JPH08500245A

JPH08500245A - 哺乳動物の多能性神経幹細胞

Info

Publication number: JPH08500245A
Application number: JP6504741A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．アンダーソン，デビッド; エル．ステンプル，デレク
Original assignee: カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
Priority date: 1992-07-27
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1996-01-16
Also published as: CA2140884A1; NZ256154A; AU4837593A; EP0658194A1; US5824489A; AU678988B2; WO1994002593A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物多能性神経幹細胞及びその子孫、並びにかかる細胞の単離及びクローン増殖のための方法を含む。クローンレベルにおいて、この幹細胞は自己再生及び非対称的***できる。系統限定が、局所的な環境に感受性である発達中のクローンにおいてで実証された。本発明はまた、例えば不死化神経幹細胞を作るための外来核酸でトランスフェクトされたかかる細胞を含む。本発明は更に、様々な組織由来の哺乳動物多能性神経幹細胞の同定並びに哺乳動物神経幹細胞及び／又はニューロンもしくはグリア前駆体の哺乳動物への移植を可能にする移植アッセイを含む。神経細胞表層マーカーに特異的な抗体及びマウスのLNGFRに対するモノクローナル抗体を検定するための新規の方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物の多能性神経幹細胞本願は、1992年７月27日提出の米国特許出願第07/920,617号の一部係属出願である1992年10月29日提出の米国特許出願第07/996,088号の一部係属出願である。発明の分野本発明は哺乳動物の多能性（multipotent）神経幹細胞及びその子孫の単離、再生及び利用に関する。背景神経堤（neural crest）は一過性の胎芽前駆集団であり、その誘導体には幅広い様々な形態、特徴及び性能を有する細胞が含まれる。これらの誘導体には全末梢神経系のニューロン及びグリア、メラノサイト、頭と首との軟骨及び接続組織、様々な分泌腺の支質、並びに心臓の流出路における細胞が含まれる（参考のため、Anderson，D.J.（1989）Neuron ３：１-12を参照のこと）。神経堤細胞の発達能及び運命についてのほとんどの知識は鳥類系における研究に由来する。運命地図が鳥類において樹立されており、そしていくつかの異なる堤細胞誘導体は心神管伝いの同じ位置に由来しうる証拠を共する（Le Dourain,N.M.（1980）Natur e 286:663-669）。シュバン（Schwann）細胞、メラノサイト、並びに知覚及び交感ニューロンは全て神経管の神経幹領域に由来しうる。他方、一部の誘導体は堤の特定領域に由来することが見い出せた。例えば、迷走神経及び仙骨領域由来の腸神経節。これらの研究は、神経管伝いの一定の位置での神経堤の発達能はその発達の運命に勝ることも示している。このことは、移動する堤細胞が遭遇する新たな環境はその発達の運命に影響を及ぼすことを示唆している。インビボでの単個細胞系統分析、及びインビトロでのクローン分析は、初期鳥類神経堤細胞が、神経管からの脱離及び移動の最中又は直後に多能性となっていることを報告している。鳥類系において、培養物中の単独の神経堤細胞由来の一定のクローンはカテコールアミン作動性及び色素沈着細胞の両者を含むことが報告されている（Sieber-Blum, A．ら（1980）Dev. Biol. 80：96-106）。 Baroffio，A．ら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：5325-5329は、頭部領域由来の鳥類神経堤細胞は成長阻止化繊維芽細胞フィーダー細胞層上で増殖させたときに高度に異質な子孫をもたらすことを報告している。初期神経堤細胞の多能性のインビボ実証が、Bronner-Fraser，M．ら（1989）N euron ３: 755-766によりニワトリにおいて報告されている。神経管から移動する前の個々の神経堤細胞を蛍光色素と共に注射した。48時間後、注射した細胞のクローン子孫は、交感神経節、末梢運動神経及び皮膚を含む神経堤細胞が移動する多数の又は全ての位置において定着していることが認められた。標識細胞の表現型分析は、少なくとも一部の神経堤細胞がインビボで多能性であることを示した。神経管からの移動に続いて、これら初期多能性堤細胞は、限定された分化誘導体のサブセットを発生せしめる様々なサブ系統へと***する。どのようにして神経堤細胞が様々なサブ系統に限定されるかのメカニズムはあまり理解されていない。神経堤誘導体の運命は、前駆体が定着する胎芽位置により何らかの方法で支配されることが知られている（Le Douarin，N.M.（1982）The Neural Crest., Cambridge University Press,Cambridge,UK）。神経堤細胞誘導の詳細なメカニズムは知られていない。上記の培養研究において、研究者は、一次神経堤細胞由来のクローンが混合型の表現型を示すことを報告している（Sieber-Blum，M．ら（1980）前掲； Baroffio,A．ら（1988）前掲：Cohen A．M．ら（1975）Dev．Bi ol． 46:262ー280；Dupin，E．ら（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：111 9-1123）。一部のクローンは一の分化細胞タイプのみを含み、一方、他のクローンは多種又は全てのアッセイ可能な堤表現型を含んでいた。明らかにかかわり合っている前駆及び多能性細胞が神経堤の中で共存している所見は、一次堤細胞の集団における予め存在している異種性を反映しているものと解釈されうるか、又はそれが発達能において進行限定を受ける細胞の集団の非同時性を反映しうるものと解釈されうる。神経堤細胞の発達能に関する分野におけるあいまいさのため、クローン培養における神経堤細胞の単離についての必要性が明らかに存在する。単離した鳥類神経堤細胞の増殖及び分化を可能にし、それ故その子孫の表現型の同定を可能にする培養系が樹立されているにもかかわらず、多能性哺乳動物神経堤細胞の自己再生を可能にする培養条件は報告されていない。かかる培養条件は哺乳動物神経堤幹細胞の単離にとって必須である。かかる幹細胞は、多能性神経堤細胞がどのようにして様々な神経堤誘導体へと限定されていくかを理解するために必須である。特に、哺乳動物神経堤幹細胞の増殖及び自己再生（Self-renewal）を可能にする培養条件が、これらの哺乳動物幹細胞の発達の特徴を明らかにするために所望される。このことは所望されており、なぜなら数多くの神経堤誘導体の腫瘍が哺乳動物、特にヒトに存在しているからである。従って、哺乳動物神経堤幹細胞の知識はヒトにおける、かかる障害の理解のために必要とされる。更にインビトロでの哺乳動物神経堤幹細胞の単離及び増殖の能力は、哺乳動物、特にヒトにおける末梢神経障害を処置するのに、前記幹細胞を使用することを可能にする。従って、ここでの目的は、フィーダー細胞非依存性培養物の中での哺乳動物多能性神経幹細胞及びその子孫のクローン培養を提供することにある。本発明の別の目的は、多能性幹細胞が神経堤の中に存在していることを実証することに向けられている。本発明の別の目的は、これらの多能性神経堤幹細胞が少なくとも一定の自己再生能力を有し、そして局所的な環境に対して感受性である状況で系統限定を受けることを実証することにある。本発明の更なる目的は、フィーダー細胞非依存性培養物中での多能性神経幹細胞の増殖及び再生を可能にする方法を提供することにある。本発明の別の目的は、多能性神経堤幹細胞の、少なくともその前駆細胞、並びにより分化した末梢神経系（PNS）のニューロン及びグリアに至る分化を可能にする方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、移植アッセイを利用する哺乳動物多能性神経幹細胞の同定を可能にする方法を提供することにある。更に、本発明の目的は神経堤幹細胞又はその子孫を哺乳動物に移植するための方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、上述の方法を、哺乳動物神経堤幹細胞及びその子孫のクローン培養、グリア又はニューロン前駆細胞の誘導又は精製、並びに胎芽ニューロン堤以外の組織に由来するかかる細胞の増殖、再生及び分化を可能にする方法の提供にまで広げることにある。更に、ここでの目的はかかるグリア及びニューロン細胞並びにその多能性幹細胞前駆体の哺乳動物への移植のための方法を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子操作した多能性神経幹細胞及びその子孫の培養を提供することにある。更に、本発明の目的は、かかる遺伝子操作した多能性神経幹細胞及びその子孫を不死化するための方法を含む、かかる細胞の培養物の作製のための方法を提供することにある。更に、本発明の目的は、多能性神経幹細胞及び／又はその子孫の特徴である表層マーカーを認識することのできるモノクローナル抗体を提供することにある。更なる目的は、かかる抗体についての血液及びハイブリドーマをスクリーニングするための新規の手順を提供することにある。発明の概要上記の目的に従い、本発明は神経堤に由来するが如きの哺乳動物多能性神経幹細胞の単離、クローン増殖及び分化を含む。この方法は、多能性神経幹細胞及びその誘導体の作製を樹立するための新規の分離及び培養手法並びにバイオアッセイを採用する。これらの方法は、非形質転換神経幹細胞及びその子孫の産生をもたらす。本発明は、フィーダー細胞非依存性培養において初めて、クローンレベルでの、哺乳動物神経幹細胞の自己再生及び非対称的分化を実証する。系統限定は発達中のクローンにおいて実証され、そして局在的な環境に対して感受性であることが示された。例えば、ポリ−Ｄ―リジン及びフィグロネクチンの混合基材上で培養した神経堤幹細胞はPNSのニューロン及びグリアーを発生せしめるが、フィブロネクチンのみの上では、この幹細胞はPNS グリアは発生せしめるがニューロンは発生せしめない。神経堤幹細胞の神経原性能は発揮されないが、フィグロネクチン上でずっと維持される。従って、神経堤幹細胞の公然たる（overt）分化及び潜伏は発達能の両者がこの環境に感受性であることが示された。本発明は、様々な組織に由来する哺乳動物多能性神経幹細胞の同定を可能にする移植アッセイを更に含む。また、哺乳動物神経幹細胞及び／又は神経もしくはグリア前駆細胞の哺乳動物への移植のための方法を含む。本発明は、グリアもしくはニューロン前駆細胞、又はかかる細胞の多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴を有する一又は複数の細胞を含んで成る細胞組成物を培養するための方法も提供する。この方法は、哺乳動物組織に由来する細胞の集団を含んで成る懸濁物を調製する；この細胞懸濁物を、その中に存在しているならば、１又は複数のグリア又はニューロン前駆細胞の自己再生を可能にする培養培地及び基材と接触させる；そして１又は複数のかかる細胞を、フィーダー細胞非依存性培養物の中で自己再生及び分化するその能力によって同定する；ことを含んで成る。本発明はまた、グリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する１又は複数の細胞を含んで成る細胞組成物を獲得するための別の方法を含む。この方法は、哺乳動物組織由来の細胞を含んで成る懸濁物を調製する；この懸濁物を、前記グリアもしくはニューロン前駆細胞又は多能性幹細胞前駆体上の神経細胞特異的表層マーカーと複合体を形成することのできる抗体と接触させる；そして形成されたならばこの複合体を単離して前記細胞組成物を獲得する；ことを含んで成る。本発明はまた、任意の上記の方法に従って作った細胞に向けられる。本発明はまた、遺伝子操作した哺乳動物多能性神経幹細胞及びその子孫の培養物を含む。課題の遺伝子をエンコードする核酸配列を、それが発現される多能性神経幹細胞の中に導入する。これらの遺伝子には神経栄養性又は生存因子及び不死化癌遺伝子が含まれうる。更に、マーカー遺伝子、例えばＥ．コリ（Ｅ．coli ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入して、このマーカー遺伝子の発現に基づいて同定されうる神経幹細胞及びその子孫を供することができうる。選択性マーカー遺伝子、例えばネオマイシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ネオマイシン耐性、neo^r）又はhis Ｄ遺伝子を導入して、淘汰圧の存在下（即ち、ネオマイシン又はＬ−ヒスジジノールを含む培地）で増殖する能力により同定される遺伝子操作した幹細胞の集団を供することができうる。神経幹細胞は選択性マーカー及び非選択性マーカーの両者でトランスフェクト（遺伝子操作）せしめて両遺伝子産物を発現する神経幹細胞を供することができうる。本発明はまた、遺伝子操作した哺乳動物多能性神経幹細胞及びその子孫の培養物を製造するための方法を含む。更に、本発明はかかる細胞系を不死化するための方法を含み、これはグリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体に少なくとも一の不死化遺伝子を含んで成るべクターをトランスフェクトせしめることによる。更に、本発明は哺乳動物多能性神経幹細胞及びその子孫の特徴的表層マーカーを認識することのできるモノクローナル抗体を含む。本発明はまた、かかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするための方法を含み、これは生存中の神経細胞をハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体と接触させ、そしてそのモノクローナル抗体がこの神経細胞と結合するかどうかを検定することを含んで成る。図面の簡単な説明図１Ａは神経管からのラットの神経堤細胞の移動を模式する。図１Ｂは神経堤細胞からのLNGFR及びネスチンの発現を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、抗−LNGFRで染色した神経堤細胞（１Ｄ）及び二次抗体で染色したバックグランドを示すコントロール（１Ｃ）に由来するFA CSプロフィールを示す。図２はLNGFR⁺ 、ネスチン⁺ ラット神経堤細胞のクローン増殖を示す。図３は哺乳動物神経堤細胞の多能性を実証する実験をまとめたフローチャートである。図４は LNGFR⁺ ファウンダー（発起）細胞に由来するクローンにおける神経特質の発現を示す。図５は神経堤由来グリアによるシュバン細胞表現型の発現を示す。図６は LNGFR⁺ ファウンダー細胞に由来するクローンにおけるぺリフェリン、 GFAP及びＯ₄の発現を示す。図７は哺乳動物神経堤細胞の自己再生を実証する実験をまとめたフローチャートである。図８は多能性神経堤細胞の自己再生を示す。図９は二次ファウンダー細胞の多能性を示す。図10は哺乳動物神経堤細胞の運命に対する基材の効果を実証する実験をまとめたフローチャートである。図11は多能性神経堤細胞のニューロン分化がこの基材によって影響されることを示す。図12は、ファウンダー細胞をFN又はFN／PDL 基材のいづれかの上で増殖させたときにもたらされる様々なクローンタイプのパーセンテージをまとめている。図13は神経堤細胞の運命に及ぼす基材の実例的な効果を実証する実験をまとめたフローチャートである。図14は、ファウンダー細胞をPDL リジンで上層で48時間（パネルＡ）又は５日間（パネルＢ）処理したときにもたらされる様々なクローンタイプのパーセンテージをまとめている。図15は多能性神経幹細胞の遺伝子操作を示す。パネルＡは、lacZ含有レトロウィルスによる感染を経た神経堤幹細胞におけるＥ．コリβ−ガラクトシダーゼ（ lacZ）の発現を示している。 β−ガラクトシダーゼ⁺ 細胞は実線矢印で表示している。パネルＢは、パネルＢにおいて示しているのと同一の顕微鏡視野における位相差の神経堤幹細胞を示す。β−ガラクトシダーゼを発現しない細胞は中抜き矢印て示している。図16は、マウスLNGFR に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ培養物に由来する上清液の特異性を示す。上清液を、マウスの座骨神経から単離した生存シュバン細胞を用いてスクリーンした。パネルＡは、ほとんどの細胞が抗−LNGFR 抗体で染色されることを示す（赤色染色；中抜き矢印）。パネルＢは、DAPIで染色されたシュバン細胞核カウンターを示す。パネルＡとの対比は、少数の細胞が抗− LNGFR抗体によってラベルされないことを示す（青色染色；中抜き矢印）。発明の詳細な説明本発明は一部、非形質転換哺乳動物神経堤幹細胞の単離及びクローン増殖、並びに他の胎芽及び成組織に由来する多能性神経幹細胞に向けられている。本発明はまた、ニューロン及びグリア系統の前駆細胞及びより分化した細胞を含む神経堤幹細胞及び多能性神経幹細胞の製造を含む。本発明はラットより単離した神経堤幹細胞を利用して実証される。しかしながら、本発明は全ての哺乳動物神経幹細胞が多能性神経幹細胞並びにその誘導体を包括しており、そしてラットに由来する神経堤幹細胞に限定されない。哺乳動物神経堤幹細胞及び多能性神経幹細胞、並びにその子孫はヒト及び非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウサギ等に由来する組織から単離できうる。本発明はいくつかの重要な方法論的な革新を包括する：１）低親和性神経成長因子レセプター（LNGFR）に対するモノクローナル抗体の、神経堤幹細胞を単離及び同定するための細胞表層マーカーとしての利用（同様に、他の神経幹細胞集団に拡張できる方法）；２）未分化の神経堤細胞のクローン増殖を可能にする細胞培養基材及び培地組成物の開発；３）哺乳動物神経堤細胞の、クローン培養におけるその分化誘導体（末梢ニューロン及びグリアを含むが、それらに限定されない）への分化を可能にする培養基材及び培地組成物の開発。本発明は神経堤幹細胞及びその他の多能性神経幹細胞も提供する。かかる細胞は、上記に概略した単離及び細胞培養の開発抜きでは幹細胞として同定できないことを理解すべきことが重要である。神経幹細胞の同定は、いくつかの基準に合うことを必要とする；１）細胞が、１又は複数種の分化誘導体を発生することのできる未分化細胞であること；２）細胞が多大な増殖能力を有すること；３）細胞が自己再生又は自己維持できること（Hallら（1989）Development106 ： 619 ；Potterら (1990) Crypt．Development 110：1001）。「無限」に自己再生することが必ずできるものとしての幹細胞の概念は皮膚又は腸の如きの再生組織のみに適用される。胎芽の発達の場合、幹細胞は制約された自己再生能力しか有さないが、しかしそれにもかかわらず幹細胞である（Potterら (1990) 前掲）。クローン培養法の開発はここでの基準１及び２の実証を可能にした。サブクローン培養の開発（即ち、単個神経幹細胞をクローンし、そしてオリジナルのファウンダー細胞由来の子孫細胞を再クローンする能力）はここでの基準３の実証を更に可能にした。この実証の意義を理解するため、神経堤由来の細胞についての別の仮説を考える：個々の未分化神経堤細胞は、ニューロン及びグリアの両者を発生するように***するが（即ち、上記の基準１及び２に合う）、しかしこのような初期細胞***によって産生された娘細胞がニューロン又はグリアのいづれかを産生し、両者は産生しないとする。この場合、この神経堤細胞は幹細胞ではなく前駆細胞であり、その理由はそれらは自己再生能力を有さないからである。このときは、神経堤細胞クローンのサブクローニングに基づき、得られる「二次」クローンはニューロン又はグリアのいづれかを含み、両者は含まない。このことは認められていない。むしろ、二次クローンのほとんど又は全てがその親クローンと同様にニューロン及びグリアの両方を含んでいた。従って、この実験は、神経系の任意の領域に由来する神経前駆細胞が幹細胞特性を有する第一の絶対的な証拠を供する。「幹細胞」が哺乳動物中枢神経系から単離又は同定されたとの主張にもかかわらず、（Cattaneoら（1991）TrendsNeurosci， 14：338 ；Reyno ldsら（1992）Science 255：1707）。どのその他の一連の公開実験においても幹細胞特性についてのこれらの厳格な基準に合っていない。このことは、「幹細胞」なる語の不正確な使用にある程度及びかかる細胞の存在を裏付けする適切な実験試験を実施することの失敗にある程度反映している。本明細書で用いる「非形質転換細胞」なる語は、インビトロにおいて、形質転換細胞内でのウィルス遺伝子の発現により細胞に改変された増殖特性を授ける癌遺伝子を含むウィルス又はウィルスゲノムの一部の導入によって細胞を不死化する必要なく増殖することのできる細胞を意味する。これらのウィルス遺伝子は典型的にはウィルス感染により、又は単離したウィルス遺伝子を含むDNA ベクターによるトランスフェクションにより導入される。本明細書で用いる「遺伝子操作した細胞」なる語は、外来（即ち、自然でない）核酸、例えばDNA の導入されている細胞を意味する。この外来核酸は様々な技術、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、DEAE媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、レトロウィルス形質転換、プロトプラスト融合及びリポフェクションにより導入されうるが、それらに限定されない。この遺伝子操作した細胞は一過性で、又は長期的に外来核酸を発現しうる。一般に、一過性発現は外来DNA がトランスフェクト細胞の染色体DNA の中に安定的に組込まれていないときに起こる。他方、外来DNA の長期的発現は外来 DNA がトランスフェクト細胞の染色体DNAの中に安定的に組込まれたときに起こる。本明細書で用いている「不死化細胞」は、遺伝子操作した細胞内での不死化遺伝子の発現によって細胞に対して改変された増殖特性を授ける「不死化遺伝子」の導入に基づき、培養物において無限に増殖することのできる細胞を意味する。不死化遺伝子はウィルス感染により、又は１もしくは複数の癌遺伝子をエンコードする単離ウィルス核酸を含むベクターによるトランスフェクションによって細胞の中に導入することができうる。ウィルス又はウィルス癌遺伝子は、不死化は可能にするが、好ましくは細胞を形質転換せしめないものを選ぶ。不死化細胞は培養物において無限に増殖するが、動物の中に導入したときに腫瘍を引き起こさないものが好ましい。本明細書で用いる「形質転換細胞」なる語は、１）培養物の中で無限に増殖する能力；及び２）動物への導入により腫瘍を引き起こす；特性を有する細胞を意味する。「形質転換」とは、形質転換細胞の作製を意味する。本明細書で用いている「フィーダー細胞非依存性培養」又は文法的な同類語は、課題の組織に由来する細胞を加える培養皿の上に一般的に最初にまかれる別の種の細胞層抜きでの、インビトロでの細胞の増殖を意味する。この「フィーダー」細胞は、課題の組織に由来する細胞の接着にとっての下層を担うか、又はミトゲン及び生存因子の起源として働く。本明細書におけるフィーダー細胞非依存性培養は化学的に規定されている下層、例えばフィブロネクチン(FN)又はポリ−Ｄ−リジン(PDL)を利用しており、そしてミトゲン又は生存因子は別の細胞又は組織に由来する精製因子又は粗製抽出物を有する液体培養培地の添加により供される。従って、フィーダー細胞非依存性培養において、培養皿中の細胞は課題の組織に由来する一次細胞であり、そして課題の組織に由来する細胞の増殖を助けるのに必要とされるその他の細胞タイプを含まない。本明細書において用いている「クローン密度」なる語は、培養皿の中でプレート培養したときに単独の衝突し合っていない細胞の単離をもたらすのに十分に低い密度を意味し、一般には約 225細胞／100mm の培養皿である。本明細書において用いている「神経堤幹細胞」なる語は、（１）自己再生する、及び（２）非対称性***する；即ち、一の細胞が***して、一方が自己（再生）であり、そして他方がその親神経堤幹細胞に比してより限定された発達能を有している細胞である二つの異なる娘細胞を産生する、特性を有することを特徴とする神経堤に由来する細胞を意味する。しかしながら、上述は、神経堤幹細胞の細胞***それぞれが非対称性***をもたらす意味を考えるべきでない。神経堤幹細胞の***は、自己再生のみを、より発達の限定された子孫の産生のみを、又は自己再生幹細胞と限定された発達能を有する細胞との産生をもたらしうることが可能である。本明細書で用いている「多能性神経幹細胞」なる語は、神経堤幹細胞の特性に似たそれを有する細胞を意味しているが、しかし神経堤に由来している必要はない。むしろ、以降に述べる通り、かかる多能性神経幹細胞は成もしくは胎芽中枢神経系の脳及び／もしくは脊髄に由来する神経上皮組織、又は末梢神経系を含んで成る組織の中に存在しうる神経上皮組織を含むその他の様々な組織に由来しうる。更に、かかる多能性神経幹細胞はその他の組織、例えば肺、骨等から、本明細書において開示する方法を利用して誘導されうる。かかる細胞は、多能性細胞に限定すべきでないが、しかし再生できる、並びにニューロン及びグリアの別のタイプ、例えばPNS及びCNSのニューロン及びグリア又はその前駆細胞へと分化できる複能性（Pluripotent）細胞を含んで成りうる。これに関連して、本明細書に記載の神経堤幹細胞は、それらが記載の条件下で、インビドロにおいて自己再生、並びにニューロン及びグリアの全てでなく一部のタイプへと分化できることにおいて少なくとも多能性であることが認められうる。従って、神経堤幹細胞は特定の組織、即ち、胎芽神経管に由来する多能性神経幹細胞である。ほとんどの態様において、神経堤幹組織は神経細胞特異的表層マーカーを更なる特徴とする。かかる表層マーカーは、神経堤幹細胞上に見い出せることに加えて、それに由来するその他の多能性神経幹、例えば末梢神経系(PNS)及び中枢神経系(CNS)のグリア及びニューロン前駆細胞上でも見い出せうる。その例は神経堤幹細胞上の神経成長因子レセプターの細胞表層発現である。ラット、ヒト及びサルにおいて、この神経成長因子レセプターは低親和性成長因子レセプター（LN GFR）である。かかる幹細胞は細胞内中間線維タンパク質であるネスチンの発現をも特徴としうる。神経堤幹細胞は成熟PNSのニューロン又はグリア細胞に会合したマーカーがないことによっても更に特徴付けられうる。ラットにおいては、かかるマーカーには、PNS グリア細胞中のスルファチド、グリア線維状酸性タンパク質（GFAP）及びミエリンタンパク質Po、並びにPNS 神経細胞中のぺリフェリン及びニューロフィラメントが含まれる。 LNGFR は神経成長因子、即ち、インビボでの神経の生存にとって重要であることが示されている神経栄養因子にとってのレセプターである。LNGFR は、神経堤細胞及びシュバン細胞（PNS のグリア細胞）を含むいくつかの哺乳動物細胞タイプ、並びに胎芽中枢神経系全体にわたる脳室帯における細胞の表層上に見い出せる。（例えば、ラット及びヒヨコ系それぞれにおけるかかる細胞を研究した。Yo nら(1988) J. Neurosci. 8：3481-3496 及びHeuer, J. G.ら（1980）Neuron 5： 283-296 を参照のこと）。LNGFR に特異的な抗体が、ラットモノクローナル抗体 217C（Peng, W.W.ら（1982） Science 215：1102-1104) 及び192-Ig（Brockes ，J．P．ら(1977) Nature 266：364-366 及びChandler，C.E.ら(1984)J．Biol ．Chem． 259：6882‐6889）並びにヒト（Ross，A.H.ら（1984）Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 81：6681-6685；Johnson，ら（1986）Cell 47：545-554；Loyら（1 990）J．Neurosci Res. 27：651-644）に由来するLNGFRに関して同定された。ヒトLNGFR に対するモノクローナル抗体はサルに由来するLNGFR と交差反応することが報告されている（Mufson,E.G.ら（1991）J．Comp．Neurol．308：555-575 ）。そのDNA 配列はラット及びヒトLNGFR に関して決定されており（Radeke，M. J.ら（1987）Nature 325：593-597 及びChao，M.V.ら（1986）Science232：518- 521、それぞれ）、そしてラットとヒトとの間で保存性が高かった。下記の技術を利用し、任意の所望の哺乳動物種に由来するLNGFRに対して特異的なモノクローナル抗体を、まずLNGFR タンパク質をエンコードする核酸を単離することにより作り上げる。かかる核酸配列を獲得するための一のプロトコールは、哺乳動物種、例えばラットとヒトとの間で高く保存されているLNGFR 遺伝子領域に由来する１又は複数の核酸配列を所望の種に由来する哺乳動物組織由来のゲノムライブラリー又はCD NAライブラリーをスクリーンするハイブリダイゼーションプローブとして使用する（Sambrook，J.ら（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press.Molecular Cloning ：A Laboratory Manual 第２版，頁8.3-8.80，9.47-9.58 及び11.45-1 1.55 ）。クローンしたLNGFR 配列を次に、LNGFR タンパク質又はその細胞外（リガンド結合性）ドメインを発現宿主において発現させるために使用し、その宿主よりLNGFR タンパク質を精製する。精製は標準の技術、例えばゲル濾過、イオン交換又はアフィニティー樹脂でのクロマトグラフィーを利用して行う。次に精製LNGFR を適当な動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター）を免疫するのに用いて、ポリクローナル抗血清を作る、及び所望の種のLNGFR に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系の作製のための脾臓細胞を供する（Harlow，E.ら（1988） Cold SpringHarbor Laboratory Press,Antibodi es ： A Laboratory Manual ：頁139-242）。 LNGFR 又は多能性神経幹細胞もしくはその子孫の特徴的な任意のその他の表層マーカーに対する抗体の生産を検定するのに新規のスクリーニング法が利用できる。この方法は特定の抗原に対するポリクローナル抗体を産生する動物を検定するために、又はかかる抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別するために実施できうる。この方法において、免疫動物に由来する血液又はハイブリドーマ培養物に由来する上清液を、特定の神経細胞系の特徴的な表層マーカーを表示する生存神経細胞と接触させる。結合が起きたか否かの検出は数多くの任意の公知の方法により容易に決定される。特に好適な方法は、特定の抗原で免疫した、ポリクローナル血液及びハイブリドーマ形成のための脾臓細胞にとっての起源である種により産生された、イムノグロブリンに対して特異的であるラベル化抗体を使用する。上記の抗体アッセイにおいて用いた生存神経細胞は、抗体の所望される特定の表層マーカーに依存する。本例においては、マウスLNGFR に対するモノクローナル抗体を、シュバン細胞の解離一次培養を利用して同定した。本例に開示のアッセイに関して、マウス線維芽細胞は陰性コントロールとして働く。しかしながら、その他の細胞系の一次培養物をLNGFN に対するモノクローナル抗体を検定するために使用することができる。例えば、前脳コリン作動性ニューロン又は知覚ニューロンが使用できうる。更に、上皮細胞の一次培養物を陰性コントロールとして使用できうる。神経細胞上に見い出せるその他のマーカーには血小板成長因子レセプター（PD GFR）、線維芽細胞増殖因子（FGF）及び幹細胞因子レセプター（SCFR）が含まれる。PDGFR 及びFGF に対するモノクローナル抗体を検定するために有用な細胞にはグリア細胞又は線維芽細胞の一次培養物が含まれる。SCFRは神経細胞のサブセット上で発現される。メラノサイト又はメラノーマ細胞の一次培養物がこのレセプターに対するモノクローナル抗体を検定するのに利用できうる。陰性コントロールには線維芽細胞及びグリア細胞の一次培養物が含まれる。種特異的であるポリクローナル又はモノクローナル抗体を常に作り出さなければならないわけではない。ある種に由来する抗原決定基に対するモノクローナル抗体は一より多くの種に由来する抗体に対して反応しうる。例えば、上記した通り、ヒトLNGFR 分子に対して特異的な抗体はサルの細胞上のLNGFR も認識する。交差反応性抗体が入手できるのなら、上記の方法を利用して種特異的な抗体を作り上げる必要はない。神経堤幹細胞中の第二マーカーであるネスチンは細胞内に主に位置している中間線維状タンパク質であり、これはラットの末梢神経系におけるCNS 神経上皮細胞及びシュバン細胞の中に存在していることが示されている（Friedmanら（1990 ）J. Comp. Neurol. 295：43-51）。ラットネスチンに特異的なモノクローナル抗体が単離されている：ラット401 （Hockfield, S. ら（1985）J. Neurosci. 5（12）：3310-3328）。マウスのネスチンを認識するポリクローナルウサギ抗− ネスチン抗血清が報告されている（Reynolds, D.A. ら（1992）Science. 225：1 707-1710）。ラットのネスチン遺伝子をエンコードするDNA 配列がクローンされている（Lendahl, U. ら（1990）Cell：60：585-595）。これらのDNA 配列は他の哺乳動物種からネスチンクローンを単離するのに使用される。次にこれらの配列を、ネスチンタンパク質を発現するために使用し、そして様々な哺乳動物のネスチンに対して特異的なモノクローナル抗体をLNGFRに関して上記した通りに作る。本明細書で用いている「グリア前駆細胞」なる語は、完全に分化したグリア細胞を、この完全に分化したグリア細胞発達物に由来する前駆多能性神経幹細胞との間の中間体である細胞を意味する。一般に、かかるグリア前駆細胞は、成及び胎芽CNS 及びPNS 組織を含む様々な組織、並びにかかる前駆細胞を潜在的に含みうるその他の組織からかかる細胞を単離するための本明細書において述べた方法に従って誘導された細胞である。本明細書で用いている「PNS グリア前駆細胞」なる語は、PNS グリア系統にかかわる哺乳動物神経堤幹細胞より分化した細胞を意味し、そしてそれは***性細胞であるがいまだ、より分化した非***性PNS グリア細胞上に見い出せる表層又は細胞内マーカーは発現していない細胞である。かかる前駆細胞は好ましくは更なる分化を経た胎芽神経堤より単離された神経堤幹細胞より獲得されたものである。しかしながら、同等の細胞はその他の組織に由来しうる。PNSグリア前駆細胞を適当な培養条件の中に入れたとき、それらは適当な分化マーカー、例えばスルファチド及びGFAPを発現するPNS グリアへと分化する。スルファチドはラット、マウス、ニワトリ及びヒトにおけるシュバン細胞及び稀突起膠細胞（oligodendricytes）の表層上に見い出せる糖脂質分子である。シュバン細胞上でのスルファチドの発現はサイクリックAMD 又はその類似体、例えばフォルスコリン（forskolin）に対する軸索接触又は暴露のいづれかに依存する（Mirsky, R.ら（1990）Development 109：105-116）。スルファチドに対して特異的なモノクローナル抗体が報告されている（Sommer,I.ら（1981）Dev. Bi ol 83：311-327）。グリア原線維酸性タンパク質（GFAP）はCNS の星状細胞及びグリア細胞並びにシュバン細胞、PNS のグリア細胞により特異的に発現される中間線維状タンパク質である（Jessen, K.R.ら（1984）J.Neurocytology 13：923-934 及びFields , K.L.ら（1989）J.Neuroimmuno. 8：311-330)。GFAPに対して特異的なモノクローナル抗体が報告されている（Debus ら（1983）Differentiation 25 ：193-20 3)。マウス及びヒトGFAP遺伝子がクローンされている（Cowan,N. J. ら（1985）N. Y. Acad. Sci. 455：575-582 及びBongcamrudlowss, D. ら（1991）Cancer Res. 51：1553-1560 、それぞれ）。これらのDNA 配列は他の哺乳動物種からGFA Pクローンを単離するのに使用されている。これらのDNA 配列はGFAPタンパク質を発現するために使用され、そして様々な哺乳動物GFAPに対して特異的なモノクローナル抗体がLNGFR について上記した通りに作製される。本明細書において用いている「PNS グリア細胞分化を可能にする因子」なる語は、限定することなく、タンパク質もしくはステロイド分子の如きの化合物又は FNもしくはPDL の如きの基材であって、少なくとも神経堤幹細胞が、PNS グリア系統へと限定されることを可能にするものを意味する。神経堤幹細胞のかかる系統限定子孫には、少なくとも二重能である、即ち自己と、より成熟した非***性 PNS グリア細胞とをもたらすように***できるグリア前駆細胞が含まれる。本明細書において用いている「ニューロン前駆細胞」なる語は、完全に分化したニューロン細胞と、完全に分化した神経堤細胞が発達していく多能性神経幹細胞との間の中間体である細胞を意味する。一般に、かかるニューロン前駆細胞は成及び胎芽CNS 及びPNS 組織、並びにかかる前駆細胞を潜在的に含みうるその他の組織を含む様々な組織からかかる細胞を単離するための本明細書に記載の方法に従って誘導される。本明細書において用いている「PNS ニューロン前駆細胞」なる語は、１又は複数のPNS ニューロン系統とかかわり合う哺乳動物神経堤幹細胞から分化した細胞を意味しており、そしてそれは***性細胞であるが、いまだより分化した非*** 性PNS ニューロン細胞上に見い出せる表層又は細胞内マーカーを発現しない細胞である。かかる前駆細胞は好ましくは更なる分化を経た胎芽神経堤から単離された神経堤幹細胞より獲得されるものである。しかしながら、同等の細胞がその他の組織から得られうる。PNS ニューロン前駆細胞を適当な培養条件の中に入れたとき、それらは適当な分化マーカー、例えばぺリフェリン、ニューロフィラメント及び高ポリシアル酸神経細胞接着分子（高PSA-NCAM）を発現する成熟PNS ニューロンへと分化する。 57KDの中間線維タンパク質であるぺリフェリンは成げっ歯動物において、主に末梢ニューロンの中で発現される。ぺリフェリンのより制約された発現が脊髄及び脳幹の一部の運動ニューロン並びに一定の群のCNS ニューロンにおいて見い出されている。ぺリフェリンはラット胎芽において、主に末梢ガングリアのニューロンの中で、並びに脊髄における腹部及び側部運動ニューロンの中で発現される。（Gorham, J.D.ら（1990）Dev. Brain Res. 57：235-248)。このマーカーに対して特異的な抗体がラットにおいて同定されている（Portier, M. ら（1983/ 84） Dev. Neurosci, 6：335-344)。ラットペリフェリン遺伝子をエンコードするDNA 配列がクローンされている（Thompson, M.A.ら（1989）Neuron 2：1043-1 053)。これらのDNA 配列を、他の哺乳動物におけるぺリフェリン遺伝子についてのDNA 配列を単離するために使用し、それをそのタンパク質を発現するため、及びLNGFR について上記した通りに他の哺乳動物ぺリフェリンタンパク質に対して特異的な抗体を作るために使用する。ニューロフィラメントはニューロン特異性中間線維タンパク質である。３つのニューロフィラメント（NF）タンパク質が報告されている：NF68, NF-L（軽）とも呼ばれている69KDのタンパク質；NF160, NF-M（中）とも呼ばれている160KD のタンパク質；NF200,NF-H（重）とも呼ばれている200KD のタンパク質。一般に、ニューロンの中でのこれら３種のNFタンパク質の協同発現がある。ラットのNF200 及びNF160 タンパク質をエンコードするDNA 配列がクローンされている（Dautigny, A.ら（1986）BiochemBiophys, Res. Commun 154：1099-1106 及びNapolitano, E.W.ら（1987）J.Neurosci. 7：2590-2599 のそれぞれ）。３種のNFタンパク質遺伝子全てがマウス及びヒトにおいてクローンされている。マウスのNF68核酸配列はLewis, S. A.ら（1985）J. Cell Biol.100 ：843-85 0 において報告されている。マウスNFl60 核酸配列はLevy, E.ら（1987）Eur. J . Biochem 166：71-77 において報告されている。マウスNF200 核酸配列はShne idman, P. S.ら（1988）Mol. Brain Res.4：217-231 において報告されている。ヒトにおいては、核酸配列は、NF68についてはJulien, J.-P. ら（1987）Bioche m Biophys Acta 909：10-20 ；FN160 についてはMyers, M.W.ら（1987）EMBO J. 6：1617-1626 ；FN200 についてはLee, J. F.ら（1988）EMBO J. 7：1947-19 55 において報告されている。これらのDNA 配列を抗体の製造のためのタンパク質を製造するために、又はその他の哺乳動物のNF遺伝子を単離するために使用し、そしてそのタンパク質を発現させ、そしてLNGFR について上記した通りに任意の所望の種に対する抗体を作り上げる。本明細書において用いている「NF⁺」なる語はこれら３種のNFタンパク質のうちの１又は複数の発現を意味する。本明細書において用いている「PNS ニューロン細胞分化を可能にする因子」なる語は、限定することなく、タンパク質もしくはステロイド分子の如きの化合物又はFNもしくはPDL の如きの基材であって、少なくとも神経堤幹細胞がPNS ニューロン系統へと限定されることを可能にするものを意味する。神経堤幹細胞のかかる系統限定子孫には、少なくとも二重能である、即ち自己と、より成熟した非 ***性PNS ニューロンとをもたらすように***できるPNS 神経前駆細胞が含まれる。哺乳動物神経堤幹細胞組成物を提供し、これは神経堤細胞誘導体にとっての起源、例えばPNS のニューロン及びグリア前駆体、換言すればPNS ニューロン及びグリアの起源として働く。フィーダー細胞抜きでの神経堤幹細胞の単離及びクローン培養についての方法を提供する。提供する実施例において、これらの方法は、ミトゲン及び生存因子の起源もしくはヒヨコ胎芽抽出物の添加された化学的に改質した培地を利用する。ニワトリ胎芽の抽出物の中に存在している因子はラットの神経堤幹細胞の増殖及び自己再生を可能にする。しかしながら、ラットの神経堤幹細胞を単離及び増殖するために用いた培地は、その他の哺乳動物種、例えばヒト及び非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウサギ等から神経堤幹細胞を単離及び増殖するために使用できうる。ここで提供する培養条件は哺乳動物神経堤幹細胞及びその子孫の単離自己再生及び分化を可能にする。これらの培養条件は、哺乳動物神経堤幹細胞の自己再生並びにこの幹細胞及びその子孫の分化に関連する成長因子の検定及び評価の手段を提供するように改良してよい。これらの改良には、限定することなく、培養培地及び／又は基材の組成の変更、神経堤幹細胞又はその分化誘導体のいづれかを同定するのに用いる特異的なマーカーの変更を含む。フィーダー細胞層抜きでの、哺乳動物神経堤幹細胞のPNS のニューロン及びグリア系統への分化を可能にする培養条件を提供する。液体培養培地に加えて、これらの培養条件は、単独の、又はポリ−Ｄ−リジンと組合されたフィブロネクチンを含んで成る下層を利用する。提供する実施例において、ヒトフィブロネクチンを、ラットの神経堤幹細胞及びその子孫の培養のために用いる。ヒトフィブロネクチンを鳥類種及び任意の哺乳動物から単離した神経堤幹細胞の培養のために用いることができ、なぜなら、フィブロネクチンタンパク質の機能は様々な種の間で高く保存されているからである。数多くの種の細胞が、ヒトフィブロネクチンを認識し、且つそれに結合するフィブロネクチンレセプターを有する。課題の神経堤幹細胞を単離するため、この幹細胞を胎芽中のその他の細胞から分離することが必要である。まず、神経堤細胞を哺乳動物の胎芽から獲得する。哺乳動物の胎芽からの神経堤細胞の単離のため、最尾側の10体節（caudal-mos t 10 somites）を含む領域を初期胎芽（ラットにおいて10.5日目の妊娠日に相当）より切り出す。これらの本体切片（trunk section）をバランス塩溶液に入れて、典型的には４℃の冷却くぼみスライドに移し、そして適当なバンファー溶液、例えばハワード・リンガー溶液中のコラゲナーゼで処理する。その神経管から体節及び脊索がなくなった後、それらをフィブロネクチン（FN）コート化培養皿の上にプレート培養して、神経堤細胞が神経管から移動するようにさせる。24時間後、鋭利なタングステン製針で管を除去してから、堤細胞をNF−コート化プレートより、典型的には0.05％でのトリプシン溶液による処理によって除去する。脱離した細胞の懸濁物を遠心により集め、そして適当な化学限定培地中で適当な密度、一般には225細胞／100mm の皿においてまく。この培地は好ましくは無血清であり、そして神経堤幹細胞の増殖及び自己再生を可能にする成分を含む。この培養皿に適当な下層、典型的にはFNとポリ−Ｄ−リジン（PDL）との組合せをコートする。神経堤幹細胞の同定のための手順には、堤細胞の培養物の短期間、一般には20 分にわたる、室温、一般には約25℃での飽和レベルの特定のマーカー、例えばLN GFR に対して特異的な抗体を伴ってのインキュベーションが含まれる。過剰の抗体はプレートを、新鮮なビタミン混合物及び牛血清アルブミンの添加された、適当な培地、典型的にはＬ15培地（Gibco）ですすぐことにより除去する。次にこの培養物を室温において、蛍光団ラベル化第二抗体、典型的には適当な希釈率のフィコエリスリンＲ−コンジュゲート化第二抗体（TAGO）と約20分にわたりインキュベートする。次に過剰な第二抗体を適当な培地、例えばＬ−１５ A irを用いて除去する。次いでこのプレートに化学限定増殖培地を覆い、そして蛍光顕微鏡で観察する。個々のLNGFR⁺クローンを蛍光活性化細胞選別（FACS）により単離するか、又はより典型的には固定されたクローンでプレートをマーキングすることにより、単離する。このマーキングは典型的には３〜４mm直径で行い、これは一般に実験の際の任意の時点でのファウンダー細胞の子孫の明確な同定を可能にする。所望するなら、個々のLNGFR⁺クローンを、クローニングシリンダーの利用によるトリプシン処理によってオリジナルプレートから除去する。幹細胞の分化を可能にする手順には、所望の系統への分化を可能にする培地、例えばシュバン細胞分化（SCD）培地中で単離幹細胞を培養することを含む。その他の手順には、分化を可能にする基材、例えばFN又はFNとPDL 上での単離幹細胞の増殖が含まれる。幹細胞及びその誘導体の系列サブクローニングにとっての手順には、前記の通りの個々のクローンのトリプシン処理、それに続く所望の基材上でのクローンの再プレート、及び幹細胞の維持にとって適切な化学限定培地又はこの神経堤幹細胞の分化を可能にするSCD培地の如きの所望の培地の中での培養が含まれる。本明細書記載の方法は機能的なアッセイの基礎を提供し、このアッセイは神経堤幹細胞、グリアもしくはニューロン前駆細胞又はかかる前駆細胞の多能性幹細胞前駆体の特徴的な特性を有する哺乳動物細胞の同定及び細胞組成物の製造を可能にする。かかる細胞を胎芽神経管以外の組織から単離するには、前駆細胞及び／又は多能性幹細胞を組織中のその他の細胞から分離する必要がある。神経管からの神経堤幹細胞の単離に用いる実施例において示す方法は当業者によって他の組織に容易に応用できうる。まず、単個細胞懸濁物をこの組織から作る；この懸濁物を作るために利用する方法は使用する組織に依存して変わるであろう。単個細胞懸濁物を作り上げるには、例えば、一部の組織は組織の機械的な崩壊を必要とし、一方、他の組織は単独で、又は機械的崩壊と組合せたタンパク質分解酵素による消化を必要とする。組織、例えば血液は単個細胞懸濁物として既に存在しており、そして懸濁物を作り上げるために更なる処理は必要としないが、赤血球の高張性溶解が所望されうる。単個細胞懸濁物を作り上げたら、それはその表層上でLNGFR 又はその他の神経細胞特異性マーカーを発現する細胞に関して富化せしめることができうる。LNGFR⁺細胞についての富化のための一のプロトコールは、細胞懸濁物を LNGFRに対して特異的な抗体とインキュベートし、そしてLNGFR⁺細胞を単離することによる。神経細胞特異的表層マーカーを発現する細胞についての富化は、これらの細胞が少ないパーセンテージ（５％未満）の出発集団を表示するときに特に所望される。神経細胞特異性表層マーカーの如きに対する抗体と複合した細胞の単離は抗体ラベル化細胞を単離するための任意の物理的方法を利用して実施させる。かかる方法には、蛍光活性化細胞選別（それにおいては細胞は一般に抗− LNGFR抗体に結合する蛍光第二抗体、例えばマウス抗− LNGFR及びフルオレセインラベルヤギ抗マウスIgGで更にラベルされている）；より分け（panning）（それにおいては、抗体ラベル化細胞を第二抗体でコートされた組織培養プレート上でインキュベートする）；アビジン、セファロース、クロマトグラフィー（それにおいては、抗− LNGFR抗体を、細胞懸濁物とインキュべートする前にビオチニル化し、これにより複合細胞をアビジン含有アフィニティーマトリックス上で回収する〔即ち、この場合、抗体は結合性ぺアーの一方の構成員との抗体コンジュゲートである〕）；又は適当な抗−抗体でコートされた磁性ビーズの利用（これにより、ラベル化LN GFR 発現性細胞は磁石の利用により未ラベル細胞から分離される）が含まれる。上記の細胞単離手順は全て、その他の抗体及びその他の細胞に既に利用されている標準の公開された手順である。神経幹細胞特異性表層マーカーに特異的な抗体の利用は、胎芽神経管以外の組織からの多能性神経幹細胞の単離をもたらす。例えば、前述した通り、LNGFR はラット及びニワトリの胎芽中枢神経系全体にわたる脳室帯の細胞の中で発現される。このことは、他の哺乳動物種がLNGFR 発現の類似のパターンを有していることを意味し、そしてヒトLNGFR に対するモノクローナル抗体についてのヒトにおける研究（Loy ら（1990）J. Neurosci. Res. 27 ：651-654)はこの予測と一致している。脳室帯由来の細胞（Cattaneo ら（1991）Trends Neurosci. 14：33 8-340 ；Reynoldsら（1992）Science255 ：1707-1710）は幹細胞のようであるため（Hallら（1989）Development 106：619-633 ；Potterら（1990）Developmen t 110：1001-1020)、神経細胞特異性表層マーカーに対する抗体は中枢及び末梢神経系並びにその他の組織源からの多能性神経幹細胞の単離において有用であることを証明するであろう。他方、又は上記の免疫単離工程と共に、細胞をクローン密度、一般には 225細胞／100mm の皿において、適当な基材上の適当な化学的に規定されている培地の中で、ラット神経堤幹細胞の単離についての実施例において記載されている通りにプレート培養する。神経堤様幹細胞（例えば多能性神経幹細胞）の存在は、単個細胞が、本明細書に記載の培養条件を利用して自己再生でき、且つ少なくとも PNS ニューロン及びグリア系統の構成員へと分化できることを実証することにより確認できる。その他のタイプの多能性神経幹細胞は、その他のタイプ、例えばCNS ニューロンもしくはグリア細胞又はその前駆細胞への分化により同定される。上記の方法において利用した組織の起源に依存して、多能性神経幹細胞は獲得できないことがある。むしろ、更に分化した細胞タイプ、例えばグリア及び神経前駆細胞が得られうる。本明細書に記載の移植アッセイ系は機能的なアッセイ基礎を提供し、このアッセイは神経堤幹細胞、多能性神経幹細胞及び／又はニューロンもしくはグリア前駆細胞の特徴的な特性を有する哺乳動物細胞の同定を可能にする。上記のインビボ又はインビトロアッセイのいづれかによって同定された課題の細胞は、標準の外科的手順を利用して哺乳動物宿主に移植する。この移植した細胞及びその子孫はその宿主細胞から、種特異性抗原の存在により、又は導入したマーカー遺伝子の発現により区別される。移植した細胞及びその子孫を、移植細胞の発達能を調べるため、成熟ニューロン及びグリアのマーカーのためにも染色する。この移植アッセイは、上記のインビトロ培養アッセイに加えて、その機能特性によって神経堤幹細胞を同定する手段を提供する。更に、多能性神経幹細胞、神経堤幹細胞、又はニューロンもしくはグリア細胞の前駆細胞の特徴を有する細胞の移植は、動物モデルにおけるPNS 及びCNS の神経障害にとってのかかる細胞治療能を調べるための手段を提供する。マウスにおけるPNS 障害の例には振せん（trembler）及び震え（shiverer）緊張（strain）が含まれる。振せん突然変異はミエリン塩基性タンパク質（MBP)にとっての構造遺伝子における欠陥を含むと考えられている。この突然変異は、MBP遺伝子と同じ染色体11の領域に位置する。この突然変異はPNS の中の軸索の欠陥ミエリン化をもたらす。類似の障害がヒトのシャルコー・マリー・ツース病であって進行性ニューロパシー筋肉萎縮をもたらす病気において見い出せる。マウスにおける震え変異は、CNS にわたる重症なミエリン欠陥及びPNS における緩やかな過剰ミエリン化をもたらす。重症な震え状況が生後12日目において見られる。類似の障害がヒトのギラム・バレ（Guillaum-Barre）病であって、急性発熱多発性神経炎を特徴とする病気に見られる。多能性神経幹細胞、神経堤幹細胞又はPNS もしくはCNS のニューロンもしくはグリア前駆細胞（インビトロ又はインビボアッセイのいづれかにより同定）の特徴を有する細胞を、これらの細胞の治療能を調べるために神経障害を示している哺乳動物に導入する。これらの細胞は好ましくは、類似のMHC ゲノタイプを有する哺乳動物、又はシクロスポリンＡの如きの薬剤を用いて免疫抑制した宿主哺乳動物から単離する。これらの細胞を特定の哺乳動物において有効であると知られている様々な末梢神経を含む領域に、又はCNS を含むことを示す哺乳動物に関する脊髄もしくは脳に注射する。これらの細胞は所望の部位に、最適濃度を決定するために一連の濃度で注射する。他方、これらの細胞は注射部位からの細胞の急速消散を防ぐために血漿塊又はコラーゲンゲルに導入する。モデル動物の神経状態に及ぼすこの処置の効果を記録する。上記の突然変異マウスにおける所望の治療的効果には、発作の削減もしくは停止、又は運動下肢（lower motor extremit ies)の改善された運動が含まれる。多能性神経幹細胞、例えば神経堤幹細胞を同定する、並びに前記幹細胞のクローン増殖及び分化を可能にする培養条件を決定する強い関心がもたれている。多能性神経幹細胞又は神経堤幹細胞を保有することは、自己再生にかかわる成長因子の同定を可能にする。更に、（１）特定の系統への幹細胞の初期段階の限定；（２）かかる限定の阻止、及び（３）幹細胞又は誘導体の増殖の陰性コントロール；にかかわる未発見の成長因子がまだありうる。多能性神経幹細胞、神経堤幹細胞、その子孫、又はそれらに由来する不死化細胞系は以下に有用である：（１）幹細胞再生に関係する成長因子の検定及び評価；（２）かかる細胞又はその分化子孫の表層上で発現されるレセプターに結合する成長因子又は薬剤の如きのリガンド（例えば、グリア成長因子（GGF)、へレグリン及びNeu分化因子（NDF)）の検定及び単離；（３）多能性神経幹細胞に特異的な成長因子を発現又は分泌する細胞の起源の提供；（４）ニューロン及びグリアの如きの幹細胞誘導体の分化に関係するその他の成長因子の検定及び評価；（５）一定の系統の前駆細胞及び成熟細胞の両方を含む様々な神経幹細胞誘導体の製造、並びに（６）モデル動物系及びヒトにおけるPNS 及びCNS の神経障害を処置するのに有用な細胞の起源の提供。ここで利用する培養条件はインビトロでの幹細胞の増殖及び分化を可能にし、そして神経幹細胞の特徴を有する細胞の存在について哺乳動物組織をアッセイすることのできる機能的なアッセイを提供する。本明細書に記載の移植アッセイは、哺乳動物神経幹細胞を同定せしめうる機能的なアッセイも提供する。実施例に記載の通り、神経堤幹細胞の培養において少なくとも６〜10の世代にわたって継代する。それらもくしはその他の多能性神経幹細胞系又は本明細書に記載の方法により獲得した前駆細胞を不死化することは不必要でありうるが、細胞系が得られたら、栄養もしくは分化因子をスクリーニングするため、又は動物における実験的移植療法を開発するために有用な増殖し続ける細胞系を作り出すためにそれを不死化させてよい。かかる不死化は多能性神経幹細胞又はグリア及びニューロン細胞の前駆体において、不死化遺伝子を導入するためのかかる細胞の遺伝子改変によって得られうる。不死化遺伝子の例には以下のものが含まれる：（１）有核癌遺伝子、例えばv-myc, n-myc, T 抗原及びEwing 肉腫癌遺伝子（Fredericksenら（19 88）Neuron 1：439-448 ；Bartlett, P.ら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：3255-3259 及びSnyder,E.Y.ら（1992）Cell 68：33-51)、（２）細胞質癌遺伝子、例えばbcrabl及びニューロフィブロミン（Solomon, E. ら（1991） S cience 254： 1153-1160)、（３）膜癌遺伝子、例えばneu 及びret（Aaronson, A .S.A（1991）Science 254：1153-1161)、（４）腫瘍抑制遺伝子、例えば突然変異ｐ53及び突然変異Rb （レチノブラストマ）（Weinberg, R. A. （1991）Scie nce 254：1138-1146)。及び（５）その他の不死化遺伝子例えばNotch 優先ネガティブ（Coffman,C. R. ら（1993）Cell 23：659-671)。特に好ましい癌遺伝子にはv-myc 及びthe SV40 T抗原が含まれる。外来（異種）核酸を多能性神経幹細胞又はその子孫に導入又はトランスフェクトすることができうる。外来DNA を保有している多能性神経幹細胞又はその子孫を遺伝子操作した細胞と呼ぶ。外来DNAは様々な技術を利用して導入できうる。好適な態様においては、外来DNA はレトロウィルストランスフェクションの技術を利用して多能性神経幹細胞に導入する。課題の遺伝子を抱える組換レトロウィルスを、マーカー遺伝子、例えばＥ．コリβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子又は癌遺伝子を導入するのに使用する。組換レトロウィルスを、高力価ウィルス粒子（一般には10⁵〜10⁶pfu／ml）を有する培養上清液を作り出すためにパッケージング細胞系の中で作る。組換ウィルス粒子を、神経幹細胞又はその子孫の培養物に感染させるために使用し、その細胞培養物をウィルス粒子及び８μｇ／ml のポリブレンを含む培地と３時間インキュベートすることにより感染させる。レトロウィルス感染の後、細胞をすすぎ、そして標準培地の中で培養する。次に感染細胞を外来DNA の取込み及び発現について分析する。これらの細胞は、選択マーカー遺伝子を取込んで発現する細胞について選別する選択条件にかけてよい。別の好適な方法においては、外来DNA はリン酸カルシウム沈殿媒介トランスフェクションの技術を利用して導入する。課題の１又は複数の遺伝子をエンコードするDNA を含むリン酸カルシウム沈殿物はWiglerら（1979）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：1373-1376の技術を利用して調製する。神経幹細胞又はその子孫の培養物を組織培養皿の中で樹立する。細胞をプレート培養して24時間後、約20 μｇ／mlの外来DNA を含むリン酸カルシウム沈殿物を加える。これらの細胞を室温で20分インキュベートする。30μＭのクロロキンを含む組織培養培地を加え、そして細胞を37℃で一夜インキュベートする。トランスフェクション後、細胞を外来DNA の取込み及び発現について分析する。これらの細胞は、選択マーカー遺伝子を取込んで発現する細胞について選別する選択条件にかけてよい。以下は例示のために紹介し、そして本発明を限定するわけではない。更に、本明細書において挙げている全ての文献は引用することで本明細書に組入れる。実施例１神経堤細胞の調整所定の調製品のため、５〜10匹の機を得た妊娠雌Sprague-Dawleyラット（Simo nson Laboratories, Gilroy, California）をCO₂窒息により殺した。胎芽を取り出し、そしてHankのバランス塩溶液（HBSS）（Gibco, Grand Island, New York ）の中に４℃で２〜４時間入れておいた。解剖顕微鏡の下で、室温において、ほぼ最尾側の10体節に相当する領域由来の組織のブロックをＬ型電気分解式の鋭利なタングステン製針を用いて各胎芽から切り出した。本体切片を、ハワーズ・リンガー溶液の中で0.75mg／mlの濃度（１リットルのdH₂O；NaCl 7.2 g ；CaCl₂ 0.17g ；KCl 0.37g 当り）の濃度にしたコラゲナーゼ（152 単位／mg ）（Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey）で処置し、そして使用前に0.22μｍのフィルターに通すことにより除菌した。このコラゲナーゼ溶液を少なくとも３回交換し、そして各交換に伴って、本体切片をパスツールピペットに通すことにより徹底的に粉砕した。多湿CO₂雰囲気の中で37℃で20分間インキュベーションした後、その本体切片を非常に緩やか粉砕してほとんどの神経管が体節及び脊索を含まなくなるようにした。そのコラゲナーゼ溶液を低温完全培地（以下に詳細）で数回交換することにより急冷した。その神経管を、完全培地ですすいだフィブロネクチンコート化（基材調製品は以下に詳細）60mm組織培養皿（Corning, Corning, New York）の上にまいた。神経管が付着するよう30分のインキュベーションを経た後、その皿を５mlの培地であふれさせた。24時間の培養期間の後、Ｌ型電気分解式の鋭利なタングステン製針及び４Ｘの対物レンズの付いた逆位相差顕微鏡を用いて、各神経管を、基材上に移動した。神経堤細胞から慎重にかき取った。堤細胞は0.05％のトリプシン溶液（Gibco)による37℃で２分の処理により除去した。これらの細胞を2000r.p.m で４分遠心し、そしてそのぺレットを１mlの新鮮な完全培地の中に再懸濁した。一般に、細胞は 225細胞／10 0mm の皿の密度でプレート培養した。基本調製品Ａ．フィブロネクチン（FN）基材組織培養皿にヒト血漿フィブロネクチン（New York Blood Center,New York,N ew York）を下記のようにしてコートした。凍結乾燥したフィブロネクチンを滅菌蒸留水（dH₂O）の中に10mg／mlの濃度となるように再懸濁し、そして使用時迄 −80℃で保存した。このフィブロネクチンストックをダルベッコリン酸緩衝食塩水（D-PBS)(Gibco) の中に 2 50mg／mlの濃度となるまで希釈した。このフィブロネクチン溶液を組織培養皿に載せ、そして直ちに捨てた。Ｂ．ポリ−Ｄ−リジン（PDL)及びFN基材滅菌ポリ−Ｄ−リジン（PDL)をdH₂Oの中に 0.5mg／mlの濃度となるように溶解した。このPDL 溶液を組織培養プレートに載せ、そして直ちに捨てた。そのプレートを室温で乾かし、５mlのdH₂Oですすぎ、そして再び乾かした。次いでフィブロネクチンを上記の通りにしてPDL の上に載せた。実施例２ラット神経堤幹細胞の増殖のための限定培地の開発無血清の化学限定基礎培地を、現在の限定培地の処法を基礎に開発した。この基礎培地は、Bottenstein, J. E.ら（1979）Proc.Natl. Acad. Sci. USA 76：5 14-517 に記載の添加剤が補充され、そして更にSieber-Blum, M.ら（1985）Exp. Cell Res. 158：267-272 に記載の添加剤の補充されたHarwot, E.ら（1979）Me thods in Enzymology 58：574-583 に記載の通りに配合したＬ15−CO₂ より成る。最終処法をここに示す：Ｌ15−CO₂ に 100μｇ／mlのトランスフェリン（Calb iochem, San Diego, California），５μｇ／mlのインスリン（Sigma, St. Loui s, MO），16μｇ／mlのプトレスシン（Sigma），20nMのプロゲステロン（Sigma ），30nMの亜セレン酸（Sigma)，１mg／mlの結晶化牛血清アルブミン（Gibco)， 39pg／mlのデキサメタソン（Sigma)，35ng／mlのレチン酸（Sigma)，５μｇ／ml のα−ｄ，１−トコフェロール（Sigma），６３μｇ／ｍｌのヒドロキシブチレート（Sigma），25ng／mlの塩化コバルト（Sigma），１μｇ／mlのビオチン（Si gma），10ng／mlのオレイン酸（Sigma）， 3.6mg／mlのグリセロール， 100ng／ mlのα−メラノサイト刺激ホルモン（Sigma），10ng／mlのプロスタグランジンEl（Sigma），67.5ng／mlのトリヨードサイロニン（Aldrich chemical Company, Milwaukee,Wisconsin）， 100ng／m lの表皮成長因子（Upstate Biotechnology,Inc., Lake Placid, New York）， 4 ng／mlのbFGF（UBI）及び20ng／mlの2.55 NGF（UBI）を加える。フィーダー細胞非依存性培養における神経堤幹細胞の増殖及び再生を可能にするため、この基礎培地に10％のヒヨコ胎芽抽出物（CEE）を添加する必要があった。この添加された培地を完全培地と呼ぶ。 CEE 下記のようにして調製した：ニワトリの卵を多湿雰囲気の中で38℃で11日間インキュベートした。卵を洗い、そして胎芽を取り出し、そして４℃の滅菌最少必須培地（グルタミン及びEarle 塩を含むMEM）（Gibco）を含むぺトリ皿の中に入れた。約10づつの胎芽を30mlのシリンジンを通じて50mlの試験管（Corning ）に入れることによりふやかした。このことは典型的には25mlの容量をもたらした。25mlづつに25mlのMEM を加えた。この試験管を４℃で１時間ゆらした。滅菌ヒアルロニダーゼ（１mg／胎芽25ｇ）（Sigma）を加え、そしてこの混合物を30, 000ｇで６時間遠心した。その上清液を集め、0.45μｍのフィルターにまず通し、次いで0.22μｍのフィルターに通し、そして使用時まで−80℃に保存した。個々の神経堤細胞の生存及び増殖にとって必要とされる低い細胞密度において、胎児牛血清（FCS, JR Scientific）又はCEE のいづれかが、クローン形成のために基礎培地の他に必要とされる。この培地を補充するためにFCS を使用するとき、それは55℃で30分間の処理により熱不活性化させる。FCS は−20℃に保存し、そして使用前に0.22μｍのフィルターに通した。 CEE は補助剤として好ましく、なぜならFCS の存在下においては、神経堤由来の細胞のほとんどが平らな線維芽細胞的な形態を示し、そしてLNGFR の発現が失われるからである。FCS 及びCEE の両者がないとき、神経堤細胞からクローンの形成は非常に少なくなる。実施例３多能性ラット神経堤細胞の単離及びクローニングＡ．神経堤細胞により発現される抗体マーカーの同定ラット神経堤細胞を同定及び単離するためには、これらの細胞を認識するのに用いることのできうる抗体マーカーを同定することが必要であった。E10.5神経管をフィブロネクチン（FN）下層の上に外植すると、次の24時間かけて神経管から移動した神経堤細胞の多数が、モノクローナル抗体192-Ig及び 271Ｃにより認識される低親和性NGF レセプター（LNGFR）を発現した。培養物において24時間の増殖を経た外植神経管の背面側からの神経堤細胞の外成長を図１のパネルＡに示す。図１のパネルＢは神経堤細胞におけるLNGFR の発現（緑色の蛍光体）及び巣ごもり（nest in）（赤色の蛍光体）を示す。神経堤細胞を下記のようにして抗体でラベルした：細胞表層抗原、例えばLNGF R に関して、生存細胞を培養物の中でラベルすることが可能であった。その培養物を第一抗体溶液と室温で20分インキュベートした。その培養物をＬ15培地（Gi bco）及びそれに１：１：２で補充された新鮮なビタミン混合物（FVM）（Hawrot , E.ら（1979）前掲）及び１mg／mlの牛血清アルブミン（Ｌ15 Air）で２回洗った。次にその培養物を室温で20分間、Ｌ−15 Airの中で１：200 の希釈率となっているフィコエリスリンＲコンジュゲート化第二抗体（TAGO）とインキュベートした。次にこの培養物をＬ−15 Airで２回すすぎ、そしてそのオリジナル培地に戻し、そして蛍光顕微鏡で調べた。ウサギ抗体LNGFR 抗血清（Weskamp, G. ら（ 1991）Neuron ６：649-663）はGisela Weskamp、カリフォルニア大学、サンフランシスコの好意による提供物であり、そして１：1000の希釈率で使用した。モノクローナル抗 −NCAM抗体５Ａ５（Dodd, J. ら（1989）Neuron 1：105-116）及びモノクローナル抗−スルファチド抗体Ｏ₄（Sommer, I.ら（1981）Dev, Biol. 83：311-327）は、Developmental Studies Hybridoma Bank（Johns Hopkins大学、バルチモア、メリーランド州）よりハイブドーマ細胞として入手し、そして提供の説明通りに準備した。細胞内タンパク質に特異的な抗体で細胞をラベルするには、ラベル前に細胞を固定し、そして浸透性にする必要がある。ほとんどの免疫細胞学にとって、ホルムアルデヒド固定が行われる。37％のホルムアルデヒド溶液を、１mMのHEPES バッファー（Gibco）を含むS-MEM の中に１：10に希釈した。培養物を 3.7％のホルムアルデヒドで室温で10分処理し、次いでD-PBS（Gibco）で３回すすいだ。一部の中間線維タンパク質（NF及びGFAP）にとっては、ホルムアルデヒド固定は不可能である。培養物は95％のエタノール及び５％の氷酢酸の溶液により−20 ℃で20分間処理することにより固定する。細胞質抗原の染色にとっては、固定化細胞はまずD-PBS, 0.1％のTween-20（Bi o-Rad Laboratories、リッチモンド、カリフォルニア）及び10％の熱不活性化正常ヤギ血清（NGS）を含んで成るブロッキング溶液で室温で15分処理する。第一抗体はD-PBS, 0.1％のTween-20及び５％のNGS の溶液で希釈する。固定化細胞を第一抗体の中で４℃で一夜インキュベートし、次いでDPBS, 0.05％のTween-20で２回すすぐ。蛍光第二抗体はD-PBS, １％のNGS で希釈し、そして細胞に室温で１時間にわたって適用する。この細胞をD-PBS, 0.05％のTween-20で２回すすぐ。光増白を防ぐため、グリセロール中の８mg／mlのＮ−プロピルガレートの溶液を、蛍光顕微鏡観察の前に、染色細胞の上に載せた。マウスモノクローナル杭−GFAP，Ｇ−Ａ−５（Debusら（1983）Differentiat ion 25：193-203）をSigma より購入し、そして１：100 の希釈率で使用した。マウスモノクローナル杭−NF200，SMI3aをSternberger Monoclonals Inc., バルチモア、メリーランドより購入し、そして１：100 の希釈率で使用した。SMI3a の反応性は、Sternberger,L.A．ら（1983）Proc. Natl. Acad.Sci.USA 80：6126 -6130に記載の06-53モノクローナル杭体と同等である。ぺリフェリンに対する精製ウサギ抗体（調製品199- 6）をシンシナチ大学、オハイオのLinda Parysek博士より入手し、そして1:500の希釈率で使用した。フローサイトメトリー分析は、神経堤細胞の70%より大が多少のLNGFR免疫反応性を示すことを示唆した（図１、パネルＤ）。約20％の神経堤細胞が高レベルの LNGFRを発現した。一部の実験において、高レベルのLNGFRを発現する神経堤細胞を、192-Ig（杭−LNGFR）でラベルして、蛍光活性化解剖選別（FACS）にかけることにより更に精製した。しかしながら、単個細胞分析のためには、クローン密度においてバルクの神経堤細胞集団をプレート培養し、次いで192-Igによる生存細胞ラベリングによりLNGFR陽性細胞に同定することがより好都合であることが実証されている。ほとんど又は全ての神経堤細胞は、CNS神経上皮細胞において見い出せる中間線維タンパク質であるネスチンも発現した。ネスチン及びLNGFRの両者を同時発現する個々の神経堤細胞を図2、パネルＡ−Ｃに示す。パネルＡは位相差での個々の神経堤細胞を示す。パネルＢ及びＣは杭−LNGFR (パネルＢ）及び杭−ネスチン（パネルＣ）の両者で染めた後のこの細胞を示す。図２、パネルＤ−Ｆはこのネスチン⁺、LNGFR⁺神経堤細胞のクローン子孫もネスチン及び LNGFRを同時発現することを示す。Ｂ．多能性神経堤細胞のクローニング個々の神経堤細胞の発達能を限定するため、クローン培養でのこれらの細胞の増殖を可能にする条件を樹立した。図３は下記の細胞クローニング実験を示すフローチャートを提供している。図３において、プレート培養培地は前記の完全培地を意味しており、そして分化培地は下記のSCD培地を意味する。無FCSのCEE含有培地（完全又はプレート培養培地）を用い、単独の神経堤細胞（図４、パネルＡは位相差、そしてパネルＢは、LNGFR染色）をFN/ PDL下層の上でプレート培養し、そして増殖及び分化させた。9〜14日後、単独の神経堤細胞により見つけられた多数のクローンは大きく、且つ神経形態を有する細胞を含んでいた（図４、パネルＣ、位相学）。定量は、クローンの＞60％が神経と非神経細胞との混合物を含むことを示唆した（下記参照）。これらの神経細胞はパン−神経マーカー、例えばニューロフィラメント（図４、パネルＥ）杭−NF160染色）及び高ポリシアル酸（PSA）NCAM （図４、パネルＤ、杭−NCAM染色）に対する抗体により、並びに末梢神経系（PNS）ニューロンにより、優先的に発現される中間線維タンパク質ぺリフェリン（図４、パネルＦ）に対する抗体によりラベルされうる。重要には、これらのニューロンはネスチンもLNGFRも発現しなく、それらが未分化神経堤細胞の特徴である２つのマーカーを失っていることを示唆する。ニューロン含有クローンも非神経細胞を含んでいた。これらの細胞はニューロンと異なり、LNGFR及びネスチンを発現し続け、そしてシュバン細胞の特徴的な長い形態を示した。未熟シュバン細胞はLNGFR及びネスチンの両者を発現することで知られるが、これらのマーカーはこの系においてシュバン細胞を同定せしめるのは、不十分であり、なぜならそれらは同様に神経堤前駆細胞により発現されるからである。より限定的なシュバン細胞マーカーの発現は、シュバン細胞の分化を高めることで知られる培地の中にこれらの細胞を移し入れることにより誘発される。シュバン細胞分化（SCD）培地と呼ぶこの培地は10％のFCSと、アデニレートサイクラーゼの活用化因子であるフォルスコリン５μＭの両者を含む。図５は神経堤由来グリアによるシュバン細胞表現型の発現を示す。FN上にまずプレート培養したクローンを完全培地の中で１週間増殖させ、次いでSCD培地に移し、そして固定及び免疫細胞化学の前に更に1〜2週間にわたり増殖させた。二形態の細胞、即ち、一方が長く、そして他方が平らな細胞が位相差において見られた（パネルＡ及びＤ）。３つのマーカー、LNGFR, Ｏ₄ 及びGFAPの調和発現を実証するため、２種類の二重ラベル実験を実施した。生存細胞をモノクローナル杭−LNGFR 192IgG（パネルＢ）及びモノクローナルＯ₄IgM（パネルＣ）で表層ラベルし、そして後固定した。平行して、同一のクローンに由来する別の細胞をまずＯ₄で表層ラベルし、次いで酸エタノールで固定し、浸透化し、そして杭−G FAP （IgG）で染色した。LNGFR⁺細胞（パネルＢ）はＯ₄ ⁺であり、そしてＯ₄ ⁺細胞のほとんど又は全てはGFAP⁺でもある（パネルＥとＦ）ことも認識すべきである。（パネルＥ）におけるＯ₄染色の程度は（パネルＣ）におけるそれとは明らかに異なり、なぜなら抗原の再分布が酸エタノール固定の後に起こるからである。パネルＣにおいて、平らなＯ₄ ⁺細胞はLNGFRに関してより弱めに染色された（パネルＢ）。かかる平坦化はミエリン化の指標であり、そしてミエリン化を経たシュバン細胞がLNGFRを下降制御及びＯ₄ を上昇制御することと一致した。 SCD培地の中で5〜10日経て、クローン中のほとんど又は全ての非ニューロン細胞が、グリア細胞に特異的な中間線維であるグリア線維状酸性タンパク質（GFAP）と、モノクローナル抗体Ｏ₄ により認識される細胞表層糖脂質スルファチドとを発現した。かかる「成熟」クローンのポリクローナル杭−ぺリフェリン及びモノクローナルＯ₄、並びに杭−GFAP抗体により三重ラベリングは、スルファチドとGFAPがぺリフェリン陽性クローンにより発現されず、そしてこれらの２つのグリアマーカーは非ニューロン細胞集団において同時発生していることを示した（図６）。図６は、位相差（パネルＢ）での単独のファウンダー細胞由来のクローンを示し、これはLNGFRを発現する（パネルＢ）。このクローンを完全培地（CEEを含み、且つ血清を欠く）の中で増殖及び分化させ、次いでSCD培地（血清及びフォルスコルを含む）に移し入れた。約10日後、その培養物を固定し、そしてウサギ杭−ぺリフェリン（パネルＣとＤ、緑／黄）、杭−GFAP(IgG)（パネルＣ、赤）及びＯ₄(IgM) （パネルＤ、青）で三重ラベルした。パネルＣとＤは同じクローンから２つの異なる領域である。 GFAPは異状細胞により発現され、そしてスルファチドはCNSにおける稀突起膠細胞により発現されるが、これら２つのマーカーの同一細胞における同時発現は末梢グリア細胞に固有である（Jessen,K.R.ら(1990)Devel.109:91-103及びMirsk y,R．ら(1990)Devel.109:105-116)。従って、これらのデーターは、ネスチン及びLNGFRを発現する単個の神経堤細胞が、末梢ニューロン及びグリアの両者を含む分化細胞のクローンをもたらすことができることを示唆している。神経表現型に至る分化は、LNGFR及びネスチン発現の欠失、並びに神経マーカー、例えばニューロフィラメント、高PSA-NCAM及びぺリフェリンの増大にかかわる。他方、グリア系統においてLNGFR及びネスチンの発現は持続され、そして更にグリアマーカー（GFAP及びＯ₄）が必要とされる。ニューロン及びグリアを産生するクローンは全て、試験した分化マーカーのいづれも発現しない少なくとも一の別の細胞タイプをも産生する；これらの細胞の種類は不明である。まとめると、これらのデーターは、LNGFR及びネスチンの同時発現により同定及び単離されたラット神経堤細胞の多能性を樹立する。実施例４インビトロでの多能性神経堤細胞の自己再生 10%のCEEの補充された、且つFN/ PDL基材の上にある培地中での10日間の培養後、ニューロンを含む全ての神経堤細胞クローンはLNGFR及びネスチンを発現する非ニューロンクローンも含んでいた（上記）。これらの細胞が未熟グリアであるか、又は自己再生を経た多能性神経堤細胞であるかを決定するため、系列サブクローニングを行った。図７はこれらのサブクローニング実験をまとめたフローチャートを供する。図７において「プレート培養培地」はCEEを含み、且つFCSを欠く完全培地を意味し、そして「分化培地」はFCS及びフォルスコリンを含むSCD 培地を意味する。系列サブクローニング実験のため、下記の通りにクローンを集め、そして再プレート培養した。一次クローンを顕微鏡で調べてそれらが衝突し合わないコロニーであること及びクローン全体が内接円の中にあることを確実なものとした。その手続全体を通じて滅菌技術を利用し、ガラス製クローニングシリンダー（直径 3 mm）の一端にシリコーングリース（Dow Corning）をコートし、そしてその一次クローンのまわりに置き、グリースが、培地が通過することのできないシールを形成するようにさせた。これらの細胞を、まずそれらをl00mlの0.05%のトリプシン溶液（Gibco）で、多湿の5%CO₂インキュベーターの中で37℃で3分処理することにより、シリンダーから取り出した。室温で、70μｌのトリプシン溶液を取出し、そして 70mlの完全培地に置き代えた。その細胞をピペットチップを介する強い粉砕により 100μ１の容量に再懸濁し、そして全容量を5mlの完全培地に希釈した。この 5mlを次に１又は２枚の60mmの皿に載せ、それを多湿の5%CO₂インキュベーターの中に２時間入れ、その時点でこの培地を新鮮な完全培地と交換した。単個のファウンダー細胞を同定し、そして以下の通りに二次クローンへと増殖させた。 LNGFR−陽性前駆細胞により創設された一次クローンをPDL/FN基材の上で6日間増殖させた（図８、パネルＡ）。この時点で、LNGFR −陽性細胞を含むクローンを生存細胞表層ラベル化により同定し、そしてこれらのクローンを次に上記のトリプシン処理によりオリジナルプレートから取出した解離した細胞を次にそのファウンダー細胞と同じ培養条件のもとでクローン密度による再プレート培養した。個々の二次ファウンダー細胞を、生存細胞を192-Igでラベルすることにより同定し、そしてその位置に印を付けた（図８、パネルＢ及びＢ′は２つの個々の二次ファウンダー細胞を示す；パネルＣ及びＣ′は17日目のこれらの個々の細胞のクローン子孫を示す）。非ニューロン及び軸索担持細胞が共にクローンの中に見えた（図８、パネルＣ及びＣ′）。図８に示すが如きの二次ファウンダー細胞に由来するクローンをSCD培地に移してシュバン細胞マーカーを発現させた。約10日後、そのサブクローンを同定し、そしてNF160及びGFAPに回して二重ラべルした（図９、パネルＡは位相差におけるクローンを示す；パネルＢは杭−NF160によるラベリングを示す、パネルＣは杭−GFAPによるラベリングを示す）。パネルＣにおけるニューロンの明確なラベリングは、パネルＢにおいてヤギ抗−ウサギ第二抗体に用いたTexas Red蛍光団のフルオレセイン通路への流出に基づく人工産物である。更に、10日間の二次培養を経て、生存サブクローンを192-Ig（杭- LNGFR）及び５Ａ５（高PSANCMに対するモノクローナル抗体）による二重ラベリングにより、ニューロン及びグリアの存在について目視採点した。一次クローンから単離した単個神経堤細胞は、ニューロン及び非ニューロン細胞、おそらくはグリアを含むクローンを増殖及び発生することができる。プレート培養培地の中で10日経た16種の一次及び151種の二次ファウンダーに由来するクローンの定量分析は、全二次ファウンダー細胞の30%より大がニューロン（Ｎ）、グリア（Ｇ）及びその他（Ｏ）の細胞をもたらすことを示唆した（表Ｉ、Ｎ＋Ｇ＋Ｏ）。しかしながら、残り70%のファウンダー細胞のうち、約50%がクローンを形成できず、死んだ。従って、クローン原性（即ち、生存）ファンダーのうち、５４％がＮ＋Ｇ＋Ｏタイプであった（表Ｉ）。これらの混合クローンが本当にグリア又はグリア前駆体を含むかを確認するため、それをSCD培地に移し、そして更に７日間発達させ、次いで固定し、そしてニューロフィラメント及びGFAP 発現について二重染色した。一次クローンと同様に、この処置は、クローンにおける高比率の非ニューロン細胞のGFAP発現を引き起こし（図9）、グリアの存在を確証せしめた。これらのデーターは、一次神経堤細胞が高頻度において、前駆細胞の多能性を保持する子孫細胞をもたらすことができることを示唆し、自己再生を示している。しかしながら、いくつかのケースにおいて、ニューロンのみを含む、二次クローンが見い出され（表Ｉ、Ｎのみ）、そしてほとんどの二次クローンはグリアとその他の細胞を含んでいたが、ニューロンは含んでいなかった（表Ｉ、Ｇ＋Ｏ）。この所見は自己再生に加えて、増殖する神経堤細胞は、***及び自己再生を特徴とするが、神経又はグリア系統のいづれかに限定されるグリア又はニューロン前駆細胞をもたらしめる他に、インビトロでの系統限定を受けうることを示唆する。実施例５多能性神経堤細胞の発達運命に対する基材組成の影響上記の実験は、PDL / FN基材上で増殖させた神経堤細胞は、末梢ニューロン及びグリアの両方を含むクローンを発生することを示す。同一の細胞集団をクローン密度においてFNのみを含む基材上で増殖させたとき、得られるクローンはグリア及び「その他の」細胞を含むが、ニューロンは含まない（図10と11、パネルＤ，Ｅ，Ｆ）。図10は、哺乳動物神経堤細胞の運命に及ぼす基材の効果を実証する下記の実験をまとめたフローチャートを供する。図11は様々なマーカーについて染色した細胞の免疫反応性を示す。 FNのみの上では、高レベルのLNGFR免疫反応性を発揮する非ニューロン細胞を含むが、NCAM⁺又は軸索担持細胞は含まないＧ＋Ｏクローンが獲得された（図11 、パネルＥ，Ｆ）。一方、PDL/FN上では、クローンはLNGFR⁺，NCAM^-非神経堤細胞、及びLNGFR^-，NCAM⁺ニューロンの両方を含んでいた（図11パネルＢ，Ｃ）。定量分析は、FNのみの上では、クローンの70〜80%がＧ＋Ｏ表現型であり、そしてどれもＮ＋Ｇ＋Ｏ表現型ではなく（図12、パネルＡ）、一方、PDL/FN上ではクローンの60%がＮ＋Ｃ＋Ｏであり、そして20%のみがGAO表現型であることを示唆した（図12、パネルＢ）。これらのデーターは、基材の組成が培養において発達する神経堤細胞の表現型に影響することを示唆している。上記の結果が、神経原性堤細胞のFN基材上に対する付着及び生存の不良により単純に説明されてしまうことを排するため、全ての堤細胞をまずFN基材上でクローンしておく別の実験を行った。図13はこれらの実験をまとめるフローチャートである。これらの実験は、付着及び／又は生存性における相違が、実際のクローン組成における相違の原因にならないことを実証するために行った。次に、１グループの細胞を48hr後に液体培地(0.05mg/ ml )中の上層としてのPDLに暴露し、同時に姉妹培養物をコントロールとしてFNのみの上に保持しておいた（図13）。LNGFRを発現するクローンは、PDLを載せる時点での生存細胞表層ラベリングにより同定し、そしてLNGFR⁺ クローンのみの発達を更にモニターした。２週間後、その培養物をSCD培地に移して更に10日間培養し、そしてその表現型を前述の通りに採点した。ニューロンの発達されないFN上に維持したクローンと異なり、PDL上層にさらされたクローンの多数が培養期終了時においてニューロンを含んでいた（図14、パネルＡ）。更に、本質的にどのクローンもPDLを載せた後はＧ＋Ｏ表現型とならなかった。これらのデーターは、PDLの上層は、神経堤細胞の分化を、あたかもそれらをFN基材の上で最初からプレート培養したように変えることができることを示唆している。更に、Ｎ＋Ｇ＋Ｏクローンの少なくとも一部は、FN上でＧ＋Ｏクローンを産生するであろうファウンダー細胞の変換に由来することも示唆される。しかしながら、PDL上層より得られる細胞障害性の上昇のため、Ｇ＋Ｏクローンを産生するであろう細胞の多数が単に死んでしまっている可能性を排することはできない。この問題のため、PDLの上層を付するのを48時間ではなく、5日目の培養物の平行セットで実施した。これらの条件のもとで、事実上全てのLNGF R⁺クローンが生存し、且つ分化した。これらのクローンの60%がニューロンを含み、一方35%がGAOを含んでいた（図14、パネルＢ）。一方、FN上で組換したクローンの90%より大がＧ＋Ｏ表現型へと発達した。これらの条件ではクローンの死はわずか又は全くないため、そしてクローンの大多数が5日目にPDLを載せた後にニューロンを含んでいたため、これらのデーターは、PDLが指定のＧ＋ＯクローンをＮ＋Ｇ＋Ｏクローンへと変換させることを示唆する。しかしながら、クローンの35%が5日目でのPDL上層付けを経Ｇ＋Ｏとなり、一方、48時間目で行った上層付けの場合事実上どれもそうならなかった事実は（図14、パネルＡとＢにおける線付きバーＧ＋Ｏを対比）、一部のクローンは48時間と5日目との間でPDLの効果に対して耐性となりうることを示している。実施例6 神経堤細胞の潜伏発達能に対する基材の影響基材が神経堤細胞の発達運命を改変することをより直接的に実証するため、系列サブクローニング実験を行った。クローンをFN上で樹立し、そして5日後、各クローンの子孫を準分割し、そしてFN及びPDL/FN基材の両方の上にクローンした。標準培地中での10日間の培養後、それらのクローンをSCD培地は移して更に１週間から10日間培養し、次いで固定し、染色し、そしてニューロン及びシュバン細胞について採点した。FN上で創設された７つの一次クローンのうちの5つが、5 日目にPDL/FN基材の上に再プレート培養したときにニューロンを含む二次クローンをもたらした（表II）。平均して、二次クローンの57±17%がニューロンを含んでいた。これらのデーターは、PDL/FN基材はFNの上で最初から増殖させた神経堤細胞クローンの運命を変えることができることを確証する。これらは、神経堤細胞の「神経原性能」がFN上で、たとえ公然たるニューロン分化が観察されないときでさえも少なくとも一定の時間にわたって保持されることも示す。このことは、FNはかかる培養条件下で明らかなニューロン分化を可能にしないことを示唆する。この理念の裏付けにおいて、PDL/FN上で樹立した一次クローンをFN上に再プレート培養したとき、どの二次クローンもニューロンを含まず、一方、 100%(5/5)の一次クローンがPDL/FN上に再プレート培養したときにニューロン含有二次クローンをもたらす（表II）。更に各一次クローン由来の二次クローンの平均して93±7%がPDL/FN上でニューロンを含み、ほとんど又は全てのクローン原性二次堤細胞がこれらの条件下で神経原性能を維持していることも示唆している。この実験は少なくとも一部の神経堤クローンがFM上で神経原性能を保持しているものの、全てのクローンがこの能力を発揮しないことを示唆する。このことは、FN上で増殖するクローン原性ファウンダー細胞における不均一性を示唆しうるか、又はFM上での培養における時間に伴う神経原性能の漸新的喪失を示唆しうる。この問題を解決するため、一次クローンを5日目ではなく、8日目に再プレート培養する第二の実験を行った。この場合、FM、対PDL/FN上で樹立した一次クローン間でより劇的な相違が観察された。8日目の再プレート培養した一次ＦＭクローンの1/6のみがPDL/FN上で任意のニューロン含有二次クローンをもたらし、そしてこの一ケースにおいて二次クローンの17%のみがニューロンを含んでいた（表II）。一方、一次PDL/FNクローンの6/6が8日目においてPDL/FN上で再プレート培養したときにニューロン含有二次クローンをもたらし、そしてその二次クローンの52±7%がニューロンを含んでいた（表II）。これらのデーターは、神経原性能はFM上で培養した神経堤細胞により徐々に喪失されるが、PDL/FN上で培養させた同じ細胞によってははるかに高い度合いで保持されることを示唆する。従って、この基材の組成は神経堤細胞の明らかな分化に影響するのみならず、多数回の細胞発生にわたって潜在発達能を維持する能力にも影響する。実施例7 移植による神経堤幹細胞の同定神経堤幹細胞は2つの一般的な基準により同定した：その抗原性表現型及びその機能特性。これらの機能特性は上記の通り培養物において（インビトロ）評価でき、又は動物体において（インビボ）評価できうる。上記の実施例は、どのように神経堤幹細胞の自己再生及び分化をクローン細胞培養を利用してインビトロでアッセイできるかを述べている。しかしながら、これらの特性は適当な動物宿主に神経堤細胞を移植することによっても決定できうる。かかるアッセイは、細胞の導入のための、及びその移植細胞を宿主動物から区別するためにその細胞及びその子孫を同定するための手段を必要とする。標準の技術を利用し、神経堤細胞を発達中の哺乳動物もしくは鳥類の胎芽に又は成動物の任意の組織もしくは器官（例えば脳、腹膜腔等）に導入することを可能にする。例えば、神経堤細胞培養物を先に記載の通りに調製する。一次又は二次培養において適当な期間経た後、神経堤細胞をLNGFRに対する抗体により生存細胞ラベリングすることにより同定し、そして先の実施例に記載の通りにトリプシン及びクローニングシリンダーを利用してプレートから取出す。その細胞を血清含有培地に希釈してトリプシンを阻害し、遠心し、そしてml当り10⁶〜10⁷細胞の濃度に再懸濁する。その細胞生存状態で維持し、そしてそれらを小滴において（約10μ ｌづつ）適用することにより35mmのぺトリ皿に注射し、そして蒸発は軽鉱油を含む液滴をかぶせることにより阻止した。これらの細胞は、そのぺトリ皿を氷の上に保つことにより冷たく保った。マウス胎芽への注射のため、胎芽日が8.5〜9.0 日目の妊娠母体を麻酔し、そしてその子宮を、腹部を切開することにより露出させた。神経堤細胞を緩やかな吸引によって鋭利なガラス製マイクロピペット（シールチップと組織への侵入中での詰まりを阻止するための側部における穴とが付いている）に吸入した。このピペットを脱落膜（deciduum）の下方1/3に挿入し、そして約1000細胞を含む約0.5μｌの容量を追い出した。そのマイクロピペットを引き抜き、そして切開部を縫合した。更に3〜4日後、その母体を殺し、そして個々の胎芽を取出し、固定し、そして注射した神経堤細胞由来の細胞の存在及び表現型について分析した。注射細胞の子孫を同定するため、それらを宿主胎芽のまわりの細胞と区別するための手段が必要である。これは下記の通りに行うことができうる。ラット神経堤細胞をマウス胎芽（母体が適切な免疫抑制を経たもの、又はマウスのSCID株の如きの遺伝的免疫欠陥株を使用）に注射し、注射細胞を外生マーカー、例えばTh yl又は主要組織適合性複合体（MHC）抗体により、ラットThyl又はMHC抗体に特異的なモノクローナル抗体を利用して同定する。他久、移植前に、外生遺伝マーカーを注射細胞上又は中にマーカーを供する手段として細胞に導入してよい。これは下記のようにする：培養物中の神経堤細胞を、lacZ遺伝子を担持する複製欠陥型のヘルパーフリーレトロウィルス粒子の懸濁物（10⁵〜10⁶pfu/mlの力価）と、 8μl/mlのポリブレンの存在下でインキュベートする。その細胞を次に新鮮な培地で数回洗い、そして上記の通りに調製する。回収した胎芽を次に標準手順に従う完全封入染色によりβ−ガラクトシダーゼの発現についてアッセイする。青色の細胞（lacZ遺伝子の発現の表示）は注射神経堤細胞の子孫に相当する。この手順は移植研究にとって適当な動物における任意の組織又は任意の発達段階に応用することができうる。完全封入染色後、陽性クローンを抱える胎芽を凍結用培地に包埋し、そしてクライオスタット上で10〜20μｍの切片にした。青色細胞を含む切片を選び、そして標準の技術に従い、特異的な抗体及びイムノベルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ組織化学を利用して成熟ニューロン及びグリアのマーカーに関してカウンター染色した。ニューロン又はグリアマーカーを発現するlacZ⁺（青色）細胞の同定は、注射した神経堤細胞の子孫が適正に分化したことを示唆する。従って、この技術は、前記幹細胞の機能を示す移植研究を通じて哺乳動物神経堤幹細胞を同定する手段を提供する。実施例8 神経堤幹細胞（NCSC_s）の遺伝子操作Ａ．NCSC_sのレトロウィルス感染この方法においては、NCSC_sを、課題の外来遺伝子を抱える、複製不能な組換レトロウィルスで感染せしめる。この外来遺伝子はレトロウィルスの長い末端反復（LTR）、この場合においてはモロニーネズミ白血病ウィルス（MoMuLV）（Cep ko．ら(1984)Cell 37：1053-1062)のコントロール下にある。他方、この外来遺伝子はウィルスの組換領域内に含まれている独立のプロモーターエンハンサーのコントロール下にある（即ち、CMV又はRSV LTR）。この特定の例においては、Ｅ．コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用し、なぜならこれは遺伝子操作した細胞を同定するのにそれ故形質転換効率を決定するのに簡単に利用できる青色の組織化学反応生成物を供するからである。ラットのNCSC培養物は上記の通りに樹立した。再プレート培養して24時間後、その細胞を約10⁵〜10⁶pfu/mlの力価を有するβ−ガラクトシダーゼ含有レトロウィルスの懸濁物（Turnerら（1987）Nature 328:131-136）に、8μｇ／mlのポリブレンの存在下で暴露した。ウィルス懸濁物に対する3ｈｒの暴露の後、その培養物をすすぎ、そして標準培地に移し入れた。この培地の中で3日間増殖させた後、形質転換細胞をＸ−gal組織化学反応（Sanesら（1986）EMBO J. 5:3133-3142）を用いて識別化した。図15、パネルＡは、固定及びＸ−g al反応を利用した染色後の、lacZ含有レトロウィルスで感染して3日後のNCSC培養物を示す。β−ガラクトシダーゼ発現細胞は実線矢印で示している。同じ顕微鏡視野の中の非発現性細胞は位相差顕微鏡により識別し（Ｂ）、そして中抜き矢印で示している。青色のβ−ガラクトシダーゼ⁺細胞は、位相差顕微鏡で見える通り、培養物の中の総細胞の約5〜10%を占めていた（図15、パネルＢ）。Ｂ．NCSC_sのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションこの方法においては、NCSC_sはリン酸カルシウム沈殿法を利用して発現性プラスミドでトランスフェクトする（Wiglerら（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76: 1373-1376）。先の実施例の通り、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をトランスフェクト細胞の識別を助長するために用いた。この場合、べクタ−ｐRSVlacZを使用し、それにおいてはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）は、ラウス肉腫ウィルス（RSV）（LTR）のコントロール下にあり、そしてSV40イントロン及びポリＡ−付加部位がこの遺伝子の3′末端に施されている（Johnsonら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3596-3600）。 NCSC_sは35mmの組織培養皿の中で樹立した。プレート培養して24時間後、約20 μｇ/mlの）pRSVlacZを含むリン酸カルシウム沈殿物を調製した。この沈殿物123 mlを各皿に加え、そして室温で20分インキュベートした。30mMのクロロキンを含む標準培地2mlを次に各皿に加え、そしてインキュベーションを37℃で一夜続けた。翌日、その培地を交換し、そしてインキュベーションを更に2日続けた。その培養物を固定し、そして標準のＸ−gal反応によりβ−ガラクトシダーゼ発現についてアッセイ化した。NCSC_sの約10%がlacZ反応生成物を発現した。Ｃ．NCSC_sの不死化 NCSC培養物を上記の通りに樹立した。その培養物を8μｇ／mlのポリブレンの存在下で、ここで固定される不死化癌遺伝子より好適に選ばれた癌遺伝子を担持するレトロウィルスの懸濁物に暴露した。このレトロウィルスは、癌遺伝子配列に加えて、例えばSV40初期プロモーター−エンハンサーにより作動するhis Dの如きの選択マーカーをエンコードする遺伝子を含む（Stockschlaeder,M.A.R．ら (1991)Human Gene Therapy 2:33)。his D遺伝子を取り込んだ細胞を、4 mMの濃度のＬ−ヒスチジノールの存在下での増殖により選別した。他方、選別はネオマイシン（500μｇ/ml）の存在下での増殖に基づいてよい。NCSC_sを遠心により10⁶pf u／mlより大の力価に濃縮した上記のレトロウィルスで感染させる。このウィルスを、8μｇ／mlのポリブレンの存在下での4〜8時間づつの二回連続インキュベーションで細胞に適用した。感染後、これらの細胞を4mMのＬ−ヒスチノール又は500μｇ／mlのネオマイシン（G418）の存在下で5〜10日間増殖させた。選択過程を生き抜いた細胞をLNGFR の発現について、上記のモノクローナル抗体192 Igを用いる生存細胞ラベリングによりスクリーンした。LNGFR⁺細胞の均質集団を含むコロニーをクローニングシリンダー及び温和なトリプシン処理を利用してクローンし、そしてデュプリケートでFN/ pDLコート化96穴プレートに移し入れた。短期間の増殖後、プレートのうちの一枚を直接凍結した（Ramirez-Solis,R.ら（1992）Meth,Enzymol.in pres s）。他のプレート中の細胞をいくつかのレプリケート96穴プレートに再プレート培養し、そのうちの一枚を細胞系の担持のために保管した。その他のプレート上の細胞を固定し、そして抗原性マーカーの発現について分析した。有効な不死化は、（１）細胞が均一に、LNGFR⁺、ネスチン⁺、ｌｉｎ^-（ここで「lin 」とは、ニューロフィラメント、ぺリフェリン、hi PSA-NCAM,GFAP,O₄及びPoを含む分化したニューロン又はグリア堤誘導体の特徴的な系統マーカーを意味する）を特徴とする抗原表現型を維持する）；並びに（2）細胞集団が数週間の継代培養にわたり表現型的に安定である（形態学的及び抗原学的に認識可能なニューロン及び／又はグリアに至る分化の欠如により規定）；ことにより示唆される。細胞系が分化する能力は、それらを、分析を助長する条件に移すことにより試験される（ニューロンの場合はCEEの省略、そしてシュバン細胞に関しては血清及び5mMのフォルスコリンの添加）。分化する能力の維持は、所望されるが、しかしながら必須でない、構成的に不死化した細胞の特性である。実施例9 マウスLNGFRに対するモノクローナル抗体の作製霊長類（Loyら（1990）J.Nenrosci.Res.27:657-664）及びラット（Chandlerら (1984)J.Biol Chem. 259:6882-6889)由来のLNGFRに特異的なマウスモノクローナル抗体を作った。マウスLNGFRに対するモノクローナル抗体は選べられていない。これらの抗体のシュバン細胞の如きの生存細胞の表層上にあるエピトープを認識し、ネズミ種からの多能性神経幹細胞（例えば神経堤幹細胞）及びその分化誘導体（並びにCNS由来の神経前駆細胞）の免疫学的単離における利用においてかかる生存細胞を適正化する。マウスからのこれらの細胞の単離が所望され、なぜならこの種は遺伝子及び免疫研究又はヒトの障害にとっての選り抜きの実験生物であるからである。マウスLNGFRに対するモノクローナル抗体を作るため、このタンパク質の細胞外ドメイン（リガンド結合性ドメイン）をエンコードするゲノムDNAフラグメントをＥ．コリの中で、グルタチオン−Ｓートランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させた（Lassarら(1989)Ce ll 58:823-831)。簡単に述べると、ラット及びヒトLNGFRについての既知のDNA配列のいづれかを基礎とする細胞外ドメインにとってのプローブをマウスゲノムライブラリーをスクリーンするために用いる陽性ハイブリダイズクローン由来のクローン化インサートを切り出し、そして適当な発現抑制配列を有するグルタチオンをエンコードするDNAと組換え、そしてＥ．コリにトランスフェクトした。その融合タンパク質をグルタチオン−Sepharoseカラム上でアフィニティー精製し、そしてラットに注射した。ラットの尾部の出血から得た血清を、標準の手順により（Brockeaら（1979),In Vitro 15:773-778）、マウスの座骨神経から単離した生存シュバン細胞の表層ラベリングによりスクリーンした。表層ラベリングはラベル化ヤギ抗−ラット抗体による。ブーストに付した後、ラットの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合を実施した。得られるハイブリドーマ培養物由来の上清液を生存シュバン細胞アッセイを利用してスクリーンした。陽性クローンを、LNGFRを発現せず、そして陰性であることがわかっているマウス細胞系であるNIH 3T3線維芽細胞で再検査した。この生存細胞アッセイの利用は、選抜した全ての抗体が生存細胞の表層上のLNGFRを認識できることを確証せしめる。更に、このアッセイは、大量の精製抗原を必要とするELISAの如きのその他のアッセイより迅速、簡単、且つ効率的である。約17の個別の陽性ハイブリドーマ系が同定され、そしてサブクローンした。一のかかる細胞系19由来の上清液により獲得した結果の例を図16に示す。マウスの座骨神経シュバン細胞の培養物を抗マウスLNGFRモノクローナル抗体の一つでラベルし、そしてDAPIでカウンター染色し、611の細胞の核が示された。左パネル（Ａ）は、細胞のほとんどが抗−LNGFR抗体でその表層上でラベルされることを示し（赤色染色；実線矢印）、右パネル（Ｂ）は、プレート上の全ての細胞核を示し、更に若干の細胞が抗−LNGFR抗体によりラベルされていないことを示している（青色染色；中抜き矢印；左パネルと対比のこと）。これらの未ラベル細胞は、LNGFRを発現することの知られていない線維芽細胞の夾雑を示しているようである。これらの細胞は抗−LNGFR抗体で得られたラベリングの特異性を実証する内部コントロールを供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4ＢＧ０１Ｎ 33/577 Ｂ 7055−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者ステンプル，デレクエル. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02129，チャールズタウン，サーティーンスストリート 149，マサチューセッツジェネラルホスピタルイースト，カーディオバスキュラーリサーチセンター，フォースフロアー【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．フィーダー細胞非依存性培養培地中で自己再生でき、且つ少なくともニューロン又はグリア前駆細胞へと分化できる、少なくとも一の哺乳動物多能性神経幹細胞を含んで成る単離細胞組成物。２．前記幹細胞が、少なくとも末梢神経系のニューロン又はグリア前駆細胞へと分化することができ、且つ低親和性神経成長因レセプター⁺の存在を更なる特徴とする請求項１記載の細胞組成物。３．前記幹細胞がネスチン⁺であることを更なる特徴とする請求項２記載の細胞組成物。４．前記細胞が、末梢神経系の成熟ニューロン又はグリア細胞の特徴的な１又は複数のマーカーを欠いていることを更なる特徴とする、請求項３記載の細胞組成物。５．前記マーカーが、スルファチド、グリア線維状酸性タンパク質、ぺリフェリン及びニューロフィラメントより成る群から選ばれる、請求項４記載の細胞組成物。６．哺乳動物の末梢神経系グリア前駆細胞を含んで成る単離細胞組成物。７．哺乳動物神経堤幹細胞を含んで成る細胞組成物を獲得するための方法であって：ａ）胎芽神経管を、第一培養培地及び第一基材と接触させて、前記胎芽神経管から移動した神経堤細胞の集団を含んで成る懸濁物を作り、そしてｂ）１又は複数の前記集団を含んで成る前記懸濁物の少なくとも一部を、前記集団における一又は複数の神経堤幹細胞の自己再生及び分化を可能にする第二培養培地及び第二基材と接触させる、ことを含んで成る方法。８．ｃ）少なくとも一の幹細胞を、フィーダー細胞非依存性培養において自己再生及び分化するその能力により同定する：段階を更に含んで成る請求項７記載の方法。９．段階ｂ）の前又は後に、前記神経堤幹細胞の表層上での低親和性神経成長因子レセプターの存在を特徴とする少なくとも一の神経堤幹細胞を同定する段階を更に含んで成る、請求項８記載の方法。 10．前記幹細胞の分化が、末梢神経系のニューロン又はグリア前駆細胞に至る、請求項７記載の方法。 11．前記第一及び第二基材がフィブロネクチンを含んで成る、請求項７記載の方法。 12．前記第一及び第二基材が、フィブロネクチンと組合されたポリ−Ｄ−リジンを含んで成る、請求項７記載の方法。 13．前記第二培養培地が、末梢神経系のニューロン細胞分化を可能にする因子を更に含んで成る、請求項７記載の方法。 14．前記末梢神経系のニューロン細胞分化を可能にする因子がフィブロネクチンと組合されたポリ−Ｄ−リジンを含んで成る基材である、請求項13記載の方法。 15．前記第二培養培地が、末梢神経系グリア細胞分化を可能にする因子を更に含んで成る、請求項７記載の方法。 16．前記末梢神経系グリア細胞分化を可能にする因子がフィブロネクチンを含んで成る基材である、請求項15記載の方法。 17．前記末梢神経系グリア細胞分化を可能にする因子がフォルスコリンである、請求項15記載の方法。 18．請求項13記載の方法に従って作られた、哺乳動物末梢神経系のニューロン前駆細胞を含んで成る単離細胞組成物。 19．請求項13記載の方法に従って作られた、哺乳動物末梢神経系のニューロン細胞を含んで成る単離細胞組成物。 20．前記ニューロン細胞がネスチン^-、低親和性神経成長因子レセプター^-、ぺリフェリン⁺ 及びニューロフィラメント⁺ であることを特徴とする、請求項19記載の単離細胞組成物。 21．請求項15記載の方法に従って作られた、哺乳動物末梢神経系のグリア前駆細胞を含んで成る単離細胞組成物。 22．請求項15記載の方法に従って作られた、哺乳動物末梢神経系のグリア細胞を含んで成る単離細胞組成物。 23．前記グリア細胞が低親和性神経成長因子レセプター⁺ 、ネスチン⁺ 、グリア線維状酸性タンパク質⁺ 及びスルファチド⁺ であることを特徴とする、請求項 22記載の単離細胞組成物。 24．グリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記前駆細胞の多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する一又は複数の細胞を含んで成る、哺乳動物組織に由来する細胞組成物を獲得するための方法であって、ａ）前記哺乳動物組織に由来する細胞の集団を含んで成る懸濁物を調製する、ｂ）前記細胞懸濁物を、一又は複数のグリアもしくはニューロン前駆細胞又は多能性幹細胞前駆体の自己再生を可能にする第一培養培地又は第一基材と接触させる、そしてｃ）存在しているならば、前記グリアもしくはニューロン前駆細胞又は多能性幹細胞前駆体を、フィーダー細胞非依存性培養におけるその自己再生及び分化能力により同定する、ことを含んで成る方法。 25．ｄ）前記グリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記前駆細胞の多能性幹細胞前駆体を、一又は複数の前記グリアもしくはニューロン前駆細胞又は多能性幹細胞前駆体の分化を可能にする第二培養培地及び第二基材と接触させる：段階を更に含んで成る、請求項24記載の方法。 26．段階ｂ）の前に：ｅ）神経細胞特異性表層マーカーを発現する一又は複数の細胞を単離する、ことを更に含んで成る、請求項25記載の方法。 27．前記神経細胞特異性表層マーカーが低親和性神経成長因子レセプターを含んで成る、請求項26記載の方法。 28．前記細胞が、末梢神経系のグリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する、請求項24記載の方法。 29．請求項24記載の方法に従って作られた、グリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体を含んで成る単離細胞組成物。 30．請求項28記載の方法に従って作られた、末梢神経系のグリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体を含んで成る単離細胞組成物。 31．グリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記前駆細胞の多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する一又は複数の細胞を含んで成る、哺乳動物組織由来の細胞組成物を獲得するための方法であって、ａ）前記哺乳動物組織に由来する細胞の集団を含んで成る懸濁物を調製する、そしてｂ）前記集団の少なくとも一部の細胞を適当な宿主細胞に移植する、そしてｃ）存在しているならば、前記グリアもしくはニューロン前駆細胞又は多能性幹細胞前駆体を、インビボでのこれらの細胞の自己再生能力並びに少なくともグリア及びニューロン系統に至る分化能力によって同定する、ことを含んで成る方法。 32．段階ｂ）の前に：ｄ）神経細胞特異性表層マーカーを発現する一又は複数の細胞を単離する、ことを更に含んで成る請求項31記載の方法。 33．前記神経細胞特異性表層マーカーが低親和性神経成長因子レセプターを含んで成る、請求項32記載の方法。 34．グリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記前駆細胞の多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する一又は複数の細胞を含んで成る、哺乳を動物組織由来の細胞組成物を獲得するための方法であって、ａ）前記哺乳動物に由来する細胞を含んで成る懸濁物を調製する、ｂ）前記懸濁物を、前記グリアもしくはニューロン前記細胞又は多能性幹細胞前駆体上の神経細胞特異性表層マーカーと第一複合体を形成できる抗体と接触させる、そしてｃ）形成されたならば、前記懸濁物から前記第一複合体を単離して、前記細胞組成物を獲得する、ことを含んで成る方法。 35．前記神経細胞特異性表層マーカーが低親和性神経成長因子レセプターを含んで成る、請求項34記載の方法。 36．前記単離が、前記第一複合体を、結合ぺアーの第一構成員を含んで成る試薬と接触させることによって第二複合体を形成することを含んで成り、ここで前記結合ぺアーの第二構成員が前記抗体又はこの抗体のコンジュゲートを含んで成る、請求項34記載の方法。 37．前記試薬が蛍光ラベルを含み、そして前記単離が、形成されたならば、前記第二複合体を蛍光活性化細胞選別によって分けることを更に含んで成る、請求項36記載の方法。 38．前記一又は複数の細胞が、末梢神経系のグリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記末梢神経系前駆細胞の多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する、請求項34記載の方法。 39．ニューロンもしくはグリア前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体を含んで成る一又は複数の細胞を宿主動物に導入することを含んで成る方法。 40．前記細胞が請求項24又は34記載の方法に従って作られた、請求項39記載の方法。 41．前記細胞が、末梢神経系のグリアもしくはニューロン前駆細胞又は前記末梢神経系前駆細胞の多能性幹細胞前駆体を含んで成る、請求項39記載の方法。 42．前記細胞が請求項７，13，15及び29のいづれか１項の方法に従って作られた、請求項41記載の方法。 43．前記宿主動物が神経系の障害を有している、請求項39又は41記載の方法。 44．グリアもしくはニューロン前駆細胞、又はその多能性幹細胞の少なくとも一の特徴的な特性を有する細胞系を不死化するための方法であって、前記細胞に不死化遺伝子を含んで成るベクターをトランスフェクトすることを含んで成る方法。 45．前記細胞系が末梢神経系のグリアもしくはニューロン前駆細胞又はその多能性幹細胞前駆体の少なくとも一の特徴的な特性を有する、請求項44記載の方法。 46．請求項44又は45記載の方法で作られた不死化細胞。 47．少なくとも一の遺伝子操作した多能性神経堤細胞を含んで成る細胞組成物。 48．前記堤細胞が、神経堤幹細胞を含んで成る、請求項47記載の細胞組成物。 49．遺伝子操作した多能性神経幹細胞の少なくとも一の分化子孫を含んで成る細胞組成物。 50．前記幹細胞が神経堤幹細胞を含んで成る、請求項49記載の細胞組成物。 51．前記分化子孫の前記子孫が末梢神経系ニューロン前駆細胞を含んで成る、請求項50記載の細胞組成物。 52．前記分化子孫の前記子孫が末梢神経系のグリア前駆細胞を含んで成る、請求項50記載の細胞組成物。 53．遺伝子操作した多能性神経幹細胞を作るための方法であって、多能性神経幹細胞を外来核酸と、前記外来核酸が前記幹細胞の中に取込まれるのを可能にする条件のもとで接触させることを含んで成る、方法。 54．前記外来核酸が前記幹細胞の中に取り込まれるのを可能にする条件がリン酸カルシウム媒介トランスフェクションを含んで成る、請求項53記載の方法。 55．前記外来核酸が前記幹細胞の中に取込まれるのを可能にする条件がレトロウィルス感染を含んで成る、請求項53記載の方法。 56．マウス低親和性神経成長因子レセプターに結合することのできるモノクローナル抗体。 57．神経細胞の特徴的な表層マーカーに結合することのできる抗体の存在を検定するための方法であって、動物を前記表層マーカーで免疫する、前記表層マーカーを表示する生存神経細胞を、前記免疫動物由来の抗体含有血清と、又は前記免疫動物より獲得した細胞より形成されたハイブリドーマにより産生された抗体と接触させる、そして前記表層マーカーに特異的な抗体が前記神経細胞に結合するかを検定する、ことを含んで成る方法。