JPH08502244A - Immunomodulatory peptide - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 天然由来のヒトのタンバク質の切片のアミノ酸配列と同一な配列からなるペプチドの精製調製品であって、上記切片が10から30残基までの長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。   (57) [Summary] A purified preparation of a peptide comprising a sequence identical to the amino acid sequence of a naturally-occurring human protein slice, wherein the slice has a length of 10 to 30 residues, and the peptide has major human histocompatibility It is characterized by binding to the class II allotype of the sex complex (MHC).

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節ペプチド 本発明の分野は、主要組織適合性複合体（MHC）抗原である。 発明の背景 主要組織適合性複合体（MHC）クラスII抗原は、脊椎動物におけるすべての特 異的免疫応答を統合する細胞表面受容体である。ヒトは３種の別個のMHCクラスI I抗原のイソタイプを持つ、即ち、約70の異なったアロタイプが知られているDR 、33の異なったアロタイプが知られているDQ、及び47の異なったアロタイプが知 られているDPとである。各個人は２乃至４のDR対立遺伝子、２個のDQ対立遺伝子 、及び２個のDP対立遺伝子を持つ。 MHC受容体（クラスＩ及びクラスIIの両方共）は、病原体、或いは他の非宿主 起源山来の小タンパク質断片（ペプチド）を結合して、これらペプチドを免疫系 の調節細胞（Ｔ細胞）に提示することによって免疫認識に必須である第一段階に 関与する。MHCによる提示が無い場合には、Ｔ細胞は病原性物質を認識すること が出来ない。MHC クラスII受容体を発現する細胞は抗原提示細胞（APC）と呼ば れる。APC は病原性生物及び他の異物質をエンドソーム小胞に封入することによ って摂取し、次いでそれらを酵素的、及び化学的分解に委ねる。APC によって摂 取された異種タンパク質は、部分的に分解されるか、或いは“プロセシングを受 けて（processed）”ペプチドの混合物を生じ、そのうちのあるものは、表面へ の移行途上にあるMHC クラスII分子に結合する。一旦、細胞表面に達すると、MH C 分子に結合したペプチドはＴ細胞による認識をうける。 MHC クラスII抗原は、α鎖、β鎖、及びプロセシングを受けたペプチドからな る３分子複合体としてAPC の表面上に発現される。細胞表面に発現される大抵の ポリペプチドの様に、α鎖、β鎖は共にそのNH₂ 末端に短いシグナル配列を含み 、両鎖を小胞体（ER）に標的指向する。小胞体内で、クラスIIのα／β鎖複合体 はインバリアント鎖（Ii）と呼ばれるもう１つのタンパク質と会合する。Iiとの 会合は（MHC ヘテロダイマーのペプチド結合切込み部位を封鎖することによって ）時期尚早のペプチド捕捉を阻害し、安定なα／β相互作用を促進して上記複合 体のエ ンドソーム小胞への以後の細胞内流通を指令するものと考えられている。エンド ソーム内で、Iiはタンパク質分解を含むプロセスによって除去され、これによっ てペプチド結合切込みを暴露し、エンドソーム内に存在するペプチドが上記 MHC 分子に結合出来る様にする。クラスII／ペプチド複合体はエンドソームから細胞 表面に運ばれ、そこで T細胞による認識とそれに続く免疫応答の活性化に利用さ れるようになる。クラスIIのMHC 分子は外因性（摂取された）タンパク質由来の ペプチドのみならず、内因性（自己の）タンパク質の分解により生成されたペプ チドにも結合する。クラスIIに結合する夫々のペプチド種の量は、その局所濃度 と、所定のクラスII分子の結合切込みに対するその親和性によって決定され、種 々のアロタイプは異なったペプチド結合特異性を示す。 胎児発育期間の初期には、哺乳動物の免疫系は“寛容状態”にあり、自己のペ プチドには応答しないように教えられている。この系の安定性と維持は、動物が 自己に対して免疫応答を生じないことを保証するために重要である。この系の崩 壊は糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症のような自己免疫症状を引起 こす。免疫系を操作して適切な非応答性の再確立を意図する現行の技術には、遮 断性ペプチドとして、合成の高親和性結合ペプチドの静脈内投与を含むプロトコ ルが取入れられている。 予防接種は抗体仲介、及び／或いはT 細胞仲介の応答を刺激することによって 病原性生物に対する保護免疫を発生する。大抵の現行の予防接種戦略は、なお、 弱毒化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的粗製の製品を用いている。こ の様なワクチンは、しばしば、抗体仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ 、発生する免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。更に、多くの疾病にお いて、間違ったタイプの応答の発生は結果として疾病の悪化状態を招くことがあ る。 発明の開示 本出願に開示された研究において、凡そ70種の既知のヒトのMHC クラスIIDRア ロタイプの内の６種（HLA-DRI、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR8 ）に結合した天然でプロセシングを受けたペプチドの特性が決定された。これら のペプチドは、外因性のタンパク質よりも主として自己タンパク質に由来する ことが見出だされた。自己ペプチドファミリーの幾つかは、予期せぬ変質した結 合性を持つことが確認された。即ち、ある自己ペプチドが多数のHLA-DRアロタイ プに結合することがある。この観察は、MHC クラスIIの機能に関する広く許容さ れている観念、即ち、各アロタイプは異なったセットのペプチドとの結合を指令 するというMHC クラスIIの機能に関する広く受入れられている観念に逆行するも のである。更に、本出願に開示された自己ペプチドのすべてでないにしてもその 多くがクラスII分子に比較的高い親和性を持って結合する。これら３つの特性、 （1）外因性よりも自己の、（2）変質した（degeneracy）、及び（3）高親和性 結合は、Ｉ型糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症の様な自己反応性を 特徴とする病状の治療的介入に対する新規の手段を示唆する。更に、この様な治 療法は移植拒絶を軽減するのに用いることが出来る。 本発明の治療法においては、本発明の高親和性の免疫調節性の自己ペプチドを モデルにした短鎖ペプチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患者のAP C に導入される。本発明のペプチドは多様なクラスIIイソタイプと結合するので 、患者によって発現される特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分 類は不必要であろう。個々のペプチドが完全には変性せず、即ち、ぺプチドがす べてではなく少数のアロタイブに結合する場合、ペプチドの“カクテル”を用い ると有用かも知れない。当該カクテルは重複した結合特異性を与える。一旦、AP C内に入ると、ペプチドはクラスII分子に高親和性を持って結合し、それによっ て、当該病状の特徴である免疫反応の原因となる免疫原性ペプチドとの結合を阻 害する。本発明の遮断性ペプチドは個体発生の間に寛容された正確なカルボキシ 及びアミノ末端を保持する自己ペプチドであるので、これらは免疫的には不活性 であり、非自己の遮断性ペプチドを用いる治療を面倒にする可能性のある免疫応 答を誘発することがない。 本発明のペプチドは、例えば、一種或いはそれ以上のペプチドを含む溶液の静 脈内注射によって、APC に直接導入されてもよい。代わりに、大量の遮断ペプチ ドを細胞内で合成する手段をAPC に提供してもよい。遮断ペプチド配列に融合し たER（小胞体）及び／或いはエンドソームへの標的指向性シグナルをコードする 組換え遺伝子を適当な発現制御配列に連結して APCに導入する。一旦、細胞内に 入ると、これらの遺伝子はハイブリッドペプチドの発現を指令する。ERに標的指 向されたペプチドは、翻訳されてヘテロダイマーに組立てられるにつれてクラス IIのα及びβ鎖に結合するであろう。ER内に高親和性結合ペプチドが存在すると α／β複合体のインバリアント鎖との会合を防止して細胞内流通を妨害する。続 いて、クラスII分子／遮断ペプチド複合体は細胞表面に発現される可能性がある が、T 細胞は発育の初期にこの複合体に寛容化されているので、免疫応答を引起 こさない。ER保持シグナルを付与されたペプチドの使用もまたペプチドと複合し たクラスII分子がERから脱離するのを防止する可能性がある。代わりに、組換え ペプチドに、合成後それをエンドソーム分画に指向するエンドソーム標的指向性 シグナルを付与し、それによって、又、エンドソーム内で内部的にプロセシング を受けたペプチドの遮断ペプチドに対する比率をずらし、ER内ではそれと結合し なかった遮断ペプチドのクラスII分子への結合を好適にしてもよい。いかなる患 者個人に対しても、一種、或いはそれ以上のER指向化されたペプチドを、エンド ソームに指向化されたペプチドと組合わせて用い、ER内で本発明のペプチドで飽 和ざれていないα−β複合体が次いでエンドサイトーシス経路で遮断されること は有利なことかも知れない。最終結果は、又、非免疫原性のクラスII／ペプチド 複合体の細胞表面発現である。 細胞内輸送系に共役したクラスIIの非制限性の高親和性結合ペプチドの使用は 、現行の薬理学的な戦略に伴う多方面の副作用を引起こすことなく、クラスIIに 限定された免疫応答の特異的ダウンレグレーションを可能にする。これらの技術 の巧みな適用は自家免疫疾患の治療及び移植拒絶反応の防止に対する重要な進歩 である。 本発明の細胞内輸送系（dclivery system）は、又、動物、例えば、ヒト患者 、或いは***の様な疾病に罹り易いウシの様な商業的に重要な哺乳動物の予防 接種の新規の方法に利用することが出来る。この様な系は、以下の諸調整により 所定の状況において要求されるタイプの免疫応答を生じる様に作成することが出 来る。（a）クラスＩ或いはクラスII MHCに対するペプチドの特異性、（b）ペプ チド／タンパク質の長さ及び／或いは配列、及び（c）細胞内小器官を標的指向 するための特異的標識の使用。本発明の系は、これらのペプチドが細胞内におい てのみ 生成され、B細胞との接触による抗体生産を刺激し得る細胞外には存在しないこ とを保証する。これは、この様なワクチンによって引起こされる免疫応答を T細 胞仲介の免疫に限定し、それによって、不適切な、或いは、潜在的に有害な応答 、例えば、ヒトの免疫不全症、マラリア、ハンセン病、及びリーシュマニア症の 原因となる生物を標的指向する一般的ワクチンで観察される様な免疫応答を制限 するものである。更に、この T細胞仲介の免疫に限定された応答は、免疫原性ペ プチドの長さ及び特性次第で、クラスＩ、またはクラスIIを基盤とするもの、或 いはその両方であり得る。即ち、MHC のクラスＩ 分子は、長さ８から10残基の ペプチドに好適に結合するが、一方、クラスII分子は、12から25残基の長さの範 囲のペプチドに高親和性で結合することが知られている。 本発明に基く免疫感作及び治療には、本発明のペプチド、即ち、天然由来のヒ トのタンパク質（即ち、“自己タンパク質”）の切片と同一のアミノ酸配列を含 むペプチドの精製標品を用いることが出来る。この様な切片は、10から30残基の 長さであり、当該ペプチドはヒトのMHC クラスIIアロタイプに結合し、好適には 、少なくとも２つの別個のMHC クラスIIアロタイプにに結合する（例えば、約70 種の既知のDRアロタイプ、約47種の既知のDPアロタイプ、或いは、約33種の既知 のDQアロタイプのいずれか）。自己ペプチド切片に対応する上記ペプチドの部分 を、ここでは、“自己ペプチド”と呼ぶ。“精製標品”とは、ポリペプチド成分 の少なくとも50%（重量で）が本発明のペプチドからなる標品を意味する。好適 な適用例では、本発明のペプチドが精製標品の少なくとも60%（更に好適には80% ）を占める。天然由来のヒトのタンパク質は、好適には、HLA-A2（以下に広く定 義される様に）、HLA-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-DRα、HLA-DRβ、インバリア ント鎖（Ii）、Igκ鎖 C領域、Ig H鎖、Na⁺／K⁺ ATPアーゼ、トランスフェリン 、トランスフェリン受容体、カルシトニン受容体、カルボキシペプチダーゼ E、 MET キナーゼ関連形質転換タンパク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース 結合タンパク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプシン C、カテプシン S、金 属プロテイナーゼ阻害因子１前駆体、或いは熱ショック・コグネイト71KDタンパ ク質であり、それは MHC（支配）のクラスＩまたはIIの抗原タンパク質、或いは 、APC の細胞表面に生じるいかなる他のヒトのタンパク質であってもよい。自己 ペ プチドは、好適には、以下の構造形式（モティーフ）に従うものである、即ち、 上記切片のアミノ末端残基、或いはその12残基内の最初の照合位置（I）に、正 荷電残基（即ち、Lys、Arg、またはHis）、或いは大きな疎水性残基（即ち、Phe ）Trp、Leu、Ile、Met、Tyr、またはPro）、並びに、I+5 の位置に、水素結合提 供残基（即ち、Tyr、Asn、Gln、Cys、Asp、Glu、Arg、Ser、TrP、またはThr）を 持つ。更に、上記ペプチドは、また、I+9、I+1、及び／或いはI-1の位置に、疎 水性残基（即ち、Phe、Trp、Leu、Ile、Met、Pro、Ala、Val、または、Tyr）（+ 記号は、右、或いはカルボキシ末端方向への位置を、及び - 記号は、左、或
い はアミノ末端方向への位置を表す）を持つ。本発明のペプチドの典型的な例は、 HLA-A2の残基 31-40（即ち、TQFVRFDSDA）、または残基 106-115（即ち、DWRFLR GYHQ）、或いはIiの残基 107-116（即ち、RMATPLLMQA）、或いは、以下の表 1-1 0 に示されている配列のどれか１つに本質的に同一な配列である。 本発明の治療及び免疫感作の方法は、また、本発明のペプチドをコードするが 自己タンパク質の全配列のすべてではなくそれ以下の配列をコードする核酸分子 （RNA 或いは DNA）を利用することも出来る。上記核酸は、自己タンパク質（或 いは他のタンパク質）から誘導されたシグナルペプチド、或いは他の流通関連の 配列を任意に含むこともあるが、好適には MHCクラスII分子に結合する特定の自 己ペプチド以外の自己タンパク質の非重要部分をコードするものである。流通関 連の配列は、ポリペプチドに結合してその細胞内流通（小器官から小器官、或い は細胞表面への右向移動）を制御する様に機能するアミノ酸配列である。この様 な流通関連の配列は、上記該ペプチドをER、リソソーム、或いはエンドソームに 流通し、シグナルペプチド（翻訳の間、タンパク質をER内へ指向するアミノ酸配 列）、KDELの様なER保持ペプチド、及びKFERQ 、QREFK の様なリソソーム標的指 向ペプチド、並びにK、R、D、E、F、I、V、及び Lから選ばれた４残基がQの一側 に隣接しているペンタペプチドを含む。本発明に有用なシグナルペプチドの一例 は、クラスIIのα或いはβの様な MHCサブユニットのペプチドと本質的に同一な シグナルペプチドであり、例えば、 MHCクラスIIαのシグナルペプチドは、配列 MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWAに含まれる。本発明の核酸によってコード されるシグナルペプチドは、もし、その部分がポリペプチドのERへの流通を引き 起こすのに十分であれば、上記の特定の25残基配列の一部（例えば、少なくとも 10アミノ酸残基）のみを含めばよい。好適な実施例においては、本発明の核酸は 、第二の自己ペプチド及び第二の流通配列（第一の自己ペプチド及び第一の流通 配列と同一か、或いは異なってもよい）をコードして、追加の自己ペプチド及び 流通配列をコードすることもある。本発明のこの局面の更に別の変形では、自己 ペプチド配列（或いは、縦に並べられた複数の自己ペプチド配列）が、本質的に 無傷のIiポリペプチドにペプチド結合により連結され、次いで、これが、クラス II分子をERからエンドソームヘ流通する際に自己ペプチド配列を一緒に運ぶ。 本発明の核酸は、又、発現制御配列（転写及び翻訳始動シグナル、プロモータ ー、及びエンハンサーと定義され、これらが会合するコーディング配列の発現を 可能にし、及び／或いは最適にする配列）、及び／或いはファージ、或いはワク シニアウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、またはレト ロウイルスの弱毒化、或いは非増殖、無毒化型のゲノム核酸を含むこともある。 本発明のペプチド及び核酸は、それらを直接、薬剤的に許容される担体に懸濁 、或いは、リポソーム、免疫刺激複合体（ISCOMS）またはそれらの類似体に封入 することにより治療用に調製することが出来る。この様な調製品は、患者の複数 のAPCを治療用調製品と接触させてペプチド或いは核酸を上記 APCに導入するこ とによってヒト患者における免疫応答を阻害するのに有用である。 本発明には、又、本発明の核酸分子を含む細胞（例、組織培養細胞、或いは、 人体内の B細胞または APCの様な細胞）も包含される。本発明の核酸を含む培養 細胞は、当該細胞を上記核酸分子からの当該ペプチドの発現を可能にする条件下 での培養を含む方法において、本発明のペプチドの製造に用いることも出来る。 ここに非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを同定する方法を開示す る。当該方法は以下の事項を含む。 （a）最初の MHCクラスIIアロタイプから溶離されたペプチドの混合物を分画 し、 （b）この混合物から自己ペプチドを同定し、及び （c）当該自己ペプチドが第二の MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうか を検査する。この様な結合は、当該自己ペプチドが非対立遺伝子的に制限された 免 疫調節ペプチドであることの表示である。 別の具体例では、本発明は、潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法を含み 、この方法は以下の事項を包含する。 （a）MHCクラスII分子を表面に発現する細胞を提供し、 （b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、及び （c）当該候袖ペプチドに結合するクラスII分子の比率が、上記核酸の存在下 に、上記核酸の非存在下の結合比率に比べて増加しているかどうかを測定する。 この様な増加は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表 示である。 本発明には、又、潜在的な免疫調節ペプチドを確認する方法が含まれ、この方 法は以下の事項を包含する。 （a）MHCクラスII分子を発現する細胞を提供し、 （b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入して、 （c）当該細胞表面上の MHCクラスII分子のレベルが、上記核酸の存在下に、 上記核酸の非存在下の MHCクラスII分子のレベルと比較して減少しているかどう かを測定する。この様な減少は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチド であることの表示である。 本発明には、又、非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを確認する方 法を含み、この方法は以下の事項を包含する。 （a）第一の MHCクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供 し、この様な細胞を病原体（例、ヒトの免疫不全ウイルス（HIV）、 B型肝炎ウ イルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、狂人病ウイル ス、Corynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordetella pertussis（ 百日咳菌）、P1asmodium属、Schistosoma 属、Leishmania属、Trypanasoma 属、 或いは Mycobacterium lepre（癩菌）の様なヒト或いは動物の病気の原因となる 感染性病原体）に感染させ、 （b）当該細胞の第一の MHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を溶離し 、 （c）当該混合物から候補ペプチドを確認し、この様な候補ペプチドは上記病 原 体由来のタンパク質の断片であり、及び、 （d）当該候補ペプチドが第二の MHCアロタイプに結合するかを検査する。こ の様な結合は、上記の候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫刺激ペプ チドであることの表示である。病原体タンパク質のこの様な免疫原性断片をコー ドする核酸は、ヒト患者に免疫応答を誘導する方法に用いることが出来、この方 法は、患者の APC内への核酸の導入を含む。 本発明の治療法は、合成ペプチドの静脈内注射を含む従来の方法に伴う諸問題 を解決する。（1）対立遺伝子の特異性のために、全体の母集団内で発現される 種々のクラスIIアロタイプのすべて、或いは大抵のものに高親和性で結合出来る ペプチドは以前には確定されていなかった。（2）静脈内に投与されたペプチド の半減期は一般に極めて低く、高度の不便と出費を伴う反復投与が必要であり、 （3）このタイプの運搬手段は、阻害ペプチドがクラスII分子、これは細胞表面 にあるが、の結合間隙を占拠する天然由来のペプチドを除去することが必要で、 この手段は、今では非常に非効率的なプロセスであると信じられており、又、（ 4）もし、利用される阻害ペプチドが、それ自身、免疫原性であれば、患者によ っては右害な免疫応答が促進されることがある。 本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記載と特許請求の範囲から明瞭とな るであろう。 詳細な説明 先ず、図面を簡単に説明する。 図面 図 1A-1Fは、夫々、パパインで消化されたHLA-DR1、DR2、DR3、DR4、DR7及びD R8 から抽出されたペプチドプールのクロマトグラフ分析であり、紫外線吸収に よって検出された通りの各HLA-DRのペプチドの種目を図示する。 210 nm及び 27 7 nmの両方に対する紫外線吸収が、16分と90分の間の保持ウインドウ（retentio n window）で500 mAUのフルスケールで示されている（各マークは２分を表す） 。 図２は、分離されたHLA-DR1に結合したペプチドのサイズ分布の代表的な質量 分析である。100 質量ユニットで測定されたペプチド質量が、質量分析によって 確定された分離ペプチドの数に対してプロットされている。ペプチドの長さは、 質量実験値を平均アミノ酸質量である118 ダルトンで割って計算された。 図３は、本発明の２つのミニ遺伝子を表し、この中でHLA-DRα鎖のリーダーペ プチドが、ヒトのインバリアント鎖Iiの15残基（A）或いは、24残基（B）の遮断 ペプチド断片のアミノ酸末端に連結している。 実験データ 方法 Ｉ．HLA-DR抗原の精製 HLA-DR分子は、ホモ接合の、エプスタイン・バールウイルスで形質転換された ヒトの幼弱化 Bリンパ芽球系から、DR1 はLG-2細胞から、DR2 はMST 細胞から、 DR3 はWT20細胞から、DR4 はPriess細胞から、DR7 はMann細胞から、及びDR8 は 23.1細胞から精製された。これらの細胞系のすべては公然と入手出来る。細胞増 殖、細胞収集条件、及びタンパク質の精製は以前に記述ざれた通りであった（Go rga，J. et al.，1991）。簡単に述べると、各細胞タイプの200 gを10 mMのトリ ス-HCI、１ mMのジチオトレイトール（DDT）、0.1 mMフェニルメチルスルホニル フルオリド（PMSF）、pH 8.0に再懸濁して、Thomasホモゲナイザーで溶解した。 核は4000 x gで５分間の遠心で除去し、ペレットを洗浄して上清が清澄になる迄 、ペレット操作を繰り返した。すべての上清を集め、膜画分が175,000 x gで40 分の遠心によって収集された。ペレットは、次いで、10 mMのトリス-HC1、１ mM のDTT、１mMのPMSF、４%のNP-40 に再懸濁された。溶解されない膜物質は、175, 000ｘｇで２時間の遠心で除去し、NP-40 に可溶の上清画分が免疫親和精製に使 用された。 界面活性剤に可溶のHLA-DRをLB3.1-プロティンA のカラム（Gorga et al.，同 上）に結合して、100 mMのグリシン、pH 11.5 で溶離した。溶離後、サンプルに トリス-HC1を加えて直ちに中和し、次いで10 mMトリス-HC1、0.1%デオキシコー ル酸（DOC）に対して透析した。LB3.1 単クローン性抗体は、非多形性のHLA-DR α鎖上に存在する立体配座決定基を認識し、この様にしてHLA-DRのすべてのアロ タイプを認識する。 DR分子の貫膜領域はパパイン消化によって除去され、その結果得られた水溶性 分子は更に10 mM トリス-HC1、pH 8.0で平衡化されたS-200 カラムのゲル濾過に よって精製された。精製されたDRサンプルは、限外濾過によって濃縮され、得量 をBCA アッセイで測定され、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析さ れた。 II．結合したペプチドの抽出と分画 水溶性で、免疫アフィニイティーによって精製されたクラスII分子は、更に、 25 mM N-モルホリノエタンスルホン酸（MES）PH 6.5中、高性能サイズ排除クロ マトグラフィー（SEC）により、流速１ ml／分で精製して、いかなる残りの小分 子量の夾雑物をも除去した。次いで、Centricon ミクロ濃縮器（分子量分離10,0 00ダルトン）（Amicon社）を、タンパク質サンプル（最終容量 100-200 μlの 間）のスピン濃縮前に、順次、SEC 緩衝液及び10% の酢酸で洗浄した。ペプチド のプールは、選択したクラスII対立遺伝子産物から１ mlの10%酢酸を加え、15分 間、70℃で抽出された。これらの条件は、結合したペプチドをクラスII分子から 遊離するために十分であり、しかも、適度に緩和でペプチドの分解を回避出来る 。ペプチドのプールは、centricon 濃縮器を介する遠心後、クラスII分子から分 離され、素通し画分に以前に結合していたペプチドが含まれていた。 収集された酸抽出のペプチドプールは、HPLCによる分離に先立ち、Savant Spe ed-Vac中で容量 50μl に濃縮された。ペプチドは、ミクロボアC-18逆相クロマ トグラフィー（RPC）カラム（Vydac）上、以下の非直線密度勾配プロトコルを川 い、0.15 ml／分の一定流速で分離された： 0-63分、5%-33%の緩衝液 B；63-95 分、33%-60% の緩衝液 B； 95-105分、60%-80% の緩衝液 B、ここで、緩衝液 A は0.06% のトリフルオロ酢酸／水で、緩衝液 Bは、0.055%トリフルオロ酢酸／ア セトニトリルであった。クロマトグラフィー分析は、多重の紫外線波長（210、2 54、277、および 292 nm）で同時に検出して、質量分析及び配列解析の前に、分 光光度的な測定を可能にした。図１に、解析された６種のDRペプチドプールの各 々に対するクロマトグラムが示されている。収集された画分は、次いで、質量分 析及びエドマン配列決定法によって分析された。 III．ペプヂドの分析 RPCの間の、ペプチドの分光光度計による測定は、アミノ酸組成（芳香族アミ ノ酸の寄与）に関する貴重な情報を提供し、以後の特性決定のためのスクリーニ ング法として用いられる。RPC 分離の間に収集された適切な画分は、次いで、Fi nnegan-MAT LaserMatマトリックス−利用のレーザー脱着質量分析計（MALD）を 用いて分析し、量的に優勢なペプチドに対する個々の質量を決定した。収集され た画分の1%-4% をマトリックス（１μｌのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）と 混合して、抽出されたペプチドの質量決定を達成した。HLA-DR1 に対するこの分 析の結果を図２に示す。次に、選択したペプチドサンプルは、自動エドマン分解 ミクロ配列決定法により、ABI 477A タンパク質シークエンザー（Applied Bios ystems）を用い、電子スプレーイオンソースを装着したFinnigan-MAT TSQ 700三 重四重極質量分析計を用いた質量分析により提供されたカルボキシ末端確認と合 わせて配列決定された。この平行して行われた分析は、ペプチドの組成及び配列 の完全な確認を保証する。SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク質 配列とのペプチドの照合は、FASTA コンピュータデータベース検索プログラムを 用い、て行われた。表1-10は、検討されたDR分子の各々に対する本配列分析の結 果である。 結果 １．HLA-DR1． 本研究に用いられたHLA-DR1 は、当該物質が結晶学的解析、及び結合ペプチド 分析に使用出来る様にパパインで可溶化された。DR1 に結合したペプチドは、酸 で抽出され、RPC を用いて分画された（図１）。２回目の抽出／RPC 分離の後、 いかなる検出可能なペプチド様物質も存在せず、ペプチドの定量的抽出が証明さ れた。抽出されたペプチドプールのアミノ酸分析（ABI 420A/130Aデリバタイザ ー／HPLC）は、質量分析によって決定されたサイズ分布（図２参照）に対応する 結合ペプチドのモル当量によって精製DR1 が完全に占拠されると仮定して、70-8 0%の得量であることが判明した。いくつかの別々の標品のDR1 抽出から得られた RPC プロフィル（溶離図）は再現性があった。更に、界面活性剤可溶性、或いは パパイン可溶化DR1 の溶離図は同等であった。ペプチドが、界面活性剤可溶性、 及びパパイン可溶化DR1 中で、事実、同一であることを確認するために、質量分 析及びエドマン配列決定分析が行われ、２つの標品からの相当する画分に対する 質 量及び配列は一致することが判明した。 マトリックス利用のレーザー脱着質量分析（MALD-MS）を用いて、平均サイズ1 8で15残基の様式を持つDR1 の溶離されたペプチドプール内に含まれる独自の質 量を持つ111 種を同定した（図２）。13-25 残基の分子量範目内に、更に、500 以上の質量種の存在が検出された。しかしながら、シグナルは十分ではなく、個 々の質量を自信をもって割当てるには至らなかった。単一の RPCピークに対応す る画分に種々の質量を持つ多重種が検出されたことは、ペプチドの共溶離を示唆 する。これらのペプチドの特徴を更に検討するために、サンプルを、電子スプレ ーイオンソースを装備した三重四重極（triplo quadruple）質量分析計（ESI-MS ）と自動エドマン分解微量配列決定法により平行して分析した（Lane et al.，J ．Prot．Chem．10:151-160（1991））。これら２つの技法を組み合わせることに より、単一の画分に含まれる（複数の）ペプチドのN-及びC-末端両方のアミノ酸 の重要な確認が可能となる。DR1 から分離された20種のペプチドに対して得られ た配列及び質量のデータが表１に列挙されている。すべての確認されたペプチド は、SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク質の領域に割り当てられ て完全に確認されている。 驚くべきことに、20種の配列決定されたDR1 に結合したペプチドの内16種が、 自己タンパク質HLA-A2及びクラスIIと会合したインバリアント鎖（Ii）の領域に 100%同一であり、全部の抽出されたペプチド質量の少なくとも26% に相当した。 これらの分離されたペプチドは長さが様々で、N-及びC-末端の両方で切断されて おり、以下のことを示唆する：１）DR1 に結合後、抗原のプロセシングが両末端 で起こる。或いは２）クラスII分子が、無差別に生成されたペプチドのプールか らの抗原に結合する。ペプチドの微量配列決定からの得量は、HLA-A2（図１）及 びIiが、それぞれ、全DR1 に結合したペプチドの少なくとも13%に当たることを 示唆している。 更に驚くべき発見は、HLA-DRに結合し、HLA-A2ペプチドと100%相同であるにも 拘らず、HLA-A2タンパク質を発現しない細胞に由来するペプチドに関するもので ある。明らかに、このペプチドは、HLA-A2タンパク質のある領域と相同の領域を 含むタンパク質に由来している。従って、これを明確にする目的で、“HLA-A2タ ンパク質”という術語は、HLA-A2タンパク質自身、並びに、HLA-A2由来のHLA-DR 結合ペプチドと80%以上の相同性を持つ10個或いはそれ以上のアミノ酸の長さの 領域を含むいかなる天然由来のタンパク質をも包含することを意味する。同様に 、“HLA-A2ペプチド”は、本申請中に広く定義されている様に、いかなるHLA-A2 タンパク質にせよそれに由来するペプチドを指すことになる。 DR1 の研究において確認された他の４種のペプチドは、２つの自己タンパク質 、トランスフェリン受容体、及びNa⁺ /K⁺ ATP アーゼ、並びに、１つの外因性タ ンパク質であるウシ血清のフェチュイン（細胞を浸す培地を強化するために用い られる血清中に存在するタンパク質）に由来した。これらのペプチドは、各々、 全DR1 母集団の僅か0.3-0.6%を占めるに過ぎず、HLA-A2、或いはIiぺプチドより も著しく少ない。クラスII分子は、細胞表面への移送途上で、外部から入ってく るエンドサイトーシス小胞の経路と交差する。リサイクルする膜タンパク質、及 びエンドサイトーシスで取込まれた外因性タンパク質は、両方共、この共通の経 路を移動する。従って、HLA-A2、トランスフェリン受容体、Na⁺/K⁺ ATPアーゼ、 及びウシのフェチュインに由来するペプチドは、すべて、同じ様にDR1 に遭遇す る。Iiは小胞体（ER）内で発生期のクラスIIと会合して（Jones et al.，Mol．I mminol．16:51-60（1978））、クラスII/Ii複合体がエンドサイトーシス画分に 到着するまで、抗原の結合を阻止し（Roche and Cresswell，Nature 345:615-61 8（1990））、そこでIiはタンパク質分解を受け（Thomas et al.，J．Immunol． 140:2670-2675（1988）； Roche and Cresswell，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3150-3154（1991））、この様にしてペプチド結合の進行を可能にする。恐ら く、DR1 に結合するIiペプチドは、この段階で生成されたと思われる。 表１に報告されているペプチドの中の５つに相当ずる合成ペプチドを調製して 、それらのDR1 に対する相対的結合親和性を測定した。インフルエンザ A 赤血 球凝集素ペプチド（HA）307-319は、以前に、高親和性のHLA-DR1 制限ペプチド と記載されているので（Roche and Cresswell，J．Immunol．144:1849-1856（19 90）；Rothbard et al.，Cell 52:515-523（1988））、対照ペプチドとして選ば れた。組換えDR1 のcDNAを発現する昆虫細胞から精製された“空の（EmPty）” のDR1 が、ヒトの細胞から分離されたDR1 よりも高い結合容量と10倍速い会合動 力学を示す ので結合実験に用いられた（Stern and Wiley，Cell 68:465-477（1992））。す べての合成ペプチドがHAペプチドに対してよく（Ki<100 nM）競合することが見 出された（表２）。最初の概算で、Iiの106-119ペプチドが、測定されたすべて の競合ペプチドの中で、最高の親和性を持ち、対照のHAペプチドについて側定さ れた値と同等であった。Ki測定に加えて、これらのペプチドは、SDS-PAGEで解析 した場合、SDS によって誘導される“空の”DR1 のα−β鎖解離に耐性を与え、 安定なペプチド結合を示唆する（Sadegh-Nassori and Germain，Nature 353:167 -170（1991）； Dornmair et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．54 :409-415（1989）； SPringer et al.，J．Bio1．Chem．252:6201-62-7（1977） ）。２つの対照ペブチド、β₂ m 152-64、或いはIi 96-110 は、いずれもSDS-誘 導によるDR1 の鎖解離に耐性を与えず、DR1 との結合に対してHA 307-319と競合 出来なかった。これらのペプチドは両方共、本研究に報告されている推定結合モ チーフを欠いている（以下参照）。 幾つかの自然界でプロセシングを受けたペプチドのコア抗原決定基（最小限の 長さ）の配列整理に基ずく推定DR1 結合モチーフが表３に示されている。この表 に列挙されているペプチドには、HLA-DR1 に対して本申請において決定されたも のに加えて、他の研究者によって確認され、DR1 を結合することが知られている ペプチドも含まれている（本表の参考文献#6は、O'Sullivan et al.，J．Immuno １．145:1799-1808，1990；参考文献#17は、Roche & Cresswoll，J．Immunol．1 44:1849-1856； 参考文献#25は、Guttinger et al.，Inten. Immunol．3:899-9 06，1991；参考文献#27は、Guttinger et al.，EMBO J．7:2555-2558，1988；及 び、参考文献#28は、Harris et al.，J．Immunol．148:2169-2174，1992である 。）。上記モチーフに提唱されている基本的に重要な残基は以下の通りである。 正荷電グループが第一の位置に所在し、本申請では方向付けのための指標位（I ）ど呼ばれ、水素結合ドナーが I+5に、更に、疎水性の残基が I+9に位置する。 更に、疎水性残基が、しばしば、I+1 及び／或いは I-1に見出される。DR1 から 配列決定された、天然でプロセシングを受けたペプチドはいずれもこのモチーフ に属する（残基 I+9を欠くHLA-A2ペプチド 103-116を例外として）。推定モチー フは、第一のアミノ酸に関して明確に定められた位置には所在しないため、又、 結合ペプチドの長さが不規則であるために、クラスＩ分子に対してされた様に、 ペプチドプールの配列からモチーフを推定することは不可能である（Falk et al .，Nature 351:290-299（1991））。li 96-110ぺプチド、即ち、結合実験で用い られた負の対照ぺプチドは、その配列の中にI及びI+5のモチーフ残基を持つが、 li 105-118に見出される８個の追加のアミノ酸が欠けている（表 3C）。 35種のこれまでに記載されているDRIに結合する合成ぺプチド（O'Sulllvan et al.，J．Immunol．145:1799-1808（1990）; Guttinger et al.，Intern．Immun ol．3:899-906（1991）; Hill et al.，J．Immunol．147:189-197（1991）; Gut tinger et al.，EMBO J．7:2555-2558（1988）; Harris et al.，J．Immunol.， 148:2169-2174（1992））の配列の比較も、又、このモチーフを支持している。 上記35種の合成ぺプチドの中で、21種（60%）は上記の正確なモチーフを持ち、 ９種（30%）はＩ或いはI+9位に単一のシフト（sllift）を含み、又、残りの５種 （10%）はＩ位に単一の置換を持つ（表 3B及び C）。興昧のあることに、後に挙 げたペプチドにおいては、Ｉ位の市荷電は、常により大きな疎水性残基で置換さ れている（表 8C）。この正確な置換に便宜を与えることの出来るポケット構造 がクラスＩ分子で記載されている（Latron et al.， Porc．Natl．Acad．Sci．U SA88:11325-11329（1991））。他の８つのアミノ酸の上記モチーフ内、或いはペ プチドの長さの中における寄与は十分には評価されてはいないが、これらのペプ チドが示す結合において、転位／喪失した残基の補償をしているのかも知れない 。これらの研究において引川された残り 117種のDR1 に結合しないベプチド（こ れらのペプチドは表３に含まれていない）の検討は、これらペプチドの中で99種 （85%）が、本申請で提唱されているDR1 モチーフを含まないことを示している 。DR1 に結合しないが、当該モチーフを含む残り18種のペプチド（15%）の中で ６種は（5%）は、他のDRアロタイプに結合することが知られている。残り12種の ペブヂドは、結合を妨害する他の部位で不都合な相互作用をするのかも知れない 。 I-A^bと呼ばれるマウスのクラスII抗原に結合する６種のぺプチド、及びマウス のI-E^bに結合する５種のペプチドに関する以前の研究において観察された正確な N-末端の***とは対照的に（Rudensky et al.，Nature 3565:622-627（1991）） 、DR1 に結合する当該ペプチドは、N-及びC-末端の両方において不均一であ る。クラスＩ分子に結合するべプチドは９量体が支配的であるが、これらとは対 照的に（Van Bleek and Nathenson，NatUre 348:213-216（1990）; Rotzschke e tal.，Nature 348:252-254（1990）; Jardetzky et al.，Nature 353:326-329（ 1991）; Hunt et al.，Science 255:1261-1263（1992））、クラスIIペプチドは よりサイズが大きく、又、末端の切断の長さと部位の両方において高度の不均一 性を示し、クラスＩ及びクラスIIのペプチドに対するプロセシングの機構が相当 に異なることを意昧している。更に、今回の結果は、クラスIIのプロセシングは 、確率論的な事象であり、DRアロタイプは、複雑で不揃いな混合物の中から種々 の長さのベプチドに結合する可能性を示唆している。観察された上記の不均一性 は、単に、結合したペプチドが更に分解するのを防ぐためかも知れない。この様 にして、クラスII分子は、結合したぺプチドが完全に分解されることから防御ず ることによって、抗原のプロセシングにおいて積極的な役割を演じるのであろう （以前に提唱された様に（Donermeyer and Allen，J．Immunol．142:1063-1068 （1989）））。又は、DRI に結合するものは15量体が支配的であるが（MALD-MS 及び配列決定されたペプチドの得量の両方から検出される様に）、これは、結合 したペプチドの剪定（trimming）の結果かも知れない。いずれにせよ、検出可能 な量の、13残基より短く、25残基より長いペプチドが存在しないことは、ペプチ ドの結合機構、或いは抗原のプロセシングに特有の長さ制限があることを示唆し ている。DR１に結合するペプチドは、内因的に合成されたタンパク質、特にMHC に関連したタンパク質に由来するものが支配的であることは、自己寛容の発生に 関連して、自己ペプチド提示機構の進化の結果かも知れない。 II．他のHLA-DRＲ分子 DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8の各々から溶離された天然でプロセシングを受げ たペプチドのアミノ酸配列が、夫々、表4-8に示されている。表9には、野生型の Arを持たないが、A2様のペプチドを結合した他の細胞系由来のDR1のアミノ酸配 列が示されている。表10は、ヒトの牌臓由来の細胞に発現されるDR4及びDR11分 子から溶離したペプチドのアミノ酸配列を示す。これらのデータは、外因性ペプ チドと比較して、結合する自己ペプチドが大いに優勢であることを証明する。こ のデータ、又、A2及びliペプチドが、繰り返し生じることを示す。 III．ペプチドの運搬 遺伝的構成 本発明の免疫調節ペプチドをコードする遺伝子のin vivo投与のための遺伝的 構成物を調製するために、以下の操作が行行われる。 重複した合成のオリゴヌクレオチドを用いて、図３に示されているリーダーペ プチド／遮断ペプチドのミニ遺伝子を、ヒトのHLA-DRα及びインバリアント鎖の cDNA鋳型から、PCR 増幅によって生成した。これらのミニ遺伝子は、Iiペプチド 断片である KMRMATPLLMQALPM（即ち、li₁₅）、及び、LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM （即ち、Ii₂₄ ）をコードする。その結果得られた構成物は、プラスミドpGEM-2- α-li₁₅、及びpGEM-2-α-li₂₄を形成するために、pGEM-2（Promega社）中に、以 下に述べるin vitro転写／翻訳系で用いるための上流T7プロモーターと共にクロ ーンされた。 in vivo発現のために、各ミニ遺伝子は、その後、pGEM-2誘導体からトランス フェクション・ベクターであるpHβアクチン-1-ネオ（neo）（Gunning et al.， （1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4831）中にザブクローンされてプラス ミドpHβアクチン-α-Ii₁₅及びpHβアクチン-α-Ii₂₄を形成した。上記の挿入さ れたミニ遺伝子は、この様にして、構成的で／強力なヒトのβアクチンブロモー ターから生体内（in vivo）で発現される。これに加えて、上記ミニ遺伝子は、p GEM-2誘導体からワクシニアウイルスの組換えベクターであるpSC11（S.Chakraba rti et al.，（1985）Mol．Cell．Biol．5，3403-3409）中にサブクローンされ てプラスミドpSCll-α-Ii₁₅及びpSCll-α-Ii₂₄を形成した。ウイルスのゲノム中 に組換え後、上記のミニ遺伝子は強力なワクシニアp_7.5プロモーターから発現さ れる。ペプチドに加えられる細胞内流通シグナル 短いアミノ酸配列は、タンパク質を特定の細胞内分画（コンパートメント）に 指向するためのシグナルとして作用することが出来る。例えば、疎水性シグナル ペプチドは、ERに仕向けられているタンパク質のアミノ末端に見出されるが、ア ミノ酸配列KFERQ（及び、他の密接に関連した配列）は細胞内ポリペプチドをリ ソソームに指向することが知られており、一方、他の配列はポリペプチドをエン ドソームに指向する。更に、ペプチド配列KDELはERに対する保持シグナルとして 作用することが示されている。これらのシグナルペプチドの各々、或いは、これ らを組合わせて、本発明の免疫調節ペプチドを、希望通りの流通に用いることが 出来る。例えば、ER標的指向のシグナルペプチドに連結された所定の免疫調節ペ プチドをコードする構成物は、当該ペプチドをERに指向し、そこで組立てられた ままで、クラスII分子に結合して、流通に必須である無傷のIiの結合を防止する 。又は、上記ペプチド上のER保持シグナルは、クラスII分子が、仮にも、ERから 分離することを防止する助けとなるような構築物を作ることも出来る。もし、代 わりに、本発明のペプチドがエンドソーム分画に指向されるならば、これは、イ ンバリアント鎖がプロセシングを受けたペプチドで置換される場合、大量の当該 ペプチドが存在し、それによってクラスII複合体に組込まれたペプチドが、天然 由来で潜在的に免疫原性のペプチドよりもむしろ本発明の高親和性ペブチドであ る可能性を増大する。本発明のペプチドがクラスIIへの組込みに利用出来る見込 みは、当該ペプチドを無傷のIiポリペプチド配列に連結することによって増大す ることが出来る。IiはクラスII分子をエンドソームヘ流通することが知られてい るので、ハイブリッドIiは、本発明のペプチドの１つ、或いはそれ以上のコピー をクラスII分子と共に運ぶことになる。一旦、エンドソーム内に入ると、上記ハ イブリッドIiは正常のエンドソームのプロセスによって分解して、本発明のペプ チド或いは、それに類似の分子の多重コピー、及びクラス１１の開放された結合 間隙とを生成する。標的指向シグナルを含む免疫調節ペプチドをコードするDNA は、PCR或いは他の標準の遺伝子操作、または合成的技法によって生成され、こ れらペプチドがDR分子と会合する能力は、下記の様に、in vitro及びin vivoで 分析される。 インバリアント鎖は、クラスII分子がER内でペプチドを結合することを防市し てヘテロダイマー形成に貢献する可能性があると提唱されている。この会合を防 止する機構は、いかなるものでもクラスII遮断の効率を増大するであろう。従っ て、クラスIIヘテロダイマーに結合するIi上の部位、或いはIiに結合するヘテロ ダイマーのαまたはβサブユニット上の部位に対応するペプチドは、この会合を 防止し、それによって、MHCクラスIIの機能を中断するために用いることが出来 る。In vitro における組立て 無細胞抽出液が真核生物のタンパク質を発現するため日常的に使用されている （Kreig，P．& Melton，D.（1984）Nucl．Acid Res．12，7057；Pelham，II．an d Jackson，R．（1976）Eur．J．Biochem．67，247）。特定のmRNAが、ウイルス RNA ポリメラーゼのプロモーターを含むDNAベクターから転写されて（Melton，D . et al．（1984）Nucl．Acid Res．12，7035）、ミクロコッカスヌクレアーゼ で処理された細胞抽出液に加えられる。³⁵Ｓメチオニン及びアミノ酸の添加が、 外因性のmRNAの翻訳を始動し、結果として標識タンバク質が生成される。タンパ ク質は、次いでSDS-PAGEにより分析され、オートラジオグラフィーによって検出 される。シグナルペプチドの切断及びコアグリコシル化の様なプロセシング事象 は、翻訳の間にミクロソーム小胞を添加することによって開始され（Walter，P ．and Blobel，G．（1983），Meth. Enzymol.，96，50）、これらの事象はSDS-P AGEゲルにおけるタンパク質の移動度の変化によって検査される。 シグナルペプチド配列を含むペプチド正確にプロセシングを受けて、インバリ アント鎖とER中でクラスII結合に対して競合する能力は、上述のin vitro系でア ッセイされる。とりわけ、上述のDRIのα-とβ-鎖、及びインバリアント鎖ペプ チドの構成物は、mRNAに転写され、これが哺乳動物のミクロソーム膜の存在下に 翻訳されるであろう。DRヘテロダイマーのIiとの会合、DR及びIiに対する抗血清 による免疫沈降試験によって測定される。本発明のペプチドをコードするmRNAを 翻訳反応に加え、トリスートリシンゲル上のSDS-PAGEで測定する場合、共免疫沈 降するIiのレベルが減少すると同時に共免疫沈降するペプチドが出現する結果と なるはずである。これらの実験は、所定の遮断ペプチドのERにおけるIi鎖結合に 対する競合剤としての潜在的有川性を決定するための迅速なアッセイ系を提供す るであろう。この無細胞系においてIiと有効に競合する能力のあることが判明し ている本発明のこれらのペプチドは、次いで、以下に述べる様に、無傷の細胞に おいて検査することが出来る。In vivo における組立て ヒトのEBVで形質転換されたB細胞系であるLG-2とHOM-2（HLA-DR1に対して 同型接合）及びマウスの B細胞ハイブリドーマであるLK35.2が、50μｇの鎖状化 pHβアクチン-α-Ii₁₅或いはpHβアクチン-α-Ii₂₄、又は（コントロールとして ）_PHβアクチン-1-neoで、エレクトロポレーション（150 mV、960μF、キュベッ ト幅0.2cm）によってトランスフェクトされる。エレクトロポレーション後、上 記細胞は、G418を含まない培地中で完全回復まで（約4日）培養される。各母集 団は、次いで、ネオマイシン耐性を表現する形質転換体母集団が得られる迄 G41 8 選別にかける（約 1-2ケ月）。耐性母集団は、制限稀釈によってサブクローン し、安定な形質転換体の遺伝的同一性は、遮断ペプチドのmRNA発現のPCR増幅に よって決定される。 遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載するLG-2、及びHO M-2の安定な形質転換体を、ペレット化細胞塊20ｇを得る迄、大規模培養条件で 培養する。各形質転換体によって発現されたHLA-DRを精製し、結合ペプチドの量 （細胞内及び細胞外両方からの）を上記の様にして分析する。総結合ペプチドの 多様性の減少の成功が証明されれば、免疫調節ペプチドの細胞内への運搬の表示 となる。 もう一つの細胞によるアッセイは、遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制 御ベクターを担載するLK35.2細胞の安定な形質転換体を利用する。これらの細胞 は、T細胞増殖アッセイにおいてAPCとして用いられる。各形質転換体を、種々の 稀釈度の鶏卵リゾチーム（HEL）、及びHELに特異的な T細胞ハイブリドーマの存 在下に24時間培養する。各アッセイに存在する T細胞の川対的活性化（リンホカ イン生成により測定）は、市販のリンホカイン依存性細胞系であるCTLL2 を用い て、³H-チミジンの取込みアッセイ（Vignali et al．（1992）J.E.M. 175：925- 932）で測定する。遮断ペプチドを発現する形質転換体が、HEL を特異的Ｔ細胞 ハイブリドーマに提示する能力を減少することを成功裡に証明出来れば、免疫調 節ペプチドの細胞内への運搬の確証となるであろう。ヒトのTK^-細胞系143（ATCC ）の細胞をワクジニアウイルス（WR株、TK⁺）（ATCC）に感染させ、感染後２時 間して、pSCll-α-Ii₁₅、或いはpSCll-α-Ii₂₄を感染細胞内にリン酸カルシウム 沈殿法によって導入する。TK~組換え体は、25μｇ/mlの濃度のブロモデオキシウ リジンを用いて選択する。組換えプラークは、ミニ遺伝子DNA の存在を求めて、 PCR によりスクリーンする。組換えウイルスは、純粋クローンのウイルス株を生 成するために、3ラウンドの限界稀釈によりクローンする。 前述のトランスフェクション実験に類似の実験において、ミニ遺伝子、或いは ベクターのみをコードする組換えワクシニアウイルスを用いて、EBVで形質転換 されたヒトのB細胞系である、LG-2、及びHOM-2 の大規模培養物を感染する。感 染後、HLA-DRを精製して、結合ペプチドの量を上記の様にして分析する。結合ペ プチド母集団の複雑性の低下、及び結合したIiペプチドの相対的量の著明な増大 は、ワクシニアが遮断ペプチドをヒトのAPC に運搬出来ることの確証である。 ミニ遺伝子、或いはベクターをコードする同じ組換えワクシニアウイルスが、 実験的に導入された自己免疫を体験しているマウスを感染するのに用いられるで あろう。この様なモデルは多数知られており、Kronenberg、Cell 65:537-542（1 991）に引用されている。合成ペプチド、或いはミニ遺伝子構成物のリポソームによる運搬 リポソームは、薬物の担体として、又、最近では、ヒトにおけるマラリアのワ クチン注射のための安全で有力な補助戦略として成功裡に使川されている（Frie s et al．（1992），Proc. Natl．Acad．Sci．USA 89:358）。包膜されたリポソ ームは、可溶性タンパク質を取込み、これらの抗原を細胞に運搬して、in vitro 及びin vivoの両方における CD 8⁺仲介の細胞溶解性（CTL）の応答をもたらす（ REddy et al., J. Immunol. 148:1585-1589，1992；及びCollins et al., J.Imm unol. 148:3336-3341，1992）。この様にして、リポソームは、合成ペプチドを APC内に運搬するための伝達体（vehicle）として用いてもよい。 Harding ら（Cell（1991）64，393-401）は、リポソームにより運搬される抗 原の、２つの細胞内のクラスII充填分画（loading compartments）のいずれか、 即ち、初期のエンドソーム及び／或いはリソソームへの標的指向は、リポソーム の膜組成を変えることによって達成出来ることを証明している。即ち、酸感受性 リポソームは、その内容物を初期エンドソーム、に指向するが、一方、酸耐性の リポソームは、その内容物をリソソームに運搬することが見出だされている。こ の様にして、本発明のペプチドは、エンドソームへの運搬が望まれている場合、 酸感受性のリポソームに、又、リソソームへの運搬が望まれている場合は、酸耐 性リポソ ームに取込まれることになろう。 リポソームは、標準の界面活性剤透析、或いは脱水−再水和法によって調製さ れる。酸感受性リポソームに対しては、ジオレオイル・ホスファチジルエタノー ルアミン（DOPE）及びパルミトイル・ホモシステイン（PHC）が用いられ、一方 、ジオレオイル・ホスファチジルコリン（DOPC）及びジオレオイル・ホスファチ ジルセリン（DOPS）が、酸耐性リポソームの調製に使用される。10^-5モルの総脂 質（DOPC/DOPS或いはDOPE/PHC、4:1 のモル比で）を乾燥し、0.2 mlのHEPES 緩 衝食塩水（HBS）（150 mM Nacl、1 mM EGTA、10 mM HEPES ｐH 7.4）中で水和し て超音波処理する。脂質の懸濁液を0.1 mlのHBSに溶かした1 M のオクチルグル コシドを加えて可溶化する。封入されるべきぺプチドを20% HBS 中 6 mM のペプ チド0.2 mlに加える。混合物は、次いで、凍結し、一晩凍結乾燥してから再水和 する。これらのリポソームは、キモトリプシンで処理して、表面に結合したペプ チドをすべて消化する。リポソームのEBV で形質転換した細胞系（上述の様に） への運搬は、37℃で12-16 時間のインキュベーションにより達成されるであろう 。HLA-DRは、リポソームで処理した細胞から精製されて、結合ペプチドは前記の 様にして分析される。 代わりに、リポソームは本発明のDNA ミニ遺伝子構成物で処方調製されて、in vitro或いはin vivoで上記構成物をAPCに運搬するために利用される。 ヒトの免疫感作は、臨床検査のためのジョンズ・ホプキンス大学・合同委員会 （The Johns Hopkins University Joint Committee for Clinical Investigatio n）、及び米国陸軍・軍医総監室・ヒト患者の研究検閲評議会（Human Subject R esearch Review Board of the Office of the Surgeon General of the U.S. Ar my）の両方によって承認された手順（Fries et al. （1992），Proc．Natl．Aca d．Sci．U.S.A．89:358-362）に従い、そこに記載の用量、或いは、治療薬のリ ポソームを基盤とする運搬に対する文献に記載されているの他の用量を用いて行 われるであろう。免疫刺激複合体（ISCOMS）を介する運搬 ISCOMSはコレステロールとQuil A（サポニン）を混合すると自発的に生成され るサイズ30-40 nmの負荷電の籠形構造物である。保護免疫は、トキソプラズマ病 及びエプスタイン・バールウイルスで誘発される腫瘍を含む種々の感染の実験モ デルにおいて、ISCOMSを抗原の運搬伝達体として用いて発生されている（Mowat and Donachie, Immunology Today 12:383-385，1991）。ISCOMSに封入された１ μｇ程度の低い抗原用量でもクラスＩ仲介のCTL 応答を起こすことが見出だされ ており、ここでは、精製した無傷のIIIV-1-IIIB gp 160 包膜糖タンパク質、或 いはインフルエンザ赤血球凝集素が抗原である（Takahashi et al.，Nature 344 :873ー875, 1990）。ペプチドは、ISCOCOMSを用い、上述のリポソームに対するの と同じ様式と用量で組織培養細胞内に運搬される。運搬されたペプチドのクラス IIペプチド結合は、次いで、上述の様に、抽出と特徴決定によって決定される。 ISCOMSによって運搬され培養細胞によって効果的に利用される本発明のペプチド は、次いで、動物或いはヒトで検査される。 治療用の合成ペブチドの運搬に加えて、ISCOMSは、ミニ遺伝子をAPC に運搬す るために構成され、この様にして上に概説されたワクシニア戦略に対する代替法 として役立つ。免疫原性ペブチドの運搬（ワクチン） 免疫系をダウンレギュレーションするという特異的な目的で、非免疫原性の自 己ペプチドを運搬するために前述の細胞内運搬システムを利用することに加えて （この様にして自己免疫状態を軽減する）、本発明の運搬システムは、代わりに 、動物の免疫系の一部を刺激するために、予防接種の新規の方法として用いるこ とも出来る。後の場合、上記の運搬システムは、特定の病原体に対する免疫応答 の刺激を意図して、免疫原性で病原体由来のペプチドを発現するDNA 構成物を、 適当な細胞内に運搬するために利用される。上記免疫原性ペプチドは標的細胞自 身の中で生成されるので、本発明のワクチン法は、抗体生成を刺激し、それによ って潜在的に有害な、或いは不適切な免疫反応誘導に利用される様な血中を循環 する遊離の抗原は存在しないことを保証する。本発明のワクチンによって刺激さ れる免疫応答は、ワクチンはAPC にのみ指向されているので、もっと全般的な免 疫応答という結果になる標準のワクチンプロトコルとは対照的に、T 細胞仲介の 応答に限定されている。ペプチドを提示するAPC のあるものは、初期に宿主のホ ストT 細胞によって溶解されることもあるが、とりわけ、ウイルス基盤のワクチ ン は、非複製的で、即ち、各担体ウイルスは単に 1個の細胞のみを感染するので、 この様な溶解は限定されている。 本発明の系を完璧にして検査するために用いられるモデル抗原は、鶏卵のリゾ チーム（HEL）である。議論はあるものの、これは、抗原提示研究のために最も よく特徴が検討されているタンパク質であり、それに対しては、多数の単クロー ン性抗体、及びクラスIとクラスIIに限定されたマウスの T細胞クローン及びハ イブリドーマが存在する。研究される一次抗原決定基は、単クローン性抗体及び CD4+ T細胞ハイブリドーマの両方が入手出来るので、ペプチドHEL34-45であり、 及び、クラス IとクラスII限定 T細胞クローン及びハイブリドーマが作られ、市 販されているので、ペプチドHEL46-61とである。この様にして、これら 2つのア ミノ酸配列は、免疫原性の抗原決定基であることが立証されている。最初、異な ったポリペプチドをコードする 4種の構成物が分析される。（a）分泌されるHEL の全体、（B）HEL 34-45、（c）HEL 46-61、及び（d）HEL 34-61。最後の 3種は 、これらの細胞内で切断されることが知られているシグナル配列、例えば、1A^ｋ （MPRSRALILGVLALTTMLSLCGG）を含み、結果としてERを指向する。すべての構成 物は、次いで、pHβApr-1 neo 中にサブクローンされる。これらの構成物を作成 する方法論は、上に概説されたものと同じである。上記構成物は、通常の真核細 胞のトランスフェクション、或いは、上述の運搬伝達体（例えば、ワクシニア、 リポソーム、或いは、ISCOMS）の１つによって、適切なAPC、例えば、LK35.2細 胞内に導入される。マウスのMHC クラスII制限分子であるIA^k及びIE^kを持ち、上 記構成物の各々でトランスフェクトされたLK35.2細胞が、適当なクラスI 及びク ラスII制限 T細胞ハイブリドーマ並びにクローンを刺激する能力を標準技法で検 査される。クラス I刺激が観察されるかどうかは、クラス I分子との結合に適切 な 8-10 量体を生成するためにペプチドの剪定がER内で起こり得るかどうかに係 ると思われる。もし、これらの構成物がクラス I刺激に効果的でないならば、ク ラス I結合に対して更に効果的なペプチドを生成するために、これらの構成物を 修飾することが出来る。これらの構成物は、クラスII限定応答に対してより効果 的でないことが立証される場合には、V 節に述べられた様に、これらにエンドソ ーム及び／或いはリソソーム指向の配列を付与することが出来る。 免疫原性ペプチドを特定の細胞内小器官に指向するために用いられる標的指向 シグナルの効果性は、種々の形質転換体の免疫金染色切片の電子顕微鏡分析を用 いて検出されるであろう。この適用のため、ウサギの抗ペプチド抗血清を生成し 、アフィニティを利用して精製する。更にHEL 34-45を認識する抗体HF10が川い られるであろう。 一旦、ある構成物が、形質転換体によってin vitroで効果的に提示出来ること が明確になれば、そのin vivo における効果性が決定される。これは、上記形質 転換体をC3H/Balb/c F1 マウスに腹腔内及び／或いは皮下注射することにより、 または、適当な運搬伝達体（例えば、リポソーム、ISCOMS、レトロウイルス、ワ クシニア）に取込まれた構成物を注射することによって検査することが出来る。 この様な免疫感作注射に対する至適プロトコル及び用量は、本出願に提供されて いる開示があれば、当事者によって決定することが出来る。免疫感作の効率は、 以下の様な標準の方法によって検査出来る。（a）HEL を適用された（HEL pulse d）APCに応答するクラスIIに限定された T細胞の増殖、（b）⁵¹Crで標識された 標的に対する CTL応答、及び（c）ELISA で測定される血清の抗体価。 一旦、本発明のワクチン運搬システムの細部が至適化されれば、有用な免疫感 作の潜在能力を持つペプチドをコードする構成物を上記の系に組込むことが出来 る。この様なペプチドは、病原体由来のタンパク質上の免疫原性抗原決定基の同 定に現今用いられている標準手段によって確認することが出来る。例えば、免疫 感作のための候補ペプチドは、抗体及び特定の病原体で感染された動物の T細胞 の分析から決定してもよい。保護的で効果的な既往（記憶）応答を獲得するため に、予防接種に川いられるペプチドは、理想的には、感染すると最高の頻度と効 率で提示されるペプチドでなければならない。これは、感染細胞から MHCクラス II分子に結合したペプチドを抽出して特徴決定するために、前記実験の部に概説 されている操作を用いて最もよく決定することが出来る。免疫原性ペプチドに対 立遺伝子制限があるならば（本発明の自己ペブチドで観察された変質した結合と 対比して）、全母集団に対して有用なワクヂ〕／を提供するためには数種の免疫 原性ペブチドをコードするミニ遺伝子が要求されるであろう。ワクチンの投与と 用量は、天然痘の予防接種に現在適用されているものと同様である。 特許請求の範囲は次の通りである。 配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人： ロバート ジー アーバン ローマン エム チクビ ダリオ エー エー ビグナリ マリー エル ヘドレイ ローランス ジェイ ステルン ジャック エル ストロミンガー （ii）発明の名称：免疫調節ペプチド （iii）配列数 ： 157 （iv）対応アドレス： （A）名宛人：フィッシュ アンド リチャードソン （B）通り： 225フランクリンストリート （C）市： ボストン （D）州： マサチューセッツ （E）国： アメリカ合衆国 （F）郵便番号：０２１１０−２８０４ （ｖ）コンピュータ読み出し形態： （A）媒体形式： 3.5”ディスク，1.44Mb （B）コンピュータ： IBM PS/2モデル50Zまたは55SX （C）作動システム： MS-DOS（バージョン5.0） （D）ソフトウェア： ワードパーフェクト（バージョン5.1） （vi）現出願データ： （A）出願番号： ＰＣＴ／ＵＳ９２／０６６９２ （B）出願日： １９９３年８月１１日 （C）分類： （vii）優先出願データ： （A）出願番号： ０７／９２５，４６０ （B）出願日： １９９２年８月１１日 （viii）代理人情報： （A）氏名： クラーク ポール ティー （B）登録番号： ３０，１６２ （C）整理番号： ００２４６／１６２００１ （ix）遠隔通信情報： （A）電話番号： （６１７）５４２−５０７０ （B）ファックス番号： （６１７）５４２−８９０６ （C）テレックス番号： ２００１５４ （２）配列番号１の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号１の記載 ： （２）配列番号２の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号２の記載 ： （２）配列番号３の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号３の記載 ： （２）配列番号４の情報 ： （ｉ）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号４の記載 ： （２）配列番号５の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号５の記載 ： （２）配列番号６の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 25 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号６の記載 ： （２）配列番号７の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 24 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号７の記載 ： （２）配列番号８の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 24 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号８の記載 ： （２）配列番号９の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号９の記載 ： （２）配列番号10の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号10の記載 ： （２）配列番号11の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 22 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号11の記載 ： （２）配列番号12の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 22 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号12の記載 ： （２）配列番号13の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号13の記載 ： （２）配列番号14の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D））トボロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号14の記載 ： （２）配列番号15の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号15の記載 （２）配列番号16の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号16の記載 ： （２）配列番号17の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号17の記載 ： （２）配列番号18の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号18の記載 ： （２）配列番号19の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号19の記載 ： （２）配列番号20の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号20の記載 ： （２）配列番号21の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号21の記載 ： （２）配列番号22の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号22の記載 ： （２）配列番号23の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号23の記載 ： （２）配列番号24の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号24の記載 ： （２）配列番号25の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号25の記載 ： （２）配列番号26の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号26の記載 ： （２）配列番号27の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号27の記載 ： （２）配列番号28の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号28の記載 ： （２）配列番号29の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号29の記載 ： （２）配列番号30の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号30の記載 ： （２）配列番号31の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号31の記載 ： （２）配列番号32の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号32の記載 ： （２）配列番号33の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号33の記載 ： （２）配列番号34の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号34の記載 ： （２）配列番号35の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号35の記載 ： （２）配列番号36の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号36の記載 ： （２）配列番号37の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号37の記載 ： （２）配列番号38の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号38の記載 ： （２）配列番号39の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号39の記載 ： （２）配列番号40の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号40の記載 ： （２）配列番号41の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号41の記載 ： （２）配列番号42の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号42の記載 ： （２）配列番号43の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 22 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号43の記載 ： （２）配列番号44の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 25 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号44の記載 ： （２）配列番号45の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号45の記載 ： （２）配列番号46の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 24 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号46の記載 ： （２）配列番号47の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号47の記載 ： （２）配列番号48の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号48の記載 ： （２）配列番号49の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号49の記載 ： （２）配列番号50の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号50の記載 ： （２）配列番号51の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号51の記載 ： （２）配列番号52の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 13 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号52の記載 ： （２）配列番号53の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号53の記載 ： （２）配列番号54の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号54の記載 ： （２）配列番号55の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号55の記載 ： （２）配列番号56の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号56の記載 ： （２）配列番号57の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号57の記載 ： （２）配列番号58の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号58の記載 ： （２）配列番号59の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号59の記載 ： （２）配列番号60の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号60の記載 ： （２）配列番号61の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号61の記載 ： （２）配列番号62の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号62の記載 ： （２）配列番号63の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号63の記載 ： （２）配列番号64の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号64の記載 ： （２）配列番号65の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号65の記載 ： （２）配列番号66の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号66の記載 ： （２）配列番号67の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号67の記載 ： （２）配列番号68の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 27 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号68の記載 ： （２）配列番号69の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 27 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D））トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号69の記載 ： （２）配列番号70の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 27 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号70の記載 ： （２）配列番号71の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 27 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号71の記載 ： （２）配列番号72の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号72の記載 ： （２）配列番号73の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号73の記載 ： （２）配列番号74の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号74の記載 ： （２）配列番号75の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号75の記載 ： （２）配列番号76の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号76の記載 ： （２）配列番号77の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号77の記載 ： （２）配列番号78の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号78の記載 ： （２）配列番号79の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号79の記載 ： （２）配列番号80の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号80の記載 ： （２）配列番号81の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号81の記載 ： （２）配列番号82の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号82の記載 ： （２）配列番号83の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号83の記載 ： （２）配列番号84の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号84の記載 ： （２）配列番号85の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号85の記載 ： （２）配列番号86の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号86の記載 ： （２）配列番号87の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号87の記載 ： （２）配列番号88の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号88の記載 ： （２）配列番号89の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号89の記載 ： （２）配列番号90の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号90の記載 ： （２）配列番号91の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号91の記載 ： （２）配列番号92の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号92の記載 ： （２）配列番号93の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号93の記載 ： （２）配列番号94の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号94の記載 ： （２）配列番号95の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号95の記載 ： （２）配列番号96の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号96の記載 ： （２）配列番号97の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号97の記載 ： （２）配列番号98の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号98の記載 ： （２）配列番号99の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号99の記載 ： （２）配列番号100の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 12 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号100の記載 ： （２）配列番号101の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号101の記載 ： （２）配列番号102の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 22 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー： 直鎖状 （xi）配列番号102の記載 ： （２）配列番号103の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号103の記載 ： （２）配列番号104の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号104の記載 ： （２）配列番号105の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 19 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号105の記載 ： （２）配列番号106の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号106の記載 ： （２）配列番号107の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号107の記載 ： （２）配列番号108の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号108の記載 ： （２）配列番号109の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号109の記載 ： （２）配列番号110の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号110の記載 ： （２）配列番号111の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 12 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号111の記載 ： （２）配列番号112の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号112の記載 ： （２）配列番号113の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号113の記載 ： （２）配列番号114の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号114の記載 ： （２）配列番号115の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トボロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号115の記載 ： （２）配列番号116の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号116の記載 ： （２）配列番号117の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号117の記載 ： （２）配列番号118の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号118の記載 ： （２）配列番号119の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号119の記載 ： （２）配列番号120の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号120の記載 ： （２）配列番号121の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号121の記載 ： （２）配列番号122の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号122の記載 ： （２）配列番号123の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号123の記載 ： （２）配列番号124の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号124の記載 ： （２）配列番号125の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号125の記載 ： （２）配列番号126の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 22 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号126の記載 ： （２）配列番号127の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 18 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号127の記載 ： （２）配列番号128の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号128の記載 ： （２）配列番号129の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号129の記載 ： （２）配列番号130の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号130の記載 ： （２）配列番号131の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号131の記載 ： （２）配列番号132の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 17 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号132の記載 ： （２）配列番号133の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号133の記載 ： （２）配列番号134の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号134の記載 ： （２）配列番号135の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号135の記載 ： （２）配列番号136の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号136の記載 ： （２）配列番号137の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号137の記載 ： （２）配列番号138の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 15 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号138の記載 ： （２）配列番号139の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号139の記載 ： （２）配列番号140の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 24 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号140の記載 ： （２）配列番号141の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 21 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号141の記載 ： （２）配列番号142の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 20 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号142の記載 ： （２）配列番号143の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 16 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号143の記載 ： （２）配列番号144の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 26 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号144の記載 ： （２）配列番号145の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 24 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号145の記載 ： （２）配列番号146の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号146の記載 ： （２）配列番号147の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 123 （B）配列の型 ： 核酸 （C）鎖の数 ： 一本鎖 （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号147の記載 ： （２）配列番号148の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 150 （B）配列の型 ： 核酸 （C）鎖の数 ： 一本鎖 （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号148の記載 ： （２）配列番号149の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 10 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号149の記載 ： （２）配列番号150の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 10 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号150の記載 ： （２）配列番号151の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 10 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D））トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号151の記載 ： （２）配列番号152の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ：4 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号152の記載 ： （２）配列番号153の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ：5 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号153の記載 ： （２）配列番号154の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ：5 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号154の記載 ： （２）配列番号155の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 25 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号155の記載 ： （２）配列番号156の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 14 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号156の記載 ： （２）配列番号157の情報 ： （i）配列の特徴 ： （A）配列の長さ ： 23 （B）配列の型 ： アミノ酸 （C）鎖の数 ： （D）トポロジー ： 直鎖状 （xi）配列番号157の記載 ： Detailed Description of the Invention                             Immunomodulatory peptide   The field of the invention is major histocompatibility complex (MHC) antigens.                             BACKGROUND OF THE INVENTION   The major histocompatibility complex (MHC) class II antigens are all characteristic of vertebrates. It is a cell surface receptor that integrates a heterogeneous immune response. Humans have three distinct MHC class I DR with I-antigen isotype, ie, about 70 different allotypes are known , 33 known DQs, and 47 known different allotypes The DP is Each person has 2-4 DR alleles, 2 DQ alleles , And two DP alleles.   MHC receptors (both class I and class II) are pathogens or other non-hosts By binding small protein fragments (peptides) of origin Yamarai, these peptides are used in the immune system. To the first step that is essential for immune recognition by presenting to regulatory cells (T cells) Involved. T cells recognize pathogenic substances in the absence of MHC presentation I can't. Cells expressing MHC class II receptors are called antigen presenting cells (APCs) Be done. APC is the encapsulation of pathogenic organisms and other foreign substances in endosomal vesicles. And then subject them to enzymatic and chemical degradation. By APC The heterologous protein taken is either partially degraded or "processed." Result in a mixture of “processed” peptides, some of which Bind to MHC class II molecules that are in transit. Once on the cell surface, MH The peptide bound to the C molecule is recognized by T cells.   MHC class II antigens consist of an α chain, a β chain, and a processed peptide. It is expressed on the surface of APC as a three-molecule complex. Most expressed on the cell surface Like a polypeptide, the α and β chains are both NH₂ Contains a short signal sequence at the end , Target both chains to the endoplasmic reticulum (ER). Class II α / β chain complex in the endoplasmic reticulum Associates with another protein called the invariant chain (Ii). With Ii Association (by blocking the peptide bond cleavage site of the MHC heterodimer ) Inhibits premature peptide capture and promotes stable α / β interactions to promote the above complex Body It is thought to direct subsequent intracellular distribution to endosome vesicles. End Within thesome, Ii is removed by processes that include proteolysis, which The peptide present in the endosome is exposed to the peptide bond Allow it to bind to a molecule. Class II / peptide complexes from endosomes to cells It is transported to the surface where it is used for recognition by T cells and subsequent activation of the immune response. Will be Class II MHC molecules are derived from exogenous (ingested) proteins Not only peptides, but peptides produced by the degradation of endogenous (self) proteins It also binds to Chid. The amount of each peptide species that binds to class II depends on its local concentration. And the species, as determined by its affinity for the binding cut of a given Class II molecule. Each allotype exhibits different peptide binding specificities.   At the beginning of fetal development, the mammal's immune system is "tolerant," and Petite is taught not to respond. The stability and maintenance of this system It is important to ensure that it does not produce an immune response against itself. Collapse of this system Destruction causes autoimmune symptoms such as diabetes, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis Rub Current technologies designed to manipulate the immune system to re-establish proper non-responsiveness include blockade. Protocol containing intravenous administration of synthetic high-affinity binding peptides as lytic peptides Have been installed.   Vaccination is by stimulating antibody-mediated and / or T cell-mediated responses Develops protective immunity to pathogenic organisms. Most current vaccination strategies still It uses relatively crude products such as attenuated or inactivated viruses. This Vaccines like these often give rise to both antibody-mediated and cell-mediated immunity. , It is not possible to modify the type of immune response that occurs. Furthermore, in many diseases However, the occurrence of the wrong type of response can result in an exacerbated condition of the disease. It                             Disclosure of the invention   In the studies disclosed in this application, approximately 70 known human MHC class IIDR genes have been identified. Six of the lotypes (HLA-DRI, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 Of the naturally processed peptide bound to) was characterized. these Peptides are derived from self proteins rather than exogenous proteins It was discovered. Some members of the self-peptide family have unexpected alterations. It was confirmed to have compatibility. That is, a certain self-peptide is a large number of HLA-DR May be combined with the group. This observation is widely accepted for MHC class II function. The idea is that each allotype directs binding to a different set of peptides. Contrary to the widely accepted notion of MHC class II function of Of. Furthermore, if not all of the self-peptides disclosed in this application Many bind class II molecules with relatively high affinity. These three characteristics, (1) self rather than exogenous, (2) degeneracy, and (3) high affinity Conjugates lead to autoreactivity like type I diabetes, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis. It suggests new avenues for the therapeutic intervention of characteristic pathologies. Furthermore, such a cure Therapy can be used to reduce transplant rejection.   In the therapeutic method of the present invention, the high affinity immunomodulatory self-peptide of the present invention is used. Modeled short peptides (preferably non-allelic restricted) were used in patient AP Introduced in C. Since the peptides of the present invention bind to various class II isotypes, , The type of tissue that determines the particular class II allele expressed by the patient. Kinds would be unnecessary. Individual peptides are not completely denatured, i.e. peptides Use peptide "cocktails" if they bind to a small number of alloteibs, but not all It may be useful. The cocktail confers overlapping binding specificities. Once AP Once inside C, the peptide binds to class II molecules with high affinity, which Block the binding to immunogenic peptides that cause the immune response that is characteristic of the condition. Hurt. The blocking peptides of the present invention are accurate carboxy tolerated during ontogeny. And, being self-peptides that retain the amino terminus, they are immunologically inactive Immune responses that can complicate treatment with non-self blocking peptides. It does not provoke an answer.   The peptide of the present invention is, for example, a solution of a solution containing one or more peptides. It may be introduced directly into the APC by intravascular injection. Instead, a large amount of blocking pepti APCs may be provided with a means of synthesizing the intracellular code. Fused to a blocking peptide sequence Encodes a targeting signal to the ER and / or endosome The recombinant gene is ligated to an appropriate expression control sequence and introduced into APC. Once inside the cell Once in, these genes direct the expression of the hybrid peptide. Target finger to ER Oriented peptides become classy as they are translated and assembled into heterodimers. It will bind to the α and β chains of II. The presence of high affinity binding peptides in the ER Prevents association of the α / β complex with the invariant chain and interferes with intracellular trafficking. Continued And the class II molecule / blocking peptide complex may be expressed on the cell surface However, since T cells are tolerized to this complex early in development, they elicit an immune response. Don't do it. The use of peptides with an ER retention signal also conjugates with peptides. May prevent class II molecules from leaving the ER. Instead, recombination Endosome targeting to peptides, which after synthesis directs them into endosomal compartments Give a signal and thereby also process internally within the endosome The ratio of the received peptide to the blocking peptide is shifted, and in the ER it binds to it. Binding of missing blocking peptides to class II molecules may be preferred. Any patient End users can also use one or more ER-directed peptides Used in combination with a peptide directed to the some, the peptide of the invention saturates in the ER. Undisguised α-β complex is then blocked by the endocytic pathway May be advantageous. The end result is also non-immunogenic class II / peptide Cell surface expression of the complex.   The use of class II non-restrictive high affinity binding peptides coupled to intracellular trafficking systems , Class II without causing the many side effects associated with current pharmacological strategies Allows specific down-regulation of a limited immune response. These technologies Skillful application of sucrose is an important advance in the treatment of autoimmune diseases and prevention of transplant rejection Is.   The intracellular transport system (dclivery system) of the present invention can also be used in animals such as human patients. Or prevention of commercially important mammals such as cattle, which are susceptible to diseases such as FMD. It can be used for a new method of inoculation. Such a system can be adjusted by the following adjustments. It can be engineered to produce the type of immune response required in a given situation. come. (A) peptide specificity for class I or class II MHC, (b) pep Targeting tide / protein length and / or sequences, and (c) intracellular organelles Use of a specific label to: In the system of the present invention, these peptides are Only It is produced and does not exist extracellularly that can stimulate antibody production by contact with B cells. And guarantee. This will reduce the immune response elicited by such vaccines. Limited to cell-mediated immunity, and thereby inappropriate or potentially harmful responses , For example, in human immunodeficiency, malaria, leprosy, and leishmaniasis Limits the immune response as observed with common vaccines targeting the causative organism To do. Furthermore, this T cell-mediated immune-restricted response is associated with immunogenicity. Based on Class I or Class II, depending on the length and characteristics of the peptide, or Or both. That is, MHC class I molecules are 8-10 residues in length. It binds favorably to peptides, while class II molecules, on the other hand, range from 12 to 25 residues in length. It is known to bind to the surrounding peptides with high affinity.   For immunization and treatment according to the present invention, the peptides of the present invention, namely naturally occurring human Containing an amino acid sequence identical to the section of the protein (ie, "self-protein") A purified preparation of the mu peptide can be used. Such a section has 10 to 30 residues. Length, the peptide binds to human MHC class II allotypes, preferably Binds to at least two distinct MHC class II allotypes (eg, about 70 Known DR allotypes, about 47 known DP allotypes, or about 33 known DR allotypes Any of the DQ allotypes). Portion of the above peptide corresponding to self-peptide section Are referred to herein as "self peptides". "Purified sample" means a polypeptide component Means a preparation of which at least 50% (by weight) consists of the peptide of the invention. Suitable In certain applications, the peptides of the present invention may comprise at least 60% (more preferably 80%) of the purified preparation. ) Occupy. The naturally-occurring human protein is preferably HLA-A2 (widely defined below. HLA-A29, HLA-Bw62, HLA-C, HLA-DRα, HLA-DRβ, in-barrier Chain (Ii), Igκ chain C region, Ig H chain, Na⁺/ K⁺ ATPase, transferrin , Transferrin receptor, calcitonin receptor, carboxypeptidase E, MET kinase-related transforming protein, guanylate-binding protein, mannose Binding protein, apolipoprotein B-100, cathepsin C, cathepsin S, gold Genus proteinase inhibitor 1 precursor, or heat shock cognate 71KD tamper The MHC (dominant) class I or II antigenic protein, or , Any other human protein that occurs on the cell surface of APCs. self Bae The peptide is preferably according to the following structural form (motif): At the amino-terminal residue of the above section, or at the first matching position (I) within the 12 residues, Charged residues (ie Lys, Arg, or His) or large hydrophobic residues (ie Phe ) Trp, Leu, Ile, Met, Tyr, or Pro), and at the I + 5 position, hydrogen bond The residue (ie Tyr, Asn, Gln, Cys, Asp, Glu, Arg, Ser, TrP, or Thr) To have. In addition, the peptide also has sparse positions at I + 9, I + 1, and / or I-1. Aqueous residue (ie Phe, Trp, Leu, Ile, Met, Pro, Ala, Val or Tyr) (+   The symbol indicates the position to the right or the carboxy terminus, and the-symbol indicates the left or
I Represents the position toward the amino terminus). Typical examples of peptides of the invention are: HLA-A2 residues 31-40 (ie TQFVRFDSDA) or residues 106-115 (ie DWRFLR GYHQ), or residues 107-116 of Ii (ie, RMATPLLMQA), or Table 1-1 below. A sequence that is essentially identical to any one of the sequences shown in 0.   Although the treatment and immunization methods of the invention also encode the peptides of the invention, Nucleic acid molecule encoding less than all but the entire sequence of a self protein (RNA or DNA) can also be used. The nucleic acid is a self-protein (or Or other proteins), signal peptides derived from Sequences may optionally be included, but are preferably specific for binding to MHC class II molecules. It encodes a non-important part of a self protein other than the self peptide. Distribution A series of sequences binds to a polypeptide and distributes it intracellularly (from organelle to organelle, or Is an amino acid sequence that functions to control the rightward movement to the cell surface). Like this A variety of distribution-related sequences make the peptide into ER, lysosome, or endosome. Circulate and signal peptide (the amino acid sequence that directs the protein into the ER during translation) Column), ER-retaining peptides such as KDEL, and lysosomal targeting fingers such as KFERQ and QREFK. Peptides and four residues selected from K, R, D, E, F, I, V, and L are on one side of Q Containing the pentapeptide adjacent to. Examples of signal peptides useful in the present invention Are essentially identical to peptides of MHC subunits such as class II α or β A signal peptide, for example, a MHC class IIα signal peptide has the sequence  Included in MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA. Encoded by the nucleic acid of the invention If the signal peptide is a part of the signal peptide, it will cause the polypeptide to flow to the ER. A portion of the above specific 25-residue sequence (eg, at least Only 10 amino acid residues) need to be included. In a preferred embodiment, the nucleic acid of the invention is , The second self-peptide and the second distribution sequence (the first self-peptide and the first distribution (Which may be the same as or different from the sequence), with additional self-peptides and It may also code distribution sequences. In yet another variation of this aspect of the invention, the self A peptide sequence (or multiple self-peptide sequences arranged in tandem) is essentially It is linked to the intact Ii polypeptide by a peptide bond, which then binds to the class When the II molecule is distributed from the ER to the endosome, it carries the self-peptide sequence together.   The nucleic acids of the invention also include expression control sequences (transcription and translation initiation signals, promoters). , And enhancer, which regulate the expression of the coding sequence with which they are associated. Enabling and / or optimizing sequences) and / or phage, or Senior virus, adenovirus, Epstein-Barr virus, or reto It may also include an attenuated, non-proliferating, detoxified form of the rovirus.   The peptides and nucleic acids of the present invention are suspended directly in a pharmaceutically acceptable carrier. Or encapsulated in liposomes, immunostimulatory complexes (ISCOMS) or their analogues By doing so, it can be prepared for treatment. Such preparations can be used by multiple patients. The APC of the above is contacted with the therapeutic preparation to introduce the peptide or nucleic acid into the above APC. Are useful for inhibiting the immune response in human patients by.   The present invention also includes cells containing the nucleic acid molecule of the present invention (eg, tissue culture cells, or B cells in the human body or cells like APC) are also included. Culture containing the nucleic acid of the present invention The cells are under conditions that allow the cells to express the peptide from the nucleic acid molecule. It can also be used for the production of the peptide of the present invention in a method including culturing in.   Here we present a method to identify non-alleletically restricted immunomodulatory peptides. It The method includes the following items.   (A) Fractionation of a mixture of peptides eluted from the first MHC class II allotype Then   (B) identifying self-peptides from this mixture, and   (C) Whether the self-peptide binds to the second MHC class II allotype To inspect. Such binding is due to non-allelic restriction of the self-peptide Exemption It is an indication that the peptide is an epidemiological regulatory peptide.   In another embodiment, the invention includes a method of identifying potential immunomodulatory peptides. This method includes the following items.   (A) providing a cell expressing an MHC class II molecule on its surface,   (B) introducing a nucleic acid encoding a candidate peptide into the cell, and   (C) The ratio of class II molecules that bind to the relevant peptide in the presence of the above nucleic acid First, it is determined whether or not the binding ratio in the absence of the nucleic acid is increased. Such an increase indicates that the candidate peptide is a potential immunomodulatory peptide. It is shown.   The invention also includes a method for identifying potential immunomodulatory peptides, which comprises The law includes the following:   (A) providing a cell expressing an MHC class II molecule,   (B) by introducing a nucleic acid encoding a candidate peptide into the cell,   (C) the level of MHC class II molecule on the cell surface is in the presence of the nucleic acid, Whether there is a decrease compared to the levels of MHC class II molecules in the absence of the above nucleic acids To measure. Such a decrease indicates that the candidate peptide is a potential immunomodulatory peptide. It is a display that it is.   The present invention also provides a method for identifying non-alleleically restricted immunomodulatory peptides. Method, which includes:   (A) Providing cells that retain the first MHC class I or class II allotype Cells such as human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis B virus. Virus, measles virus, rubella virus, influenza virus, mad virus , Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis ( B. pertussis), P1asmodium, Schistosoma, Leishmania, Trypanasoma, Or cause human or animal diseases such as Mycobacterium lepre. Infectious pathogen),   (B) eluting a mixture of peptides that bind to the first MHC allotype of the cell ,   (C) A candidate peptide was confirmed from the mixture, and such a candidate peptide was original A fragment of a protein derived from the body, and   (D) Test whether the candidate peptide binds to the second MHC allotype. This Such binding is due to the non-allelic restricted immunostimulatory peptide of the candidate peptide described above. It is an indication that it is Cido. Coat such immunogenic fragments of pathogen proteins. Nucleic acid can be used in a method of inducing an immune response in human patients. The method involves the introduction of nucleic acid into the patient's APC.   The therapeutic methods of the present invention present problems associated with conventional methods involving intravenous injection of synthetic peptides. To solve. (1) Expressed within the entire population due to allele specificity Can bind all or most of the various class II allotypes with high affinity The peptide has not been previously determined. (2) Peptide administered intravenously The half-life of is generally extremely low, requiring repeated administration with high inconvenience and expense, (3) In this type of vehicle, the inhibitory peptide is a class II molecule, which is the cell surface. However, it is necessary to remove the naturally-occurring peptide that occupies the binding gap of This measure is now believed to be a very inefficient process, and ( 4) If the inhibitory peptide utilized is itself immunogenic, then In some cases, a harmful immune response may be promoted.   Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and claims. Will                                 Detailed description   First, the drawings will be briefly described.                                   Drawing   Figures 1A-1F show papain digested HLA-DR1, DR2, DR3, DR4, DR7 and D, respectively. Chromatographic analysis of the peptide pool extracted from R8, Thus, the peptide species of each HLA-DR as detected are illustrated. 210 nm and 27 UV absorption for both 7 nm has retention windows between 16 and 90 minutes (retentio n window) shown at full scale of 500 mAU (each mark represents 2 minutes) .   Figure 2 is a representative mass of the size distribution of isolated HLA-DR1-bound peptides. Analysis. Peptide mass measured at 100 mass units was determined by mass spectrometry Plotted against the number of defined isolated peptides. The length of the peptide is Calculated by dividing the experimental mass value by the average amino acid mass of 118 Daltons.   FIG. 3 represents two minigenes of the invention, in which the leader chain of the HLA-DRα chain. Peptide blocks 15 residues (A) or 24 residues (B) of human invariant chain Ii It is linked to the amino acid terminus of the peptide fragment.                                 Experimental data Method I. Purification of HLA-DR antigen   HLA-DR molecule was transformed with homozygous Epstein-Barr virus From human embryonic B lymphoblastoid lines, DR1 from LG-2 cells, DR2 from MST cells, DR3 from WT20 cells, DR4 from Pries cells, DR7 from Mann cells, and DR8 from Purified from 23.1 cells. All of these cell lines are publicly available. Cell expansion Breeding, cell harvesting conditions, and protein purification were as previously described (Go rga, J. et al., 1991). Briefly, 200 g of each cell type was added to 10 mM triglyceride. Su-HCI, 1 mM dithiothreitol (DDT), 0.1 mM phenylmethylsulfonyl It was resuspended in fluoride (PMSF), pH 8.0 and lysed with a Thomas homogenizer. The nuclei were removed by centrifugation at 4000 xg for 5 minutes and the pellet was washed until the supernatant was clear. The pellet operation was repeated. All supernatants were collected and the membrane fraction was 40 at 175,000 x g. Collected by centrifugation for minutes. The pellet was then 10 mM Tris-HC1, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 4% NP-40. The undissolved membrane material is 175, After centrifugation at 000 xg for 2 hours, the supernatant fraction soluble in NP-40 was used for immunoaffinity purification. Was used.   The detergent-soluble HLA-DR was loaded onto a LB3.1-protein A column (Gorga et al. Bound to (above) and eluted with 100 mM glycine, pH 11.5. After elution, sample Immediately neutralize by adding Tris-HC1, then use 10 mM Tris-HC1, 0.1% deoxycotyl. It was dialyzed against acid (DOC). LB3.1 monoclonal antibody is non-polymorphic HLA-DR It recognizes the conformational determinants present on the α chain and, in this way, all the HLA-DR alleles. Recognize type.   The transmembrane region of the DR molecule was removed by papain digestion resulting in water solubility. The molecule was further subjected to gel filtration on an S-200 column equilibrated with 10 mM Tris-HC1, pH 8.0. Therefore, it was purified. The purified DR sample was concentrated by ultrafiltration and the yield Was measured by BCA assay and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. It was II. Extraction and fractionation of bound peptides   The water-soluble, immunoaffinity purified Class II molecules are 25 mM N-morpholinoethanesulfonic acid (MES) PH 6.5 in high performance size exclusion chromatography Purify by chromatography (SEC) at a flow rate of 1 ml / min to remove any remaining aliquots. A small amount of contaminants was also removed. Then Centricon Micro Concentrator (Molecular Weight Separation 10,0 00 Daltons (Amicon) to a protein sample (final volume 100-200 μl) (Between) and spin concentration, the cells were sequentially washed with SEC buffer and 10% acetic acid. peptide The pool was prepared by adding 1 ml of 10% acetic acid from the selected class II allele product for 15 minutes. During the extraction at 70 ° C. These conditions allow bound peptides to be removed from class II molecules. Sufficient to release, yet moderately moderate to avoid peptide degradation . The peptide pool was separated from class II molecules after centrifugation through a centricon concentrator. Separated and the flow-through fraction contained the previously bound peptide.   The collected acid-extracted peptide pool was separated by Savant Spe Concentrated to a volume of 50 μl in ed-Vac. Peptides are microbore C-18 reverse phase chroma The following non-linear density gradient protocol was run on a topography (RPC) column (Vydac). , Separated at a constant flow rate of 0.15 ml / min: 0-63 min, 5% -33% buffer B; 63-95 Min, 33% -60% buffer B; 95-105 min, 60% -80% buffer B, where buffer A Is 0.06% trifluoroacetic acid / water, buffer B is 0.055% trifluoroacetic acid / water. It was cetonitrile. Chromatographic analysis uses multiple UV wavelengths (210, 2 54, 277, and 292 nm) at the same time, and prior to mass and sequence analysis, It enabled photometric measurement. Figure 1 shows each of the 6 DR peptide pools analyzed. The chromatograms for each are shown. The collected fractions were then Analysis and analysis by Edman sequencing. III. Analysis of peptides   The spectrophotometric determination of the peptide during RPC is based on the amino acid composition (aromatic amine No. acid contribution), and the screener for subsequent characterization. It is used as a ring method. Appropriate fractions collected during RPC separation were nnegan-MAT LaserMat matrix-based laser desorption mass spectrometer (MALD) Was used to determine the individual masses for the quantitatively predominant peptides. Collected 1% -4% of the collected fractions with matrix (1 μl of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) Mixing achieved mass determination of the extracted peptides. This amount for HLA-DR1 The result of the analysis is shown in FIG. Next, the selected peptide sample is subjected to automated Edman degradation. ABI 477A Protein Sequencer (Applied Bios Finnigan-MAT TSQ 700 with electrospray ion source Combined with the carboxy-terminal confirmation provided by mass spectrometry using a quadrupole mass spectrometer. It was sequenced together. This parallel analysis is based on the peptide composition and sequence. Guarantee full confirmation of. Proteins stored in the SWISS-PROT database Matching peptides to sequences is done using the FASTA computer database search program. Used and done. Table 1-10 provides the results of this sequence analysis for each of the DR molecules examined. It is the fruit. result 1. HLA-DR1.   HLA-DR1 used in this study was obtained by crystallographic analysis of the substance and binding peptide. It was solubilized with papain so that it could be used for analysis. The peptide bound to DR1 And fractionated using RPC (Fig. 1). After the second extraction / RPC separation, The absence of any detectable peptidomimetics demonstrates the quantitative extraction of peptides. It was Amino acid analysis of the extracted peptide pool (ABI 420A / 130A Derivatizer -/ HPLC) corresponds to the size distribution determined by mass spectrometry (see Figure 2) Assuming that the molar equivalents of binding peptide completely occupy the purified DR1, 70-8 It was found to be 0% yield. Obtained from DR1 extraction of several separate preparations The RPC profile (elution diagram) was reproducible. In addition, surfactant-soluble, or The elution profiles of papain-solubilized DR1 were similar. Peptide is soluble in detergent, And in papain-solubilized DR1 to confirm that they are in fact Analysis and Edman sequencing analysis were performed on the corresponding fractions from the two preparations. quality The amounts and sequences were found to match.   Average size 1 using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry (MALD-MS) Unique quality contained within the eluted peptide pool of DR1 with a pattern of 8 to 15 residues We identified 111 species with abundance (Fig. 2). Within the molecular weight range of 13-25 residues, further 500 The presence of the above mass species was detected. However, the signal is not sufficient and It was not possible to confidently assign each mass. Corresponds to a single RPC peak Detection of multiple species with different masses in fractions suggesting co-elution of peptides To do. To further characterize these peptides, samples were prepared by electronic spraying. ー triplo quadruple mass spectrometer equipped with ion source (ESI-MS ) And automated Edman degradation microsequencing in parallel (Lane et al., J. ． Prot. Chem. 10: 151-160 (1991)). To combine these two techniques Thus, the amino acids at both the N- and C-termini of the peptide (s) contained in a single fraction The important confirmation of Obtained for 20 peptides isolated from DR1 Sequence and mass data are listed in Table 1. All confirmed peptides Are assigned to protein regions stored in the SWISS-PROT database Have been fully confirmed.   Surprisingly, 16 of the 20 sequenced DR1 bound peptides In the region of invariant chain (Ii) associated with self-protein HLA-A2 and class II It was 100% identical and represented at least 26% of the total extracted peptide mass. These isolated peptides vary in length and are truncated at both the N- and C-termini. And suggests the following: 1) After binding to DR1, antigen processing is at both ends Happens in. Or 2) Is the class II molecule a pool of indiscriminately generated peptides? Bind to these antigens. The amount obtained from microsequencing of the peptides was HLA-A2 (Fig. 1) and And Ii account for at least 13% of all DR1 bound peptides, respectively. Suggests.   A more surprising finding is that it also binds to HLA-DR and is 100% homologous to the HLA-A2 peptide. Regardless of the peptides derived from cells that do not express HLA-A2 protein is there. Apparently, this peptide has a region of homology with a region of the HLA-A2 protein. It is derived from the containing protein. Therefore, for the purpose of clarifying this, “HLA-A2 The term "protein" means HLA-A2 protein itself and HLA-DR derived from HLA-A2. 10 or more amino acids long with 80% or more homology to the binding peptide It is meant to include any naturally-occurring protein containing regions. As well , "HLA-A2 Peptide," as defined broadly in this application, for any HLA-A2 peptide. Whether it is a protein, it means a peptide derived from it.   The other four peptides identified in the DR1 study are two self-proteins , Transferrin receptor, and Na⁺ / K⁺ ATPase and one exogenous tag Fetuin of bovine serum, which is a protein (used to enhance the medium in which the cells are soaked Present in the serum). Each of these peptides It accounts for only 0.3-0.6% of the total DR1 population and is more than HLA-A2 or Ii peptides. Is also significantly less. Class II molecules enter from the outside during transfer to the cell surface. Crosses the pathway of endocytic vesicles. Membrane protein to be recycled, and And endocytosed uptake of exogenous proteins are both common pathways. Move the road. Therefore, HLA-A2, transferrin receptor, Na⁺/ K⁺ ATPase, And peptides derived from bovine fetuin all encounter DR1 similarly. It Ii associates with nascent class II within the endoplasmic reticulum (ER) (Jones et al., Mol. I. mminol. 16: 51-60 (1978)), Class II / Ii complex in the endocytic fraction Blocks antigen binding until arrival (Roche and Cresswell, Nature 345: 615-61). 8 (1990)), where Ii undergoes proteolysis (Thomas et al., J. Immunol. 140: 2670-2675 (1988); Roche and Cresswell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3150-3154 (1991)), thus allowing the progression of peptide binding. Maybe First, the Ii peptide that binds to DR1 appears to have been produced at this stage.   Prepare synthetic peptides corresponding to 5 of the peptides reported in Table 1 , Their relative binding affinities for DR1 were measured. Influenza A red blood The hemagglutinin peptide (HA) 307-319 was previously a high affinity HLA-DR1 restricted peptide. (Roche and Cresswell, J. Immunol. 144: 1849-1856 (19 90); Rothbard et al., Cell 52: 515-523 (1988)), selected as a control peptide It was "Empty (EmPty)" purified from insect cells expressing recombinant DR1 cDNA DR1 has higher binding capacity and 10-fold faster association activity than DR1 isolated from human cells. Show mechanics Therefore, it was used for binding experiments (Stern and Wiley, Cell 68: 465-477 (1992)). You It was found that all synthetic peptides competed well (Ki <100 nM) for HA peptides. Issued (Table 2). In the first approximation, Ii 106-119 peptide was all measured Has the highest affinity among the competitor peptides of It was equivalent to the value given. In addition to Ki measurement, these peptides were analyzed by SDS-PAGE. Resistant to SDS-induced “empty” DR1 α-β chain dissociation, Suggest a stable peptide bond (Sadegh-Nassori and Germain, Nature 353: 167). -170 (1991); Dornmair et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54 : 409-415 (1989); SPringer et al., J. et al. Bio1. Chem. 252: 6201-62-7 (1977) ). Two control peptides, β₂ m 152-64 or Ii 96-110 are both SDS-inducing Does not tolerate resistance to DR1 strand dissociation and competes with HA 307-319 for binding to DR1 I could not do it. Both of these peptides are putative binding models reported in this study. Lack of chief (see below).   Core antigenic determinants of some naturally processed peptides (minimal The putative DR1 binding motifs based on the (length) sequence arrangement are shown in Table 3. This table The peptides listed in Table 1 below are those that were determined in this application for HLA-DR1. In addition to, confirmed by other researchers and known to bind DR1 Peptides are also included (reference # 6 in this table is O'Sullivan et al., J. Immuno). 1.145: 1799-1808, 1990; reference # 17 is Roche & Cresswoll, J. et al. Immunol. 1 44: 1849-1856; Ref. # 25 is Guttinger et al., Inten. Immunol. 3: 899-9 06, 1991; reference # 27 is Guttinger et al., EMBO J. et al. 7: 2555-2558, 1988; and And reference # 28 is Harris et al., J. Am. Immunol. 148: 2169-2174, 1992. . ). The fundamentally important residues proposed in the above motif are as follows. The positive charge group is located in the first position, and in this application, the index position (I The hydrogen bond donor is located at I + 5 and the hydrophobic residue is located at I + 9. Furthermore, hydrophobic residues are often found at I + 1 and / or I-1. From DR1 All sequenced, naturally processed peptides have this motif. (With the exception of HLA-A2 peptide 103-116, which lacks residues I + 9). Estimated mochi F is not in a well-defined position with respect to the first amino acid, Due to the irregular length of the binding peptides, as was done for class I molecules, It is not possible to infer motifs from the sequences of peptide pools (Falk et al ., Nature 351: 290-299 (1991)). li 96-110 peptide, ie used in binding experiments The negative control peptide given has the I and I + 5 motif residues in its sequence, It lacks the 8 additional amino acids found in li 105-118 (Table 3C).   Thirty-five previously described DRI-binding synthetic peptides (O'Sulllvan et al.  al., J. Immunol. 145: 1799-1808 (1990); Guttinger et al., Intern. Immun ol. 3: 899-906 (1991); Hill et al.,J． Immunol. 147: 189-197 (1991); Gut tinger et al., EMBO J. 7: 2555-2558 (1988); Harris et al., J. Am. Immunol., A comparison of the sequences of 148: 2169-2174 (1992)) also supports this motif. Of the above 35 synthetic peptides, 21 (60%) have the above exact motifs, 9 species (30%) include single shift (sllift) at I or I + 9 position, and the remaining 5 species (10%) have a single substitution at the I position (Table 3B and C). What is exciting is that In the peptide, the city charge at position I is always replaced with a larger hydrophobic residue. (Table 8C). Pocket structure that can provide convenience for this exact replacement Have been described as class I molecules (Latron et al., Porc. Natl. Acad. Sci. U. SA88: 11325-11329 (1991)). Within the other 8 amino acid motifs above, or Although their contribution in peptide length has not been fully evaluated, these peptides May be compensating for rearranged / lost residues in the bond shown by tide . The remaining 117 peptides drawn in these studies did not bind to DR1. These peptides are not included in Table 3). (85%) show that they do not contain the DR1 motif proposed in this application . Of the remaining 18 peptides (15%) that do not bind to DR1 but contain the motif Six species (5%) are known to bind to other DR allotypes. 12 kinds left Pebzido may interact adversely with other sites that interfere with binding .   I-A^bMice, which bind to the class II antigens of mice called I-E^bThe exact results observed in previous studies on five peptides that bind to In contrast to N-terminal splitting (Rudensky et al., Nature 3565: 622-627 (1991)) , The peptide that binds to DR1 is heterogeneous at both the N- and C-termini. It The peptides that bind to class I molecules are predominantly 9-mers, but Illuminally (Van Bleek and Nathenson, NatUre 348: 213-216 (1990); Rotzschke e tal., Nature 348: 252-254 (1990); Jardetzky et al., Nature 353: 326-329 ( 1991); Hunt et al., Science 255: 1261-1263 (1992)), class II peptides Larger size and a high degree of heterogeneity in both length and site of truncation And the processing mechanism for class I and class II peptides is I am contemplating different things. Furthermore, this result shows that Class II processing is , A stochastic event, and DR allotypes vary from a complex and ragged mixture. Suggesting the possibility of binding to a peptide of length. The above heterogeneity observed May simply be to prevent further degradation of the bound peptide. Like this Thus, class II molecules do not protect the bound peptides from being completely degraded. Play an active role in antigen processing by (As previously proposed (Donermeyer and Allen, J. Immunol. 142: 1063-1068. (1989))). Alternatively, those that bind to DRI are dominated by the 15-mer (MALD-MS And the yield of the sequenced peptide). It may be the result of trimming of the peptide. In any case, it can be detected The absence of significant amounts of peptides shorter than 13 residues and longer than 25 residues is Suggesting that there is a unique length restriction on the binding mechanism of the antigen or the processing of the antigen. ing. Peptides that bind DR1 are endogenously synthesized proteins, especially MHC The predominance of those derived from proteins associated with is implicated in the development of self-tolerance. Relatedly, it may be the result of the evolution of self-peptide display mechanism. II. Other HLA-DRR molecules   Natively processed and eluted from each of DR2, DR3, DR4, DR7 and DR8 The amino acid sequences of these peptides are shown in Table 4-8, respectively. Table 9 shows the wild type The amino acid sequence of DR1 from another cell line that has no Ar but has an A2-like peptide attached. The columns are shown. Table 10 shows DR4 and DR11 min expressed in cells derived from human spleen. The amino acid sequence of the peptide eluted from the offspring is shown. These data show that exogenous pep It demonstrates that the self-peptides that bind are highly predominant compared to Tide. This Data, and also shows that the A2 and li peptides occur repeatedly. III. Peptide delivery   Genetic makeup   Genetic for In Vivo Administration of Genes Encoding Immunomodulatory Peptides of the Invention The following operations are performed to prepare the composition.   Using overlapping synthetic oligonucleotides, the leader sequence shown in Figure 3 was used. The minigene of the peptide / blocking peptide was added to human HLA-DRα and invariant chain Generated by PCR amplification from the cDNA template. These minigenes are Ii peptides The fragment KMRMATPLLMQALPM (ie li_Fifteen) And LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM (That is,Ii ₂₄ ) Code. The resulting construct is the plasmid pGEM-2- α-li_Fifteen, And pGEM-2-α-li_{twenty four}In pGEM-2 (Promega) to form It should be cloned with an upstream T7 promoter for use in the in vitro transcription / translation system described below. Was heard.   Each minigene was then transduced from the pGEM-2 derivative for in vivo expression. PHβ actin-1-neo (neo) (Gunning et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4831) plus being subcloned during Mid pH β-actin-α-Ii_FifteenAnd pHβ actin-α-Ii_{twenty four}Was formed. Inserted above In this way, the isolated minigene is constitutive / strong in human β-actin bromo. Is expressed in vivo from the target. In addition to this, the minigene A recombinant vector of vaccinia virus from GEM-2 derivative, pSC11 (S.Chakraba rti et al., (1985) Mol. Cell. Biol.Five, 3403-3409) Plasmid pSCll-α-Ii_FifteenAnd pSCll-α-Ii_{twenty four}Was formed. In the genome of the virus After recombination into the_7.5Expressed from promoter Be done.Intracellular trafficking signal added to peptides   A short amino acid sequence directs proteins into specific subcellular compartments It can act as a signal to direct. For example, a hydrophobic signal Peptides are found at the amino terminus of proteins destined for the ER, but The mino acid sequence KFERQ (and other closely related sequences) is used to bind intracellular polypeptides. It is known to direct to the sosome, while other sequences entrap the polypeptide. Directed to the dosome. Furthermore, the peptide sequence KDEL is a retention signal for the ER. It has been shown to work. Each of these signal peptides, or In combination, the immunomodulatory peptide of the present invention can be used for desired distribution. I can do it. For example, a given immunomodulatory peptide linked to a signal peptide for ER targeting. The peptide-encoding construct directed the peptide to the ER where it was assembled. Until it binds to class II molecules and prevents intact Ii binding that is essential for circulation . Alternatively, the ER retention signal on the peptide is Constructs can also be made that help prevent separation. If you Alternatively, if the peptide of the invention is directed to the endosomal compartment, this will If the variant chain is replaced with a processed peptide, a large amount of The presence of a peptide, which results in its incorporation into the class II complex, Is a high affinity peptide of the present invention rather than a derived and potentially immunogenic peptide. Increase the likelihood of Potential use of peptides of the invention for class II integration Is increased by linking the peptide to an intact Ii polypeptide sequence. Rukoto can. Ii is known to distribute class II molecules to endosomes Therefore, the hybrid Ii is one or more copies of the peptide of the invention. Will be carried with the class II molecule. Once inside the endosome, Ibrid Ii is degraded by the normal endosomal process, and Multiple copies of tide or a molecule similar thereto and open binding of class 11 And create a gap. DNA encoding an immunomodulatory peptide containing a targeting signal Are produced by PCR or other standard genetic engineering or synthetic techniques. The ability of these peptides to associate with DR molecules is demonstrated in vitro and in vivo as described below. Be analyzed.   The invariant chain prevents class II molecules from binding peptides within the ER. It has been proposed that it may contribute to heterodimer formation. Prevent this meeting Any stopping mechanism will increase the efficiency of class II blockade. Follow A site on Ii that binds to a class II heterodimer, or a hetero that binds to Ii. Peptides corresponding to sites on the α or β subunits of the dimer are responsible for this association. Can be used to prevent and thereby disrupt the functioning of MHC class II. ItIn vitro assembly   Cell-free extracts are routinely used to express eukaryotic proteins (Kreig, P. & Melton, D. (1984) Nucl. Acid Res. 12, 7057; Pelham, II. An. d Jackson, R. (1976) Eur. J. Biochem.67, 247). Specific mRNA is a virus Transcribed from a DNA vector containing an RNA polymerase promoter (Melton, D . et al. (1984) Nucl. Acid Res.12, 7035), Micrococcal nuclease Is added to the cell extract treated with.³⁵The addition of S-methionine and amino acids It initiates the translation of exogenous mRNA, resulting in the production of labeled proteins. Tampa The proteins are then analyzed by SDS-PAGE and detected by autoradiography. Is done. Processing events such as signal peptide cleavage and core glycosylation Is initiated by the addition of microsomal vesicles during translation (Walter, P ． and Blobel, G. (1983), Meth. Enzymol.,96, 50), these events are SDS-P Tested by changes in protein mobility in AGE gels.   Peptides containing signal peptide sequences are correctly processed and The ability of the ant chains to compete for class II binding in the ER is determined by the in vitro system described above. It is essay. In particular, the DRI α- and β-chains described above, and invariant chain peptides The constituents of tide are transcribed into mRNA, which in the presence of mammalian microsomal membranes. Will be translated. Association of DR heterodimer with Ii, antiserum against DR and Ii It is measured by the immunoprecipitation test by MRNA encoding the peptide of the present invention In addition to translation reaction, co-immunoprecipitation when measured by SDS-PAGE on Tris-Tricine gel As a result of the appearance of peptides that co-immunoprecipitate at the same time as the level of Ii Should be. These experiments show that Ii chain binding in the ER of a given blocking peptide Providing a rapid assay system for determining potential rivality as a competitive agent Will Proved to be able to compete effectively with Ii in this cell-free system These peptides of the invention, which are present in the present invention, are then applied to intact cells as described below. It can be inspected in advance.In vivo assembly   Human EBV-transformed B cell lines LG-2 and HOM-2 (for HLA-DR1 Homozygous) and mouse B cell hybridoma LK35.2 was chained to 50 μg pHβ actin-α-Ii_FifteenOr pHβ actin-α-Ii_{twenty four}, Or (as a control )_PHβ actin-1-neo, electroporation (150 mV, 960 μF, cuvette 0.2 cm width). After electroporation, above The cells are cultured in G418-free medium until complete recovery (about 4 days). Mothers The group then G41 until a transformant population expressing neomycin resistance is obtained. 8 Sort (about 1-2 months). Resistant population subcloned by restricted dilution However, the genetic identity of the stable transformants was determined by PCR amplification of the mRNA expression of the blocking peptide. Is determined.   LG-2 and HO carrying mini-gene of blocking peptide or negative control vector M-2 stable transformants under large-scale culture conditions until 20 g of pelleted cell mass is obtained. Incubate. The HLA-DR expressed by each transformant was purified and the amount of bound peptide Analyze (both intracellular and extracellular) as described above. Of total bound peptides Indication of intracellular delivery of immunomodulatory peptides if successful in reducing diversity Becomes   Another cell-based assay involves blocking peptide minigenes, or negative control. Use stable transformants of LK35.2 cells carrying the control vector. These cells Is used as an APC in a T cell proliferation assay. Each transformant Existence of dilution of hen egg lysozyme (HEL) and HEL-specific T cell hybridoma Incubate for 24 hours in the presence. Streamwise activation of T cells present in each assay (lymphokine (Measured by in-line production) was performed using CTLL2, a commercially available lymphokine-dependent cell line. hand,³H-thymidine incorporation assay (Vignali et al. (1992) J.E.M.175: 925- 932). The transformant expressing the blocking peptide is a HEL-specific T cell Successful proof of reduced ability to present to hybridomas will result in immune regulation. It would be a confirmation of the intracellular delivery of node peptides. Human TK^-Cell line 143 (ATCC ) Cells of vaccinia virus (WR strain, TK⁺) (ATCC), 2 o'clock after infection In between, pSCll-α-Ii_Fifteen, Or pSCll-α-Ii_{twenty four}Infected cells with calcium phosphate It is introduced by the precipitation method. TK ~ recombinant is 25 μg / ml bromodeoxy Select using lysine. Recombinant plaques require the presence of minigene DNA, Screen by PCR. Recombinant virus produces pure cloned virus strains To achieve, clone with 3 rounds of limiting dilution.   In an experiment similar to the transfection experiment described above, the minigene, or EBV transformation with recombinant vaccinia virus encoding vector only Infected large scale cultures of the human B cell line, LG-2, and HOM-2. Feeling After staining, HLA-DR is purified and the amount of bound peptide is analyzed as described above. Join Reduced complexity of the peptide population and marked increase in the relative amount of bound Ii peptides Confirms that vaccinia can deliver the blocking peptide to human APCs.   The same recombinant vaccinia virus encoding a minigene or vector It can be used to infect mice undergoing experimentally introduced autoimmunity Ah Many such models are known, and Kronenberg, Cell 65: 537-542 (1 991).Delivery of synthetic peptides or minigene components by liposome   Liposomes serve as drug carriers and, more recently, in malaria in humans. It has been successfully used as a safe and powerful auxiliary strategy for Kuching injection (Frie s et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 358). Enveloped liposo Incorporates soluble proteins and transports these antigens to cells for in vitro And CD 8 both in vivo⁺Results in a mediated cytolytic (CTL) response ( REddy et al., J. Immunol. 148: 1585-1589, 1992; and Collins et al., J. Imm. unol. 148: 3336-3341, 1992). In this way, the liposomes will be loaded with synthetic peptides. It may also be used as a vehicle for transportation into the APC.   Harding et al. (Cell (1991) 64, 393-401) have reported that One of the two intracellular Class II loading compartments, That is, targeting to early endosomes and / or lysosomes is It can be achieved by changing the film composition of. That is, acid sensitivity Liposomes direct their contents to early endosomes, while they are acid-resistant. Liposomes have been found to deliver their contents to lysosomes. This Similarly, when the peptide of the present invention is desired to be delivered to endosomes, Acid-tolerant liposomes and, if delivery to lysosomes is desired, Sex liposo Will be taken into account.   Liposomes are prepared by standard detergent dialysis or dehydration-rehydration methods. Be done. For acid-sensitive liposomes, dioleoyl phosphatidyl ethano Luamine (DOPE) and palmitoyl homocysteine (PHC) are used, while , Dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC) and dioleoyl phosphatidyl Dilserine (DOPS) is used in the preparation of acid resistant liposomes. Ten^-FiveTotal fat in moles Dry the quality (DOPC / DOPS or DOPE / PHC, 4: 1 molar ratio) and remove 0.2 ml HEPES buffer. Hydrated in buffered saline (HBS) (150 mM Nacl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES pH 7.4) And sonicate. 1 M octylglut in a lipid suspension in 0.1 ml HBS. Add coside to solubilize. The peptide to be encapsulated was treated with 6 mM peptide in 20% HBS. Add to 0.2 ml of tide. The mixture is then frozen, lyophilized overnight and rehydrated. To do. These liposomes were treated with chymotrypsin to generate surface bound pep Digest all tide. Cell lines transformed with liposomal EBV (as described above) Delivery to cells will be achieved by incubation at 37 ° C for 12-16 hours . HLA-DR was purified from liposome-treated cells and the bound peptides were Is analyzed in this way.   Alternatively, liposomes can be formulated with the DNA minigene constructs of the invention to  Used to deliver the above components to APC in vitro or in vivo.   Human immunization is a joint committee of Johns Hopkins University for clinical testing. (The Johns Hopkins University Joint Committee for Clinical Investigatio n), and the United States Armed Forces / Physician's Office / Human Subject R esearch Review Board of the Office of the Surgeon General of the U.S. Ar my)) (Fries et al. (1992), Proc. Natl. Aca. d. Sci. U.S.A. 89: 358-362) according to the Perform using other doses described in the literature for posome-based delivery. Will be seen.Transport through the immune stimulating complex (ISCOMS)   ISCOMS is spontaneously produced when cholesterol and Quil A (saponin) are mixed. It is a negatively charged cage structure with a size of 30-40 nm. Protective immunity is toxoplasmosis And experimental models of various infections including tumors induced by Epstein-Barr virus. It was developed in Dell using ISCOMS as an antigen delivery vehicle (Mowat and Donachie, Immunology Today 12: 383-385, 1991). 1 enclosed in ISCOMS Found to induce class I-mediated CTL responses even at antigen doses as low as μg Where the purified intact IIIV-1-IIIB gp 160 envelope glycoprotein, or Or influenza hemagglutinin is the antigen (Takahashi et al., Nature 344 : 873-875, 1990). Peptides for ISPOCOMS It is delivered into tissue culture cells in the same manner and dose. Class of peptide delivered II peptide binding is then determined by extraction and characterization, as described above. Peptides of the invention carried by ISCOMS and utilized effectively by cultured cells Are then tested on animals or humans.   In addition to delivering synthetic peptides for therapeutic use, ISCOMS delivers minigenes to APCs. An alternative to the vaccinia strategy that has been constructed for and is thus outlined above. Serve as.Transport of immunogenic peptides (vaccine)   Non-immunogenic autologous for the specific purpose of down-regulating the immune system. In addition to using the intracellular delivery system described above to deliver your peptide, (Reducing the autoimmune status in this way), the delivery system of the present invention instead , As a new method of vaccination, to stimulate part of the animal's immune system. I can do it. In the latter case, the delivery system described above will result in an immune response to certain pathogens. DNA constructs expressing immunogenic and pathogen-derived peptides for the stimulation of It is used for delivery into suitable cells. The immunogenic peptide is the target cell Being produced in the body, the vaccine method of the present invention stimulates antibody production and thereby Circulates in the blood to be used to induce potentially harmful or inappropriate immune responses. Guarantees that there is no free antigen present. Stimulated by the vaccine of the invention The immune response that is given is a more general immune response, as the vaccine is directed only at APC. In contrast to standard vaccine protocols that result in an epidemiological response, T cell-mediated Limited to responses. Some APCs that display peptides are initially found in host It may be lysed by streptococcal cells, but is especially viral-based The Is non-replicating, that is, each carrier virus infects only one cell, Such dissolution is limited.   The model antigen used to perfect and test the system of the present invention is hen egg lysozyme. It is a team (HEL). Although controversial, this is the most important for antigen presentation studies. It is a well characterized protein for which a large number of single Antibodies, and mouse T cell clones and clones restricted to class I and class II. Ibridomas exist. The primary antigenic determinants studied are monoclonal antibodies and Since both CD4 + T cell hybridomas are available, it is the peptide HEL34-45, In addition, class I and class II limited T cell clones and hybridomas were produced and Since it is sold, it is the peptide HEL46-61. In this way, these two The mino acid sequence has proven to be an immunogenic determinant. First, different Four constructs encoding different polypeptides are analyzed. (A) Secreted HEL , (B) HEL 34-45, (c) HEL 46-61, and (d) HEL 34-61. The last three species , Signal sequences known to be cleaved in these cells, for example 1A^k (MPRSRALILGVLALTTMLSLCGG), resulting in ER orientation. All configurations The product is then subcloned into pHβApr-1 neo. Create these components The methodology to do is the same as outlined above. The above composition is a normal eukaryotic cell. Cell transfection, or the delivery vehicle described above (eg, vaccinia, Liposome, or ISCOMS), and a suitable APC, eg LK35.2, Is introduced into the cell. IA, the mouse MHC class II restriction molecule^kAnd IE^kHave and on LK35.2 cells transfected with each of the constructs described above were transfected with the appropriate class I and class. The ability to stimulate Ras II-restricted T cell hybridomas and clones was assayed using standard techniques. Be assessed. Whether class I stimulation is observed is appropriate for binding to class I molecules. Whether pruning of the peptide can occur within the ER to produce the desired 8-10-mer. It seems to be that. If these components are not effective in class I stimulation, These constructs were used to generate more effective peptides for Ras I binding. Can be modified. These constructs are more effective against class II restricted responses If it proves to be unreasonable, endorsing them as described in Section V. And / or lysosome-directed sequences can be provided.   Targeting used to target immunogenic peptides to specific intracellular organelles Signal efficacy was determined by electron microscopy of immunogold stained sections of various transformants. Will be detected. For this application, generate rabbit anti-peptide antisera , Purify using affinity. Furthermore, the antibody HF10 that recognizes HEL 34-45 Will be done.   Once a component can be effectively presented in vitro by a transformant If it becomes clear, its in vivo efficacy will be determined. This is the above trait By intraperitoneally and / or subcutaneously injecting the transformant into C3H / Balb / c F1 mice, Alternatively, a suitable delivery vehicle (eg, liposome, ISCOMS, retrovirus, vaccine, etc.) It can be examined by injecting the composition taken up by chycinia). Optimal protocols and doses for such immunization injections are provided in this application. The relevant disclosure can be decided by the parties. The efficiency of immunization is It can be inspected by the following standard methods. (A) HEL applied (HEL pulse d) Proliferation of class II restricted T cells that respond to APC, (b)⁵¹Labeled with Cr CTL response to target, and (c) serum antibody titer measured by ELISA.   Once the details of the vaccine delivery system of the present invention have been optimized, a useful immunity A construct encoding a peptide with production potential could be incorporated into the above system. It Such a peptide would have the same identity as the immunogenic It can be confirmed by standard means currently in use. For example, immunity Candidate peptides for sensitization include antibodies and T cells of animals infected with certain pathogens. It may be determined from the analysis of. To obtain a protective and effective history (memory) response In addition, peptides that can be used for vaccination ideally have the highest frequency and efficacy when infected. It must be a peptide presented at a rate. This is the MHC class from infected cells In order to extract and characterize the peptide bound to the II molecule, outlined in the experimental section above. It can be best determined using the procedure described. For immunogenic peptides If there is upright restriction (with the altered binding observed with the self-peptides of the invention, In contrast, several types of immunity are needed to provide useful vaccines / for the entire population. A minigene encoding the native peptide will be required. Vaccine administration The doses are similar to those currently applied for smallpox vaccination. The claims are as follows. Sequence list (1) General information:       (I) Applicant: Robert G Urban                         Roman M Chikubi                         Dario Ae Bignari                         Marie El Hedley                         Laurence Jay Stern                         Jack El Stromminger       (Ii) Title of invention: Immunoregulatory peptide       (Iii) Number of sequences: 157       (Iv) Corresponding address:             (A) Addressee: Fish and Richardson             (B) Street: 225 Franklin Street             (C) City: Boston             (D) State: Massachusetts             (E) Country: United States             (F) Zip code: 02110-2804       (V) Computer read mode:             (A) Media format: 3.5 ”disk, 1.44Mb             (B) Computer: IBM PS / 2 model 50Z or 55SX             (C) Operating system: MS-DOS (version 5.0)             (D) Software: Word Perfect (Version 5.1)       (Vi) Current application data:             (A) Application number: PCT / US92 / 06692             (B) Application date: August 11, 1993             (C) Classification:       (Vii) Priority application data:             (A) Application number: 07 / 925,460             (B) Application date: August 11, 1992       (Viii) Agent information:             (A) Name: Clark Paul Tee             (B) Registration number: 30,162             (C) Reference number: 00246/162001       (Ix) Telecommunication information:             (A) Telephone number: (617) 542-5070             (B) Fax number: (617) 542-8906             (C) Telex number: 200154 (2) Information of SEQ ID NO: 1:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 1: (2) Information of SEQ ID NO: 2:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 2: (2) Information of SEQ ID NO: 3:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 3: (2) Information of SEQ ID NO: 4:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 4: (2) Information of SEQ ID NO: 5:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 5: (2) Information of SEQ ID NO: 6:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 25           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 6: (2) Information of SEQ ID NO: 7:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 24           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 7: (2) Information of SEQ ID NO: 8:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 24           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 8: (2) Information of SEQ ID NO: 9:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 9: (2) Information of SEQ ID NO: 10:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 10: (2) Information of SEQ ID NO: 11:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 22           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 11: (2) Information of SEQ ID NO: 12:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 22           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 12: (2) Information of SEQ ID NO: 13:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 13: (2) Information of SEQ ID NO: 14:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D)) Tobology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 14: (2) Information of SEQ ID NO: 15:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 15 (2) Information of SEQ ID NO: 16:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 16: (2) Information of SEQ ID NO: 17:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 17: (2) Information of SEQ ID NO: 18:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 18: (2) Information of SEQ ID NO: 19:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 19: (2) Information of SEQ ID NO: 20:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 20: (2) Information of SEQ ID NO: 21:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 21: (2) Information of SEQ ID NO: 22:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 22: (2) Information of SEQ ID NO: 23:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 23: (2) Information of SEQ ID NO: 24:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 24: (2) Information of SEQ ID NO: 25:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 25: (2) Information of SEQ ID NO: 26:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 26: (2) Information of SEQ ID NO: 27:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 27: (2) Information of SEQ ID NO: 28:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 28: (2) Information of SEQ ID NO: 29:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 29: (2) Information of SEQ ID NO: 30:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 30: (2) Information of SEQ ID NO: 31:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 31: (2) Information of SEQ ID NO: 32:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 32: (2) Information of SEQ ID NO: 33:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 33: (2) Information of SEQ ID NO: 34:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 34: (2) Information of SEQ ID NO: 35:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 35: (2) Information of SEQ ID NO: 36:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 36: (2) Information of SEQ ID NO: 37:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 37: (2) Information of SEQ ID NO: 38:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 38: (2) Information of SEQ ID NO: 39:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 39: (2) Information of SEQ ID NO: 40:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 40: (2) Information of SEQ ID NO: 41:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 41: (2) Information of SEQ ID NO: 42:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 42: (2) Information of SEQ ID NO: 43:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 22           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 43: (2) Information of SEQ ID NO: 44:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 25           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 44: (2) Information of SEQ ID NO: 45:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 45: (2) Information of SEQ ID NO: 46:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 24           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 46: (2) Information of SEQ ID NO: 47:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 47: (2) Information of SEQ ID NO: 48:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 48: (2) Information of SEQ ID NO: 49:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 49: (2) Information of SEQ ID NO: 50:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 50: (2) Information of SEQ ID NO: 51:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 51: (2) Information of SEQ ID NO: 52:       (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 13           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 52: (2) Information of SEQ ID NO: 53:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 53: (2) Information of SEQ ID NO: 54:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 54: (2) Information of SEQ ID NO: 55:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 55: (2) Information of SEQ ID NO: 56:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 56: (2) Information of SEQ ID NO: 57:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 57: (2) Information of SEQ ID NO: 58:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 58: (2) Information of SEQ ID NO: 59:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 59: (2) Information of SEQ ID NO: 60:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 60: (2) Information of SEQ ID NO: 61:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 61: (2) Information of SEQ ID NO: 62:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 62: (2) Information of SEQ ID NO: 63:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 63: (2) Information of SEQ ID NO: 64:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 64: (2) Information of SEQ ID NO: 65:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 65: (2) Information of SEQ ID NO: 66:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 66: (2) Information of SEQ ID NO: 67:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 67: (2) Information of SEQ ID NO: 68:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 27           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 68: (2) Information of SEQ ID NO: 69:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 27           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D)) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 69: (2) Information of SEQ ID NO: 70:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 27           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 70: (2) Information of SEQ ID NO: 71:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 27           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 71: (2) Information of SEQ ID NO: 72:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 72: (2) Information of SEQ ID NO: 73:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 73: (2) Information of SEQ ID NO: 74:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 74: (2) Information of SEQ ID NO: 75:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 75: (2) Information of SEQ ID NO: 76:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 76: (2) Information of SEQ ID NO: 77:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 77: (2) Information of SEQ ID NO: 78:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 78: (2) Information of SEQ ID NO: 79:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 79: (2) Information of SEQ ID NO: 80:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 80: (2) Information of SEQ ID NO: 81:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 81: (2) Information of SEQ ID NO: 82:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 82: (2) Information of SEQ ID NO: 83:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 83: (2) Information of SEQ ID NO: 84:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 84: (2) Information of SEQ ID NO: 85:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 85: (2) Information of SEQ ID NO: 86:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 86: (2) Information of SEQ ID NO: 87:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 87: (2) Information of SEQ ID NO: 88:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 88: (2) Information of SEQ ID NO: 89:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 89: (2) Information of SEQ ID NO: 90:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 90: (2) Information of SEQ ID NO: 91:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 91: (2) Information of SEQ ID NO: 92:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 92: (2) Information of SEQ ID NO: 93:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 93: (2) Information of SEQ ID NO: 94:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 94: (2) Information of SEQ ID NO: 95:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 95: (2) Information of SEQ ID NO: 96:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 96: (2) Information of SEQ ID NO: 97:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 97: (2) Information of SEQ ID NO: 98:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 98: (2) Information of SEQ ID NO: 99:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 99: (2) Information of SEQ ID NO: 100:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 12           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 100: (2) Information of SEQ ID NO: 101:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 101: (2) Information of SEQ ID NO: 102:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 22           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 102: (2) Information of SEQ ID NO: 103:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 103: (2) Information of SEQ ID NO: 104:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 104: (2) Information of SEQ ID NO: 105:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 19           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 105: (2) Information of SEQ ID NO: 106:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 106: (2) Information of SEQ ID NO: 107:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 107: (2) Information of SEQ ID NO: 108:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 108: (2) Information of SEQ ID NO: 109:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 109: (2) Information of SEQ ID NO: 110:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 110: (2) Information of SEQ ID NO: 111:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 12           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 111: (2) Information of SEQ ID NO: 112:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 112: (2) Information of SEQ ID NO: 113:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 113: (2) Information of SEQ ID NO: 114:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 114: (2) Information of SEQ ID NO: 115:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Tobology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 115: (2) Information of SEQ ID NO: 116:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 116: (2) Information of SEQ ID NO: 117:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 117: (2) Information of SEQ ID NO: 118:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 118: (2) Information of SEQ ID NO: 119:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 119: (2) Information of SEQ ID NO: 120:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 120: (2) Information of SEQ ID NO: 121:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 121: (2) Information of SEQ ID NO: 122:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 122: (2) Information of SEQ ID NO: 123:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 123: (2) Information of SEQ ID NO: 124:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 124: (2) Information of SEQ ID NO: 125:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 125: (2) Information of SEQ ID NO: 126:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 22           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 126: (2) Information of SEQ ID NO: 127:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 18           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 127: (2) Information of SEQ ID NO: 128:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 128: (2) Information of SEQ ID NO: 129:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 129: (2) Information of SEQ ID NO: 130:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 130: (2) Information of SEQ ID NO: 131:       (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 131: (2) Information of SEQ ID NO: 132:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 17           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 132: (2) Information of SEQ ID NO: 133:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 133: (2) Information of SEQ ID NO: 134:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 134: (2) Information of SEQ ID NO: 135:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 135: (2) Information of SEQ ID NO: 136:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 136: (2) Information of SEQ ID NO: 137:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 137: (2) Information of SEQ ID NO: 138:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 15           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 138: (2) Information of SEQ ID NO: 139:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 139: (2) Information of SEQ ID NO: 140:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 24           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 140: (2) Information of SEQ ID NO: 141:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 21           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 141: (2) Information of SEQ ID NO: 142:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 20           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 142: (2) Information of SEQ ID NO: 143:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 16           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 143: (2) Information of SEQ ID NO: 144:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 26           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 144: (2) Information of SEQ ID NO: 145:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 24           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 145: (2) Information of SEQ ID NO: 146:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 146: (2) Information of SEQ ID NO: 147:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 123           (B) Sequence type: Nucleic acid           (C) Number of chains: Single chain           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 147: (2) Information of SEQ ID NO: 148:     (I) Sequence features:           (A) Array length: 150           (B) Sequence type: Nucleic acid           (C) Number of chains: Single chain           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 148: (2) Information of SEQ ID NO: 149:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 10           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 149: (2) Information of SEQ ID NO: 150:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 10           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 150: (2) Information of SEQ ID NO: 151:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 10           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D)) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 151: (2) Information of SEQ ID NO: 152:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 4           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 152: (2) Information of SEQ ID NO: 153:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 5           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 153: (2) Information of SEQ ID NO: 154:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 5           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 154: (2) Information of SEQ ID NO: 155:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 25           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 155: (2) Information of SEQ ID NO: 156:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 14           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 156: (2) Information of SEQ ID NO: 157:     (I) Sequence features:           (A) Sequence length: 23           (B) Sequence type: Amino acid           (C) Number of chains:           (D) Topology: Linear     (Xi) Description of SEQ ID NO: 157:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 39/00 Ａ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/08 14/47 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/24 9455−4Ｃ 37/64 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ 7729−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者 ビグナリ ダリオ エー エー イギリス国 ケント州 ローワー レイン ハム ロード 761 (72)発明者 ヘドレイ マリー リン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ＃１ ワルデン ストリート 214 (72)発明者 ステルン ローランス ジェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ア ーリントン ニューポート ストリート 181 (72)発明者 ストロミンガー ジャック エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 レ キシントン マサチューセッツ アベニュ ー 2030─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI A61K 38/55 39/00 A 9284-4C C07H 21/04 B 8615-4C C07K 7/08 14/47 8318- 4H C12N 5/10 15/09 ZNA C12P 21/02 C 9282-4B G01N 33/53 D 8310-2J 9455-4C A61K 37/24 9455-4C 37/64 9281-4B C12N 15/00 ZNA A 7729-4B 5/00 B (72) Inventor Bignari Dario A.A. Lower Kent, Kent, United Kingdom 761 (72) Inventor Hedley Marie Lin United States Cambridge # 1 Walden Street, Massachusetts 214 (72) Inventor Stern Laurence Jay United States Arlington Newport Str. Massachusetts Over door 181 (72) inventor Sutorominga jack El United States Massachusetts Les Kishinton Massachusetts Abenyu over 2030

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプチ ドの精製標品であって、当該切片は長さ10から30残基までであり、上記ペプチド がヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合することを 特徴とする。 ２．請求項１に記載の調製品であって、上記ペプチドが少なくとも２つの別個 の MHCクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。 ３．請求項１に記載の調製品であって、上記のヒトタンパク質が、HLA-A2、HL A-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Igκ 鎖 C領域、Ig H鎖、Na⁺/K⁺ ATP アーゼ、トランスフェリン、トランスフェリン 受容体、カルシトニン受容体、カルボキシペプチダーゼ E、MET キナーゼ関連形 質転換タンパク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ア ポリポタンパク質 B-100、カテプシンＣ、カテプシンＳ、金属プロテイナーゼ阻 害因子 １ 前駆体、或いは、熱ショック・コグネイト 71 kD タンパク質である 。 ４．請求項１に記載の調製品であって、上記ヒトタンパク質がMHC のクラス I 或いはクラスII分子であることを特徴とする。 ５．請求項１に記載の調製品であって、上記切片が以下のモチーフに属するこ とを特徴とする。 当該切片のアミノ末端、或いはその12残基内の最初の照合点(I)に、正荷電残 基、又は大きな疎水性残基を、及び I+5 位に、水素結合供与残基を含む。 ６．請求項５に記載の調製品であって、上記モチーフが I+9 位に疎水性残基 を含むことを特徴とする。 ７．請求項６に記載の調製品であって、上記モチーフが、更に、I+1 或いはI -1 位に疎水性残基を含むことを特徴とする。 ８．請求項１に記載の調製品であって、上記切片がHLA-A2の残基 29-40、或い は残基 106-115を含むことを特徴とする。 ９．請求項１に記載の調製品であって、上記切片がIiの残基 107-116を含むこ とを特徴とする。 １０．治療用組成品が、 （a）天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプ チドであって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主 要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合し、及び、 （b）薬剤学的に許容される担体からなることを特徴とする。 １１．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプチ ドを含むリポソームであって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記ペブ チドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合するこ とを特徴とする。 １２．天然由来のヒトのタンパク質の切片のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列 からなるペプチドを含む免疫刺激複合体（ISCOM）であって、上記切片は10から3 0残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）クラス IIアロタイプに結合することを特徴とする。 １３．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の 抗原提示細胞（APC）を請求項１０に記載の治療用組成物と接触させることから なることを特徴とする。 １４．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の APCを請求項１１に記載のリポソームと接触させることからなることを特徴とす る。 １５．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の APCを請求項１２に記載のISCOMと接触させることからなることを特徴とする。 １６．ポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペブチドがペプチド結 合で連結された第一と第二のアミノ酸配列からなり、上記第一の配列は天然由来 のヒトのタンパク質の切片の配列と同一であり、当該切片がヒトのMHCのクラスI Iアロタイプに結合して、10から30残基の長さであり、又、第二の配列は、それ が付着するポリペプチドの細胞内流通を制御する配列（流通配列）であることを 特徴とする。 １７．請求項１６に記載の核酸であって、上記の流通配列が上記ポリペプチドを 小胞体（ER）、リソソーム、或いはエンドソームに流通することを特徴とする。 １８．請求項１６に記載の核酸であって、上記の第二の配列が MHCサブユニット のシグナルペプチドと本質的に同一であることを特徴とする。 １９．請求項１８に記載の核酸であって、上記サブユニットがMHCクラスIIα或 いはβサブユニットであることを特徴とする。 ２０．請求項１６に記載の核酸であって、上記の流通配列が KDEL、 KFERQ、 QR EFK 、 MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA 、Qの一側にK 、R 、D 、E 、F 、I 、V 及 びＬから選ばれた４残基が隣接しているペンタペプチド、或いはシグナルペプチ ドであることを特徴とする。 ２１．請求項１６に記載の核酸を含むリポソーム、或いはISCOMを特徴とする。 ２２．ペプチド結合で連結された第一と第二のアミノ酸配列からなるポリペプチ ドをコードする核酸であって、上記第一の配列が天然由来のヒトのタンパク質の 切片の配列と同一であり、上記切片がヒトのMHCクラスIIアロタイプに結合して 、10から30残基の長さであり、又、第二の配列がヒトのIiと本質的に同一である ことを特徴とする。 ２３．請求項２２に記載の核酸であって、上記ポリペプチドが、上記の第二配列 に縦に連結した上記第一配列の複数のコピーからなることを特徴とする。 ２４．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸からなる自己ペプチ ドをコードする核酸分子であって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記 自己ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）クラスIIアロタイプに結合 し、上記核酸分子が上記タンパク質の全配列よりも少ない配列をコードすること を特徴とする。 ２５．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、それが付着す るポリペブチドの細胞内流通を制御するペプチド配列をコードすることを特徴と する（流通配列）。 ２６．請求項２５に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、第二の自己ペ プチド及び第二の流通配列をコードすることを特徴とする。 ２７．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、発現制御因子 を含むことを特徴とする。 ２８．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子がプラスミド、或いはウ イルスのゲノム、配列を含むことを特徴とする。 ２９．請求項２８に記載の核酸分子であって、上記分子が非増殖性で非毒性のワ クシニアウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、或いはレ トロウイルスのゲノムであることを特徴とする。 ３０．請求項２４に記載の核酸分子を含むリポソーム、或いはISCOMを特徴とす る。 ３１．請求項２７に記載の核酸分子を含む細胞を特徴とする。 ３２．請求項３１に記載の細胞であって、上記細胞がヒトの B細胞、或いはAPC であることを特徴とする。 ３３．請求項３１に記載の細胞であって、上記核酸がウイルスのゲノム核酸から なることを特徴とする。 ３４．ペプチド調製の方法であって、当該方法が、上記核酸分子からの上記ペプ チドの発現を可能にする条件下に請求項３１に記載の細胞を培養することからな ることを特徴とする。 ３５．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、請求項 ２４に記載の核酸を、上記患者の複数の APCに導入することからなることを特徴 とする。 ３６．薬剤学的に許容される担体中の請求項２４に記載の核酸からなる治療用組 成物を特徴とする。 ３７．ヒト患者に免疫応答を誘発する方法であって、上記方法が、上記患者の A PC内に、ヒト起源以外のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸分子を導入 し、上記断片が MHCのクラスＩ或いはII分子に結合することを特徴とする。 ３８．請求項３７に記載の方法であって、上記タンパク質が、ヒト、或いは動物 の病気の原因となる感染性作用物質に関するものであることを特徴とする。 ３９．請求項３８に記載の方法であって、上記感染性作用物質が、ヒトの免疫不 全症ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、インフ ルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、 Corynebactcm diphtheriae（ジフテリア 菌）、Bordetella pertussis（百日咳菌）、Plasmodium属、Schistosoma属、Lei shmania属、Trypanasoma属、或いは Mycobacterium lepre（癩菌）であることを 特徴とする。 ４０．請求項１に記載の調製品であって、上記切片が、本質的に表1-10のいずれ かに提示されている配列の１つからなることを特徴とする。 ４１．非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチドの同定方法であって、上記方法が 以下の事項からなることを特徴とする。 （a）第一のMHC クラスIIアロタイプから溶離されるペプチドの混合物を分画 し、 （b）上記混合物から自己ペプチドを同定して、 （C）上記自己ペプチドが第二の MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうか を検査し、当該結合は、自己ペプチドが非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチド であることの表示である。 ４２．潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事 項からなることを特徴とする。 （a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提供し、 （b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、 （c）上記の候補ペプチドに結合する上記クラスII分子の比率が、上記核酸の 非存在下に結合する比率と比較して、上記核酸の存在下に増大するかどうかを測 定 し、上記増大は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表 示である。 ４３．潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事 項からなることを特徴とする。 （a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提供し、 （b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、 （c）上記細胞の表面上の MHCのクラスII分子のレベルが、上記核酸の非存在 下の上記分子のレベルと比較して、上記核酸の存在下に減少するかどうかを測定 し、上記減少は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表 示である。 ４４．非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを同定する方法であって、 上記方法が以下の事項からなることを特徴とする。 （a）第一のMHCのクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供 し、上記細胞が病原体で感染され、 （b）上記細胞の第一のMHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を溶離し、 （c）上記混合物から候補ペプチドを同定し、上記候補ペプチドが上記病原体 からのタンパク質の断片であり、 （d）上記候補ペプチドが第二のMHCアロタイプに結合するかどうかを検査し、 上記結合は、上記候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチド であることの表示である。[Claims] 1. A purified preparation of a peptide consisting of the same amino acid sequence as a section of a naturally-occurring human protein, the section having a length of 10 to 30 residues, wherein the peptide is a human major histocompatibility complex ( MHC) class II allotype. 2. A preparation according to claim 1, characterized in that the peptide binds to at least two distinct MHC class II allotypes. 3. The preparation according to claim 1, wherein the human protein is HLA-A2, HLA-A29, HLA-Bw62, HLA-C, HLA-DRα, HLA-DRβ, invariant chain (Ii), Igκ chain C region, Ig H chain, Na ⁺ / K ⁺ ATPase, transferrin, transferrin receptor, calcitonin receptor, carboxypeptidase E, MET kinase-related transforming protein, guanylate binding protein, mannose binding protein, apolipoprotein B -100, cathepsin C, cathepsin S, metalloproteinase inhibitor 1 precursor, or heat shock cognate 71 kD protein. 4. The preparation according to claim 1, wherein the human protein is an MHC class I or class II molecule. 5. The preparation according to claim 1, wherein the slice belongs to the following motif. Include a positively charged residue, or a large hydrophobic residue, at the amino terminus of the section, or the first reference point (I) within its 12 residues, and a hydrogen bond donor residue at position I + 5. 6. The preparation according to claim 5, wherein the motif contains a hydrophobic residue at position I + 9. 7. The preparation according to claim 6, wherein the motif further contains a hydrophobic residue at the I + 1 or I-1 position. 8. The preparation according to claim 1, characterized in that the section contains residues 29-40 or residues 106-115 of HLA-A2. 9. A preparation according to claim 1, characterized in that the section comprises residues 107-116 of Ii. 10. The therapeutic composition is (a) a peptide consisting of the same amino acid sequence as a section of a naturally-occurring human protein, wherein the section has a length of 10 to 30 residues, and the peptide is a major human tissue. It is characterized in that it is bound to the class II allotype of the compatible complex (MHC) and (b) consists of a pharmaceutically acceptable carrier. 11. A liposome containing a peptide having the same amino acid sequence as that of a naturally-occurring human protein slice, wherein the slice has a length of 10 to 30 residues, and the peptide is a human major histocompatibility complex (MHC). ) Of the class II allotype. 12. An immunostimulatory complex (ISCOM) comprising a peptide consisting of an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of a naturally-occurring human protein slice, said slice being 10 to 30 residues in length, wherein said peptide is It is characterized by binding to the human major histocompatibility complex (MHC) class II allotype. 13. A method of inhibiting an immune response in a human patient, characterized in that the method comprises contacting an antigen presenting cell (APC) of the patient with a therapeutic composition according to claim 10. 14. A method of inhibiting an immune response in a human patient, characterized in that the method comprises contacting the patient's APC with the liposome of claim 11. 15. A method for inhibiting an immune response in a human patient, characterized in that the method comprises contacting the patient's APC with ISCOM according to claim 12. 16. A nucleic acid encoding a polypeptide, wherein the polypeptide comprises a first and second amino acid sequence linked by a peptide bond, the first sequence being identical to the sequence of a naturally occurring human protein section. , The section is bound to the human MHC class II allotype and is 10 to 30 residues in length, and the second sequence is a sequence that controls intracellular trafficking of the polypeptide to which it is attached ( Distribution arrangement). 17． The nucleic acid according to claim 16, wherein the distribution sequence distributes the polypeptide to the endoplasmic reticulum (ER), lysosome, or endosome. 18. The nucleic acid according to claim 16, characterized in that said second sequence is essentially identical to the signal peptide of the MHC subunit. 19. The nucleic acid according to claim 18, wherein the subunit is an MHC class II α or β subunit. 20. The nucleic acid according to claim 16, wherein the distribution sequence is selected from K, R, D, E, F, I, V and L on one side of KDEL, KFERQ, QR EFK, MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA, Q 4. It is characterized by being a pentapeptide in which residues are adjacent to each other, or a signal peptide. 21. A liposome containing the nucleic acid according to claim 16 or ISCOM. 22. A nucleic acid encoding a polypeptide consisting of a first and a second amino acid sequence linked by a peptide bond, wherein the first sequence is the same as the sequence of a fragment of a naturally occurring human protein, and the fragment is It is characterized in that it binds to the human MHC class II allotype and is 10 to 30 residues in length, and that the second sequence is essentially identical to human Ii. 23. 23. The nucleic acid according to claim 22, characterized in that said polypeptide consists of a plurality of copies of said first sequence vertically linked to said second sequence. 24. A nucleic acid molecule encoding a self-peptide consisting of the same amino acid as a section of naturally-occurring human protein, wherein the section has a length of 10 to 30 residues, and the self-peptide is a human major histocompatibility complex. It is characterized in that it binds to the body (MHC) class II allotype and the nucleic acid molecule encodes less than the entire sequence of the protein. 25. 25. The nucleic acid molecule according to claim 24, characterized in that the molecule further encodes a peptide sequence which controls the intracellular distribution of the polypeptide attached to it (distribution sequence). 26. 26. The nucleic acid molecule according to claim 25, characterized in that the molecule further encodes a second self peptide and a second trafficking sequence. 27. The nucleic acid molecule according to claim 24, wherein the molecule further comprises an expression regulator. 28. The nucleic acid molecule according to claim 24, characterized in that the molecule comprises a plasmid or a viral genome or sequence. 29. 29. The nucleic acid molecule according to claim 28, wherein the molecule is a non-proliferative, non-virulent, vaccinia virus, adenovirus, Epstein-Barr virus, or retrovirus genome. 30. A liposome containing the nucleic acid molecule according to claim 24, or ISCOM. 31. A cell comprising a nucleic acid molecule according to claim 27. 32. The cell according to claim 31, wherein the cell is a human B cell or APC. 33. The cell according to claim 31, wherein the nucleic acid comprises a genomic nucleic acid of a virus. 34. A method for preparing a peptide, characterized in that the method comprises culturing the cell of claim 31 under conditions that allow expression of the peptide from the nucleic acid molecule. 35. A method of inhibiting an immune response in a human patient, characterized in that it comprises introducing the nucleic acid of claim 24 into a plurality of APCs of said patient. 36. A therapeutic composition comprising a nucleic acid according to claim 24 in a pharmaceutically acceptable carrier. 37. A method for inducing an immune response in a human patient, which comprises introducing into the APC of the patient a nucleic acid molecule encoding an immunogenic fragment of a protein of non-human origin, wherein the fragment is of MHC class. It is characterized by binding to I or II molecules. 38. 38. The method according to claim 37, characterized in that the protein relates to an infectious agent which causes human or animal disease. 39. 39. The method of claim 38, wherein the infectious agent is human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B virus, measles virus, rubella virus, influenza virus, rabies virus, Corynebactcm diphtheriae. ), Bordetella pertussis (Pertussis), Plasmodium genus, Schistosoma genus, Lei shmania genus, Trypanasoma genus, or Mycobacterium lepre (Mycobacterium leprae). 40. A preparation according to claim 1, characterized in that said section consists essentially of one of the sequences presented in any of Tables 1-10. 41. A method for identifying a non-allelic restricted immunomodulatory peptide, characterized in that the above method comprises: (A) fractionating the mixture of peptides eluted from the first MHC class II allotype; (b) identifying the self peptide from the mixture; (C) converting the self peptide to a second MHC class II allotype. Whether it binds is tested and the binding is an indication that the self peptide is a non-allelic restricted immunomodulatory peptide. 42. A method for identifying a potential immunomodulatory peptide, characterized in that the method comprises: (A) providing a cell expressing a MHC class II molecule on its surface, (b) introducing a nucleic acid encoding a candidate peptide into the cell, (c) the above class II molecule binding to the above candidate peptide Is increased in the presence of the nucleic acid as compared to the ratio of binding in the absence of the nucleic acid, wherein the increase indicates that the candidate peptide is a potential immunomodulatory peptide. Is displayed. 43. A method for identifying a potential immunomodulatory peptide, characterized in that the method comprises: (A) providing a cell expressing a MHC class II molecule on the surface, (b) introducing a nucleic acid encoding a candidate peptide into the cell, (c) an MHC class II molecule on the surface of the cell Is decreased in the presence of the nucleic acid as compared to the level of the molecule in the absence of the nucleic acid, the decrease being indicative of the candidate peptide being a potential immunomodulatory peptide. It is a display of the thing. 44. A method for identifying a non-alleletically restricted immunomodulatory peptide, characterized in that the method comprises: (A) providing a cell carrying a first MHC class I or class II allotype, said cell being infected with a pathogen, and (b) eluting a mixture of peptides which bind to said first MHC allotype. And (c) identifying a candidate peptide from the mixture, wherein the candidate peptide is a fragment of a protein from the pathogen, and (d) testing whether the candidate peptide binds to a second MHC allotype, Binding is an indication that the candidate peptide is a non-alleleically restricted immunomodulatory peptide.