JPH08502733A

JPH08502733A - 真皮に対する角化細胞の接着を改善する生成物および方法

Info

Publication number: JPH08502733A
Application number: JP6507342A
Authority: JP
Inventors: ロバートイーバーゲソン; グレゴリーピーランストラム; パトリシアルシエ; エムピーターマリンコヴィッチ
Original assignee: オレゴン州
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-27
Publication date: 1996-03-26
Also published as: AU5095493A; CA2143644A1; DE69330352D1; EP0675728A4; AU691788B2; EP0675728B1; ATE201994T1; DE69330352T2; EP0675728A1; WO1994005316A1

Abstract

(57)【要約】表皮角化細胞とその下に位置する真皮との間を接着させる単離したタンパク質カリニンおよびＫ−ラミニンを開示する。精製したカリニンは約410〜495kDaの分子量を有し、細胞関連形態（約495kDa）および２種の培地関連形態（それぞれ、約460および410kDa）で存在する。Ｋ−ラミニン接着分子は約650kDaの分子量を有しウエスタンブロッティングによりラミニンのB1およびB2フラグメントに類似する第１および第２フラグメントおよびモノクローナル抗体BM165、カリニンに特異的な抗体と免疫反応する190kDaの第３フラグメントに分離する単離異種三量体ラミニン変異体である。移植角化細胞がその下に位置する基盤に接着するのを改善するためにカリニンまたはＫ−ラミニンを用いる方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】真皮に対する角化細胞の接着を改善する生成物および方法認知本発明は米国立衛生研究所からの承認番号AR 35689に基づき政府の支援により行われた。米国政府は本発明に所定の権利を有する。発明の背景１．発明の分野本発明は角化細胞が真皮に接着するのに有用な基底膜タンパク質に関する。さらに特に、本発明は皮膚移植の成功率を高めるために、これらのタンパク質を用いる方法に関する。２．発明の一般的背景培養した表皮移植片（角化細胞移植片）を生命切迫火傷の患者の処置に用いることは、最初にオッコナー（O'Conner）等の「The Lancet １：75〜78（1981）」により報告されている。火傷患者の皮膚生検小試料をin vitroで培養し、さらに培養した自家移植片を火傷患者の腕の全厚創傷（full thickness wounds）に配置した。培養角化細胞は十分に増殖し６週間で創傷を覆った。その後の研究でこの方法を変更して無血清培地で角化細胞を増殖させるように改良した。他のものは自己の培養角化細胞を用いて表面を再生した複合死体皮膚同種移植片を用いることを示唆している。また培養細胞に対して種々の裏材を用いること、または角化細胞の培養方法を変更することも試みられている。しかし、培養角化細胞を移植しても期待外れに終わることが多かった。角化細胞移植片を適用する最も有用な１例は、損傷が生体表面の半分以上に及んでいる火傷をおった患者においてである。かかる患者は、外科的切除後に火傷の領域に表皮を再生するのに十分な量の分離皮膚厚さの移植片を提供するには不十分な供与部位を有する。不幸なことには、これらの環境において角化細胞を自己移植した結果は変動が大きくかつ期待外れであった。培養した表皮移植片は正常な皮膚より有意に脆く水庖を起こし易いことがわかった。ウッドレイ（Woodle y）等の「JAMA 259：2566〜2571（1988）参照。数人の研究者は、１種以上の結合組織成分における異常性により、臨床的に観察された表皮−真皮間の接着性の変化を説明できるかもしれないと示唆している。しかし、この成分の正体は不明瞭なままである。ラミニンは既に非コラーゲン性糖タンパク質として記載されている。この分子はほとんどすべての基底膜において見出される高分子量（850 kDa）の細胞外マトリックス糖タンパク質である。基底膜は遍在する、分化した型の細胞外マトリックスであり、器官の実質細胞を間隙コラーゲン間質から分離する。このマトリックスと細胞の相互作用は正常な細胞過程および新生物形成細胞過程に関して重要である。マウスのエンゲルブレス−ホルム−スウォーム〔Engelbreth-Holm-Swarm（EHS ）〕腫瘍から単離したラミニンは、ジスルフィド結合した三量体で400 kDaのＡ鎖、220 kDaのB1鎖および210 kDaのB2鎖からなる〔クーパー（Cooper）等の、「 Eur．J．Biochem．119：189〜197（1981）」参照〕。ロータリシャドウイング電子顕微鏡により、EHSラミニンは１本の長腕と３本の短腕を有する非対称十字形のイメージが得られた〔エンジェル（Engel）等の、「J．Mol．Biol．150：97〜 120（1981）」参照〕。巨大EHSラミニン分子の断片化研究により種々の特性を個々の分子領域に局部限定することが促進された。この分子が巨大サイズで、多領域構造を有することは、基底膜を架橋し、多数の基底膜成分の相互作用を媒介し、さらに基底膜に隣接する基底細胞の表面にある受容体と相互作用する能力をこの分子に付与する。種々の細胞外マトリックスタンパク質はタイプIVコラーゲン、ニドーゲン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含め、EMSラミニンと相互作用することができる。角化細胞〔スタンレイ（Stanley）等の、「J．Invest．Dermatol．82：456〜4 59（1982）」参照〕および真皮繊維芽細胞〔Woodley等の、「J．Cell．Physiol ．136：140〜146（1988）」参照〕を含む多種の細胞は培養中にラミニンを合成することが示されている。絨毛ガン細胞〔ピータース（Peters）等の、「J．Bio l．Chem．260：14732〜14742（1985）」参照〕およびHT 1080繊維肉腫細胞〔アリタロ（Alitalo）等の、「Cell 19：1053〜1062（1980）」参照〕を含むいくつかの細胞系は、Ａ鎖に比べＢ鎖を過剰に合成する。これらの観察結果に関連する、最近のヒト皮膚試料のin situハイブリダイゼーション研究はB1およびB2鎖遺伝子の過剰な発現を明らかにしたが、Ａ鎖遺伝子の発現は検出できなかった〔オルセン（Olsen）等の、「Lab Invest．60：772〜782（1989）」参照〕。皮膚および培養細胞のいずれにおいても、B1およびB2鎖が比較的過剰量合成されＡ鎖の合成がラミニン組み立てにとって速度制限段階としてはたらくかもしれない。さらに、ラミニン鎖は集合して多様な構造となると考えられる。メロシンはラミニンの変異体でB1鎖、B2鎖、およびＡ鎖と異なる第３の鎖を含むが、配列分析により40％の相同性を示す〔エーリヒ（Ehrig）等の、「Proc．Natl．Acad．Sci ．87：3264〜3268（1990）」参照〕。マウス心臓ラミニンはラミニン変異体でありメロシンと同様の置換したＡ鎖を有する〔ポールソン（Paulsson）およびサラジン（Saladin）の、「J．Biol．Chem．264：18726〜18732（1989）」参照〕Ｓ −ラミニン、他のラミニン変異体は、正常なＡ鎖、B2鎖、およびB1鎖といくらか相同配列を示す変異体鎖を含む〔ハンター（Hunter）等の、「J．Cell Biol．11 3：971〜978（1989）」参照〕。最近、メロシン変異体鎖およびＳ−ラミニン変異体鎖がマイオテンドナウス結合（myotendonous junction）を含む特定の組織でB2と一緒に複合体を形成することが見出された〔エングバル（Engvall）等の、「J．Cell Regulation １：731〜740（1990）」参照〕。Ａ鎖を欠くと考えられる、他の２種のラミニン変異体が報告されているが、メロシンおよびＳ−ラミニンと異なり、これらが組織中に存在するかどうかは知られていない。これらにはラットのRN22神経鞘腫ラミニン〔デービス（Davis）等の、「J．Neurosci．５：2662〜2671（1985）」；エドガー（Edgar）等の、「J．Cell Biol．106：1299 〜1306（1988）」参照〕；および3T3含脂肪細胞ラミニン、〔アラタニ（Aratani ）およびキチガワ（Kitigawa）の、「J．Biol．Chem．263：16163〜16169（1988 ）」参照〕が含まれる。これらの形態のものにはB1およびB2サブユニットが含まれるが、電気泳動的に正常なＡサブユニットが含まれていない。したがって、ラミニンはタンパク質のファミリーとして存在する。その個々のメンバーは組織分布を制限され、例えばメロシンおよびＳ−ラミニンは筋肉および神経の基底膜にそれぞれ局在するが、上皮性基底膜には局在しない。ラミニンは多くの種類の細胞の増殖および分化に影響を及ぼし、さらにヒトの発生の初期段階に存在する。またラミニンは培養基盤上の角化細胞により分泌される細胞外マトリックスの成分でもある〔カーター（Carter）等の、「J．Cell Biol．111：3141〜3154（1990）」；マルチシオ（Marchisio）等の、「J．Cell Biol．112：761〜773（1991）」参照〕。外から添加したEHSラミニンはヒト角化細胞〔ビルケ（Wilke）およびスクビッツ（Skubitz）の、「J．Invest．Dermato l．97：141〜146（1991）」参照〕を含め、多くの種類の上皮性細胞種〔テラノバ（Terranova）等の、「Cell 22：719〜726（1980）」；グッドマン（Goodman ）等の、「J．Cell Biol．105：595〜610（1987）」参照〕の付着を促進するが、培養角化細胞の運動性を著しく減少させる〔Woodley等の、「J．Cell．Physio l．136：140〜146（1988）」参照〕。この培養角化細胞の運動性が著しく減少することは、移植した角化細胞のための接着タンパク質としてEHSラミニンを用いる障害となる。角化細胞の移動を阻害することは角化細胞の培養シートが損傷表面にわたり広がり、表皮の欠落を完全に被覆する能力を減少させる。したがって、EHSラミニンは角化細胞移植の際に使用することが適切でないと考えられる。本発明の目的は上皮−真皮接着を提供する、治療上有用な形態の、新規に単離した結合組織成分を同定し提供することである。本発明の他の目的は移植した培養角化細胞がその下に位置する基盤、例えば哺乳類またはヒトの真皮に接着するのを促進するために、かかる治療上有用な物質を用いることである。さらに他の本発明の目的は角化細胞の移動を最小限にしか阻害しない、かかる治療上の物質を提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的は次の詳細な説明を参照することにより一層明瞭に理解することができる。発明の開示上述の目的は種々の単離し精製した新規タンパク質を同定しさらに生産することにより達成された。これらのタンパク質はヒト上皮下皮膚、気管、食道、角膜および羊膜の基底膜のアンカリングフィラメントに存在する。これらの新規タンパク質の１種は、発見者によりカリニンと命名され、ヒトの真皮と表皮との間を接着させることが見出された。またこのタンパク質は、角化細胞をin vitroで固体基盤に、さらにin vivoで基底膜に接着させることに関連する。カリニンは約410〜約495kDaの範囲の分子量を有する種々の形態で存在する。カリニンは未処理の分子中のジスルフィド結合を切断した後に、ウエスタンブロッティングすると、別々のサブユニットに分離する。カリニンの１種の形態は「 KC」型と称され「細胞」画分に存在する（細胞内におけるような細胞と関連しまたは細胞培養物中の細胞層に関連して）。KC型は約495kDaの分子量を有する。この型のジスルフィド結合が切断されると、KC型は200-kDaのサブユニット、155-k Daのサブユニット、および140-kDaのサブユニットに分離する。他の２種類のカリニンは「KM1」および「KM2」型と称され、特定のカルシウム濃度下でカリニン産生細胞を浸す細胞培養培地中に蓄積する傾向がある。KM1型は約460kDaの分子量を有し、低濃度（0.035mM）のカルシウム下に培地中に蓄積する。ジスルフィド結合を切断した場合、KM1は165-kDaのサブユニット、155-kD aのサブユニット、および140-kDaのサブユニットに分離する。KM2型は約410kDa の分子量を有し、高濃度（1.0mM）のカルシウム下に培地中に蓄積する。ジスルフィド結合を切断した場合、KM2は165-kDaのサブユニット、140-kDaのサブユニット、および105-kDaのサブユニットに分離する。KC、KM1、およびKM2の140-kDa のサブユニットは同一であると考えられる。KM1およびKM2の165-kDaのサブユニットはKCの200-kDaサブユニットが細胞外で処理されることで誘導されると思われる。KCの155-kDaサブユニットはKM1の155-kDaと同一であると考えられる。したがって、KCがKM1に転化する間に、200-kDaサブユニットが165-kDaサブユニットにまで処理され、KM1がKM2へ転化する間に、155-kDaサブユニットが105-kDaサブユニットにまで処理される。モノクローナル抗体BM165のエピトープは、ブロットをBM165で探索する場合、165-kDaサブユニット上で確認される。 460-kDa型のカリニンのロータリシャドウイメージングは２個の小球状体を第１末端に、さらに単一の大球状体を反対の末端に有する非対称の107-nm長ロッドを明らかにする。410-kDa型は第１末端の２個目の小球状体を欠如すると思われる。カリニンは結合性表皮水泡症のような疾病を患ったヒトの上皮−真皮結合に欠如していることが見出され〔ハーリッツの多様体（Herlitz's variety）〕、そこでは表皮がその下に位置する真皮から分離している。ヒト皮膚についてのカリニンの免疫局在は、この抗原がアンカーリングフィラメントとして既知の超構造要素であることを示す。ロッド状の型およびカリニンのロータリシャドウにより示された長さもこの役割と矛盾しない。ほとんどのカリニンが電子密度の高い稠密層に局在し、真皮−上皮結合の抗体誘導破裂が起こるという知見はBM165抗体エピトープが半接着斑に結合する原因であるカリニン分子の領域近くに位置することを示唆している。抗原の反対末端は電子密度の高い稠密層に埋設されていると思われる。また他の本発明の接着タンパク質は角化細胞により産生されるラミニン変異体であり本発明者はＫ−ラミニンと命名した。この単離した変異体は約650kDaの分子量を有しウエスタンブロッティングで３種のフラグメントに分離する。第１および第２フラグメントはEHSラミニンのB1およびB2フラグメントとほとんど同一であり、それぞれ220kDaと210kDaの分子量を有する。第３のフラグメントは約19 0kDaの分子量を有し、ラミニン抗Ａ鎖モノクローナル抗体1F5、11D5および4C7と免疫反応しないが、カリニンの165Kおよび200K鎖に対するモノクローナル抗体BM 165と免疫反応する。したがって、620kDaのタンパク質はBM165エピトープを含む190kDaサブユニットを有するラミニンの新規な変異体である。単離したＫ−ラミニン分子では、B1、B2および第３の鎖はB1の鎖の約１に対し B2の鎖が１、190kDaフラグメントの鎖が１の割合で存在する。この比は単一の22 0kDaのB1鎖、単一の210kDaのB2鎖、および単一の190kDaの鎖を含む単離した異種三量体分子（heterotrimeric molecle）と一致する。190kDaの鎖はEHSラミニンＡ鎖より約240kDaだけ短く、190kDaの鎖とmAbsの1F5、11D5および4C7との間の抗原−抗体反応を欠くことから明らかなように、ラミニンＡ鎖とは免疫学的に関連しない。その代わりに、変異体190kDa鎖は165kDaの鎖に処理されるカリニンの20 0kDaの鎖と構造的および免疫学的な類似性を示す。Ｋ−ラミニン分子はＹ型の、十字型でない、１本の長腕と２本の短腕をもつ、ロータリシャドウイメージを有する。球状領域は短腕の各遠位末端および長腕の遠位末端に存在する。このロータリシャドウイメージは通常ラミニンＡ鎖により与えられる短鎖が欠如していることを示す。置換した190kDa鎖は長腕の末端で大きな球状体の代わりに寄与する。また小球状領域が第１と第２短腕の共通部分に若干の画像として存在する。Ｋ−ラミニンはモノクローナル抗体BM 165（カリニンおよびＫ−ラミニンの双方と交差反応する）と免疫反応するが、モノクローナル抗体K140（カリニンの14 0kDaフラグメントを認識するが、Ｋ−ラミニンと反応しない）と免疫反応しない。Ｋ−ラミニンは、他のラミニン変異体が見出されるヒト骨格筋、血管内皮細胞および末梢神経の基底膜に通常現れない。しかし、Ｋ−ラミニンは羊水中およびヒト皮膚で真皮−表皮結合の基底膜領域に見出され、さらに、扁平上皮細胞ガン腫系SCC-25により産生される。また、他の本発明の新規タンパク質はＫ−ラミニンとカリニンとの間の共有結合付加生成物である。単離した付加生成物には、EH SラミニンのB1およびB2フラグメントとほぼ電気泳動で同一な、第１および第２の電気泳動フラグメント、ならびにモノクローナル抗体1F5、11D5および4C7と免疫反応しないが、モノクローナル抗体BM 165と免疫反応する190kDaの第３フラグメントを有するＫ−ラミニン分子が含まれる。カリニン分子はＫ−ラミニンに共有結合で結合し、さらにカリニンとしての上述の特性を有する。付加生成物はポリクローナル抗カリニンおよびポリクローナル抗ラミニンの両抗体と免疫反応し、さらに付加生成物の還元により105、140、145、165および190kDaのフラグメント、ならびにラミニンのB1およびB2鎖に相当するウエスタンブロット上の７種の電気泳動バンドパターンが得られる。145kDaのバンドは165kDa鎖のタンパク質分解生成物である。Ｋ−ラミニン／カリニン複合体のロータリシャドウイメージ分析は単離した分子が２本の短腕と２本の長腕を有することを明らかにする。長腕の長さ配分は約 81nmの長さをもつ第１の長腕および約103nmの長さをもつ第２の長腕を有する２頂性（bimodal）である。81nmの腕はＫ−ラミニンの長腕の長さに一致し、さらに103nmの長さはカリニン分子の全長と一致する。このＫ−ラミニン／カリニン付加生成物のシャドウイメージはラミニンのシャドウイメージと実質的に異なり、 37nmの長さの３本の短腕と77nmの長さの１本の長腕を有する非対称十字型である。ラミニンの３本の短腕はそれぞれ２つの球状領域を有し、さらに長腕は単一の大きな末端球状領域を示す。また、本発明には移植した角化細胞とその下に位置する基盤との間に、ある量のタンパク質または本発明のタンパク質を供給することにより、移植した角化細胞がその下にある基盤に接着するのを改善する方法が含まれる。タンパク質の量は角化細胞が通常産生する量より多い。この多量のカリニン、Ｋ−ラミニンまたはＫ−ラミニン／カリニン付加生成物は、創傷表面のような基盤に、または移植部位に培養した角化細胞の集密層を配置する前にその集密層の基底表面に、１種以上のこれらのタンパク質の外部供給を行うことにより提供することができる。タンパク質またはタンパク質群を医薬として許容できる担体に、好ましくは１〜 10μg／ml、または40μg／mlより多いような一層多量に供給することができる。本発明の他の観点では、移植前の培養した角化細胞にタンパク質またはタンパク質群を供給する代わりに、培養した角化細胞を誘導して、サイトカインのような増殖プロモータに曝すことによりこれらのタンパク質物質の産生を基底レベルから超生理学的レベルに高めることができる。あるいはまた、本発明の他の観点では、角化細胞を培養中に監視して、それらの細胞がカリニン、Ｋ−ラミニン、またはそれらの付加生成物を活発に産生する時期を決定し；１種以上のこれらの物質の、角化細胞による活発な生産が有意に減少する前に、角化細胞を基盤に移植する。図面の簡単な説明図1Aはヒト***のBM165抗原の間接免疫蛍光局在を示す顕微鏡写真であり、図1 Bは融合してないミエローマからの培地で染色した凍結断面を示す。図2Aは真皮−表皮結合領域の超構造の特徴を示すヒト皮膚の真皮−表皮結合の顕微鏡写真であり、棒線は100nmの長さを示す；図2Bは真皮−表皮基底膜のアンカリングフィラメントへのBM165モノクローナル抗体の局在を示す図2Aに似た顕微鏡写真であり；図2Cは無傷の皮膚の連続した広がりに沿ったBM165標識を示し棒線は200nmの長さを示し；さらに図2Dは抗体BM165が表皮剥離を誘導する領域の基底膜に沿ったBM165標識を示す。図3AはBM165で染色した培養角化細胞の集密層の顕微鏡写真であり；図3Bは対照培地で染色した培養物；図3Cは細胞層を培養基盤に平行にして撮影した透過型電子顕微鏡写真断面であり、黒い棒線は20nmの長さを示す；さらに図3Dでは、BM 165で染色する前にEDTAを用いて細胞を基盤から除去した。図4Aは集密に近い状態まで増殖させ、次にPBS（リン酸緩衝溶液）で洗浄しBM1 65モノクローナル抗体とインキュベーションして固定する前に５nm金結合２次抗体とインキュベーションした角化細胞培養物中の連続した亜細胞（subcellular ）マトリックスの顕微鏡写真であり；図4Bは集密に近い状態まで増殖させBM165 で染色することなく直ちに固定した角化細胞であり；図4Cは図4Aに示すように調製した細胞の走査型電子顕微鏡写真であり、図4Dは図4Bに示すように調製した集密培養物の走査型電子顕微鏡写真である。図5Aは75〜80％の集密にまで増殖させ、次に洗浄しPBSで処理し処理後10分で撮影した角化細胞の顕微鏡写真であり、棒線は20μｍを示す；図5BはPBS処理後6 0分で顕微鏡写真撮影した細胞を示し；図5Cは図5Aに似た顕微鏡写真であり細胞をPBSで洗浄し50μg／mLのBM165 mAbで処理し10分後に撮影した；図5Dは60分後の細胞を示し；図5Eは図5Aに似た顕微鏡写真で、細胞をPBSで洗浄し10mMのEDTA で処理し、処理後10分で撮影した；図5Fは60分後に撮影した細胞を示す。図6Aは培養した角化細胞の顕微鏡写真であり、その細胞を培地中に６時間置いた後BM165モノクローナル抗体に曝した；図6Bは培地中に24時間置いた後であり、さらに；図6Cは培地中に48時間置いた後であり；図6Dおよび6Eは図6Bに似た顕微鏡写真であり角化細胞の移動路に沿った基盤の標識を示す。図７は角化細胞を培養した培地から単離したBM165抗原の電気泳動分析結果を示すウエスタンブロットである。図8A〜8Cはアフィニティ精製に次いでBM165抗原のロータリーシャドウ分析した結果を示す種々の倍率の写真であり、棒線は100nmの長さを示す。図９はヒト皮膚の真皮−表皮結合の基底膜領域の超構造の概略線図である。図10A、10Bは異なるカルシウム濃度中で増殖させた培養角化細胞からのカリニンを、アクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、免疫沈降反応させた結果を描く。図11はスタフィロコッカスのV8プロテアーゼで消化した後に得たカリニンサブユニットのペプチド断片化マップを含む。図12はウエスタンブロッティングにより確認したカリニンの細胞関連、培地関連、および組織関連形態の比較である。図13A、13Bはカリニンの細胞関連および培地関連形態のパルス−チェイス比較の結果を示し、免疫沈降反応生成物をアクリルアミドゲルで分離した後に示す。図14は器官培養したウシ皮膚により合成されたカリニンのパルス−チェイス比較の結果を示し、免疫沈降反応生成物をアクリルアミドゲルで分離した後に示す。図15は抗体を用いラミニン（L）、Ｋ−ラミニン変異体（V）、およびカリニン（K）可視化する角化細胞培地の非還元免疫沈降反応の結果を示すSDS-PAGEゲルである。図16は角化細胞の細胞および培地画分における24時間の代謝標識期間（metabo lic labeling period）後のラミニンを比較するSDS-PAGEゲルである。図17はラミニン（L）、Ｋ−ラミニン変異体（V）、およびB1、B2二量体（d）をオートラジオグラフィにより可視化するSDS-PAGEである。図18Aおよび18Bは皮膚培養物中のラミニン生合成を示すSDS-PAGEである。図19Aおよび19Bはアフィニティで精製した扁平上皮細胞ガン腫培地からのＫ− ラミニンおよびラミニンのロータリシャドウイメージング分析結果である。図20Aおよび20Bは（A）ラミニンおよびＫ−ラミニンの比較免疫ブロッティング結果ならびに（B）V8プロテアーゼを用いたペプチドマッピング研究結果を示すSDS-PAGEゲルである。図21A、21B、21C、21D、21Eおよび21Fは、末梢神経（A、C、E）および生後１ヶ月のヒト新生児***（B、D、F）をポリクローナル抗ラミニン（AおよびB）；ポリクローナル抗カリニン（CおよびD）；Mab 5H2抗メロシン（E）、およびポリクローナル抗カリニン、免疫前の（preimmune）血清（F）で間接免疫蛍光顕微鏡法により分析したラミニン分布を比較する一連の顕微鏡写真である。図22はカリニンに対するモノクローナル抗体を用いて羊膜抽出物からアフィニティ精製したＫ−ラミニンおよびカリニンの電気泳動分析結果である。図23（A）はカリニンおよびＫ−ラミニン／カリニン付加生成物の分画を示すグラフであり、図23（B）はこの材料の非還元電気泳動分析結果である。図24A、24B、24Cおよび24Dはカリニンおよびラミニンに対するポリクローナル抗体を用いて免疫アフィニティ精製したＫ−ラミニン／カリニン付加生成物のウエスタンブロッティング分析結果を示す。図25は図23（A）のピーク２に存在する複合体のロータリシャドウイメージ分析結果である。図26は図25のロータリシャドウイメージ分析結果における長腕長さの配分を示すグラフである。好適例の詳細な説明真皮−表皮結合での基底膜の超構造を図９に概略図で示す。この図は電子密度の低い層14、その下に隣接する電子密度の高い稠密層16、および真皮18上に位置する原形質膜12を有する基底角化細胞10の一層低い部分を描く。半接着斑20を原形質膜12上の角化細胞10の基底部に描く。張原フィラメント22は半接着斑20に差し込まれ細胞質に延在する。アンカリングフィラメント24は半接着斑20の付着斑の真下の原形質膜から生じる。このフィラメントは電子密度の低い層14を横切り基底原形質膜12を電子密度の高い稠密層16と接続し、さらに半接着斑の領域で最も多い。アンカリング細繊維26は、対照的に短い湾曲した構造であり、その中央部に不規則な間隔の横断帯（cross banding）を有し、両端で広がっている。細繊維26の遠位部分は稠密層に差し込まれているが、近位部分は乳頭状に真皮で終端するかあるいはループを形成して電子密度の高い稠密層に没入する。本発明の１つの観点はアンカリングフィラメント24と結合するタンパク質に関し、真皮を表皮に接着する際に重要な作用を行う。アンカリング細繊維網状体の超構造はこれが基底膜をその下に位置する真皮に確保することを示唆する。スシ（Susi）等の、「J．Cell Biol．34：686〜690（ 1967）」；カワナミ（Kawanami）等の、「Am．J．Pathol．92：389〜410（1978 ）」を参照。この仮説は劣性の栄養障害性表皮水疱症を患う個体がアンカリング細繊維を欠いており〔ブリッガマン（Briggaman）等の、「J．Invest．Dermatol ．65：203〜211（1975）」；レイフ（Leigh）等の、「J．Invest．Dermatol．90 ：6 12〜639（1988）」；ブルックナ−ツダーマン（Bruckner-Tuderman）等の、「J ．Invest．Dermatol．93：３〜９（1989）」参照〕さらに、下側に隣接する間質から表皮基底膜を自然に分離する傾向があるという観察結果により支持される。本発明者はアンカリングフィラメントと結合する本発明の種々のタンパク質を記載する。これらのタンパク質はさらに超構造の位置および組織分布により特徴付けられる。これらのタンパク質を精製しその繊維状コンフォメーションをシャドウイメージングにより決定した。最後に、カリニンはin vitroで角化細胞がプラスチックまたはガラス基盤に接着するかあるいはin vivoで基底膜に接着するのに必須であることを示す。カリニン免疫原の供給源カリニンをモノクローナル抗体BM165を用いて局在化した。このBM165は「BM16 5免疫原」を用いて調製した。 BM165免疫原をヒト羊膜抽出物から誘導し、以下のように調製した。ヒト羊膜からのタイプVIIコラーゲンのNC-1球状領域のコラーゲナーゼ抽出および精製は〜10101（1990）」を参考のためここに記載する。この精製の１つの段階中に、抽出物を低塩濃度の緩衝液（２M尿素、25mM NaCl、５mM EDTAおよび50mMTris-HC l、pH7.8）中でDEAEセルロース〔DE52、ワットマン社（Whatman）〕とインキュベーションする。非結合画分をNC-1領域のさらなる精製に用いた。DEAEセルロースを0.2M NaClを含む等量の緩衝液で洗浄し、溶出した物質を17,000×gで60分間遠心分離した後単離した。試料を硫安沈殿（50％飽和）により10倍に濃縮し透析によりPBS（リン酸緩衝溶液）中で平衡化した。得られたタンパク質の複合体混合物はカリニンに対するハイブリドーマの調製に際し免疫原としてはたらいた。角化細胞の細胞培養ヒト***角化細胞をボイス（Boyce）等の、ここに参考として加入する「J．Ti ss．Cult．Meth．９：83〜93（1985）」で公知になった方法に従って調製した。これらの細胞を0.15mM CaClβ含有の角化細胞増殖培地（KGM）で増殖させ製造者の指示〔クロネティクス社（Clonetics）〕に従い継代培養した。ほとんどの免疫細胞化学実験では、第１または第２継代細胞をガラスまたはプラスチックチャンバースライド〔ラブ−テク社（Lab-Tek）〕中で、あるいはガラスカバースリップ上で約80％の集密まで増殖させた。大規模収集のために、使用済み培地細胞を15 0-cm²組織培養ディッシュ内で増殖させ１週間に３回15mLの新鮮培地を供給した。 BM165抗原のアフィニティによる精製増殖中の角化細胞から収集した培地を2,000×gで10分間遠心分離により清澄にした。内因性プロテアーゼの活性をEDTA、PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）およびN-エチルマレイミドをそれぞれ終濃度で５mM、50μM）および50 μMまで添加することにより最小にした。培地を濾過により滅菌し直ちに処理するか使うまで−20℃で凍結保存した。 BM165モノクローナル抗体（mAbs）を製造者により説明されているように、１m LのCNBr-活性化セファロース4B〔ファルマシアエルケービーインコーポレーション（Pharmacia LKB，Inc．）〕に樹脂当たり１mgの抗体の量で結合させた。角化細胞培地（１〜２リッター）を抗体の結合した15mLのカラムに通過させカラムをPBSで洗浄した。BM165抗原を１Ｍ酢酸で溶出させ分画を280nmの吸光度について監視した。プールした画分をジイソプロピルフルオロリン酸（５μg／mL）で処理し次に分析するのに適切な緩衝液に対して透析した。溶出画分のSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行うために、画分の試料を還元前に３〜５％の勾配ゲル上で、さらにβ− メルカプトエタノールで還元した後に５％ゲル上で分離した。高分子量の予め染色した標準品〔バイオラッド社（Biorad）〕に加え、ジスルフィド結合したタイプVIIコラーゲンのNC-1領域（Mr=450,000ダルトン）、還元したNC-1領域（Mr=15 0,000ダルトン）および還元したフィブリリン（Mr=350,000ダルトン）〔サカイ（Sakai）等の、「J．Cell Biol．103：1577〜1586（1986）」参照〕をMr目盛の決定に用いた。組織調製抗原の一括した免疫局在化（enbloc immunolocalization）をキーネ（Keene）等により、以前「J．Cell Biol．104：611〜621（1987）」に記載されたように実施したが、以下のように幾つかの変更を行った。割礼後短期間に収集したヒト新生児***を、すべてが上皮を含む0.5mm×１mm のブロックに切断し、さらにリン酸緩衝溶液（PBS）、４℃のpH7.4中で２時間洗浄し、６時間にわたりPBSを数回変えてすすぎ、その後1.0％BSA（ウシ血清アルブミン）を含むPBSで１：３に希釈した１nm金結合二次抗体〔ヤンセンライフサイエンスプロダクト社（Janssen Life Science Product）、米国ニュージャージー州ピスキャッタウエイ所在〕中、４℃で一昼夜インキュベーションした。洗浄後に、***組織を氷冷銀強化溶液〔ヤンセンライフサイエンスプロダクト社（Ja nssen Life Science Product）、米国ニュージャージー州ピスキャッタウエイ所在〕中で15分間浸漬し、その後直ちに室温まで温めた。銀を室温で７分間１nm金粒子上に沈殿させた後、その組織を水で15分間にわたり数回すすぎ、その後pH7. 4の0.1Mカコジル酸緩衝液ですすいだ。最後にこれらの組織を0.1Mカコジル酸緩衝化1.5％／1.5％グルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド、pH7.4中で固定し、一連の段階的エタノール希釈中で脱水し、プロピレンオキシドに曝し、さらにスパルスエポキシ（Spurrs epoxy）中に埋設した。用いた対照抗体にはエラスチン〔ドクターリンサカイ（Dr．Lynn Sakai）により生産され提供された〕、コラーゲンタイプIV〔Sakai等の、「Am．J．Pathology 108：310〜318（198 2）」参照〕、およびコラーゲンタイプVI〔Keene等の、「J．Cell．Biol．107 ：1995〜2006（1988）」参照〕を認識するものが含まれる。皮膚の試料の１種を氷冷アセトン中で30分間固定し、緩衝液中ですすぎ、さらに３％／３％アルデヒドおよび１％OsOC中で固定し、その後スパルスエポキシ中に埋設する前にアセトン中で脱水してアンカリングフィラメントの存在を示した（図2A）。電子顕微鏡試験抗体処理の前に正常細胞の超構造を検査するために、ヒト角化細胞培養物をガラスカバースリップ上で増殖させ、0.1Mカコジル酸緩衝化1.5％／1.5％グルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド、1.0％OsOC中で固定した。培養物を一連の段階化したエタノール中で脱水し、その後透過型電子顕微鏡（TEM）のためにスパルスエポキシ中に直接埋設するか、または臨界点乾燥し既に記載された〔Keene等の、「J．Cell．Biol．107：1995〜2006（1988）」〕ように走査型電子顕微鏡（SEM）のためにスパッターコーティングした。 TEM免疫電子顕微鏡検査を、８−ウエルのパーマノックス培養フラスコ上で増殖させた角化細胞について行った。この際、（a）一次抗体の培養時間を室温で４時間としたこと；（b）二次抗体を５nm金に結合させＢＳＡ緩衝液（20mM Tris -HCl、0.9%NaCl、１mg/mL BSA、20mM NaN₃）で１：３に希釈したこと；および（ c）銀強化法を省略したことを除き、組織について上述したのと同一のプロトコルを使用した。角化細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、抗体に曝した後SEMにより観察し、この角化細胞をエタノール中で脱水してから液体CO₂によって臨界点乾燥する以外は同一に処理した。通常のTEM検査用に、60〜90nmの厚さの切片を、ライヘルト（Reichert）の超ミクロトーム上でダイヤモンドナイフを用いて切断した。切片を酢酸ウラニルおよびレイノールズクエン酸鉛中でコントラストをつけ〔レイノルズ（Reynolds) の「J．Cell Biol．17：208〜215（1963）」〕、60kVで操作するフィリップス41 0 LS TEM装置を用いて検査した。通常のSEM検査用に、試料を最小量の金−パラジウムを用いてスパッターコーティングし、10kVで操作する走査型電子顕微鏡（モデルDS130；インターナショナルサイエンティフィックインスツルメンツ，インコーポレーシヨン（International Scientific Instruments）、米国カリフォルニア州ミルピタス所在）の上側ステージで、３〜10nmのスポットサイズを使用して観察した。他の技術ウエスタンブロッティング、ロータリシャドウ分析および長さ測定を含む方法は他の文献〔モーリス（Morris）等の、「J．Biol．Chem．261：5638〜5644（19 86）」；ルンストラム（Lunstrum）等の、「J．Biol．Chem．261：9042〜9048（ 1986 に詳述されている。分子のロータリシャドウイングは、ショトン（Shotton）等の、「J．Mol．Bio l．131：303〜329（1979）」およびティラー（Tyler）等の、「J．Ultrastruct ．Res．71：95〜102（1980）」により記載される標準技術を変更して行った。0. 15M炭酸塩緩衝液、pH7.4中の試料をグリセロールを用いて終濃度70％まで希釈した。次に、エアブラシを用いて、100μLの溶液を新たに開裂させた６mmの直径のマイカディスク上に鋭角で噴霧した。小滴直径は50〜200μmであった。試料を10^-6 トルのエバポレータ中で乾燥させた。白金線を炭素電極に巻き付け試料をステージ上に配置し100rpmで回転させた。高電圧で、白金は蒸発しマイカ表面から６ °の角度で完了した。次にステージを炭素源に対し90゜傾けチャンバを空にした。炭素の50Å層をマイカの表面に蒸着して「炭素レプリカ」を形成させた。炭素レプリカは炭素被覆マイカを２回蒸留した水に慎重に浸漬することにより直ちにマイカから浮遊した。炭素レプリカは400メッシュの格子に乗せた。レプリカを3 0μmの対物レンズ有効口径を有す80kVの透過型電子顕微鏡を用いて試験した。 BM165ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製ハイブリドーマを調製し既に記載されているような間接免疫蛍光法によりスクリーニングした。Sakai等の、「J．Cell Biol．103：1577〜1586（1986）」参照。MB165 mAb、IgGiを他の文献〔Keene等の、「J．Cell Biol．113：971〜978（1 991）」参照〕に記載されたように細胞培養物の上清から精製した。種々のモノクローナル抗体はザラジョラカンサーリサーチファウンデーション（ the La Jolla Cancer Research Foundation）のドクターエバエングバル（D r Eva Engvall）により提供された。これらの抗体には次のものが含まれる：11D 5 mAb〔Engvall等の、「Cell Regulation １：731〜740（1990）」参照〕、ラミニンＡ鎖に特異的な4C7 mAb〔Engvall等の、「J．Cell Biol．103：2457〜2465 （1986）」参照〕、およびラミニンＢ鎖に特異的な4E10〔ウェワー（Wewer）等の、「J．Biol．Chem．」258：12654〜12660（1983）参照〕。マウスラミニンに対するラビットポリクローナル抗血清を米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Campany）から入手した。モノクローナル抗体はヒト羊膜から、タイプVIIコラーゲンのNC-1領域の単離について記載されているようなコラーゲナーゼ消化により、最初に抽出したタン iol．Chem．265：10095〜10101（1990）」を参照。得られたハイブリドーマを間接免疫蛍光法により、ヒト胎児***の、血管基底膜領域ではない真皮−表皮領域に対する局在についてスクリーニングした。選択したハイブリドーマを、免疫原および既知の基底膜成分を含むタンパク質抽出物のウエスタンブロッティングにより再スクリーニングした。既知の基底膜成分を認識しないハイブリドーマをさらに研究するために保存した。前述のスクリーニングの１つは同一の特有なタンパク質を認識すると思われる２種のハイブリドーマを生じた。これらのうち１つは、BM165と称され、ここに報告する研究に用いた。BM165ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体も、BM165と称され、皮膚の真皮−表皮結合の基底膜領域を特異的に確認するが、脈管構造または周囲の神経の基底膜に反応性を示さない（図１）。 BM165免疫反応性の組織分布 BM165 mAb反応性の組織分布を表Ｉに示す。皮膚、気管、食道、角膜および羊膜の表皮下領域のすべては、はっきりとした、輝いている、連続する線形の蛍光を示した。蛍光の組織分布は腸管平滑筋の随時の弱い染色を除けば、半接着斑およびアンカリング細繊維の出現に直接に近似した。BM165 mAb反応性はヒト腎臓、血管、神経、および軟骨からの組織では観察されなかった。次にBM165 mAbを用いて、ヒト***の真皮−表皮基底膜内に対応する抗原を局在化した。一次抗体を１nmの金に結合した二次抗体を用いて局在化した。これを銀強化法により可視化した。１nmの金の使用は５nmの金結合二次抗体が基底膜の透過を制限されるために必要であった。この方法は半接着斑の基底緻密プレートの直下で、BM165抗原をアンカリングフィラメントに対して局在化した（図2Bおよび2C）。アンカリングフィラメントの標識は無関係な特異性を有する抗体を一次抗体として用いる場合には見出せなかった（データは示していない）。いくつかの追加の標識を電子密度の高い稠密層に沿って観察した（図2C）が、大部分の標識は半接着斑の下に現れた。少量の金堆積物も電子密度の高い稠密層の真皮側の下に見出された。これらの実験を通じて、一次抗体とインキュベーションする間に、広範囲で、しばしば完全な皮膚試料の脱上皮化が通常観察された。このことは、タイプIVおよびタイプVIIコラーゲンに対する抗体を使用した場合の本発明者の多くの経験とは全く異なることである。図2BおよびＣに示す剥がれていない（unsplit）基底膜の領域は組織末端から比較的離間した領域を含む。組織末端近くでは抗体濃度が最高で表皮は基底膜から分離し、極めて強烈な標識が電子密度の高い稠密層に沿って均一に見出せ、そこは細胞界面であった（図2D）。いくつかの標識はなお半接着斑の細胞外表面に結合していると思われたが、このことは比較的稀であった（図示せず）。本発明者は理論および科学的知識の限界により拘束されるのを望まないが、通常の顕微鏡法により見出せる基底膜領域の分子要素の位置づけが完全に人工的である場合がある。迅速−凍結および凍結−再生（substitution）により調製されたラットの門歯、舌および歯肉の電子顕微鏡検査は、電子密度の低い層を完全に欠いている均一な25〜100 nmの厚さの高電子密度基底膜を明らかにした〔ゴールドベルグ（Goldberg）等の、「Eur．J．Cell Biol．42：365〜368（1986）」参照〕。本発明者の１人は、ヒト皮膚の真皮−表皮結合を用いて同一の観察結果を得た。したがって、電子密度の低い層は、基底膜からの細胞が減少することから得られる人工産物であり、さらに電子密度の高い稠密層は完全な基底膜の残部であるかもしれない。その通りである場合には、カリニンが基底膜内全体に配置され、半接着斑が基底層と接触している部位に一端だけが集中していると思われる。次に、アンカリングフィラメントは基底層内のこれらの種を反映する。これらの種は半接着斑に強く結合し、さらに細胞が減少するにつれて基底膜から引き寄せられるために緊張して直線状になる。細胞培養物中のカリニンの局在性 BM165 mAbを用いて角化細胞培養物中の対応する抗原を可視化した。図3Aに示すように、集密細胞の上部表層に適用した場合、抗体は培養細胞の間のプラスチック基盤の表面に局在した（細胞層を培養基盤に平行にして撮影した、図3Cと比較せよ）。細胞内蛍光は観察されなかった。この普通でない局在化はタイプIVコラーゲン〔Sakai等の、「Am．J．Pathology 108：310〜318（1982）」参照〕、ラミニン、またはタイプVIIコラーゲン〔Sakai等の、「J．Cell Biol．103：157 7〜1586（1986）」参照〕に対する抗体では繰り返すことはできなかった（データは示さず）。かかるBM165 mAbsの局在化は、同一の免疫学的サブタイプであるが、無関係な特異性を有す抗体を用いる場合には観察されなかった（データは示さず）。また、抗原は細胞を10mM EDTAで除去した後プラスチック基盤全体の強烈な蛍光により示されるように、細胞の下の基盤上に存在した（図3D）。またBM165抗原を図4A〜4Dに示すように、角化細胞培養物中の連続する亜細胞マトリックスに沿って局在化した。角化細胞を集密に近い状態に増殖させ直ちに固定するか（図4Bおよび4D）またはPBSで洗浄してさらに固定する前に５nmの金結合二次抗体と、次にBM165 mAb（50μg／mL）とインキュベーションした（図4A および4C）。角化細胞培養物中の抗原の電子顕微鏡検査は免疫金結合物が電子密度の高い微細なフェルト状構造上の基盤を均一に横断して直線状に堆積する（図 4A）。フェルト状構造は細胞の下に続いていたが、無標識のことが多かった。場合によって、肥厚が、他の研究者により観察された構造〔コンプトン（Compton ）等の、「Lab．Invest．60：600〜612（1989）」参照〕に似た、未発達半接着斑に類似の角化細胞原形質膜に沿って見出すことができた（図4B）。上述した角化細胞培養物中のBM165の超構造的免疫局在化の研究は濃縮したBM1 65 mAbと長期にインキュベーションする間の角化細胞の丸み付けおよび剥離挙動により複雑化した。未処理角化細胞の形態に比較して変化したBM165インキュベーション細胞の形態を示す走査型電子顕微鏡写真を図4Cおよび4Dにそれぞれ示す。図4Cに示す処理角化細胞は丸みを帯びBM165とインキュベーションする間に剥離した。剥離した角化細胞は容易にプラスチック上を再度覆いさらに未処理細胞に比較して同等の勢いで増殖し、丸みを帯びさらに剥離した細胞が抗体処理により代謝上傷つけられなかったことを示す（図示せず）。これらの観察結果をさらに追求するために、正に亜集密状態の角化細胞培養物を精製したBM165 mAbと別々に10および60分間インキュベーションした。インキュベーションの後、培養物を写真撮影した（図5A〜Ｆ）。PBS中の精製mAbs、PBS 単独、または10mM EDTAを角化細胞と平行にインキュベーションした。また平行培養物をPBS中の抗タイプVIIモノクローナルIgGと対応する同一時間インキュベーションした。BM165 mAb（図5Cおよび5D）およびEDTA（図5Eおよび5F）には60 分インキュベーションした後に角化細胞に広範囲な丸み付けおよび剥離が生じることが観察された。かかる丸み付けおよび剥離は培養物をPBS（図5Aおよび5B）、抗タイプVIIコラーゲンまたは抗ラミニン（図示せず）とインキュベーションする場合には観察できなかった。したがって、BM165エピトープは角化細胞付着部に含まれるが、真皮繊維芽細胞が基盤に付着ずる部位には含まれない。また図3Aの顕微鏡写真は集密角化細胞培養物が細胞内蛍光を現さないことを示唆する。平板培養時間に対して生じる抗原の基盤への堆積を評価するために、角化細胞を低密度で平板培養し、さらに蛍光の発現が細胞密度の増加の関数として観察された。これらの研究に関する顕微鏡写真の結果は図6A〜6Eに示されるが、さらにBM16 5抗原の合成が細胞の増殖および移動に関係することを示す。平板培養後６時間では、細胞内蛍光が観察できたにすぎない（図6A）。24時間では、個々の細胞および細胞クラスターが核周囲の細胞内蛍光およびこれらの細胞に直接隣接する基盤の蛍光染色を両方とも示した（図6B、6Dおよび6E）。いくつかの場合、細胞が移動し、基盤に付着した蛍光染色を後に残すことがわかった（図6Dおよび6E）。細胞クラスターが大きくなるので（図6C）、周辺細胞のみが細胞内蛍光を示すにすぎず、クラスターの中央領域に位置する細胞がこの抗原をもはや合成しないことを示した。これらの結果は細胞増殖および移動が角化細胞コロニーの周囲で起こり内部細胞が無活動であるという以前の観察結果〔バランドン（Barrandon）等の、「Cell 50：1131〜1137（1987）」参照〕と一致する。集密培養物の内側にある細胞がBM165抗原を合成するとは思われなかったので、BM165抗原は細胞が増殖し移動することにより最初に産生されると結論付けた。これらのデータは、発育中または再生中の上皮で、カリニンが移動基盤上で最初に均一に分布することを示す。このことはプラスチックまたはガラスのいずれかの上で培養した角化細胞がカリニンを、培養物中で未発達半接着斑と考えられるものの下だけでなく、基盤上に均一に堆積するという観察結果により支持される。角化細胞の培養物が集密になりさらに患者に移植するのに十分な表面を有するようになると、集密培養物はカリニンを基盤上に堆積しなくなった。このことは皮膚移植部位の真皮、筋肉または皮下組織に培養角化細胞が接着しにくくなる理由と考えられる。ディスパーゼ（dispase）またはトリプシンのような酵素を用いて角化細胞を培養表面から除去することもカリニンを分解する場合がある。したがって、角化細胞を酵素で除去した後外因性カリニンを供給することは酵素の使用により生じる損傷を相殺することができる。カリニンのPAGE 抗原をさらに特徴付けるために、BM165 mAbを用いる免疫アフィニティクロマトグラフィーによりBM165免疫原を角化細胞培地から分画し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（図７）。上述したように（BM165抗原のアフィニティ精製、を参照）、BM165抗原を使用後角化細胞培養培地からアフィニティ精製した。ジスルフィド結合を還元する前にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析する場合、２つの種をクーマシーブルーを用いて染色し可視化した（レーン１）。両分子種は免疫ブロット陽性であった（レーン２）。優勢種は約410,000ダルトンの推定Mrに泳動し、さらに劣勢種はMr 460,000ダルトンに認められることが多かった。メルカプトエタノールでジスルフィド結合を還元した後、４種の主要な電気泳動種が分離された（レーン３、矢印）：Mr=165,000、155,000、140,000および10 5,000ダルトン。これらのバンドはいずれも、EHSラミニンに対するポリクローナル抗血清と〔シグマ社（Sigma）〕、またはヒトＡ、B1またはB2鎖（Engvall）に対するモノクローナル抗体と免疫反応しない（データは示さず）。165kDa（キロダルトン）種だけ（および化学的に染色したいずれのバンドにも対応しない分解生成物と推定される免疫反応性の一層小さい種）がmAb BM165を用いて探査したウエスタンブロッティングにより示されるようなBM165エピトープを含む（レーン４）。ジスルフィド結合した410kDaおよび460kDa種をゲルから別々に削り取り、２− メルカプトエタノールを用いて還元した。還元生成物を電気泳動させて分離した。460kDaの種には165kDa、155kDaおよび140kDa鎖が含まれ（レーン５）、さらに少量の200kDa種がクーマシーブルーを用いて染色した後かすかに見出せるにすぎなかった（レーン３）。また200kDa種にはBM165エピトープが含まれていた。460 kDa種には165kDa、140kDaおよび105kDa鎖が含まれた（レーン７）。これらの結果は３種の非同一鎖を有するタンパク質分子の同定結果と一致する。非還元種の電気泳動の移動度の差は、タンパク質分解により155kDa種が105kDa 種に転化することから説明することができる。また、これらの結果は200kDaおよび165kDa鎖が生合成のパルス−チェイス実験により確認されるように、前駆体一生成物関係を有することを示した。カリニンのロータリーシャドウイング精製BM165抗原のロータリシャドウイメージングは107nmの長さの中央ロッドを有する直線状分子を示した（図８）。この分子は２種の形態を有することがわかる。一層通常の形態はロッド部の各末端に１個の球状の節を有する広がったダンベル型プロファイルを有するように見える（図8B）。一方の節は他方の節より小さく見えることが多い。最も少ない形態は、一端に大球状体を有し他端に一層小さい球状体を有する非対称形である（図8Fおよび8G）。両形態は本発明者が気づいている他の分子とは異なっている。２つの形態の比較的多いもの、および一層大きな種に付加的な節が存在することは460kDaの形態を示す一層大きなイメージに一致する。カリニンのロータリシャドウイングは非対称分子であることを示す。この確認結果はカリニン分子の１個の部位が角化細胞表面の受容体と相互作用することができ他の部分が電子密度の高い稠密層内に埋設されたままであり、従って、細胞 −基盤接着を提供する分子構造と一致する。さらにこの効果は培養細胞を抗体と共にインキュベーションした際に観察された細胞−基盤接触の破壊、およびBM16 5抗体により生じる矛盾のない劇的な皮膚の脱上皮化により支持される。カリニンの前駆体−生成物の関係カリニンの高分子量（HMW）形態が角化細胞により分泌され細胞外で処理され低分子量形態になることをここに示す。細胞外処理には２種の独立した段階が含まれる。図10Aには、カリニンの３種の形態が次に示すBM165 mAbsを用いる放射線で標識した角化細胞の培養物の免疫沈降に存在する。図10Aに示す実験では、角化細胞の培養物を0.035mMのCaCl₂（レーン２）、0.15mMのCaCl₂（レーン１および３）、または1.0mMのCaCl₂（レーン４）を含む培地中で接着後24時間代謝にかかわる標識を付した。標識細胞（レーン１）および培地（レーン２、３、４）をBM16 5 mAbを用いて免疫沈降させ、３〜５％の勾配のアクリルアミドゲルの非還元SDS -PAGEにより分離し、さらにフルオログラフィにより可視化した。選択した放射能バンドを乾燥ゲルから削り取り、２％の２−メルカプトエタノールを含むゲル試料緩衝液で元に戻した。１種の形態のカリニンは、細胞画分に存在し、「KC」と称され非還元SDS-PAGE により約460kDaと見積もられる（レーン１）。他の２種の形態は、「KM１」（44 0kDa）および「KM２」と称され（400kDa）、培地画分に観察される（レーン２、３および４）。KM１は主として低カルシウム濃度の条件下に培養した角化細胞の培地に蓄積する（0.035mMのCaCl₂、レーン２）。KM２は主として高カルシウム培地で培養した角化細胞の培地に蓄積する（1.0mMのCaCl₂、レーン４）。0.15mMの CaCl₂を含む培地では（レーン３）、培養中のKM１およびKM２の蓄積量がほぼ等しい。カリニンに加え、BM165 mAbsは角化細胞培地から650kDaタンパク質を共沈させる（図10Aの記号「Ｖ」により示される、レーン２〜４）。650kDa形態は、二次元還元にかけた場合の、ラミニンB1およびB2ならびに特有の190kDaサブユニットを含むラミニンの新規な変異体である（図10B、レーン１）。図10Bでは、還元した試料を５％アクリルアミドゲルのSDS-PAGEにより分離した。試料は次のものである：還元したラミニン変異体Ｖ（レーン１）；還元したカリニン形態KC（レーン２）；還元したカリニン形態KM１（レーン３）；および還元したカリニン形態KM２（レーン４）。右側のマーカーは還元したカリニンサブユニットの位置を示す。マーカーの右にはMr×10^-3値を示す。ゲルで精製した後、図10Aに示すもの（レーン１および３）に似たKC、KM１、およびKM２バンドを削り取り二次元還元分析にかけた（図10B、それぞれレーン２〜４）。カリニンの３種の形態すべてが140kDaサブユニットを含むことが見出された。また、KCはKM１またはKM２と異なり、200kDaサブユニットをも含んでいた。さらにKCは155kDaサブユニットをも含んでいた。KM１は、140kDaサブユニットに加え、165kDaサブユニットおよび155kDaサブユニットを含んでいた。KM ２は、140kDaサブユニットに加え、165kDaサブユニットおよび105kDaサブユニットを含んでいた。これらの結果からKCは200kDaサブユニットが165kDaサブユニットに処理されKM１に転化し、さらにKM１は155kDaサブユニットが105kDaサブユニットに処理されKM２に転化することを示す。図11にはスタフィロコッカスのV8プロテアーゼで消化して得たカリニンのサブユニットのペプチド断片化マップを描く。0.15mMのCaCl₂を含む培地中で増殖する角化細胞の培養物は24時間、代謝にかかわる標識を付し、図10Ａ、図10Ｂに示すようにBM165を用いて免疫沈降させ、さらに５％アクリルアミドゲルの還元SDS -PAGEにより分離した。指定された分子量の還元カリニンサブユニットを含む放射能バンドを乾燥ゲルから削り取りV8プロテアーゼで部分的に消化した。消化生成物を10%のアクリルアミドゲルSDS-PAGEにより分離しフルオログラフィにより可視化した。右端にはMr×10^-3値を示す。かかるV8プロテアーゼペプチドマッピングにかけた場合、KCの140kDaサブユニットはKM１およびKM２の140kDaサブユニットで得られた消化フラグメントに似た消化フラグメントを示した（図11）。同様に、KCの155kDaサブユニットはKM１の 155kDaサブユニットの消化パターンに似た消化パターンを示した。したがって、 155kDaサブユニットはKCがKM１に転化する場合処理されないと思われる。さらに、KCの200kDaサブユニットならびにKM１およびKM２の165kDaサブユニットのV8プロテアーゼ消化は種々の電気泳動的に似たフラグメントを示し、KM１およびKM２の165kDaサブユニットがKCの200kDaサブユニットから誘導されることを示す。ウエスタンブロッティングの比較研究によりKCのKM１およびKM２への処理をさらに解明することができた。結果を図12に示し、これらはウエスタンブロッティングにより確認されたカリニンの細胞−関連、培地−関連、および組織−関連形態の比較を示す。SCC-25培地画分からのカリニン（レーン１、３、６、および９）、細胞画分からのカリニン（レーン５）およびコラゲナーゼ消化したヒト羊膜からのカリニン（レーン２、４、７、および10）は２−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液を数分間供給する内に95℃で３分間可溶化した（レーン８）。次いですべての試料を５％アクリルアミドゲルの還元SDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロースに移し、さらにアミドブラックを用いて全タンパク質について染色する（レーン１，２）か、次の一次抗体：mAb 6F12（レーン３、４）、カリニンに対するポリクローナル抗血清（レーン５、６、７、８）、およびmAb BM165（レーン９、10）中でインキュベーションし、次に適当なHRP結合二次抗体を用いて可視化した。右端にはMr×10^-3値を示す。これらの研究を行うために、SCC-25扁平上皮細胞ガン腫細胞（ATCC # CRL1628 ）からカリニンを得た。細胞−関連カリニンを100mmの直径のプラスチック製培養ディッシュ上で増殖させたSCC-25細胞の80％集密培養物から得た。細胞層をPB Sで洗浄し、次に氷***解緩衝液（10mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、２mM EDT A、250μM PMSF、１mM ｎ−エチルマレイミド、0.3％NP-40、0.05％トリトン X 100、0.3％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％BSA、および0.1％SDS）を用いて抽出した。その後の段階はすべて４℃で行った。細胞およびマトリックスは細胞リフターを用いてディッシュから除去し、次いでダウンス（Dounce）ホモジナイザを用いて可溶化し25,000×gで30分間遠心分離した。上清をジイソプロピルフルオロリン酸（５μg／mL）で処理し、K140セファロースと混合し、さらにロッキングプラットフォーム上で一昼夜インキュベーションした。マトリックスをクロマトグラフィーカラムに移し、50カラム容量の溶解緩衝液、次に50カラム容量のPBSで洗浄した。その後カラムを1M酢酸を用いて溶出させた。ピーク画分を280 nmのUV吸収により決定し、プールし、水に対して透析し、その後凍結乾燥した。カリニン様ポリペプチドを細胞を浸す培養培地から分離するために、BM165セファロースの代わりにK140セファロースを用いた。「K140」mAbsを分離するために必要な免疫原はヒト羊膜から精製した。コラゲナーゼ抽出したヒト羊膜の膜をBachinger等の、「J．Biol．Chem．265：10095〜 10101（1990）」から採用した方法により処理した。硫安を終濃度30％（W/V）まで添加することによりタンパク質を最初の可溶性画分から沈殿させさらに４℃で一昼夜インキュベーションした。沈殿物を遠心分離（17,000×g）60分間）して回収しさらに透析前にクロマトグラフィー緩衝液に再懸濁させた。これにより試料の総粘度（overall viscosity）が著しく減少し、おそらくこれは核酸の除去によるものである。残留不溶物をベックマンタイプの19ローター中の超遠心分離（18,000rpm、１時間）により試料から除去した。得られた免疫原を用いて２種のBalb/cマウスに接種した。ハイブリドーマを調製し最初に、Sakai等の、「J． Cell Biol．103：1577〜1586（1986）」に従う間接免疫蛍光顕微鏡法によりスクリーニングした。「K140」と称す１種のハイブリドーマはカリニンの140kDaサブユニットを特異的に認識するmAbを産生した。さらに図12に関し、K140セファロースカラムを通過したSCC-25培養培地のピーク画分からの総タンパク質（アミドブラックで染色した）をレーン１に示す。レーン１のカリニンサブユニットを示すパターンのバンドは上述した正常***角化細胞から精製したカリニンサブユニットバンドのパターンに似ている。図12のレーン２はコラゲナーゼ可溶化羊膜組織からのピーク溶出画分中の総タンパク質を染色して同様に示す。このパターンはK140mAbが、羊膜組織から、（カリニンに加え）上述の650kDaラミニン変異体から生じる220kDa、210kDa、および190kDaのペプチドを沈殿することを示す。K140セファロースカラムは培養培地から650kDaラミニン変異体を免疫精製しなかった（図12、レーン１）。これらの知見はK140 mAbと650kDaラミニン変異体との交差反応性のためではなく、むしろ組織におけるカリニンと650kDaラミニンとの間の共有結合によると考えられる。 K140mAbはカリニンの140kDaサブユニットを特異的に認識した。140kDaサブユニットの電気泳動位置は細胞培養培地から得たカリニン（図12、レーン３および６）、および組織から得たカリニン（レーン４、７、および８）に変化を与えなかった。さらに、KCラミニンの140kDaサブユニットは、カリニンに関するポリクローナル抗血清により認識され（レーン５）、未変化の電気泳動挙動を示した。また、140kDaサブユニットは還元免疫ブロット分析でK140mAbsにより認識された（データは示さず）。これらの結果は140kDaサブユニットが処理されないことを示した。さらに図12に関し、ポリクローナル抗カリニン抗血清を用いて細胞から得た（レーン５）、培養培地から得た（レーン６）、および組織から得た（レーン７および８）カリニンの免疫ブロットは合計６バンドであった。155kDaおよび105kDa サブユニットを示すバンドは140kDaサブユニットの生成物としてK140により（レーン３および４）または200kDaサブユニットの処理生成物としてBM165mAbにより（レーン９および10）確認できなかった。また結果を図10に示すが、これらのデータは105kDaサブユニットが155kDaサブユニットのタンパク質分解生成物であることを示す。図12の、レーン５〜８で用いたポリクローナル抗カリニン抗体は105kDa鎖を含むが155kDa鎖を含まないKM２について作製された。それにもかかわらず、この抗血清は155kDaサブユニットを認識した。したがって、155kDaと105kDa鎖との間の前駆体−生成物関係が示された。ヒト羊膜組織から得たようなカリニンを培養SCC-25細胞から得たカリニンと比較した。ヒト羊膜組織からの、カリニンをコラゲナーゼ可溶化組織から、または沸騰SDS-PAGE緩衝液で可溶化した組織から得た材料をアフィニティクロマトグラフィーにかけることにより精製した。培養した細胞からの、カリニンを細胞から、または細胞を浸している培地から精製した。さらに図12では、コラゲナーゼ可溶化羊膜試料（レーン７）および緩衝液可溶化羊膜試料（レーン８）はそれぞれポリクローナル抗カリニン抗体と免疫反応する３種のバンドを生じた。これらのバンドはカリニンの165-、140-、および105kDaサブユニットと等価である。SCC- 25細胞（レーン５）または細胞培養培地（レーン６）から得た試料はポリクローナル抗カリニン抗体により認識されるようなカリニンの200-および155kDaサブユニットを明らかにする。200-および155kDaサブユニットは羊膜組織から得た材料には明らかに含まれていなかった（レーン７および８）。したがって、羊膜組織から得たカリニンが細胞培養培地に存在するカリニンの最も広範囲に処理されている形態、すなわち、KM２と類似していると考えられる。また羊膜組織カリニン（図12、レーン７および８）はかかる組織からの145kDaバンドを産生し、このバンドは他のバンドより抗カリニンポリクローナル抗体によりあまり強く染色されなかった。BM165 mAbを用いて実施したコラゲナーゼ可溶化試料の免疫ブロット（レーン10）は145kDaサブユニットが165kDaサブユニットのタンパク質分解生成物であることを示した。かかるタンパク質分解は細胞培養物中で稀にしか観察されなかった。カリニン処理の部位、速度、および他の動力学を決定するために、パルス−チェイス試験を懸濁および付着角化細胞を用いて行った。図13Aおよび13Bに示す試験は、懸濁および付着角化細胞共に、標識カリニンが10分間のパルス後約90分間細胞培養培地中に現れた。図13Aおよび13Bはカリニンの細胞結合形態と培養培地形態とのパルス−チェイス比較の結果を示す。図13Aでは、付着角化細胞を10分間³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システインを含む培地中で標識した。放射能を有する培地を除去しその後細胞を放射能を有しない培地中で培養した。培養物を除去し細胞−および培地−画分を０、0.5、1.5、３、６、および24時間の放射能チェイス後にポリクローナルカリニン抗血清で免疫沈降させるために処理した。図13 Bでは、懸濁培養物中の角化細胞を図13Aに示すように標識した。放射能を有する培地を除去し細胞を180分間無放射能の培地中で培養した。細胞および培地のアリコートを標識期間の終わりに除去した。放射能チェイスの30、90、および180 分後に、細胞および培地をカリニンに対するポリクローナル抗血清で免疫沈降させた。沈殿した生成物を５％アクリルアミドゲルの還元SDS-PAGEにより分離しフルオログラフィにより可視化した。１つの条件（180Ｃ）では、細胞を、免疫沈降のために細胞および培地画分を処理する前に標識および180分のチェイス中に1 0nmコルヒチン中で培養した。右端にはMr×10^-3値を示す。したがって、KC形態のカリニンは合成され、KC誘導200kDaバンドが培地中に現れることにより示されるように、90分未満に細胞により分泌される。カリニンの懸濁培養培地中への分泌は10nMコルヒチンにより阻害され、結果として処理細胞内にKC形態の蓄積が起こる。これらの結果はカリニンのKC形態が分泌され細胞溶解の結果として、放出されず、さらにこの分泌がコルヒチンにより阻害されることを示す。したがって、KC形態は培地形態の細胞内前駆体ではない。カリニンの標識KC形態の重要部分は、24時間まで細胞画分から有意に明らかであると思われるが、上述した分泌時間より著しく長い、チェイスの６時間後でさえも付着細胞画分中に存続する（図13A）。逆に言えば、カリニンの培養物一培地形態（KM１およびKM２）は付着もしくは懸濁条件（図13Aおよび13B）または付着細胞を24時間継続して標識した後（図１）のいずれの細胞画分にも蓄積しない。これらの結果の説明の１つは、カリニンのKC形態が培養基盤または細胞成分とのアフィニティにより、分泌後の細胞画分に残ることであり、さらに200kDaサブユニットが165kDaサブユニットに処理される間に、このアフィニティが損失し、これによりKM１が培地中に拡散するのを促進する。これらの観察結果はカリニンが角化細胞の活発な増殖および移動により培養基盤上に広範囲に堆積することを示すここに開示した他の結果に一致する。 165kDaおよび105kDaサブユニットは懸濁または付着角化細胞のいずれの細胞画分にも一貫して存在しない（図13Aおよび13B）。これらの結果は200kDaサブユニットの165kDaサブユニットへの処理さらに155kDaサブユニットの105kDaサブユニットへの処理が細胞外で発生することを示す。懸濁および付着角化細胞の培地中の165kDaサブユニットの出現は90分で起こり、200kDaサブユニットの165kDaサブユニットへの処理が分泌後間もなく始まることを示す。付着細胞の培地中の200k Daサブユニットバンドは、放射能チェイスの６時間後に比較して24時間後に強度が弱くなり165kDaサブユニットは強度を増す。対照的に、105kDaサブユニットは放射能チェイス後にだけ６〜24時間培養培地に出現し、155kDaサブユニットの10 5kDaサブユニットへの細胞外処理が第１処理段階に比べ著しく緩徐に起こることを示す。初代細胞培養からin vitroの現象を処理することにより得た生合成データをさらに確認するために、図14に示すように、皮膚器官培養パルス−チェイス研究を行った。図14は器官培養ウシ皮膚により合成されたカリニンのパルス−チェイス比較示す。器官培養物中のウシ胎児皮膚を10分間（レーン１、２、３、４）または16時間（レーン５）³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システインを含む培地中で放射線で標識し、その後細胞を放射能を有しない培地中で培養した。培養した皮膚のアリコートを標識期間の終わり（レーン１）および放射能チェイス後に除去し、カリニンに対するポリクローナル抗血清で免疫沈降させ、５％アクリルアミドゲルの還元SDS-PAGEにより分離し、さらにフルオログラフィにより可視化した。右端にはMr×10^-3値を示す。器官培養の開始に際し、10分の放射能パルス後、KC形態のカリニンだけを検出した（図14、レーン１〜４）。長期間の放射能チェイスの後、200kDaサブユニットは完全に165kDaに転化すると思われた（レーン５）。155-および140kDaサブユニットは共に72時間のチェイス後に存在した。この期間中、155kDaサブユニットの105kDaへの転化は観察されず、この理由はいずれも処理が起こらず、または組織中のKM２が抽出用に用いられる免疫沈降緩衝液により可溶化しないからである。Ｋ−ラミニン変異体本発明者は上皮基底膜のサブセットが、EHS原型のラミニンに加え、ラミニンの新規な変異体を含むことを見出した。器官培養物中の皮膚および初代培養物中の表皮細胞がこの変異体を産生し、この変異体は「Ｙ」型のロータリシャドウイメージを有する。この変異体はB1鎖、B2鎖、およびラミニンＡ鎖とは免疫学的に異なるが、カリニンの200／165kDaサブセットと免疫学的におよび構造上関連する第３の190kDa鎖よりなる。ここで用いる用語「Ｋ−ラミニン」はこの変異体をいい、以下により詳しく説明する。Ｋ−ラミニン単離用材料角化細胞増殖培地（KGM）を米国、カリフォルニア州、サンジエゴ所在のクロネティックスコーポレーション（Clonetics Corporation）から購入した。ヒドロコルチゾン、コレラトキシン、および組織培養品質の上皮成長因子を米国、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma Chemical Campanyから購入した。マウス EHSラミニン、DME）熱不活性化FBS、ハムズ（Ham's）F-12栄養素混合物、およびペニシリン／ストレプトマイシン100×溶液を米国、ニューヨーク州、グランドアイランド所在のギブコ（Gibco）／BRL社から購入した。ラビット抗マウスIgG 免疫ビーズ、ヤギ抗ラビットIgG免疫ビーズ、および電気泳動用に予め染色した高分子量マーカーを米国、カリフォルニア州、リッチモンド所在のBiorad社から購入した。CNBr活性化セファロースC1-4Bビーズを米国、カリフォルニア州、プレザントヒル所在のPharmacia／LKB社から購入した。V8プロテアーゼを米国、カリフォルニア州、アーヴィン所在のICN／フロー（Flow）社から購入した。35S- システインおよび35S-メチオニンを米国、マサチューセッツ州、デンヴァー所在のアマシャム（Amersham）社から購入した。Ｋ−ラミニン単離抗体のための方法 mAb BM165は前にこの明細書でおよびロウセル（Rousselle）等の、「J．CellB iol．114：567〜576（1991）」で記載した、参考としてここに記載したように、カリニンの165kDa鎖と反応する。カリニンの140kDaサブユニットおよびカリニンに対するラビットポリクローナル抗血清と反応するmAb K140の調製および特異性を以下に示す。mAbs 1F5、11D5〔Engvall等の、「Cell Regul．１：731〜740（1 990）」；4C7、Engvall等の、「J．Cell Biol．103：2457〜2465（1986）」に特異的なラミニンＡ鎖；mAb 2E8、Engvall等の、「J．Cell Biol．103：2457〜246 5（1986）」に特異的なラミニンB2鎖；および抗メロシン（merosin）mAb 5H2、レイボ（Leivo）等の、「Lab．Invest．60：783〜790（1989）」〕をthe La Jol la Cancer Research FoundationのDr．Eva Engvallから入手した。マウスラミニンに対するアフィニティ精製したポリクローナル抗体を米国、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma Chemical Campanyから入手した。モノクローナル抗体を以前説明したように（Keene等の、1991）ハイブリドーマ培地から精製した。この段落に記載の文献はすべてこれらの抗体の調製方法のさらなる開示を提供するために参考として記載した。これらの研究の過程で新たなmAb、545を開発した。mAb 545にとっての抗原は以前記載されているように〔マドックス（Maddox）等の、「J．Biol．Chem．261 ：21381〜21385（1989）」調製したヒト羊膜のPF3画分の還元生成物から得た。簡単には、PF3画分のジスルフィド結合を還元しビニルピリジンでアルキル化した。システイン残基を含むペプチドを室温で0.2M NaClおよび５mM EDTAを含む、 pH7.5の0.5M Tris-HCl緩衝液中、100倍モル過剰量の２−メルカプトエタノールで一昼夜還元した。メルカプトエタノールに対するビニルピリジンの等モル量を添加しさらに室温で90分間インキュベーションした後、ペプチドをゲル濾過により過剰の試薬から分離し、さらに以前記載された〔Sakai等の、「J．CellBiol． 103：1577〜1586（1986）」〕ようにBALB/cマウスの免疫感作用に用いた。mAb 545はラミニンを放射線で標識した角化細胞ならし培地中のタンパク質の複合混合物から特異的に免疫沈殿させることが示された（図示せず）。さらに、この抗体は間接免疫蛍光顕微鏡法によりヒト皮膚断面上のポリクローナル抗ラミニン抗体と同一染色パターンを有することが示された（図示せず）。「K140」mAbsを調製するのに必要な免疫原はヒト羊膜から精製した。コラゲナーゼ抽出ヒト羊膜をBachinger等の、「J．Biol．Chem．265：10095〜10101（199 0）」から採用する方法により処理した。タンパク質は、硫安を終濃度30％（W/V ）まで添加することにより最初の可溶性画分から沈殿させ、さらに４℃で一昼夜インキュベーションした。沈殿物質を遠心分離（17,000×g、60分）して回収し、透析前にクロマトグラフィー緩衝液中に再懸濁させ、これにより試料の全粘度を著しく減少させ、これはおそらく核酸の除去によると考えられる。残留する不溶性物質を超遠心分離（18,000rpm、１時間）Beckman型19ロータにより試料から除去した。得られた免疫原をもちいて２匹のBalb/cマウスに接種した。ハイブリドーマを調製し最初にSakai等の、「J．Cell Biol．103：1577〜1586（1986）」〕に従い間接免疫蛍光顕微鏡法によりスクリーニングした。「K140」と称するハイブリドーマの１種はカリニンの140kDaサブユニットを特異的に認識するmAbを産生した。細胞培養角化細胞を確立された方法〔レインワルド（Rheinwald）およびグリーン（Gre en）の、「Cell ６：331〜334（1975）」；オッキーフ（O'Keefe）等の「J．In vest．Dermatol．90：767〜770（1988）」〕の変更により新生児***から培養した。最初の継代の前に、培養物を0.02％EDTAを含む滅菌PBS中で５分間インキュベーションし、真皮繊維芽細胞および3T3細胞を緩徐にピペットで移して除去し、その後洗浄し0.05％トリプシンおよび0.02％W/VのEDTAで処理して角化細胞を懸濁させた。その後、細胞を0.15mM CaClβ含有KGM中で増殖させ製造者の指示に従い継代培養した。扁平上皮細胞ガン腫細胞系SCC-25（受入れNo．CRL1628の基に米国、メリーランド州、ロックビルのATCCに寄託した）を50％Ham's F-12培地、50％DME培地で、0.5μg／mLのヒドロコルチゾンと、10％FBSを用いた培地中で培養し、通常PBS中の0.05％トリプシン、0.02％EDTAを用いて継代培養した。またカリニンをSCC-25扁平上皮細胞のガン腫細胞（ATCC # CRL1628）から得た。細胞−関連カリニンを100mmの直径のプラスチック製培養ディッシュ上で増殖させたSCC-25細胞の80％集密培養物から得た。細胞層をPBSで洗浄し、次に氷冷溶解緩衝液（10mM Tris-HCI pH7.4、150mM NaCl、2mM EDTA）250μM PMSF、１mM ｎ−エチルマレイミド、0.3％NP-40、0.05％トリトンX100、0.3％デオキシコ
ール酸ナトリウム、0.1％BSA、および0.1％SDS）を用いて抽出した。その後の段階はすべて４℃で行った。細胞およびマトリックスは細胞リフターを用いてディッシュから除去し、次いでDounceホモジナイザを用いて可溶化し25,000×gで30分間遠心分離した。上清をジイソプロピルフルオロリン酸（５μg／mL）で処理し、K140セファロースと混合し、さらにロッキングプラットフォーム上で一昼夜インキュベーションした。マトリックスをクロマトグラフィーカラムに移し、50カラム容量の溶解緩衝液、次に50カラム容量のPBSで洗浄した。その後カラムを1M 酢酸を用いて溶出させた。ピーク画分を280nmのUV吸収により決定し、プールし、水に対して透析し、その後凍結乾燥した。細胞標識 24時間の標識試験のために、分離させた第３回継代角化細胞を２時間完全KGM 中、５×10⁵細胞／cm²の密度で、組織培養プラスチック製ディッシュに付着させた。接着細胞をメチオニンおよびシステイン不完全KGMで簡単に洗浄した。標識は35S-メチオニンおよび35S-システインのそれぞれが50μCi／mL含まれる不完全 KGM中で24時間標準培養条件下に行った。器官培養試験では、ウシ胎児皮膚を子宮から排出されて４時間内に10インチ（頭部から臀部までの長さ）の子ウシから取り出した。皮膚を１mm×１mm断面に切断しヒドロコルチゾン（0.5μg／mL）コレラトキシン（10ng／mL）、上皮細胞成長因子（10ng／mL）、ペニシリン（100単位／mL）、ストレプトマイシン（100μ g／mL）ウシ胎児血清２％、35S-メチオニン（50μCi／mL）、および35S-システイン（50μCi／mL）を含むメチオニンおよびシステイン不完全DME中で24時間懸濁させて培養した。その後、組織を洗浄し、上記因子および10％FBSを含む放射能を含まない完全なDME中で72時間インキュベーションした。組織のアリコートを24時間の標識期間の後、さらに72時間の放射能を含まないチェイス期間後に再び、除去して細胞試料のために以下に説明したような免疫沈降用に処理した。分析すべきそれぞれの試料のために、10μgタンパク質Ｇ精製モノクローナル抗体を100μLラビット抗マウスIgG免疫ビーズに添加するかあるいは10μLポリクローナルラビット抗血清を400μLの「二次抗体」ヤギ抗ラビットIgG免疫ビーズに添加した。ポリクローナル制御条件のために、10μL正常ラビット血清を用いた。モノクローナル制御条件のために一次抗体を用いなかった。混合物を37℃で２時間軽くかき混ぜながらインキュベーションした。抗体−免疫ビーズ複合体を 2,500rpmの遠心分離により小さく丸め、放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（10mM Tris-HCI p1I7.4、150mM NaCl、２mM EDTA、250μM PMSF、１mMｎ−エチルマレイミド、２mM 1-メチオニン、２mM 1-システイン、0.3％NP-40、0.05％トリトンX-100、0.3％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％BSA）を用いて１回洗浄し、さらに標識した試料を用いて使用する前に再び小さく丸めた。細胞層を放射能を含まない培養培地で１回洗浄し次に細胞スクレイパーおよび 0.1％SDSを含む氷冷RIPA緩衝液を用いて収集した。その後の段階はすべて４℃で行った。標識した細胞物質をDounceホモジナイザで可溶化し14,000rpmで10分間回転させた。標識した培地を培養物から除去し2,000rpmで遠心分離した。各試料は標識細胞のアリコートまたは培地上清を、免疫性のない10μLのラビット血清と予め混合した400μLのヤギ抗ラビットIgG免疫ビーズ、もしくは100μLラビット抗マウスIgG免疫ビーズのいずれかの遠心分離ぺレットに添加することにより予め浄化した。各試料を一時的に渦巻き混合し、その後１時間ロッキングプラットフォーム上に放置した。次に混合物を14,000rpmで10分間遠心分離し、さらに特異的抗体と予め混合した免疫ビーズの遠心分離したペレットと上清を混合した。各試料を一時的に渦巻き混合し、その後18時間ロッキングプラットフォーム上で特異的抗体と一緒にインキュベーションし、その後2,500rpmで10分間遠心分離して小さく丸めた。遠心分離後、上清を除去しペレットをRIPA緩衝液（培地試料）または0.1％SDSを含むRIPA緩衝液（細胞）で洗浄し、一時的に渦巻き混合し、その後再び遠心分離した。５回の洗浄後、ペレットを試料緩衝液と混合し、95℃に３分間加熱し、再び遠心分離し、さらに上清をSDS-PAGEにより分析した。１つの試験では、mAb BM165を用いて免疫沈降させる前にmAb K140セファロースカラムに対し通過させることによりカリニンを予め浄化した標識角化細胞培地から除去した。ラミニン変異体の免疫アフィニティ精製最初のもしくは第２回の３か月の羊水穿刺または扁平上皮細胞ガン腫細胞ならし培地をそれぞれ1,000rpmで遠心分離して細胞残骸物を除去した。上清を250μm PMSF、１mM ｎ−エチルマレイミド、２mM EDTA、および0.02％アジ化ナトリウムに導入し、その後18,000rpmで90分間遠心分離した。次に上清をmAb BM165セファロース〔Rousselle等の、「J．Cell Biol．114：567〜576（1991）」〕、またはmAb 2E8セファロースカラム（１mLのマトリックスに対して１mgの抗体を、製造者である、米国カリフォルニア州プレザントヒル所在の、Pharmacia社の指示によりCL4Bセファロースに結合させた）に対して通過させ、50カラム容量のPBS で洗浄し、次に１M酢酸で溶出した。ピーク画分をW 280吸光度およびウエスタンブロッティングにより測定しジイソプロピルフルオロリン酸（５μg／mL）で処理し、さらに水に対して透析した。ロータリシャドウイング分析にための試料を 0.2M重炭酸アンモニウムに対して透析しセントリコン30（centricon-30）マイクロコンセントレータ（アミコン社、米国、マサチューセッツ州、デンバー所在）上で５倍に濃縮した。他の方法次の方法を以前記載されているように実施した：SDS-PAGE電気泳動〔ラエムリ（Laelnmli）「Nature 277：680〜685（1980）」〕、免疫ブロット分析とタンパク質のニトロセルロースへの電気泳動トランスファ〔ルンストラム（Lunstrum）等の、「J．Biol．Chem．261：9042〜9048（1986）」〕、電子顕微鏡法によるロータリシャドウイメージの可視化〔モリス（Morris）等の、「J．Biol．Chem．2 61：5638〜5644（1986）」〕、ヒト組織の凍結断面の間接免疫蛍光顕微鏡法〔Sa kai等の、「J．Cell Biol．103：1577〜1586（1986）」〕、放射能を有するタンパク質を含むアクリルアミドゲルのフルオログラフィ〔ボンナ（Bonner）およびラスキ（Laskey）の「Eur．J．Biochem．46：83〜88（1974）」〕、および削り取ったゲルバンドのV8プロテアーゼ消化〔クリブランド（Cleveland）等の、「J．Bi ol．Chem．252：1102〜1106（1977）」〕。Ｋ−ラミニンの特徴付け 24時間の放射能標識期間から誘導したヒト角化細胞ならし培地を図15に示すように次の抗体を用いて免疫沈降させた：レーン１、ポリクローナル抗ラミニン；レーン２、2E8（モノクローナル抗ラミニンB2鎖）：レーン３、1F5（モノクローナル抗ラミニンＡ鎖）；レーン４、4C7（モノクローナル抗ラミニンＡ鎖）；レーン５、11D5（モノクローナル抗ラミニンＡ鎖）；レーン６、BM165（モノクローナル抗カリニン200/165 kDa鎖）；レーン７、mAb140によりカリニンを取り除いた培地のBM165免疫沈降物（モノクローナル抗カリニン140kDa鎖）；レーン８、対照（一次抗体でない）；レーン９および10、連続して免疫沈降させた培地、最初に4C7モノクローナル抗ラミニンＡ鎖（レーン９）で次にポリクローナル抗ラミニン（レーン10）。試料を３〜５％アクリルアミドゲルのSDS-PAGEにより分析しオートラジオグラフィにより可視化した。図15は、Ｌ＝ラミニン、Ｖ＝変異体、Ｋ＝カリニンを示し、右端にはMr×10^-3値を示す。ポリクローナル抗EHSラミニンは、ジスルフィド結合の還元前に、２種の電気泳動種を特異的に沈殿させる（図15、レーン１）。一次抗体を含まない同一の培地からはバンドが沈殿しない（レーン８）。同一の２種の電気泳動種はモノクローナル抗ラミニンB2鎖抗体2E8により沈殿した（レーン２）。対照的に、モノクローナル抗ラミニンＡ鎖抗体1F5、4C7および11D5は、一層遅い電気泳動種だけを沈殿させる（それぞれ、レーン３、４および５）。mAb BM165はカリニンと一層速く移動する種を共沈殿させる（レーン６）。mAb K140はカリニンを沈殿させるが標識角化細胞培地からのラミニン変異体を沈殿させない（図示せず）。カリニンは標識培地から過剰量のK140を用いて取り除かれ、BM165だけが一層速く移動するラミニン変異体を沈殿させる（レーン７）。免疫学的試薬の確認された特異性が与えられ、その結果はヒト角化細胞が少なくともB2鎖を含むが、正常なＡ鎖を含まない一層小さい分子量のラミニン変異体を分泌することを示す。またこれらの結果はmAb BM165が一層速く移動するラミニン種と交差反応し、このラミニン種に含まれる変異体鎖がラミニンＡ鎖よりカリニン200/165 kDa鎖に免疫学的に一層密接に関連することを示唆する。角化細胞培地からのいずれの種も沈殿させない（図示せず）抗メロシンmAb 5H2はヒト皮膚の真皮−表皮基底膜からのメロシンの欠落に一致する。一層速い電気泳動種のラミニン変異体としての同一性をさらに確認するために、放射線標識角化細胞培地は抗ラミニンＡ鎖抗体を用いて正常ラミニンが予め取り除かれ次いでポリクローナル抗ラミニン血清を用いて再沈殿させた。抗Ａ鎖抗体はラミニンだけを除去し、ポリクローナル血清に少量の通常のラミニンを加えたものを用いて特異的に除去される変異体を残す（レーン９、10）。ラミニン角化細胞と培地画分との比較を図16に示す。24時間の代謝にかかる標識期間後、角化細胞ならし培地（レーン１、３）および角化細胞細胞画分（レーン２、４）をそれぞれポリクローナル抗ラミニンで免疫沈降させた。次に沈殿物質を３〜５％勾配ゲルの非還元SDS-PAGEにより分離し（レーン１、２）５％アクリルアミドゲルの還元SDS-PAGEにより分離した（レーン３、４）。変異体（Ｖ、レーン１）およびラミニン（Ｌ、レーン１）を含む非還元ゲルバンドを乾燥ゲルから削り取り、２％の２−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液を用いて再び水和させ、さらに５％アクリルアミドゲル上の２次元SDS-PAGEにより分離した。変異体バンドはレーン５でありラミニンバンドはレーン６である。すべての試料をフルオログラフィにより可視化した。非還元SDS-PAGEにより角化細胞培地画分からの抗ラミニン免疫沈降生成物（図 19、レーン１）を角化細胞の細胞画分のもの（レーン２）と比較する場合、24時間の標識期間後に、培地画分のラミニンの量より、ラミニンの量の多い画分（図 16、Ｌ）が細胞画分中に存在すると考えられる。また細胞画分には一組の220〜210kDaバンドに還元される（図示せず）強力な4 00kDaバンド（図16、ｄ）が含まれる。したがって、この400kDaバンドはB1−B2 鎖二量体であると説明が付き、この存在は以前から提唱されていた〔コーパー(C ooper)等の、「Eur．J．Biochem．119：189〜197（1981）」；モリタ(Morit a)等の、「Biochem．J．229：259〜264（1985）」；ピータース(Peters)等の、「J．Biol．Chem．260：14732〜14742（1985）」〕。ラミニンＡ鎖は400 kDaバンドの二次元分析には検出されなかった（図示せず）。培地誘導免疫沈降物の還元（レーン１）はラミニンB1およびB2鎖の位置および190kDa位置（レーン３）に優勢なバンドを明瞭に示す。劣勢量のラミニンの存在に一致して、少量のラミニンＡ鎖だけが見出される。対照的に、細胞誘導物質の還元（レーン４）は未還元ゲルパターンにより示されるラミニンとその変異体のほぼ等量の混合物から予測される量のＡ、B1、B2および190kDa鎖を示す（レーン２）。非還元変異体ゲルバンド（図16、レーン１バンドＶ）を削り取りジスルフィド結合を還元してSDS-PAGEにより分析する場合（図 16、レーン５）、Ｂ鎖および別の190kDaバンドを含む広いバンドが存在する。あるいはまた、非還元ラミニンゲルバンドを同様に処理する場合、400kDa Ａ鎖が観察され190kDaバンドは観察されなかった（レーン６）。図６に示す結果と一緒に、これらのデータは変異体が、B1およびB2鎖のそれぞれと電気泳動的に同一の鎖を含み、さらに抗体のそれぞれがＡ鎖内の種々のエピトープに向けられた３種のモノクローナル抗体と免疫反応しないが、カリニンの200／165kDaサブユニットに対して向けられたモノクローナル抗体と反応する190kDaの第３鎖を含むことを示す。皮膚器官培養中のラミニン生合成をウシ胎児皮膚を24時間の代謝標識のために培養物中に懸濁することにより研究した。分析は直ちに（図17、レーン１）または非放射能性培地中で追加の72時間培養した後（レーン２）に行った。試料をポリクローナル抗ラミニン抗体で免疫沈降させ、３〜５％アクリルアミドゲルの非還元SDS-PAGEにより分離し、その後オートラジオグラフィにより可視化した。図 17では、Ｌ＝ラミニン、Ｖ＝変異体、およびｄ＝二量体である。ウシ胎児皮膚を用いたこれらの器官培養研究は24時間の標識期間後、ポリクローナルラミニン抗血清で培養皮膚から免疫沈降させた物質の非還元パターン（図 17、レーン１）が24時間標識した角化細胞細胞画分から得たもの（図16、レーン２）と類似することを示す。この知見は種々の種の産生が初代細胞培養の人工産物でなく皮膚器官培養物にも産生されることを示す。標識した皮膚を付加的な72 時間に放射能を含まない培地で培養する場合、ラミニンおよび変異体種の強度は減少するが予測されるB1−B2二量体の強度に有意な損失がない（図３、レーン２）。変異体およびラミニンを示すバンドの強度は減少し、この現象はアッセイ方法に対してこれらの物質の不溶性が反転するかまたは増加することを示す、１つの形態が他のものに処理されている証拠はない。非放射能チェイスの期間後のB1 −B2二量体バンドの保存された強度は二量体が不十分にジスルフィド結合したラミニンを示すだけではなく、ラミニンのアセンブリにまたは若干の他の目的に将来使用するためにとっておくことができる安定な存在物を示す場合がある。ラミニンおよびＫ−ラミニンの免疫化学的比較を行い、結果を図19に示す。非還元分析結果を図18Aに示し、さらに図18Bに還元分析結果を示す。非還元分析に関し、ヒト羊水および扁平上皮細胞ガン腫(SCC)ならし培地を2E8セファロース（モノクローナル抗ラミニンB2鎖）、またはBM165セファロース（モノクローナル抗カリニン）を用いてアフィニティクロマトグラフィーのために用いた。レーン１および４をwE8精製SCCならし培地のために；レーン２は2E8精製ヒト羊水；レーン３はBM165精製ヒト羊水；レーン５はBM165精製SCCならし培地；レーン６はE HS腫瘍からのラミニンである。試料を３〜５％のアクリルアミド勾配ゲル上の非還元SDS-PAGEにより分離しクーマシーブルー染色（レーン１）またはポリクローナル抗ラミニン抗体を用いたウエスタンブロッティング（レーン２、３、４、５および６）により可視化した。ラミニンおよびその変異体の還元分析結果を図18Bに示す。図18Aに示すSCCならし培地から誘導した非還元変異体バンド（レーン１、Ｖ）をゲルから削り取り還元条件下に二次元SDS-PAGEにより分離しクーマシーブルー染色により可視化した（レーン１）。SCCならし培地（レーン２／３）およびEHSラミニン（レーン４）のBM165セファロース精製によるピーク画分を５％のアクリルアミドゲル上のS DS-PAGEにより還元条件下に分離しニトロセルロースに移した。SCC誘導物質を含むレーン（レーン２／３）を半分に分け、半分の一方をmAb 545とインキュベーションした（レーン２）。他の半分（レーン３）とレーン４をポリクローナル抗ラミニン抗体とインキュベーションした。ヒト扁平上皮細胞ガン腫培養物からのならし培地、およびヒト羊水はいずれも生化学的量のラミニンおよび変異体を免疫アフィニティ精製するのに有用であることが見出された。ならし扁平上皮ガン腫細胞培地を2E8セファロースを用いて精製する場合、ピーク溶出画分を非還元SDS-PAGEにより分離し、２種の高分子量ラミニン種、ならびに150kDaバンドをクーマシーブルーにより染色した（図18A ）レーン１）。150kDaバンドは二次元還元SDS-PAGEで低分子量バンドを得られないので（図示せず）、このバンドはニドーゲンを示すと考えられる。一層速い移動度の変異体種を示すこのバンドを削り取り、二次元還元SDS-PAGEにより分離し、さらにクーマシーブルーにより染色した場合、広い220〜210kDaバンドならびに異なる190kDaバンドを可視化した（図18B、レーン１）。結果は図16の放射線標識物質で得られる結果に類似した。したがって、クーマシーブルー染色は化学量論的に、一層速い移動度の変異体種のB1、B2および190kDa鎖が等量づつ存在することを明らかにした。 2E8セファロース（レーン１、３および５）ならびにBM165セファロース（レーン２および４）で精製したならし扁平上皮ガン腫細胞培地および羊水からのピーク画分の非還元ウエスタンブロッティング分析（図18A）は一次抗体として用いるポリクローナルラミニン抗血清を用いて行った。羊水（レーン２および３）ならびに扁平上皮ガン腫細胞培地（レーン１、４および５）は抗ラミニンB2鎖カラムによる精製が２種の非還元種を産生し抗カリニンカラムによる精製が単一の非還元種だけを産生する本質的に同一の結果を生じる。一層大きい分子量の非還元種（レーン１、２および４）はEHS腫瘍から精製したラミニンと一緒に移動する（レーン６）。図15に示す放射能を有する角化細胞培地で得られる結果に似て、一層低分子量の非還元ラミニン変異体種がBM165セファロースによりアフィニティ精製された唯一の形態である。変異体とカリニンをBM165アフィニティクロマトグラフィーにより扁平上皮ガン腫細胞培養培地から精製した。ジスルフィド結合還元カリニンおよび変異体鎖をワイドコームを用いるSDS-PAGEにより分離し、さらにニトロセルロースに移した。次にニトロセルロースを電気泳動のレーンの中央から切断し、半分の一方（図18B、レーン２）はラミニンB1鎖に特異的なモノクローナル抗体545を用いてウエスタンブロッティングした。レーン（レーン３）の他の半分およびEHSラミニン鎖を含む第２レーン（レーン４）をポリクローナル抗ラミニンを用いてブロッティングした。抗B1抗体だけがＢ鎖を含む広いバンドの上半分にだけブロッティングするが、B1およびB2鎖が共にポリクローナル血清により認識される。この結果、変異体が抗B2モノクローナル抗体により免疫沈降する観察結果（図15、レーン２）と一緒に、変異体が真正のB1およびB2鎖を含むことを示す。190kDa鎖の位置に反応を示さず、さらにこの鎖の他のEHSラミニンサブユニットらの免疫学的差異を変更する。図18A、レーン１に示すように扁平上皮細胞ガン腫ならし培地からの抗B2鎖アフィニティ精製変異体およびラミニンをロータリシャドウイメージングにより可視化した。プールしたピーク溶出画分をクーマシー染色により分析し図18A（レーン１および４）に示すウエスタンブロットをイメージ化した。ラミニンに極めて類似した十字形分子は容易に確認された（図19A）。さらに、図19Bに示す分子がよく見出された。これらのものは寸法およびコンフォメーションで１本の長腕 50と大きな球状領域52をその遠位末端に有し、さらに２本の短腕54、56とその遠位末端にそれぞれ２個の球状領域を有する、通常の十字型ラミニン分子に類似する「Ｙ」型分子として現れる。変異体として示す「Ｙ」型分子は、第３の短腕を有さないが、２本の短腕54、56と長腕50の共通部分に小さな球状領域58が存在する若干のイメージを示し、ラミニンの十字形とは異なる。 400kDa A鎖と190kDa変異体鎖との間の分子量の相違は従ってラミニン十字形の第３短腕に含まれる必要がある。Ａ鎖の190kDa置換基はＡ鎖によりラミニンに与えられる構造に類似した長腕の遠位末端に大きな球状体を与える。この球状体が変異体において無傷であると考えられ抗体4C7がラミニン上のこの球状体を特異的に認識するという事実〔Engvall等の、「J．Cell Biol．103：2457〜2465（19 86）」〕はさらにこの鎖がＡ鎖の真の置換基であり、分解生成物でない証拠である。ラミニン変異体（Ｋ−ラミニン）およびラミニンの免疫学的ならびに構造上の分析を行った。図20Aはラミニンおよびその変異体の比較免疫ブロッティングにより得た。SCCならし培地の2E8セファロース（抗ラミニンB2鎖）精製から誘導したラミニンおよび変異体を非還元下（上半分）または還元条件下（下半分）に３〜５％アクリルアミドゲル上で分離しニトロセルロースに電気泳動的に移した。非還元おび還元試料のいずれのレーンをも含むニトロセルロースを半分に切断した。次にウエスタンブロッティング分析をポリクローナルラミニン抗血清（左半分）およびポリクローナルカリニン抗血清（右半分）を用いて実施した。ポリクローナル抗体はラビットの400kDa非還元カリニンゲルバンドに生じた〔 Rousselle等の、「J．Cell Biol．114：567〜576（1991）」参照〕。この抗体はジスルフィド結合還元後のウエスタンブロッティングによりすべてのカリニン鎖を認識した。ラミニンおよび変異体を2E8セファロース（抗B2鎖）アフィニティクロマトグラフィーを用いて扁平上皮ガン腫細胞培地から精製し、生成物をジスルフィド結合還元前後のSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより評価した。ニトロセルロースを２つのレーンの中央で切断し、さらに各レーンの半分の１つをポリクローナル抗ラミニンとインキュベーションし、さらに他の半分をポリクローナル抗カリニンとインキュベーションした（図2OA）。抗ラミニン血清は還元前にラミニンおよび変異体を共に認識するが、抗カリニン血清は変異体だけを認識する。抗カリニン血清とラミニンとの反応性の欠如は変異体との交差反応性が190kDa 鎖により起こるに相違ないことを示す。この交差反応性がジスルフィド結合の還元により消失し、さらにポリクローナル抗カリニン血清は190kDa鎖と反応しない。免疫学的交差反応性はこれらの鎖がコンフォメーション上のエピトープを共有するが特異的なエピトープを配列しないことを示唆する。変異体とポリクローナル抗カリニン血清との反応性は190kDa変異体鎖が200kDaカリニン鎖に存在するエピトープを含むが、ラミニンＡ鎖には含まれず、変異体鎖がＡ鎖の分解生成物でないという結論を支持することを示す。ポリアクリルアミドゲルから削り取った、それぞれの190kDa変異体鎖（Ｖ）、および200kDaカリニン鎖（Ｋ）のV8プロテアーゼ消化物から生じたペプチドの比較（図20B）は、ほぼ同一の電気泳動移動度を示した。これらのゲルはゲルから放射線で標識した角化細胞培地のポリクローナル抗ラミニン免疫沈降物から誘導した変異体の190kDaサブユニット（レーンＶ）、およびカリニンの200kD aサブユニット（レーンＫ）を含むバンドを削り取ることにより作製した。バンドをV8プロテアーゼを用い（２μg／ml、30分間、室温で）て部分的に消化しさらに消化生成物をSDS-PAGEの10％アクリルアミドゲルにより分離した。これらのデータはこれらの鎖が極めて類似しているが同一でないことを示す。ポリクローナル抗カリニン抗血清は変異体と交差反応するため、この反応の分布を皮膚および腕に似た神経叢（plexus nerve）で試験した（図22）。20週のヒト胎児から（Ａ、ＣおよびＥ）またはヒト新生児***（Ｂ、ＤおよびＦ）からの凍結した腕に似た神経叢の厚さ８μmの切片を間接免疫蛍光顕微鏡法により分析した。ＡおよびＢはポリクローナル抗ラミニンを用いて；ＣおよびＤはポリクローナル抗カリニンを用いて；ＥはMab 5H2抗メロシンを用いて；さらにＦはポリクローナル抗カリニンを用いて、前免疫血清で分析した。目盛りバーは160μmである。カリニンについてmAb BM165を用いて得られた結果と類似して、反応性は皮膚の真皮−表皮結合の基底膜領域に制限され（図21D）、さらに腕に似た神経叢中の前免疫血清対照については反応が見られなかった（図21C、16F）。ポリクローナル抗ラミニン血清の反応性に関しては、前記血清は神経および皮膚のすべての基底膜と反応する（図21A，16B）。また神経はB2鎖特異抗体（図示せず）および抗メロシンで（図21E）強く染色された。この結果は変異体が皮膚の真皮−表皮結合の範囲を超えて分布せず末梢神経には存在しないことを示す。カリニン、ラミニン、および変異体の分布を種々の他のヒト組織で同様に分析し、その結果を表２に示す。ポリクローナルラミニン抗血清により特異的に認識されるラミニンは骨格筋、血管内皮、および図22で見られるように、末梢神経の基底膜で明瞭に反応する。カリニンまたは変異体はいずれもmAb K140またはカリニンおよび変異体の双方を認識するポリクローナルカリニン抗血清との免疫反応性を欠くことから証明されたこれらの区域には存在しない。気管、大腸および小腸、羊膜、肺、および皮膚で、ポリクローナルラミニン抗血清は構造を含むすべての基底膜と反応したが、 mAb K140およびポリクローナルカリニン抗血清は上皮−間充織界面でだけ反応した。これらの結果は、試験した組織で、変異体がすべてのラミニン分布の異なるサブセットを示し、さらに変異体の分布がカリニンの分布を超えて広がるとは思われないことを示す。要約すると、Ｋ−ラミニンはその分布が皮膚の真皮−表皮結合の基底膜領域に制限され、さらに末梢神経、骨格筋、および血管の非上皮基底膜に存在しないラミニンの変異体である。この分子はヒトおよびウシ角化細胞により、および扁平上皮細胞ガン腫系により合成される。またこの分子は羊水に存在し、上皮特異的分子カリニンも同様に存在している（図示せず）。この変異体はＡ鎖に対して置換された190kDa鎖を有し、これは約240kDaだけＡ鎖より短く、さらにラミニンＡ鎖と免疫学的に無関係である。対照的に、変異体190kDa鎖はカリニンの200／165 kDa鎖と構造上および免疫学上の類似性を示す。変異体のロータリシャドウイメージングによる可視化はＡ鎖によりラミニンに通常与えられる短腕がこの分子には欠けていることを示す。しかし、置換した190kDa鎖はＡ鎖により通常のラミニンに与えられる領域に極めて類似すると思われる長腕の末端に大きな球状体を与える。この大きな球状体の存在はロータリシャドウイメージがB1−B2鎖二量体を示さなくし、これらの二量体のいずれも細胞培地調製物中に検出されなかったという観察結果に一致する。「Ｙ」型ラミニン変異体はラット神経髄腫細胞の生成物として既に報告されている。この神経髄腫の分子はラミニンＡ鎖を欠いており代わりに他の130および3 5kDaペプチドを含む〔デービス（Davis）等の、「J．Neurosci．５：2662〜2671 （1985）」参照〕。したがって神経髄腫ラミニン変異体は構造上、および分子の生物学的分布において、Ｋ−ラミニンと異なる。Ｋ−ラミニンは末梢神経組織中には見出されない。ポリクローナル抗カリニンは皮膚細胞誘導変異体と交差反応するが、末梢神経組織とは反応しない。末梢神経組織との交差反応に関するポリクローナル抗カリニンのこの欠陥はＫ−ラミニンおよび神経髄腫変異体が免疫学的に異なることを示す。皮膚変異体は神経髄腫産生変異体に関連しない。またラット星状細胞はＡ鎖を欠いているラミニン変異体を合成するが星状細胞変異体に置換鎖は観察されなかった〔リエシ（Liesi）およびリステリ（Risteli ）の、「Exp．Neurol．105：86〜92（1989）」参照〕。3T3-L1含脂肪細胞は200k Da鎖でＡ鎖を置換した分子を産生したが〔アラタニ（Aratani）およびキチガワ（Kitigawa）の、「J．Biol．Chem．263：16163〜16169（1988）」参照〕、Ｋ− ラミニンが含脂肪細胞に存在するとは思われない。Ａ鎖を置換したラミニン変異体にはメロシン〔エーリヒ（Ehrig）等の、「Proc．Natl．Acad．Sci．83：3264 〜3268（1990）」〕およびマウス心臓ラミニン〔パウルソン（Paulsson）およびサラジン（Saladin）の、「J．Biol．Chem．264：18726〜18732（1989）」参照〕が含まれるが、これらの分子の双方は３本のEHSラミニン短腕の暗示を残す。悪性および非悪性角化細胞により合成されるラミニンの以前の評価はラミニンと他の糖タンパク質との関連を示した〔フレネッテ（Frenette）等の、「Cancer Resarch 48：5193〜5202（1988）」参照〕。データはラミニン、角化細胞変異体、およびカリニンの抗ラミニン血清による共沈殿を支持する。以下に示すように、ラミニンはカリニン糖タンパク質と共有結合する。ウッドレイ（Woodley）「J．Cell．Physiol．136：140〜146（1988）」参照〕はEHSラミニンは角化細胞の移動を阻害することが報告されている。このラミニンの阻害活性はＡ鎖のフラグメント中に存すると考えられる。変異体においてＡ鎖が存在しないことにより、ラミニンと対照的に、細胞移動を促進すると考えられる。したがって、Ｋ−ラミニン接着分子は移植角化細胞とその下に存在する真皮との間に外から供給して角化細胞の移動を阻害することなく角化細胞の接着を改善することができる。カリニンとＫ−ラミニンの共有結合カリニンをヒト羊膜から直接に単離する場合、カリニン鎖およびラミニン変異体鎖が複合して希釈したポリアクリルアミドゲルにだけ入るジスルフィド結合した集合体になることが一貫して見出される。この共有結合を示すために、ヒト羊膜をBachinger等の「J．Biol．Chem．256 ：10095〜10101（1990）」に既に記載されているように細菌性のコラゲナーゼを用いて、出願人が組み入れた米国特許出願第07/936,850号で変更したようにして、抽出した。まず、タンパク質は硫安を終濃度30％(W/V)まで添加することにより最初の可溶性画分から沈殿し４℃で一昼夜インキュベーションした。沈殿した物質を遠心分離（17,000×gで60分間）して回収し透析する前に、クロマトグラフィー緩衝液に再懸濁した。タイプVIII特異的mAbカラム上のアフィニティクロマトグラフィーの直前に、不溶性物質を超遠心分離、18,000 rpmで１時間タイプ 19ローター(Beckman Instruments)により試料から除去した。次にこの段階からの未結合画分をK140セファロースカラムにかけ、洗浄し、溶出させ、さらにピーク画分を得た。ピーク画分をジイソプロピルフルオロリン酸（５μg／ml）で処理し、水に対して透析し、さらに用いるまで−70℃で保存した。したがって、カリニンを可溶性画分からカリニンに対して向けられたモノクローナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。この精製した物質の電気泳動分析結果を図22に示す。カリニン（165k、145k、140kおよび105kDaのバンド）とＫ−ラミニン（B1、B2および190K）の両サブユニットを確認した。最初にmAb BM165を、これはカリニンの165Kサブユニットを認識しＫ−ラミニンの190Kサブユニットと交差反応することが示されるが、この精製において用いた。BM165のこの交差反応性はこれらの調製物中にカリニンおよびＫ−ラミニンが存在することを示す。しかし、同一の結果をmAb K140を用いて得、このmAbはカリニンの140 Kサブユニットを認識しＫ−ラミニンと交差反応しない。カリニンとＫ−ラミニンの安定な結合はmAbがカリニンとだけ反応するとしても調製物中のカリニンおよびＫ−ラミニンサブユニットの存在を説明する。このアフィニティ精製した物質のイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる分析結果を図23Aに示す。この物質は本質的に２つのピークに分画することができる。分離した物質の非還元条件下の電気泳動分析は第１ピークが角化細胞培養培地に存在するカリニンに相当する物質を含むことを示す。第２ピーク中の物質はほとんどゲルに入らない極めて高分子量の複合体である。還元後のピーク２中の物質の電気泳動分析は図22に見られる７種のバンドと同一のパターンを示した。これらの物質のカリニンおよびラミニンに対するポリクローナル抗体を用いる免疫化学的分析結果を図25に示す。指示画分からの試料を還元および非還元電気泳動により分離しさらにポリクローナル抗カリニンおよびポリクローナル抗ラミニンを用いてウエスタンブロッティング分析した。ピーク１に示す物質がカリニンとして確認されただけでラミニンＢ鎖は見出されなかった（図24Aおよび24C）。２−メルカプトエタノールで還元した後、カリニンならびにラミニンB1および B2鎖をピーク２の物質中に確認した（図24Cおよび24D）。これらの結果はカリニンおよびＫ−ラミニンを共に含む高分子量複合体の同定結果に一致する。さらにカリニンおよびＫ−ラミニンのコンフォメーションをロータリシャドウイメージ分析により得た。図23Aのピーク２からの物質のイメージを図25に示す。代表的アセンブリは２本の短腕70、72および２本の長腕74、76を有することを特徴とする。長腕74、76の長さは図26に示すビモーダル分布を示す。第１長腕の 81nmの長さは以前決定したＫ−ラミニンの長腕の長さと一致ずるが、他の長腕の 103の長さはカリニン分子の長腕に一致する。考え合わせると、上述したこのことおよびその結果はカリニンおよびＫ−ラミニンが組織中に配置され共有結合することを示す。培養表皮性ケラチン細胞の移植角化細胞を移植する方法は既に文献に記載されており、これらの方法のいずれも本発明の変更に適している。かかる移植を通常どのように行うかは当業者の知識の範囲内である。しかし、例示として、適切な移植方法の種々の例を開示する。例１角化細胞移植の１つの方法はO'Connor等の「The Lancet １：75〜78（1981）」により開示されている。患者から２個の２cm²皮膚試料を局所麻酔下に除去した。この組織を培地中に配置し培養および移植片調製のための実験室に移した。その後できるだけ多くの皮下組織および真皮をその組織から除去し、次に組織を切り刻みトリプシン処理した。細胞を種々の密度で接種した（４×10⁵個の致死照射した3T3細胞を含む50mm直径のディッシュに対し10⁴〜10⁶個）。これらの培養物に、20％ウシ胎児血清、0.4μg／mLのヒドロコルチゾル、および0.1ナノモル／Lのコレラゲンを補強した強化イーグル培地を供給した。これらの培養物を3 0℃で10％CO₂雰囲気下にインキュベーションした。３日後、上皮成長因子（EGF 1Ong/mL）を培地に添加した。培養物が集密になるか（14〜21日）または継代培養するまで週２回培地交換した。若干の亜集密(subconfluent)培養物を生存能力を有するように凍結しその後継代培養した。この方法で、その後移植片として用いるために二次および三次継代培養物を調製することができた。集密上皮細胞を、酵素ディスパーゼを用いて培養ディッシュの表面から集密状態のまま分離した。分離後、各弾性上皮は２〜2.5cmまで収縮した。次いで各上皮を無血清培地で洗浄し２cm直径の円形に切断した２層の滅菌ワセリンガーゼ上に基底側を上にして配置した。十分な無血清培地を添加し露出した基底面を覆った。その後移植片を含む種々のディッシュをガラス製広口ビン内に配置し；広口ビン内の雰囲気を10％CO₂で満たし密封した広口ビンをベッドのそばに運んだ。ワセリンガーゼの覆いを含む上皮移植片を準備した創傷部位で基底細胞層が創傷面に対して向くように配置した。縫合は不要であった。その理由は移植片が単層の非浸透微細メッシュガーゼにより所定位置に保持され、この単層が毎日取り替えられる粗大メッシュガーゼの緩い層により覆われているからである。この微細メッシュガーゼとワセリンガーゼは６〜10日間で除去し、この領域をワセリンガーゼの単層と粗大ガーゼの緩い層で再び手当てした。これらの手当てを移植時から３〜４週間毎日交換した。その後、移植片を大気に曝したが、ラノリン軟膏の薄い層で毎日１回処置した。上述の上皮移植片を３種の異なる型の「受容者の支持組織(recipient beds)」（創傷面）：初期肉芽組織（７日経過未満）、慢性肉芽組織、および筋膜まで削り取られた新しい領域上に配置した。本発明に従い、集密上皮がその下の組織に接着するのを、外因性カリニンをの薄い膜を角化細胞培養物の基底面上または移植片が配置された組織の露出面の上皮上に広げることにより改善することができる。かかる外因性カリニンは優れた接着をもたらす。その理由は(a)細胞培養物中の集密角化細胞がカリニン産生を停止するかまたは有意に減少させた；(b)培養細胞の基底面上に最初に存在するカリニンをディスパーゼ処理により分解した；さらに(c)カリニンが真皮−表皮結合の安定化に必要になるからである。あるいはまた、外因性カリニンまたは共有結合カリニン／Ｋ−ラミニンを培養角化細胞と上皮の間に適用する。好ましくは、カリニン、またはＫ−ラミニン、または共有結合体を、生理学的量のCa⁺⁺およびMg⁺⁺（例えば、0.7〜1.1ミリモル／LのMg⁺⁺および１〜３ミリモル／LのCa⁺⁺）を含むPBSのような医薬として許容できる担体に適用する。接着タンパク質はCa⁺⁺およびMg⁺⁺を含むPBS中に懸濁させることができ、その後局所適用のためにゼラチンまたはプロピレングリコール基剤に導入することができる。例２また、自家移植の培養ヒト上皮を移植する方法がガリコ(Gallico)等の、「New Eng．J．Med．311：448〜451（1984）」に開示されている。患者は２名の子供で、その体の95％より多くの部分に火傷を受けていたが、その体表面は半分以上を培養上皮自己移植でうまく被覆していた。承諾のもとに、皮膚の２cm²全厚生検試料を各患者の腋窩から除去した。この皮膚を切り刻みトリプシン処理して単一細胞懸濁液を作製した。２×10⁶個の細胞のアリコートを凍結し保存するかあるいは75cm²の表面積を有するフラスコ中で培養した。コロニーが10日で集密になった時、この培養物をトリプシンで処理し、さらに２×10⁵個の細胞を接種して移植のための二次および三次培養物を作製した。移植片を調製するために、細胞を培養したシートをディスパーゼを用いてフラスコから離し、培地で洗浄し、さらに4.5×６cmに切断したワセリンガーゼに当てた。火傷を、第３度の顔の火傷を除き、筋肉の筋膜まで削り取り、死んだ組織を除去するのに十分な深さまで接線方向に削り取った。培養された移植片をガーゼ裏材とともに準備した創傷面上に配置し、所定位置で縫合し、乾燥ガーゼで手当てした。７〜10日後ワセリンガーゼを除去した。本発明により、上述の方法は解放された角化細胞をまだ同定されていないサイトカインを用いて処理してカリニンの発現を強化させることにより変更した。カリニン産生が細胞増殖に関連していると考えられるために、成長ホルモンが候補となるかもしれない。また他の栄養計画も効果的であった。例３自家培養ヒト上皮の移植を上記例１および２のように行うことができる。本発明により、これらの方法を、十分な数の角化細胞がなお活発にカリニンを産生している間に、これらの角化細胞を移植することにより変更する。この場合には、 10mM EDTAを用いて処理することにより培養基盤から亜集密角化細胞を離すことができる。懸濁細胞を増殖培地で洗浄してビトロゲン(Vitrogen)〔コラーゲンコーポレーション(Collagen Corporation)、米国、カリフォルニア州、パロアルト所在〕中に懸濁させテフロン形成品内のガーゼの層に注ぎ単一角化細胞の薄い安定化層を製造する必要がある。ビトロゲンは37℃で短時間インキュベーションすることによりゲル化し、さらにゲルを形成品から引き上げ創傷支持組織に当てる。移した細胞を例１および２に示すように保護する。カリニンが角化細胞を分離することによってのみ合成されるという観察結果を鑑み、集密状態の細胞を火傷の再上皮化に好結果を与えるのに用いることを考えることは重要である。たとえば、カリニンが結合性の表皮水疱症〔エディ(Eady) の、「CIin．Exp.Dermatol．12：161〜170（1987）」参照〕または妊娠ヘルペス〔カッツ(Katz)等（改訂）の、「Dermatology in General Medicine」マグローヒル社、米国、ニューヨーク州、586〜588（1987）参照〕のような特定の水疱症条件の患者で不足するかまたは変化している場合がある。したがって、カリニン（またはカリニンを含むＫ−ラミニンのような物質）の局所適用もこれらの状態を処置して真皮と表皮の間の接着を改善するのに有用である場合がある。例４ in vitroの標準付着アッセイを行い精製カリニンが角化細胞のプラスチック基盤への付着性を高めることがわかった。これらのアッセイでは、外因性の精製カリニンまたは対照タンパク質を基盤と一緒に一昼夜インキュベーションし、その後プレートを洗浄する。未付着細胞を洗浄して除去し、さらに残った付着細胞を、オーマイレイ(Aumailley)等の、「Exp．Cell．Res．181：463〜474（1989）」に記載されたように、定量する。例５カリニンまたはＫ−ラミニンが角化細胞の基盤への付着性を高めるはたらきを、創傷支持組織へのトランスファーシートを調製する際に行うように、細胞シートをディスパーゼで処理しプラスチックまたはガラス基盤から離すことにより示す。次にこのシートをカリニンまたは対照タンパク質でコーティングした一連のプラスチック基盤に移す。細胞シートの接着は形態学的に評価されこのシートがカリニンコーティング基盤への優れた接着性を有することが示される。また、このシートの接着性をBM165 mAbを用いる間接免疫蛍光法により評価する。強固に付着した細胞シートは、集密角化細胞培養物の研究で示されたような基盤表面への抗体の侵入を起こさせない。細胞の下方の蛍光が強固でない付着細胞について観察される。例６この例はカリニンが培養角化細胞により合成される間の細胞周期の相を示す。単一の角化細胞を培養開始後の種々の時間で平板培養し、さらにカリニンは細胞内または基盤上に免疫学的に集中する。細胞内カリニンは角化細胞の単一細胞または小クラスター内にだけ存在する。カリニンは、大コロニーの中央領域にある角化細胞内には見出されず、細胞がまだ分離し移動する周囲においてだけ見出される。種々の時間、培養物を平板培養した後に選定した時点で12時間放射線標識タンパク質前駆体と一緒にインキュベーションする。次にカリニンを全培養時間の関数として定量的に免疫沈降させる。これらの実験の予備的結果はカリニン合成が細胞ベース当たりで測定する場合、培養時間とともに低下することを示す。この情報は細胞培養の至適時間を規定し角化細胞によるカリニンの産生および堆積を最大にする。本発明にはヒトおよび動物由来のカリニンが含まれる。カリニンはウシ胎児、ヒト羊膜および羊水のような種々の供給源に存在する（またこれらから精製することができる）。将来的に、また技術的進歩により角化細胞の接着を提供するカリニンの個々の領域の同定、単離および精製が可能になるかもしれない。これらの領域は単離したカリニンをフラグメント化して個々の領域を作製して確認することができ、さらに各領域の角化細胞付着因子として機能する能力を個別的に試験することができる。あるいはまた、細胞接着をブロックする領域特異モノクローナル抗体を作製して活性領域または領域群を確認するのに用いることができる。これらの進歩が達成されると、単離した接着領域を精製し本発明に用いることができる。またさらなる進歩はカリニン、カリニンサブチェイン、または角化細胞接着を提供する関連タンパク質もしくは糖タンパク質の分子クローニングが可能になる。これらのクローン化した鎖は確認した構造領域についての構造情報を提供する。次にクローン化領域をin vitroで発現させることができる。細胞付着領域が単一カリニン鎖内に含まれる場合、機能的フラグメントをin vitroで産生させることができる。組換えタンパク質フラグメントをクリーグラー(Kriegler)等の、「 Gene Transfer and EXPression」ストックホルムプレス社、米国、ニューヨーク州(1990)に記載されたようにSV40ウイルスベクターを用いてCV-1細胞内にトランスフェクションする。動物試験動物試験を行い、ヒト角化細胞が創傷支持組織に接着するのを促進するのにカリニンまたはカリニン／Ｋ−ラミニン付加生成物が有効であることを示すことができる。適切な創傷支持組織には削り取った表皮の領域、または下に位置する真皮領域が曝されたままの火傷が含まれる。例７新生児***から、および廃棄された外科の試料から得た組織片から誘導したヒト角化細胞を標準条件を用いて細胞培養物中で広げる。細胞を亜集密状態まで増殖させその後EDTAによる分離で収集するか、または超集密状態まで増殖させ得られた細胞シートをディスパーゼを用いて分離する。カリニンおよびＫ−ラミニンは、培養した角化細胞、KB細胞、WISH細胞またはウロコ状ガン腫細胞系２５で、どれにも最大量を産生させ、この使用済み培地から、カリニンおよびＫ−ラミニンの「Ａ」様の鎖を認識するBM165モノクローナル抗体を結合した免疫アフィニティカラムを用いて、精製する。両分子はマトリックスに保持され0.1M酢酸で溶出し直ちに中和される。Ｋ−ラミニンおよびカリニンの混合物をカリニンの「B1」様の鎖だけを認識するBM140モノクローナル抗体を結合したカラムを用いる免疫アフィニティによりさらに分画する。純粋カリニンをカラムから溶出し、精製されたＫ−ラミニンは流出液に含まれる。この方法をウエスタンブロッティング分析により判断して純粋なＫ−ラミニンが得られるまで繰り返す。カリニン−Ｋ−ラミニン付加生成物をBM165アフィニティマトリックスを用いて精製する。付加生成物は、ヒト羊膜をここに参考として記載する、Bachinger（1990）により、および本件出願人の米国特許出願第07/936,850号に記載されているように大量にコラゲナーゼ消化して可溶化させる。培養細胞から不十分な量のカリニンおよびＫ−ラミニンしか得られない場合、精製した付加生成物の２種の分子を結合するジスルフィド結合を、１〜10mMシステインと一緒にインキュベーションすることで選択的に還元する一方、元のコンフォメーションを保持する。還元生成物を上述のように分画する。それぞれのヌードマウスに各１cm²の４つの全厚皮膚創傷を与える。これらの創傷を麻酔下に、背後の、２個所の脊椎中線の両側に与える。創傷は以下に記載するように直ちに処置し、さらにそのマウスを軽度の麻酔下に１〜５日間回復させ創傷面に外傷を与えないようにする。１〜５日で、マウスを麻酔の過剰投与により殺し創傷面を標準組織学により適用したヒト角化細胞の均一な接着性について評価し、免疫組織学による評価を追加してヒト由来付着細胞を確認する。プローブはヒト特異抗ケラチン抗体である。切片を、表皮付着対創傷面に沿った剥離の割合により評価する。カリニン、Ｋ−ラミニンおよびカリニン−Ｋ−ラミニン付加生成物を個々に評価する。これらの分子を０、１、2.5、５および10μg／mLの濃度で、生理的量の Ca⁺⁺およびMg⁺⁺を含むPBSに溶解する（生理的量の例は0.7〜1.1ミリモル／LのMg⁺⁺ および１〜３ミリモル／LのCa⁺⁺である）。１．角化細胞シート：０μg／mLの溶液をマウスの左側の創傷に常に適用する。各分子の試験溶液を右側の創傷に適用する。傷つけた後直ちに、角化細胞シートをマウスの両側の創傷面に適用し、さらに創傷をワセリンコーティングガーゼでカバーする。分子濃度当たり１匹のマウスを用いる。２．角化細胞懸濁液：分散させた角化細胞を0.2％のゲラチン、Ca⁺⁺およびMg⁺⁺を加えた37℃のPBS中に懸濁させる。懸濁液の一部を分離するために、試験分子のそれぞれを終濃度０、１、2.5、５および10μg／mLまで添加する。懸濁液を疎水性表面を含む形成品に直ちに注ぎ、ナイロンメッシュを用いて層を形成させる。これらのプレートを４℃に冷却しゲラチンを固める。次にゲルをワセリンコーティングガーゼでカバーし創傷面に適用する。ゲル懸濁液を新たな創傷に適用する。０μg／mL分子懸濁液をマウスの左側の創傷に常に適用する。分子濃度当たり１匹のマウスを用いる。定義この明細書で用いる、抗原は、これがモノクローナル抗体により、例えSDS-PA GEにおいて免疫沈降する場合、そのモノクローナル抗体と「免疫反応する」。単離したＫ−ラミニンのような、「単離した」分子は、in vivoでその分子と関連する他の分子を含まないよう十分精製した分子である。精製した分子の例は免疫アフィニティ分離にかけ単離した種以外のすべてのタンパク質を十分に分離させたものである。共有結合カリニン−Ｋ−ラミニンは、in vivoでこの複合体の環境に見出される他のタンパク質を実質上含まない場合、単離体である。電気泳動バンドは、それらのバンドをモノクローナル抗体に曝す時に同一のモノクローナル抗体と反応する実質上同一のバンドパターンを生じる場合実質的に電気泳動上同一である。モノクローナル抗体と抗原との間の反応は抗原−抗体相互作用と称する。ジスルフィド結合を壊す条件下の還元には２−メルカプトエタノールへの暴露が含まれる。付加生成物は共有結合複合体である。種々の好適例において本発明の原理を例示し説明したが、当業者にとって、本発明をかかる原理から逸脱することなく組み合わせおよび詳細において変更することができると考えられる。本件出願人は次の特許請求の範囲の意図および範囲内に入るすべての変更について権利を要求する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ルシエパトリシアフランス国 69009 リヨンリュデュドクチュールラフィン 19 (72)発明者マリンコヴィッチエムピーターアメリカ合衆国オレゴン州 97005 ビーバートンセンターストリート 11635 ４

Claims

【特許請求の範囲】１．単離したタンパク質である、Ｋ−ラミニン。２．約650 kDaの分子量を有し、ウエスタンブロッティングにより３種のフラグメントに分離する単離異種三量体ラミニン変異体。３．３種のフラグメントが： EHSラミニンの旧鎖に対するモノクローナル抗体と反応する第１の電気泳動バンド； EHSラミニンのB2鎖に対するモノクローナル抗体と反応する第２の電気泳動バンド；および約190kDaの第３の電気泳動バンドを含む請求項２に記載の単離異種三量体ラミニン変異体。４．約650 kDaの分子量を有し、ウエスタンブロッティングにより：ラミニンのB1およびB2フラグメントと実質上電気泳動的に同一である第１および第２フラグメント；およびモノクローナル抗体1F5、11D5および4C7と免疫反応しないが、モノクローナル抗体BM165と免疫反応する190kDaの第３フラグメントに分離する単離異種三量体ラミニン変異体。５．実質上図19Bに示すようなロータリシャドウイメージを有する請求項２に記載の単離ラミニン変異体。６．Ｙ型ロータリシャドウイメージであるが、十字型ロータリシャドウイメージでない、長腕ならびに第１および第２短腕有し、第１および第２短腕ならびに長腕が各腕の遠位末端に球状領域を含む請求項２に記載の単離ラミニン変異体。７．ロータリシャドウイメージがさらに第１および第２短腕の共通部分に小球状領域を含む請求項６に記載のラミニン変異体。８．長腕の遠位末端の球状領域が190kDa領域を含む請求項７に記載のラミニン変異体。９．さらにラミニン変異体と共有結合するカリニン分子を含む請求項２に記載のラミニン変異体。１０．電子対を共有する、ジスルフィド結合したカリニンとＫ−ラミニンの共有結合付加生成物。１１．ラミニンのB1およびB2鎖と実質上電気泳動的に同一である第１および第２電気泳動フラグメント、および190kDaの第３鎖を含む異種三量体ラミニン変異体の分子；およびラミニン変異体とジスルフィド結合により共有結合したカリニン分子であり、ラミニン変異体から単離したカリニン分子が約410〜460kDaの分子量を有し、さらにウエスタンブロッティングで還元条件下に165kDa 145kDa 140kDaおよび105k Daのフラグメントに分離するカリニン分子を含む単離した共有結合付加生成物。１２．ポリクローナル抗カリニン抗血清およびポリクローナル抗ラミニン抗血清と免疫反応し、さらに還元後に実質的に図22に示すような７種の電気泳動バンドのパターンを与える単離した共有結合付加生成物。１３．移植角化細胞とその下に位置する基盤との間に、角化細胞により通常産生される量より多い量のＫ−ラミニンを供給する工程を含む移植角化細胞がその下に位置する基盤に接着するのを改善する方法。１４．Ｋ−ラミニンを供給する工程が角化細胞によるＫ−ラミニンの産生を超生理学的レベルに高めることを含む請求項１３に記載の方法。１５．Ｋ−ラミニンを供給する工程が角化細胞と基盤の間にＫ−ラミニンとカリニンの共有結合付加生成物を供給することを含む請求項１３に記載の方法。１６．基盤が火傷の表面である請求項１３に記載の方法。１７．基盤がヒト真皮または皮下組織である請求項１６に記載の方法。１８．Ｋ−ラミニンを供給する工程が少なくとも１〜10μg／mLの濃度で医薬として許容できる担体中にＫ−ラミニンを供給することを含む請求項１７に記載の方法。１９．外因性カリニンもしくはＫ−ラミニンまたはカリニンとＫ−ラミニンの共有結合付加生成物のある量を移植角化細胞とその下に位置する基盤の間に供給する工程を含む角化細胞が基盤に接着するのを改善する方法。２０．基盤がヒト真皮または皮下組織である請求項１９に記載の方法。２１．移植角化細胞の細胞培養物のカリニン産生を監視し；さらに角化細胞がカリニンを活発に産生する間に該角化細胞を移植することを含む角化細胞が下に位置する基盤に接着するのを改善する方法。２２．基盤がヒト真皮または皮下組織である請求項２１に記載の方法。２３．移植角化細胞によるカリニンの産生を超生理学的レベルに高めることを含む角化細胞が下に位置する基盤に接着するのを改善する方法。２４．基盤がヒト真皮または皮下組織である請求項２３に記載の方法。