランスジェニック動物が
作成できることは容易に認識できよう。
ヒトケラチンK1ベクターをその胚芽及び体細胞に含有しているトランスジェ
ニック動物では、そのベクターの核酸カセットは表皮細胞でしか発現されない。
これは、組織の配列の発現をそれほど制御できない他のトランスジェニック動物
モデルと比較して顕著な利点である。
好ましい態様では、トランスジェニック動物は核酸カセット内に腫瘍遺伝子配
列を含有する。好ましくは、動物は齧歯類である。トランスジェニック動物は、
癌の起源、癌の処置、環境と癌との相互作用、並びに薬物、医薬及び他の化学相
互作用を目的とする種々の疾患を研究するための方法に使用することができる。
トランスジェニック動物は動物のヒフ細胞を使用できるあらゆる検定に有用であ
る。
本発明の特定の1つの態様は、創傷又は外科的切開の治癒を増強させる方法で
ある。この方法は、ケラチンK1ベクターで表皮細胞をインビボ形質導入するこ
とを特徴とする。このベクターの核酸カセットは成長因子の核酸配列を含有して
いる。
創傷又は外科的切開を処置するための好ましい態様では、多くのベクターを表
皮細胞に導入することである。この多くのベクターでは、少なくとも1つのベク
ターのカセットは表皮成長因子(TGF−α)の核酸配列を含有し、少なくとも
1つのベクターのカセットは皮膚成長因子(PDGF)を含有し、少なくとも1
つのベクターのカセットは表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパ
ク質の核酸配列を含有し、そして少なくとも1つのベクターのカセットは血管形
成因子の核酸配列を含有する。マトリックスタンパク質の配列は、表皮を真皮に
アンカーするために有用な配列から選択することができるが、通常は、IV型コ
ラーゲン、ラミニン、ニドゲン(nidogen)、及びVII型コラーゲンからなる
群の中から選択される。ベクターの組合わせにより、創傷又は外科的切開を早急
か
つ迅速に治癒させる増強のために必須の要素すべてを提供することができる。こ
の操作は形成外科又は再建外科の場合、非常に有用である。さらに、ヒフ潰瘍は
、以下の創傷治癒又は外科的切開に関して記載している以下の類似の操作によっ
て処置することができる。これらの創傷、外科的切開及びヒフ潰瘍を治癒するた
めの操作は動物及びヒトに有用である。
創傷、外科的切開及びヒフ損傷を処置し又は治癒させるためのex vivoアプロ
ーチでは、まずベクターを表皮細胞にex vivo導入する。この形質転換した表皮
細胞を、処置する動物又はヒトに移植する。
本発明の他の態様は乾癖を処置する方法である。この方法では、表皮細胞をケ
ラチンK1ベクターでインビボ形質導入する。該ベクター内の核酸カセットはT
GF−β、サイトカインレセプターの可溶性形態及びアンチセンスRNAからな
る群から選ばれるタンパク質又はポリペプチドの核酸配列を含有している。サイ
トカインレセプターはIL−1、IL−6及びIL−8からなる群から選ぶこと
ができる。アンチセンスRNA配列はTGF−α、IL−1、IL−6及びIL
−8からなる群から選ばれる。
本発明のもう1つの態様は、ヒト癌を処置する方法である。この方法は、表皮
細胞をケラチンK1ベクターでインビボ形質導入する工程を包含する。いずれか
のベクターの核酸カセットは、ヒトパピローマウイルスのE6又はE7遺伝子の
アンチセンスRNAをコードする核酸配列、又は正常なp53タンパク質をコー
ドする核酸配列を含有している。
ケラチンK1ベクターは3’フランキング配列内に、ビタミンD3によって抑
制することのできる新規な負の調節要素を含有している。ベクター内のビタミン
D3調節要素を用いれば、動物及びヒトに普通に使用される物質であるビタミン
Dによって核酸カセットの発現を調節できる。
ヒトケラチンK1ベクターは、18kb Eco RV断片由来の付加的な5’フラ
ンキング配列をその5’末端に挿入することによっても修飾することができる[
配列番号3の6090から14180ヌクレオチド]。これらの配列を付加すれ
ば、ヒトケラチンK1ベクターを内生K1遺伝子と全くおなじように発現させる
こと
ができ、即ちターミナル分化に傾倒した細胞にて有糸***後に発現させることが
できる。これらの細胞は死亡するようにプログラムされ、結局、環境下に抜け落
ちるので、これは細胞内にて一時的に発現させるための他の方法である。
本発明の他の態様はケラチンK1ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する
工程を包含するワクチン接種の方法である。ベクター内の核酸カセットは通常、
免疫学的応答を誘導するポリペプチドをコードしている。この例はヒトパピロー
マウイルス由来のウイルスキャプシドである。当業者ならば、他の種々のタンパ
ク質を使用して、免疫応答を生成させ、従ってワクチン接種用の抗体を生産でき
ることは容易に理解されよう。
本発明を説明するために以下に実施例を記載するが、これはいかなる意味にお
いても本発明の限定を意図するものでない。
実施例1
HK1遺伝子由来のベクターの構築及び特性化
内生DNAの発現を表皮に標的化させるため、ヒトケラチンK1遺伝子からベ
クターを構築した。その多くの用途の中には、トランスジェニック動物を作成す
るのに有用なものがある。
ヒトケラチンK1遺伝子の構造を第1図に模式図として表す。全ヒトケラチン
K1遺伝子を含有する12kb EcoRI断片をλクローンc55から始めに単離
した[Johnsonら,PNAS,USA,Vol.82,pp.1896-1900(1985)]。標的化(タ
ーゲッティング)ベクターを構築するに当たり、ATGを含有する最初のエキソ
ンの殆どを取り出し、5’非コード化配列、最初のイントロン及びイントロン−
エキソン境界のみを残した。さらに、終止コドンまでの遺伝子の残りを除去した
。以下の唯一の制限部位(BamHI、XmaI、KpnI、NotI及びClaI)を含
有するポリリンカーを最初のイントロンの3’部位内に操作し、内生DNAの挿
入を容易にした。これらの操作はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するこ
とによって行った。唯一のEcoRI部位はベクターの末端に保存し、pGEMベ
クター内にて容易に増幅できるようにし、胚に注射する前にプラスミド配列から
精製のた
めに切除できるようにした。
この方法によってベクターを構築できる原理は次の通りである。12kbヒトケ
ラチンK1断片の発現特性に関与する特定の要素は規定しなかったので、全5’
及び3’フランキング領域をベクター構築物中に含ませた。当業者ならば、これ
らの要素をさらに規定し、フランキング配列をそれに従って変化させることので
きることは容易に理解されよう。さらに、3’非コード化領域内の配列は表皮細
胞における内生DNAの転写体に対する安定性を確実にできるので、その配列は
保持させた。最初のイントロンは保持させ、発現効能を向上させ得るようにした
[Brinsterら,PNAS,USA,Vil.82,pp.1896-1900(1988)]。
実施例2
表皮ケラチノサイトにおけるHK1発現
ヒトケラチンK1標的化ベクターを表皮ケラチノサイトにおける専属的な発現
に関して評価するため、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現ベクター
のポリリンカー領域内に位置するBamHI及びClaI制限部位にクローンした(
第1図)。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は標的化の特異性を評価するためのレポ
ーター遺伝子として頻繁に使用されている[MacGregorら,In:Methods in Mole
cular Biology Vol.7,pp.217-235(1991)]。この構築物をpHK1.β−ガ
ルと命名した。この構築物の発現が機能的タンパク質を産生するか否か、及びベ
クターが細胞タイプ特異性を保持しているか否かを決定するため、この構築物を
初代表皮ケラチノサイト及び初代表皮フィブロブラストにトランスフェクトした
。トランスフェクションの72時間後に、基質、5−ブロモ−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシダーゼ(Xガル)を含有する溶液で染色した。β−
ガラクトシダーゼ活性は青呈色によって示されるが、これはケラチノサイトにて
検出され、フィブロブラストには検出されなかった。従って、HK1.β−ガル
構築物の発現は細胞タイプ特異的であり、機能的タンパク質が産生された。
実施例3
トランスジーン・マウス
実施例2に述べているインビトロ試験に利用した同じpHK1.β−ガル構築
物をトランスジェニックマウスの作成に使用した。この構築物をEcoRIで消化
し(第1図参照)、調製用アガロースゲル電気泳動にかけ、発現を妨害しかねな
いプラスミド配列(pGEM3)からpHK1.β−ガル発現構築物を分離精製
した。分離した発現構築物配列を精製し、NA45DEAE膜[Schleicher & S
chuell]を使用して回収した。DNAを沈降させ、1−3ng/μlに再懸濁し
た。異系交配したICR雌性マウス[Sasco]にPMS及びHCGを与えて過剰
***を剌激し、FVB雄性マウス[Taconic]と交尾させ、得られた輸卵管から
初期受精胚(最も好ましくは細胞段階)を採取した。DNAを生殖核にマイクロ
インジェクトし、偽妊娠した受容体である雌性マウス(精管除去したB6D2F1
雄性マウス(Taconic)と交尾させたICR雌性マウスの結果)に胚を外科的に
移した。
初期の実験では、40匹のマウスが産まれた。pHK1.β−ガルのトランス
ジーン(transgene)がこれらのマウスの表皮に専属的に発現されているか否か
を迅速に決定するため、出生時にこれらの動物を殺した。少量の組織を取り出し
てDNAを抽出し、残りの新生児をTissue-Tek O.C.T.中にて迅速に凍結
し、凍結切片とした。HK1ベクター内のイントロンに特異的なオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して、抽出したDNAについてPCR分析を行い、それに
より、40匹の新生児のうち5匹がHK1.β−ガル構築物を含有していること
が証明された。
HK1β−ガル構築物の発現が表皮に限定されているか、又は他の扁平上皮で
も発現されているかを評価するため、凍結した縦軸切片を幾つかのPCR陽性及
びPCR陰性の包埋した新生児から切断し、それらをX−ガルで染色した。典型
的な結果を第2図に示す。ここでは、PCR陽性動物#30が表皮にてβ−ガラ
クトシダーゼを高いレベルで発現し(第2A図)、またPCR陰性の兄弟#29
は完全に陰性であったが(第2B図)、このことは内生ネズミβ−ガラクトシダ
ーゼが充分なレベルで表皮に発現されておらず、この検定の偽陽性の原因となっ
たことを示している。陽性(#30)及び陰性(#29)の新生児ともに、腸に
染色が観察された。このことは内生酵素活性、又は腸内細菌によるβ−ガラクト
シダーゼの産生と考えられる。X−ガル染色は基底コンパートメント内に見いだ
されるが、これは分化層における程には強くない(第2D図)。従って、ヒトケ
ラチンK1発現ベクターは増殖性基底細胞にも実質的な数で発現されている。
これらの初期トランスジェニック実験による最も重要な知見は、ヒトケラチン
K1遺伝子から構築したベクターが内生コード化配列の発現をトランスジェニッ
クマウスの表皮に専属的に標的化できるという点である。この標的化の特異性は
第2A図から容易に理解できる。#30のヒフにおけるこの低いパワーの暴露は
X−ガルによる強い染色を示している。さらに、この切片には矢印で示す多くの
毛包及び皮脂腺があり、これらはX−ガルによって染色されない。ケラチンK5
及びK14は表皮にて発現されるばかりでなく、毛包及び皮脂腺などのすべての
扁平上皮にて発現される。ケラチンK14の発現パターン(第2C図)は、第2
A図と一致する連続切片から得た領域の特異的なK14抗血清との免疫蛍光によ
り認められる。表皮の染色性と毛包及び皮脂腺の染色性とに注意すべきである。
ヒトケラチンK1発現ベクターの構築に使用する戦略がトランスジェニックマウ
スにおける標的化特異性を変化させるならば、X−ガル染色は毛包、皮脂腺、他
の扁平上皮、及びおそらくは他の組織型さえでも観察されたであろう。しかし、
HK1.β−ガル・トランスジーンの発現はケラチンK1遺伝子自身のように表
皮に限定されている。
実施例4
ビタミンD3によるケラチンK1ベクターの調節
新規なビタミンD3応答要素を使用し、表皮における発現レベルを調節した。
ヒトケラチンK1遺伝子の調節要素のすべてが同定されているわけではないが、
ヒトケラチンK1遺伝子由来の新規な負調節要素(HK1.NRE)は同定され
ており、この実施例はそれがビタミンD3に対して応答してヘテロローガスな(
異種の)プロモーターを抑制できることを証明するものである。HK1.NRE
は70ヌクレオチド長(配列番号1の9134から9204ヌクレオチド)であ
る。
PCR技法を使用し、この断片の反対末端にBamHI及びBgl II部位を創製し
た。これにより、この断片の多重コピーが創製されるが、その理由は連結及び、
BamHI及びBgl IIによる消化が、頭−尾(ヘッド−to−テイル)連結した
オリゴヌクレオチドを選択するからである。HK1.NREの4つの直列(タン
デム)コピーをpA10.CATのBgl IIクローニング部位に挿入した。この
構築物を初代マウスの表皮細胞にトランスフェクトすると、ビタミンD3の不存
在下では、この構築物は高度に発現される(第3図)。培養培地に増加濃度でビ
タミンD3を添加すると、この異種プロモーターの転写が抑制される。この観察
事項は、ヒトケラチンK1発現ベクターの活性が表皮にて調節できることを示し
ている。ヒトケラチンK1ベクターの活性はビタミンD3又はその同族体を皮膚
に局所適用することによって表皮にて抑制される。
実施例5
ヒフ発癌のためのトランスジェニック動物モデルの開発
マウスの生殖細胞系(germline)に遺伝子を安定に導入できることから、ヒト
疾患の動物モデルの作成の見通しが大幅に増大した[Leder及びStewart1988
年4月12日発行の米国特許第4,736,866号、及びPalmiter及びBrinst
er,Ann.Rev.Genet.,Vol.20,pp.465-499]。このような遺伝子を、発現を
特定の組織に標的化する調節配列と結合させると、生きた生物に関連する研究疾
患ばかりでなく、それらの遺伝子の標的であると疑われる特定の組織における研
究疾患に対するモデルが提供される。従って、トランスジェニックマウスは疾患
進行に対する血液供給、無傷の免疫系、体液性及び細胞性成長制御及び物理的障
壁などの因子の及ぼす影響を決定できる可能性を提供できる。表皮は標的化され
る遺伝子発現のための魅力的な組織である:これは一般に上皮疾患のモデルばか
りでなく、表皮のアクセス容易性から、進行性の病態変化を容易に検出でき、さ
らにトランスジーン発現及びこれらの過程における環境因子が果す潜在的な役割
を評価することができる。さらにまた、癌を処置するために遺伝子治療を利用す
る見通しが現実のものになりかかっている。従って、ヒト癌の動物モデルはこれ
らの
アプローチの治療可能性を評価するうえで有用であろう。ヒフ疾患の動物モデル
の開発は、表皮に遺伝子発現を特異的に標的化できる能力に左右される。実施例
1に記載するヒトケラチンK1標的化ベクターは、この目的に理想的に適してい
る。
実施例6
表皮へのv−rasHa腫瘍遺伝子の標的化
トランスフォーミング能を活性化するコドン12、13及び61の点突然変異
によって、プロト腫瘍遺伝子の1つの族であるras族(rasHa、rasK1、
rasN)がヒト腫瘍の約20%で同定された。ras遺伝子が活性化されるメ
カニズムは現在のところ分かっていないが、環境因子がras突然変異の病因に
中枢的役割を果していることを示す広く行き渡った証拠が存在する。現在までの
ところ、ヒト皮膚悪性腫瘍におけるras活性化を調べる研究は殆ど為されてい
ない。しかし、最近の報告では、太陽光線にさらされた体部位、興味深いことに
UV放射線によるヒフ暴露から導かれる可能性ある潜在的なピリミジンダイマー
部位に現れる基底及び扁平細胞癌腫のrasHa活性化が同定された。開始(イニ
シエーション)、増進(プロモーション)及び悪性腫瘍保存の3つの別個の段階
が規定されている化学的発癌のマウス皮膚モデルでは、rasHa活性化が良性の
扁平乳頭腫に見いだされ、イニシエーション及びプロモーションの最終点はヒフ
発癌におけるrasHaの初期の役割を示している。これらを総合すれば、上記の
実験の証拠は、rasHa誘導化ヒフ発癌のメカニズムをさらに研究するための動
物モデルを開発する重要性を示している。この目的に沿って、Harveryネズミ肉
腫ウイルスのv−rasHaタンパク質[Dharら,Science,Vol.217,pp.934-9
37(1982)]をコードする配列をヒトケラチンK1発現ベクターのBamHI及び
ClaI部位にクローンした(第4図)。v−rasHaトランスジーンの発現を内
生ras遺伝子の発現と峻別するため、ヒトケラチンK6エピトープをコードす
る配列(配列番号4)をv−rasHaカセットの5’末端にて操作した。
HK1rasトランスジェニックマウスは以下の表現型を示す:1)表皮に
専属的にv−rasHa(HK1ras)を発現する新生児トランスジェニックマ
ウスは48時間目に明瞭な皺のあるヒフを示す;2)若年性HK1rasトラン
スジェニックマウスは、14日目にピークを迎える角化(keratinization)を示
す;3)新生児HK1rasマウスの組織型は表皮の20倍までの厚さを有する
塊状の表皮過形成を示す;4)14日までにこれは塊状の角質増殖症に進行する
。組織型はともに腫瘍発現前であり乳頭腫性であり異形成でないものであり、皮
膚の付属物を殆ど示さない。
HK1rasトランスジェニックマウスは良性腫瘍を発達させる。通常の損傷
は単一の部位に10−12週以内で現れる。これらの腫瘍の組織型により、充分
に分化した扁平乳頭腫であることが判明している。乳頭腫は創傷後に部位にて現
れることが多い。これらの乳頭腫の多くは退行する傾向がある。この退行減少は
、rasHa単独では良性の表現型さえも維持するのに充分でなく、またさらなる
腫瘍遺伝子/アンチ腫瘍遺伝子の役割が関与できる事象がさらに必要であること
を示している。
実施例7
トランスジェニックマウスの表皮へのfos腫瘍遺伝子の標的化
最近のインビトロ試験は、v−fos遺伝子は活性化rasHaを発現する悪性
の初代ケラチノサイト又は乳頭セルラインに変換できることを示している[Gree
nhalghら,PNAS,USA,Vol.1,pp.643-647(1990);Greenhalgh及びYuspa,M
ol.Carcinogen.,Vol.1,pp.134-143(1988)]。このことは、fosが表皮
発現の後期の役割を果し、活性化rasHa発現によって伝えられる良性の表現型
と共同作業することを示唆している。これ単独で、HK1rasマウスと交尾す
る観点からHK1fosトランスジェニックマウスの確立を開始させるのに充分
であるが、さらに2つの研究により、通常の表皮分化におけるfosの役割が同
定され、fosが摂動に対する魅力的な標的として強調された。c−fos/β
−ガル融合遺伝子を使用し、Curran及びその共同研究者[Smeyneら,Neuron,Vo
l.8,pp.13-23(1992)]は表皮の分化層において有意なfos発現を示し、[
Fisherら,Dev
elopment,Vol.III,pp.253-258(1991)]はc−fos発現を顆粒細胞の特
定のサブセットに局在化させた。つまり、fosはケラチノサイト分化の最終段
階の制御に際し、重要な役割を有している場合がある。このような特殊細胞にお
けるc−fosの正常な役割のv−fosによる推定の摂動はトランスジェニッ
クマウスにおける標的化された発現に関連してのみ研究することができる。さら
に、c−fosプロト腫瘍遺伝子はc−jun/AP1遺伝子産物と関連して転
写調節物質として機能することが知られており、従ってrasHa標的化が腫瘍形
成の際に膜シグナリングの研究を代表する一方、fos標的化によりこの工程の
転写制御の役割が解明される。
従って、FBJ/FBRキメラv−fosプラスミドpFBRJ由来のfos
タンパク質コード化配列をヒトケラチンK1標的化ベクターに挿入した(第5図
)。v−fosトランスジーンの発現を内生fos遺伝子の発現と峻別するため
、ヒトケラチンK1エピトープをコードする配列(配列番号5)をv−fosカ
セットの5’末端において操作した。
HK1fosトランスジェニックマウスは次の表現型を表す:1)傷付けた(
タッグした)耳に特異的な耳表現型が3−4カ月目の初期に現れ、左右対称とな
る;2)顕著な表現型を表す幾つかの動物では、傷付けた耳損傷は大ざっぱに言
って良性の角化棘細胞腫に似ていることがある;3)高齢の動物(約1年齢)で
は、腋窩に脱毛症及び角質増殖症が発達することが多い。
HK1fosマウスの組織型は次の通りである:初期の耳損傷の組織型は、形
成異常の細胞が殆どなくてさらなる新生物進行の証拠もない腫瘍発現前の病態で
ある過形成及び角質増殖症を示す;2)後期の段階では、大ざっぱな角質増殖症
の組織型は良性の角化棘細胞腫に似ている。
3−4カ月で明らかな腫瘍発現前の耳表現型を発達させるHK1fosトラン
スジェニックマウスの3つの系統が確立されている。傷付け(即ち、耳タッグ)
によるプロモーション剌激はこの表現型の外観を明らかに促進しており、それは
結果的に左右対称となる。また、腋窩及び鼡径領域の摩擦も腫瘍発現前の過形成
及び角質増殖症応答を有意な潜伏期間後に促進できるようである。これらのデー
タを総合すると、v−fosによる正常なケラチノサイト分化及び摂動における
、腫瘍発現前の分化障害を導くfos遺伝子の基本的な役割が支持される。幾つ
かのHK1fosマウスでは、重篤な耳損傷は良性の角化棘細胞腫に類似して進
行するようである。この時の数は少ないが、得られた腫瘍型の数はターミナル分
化の後期段階におけるfosの役割と矛盾がなく、少ない数と潜伏はさらなる事
象が必要であることを示している。
実施例8
HPV18E6及びE7遺伝子発現の表皮への標的化
ヒトの特定の扁平上皮癌の病因論においてヒト乳頭腫(パピローマ)ウイルス
(HPV)が関連する臨床及び疫学的な研究により、広い証拠が存在する。HP
Vは扁平上皮細胞に対する特異的な指向性を有しており、種々の型のHPVが、
感染する解剖学的部位に対する特異性を有している。さらに、HPVの特定のサ
ブグループ内の特定の型は良性(例えばHPV6及び11)又は悪性(例えばH
PV−16及び18)疾患のいずれかの発達に関与しており、これはE6及びE
7遺伝子の性質を中心に展開する。これらが感染した上皮の分化プログラムに適
合させることにより、感染子孫を生産するための賢明な戦略がHPVによって開
発された。HPVは基底上皮細胞に感染するが、このコンパートメントでは細胞
溶解性の複製を受けないことから、細胞の胚芽プールは後期のウイルス遺伝子発
現の細胞変性作用を受けない。ウイルスの産生は、増殖能を欠きかつ環境中に落
屑されるであろう最終的に(terminally)分化した細胞にのみ起こる。この戦略
は成熟ウイルス粒子の広がりを提供するばかりでなく、基底コンパートメントか
ら細胞を補充することによってそれらを連続的に産生させることができる。ウイ
ルスの生活環は扁平上皮細胞の分化のすべての段階と非常に密接に関係している
ので、成功する培養系を確立するのは困難であった。現在までのところ、これら
の宿主因子はパピローマウイルスゲノム自身の内に存在する調節メカニズムと関
係して、トランスジェニックマウスの扁平上皮におけるHPV遺伝子発現の病因
効果を観察する企ても妨げていた。これらのトランスジェニックマウスモデル利
用に対す
る制限は、ヒトケラチンK1標的化ベクターを使用して扁平上皮にHPV遺伝子
発現を特異的に標的化できる能力によって克服することができた。記載している
実施例では、HPV18のE6及びE7遺伝子のコード化配列をヒトケラチンK
1標的化ベクターのBgl II及びClaI部位に挿入した。
HKIE6/E7マウスは次の表現型及び組織型を示す:
1)1匹のマウスは、薄皮(fur)におけるヒフ硬直、肥厚及びざらざらさに
よって特徴付けられる繊細(subtle)なヒフ損傷を7カ月目に示し、これはその
後、10カ月までにいぼ様構造体に進行する;2)この損傷の組織型は過形成、
角質増殖及び疣贅形成の始まりを示す;3)11カ月目の別のマウスの損傷の組
織型は、HPVによって誘導される典型的ないぼを特徴とする。
低い頻度と長い潜伏期間を有するHPV様損傷を発達させる3つのHK1 E
6/E7トランスジェニックマウス系統がこれまでに確立されている。この場合
、この限定された表現型の外観が損傷の繊細な性質、及び長い潜伏期間の必要性
又はHPV生物学の複雑な性質を反映しているか否かは不明である。しかし、本
発明者らの研究がヒトにおけるHPV感染の疫学と矛盾のないことは注目に値す
るものであり、即ち大きなパーセンテイジの特定の雌性集団はHPV6、11、
16及び18による子宮頚感染に対して陽性であると試験され得るが、殆どは明
白な損傷に発達するほどには進行しない。これらのマウスが示す見掛けの遅れ及
び低い表現型の頻度は上皮分化の際のHPV発現の結果を研究する相当する背景
を提供できるのは当然であると言い得る。さらに、これらのマウスは、HPV1
8のE6及びE7の発現を阻害するよう設計された新規なアンチセンス医薬の効
能を評価する際にも有用であり得る。
実施例9
TGF−αを表皮に発現するトランスジェニックマウスの調製
トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF−α)は表皮成長因子(EG
F)に類似した構造及び機能特性を有しているサイトカインである。TGF−α
及びEGFともに表皮成長因子レセプター(EGF−R)と結合し、チロシンキ
ナーゼカスケードを刺激する。TGF−αは正常細胞及び形質転換細胞の両者で
発現され、培養ケラチノサイトの増殖の原因となる。インビトロでは、TGF−
αは血管形成を誘導し、創傷治癒の促進能がEGFよりも強力である。正常なヒ
トの皮膚では、表皮のすべての層及び皮膚の付属物の特定領域にてTGF−αの
発現が起こる。乾癬、扁平上皮細胞癌、及び先天性水疱性魚鱗癬様紅皮症などの
幾つかの皮膚疾患はTGF−αの発現の改変と関連している。
TGF−α発現の改変がこれらの疾患の発症に役割を担っているか否かを決定
するため、ヒトTGF−αのタンパク質コード化配列をヒトケラチンK1標的化
ベクターに挿入した(第7図)。HK1.TGF−α構築物を胚に挿入すると、
rasHaと極めて類似している表現型創始者(founder)が得られる。表現型も
表皮過形成、角質増殖症及び相対的脱毛症と類似していた。1つの創始者(21
/2月齢)は多重乳頭腫を発育させた。組織学的には、これらは明らかに扁平乳
頭腫のようであった。現在までのところ、これらの損傷の中には悪性表現型を保
存しているものはない。
実施例10
HIVtat遺伝子を表皮に発現させるトランスジェニックマウスの調製
ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)によって感染された患者は特定のAIDS
関連の皮膚障害を発現させる高い危険性を有している。徴候を示す患者は乾癬な
どの過剰増殖状態からカボシ肉腫及び転移性基底細胞癌の範囲のヒフ損傷を有す
ることが多い。HIV遺伝子の正確な役割、起源の細胞、及びこのようなヒフ損
傷の病因については不明のままである。特定のHIV遺伝子、即ちトランス調節
タンパク質、tatは、宿主細胞及び組織の恒常性メカニズムに対して直接又は
間接的な役割を果たしている可能性がある。あるいは、HIVtat遺伝子は潜
在的又は日和見感染に由来する他のウイルス遺伝子、即ちヒトパピローマウイル
ス(HPV)と相互作用し又はそれを活性化するのかもしれない。AIDS関連
の皮膚障害の発達におけるケラチノサイトの役割を直接的に評価するため、HI
Vtat遺伝子をトランスジェニックマウスの表皮に標的化させた。ヒトケラチ
ンK1ベクターを使用することにより、tat遺伝子が標的化され、かつケラチ
ノサイトにおいて専属的に発現された(第8図)。HIVtat遺伝子単独又は
他の腫瘍遺伝子と共同しての発現の結果として、予期できる動力学によって皮膚
損傷を発達させるマウス株の開発は、HIVtat遺伝子の発現を阻害するよう
設計したアンチセンス医薬の治療可能性を評価するために有用なモデルとして役
立つ。
実施例11
遺伝子治療の応用のためのHK1ベクターの利用
表皮細胞における専属的な発現を望み、それがHK1ベクターの一時的な発現
のためである場合、HK1ベクターは遺伝子治療のための優れた選択肢である。
ヒトケラチンK1遺伝子自体とは異なり、12kb断片由来のヒトケラチンK1ベ
クターは表皮の増殖性基底細胞にて発現される。より最近のトランスジェニック
実験にて、ヒトケラチンK1遺伝子を含有する大きな断片である18kb EcoR
V断片[第9図の模式図を参照]が内生マウスK1遺伝子と正確に同じように、
即ちターミナル分化にコミットした細胞において有糸***後に発現することが決
定された。これらの細胞は死滅するように前もってプログラムされており、結局
は環境中に脱落する。従って、一時的発現が望ましいヒト適用のために、細胞が
ターミナル分化にコミットし、表皮の外側の層への上方移行を開始する後にのみ
細胞に発現されるベクターを設計することができる。このベクターは環境に脱落
する約10−14日前に発現されるであろう。このことは、元のヒトケラチンK
1ベクターの末端に18kb Eco RV断片由来の付加的な5’フランキング配列
を挿入することによって行うことができる。
実施例12
発癌物質及び腫瘍プロモーターの検出
ヒトに対する化学物質の有害可能性を評価するための迅速かつ安価な検定法と
して、遺伝子毒性化学物質のための短期間試験(STTs)が元々開発されてい
た。しかし、ナショナル・トキシコロジー・プログラムによって開始された、齧
歯類発癌性を予測するためのSTTsの能力を評価するプロジェクトの結果を要
約した最近の報告は、STTsのみに頼る確実性に疑問を投げ掛けている。この
齧歯類検定にて検出された最も強力な3つの発癌物質は評価された4つのSTTS
のいずれにも遺伝子毒性を産生しなかった[Tennantら,Science,Vol.236,p
p.933-941(1987)]。従って、化学、農学、食品及び医薬の企業が新規化合物
についてEPA/FDA承認を受けるためには現在、2百万ドルに上る費用のか
かる2年動物試験を行うことを要求されている。発癌物質及び腫瘍プロモーター
を迅速に検出するよう遺伝子操作された新規なトランスジェニックマウス系統の
開発は長期動物試験の諸経費を大幅に削減することになろう。ここに特許請求し
ているトランスジェニックマウス系統が発癌物質の迅速検出に適合しているか否
かをまず始めに、既知の皮膚癌の発癌物質、DMBAを用いて決定するにあたり
、良性の損傷が対照の非処置小動物よりも早く現れるか否かを決定した。腫瘍プ
ロモーターを検出するための適合性を決定するには、既知のプロモーター、12
−O−テトラ−デカノイルホルボール−13−アセテート(TPA)をrasHa
及びfosマウスに適用した。rasHaマウスの良性の損傷及びfosマウスの
過形成が創傷部位(即ち、タッグした耳)に現れ、創傷が腫瘍形成を促進(プロ
モート)することができるので、この系統は上記の試験に有用である。
本明細書に言及しているすべての特許及び公報は本発明が関連する当業者のレ
ベルを示している。本明細書に引用によって記載しているすべての特許及び公報
は、個々の文献が具体的にかつ個々に引用して記載されているのと同じ程度に本
明細書に包含される。
当業者ならば、本発明を実施し、記載している目的及び利点並びに本発明に本
質的なものを入手するために本発明を充分に適合させることは容易に理解できる
であろう。方法、操作、処理、特定の化合物の分子と関連して記載しているバイ
オリアクター、核酸配列、形質転換された表皮細胞、トランスジェニック動物及
びヒトケラチンK1ベクターは例示であって、本発明の範囲の限定を意図するも
のでない。以下の請求の範囲によって規定される本発明の精神に包含される本発
明の改変及び他の使用が当業者には明らかである。
(1)一般的情報
(i)特許出願人:ループ、デニス・アール
ロスナゲル、ジョセフ・エイ
グリーンハル、デイビッド・エイ
ユスパ、スチュアート・エイチ
(ii)発明の名称:トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を
標的化するベクターの開発
(iii)配列の数:5
(iv)連絡先:
(A)名宛人:フルブライト・アンド・ヤオースキ
(B)通り:スイート5100、マクキネイ1301番
(C)市:ヒュストン
(D)州:テキサス
(E)国:アメリカ合衆国
(F)ZIP:770010−3095
(v)コンピューター解読書式
(A)媒体型:フロッピーデスク
(B)コンピューター:IBMP C適合
(C)オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:パテントイン リリース#1.0,バージョン
#1.25
(vi)本出願のデータ:
(A)出願番号:US
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人情報
(A)氏名:ポール、トーマス・ディー
(B)登録番号:32,714
(C)参照/整理番号:Dー5478
(ix)電話連絡先情報:
(A)電話番号:713/651−5325
(B)ファックス番号:713/651−5246
(C)テレックス:762829
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴
(A)長さ:10747塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴
(A)長さ:6693塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(vi)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(A)長さ:24979塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴
(A)長さ:8アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴
(A)長さ:16アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号4:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
A61K 31/70 ADU
39/00 A 9284−4C
48/00 8314−4C
C07H 21/04 B 8615−4C
C12N 5/10
// A61K 31/24 9455−4C
38/00
9455−4C A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,CA,
CH,DE,DK,ES,FI,GB,HU,JP,K
P,KR,LK,LU,MG,MN,MW,NL,NO
,PL,RO,RU,SD,SE,UA
(72)発明者 ループ、デニス・アール
アメリカ合衆国77030テキサス州、ヒュー
ストン、ベルフォンテイン2331番
(72)発明者 ロスナゲル、ジョセフ・エイ
アメリカ合衆国77096テキサス州、ヒュー
ストン、クイーンズロック・ドライブ5427
番
(72)発明者 グリーンハル、デイビッド・エイ
アメリカ合衆国77025テキサス州、ヒュー
ストン、ブロンプトン7423番
(72)発明者 ユスパ、スチュアート・エイチ
アメリカ合衆国20817メリーランド州、ベ
セスダ、カリタ・コート8013番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.表皮に核酸カセットを発現させるためのケラチンK1ベクターであって、 ケラチンK1プロモーター、転写されるが翻訳されない5’領域及び最初のイ ントロンを該核酸カセットの発現のための配列及び位置関係をもってすべて含有 するケラチンK1遺伝子の5’フランキング配列である該5’フランキング領域 ; 転写されるが翻訳されない3’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コー ド化DNAを含有する、ビタミンD3調節配列を含有するケラチンK1遺伝子の 3’フランキング領域;及び 5’フランキング領域と3’フランキング隣接とを結ぶ、種々の制限エンドヌ クレアーゼ部位を有するポリリンカーであって核酸カセットを挿入するための位 置をさらに提供するポリリンカー、を含有するベクター。 2.5’フランキング領域が約1.2kbであり、3’フランキング領域が約3 9kbである、請求項1に記載のケラチンK1ベクター。 3.該核酸カセットがタンパク質、ポリペプチド又はアンチセンスRNAをコ ードする核酸配列を包含する、請求項1に記載のベクター。 4.該カセットが腫瘍遺伝子をコードする核酸配列を包含する、請求項1に記 載のベクター。 5.腫瘍遺伝子がras、fos、myc、erb、src、sis及びju nからなる群の中から選ばれる請求項4に記載のベクター。 6.該カセットがトランスフォーミング遺伝子をコードする核酸配列を包含す る請求項1に記載のベクター。 7.制限エンドヌクレアーゼがBamHI、XmaI、KpnI、NotI、ClaI及 びBglIIからなる群の中から選ばれる、請求項1に記載のベクター。 8.該核酸カセットがヒトパピローマウイルスのE6又はE7トランスフォー ミング配列を含有する、請求項1に記載のベクター。 9.該核酸カセットがTGF−α配列を含有する、請求項1に記載のベクター 。 10.18kbEcoRV断片由来の付加的な5’フランキング配列を末端にさら に含有する、請求項1に記載のベクター。 11.請求項3に記載のベクターを含有する形質転換表皮細胞を有するバイオ リアクター。 12.ホルモン、成長因子、酵素、薬物、腫瘍サプレッサー、レセプター、ア ポリポタンパク質、凝固因子、腫瘍抗原、ウイルス抗原、昆虫抗原、細菌抗原、 及び寄生虫抗原からなる群の中から選ばれるタンパク質又はポリペプチドをコー ドする核酸配列を有するカセットをベクターが包含する、請求項11に記載のバ イオリアクター。 13.核酸配列がプロインスリン又はインスリンをコードしている請求項12 に記載のバイオリアクター。 14.核酸配列が成長ホルモンをコードしている請求項12に記載のバイオリ アクター。 15.核酸配列がインスリン様成長因子I、インスリン様成長因子II、又は インスリン成長因子結合性タンパク質をコードしている請求項12に記載のバイ オリアクター。 16.核酸配列が凝固因子をコードしている請求項12に記載のバイオリアク ター。 17.核酸配列が表皮成長因子(TGF−α)、皮膚成長因子(PDGF)、 又は血管形成因子をコードしている請求項12に記載のバイオリアクター。 18.核酸配列がIV型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、又はVII型コラ ーゲンをコードしている請求項12に記載のバイオリアクター。 19.該カセットが免疫学的応答を誘導するタンパク質を包含する、ワクチン 生産のための請求項12に記載のバイオリアクター。 20.ケラチンK1ベクターを表皮細胞にex vivo導入するための方法であっ て、選択マーカーを有するベクターを同時形質転換し、得られた形質転換細胞を 選択する工程を包含する方法。 21.配列番号1に記載の調節配列を含有するヒトケラチンK1遺伝子の非 コード化断片。 22.配列番号1の1から1246ヌクレオチドからなる5’フランキング領 域; 配列番号1の6891から10747ヌクレオチドからなる3’フランキング 領域;及び 配列番号2の2351から2376ヌクレオチドからなるリンカー を有するヒトケラチンK1ベクター。 23.即座に受精した卵を採取し、 請求項3に記載のベクターを前核にマイクロインジェクションすることによっ て該ベクターを該受精卵に挿入し、そして 得られたインジェクション卵を偽妊娠した雌性の受容体に移すこと、 を特徴とするトランスジェニック動物の作成方法。 24.その胚及び体細胞に請求項3に記載のベクターを含有しているトランス ジェニック動物であって、該ベクターが該動物又は該動物の祖先へ胚段階に導入 されたものであり、該ベクターの核酸カセットが表皮のみにおいて発現される該 トランスジェニック動物。 25.核酸カセットがトランスフォーミング遺伝子配列を含有する、請求項2 4に記載のトランスジェニック動物。 26.腫瘍遺伝子が第1表に記載のものから選ばれる、請求項25に記載のト ランスジェニック動物。 27.動物が謡歯類である請求項24に記載のトランスジェニック動物。 28.癌の起源を研究し、又は癌を処置するための方法であって、 核酸カセット中に腫瘍遺伝子を含有するヒトケラチンK1ベクターによって胚 をインジェクションすることにより、トランスジェニック動物を作成し、 得られた動物又はその子孫を癌の研究に使用すること、 を特徴とする方法。 29.核酸カセットがfos腫瘍遺伝子配列を含有している請求項28に記載 の方法。 30.核酸カセットがras腫瘍遺伝子配列を含有している請求項28に記載 の方法。 31.試験動物が1以上の腫瘍遺伝子を含有している請求項28に記載の方法 。 32.ケラチンK1ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する方法であって 、該表皮細胞を形質転換するに充分な時間、該表皮細胞に該ベクターを接触させ る方法。 33.ヒトに核酸カセットを一時的に導入するための方法であって、該カセッ トを含有するケラチンK1ベクターを表皮細胞に、該ベクターを該細胞に形質導 入するに充分な時間接触させる方法。 34.創傷又は外科的切開の治癒を速める方法であって、成長因子をコードす る核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベクターを表皮細胞に インビボ形質導入する方法。 35.種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも1つの ベクターのカセットが表皮成長因子(TGF−α)の核酸配列を含有し、少なく とも1つのベクターのカセットが皮膚成長因子(PDGF)を含有し、少なくと も1つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の 核酸配列を含有し、そして少なくとも1つのベクターのカセットが血管形成因子 の核酸配列を含有する、請求項34に記載の方法。 36.マトリックスタンパク質の配列が、IV型コラーゲン、ラミニン、ニド ゲン及びVII型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードす る配列から選ばれる請求項35に記載の方法。 37.血管形成因子が酸フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト 成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項35に記載の方 法。 38.成長因子の核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベク ターを表皮細胞にインビボ形質導入することを特徴とする、皮膚漬瘍を処置する 方法。 39.種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも1つの ベクターのカセットが表皮成長因子(TGF−α)の核酸配列を含有し、少なく とも1つのベクターのカセットが皮膚成長因子(PDGF)を含有し、少なくと も1つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の 核酸配列を含有し、そして少なくとも1つのベクターのカセットが血管形成因子 の核酸配列を含有する、請求項38に記載の方法。 40.マトリックスタンパク質の配列が、IV型コラーゲン、ラミニン、ニド ゲン及びVII型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードす る配列から選ばれる請求項39に記載の方法。 41.血管形成因子が酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラス ト成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項39に記載の 方法。 42.ヒト及び動物の創傷、外科的切開又は皮膚潰瘍の治癒を速める方法であ って、 成長因子の核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベクターを 表皮細胞にex vivo形質導入し、そして 得られた形質導入表皮細胞を、処置する動物又はヒトに移植する、 ことを特徴とする方法。 43.種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも1つの ベクターのカセットが表皮成長因子(TGF−α)の核酸配列を含有し、少なく とも1つのベクターのカセットが皮膚成長因子(PDGF)を含有し、少なくと も1つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の 核酸配列を含有し、そして少なくとも1つのベクターのカセットが血管形成因子 の核酸配列を含有する、請求項42に記載の方法。 44.マトリックスタンパク質の配列が、IV型コラーゲン、ラミニン、ニド ゲン及びVII型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードす る配列から選ばれる請求項43に記載の方法。 45.血管形成因子が酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラ スト成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項43に記載 の方法。 46.TGF−β、サイトカインレセプターの可溶性形態、及びアンチセンス RNAからなる群から選ばれるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配 列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベクターを表皮細胞にインビボ 形質導入することを特徴とする、乾癖を処置する方法。 47.該カセットがTGF−βの配列を含有する請求項46に記載の方法。 48.該カセットがIL−1、IL−6及びIL−8からなる群の中から選ば れるサイトカインレセプターの可溶性形態を含有する、請求項46に記載の方法 。 49.該カセットがTGF−α、IL−1、IL−6及びIL−8からなる群 の中から選ばれる配列に対するアンチセンスRNAを含有する、請求項46に記 載の方法。 50.ヒトパピローマウイルスのE6又はE7遺伝子に対するアンチセンスR NAをコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベクタ ーを表皮細胞にインビボ形質導入する、皮膚癌を処置する方法。 51.正常なp53タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸カセットを 含有するケラチンK1ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する、皮膚癌を処 置する方法。 52.免疫学的応答を誘導するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸 配列を有する核酸カセットを含有するケラチンK1ベクターを表皮細胞にインビ ボ形質導入する、ワクチン接種の方法。 53.該カセットがウイルスキャプシドタンパク質の配列を含有する請求項5 2に記載の方法。 54.キャプシドタンパク質がヒトパピローマウイルス由来である請求項53 に記載の方法。
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