JPH084501B2 - Mutant tPA related to sugar chain - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規な糖鎖変異tPAとその医薬組成物並びに
該変異tPAの生産に係る遺伝子組換技術に関する。さら
に詳しくはtPAのアミノ酸配列においてアミノ酸の新規
な置換をおこない，該置換によってアスパラギン結合型
糖鎖に変異をもたらし，該変異によってtPAの医薬用途
における特性を改善することを内容とする。従って本発
明は医療用医薬品の分野において利用することができ
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (1) Field of Industrial Application The present invention relates to a novel sugar chain mutant tPA, a pharmaceutical composition thereof, and a gene recombination technique for producing the mutant tPA. More specifically, the content of the present invention is to perform a new amino acid substitution in the amino acid sequence of tPA, to cause a mutation in the asparagine-linked sugar chain by the substitution, and to improve the properties of tPA for pharmaceutical use by the mutation. Therefore, the present invention can be used in the field of medical drugs.

（２）従来技術 組織プラスミノーゲン活性化因子（本発明においてtP
Aと略記される）が医薬品分野において特に血栓症治療
剤として有用な物質であり，その利用をいっそう容易に
する目的で遺伝子組換技術が応用されることは一般に公
知であり，下記文献１）〜３）に示されるとおりであ
る。またtPAの生体内利用を高める目的でtPAのアミノ酸
配列に各種の構造的変異を加える試みがなされており，
この目的のために同様に遺伝子組換技術が応用されてい
ることも一般に公知であり，例えば下記文献４）〜９）
に示されるとおりである。(2) Prior art Tissue plasminogen activator (tP in the present invention
(Abbreviated as A) is a substance particularly useful as a therapeutic agent for thrombosis in the pharmaceutical field, and it is generally known that gene recombination technology is applied for the purpose of facilitating its use. ~ 3). In addition, attempts have been made to add various structural mutations to the amino acid sequence of tPA in order to enhance the bioavailability of tPA.
It is generally known that genetic recombination technology is also applied for this purpose, and for example, the following Documents 4) to 9).
As shown in.

１）欧州特許出願公開 No.0041766 A2 ２）欧州特許出願公開 No.0093619 A1 ３）ペニカ エタール.,ネイチャー301 214−221（1983） （Pennica et al.,Nature301 214−221（1983）） ４）エッチ．カギタニ，エタール.,フェブスレット.189
巻,1号（1985）145−149 （H.Kagitani, et al.,FEBS Lett. Vol.189,No.1（198
5）145−149） ５）エー．ジェー．ブイ．ゾンネベルト，エタール：プ
ロッシ．ナショル．アカド．サイ．ユーエスエー83,467
0−4674（1986） （A.J.V.Sonneveld,et al:Proc.Natl.Acad.Sci.USA83,4
670−4674（1986）） ６）国際特許出願公開 No.8601538 ７）欧州特許出願公開 No.0155387 A2 ８）欧州特許出願公開 No.0178105 A2 ９）欧州特許出願公開 No.0199574 A tPAのアミノ酸配列における構造的変異の中に糖鎖変
異を目的としたものがある。すなわちtPAは他の多くの
生理活性物質と同様に糖蛋白質であり，通常は分子内に
３本あるいは２本のアスパラギン結合型糖鎖を持ってい
る。従ってこれら糖鎖の増減変異がtPAの生体内利用に
関連する諸々の物理化学的特性に重要な影響を及ぼすで
あろうことは容易に推考することができる。例えばアス
パラギン結合型糖鎖を増加して水溶性を高めるとか，糖
鎖の結合位置を変化せしめて溶解度と血中消失時間の双
方を同時に満足する最適値を求めるとか，目的に応じた
各種の改良を意図することができる。前記文献８）は子
宮由来のtPAの３本のアスパラギン結合型糖鎖をすべて
消失せしめたるための技術を開示している。1) European Patent Application Publication No.0041766 A2 2) European Patent Application Publication No.0093619 A1 3) Penika Ettal., Nature 301 214-221 (1983) (Pennica et al., Nature 301 214-221 (1983)) 4 ) Etch. Kagitani, Ettal., Febslett. 189
Volume, 1 (1985) 145-149 (H. Kagitani, et al., FEBS Lett. Vol.189, No.1 (198
5) 145-149) 5) A. J. buoy. Sonnebert, Ettal: Prossi. National. Acad. Rhino. USA 83, 467
0-4674 (1986) (AJVSonneveld, et al: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 , 4
670-4674 (1986)) 6) International patent application publication No. 8601538 7) European patent application publication No. 0155387 A2 8) European patent application publication No. 0178105 A2 9) European patent application publication No. 0199574 AtpA amino acid sequence Among the structural mutations in, there are those aimed at sugar chain mutations. That is, tPA is a glycoprotein like many other physiologically active substances, and usually has three or two asparagine-linked sugar chains in the molecule. Therefore, it can be easily inferred that the increase / decrease mutation of these sugar chains will have an important influence on various physicochemical properties related to the bioavailability of tPA. For example, increasing the water solubility by increasing the number of asparagine-linked sugar chains, or changing the sugar chain binding position to find the optimal value that satisfies both solubility and blood elimination time at the same time, and various improvements depending on the purpose Can be intended. The above document 8) discloses a technique for eliminating all three asparagine-linked sugar chains of tPA derived from the uterus.

他方，糖蛋白質において糖鎖が蛋白質に結合する部位
についてはある種の規則性の存在することが知られてい
る。すなわち糖鎖は一般に蛋白質中のアスパラギン残基
に結合し，しかも当該アスパラギンを含むアミノ酸配列
はいわゆるAsparginesequonと呼ばれる規則的な配列を
しており，これは例えば下記文献10）〜16）によれば三
つのアミノ酸から構成される配列，すなわちトリプレッ
トであって，具体的にはAsn−Ｘ−Thr,Asn−Ｘ−Serあ
るいはAsn−Ｘ−Cysによって示され,Xはプロリン以外の
いずれのアミノ酸でもよいことが知られている。On the other hand, it is known that there is a certain degree of regularity in the site where the sugar chain binds to the protein in the glycoprotein. That is, sugar chains generally bind to asparagine residues in proteins, and the amino acid sequence containing the asparagine has a regular sequence called so-called Asparginesequon. A sequence consisting of three amino acids, namely a triplet, specifically represented by Asn-X-Thr, Asn-X-Ser or Asn-X-Cys, where X may be any amino acid other than proline It has been known.

10）イー．バウゼ，エ タール：フェブスレターズ,108
巻２号 341〜344（1979） （E.Bause,et al:FEBS LETTERS Vol.108,No.2 341〜344
（1979）） 11）イー．バウゼ，エ タール：バイオケム．ジェー．
（1982）203,761〜768 （E.Bause,et al:Biochem.J.（1982）203,761〜768） 12）イー．バウゼ：バイオケム．ジェー．（1983）209,
331〜336 （E.Bause:Biochem.J.（1983）209,331〜336） 13）アール．ディー．マーシャル：バイオケミカル ソ
サイエティー トランスアクションズ（1984）12巻 51
3〜514 （R.D.Marshall:Biochemical Society Transactions（1
984）Vol.12,513〜514） 14）イー．バウゼ：同誌（1984）12巻 514〜517 （E.Bause:ibid.（1984）Vol.12,514〜517） 15）ディー．ケー．ストラック アンド ダブル．ジェ
ー．レンナルツ イン ダブル．ジェー．レンナルツ編
ザ バイオケミストリー オブ グリコプロティンア
ンド プロテオグリカンス，プレナムプレス,1980,ニュ
ーヨーク,35〜83頁 （W.K.Struck and W.J.Lennarz in W.J.Lennarz ed.The
Biochemistry of Glycoprotein and Proteoglycans,Pl
enum Press,1980,New York,pp35〜83） 16）シー．ロニン，エタール.,フェブス レット.,96,1
79（1978） （C.Ronin,et al.,FEBS Lett.,96,179（1978）） （３）発明が解決しようとする問題点 tPAにおける糖鎖の問題については，これまでに前記
文献８）による以外には特別な開示はなされていない。
しかしながら糖鎖の問題に対してはより多くの考慮がは
らわれる必要がある。例えば前記したAsparagine sequo
nを構成するトリプレットを分子内に有しながら，ある
種のトリプレットでは当該部位に糖鎖が結合する分子と
結合しない分子とが混在し，その結果生産物のロットご
とに結合糖鎖数が変動してしまうことが知られている。
このような結合糖鎖数の不均一性はプラスミノーゲン，
セルロプラスミン，プロラクチン，マウスIgM,ウシα−
ラクトアルブミン等においてすでに観察されているが,t
PAにおいても同様であり，下記文献17）によれば天然tP
Aのアミノ酸位置番号184〜186のトリプレットであるAsn
−Gly−Serに対する糖鎖の結合は特に不確実であり，そ
の結果，結合糖鎖数の不均一を招いている。10) E. Bauze, Ettal: Phebs Letters, 108
Volume 2, Issue 341-344 (1979) (E.Bause, et al: FEBS LETTERS Vol.108, No.2 341-344)
(1979)) 11) E. Bauze, Etal: Biochem. J.
(1982) 203,761 to 768 (E. Bause, et al: Biochem.J. (1982) 203,761 to 768) 12) E. Bauze: Biochem. J. (1983) 209,
331-336 (E.Bause: Biochem.J. (1983) 209,331-336) 13) Earl. Dee. Marshall: Biochemical Society Trans Actions (1984) Volume 12 51
3 to 514 (RDMarshall: Biochemical Society Transactions (1
984) Vol.12,513 ~ 514) 14) E. Bauze: The same magazine (1984), 12 volumes 514-517 (E.Bause: ibid. (1984) Vol.12,514-517) 15) D. K. Struck and double. J. Renaltz in double. J. Rennalts, The Biochemistry of Glycoprotein and Proteoglycans, Plenum Press, 1980, New York, 35-83 (WKStruck and WJLennarz in WJLennarz ed.The
Biochemistry of Glycoprotein and Proteoglycans, Pl
enum Press, 1980, New York, pp35-83) 16) See. Ronin, Ettal., Phebs Lett., 96 , 1
79 (1978) (C. Ronin, et al., FEBS Lett., 96 , 179 (1978)) (3) Problems to be Solved by the Invention Regarding the problem of sugar chains in tPA, it has hitherto been described in Reference 8 ), But no special disclosure is made.
However, more consideration needs to be given to the problem of sugar chains. For example, Asparagine sequo
Despite having a triplet that constitutes n in a molecule, some types of triplets have a mixture of molecules that bind to sugar chains and molecules that do not, which results in a change in the number of sugar chains bound to each product lot. It is known to do.
Such heterogeneity in the number of linked sugar chains is caused by plasminogen,
Ceruloplasmin, prolactin, mouse IgM, bovine α-
Although already observed in lactalbumin, etc., t
The same is true for PA, and according to the following document17), natural tP
Asn, which is a triplet of amino acid position numbers 184 to 186 of A
The binding of sugar chains to -Gly-Ser is particularly uncertain, resulting in uneven number of sugar chains.

17）グンナー ポール，エタール.,バイオケミストリ
ー，23,3701−3707（1984） （Gunnar Pohl,et al.,Biochemistry,23,3701−3707（1
984）） 特定部位に糖鎖の結合している蛋白質と結合していな
い蛋白質とを分離することはきわめて困難であるので，
実際には不均一のまま使用されることになるが，その結
果は好ましくない。例えば溶解度等の物性が糖鎖の結合
していない蛋白質の存在に応じて変化し，また非経口投
与でしばしば観察される免疫原性が変化して品質が一定
しない。すなわち天然tPAには医療用医薬品として利用
する上で重要な用件である品質についてこれが一定しな
いという欠点がある。従って特定部位への糖鎖の結合を
均一にするための特別の技術が提供される必要がある。
またtPAの糖鎖には別の角度からも考慮がはらわれなけ
ればならない。すなわちtPAの実用化にあたってはこれ
を医療用医薬品として使用する目的や程度に応じてその
血栓溶解活性を変化させあるいは溶解度や血中半減期を
調整することが必要であり，これを糖鎖の変異で達成す
ることが望まれる。本発明はこの目的のためにおこなう
べき変異tPAの提供を問題点とした。17) Gunnar Paul, Ettal., Biochemistry, 23, 3701-3707 (1984) ( Gunnar Pohl, et al., Biochemistry, 23, 3701-3707 (1
984)) It is extremely difficult to separate a protein with a sugar chain bound to a specific site from a protein with no sugar chain bound.
In practice, it will be used without uniformity, but the result is not desirable. For example, the physical properties such as solubility change depending on the presence of a protein to which a sugar chain is not bound, and the immunogenicity often observed in parenteral administration changes, resulting in inconsistent quality. In other words, natural tPA has the drawback that quality is an uncertain factor, which is an important requirement for use as a prescription drug. Therefore, it is necessary to provide a special technique for uniform binding of sugar chains to specific sites.
In addition, the sugar chain of tPA must be considered from another angle. In other words, in the practical application of tPA, it is necessary to change its thrombolytic activity or adjust its solubility and blood half-life according to the purpose and degree of its use as a medical drug. It is hoped that The present invention has a problem to provide mutant tPA to be performed for this purpose.

（４）問題点を解決するための手段 本発明者は前記問題点に対し種々の検討を行い，その
結果，天然tPAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186
番のSerをそれぞれSerおよびThrに置換するか,119番のS
erをMetに置換するか,96番のGln,98番のIle,119番のSer
をそれぞれAsn,Thr,Metに置換することによって解決さ
れることを知り，本発明を完成するに至った。すなわち
本発明は上記によって示されるとおりのアミノ酸置換を
特徴する糖鎖に関する変異tPA,その医薬組成物並びに該
tPAの生産に係る遺伝子組換技術を要旨とするものであ
る。(4) Means for Solving the Problems The present inventor conducted various studies on the above problems, and as a result, Gly and 186 of amino acid position number 183 of natural tPA were found.
Replace Ser of No. with Ser and Thr respectively, or S of No. 119
Replace er with Met, or Gln 96, Ile 98, Ser 119
The inventors have found that the problem can be solved by substituting Asn, Thr, and Met for each, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a mutant tPA relating to a sugar chain characterized by amino acid substitution as described above, a pharmaceutical composition thereof, and
The gist is the gene recombination technology relating to the production of tPA.

以下に本発明定義，構成，方法の項に分けて説明す
る。The definition, configuration, and method of the present invention will be described below separately.

定義 本発明において天然tPAとはヒトメラノーマ細胞のmRN
Aから転写して得られるcDNA（原cDNAと呼ぶことにす
る）並びに該cDNAに該cDNAがコードするアミノ酸配列に
変異が起らない範囲内の人工的変異が加えられたcDNA
（類似cDNAと呼ぶことにする）がコードするアミノ酸配
列を有するtPA活性ペプチドを言う。このアミノ酸配列
および該配列における各アミノ酸のアミノ酸位置番号は
ペニカらによってすでに文献３）に詳細に開示されてお
り，本発明における天然tPAのアミノ酸配列および各ア
ミノ酸のアミノ酸位置番号は同文献のFig3に記載される
配列および位置番号によって特定される。Definition In the present invention, natural tPA is mRN of human melanoma cells.
A cDNA obtained by transcription from A (to be referred to as an original cDNA) and a cDNA obtained by adding an artificial mutation within the range in which the amino acid sequence encoded by the cDNA does not cause mutation.
It refers to a tPA active peptide having an amino acid sequence encoded by (to be referred to as similar cDNA). This amino acid sequence and the amino acid position number of each amino acid in the sequence have already been disclosed in detail in Reference 3) by Penica et al., And the amino acid sequence of natural tPA and the amino acid position number of each amino acid in the present invention are shown in Fig. 3 of the reference. It is identified by the sequence and position number listed.

変異tPAとは原cDNAまたは類似cDNAにこれらcDNAがコ
ードするアミノ酸配列に変異が起る程度に特別の人工的
変異が加えられたcDNA（変異cDNAと呼ぶことにする）が
コードするアミノ酸配列を有するtPA活性ペプチドであ
ると定義される。ここで特別な人工的変異とは遺伝子組
換操作，例えばZoller and Smithの部位特異的変異誘発
を利用してcDNAの核酸塩基配列に部分的な欠落，附加，
変換が加えられることを言う。従って変異tPAのアミノ
酸配列は天然tPAのアミノ酸配列が部分的に欠落，附
加，変換したものであると言うことができる。本発明に
おいて変異の語が各種の局面において各種の意味で使用
されるが，混乱を避けるために議論される局面に応じて
区別して使用される必要があり，例えば核酸塩基配列に
部分的な欠落，附加，変換があった場合にはcDNAの核酸
塩基配列の配列変異であり，アミノ酸配列に部分的な欠
落，附加，変換があった場合にはアミノ酸配列の配列変
異であり，結合糖鎖に欠落，附加，変換があった場合に
は糖鎖の結合変異であるとそれぞれ区別される。本発明
に係る変異tPAは当該変異の結果として二次的に糖鎖変
異を伴なっている。従って単にアミノ酸配列における変
異のみを問題として議輪する場合に該tPAを変異tPAと呼
び，糖鎖変異にまで着目し，糖鎖変異を特に強調する必
要のある変異tPAを指称する場合には別に糖鎖変異tPAの
語をもって区別することにする。Mutant tPA has an amino acid sequence encoded by a cDNA in which a special artificial mutation is added to the original cDNA or similar cDNA to the extent that the amino acid sequence encoded by these cDNAs has a mutation (referred to as mutant cDNA). Defined to be a tPA active peptide. Here, the special artificial mutation is a gene recombination operation, for example, Zoller and Smith site-directed mutagenesis is used to partially delete, add,
Says that a conversion is added. Therefore, it can be said that the amino acid sequence of mutant tPA is a partial deletion, addition, or conversion of the amino acid sequence of natural tPA. In the present invention, the term “mutation” is used in various aspects in various meanings, but it is necessary to distinguish them according to the aspects discussed in order to avoid confusion. For example, partial deletion in a nucleobase sequence. , If there is addition or conversion, it is a sequence variation of the cDNA nucleobase sequence, and if there is partial deletion, addition, or conversion in the amino acid sequence, it is sequence variation of the amino acid sequence, If there is a deletion, addition, or conversion, it is distinguished as a sugar chain binding mutation. The mutant tPA according to the present invention is secondarily accompanied by sugar chain mutation as a result of the mutation. Therefore, when only the mutation in the amino acid sequence is discussed as a problem, the tPA is called a mutant tPA, and the sugar chain mutation is focused on. The term “glycan-mutated tPA” will be used for distinction.

構成 本発明の構成上の特徴は糖鎖変異を目的とした所定の
アミノ酸位置番号のアミノ酸の他のアミノ酸への置換で
ある。第一種はアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186
番のSerをそれぞれSerおよびThrに置換することであ
り，これによりアミノ酸位置番号184番のAsnに対する糖
鎖結合を均一化することができる。すなわち前記したご
とく天然tPAの該Asnに対する糖鎖の結合が不均一である
ために品質を損ねているのであるが，本発明により一定
品質の生産物の提供が可能となる。第二種はアミノ酸位
置番号119番のSerをMetに置換することであり，これに
より117番のAsnに結合する糖鎖が消失し，血中半減期が
長くなる。第三種はアミノ酸位置番号96番のGln,98番の
Ileおよび119番のSerをそれぞれAsn,ThrおよびMetに置
換することであり，これによりアミノ酸位置番号117番
のAsnに結合する糖鎖が消失し，アミノ酸位置番号96番
に新たに糖鎖が結合する。Constitution A constitutional feature of the present invention is the substitution of an amino acid at a predetermined amino acid position number with another amino acid for the purpose of sugar chain mutation. The first type is Gly at position 183 and 186.
No. Ser is replaced with Ser and Thr, respectively, and this makes it possible to homogenize sugar chain binding to Asn at amino acid position 184. That is, as described above, the quality of the natural tPA is impaired due to the uneven binding of the sugar chain to the Asn, but the present invention makes it possible to provide a product of constant quality. The second type is to replace Ser at amino acid position 119 with Met, which eliminates the sugar chain that binds to Asn at position 117 and prolongs blood half-life. The third type is Gln at amino acid position 96, and the
Substitution of Ile and Ser of 119 with Asn, Thr, and Met, respectively. As a result, the sugar chain that binds to Asn of amino acid position 117 was deleted, and a new sugar chain was bonded to amino acid position 96. To do.

次に本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって
生産することができる。従って本発明変異tPAをコード
するcDNA,該cDNAを外来遺伝子として含み，かつ選択し
た宿主内で制禦および発現が可能となるように連結して
得られた発現プラスミドは本発明最終目的物質の生産の
ために必要な中間物質であり，同一の問題点を解決する
意味において発明としては供に一体となるべきものであ
る。発現プラスミドの具体例としてZem99−6000,同−63
00,同−6400,によって識別表示されるプラスミドをあげ
ることができ，これらはいずれもそれぞれ後記実施例に
おいて示される。また発現プラスミドによって形質転換
された宿主もcDNAおよび発現プラスミドと同様に発明と
しては供に一体となるべきものであり，宿主としては大
腸菌や動物細胞，とりわけBHK細胞が使用される。形質
転換した大腸菌の例としてEscherichiacoli RR1−Zem99
−6000,同−6300,同−6400によって識別表示される大腸
菌をあげることができ，これらはいずれもそれぞれ後記
実施例において示され，かつそれぞれの表示をもって微
工研に寄託されている。Next, the final substance of the present invention can be produced by a gene recombination technique. Therefore, the cDNA encoding the mutant tPA of the present invention, and the expression plasmid obtained by ligating the cDNA as a foreign gene and ligating so that it can be restrained and expressed in the selected host are the production of the final target substance of the present invention. It is an intermediate substance necessary for the above, and should be united together as an invention in the sense of solving the same problem. Specific examples of expression plasmids include Zem99-6000 and Zem99-63.
The plasmids identified by "00" and "-6400" can be mentioned, and each of them is shown in the Examples below. Also, the host transformed with the expression plasmid should be integrated together as an invention in the same manner as the cDNA and the expression plasmid, and E. coli or animal cells, especially BHK cells are used as the host. Escherichia coli RR1-Zem99 as an example of transformed E. coli
Examples of Escherichia coli identified by -6000, -6300, and -6400 are shown in Examples below, and each of them has been deposited with the Institute of Microtechnology.

最終目的物質である本発明糖鎖変異tPAは天然tPAが変
異したものであるにもかかわらず，後記実験例によって
示されるごとく天然tPAの活性，すなわち血栓溶解活性
を天然tPAと同程度に有している。従って天然tPAが医薬
組成物の必須の有効成分となって，その活性を利用する
医療目的に提供されるのと同様に，本発明糖鎖変異tPA
もその活性を利用する治療目的のための医薬組成物の必
須の有効成分となることができる。とりわけ各種の血栓
症治療剤となることができるのは後記実験例より明らか
である。ところで後記実験例によって示されるごとく，
本発明糖鎖tPAの血中消失半減期は天然tPAのそれに比べ
て２〜10倍大きい。この点を考慮すると本発明糖鎖変異
tPAは天然tPAよりも優れた血栓症治療剤となることが知
られる。すなわち，天然tPAの一日当りの用量はその急
速な血中消失を配慮して30mg−150mg/人であるとみられ
るに対し，本発明糖鎖変異tPAのそれは0.3mg−75mg/人
で十分であることが知られる。もちろん本発明は当該範
囲に限定されるものではなく，一日用量は症状に応じて
適宜に増減すればよいが，本発明によってはるかに改良
された医薬組成物，とりわけ血栓症治療剤が提供される
ことは明らかである。Although the sugar chain-mutated tPA of the present invention, which is the final target substance, is a mutant of natural tPA, it has the activity of natural tPA, that is, thrombolytic activity, to the same extent as natural tPA, as shown in the experimental examples described below. ing. Therefore, in the same manner that natural tPA serves as an essential active ingredient of a pharmaceutical composition and is provided for medical purposes utilizing its activity, the sugar chain-mutated tPA of the present invention is the same.
It can also be an essential active ingredient of a pharmaceutical composition for therapeutic purposes utilizing its activity. Especially, it can be used as a therapeutic agent for various thrombosis, as will be apparent from the experimental examples described below. By the way, as shown in the experimental examples below,
The elimination half-life in blood of the sugar chain tPA of the present invention is 2 to 10 times larger than that of natural tPA. Considering this point, the sugar chain mutation of the present invention
It is known that tPA is a better thrombosis therapeutic agent than natural tPA. That is, the daily dose of natural tPA is considered to be 30 mg-150 mg / person in consideration of its rapid elimination in blood, whereas that of the sugar chain-mutated tPA of the present invention is 0.3 mg-75 mg / person. Is known. Of course, the present invention is not limited to this range, and the daily dose may be appropriately increased or decreased according to the symptom, but the present invention provides a much improved pharmaceutical composition, especially a therapeutic agent for thrombosis. It is clear that

この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり，動
静脈内投与される。注射剤として製造するためには，微
量生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこ
なえばよい。従って例えば本発明糖鎖変異tPAを単独あ
るいは適当な賦形剤，溶解剤と供に水溶液とし，無菌
過して充填し，凍結乾燥し，他方溶解用水溶液を添付し
て用時溶解型注射剤とすればよい。In this case, the pharmaceutical composition is mainly an injection, which is intravenously administered. In order to produce an injectable preparation, it may be carried out according to a conventional method for preparing a trace amount of physiologically active substance as an injectable preparation. Therefore, for example, the sugar chain variant tPA of the present invention is used alone or as an aqueous solution together with a suitable excipient and a solubilizer, and is sterilized and filled, and lyophilized. And it is sufficient.

方法 本発明物質の製造方法および評価方法について説明す
る。Method The production method and evaluation method of the substance of the present invention will be described.

まず本発明物質を製造するために必要な天然tPAをコ
ードするcDNA（原cDNAまたは類似cDNA）を含むクローン
はボウズメラノーマ細胞ラインのmRNAを出発物質として
すでに数種のものが構成されているので，該cDNAを外来
遺伝子として含むプラスミドで形質転換した適当な株を
入手し，プラスミドを単離して使用すればよい。例えば
pDR1496（ATCC20728）,pDR1296（ATCC53347）等であ
る。あるいはさらにこれらのプラスミドからtPAのコー
ド部分をとり出し，適当なプロモータおよびターミネー
タを連結して得られる発現プラスミドを用意し，これを
使用してもよい。例えば下記文献18）によって示される
MThGH111およびMThGH112からメタロチオネインプロモー
タ（MT−１プロモータと略記する）およびヒト成長ホル
モンターミネータ（hGHターミネータと略記する）を得
て，これらにtPAコード部分を連結して発現プラスミド
を用意し，使用すればよい。First of all, since several clones containing cDNA (original cDNA or similar cDNA) encoding natural tPA necessary for producing the substance of the present invention have already been constructed starting from the mRNA of Bowes melanoma cell line, A suitable strain transformed with a plasmid containing the cDNA as a foreign gene may be obtained, and the plasmid may be isolated and used. For example
Examples include pDR1496 (ATCC20728) and pDR1296 (ATCC53347). Alternatively, an expression plasmid obtained by further extracting the tPA coding portion from these plasmids and ligating an appropriate promoter and terminator may be used. For example, it is shown by the following reference 18)
A metallothionein promoter (abbreviated as MT-1 promoter) and a human growth hormone terminator (abbreviated as hGH terminator) are obtained from MThGH111 and MThGH112, and a tPA coding portion is ligated to these to prepare an expression plasmid, which may be used. .

18）パルミター，エタール.,サイエンス 222 809−81
4,1983 （Palmiter,et al.,Science 222 809−814,1983） 一例を示せば次のごとくである。まずMThGH111よりMT
−１プロモータを含むKpn I−Bam HI断片を単離し，プ
ラスミドpUC18に挿入した後,MT−１プロモータを含むBa
mHI−Sal I断片を用意する。他方MThGH112よりMT−１プ
ロモータおよびhGHターミネータを含むEco RI断片を単
離し，プラスミドpUC13に挿入した後,hGHターミネータ
を含むBgl II−Sal I断片を用意する。18) Palmiter, Ettal., Science 222 809-81.
4,1983 (Palmiter, et al., Science 222 809-814, 1983) An example is as follows. First, MT from MThGH111
The Kpn I-Bam HI fragment containing the -1 promoter was isolated and inserted into the plasmid pUC18.
Prepare the mHI-Sal I fragment. On the other hand, an Eco RI fragment containing the MT-1 promoter and hGH terminator is isolated from MThGH112, inserted into the plasmid pUC13, and then a Bgl II-Sal I fragment containing the hGH terminator is prepared.

以上の二つの断片とtPAのpre−pro部分をコードするBam
HI−Xho II断片とを結合し，その結果得られるプラス
ミドを精選し，さらにBgl IIで切断し，ここにpDR1296
から得てきたtPAをコードするXho II断片を挿入すれ
ば，目的とする発現プラスミドが得られる。Zem99はこ
のようにして得られる発現プラスミドの一例であり，図
１にその制限酵素マップを示す。Bam encoding the above two fragments and the pre-pro part of tPA
The HI-Xho II fragment was ligated and the resulting plasmid was carefully selected and further digested with Bgl II, where pDR1296
The desired expression plasmid can be obtained by inserting the XhoII fragment encoding tPA obtained from the above. Zem99 is an example of the expression plasmid thus obtained, and its restriction enzyme map is shown in FIG.

本発明変異tPAは公知の遺伝子組換操作を適宜組合わ
せることによって製造することができるが，本発明では
もっぱら特定位置のアミノ酸の置換が行なわれる関係で
本発明変異tPAをコードするcDNAの調製のためには特にZ
oller and Smithの部位特異的変異誘発（site−directe
d mutagenesis）を好便に利用することができる。すな
わち天然tPAのアミノ酸配列をコードするcDNA（原cDNA
および類似cDNA）をM13のごときファージベクターに組
込み，その結果得られる二本鎖M13DNAで形質転換した大
腸菌の培養液から一本鎖M13DNAを用意し，これに所定の
合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニーリン
グして変異を誘発させればよい。例えばプラスミドpDR1
496からtPAをコードするcDNAを含む断片をM13tg130RFベ
クターに組込み，その結果得られる二本鎖M13DNAから一
本鎖M13DNAを用意し，目的とするアミノ酸の置換に応じ
て所定の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすれば
よい。アミノ酸位置番号186番のSerをThrに置換し，さ
らに糖鎖結合を用意にする目的で同183番のGlyをSerに
置換するためには下記合成ヌクレオチドPM5を使用すれ
ばよい。The mutant tPA of the present invention can be produced by appropriately combining known genetic recombination operations. However, in the present invention, the preparation of a cDNA encoding the mutant tPA of the present invention is performed because of the substitution of amino acids at specific positions. Especially for Z
oller and Smith site-directed mutagenesis
d mutagenesis) can be conveniently used. That is, the cDNA encoding the amino acid sequence of natural tPA (original cDNA
And similar cDNA) into a phage vector such as M13, and prepare single-strand M13DNA from the resulting culture solution of Escherichia coli transformed with double-strand M13DNA, and annealed it with a predetermined synthetic oligonucleotide as a primer. And induce mutations. For example plasmid pDR1
A fragment containing the cDNA encoding tPA from 496 was inserted into an M13tg130RF vector, single-stranded M13DNA was prepared from the resulting double-stranded M13DNA, and a predetermined synthetic oligonucleotide was annealed depending on the substitution of the target amino acid. Good. To replace Ser at amino acid position number 186 with Thr and further replace Gly at position 183 with Ser for the purpose of preparing a sugar chain bond, the following synthetic nucleotide PM5 may be used.

PM5:5′ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3′ アミノ酸位置番号119番のSerをMetに置換するためには
下記合成ヌクレオチドPM6を使用すればよい。PM5: 5′ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3 ′ In order to replace Ser at the amino acid position number 119 with Met, the following synthetic nucleotide PM6 may be used.

PM6:5′GGC CAA CGC CAT GGA GTT CCA GTT 3′ アミノ酸位置番号96番のGlnおよび同98番のIleをそれぞ
れAsnおよびThrに置換するためには下記合成ヌクレオチ
ドPM7を使用すればよい。PM6: 5'GGC CAA CGC CAT GGA GTT CCA GTT 3'The following synthetic nucleotide PM7 may be used to replace Gln at amino acid position 96 and Ile at amino acid position 98 with Asn and Thr, respectively.

PM7:5′CCT GTA GCT GGT ACC GTT GTC CTC GTA 3′ アミノ酸位置番号96のGln,98番のIle,119番のSerをそれ
ぞれAsn,Thr,Metに置換するためにはPM6およびPM7によ
って逐次的に一本鎖M13DNAに変異を導入すればよい。ま
たPM6およびPM7によってそれぞれ別の一本鎖M13DNAに変
異を導入し，別々に発現プラスミドを調製し，それぞれ
における所定の消化断片を連結してもよい。PM7: 5 ′ CCT GTA GCT GGT ACC GTT GTC CTC GTA 3 ′ To replace Gln at amino acid position 96, Ile at 98, and Ser at 119 with Asn, Thr, and Met, use PM6 and PM7 sequentially. A mutation may be introduced into the single-stranded M13 DNA. Alternatively, PM6 and PM7 may be used to introduce mutations into different single-stranded M13 DNAs, separately prepare expression plasmids, and ligate predetermined digested fragments in each.

部位特異的変異誘発を行った後は，得られた反応液で
大腸菌を形質転換し，これを培養して得られるプラーク
について放射標識した合成オリゴヌクレオチドをハイブ
リッドしてスクリーニングすれば，本発明に係る変異tP
AをコードするcDNAを外来遺伝子として含む二本鎖M13フ
ァージDNAを得ることができる。必要により該DNAから当
該cDNAを切り出し，これを宿主に応じて使用される適当
な発現ベクターに連結することは常法に従って適宜おこ
なえばよい。After site-directed mutagenesis, Escherichia coli is transformed with the obtained reaction solution, and plaques obtained by culturing the same are screened by hybridizing radiolabeled synthetic oligonucleotides. Mutant tP
Double-stranded M13 phage DNA containing the cDNA encoding A as a foreign gene can be obtained. If necessary, the cDNA may be excised from the DNA and ligated to an appropriate expression vector used depending on the host, according to a conventional method.

以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺
伝子組換操作はほとんどが公知であるので，文献あるい
は簡単な記述によって以下に説明する。Since most of the individual gene recombination operations used in the intermediate steps of the above manufacturing process are known, they will be described below in the literature or a brief description.

制限酵素によるプラスミドの切断，および切断して得
られるDNA断片のアガロースゲル電気泳動またはポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合につ
いては下記文献19）の記述が参照される。For the digestion of the plasmid with a restriction enzyme, and the separation, recovery, and ligation of the DNA fragment obtained by the digestion by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis, refer to the description in the following document 19).

19）マニアティス，ティー，エタール.,モレキュラーク
ローニング，ア ラボラトリー マニュアル，コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー 1982 （Maniatis,T,et al., Molecular Cloning,A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982） 例えば天然tPAをコードするcDNAを含むプラスミドお
よびM13ファージベクターを各々切断し，断片を結合し
てcDNAの組込まれた二本鎖M13DNAを得る場合に応用され
る。19) Maniatis, T, Ettal., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982 (Maniatis, T, et al., Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982) For example, it is applied when a plasmid containing a cDNA encoding natural tPA and an M13 phage vector are each cleaved, and the fragments are ligated to obtain a double-stranded M13 DNA in which the cDNA is incorporated.

プラスミドの大腸菌への形質転換は下記文献20）に従
えばよい。Transformation of the plasmid into Escherichia coli may be carried out according to the following Reference 20).

20）DNA クローニング 第１巻第６章 ディー．エ
ム．グロバー編，アイ アール エル プレス1985 （DNA cloning Vol.1, chap.6, ed.D.M.Glover IRL pre
ss 1985） 例えば天然tPAをコードするcDNAの組込まれた二本鎖M
13DNAあるいはtPAをコードするcDNAの組込まれた発現プ
ラスミドを大腸菌への形質転換に供するときに応用され
る。20) DNA Cloning Volume 1 Chapter 6 D. M. Glover, IRL Press 1985 (DNA cloning Vol.1, chap.6, ed.DMGlover IRL pre
ss 1985) For example, a double-stranded M incorporating a cDNA encoding natural tPA.
It is applied when an expression plasmid in which 13DNA or a cDNA encoding tPA is incorporated is used for transformation into Escherichia coli.

変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオ
チドのPhosphoamidite法による合成および５′末端の標
識はそれぞれ下記文献21）および22）によればよい。Synthesis of oligonucleotides for mutagenesis and screening by the Phosphoamidite method and labeling of the 5'end may be carried out by the following references 21) and 22), respectively.

21）エス．エル．ビューケージ，エタール.,:テトラヘ
ドロン レット.,22 1859（1981） （S.L.Beaucage,et al.,Tetrahedron Lett.,22 1859（1
981）） 22）エー．マキサム アンド ダブリュ．ギルバード，
メソッズ イン エンチモロジー,65巻499−560頁アカ
デミックプレス1980 （A.Maxam and W.Gilbert,Methods in Enzymology,Vol.
65 p499−560,Academic Press 1980） DNA塩基配列の決定は下記文献23）に従いdideoxy法に
よりおこなえばよい。21) S. El. View Cage, Ettal.,: Tetrahedron Lett., 22 1859 (1981) (SLBeaucage, et al., Tetrahedron Lett., 22 1859 (1
981)) 22) A. Maxam and W. Gilbird,
Methodology in Enzymology, Volume 65, pp. 499-560 Academic Press 1980 (A. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology, Vol.
65 p499-560, Academic Press 1980) The DNA base sequence may be determined by the dideoxy method according to the following Reference 23).

23）エフ．サンガー．エタール.,ピー．エヌ．エー．エ
ス．745463,1977 （F.Sanger et al.,P.N.A.S745463,1977） 例えば変異誘発し，スクリーニングした一本鎖M13DNA
について塩基配列を決定し，目的とする変異が誘発され
ているか否かを確認する場合に応用される。23) F. Sanger. Etal., Pee. N. A. S. 74 5463,1977 (F. Sanger et al., PNAS 74 5463,1977) For example, mutagenized and screened single-stranded M13 DNA
It is applied to determine the nucleotide sequence of sucrose and confirm whether or not the desired mutation has been induced.

二本鎖および一本鎖のM13ファージDNAは以下のように
調製される。すなわち形質転換した大腸菌を下記文献2
4）により培養し，さらに振盪培養し，遠心分離する。
沈澱部の大腸菌からは前記文献19）に記載の方法により
二本鎖M13DNAを得る。また上澄液からは，その1.3mlに2
60μｌの2.5M NaClと20％ PEG 6000を加え，混合物をエ
ッペンドルフミクロチューブで遠心分離し，得られるペ
レットを120μｌの10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.9,0.1mM
EDTA）に懸濁し，フェノール抽出し，エタノールで沈
澱させ,70％エタノールで洗浄し，乾燥後30μｌの10mM
トリス塩酸緩衝液（pH7.9,0.1mM EDTA）に再び懸濁して
一本鎖M13DNAを得る。Double-stranded and single-stranded M13 phage DNA is prepared as follows. That is, the transformed E. coli was transformed into
Incubate according to 4), shake, and centrifuge.
Double-stranded M13 DNA is obtained from the Escherichia coli at the precipitate by the method described in the above-mentioned document 19). From the supernatant, add 2 to 1.3 ml.
60 μl of 2.5 M NaCl and 20% PEG 6000 were added, the mixture was centrifuged in an Eppendorf microtube, and the resulting pellet was 120 μl of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 mM).
EDTA), extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, dried and 30 μl of 10 mM
Resuspend in Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 mM EDTA) to obtain single-stranded M13 DNA.

24）ジェー．メッシング，メソッズ イン エンチモロ
ジー101,20−78,1983 （J.Messing,Method in Enzymology 101,20−78,1983） 部位特異的変異誘発反応は下記文献25）に従っておこ
なわれる。24) J. Messing, Mesozzu in Enchimoro <br/> Gee 101 is performed according 20-78,1983 (J.Messing, Method in Enzymology 101 , 20-78,1983) site-directed mutagenesis reactions the following Reference 25).

25）ゾラー アンド スミス，メソッズ イン エンチ
モロジー 100 468−500,1983 （Zoller and Smith,Methode in Enzymology,100 468−
500,1983） すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合
成オリゴヌクレオチド（プライマー）20pmolに一本鎖M1
3DNA1μg,アニーリング用緩衝液（50mMトリス塩酸,pH8.
0,0.25mM MgCl₂）２μl,B緩衝液（0.2Mトリス塩酸,pH7.
5,0.1M MgCl₂,0.1Mジチオスレイトール）８μl,dATP,dG
TP,dCTP,dTTP各2.5mMずつの混合物４μl,5mM rATP 2μ
l,蒸留水１μl,T₄DNAリガーゼ５単位,DNAポリメラーゼI
Klenow フラグメント５単位を加え，最終全液量を20
μｌとして14℃３時間反応させる。25) Zoller and Smith, Mesozzu Inn Enchimoroji 100 468-500,1983 (Zoller and Smith, Methode in Enzymology, 100 468-
500,1983) That is, single-stranded M1 was added to 20 pmol of synthetic oligonucleotide (primer) for mutagenesis end-labeled with non-radioactive phosphate.
3 μg of DNA, annealing buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.
0,0.25 mM MgCl ₂ ) 2 μl, B buffer (0.2 M Tris-HCl, pH 7.
5,0.1M MgCl ₂ , 0.1M dithiothreitol) 8μl, dATP, dG
Mixture of 2.5 mM each of TP, dCTP, dTTP 4 μl, 5 mM rATP 2 μ
l, distilled water 1 μl, T ₄ DNA ligase 5 units, DNA polymerase I
Add 5 units of Klenow fragment to give a final total volume of 20
μl is reacted at 14 ° C. for 3 hours.

次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたDNAで大腸
菌を形質転換するためには下記文献26）に従って行な
い，さらに下記文献27）に従って形質転換した大腸菌を
大腸菌JM103とまぜて寒天培地上に拡げ,37℃で一夜培養
し，形成するプラークをニトロセルロースフィルター上
に写しとる。Next, in order to transform Escherichia coli with the mutagenized DNA using the reaction mixture, the procedure described in the following Reference 26) is performed, and the E. coli transformed according to the following Reference 27) is mixed with E. coli JM103 and then placed on an agar medium. Spread and incubate overnight at 37 ℃, and copy the formed plaques onto a nitrocellulose filter.

26）クレーマー エタール.,セル 38 879−887,1984 （Kramer et al.,Cell 38 879−887,1984） 27）グルンスタイン アンド ホグネス，ピー．エヌ．
エー．エス．ユーエスエー 72 3961,1975 （Grunstein and Hogness,P.N.A.S.USA 72 3961,1975） ニトロセルロースフィルター上に写しとったプラーク
についてのスクリーニングは以下のように行なう。26) Kramer Ettal., Cell 38 879-887,1984 (Kramer et al., Cell 38 879-887,1984) 27) Gurung Stein and Hogness, copy. N.
A. S. USA 72 3961,1975 (Grunstein and Hogness, PNASUSA 72 3961,1975) Screening for plaques transferred on nitrocellulose filters is performed as follows.

ニトロセルロースフィルターを６倍のSSC（１倍のSSC
は150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム）,10倍のDenhar
dt's（１倍のDenhardt'sは0.02％ポリビニルピロリド
ン,0.02％フィコール,0.02％ウシ血清アルブミン）,50
μg/ml超音波処理サケ***DNAの中に加えて65℃３時間
処理し，予備ハイブリッドを形成させる。次いでフィル
ターを放射標識した変異誘発用合成オリゴヌクレオチド
と同一緩衝液条件下で混合し65℃で一夜放置してハイブ
リットを形成させる。フィルターを６倍のSSCで洗浄
し，水分をきった後，増感スクリーンを重ね,X線フィル
ムに露出して目的のプラークを選出する。Nitrocellulose filter with 6 times SSC (1 time SSC
Is 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 10 times Denhar
dt's (1x Denhardt's is 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% ficoll, 0.02% bovine serum albumin), 50
μg / ml Ultrasonication Add to salmon sperm DNA and treat at 65 ° C for 3 hours to form pre-hybrid. The filter is then mixed with radiolabeled synthetic oligonucleotide for mutagenesis under the same buffer conditions and left at 65 ° C. overnight to form a hybrid. After washing the filter with 6 times SSC and removing water, an intensifying screen is overlaid and exposed to X-ray film to select the target plaque.

変異tPAをコードするcDNAを二本鎖M13DNAから切り出
し，これを発現ベクターに連結して得られる発現プラス
ミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換に使用すればよい
が，例えばBHK細胞の形質転換のためには下記文献28）
に従ってLoyterらの方法によりおこなえばよい。すなわ
ち得られた発現プラスミドを例えばpSV2−dhfrと供にBH
K⁵⁷⁰細胞株（ts,tk^-）に形質転換する。なおpSV2−dhfr
については下記文献29）が参照される。The expression plasmid obtained by excising the cDNA encoding the mutant tPA from the double-stranded M13 DNA and ligating it to an expression vector may be used for transformation depending on the host, for example, for transformation of BHK cells. Is the following reference 28)
According to Loyter et al. That is, the obtained expression plasmid was combined with, for example, pSV2-dhfr and BH
K ⁵⁷⁰ cell line (ts, tk ^-) and transformed into. PSV2-dhfr
For details, see Reference 29) below.

28）ロイター エタール.,ピー．エヌ．エー．エス．ユ
ーエスエー，79 422,1982 （Loyter et al.,P.N.A.S.USA,79 422,1982） 29）サブラマニ，エタール：モル．セル．バイオロ．1
854−864,（1981） （Sabramani, et al:Mol.Cell.Biol.1 854−864,（198
1） クローニングは限界希釈法（limiting dilution法）
を利用して以下のごとく行なうことができる。28) Reuter Ethal., P. N. A. S. USA, 79 422,1982 (Loyter et al., PNASUSA, 79 422,1982) 29) Sabramani, etal: mol. cell. Biolo. 1
854-864, (1981) (Sabramani, et al: Mol.Cell.Biol. 1 854-864, (198
1) Cloning is the limiting dilution method
You can do the following using.

形質転換の数日後より200nM Amethopterin含有ダルベ
コ変法イーグル培地（ダルベコ変法イーグル培地，ブド
ウ糖3.5％，炭酸水素ナトリウム7.5％，牛胎児血清（FC
S）５％，トラネキサム酸3mM,グルタミン2mM,（＋）−A
methopterin 200nM）で２〜３日毎に１〜２周培地交換
しながら限界希釈して産生株を得る。次に産生株をロー
ラーボトルに用意した200nM Amethopterin含有ダルベコ
変法イーグル培地300mlに接種し,37℃で培養し，培養開
始より３〜４日後より毎日３〜４週間同量の培地で培地
交換し，培養上清を集めればよい。Several days after transformation, Dulbecco's modified Eagle medium containing 200 nM Amethopterin (Dalbeco's modified Eagle medium, glucose 3.5%, sodium bicarbonate 7.5%, fetal bovine serum (FC
S) 5%, tranexamic acid 3 mM, glutamine 2 mM, (+)-A
The production strain is obtained by limiting dilution with methopterin 200 nM) every 2-3 days while changing the medium once or twice. Next, inoculate 300 ml of Dulbecco's modified Eagle medium containing 200 nM Amethopterin prepared in a roller bottle with the production strain, incubate at 37 ° C, and exchange the medium with the same amount of medium for 3-4 weeks every day 3-4 days after the start of culture. , Collect the culture supernatant.

変異tPAの精製のためには抗tPA抗体を担体に結合した
抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィーを
好便に利用することができる。すなわちあらかじめトリ
ス緩衝液（100mMトリス塩酸,pH7.5,0.5M NaCl）で緩衝
化した抗体カラムに前記培養上清をチャージし，同上ト
リス緩衝液で洗浄後,5M KSCN溶液（同上トリス緩衝液に
溶解）で活性成分を溶出する。溶出した活性画分は濃縮
し，例えばセファクリルＳ−200にチャージし，トリス
緩衝液（50mMトリス塩酸,pH7.5,0.5M NaCl,1.5M KSCN）
でゲル過する。再び活性画分は濃縮し，脱塩し，例え
ばマニトールを添加して凍結乾燥すれば最終物質を得る
ことができる。For purification of mutant tPA, affinity chromatography using an antibody column in which an anti-tPA antibody is bound to a carrier can be conveniently used. That is, the above-mentioned culture supernatant was charged in an antibody column buffered with Tris buffer (100 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.5M NaCl) in advance, washed with Tris buffer as above, and then 5M KSCN solution (in Tris buffer as above). The active ingredient is eluted by dissolution. The eluted active fraction was concentrated and charged with, for example, Sephacryl S-200, and Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1.5 M KSCN) was added.
To pass the gel. The active fraction can be concentrated again, desalted, and added with mannitol, for example, and freeze-dried to obtain the final substance.

以上の工程操作によって得られた本発明糖鎖変異tPAに
おいては，糖鎖の結合位置を特定する必要があり，この
目的のためには以下の分析を行なえばよい。In the sugar chain mutant tPA of the present invention obtained by the above process operation, it is necessary to specify the binding position of the sugar chain, and the following analysis may be performed for this purpose.

まず糖鎖変異tPAについて，下記文献30）に示すWaxda
llらの方法に従い，ジスルフィド結合を還元アルキル化
後，反応液をPD−10カラム （ファルマシアジャパン
社）により脱塩し，ついで凍結乾燥物を1mlの4M尿素含
有50mMトリス緩衝液pH9.0に溶解し，リジルエンドペプ
チダーゼを酵素対基質モル比が１対100となるよう加え,
37℃で16時間酵素消化を行う。酵素消化終了後，反応液
に70％ギ酸を加え,pH2に調整して反応を止め，反応液は
下記の条件下での高速液体クロマトグラフィーによるペ
プチドマッピングに供する。 First, regarding sugar chain mutant tPA, Waxda shown in Reference 30) below.
ll et al., Reductive alkylation of disulfide bond
After that, the reaction solution was added to PD-10 column. (Pharmacia Japan
Desalination, and then the freeze-dried product was added with 1 ml of 4M urea.
Dissolved in 50 mM Tris buffer pH 9.0, and lysyl endopep
Add tidase to a molar ratio of enzyme to substrate of 1: 100,
Perform enzymatic digestion at 37 ° C for 16 hours. Reaction solution after enzymatic digestion
70% formic acid was added to the solution to adjust the pH to 2 to stop the reaction, and the reaction solution
High-performance liquid chromatography chromatography under the following conditions:
Use for petite mapping.

30）ワックスダール，エム．ジェー.,エタール.:バイオ
ケミストリー，7,1959,（1968） Waxdall,M.J.,et al.:Biochemistry,7,1959,（1968）） カラム Ultrapore RPSC（ベックマンジャパン社） 溶出液 0.1％トリフルオロ酢酸水溶液及び0.08％トリ
フルオロ酢酸含有アセトニトリル 溶出条件 アセトニトリル含量を60分で０％から60％に
上昇させるリニアグラジエント 流速 毎分1ml 検出 206nmの紫外吸収 ペプチドマッピングでは，あらかじめ天然tPAについ
て上記と同一の酵素消化を行い，糖含有ペプチドを含
め，すべての断片ペプチドについての溶出位置を決定し
ておく。この結果を基にして，各糖鎖変異tPAについて
の糖含有ペプチドの溶出位置を推定し，さらにレクチン
−パーオキシダーゼを用いたドットブロッティング法に
より，糖鎖の有無の確認を行う。30) Wax Dahl, M. J., et al .: Biochemistry, 7 , 1959, (1968) Waxdall, MJ, et al .: Biochemistry, 7 , 1959, (1968)) Column Ultrapore RPSC (Beckman Japan) Eluent 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution Acetonitrile containing 0.08% trifluoroacetic acid Elution conditions Linear gradient to increase the acetonitrile content from 0% to 60% in 60 minutes Flow rate 1 ml / min Detection UV absorption at 206 nm In peptide mapping, the same enzymatic digestion as above was performed for natural tPA. Then, the elution positions of all fragment peptides including the sugar-containing peptide are determined. Based on these results, the elution position of the sugar-containing peptide for each sugar chain mutant tPA is estimated, and the presence or absence of sugar chains is confirmed by the dot blotting method using lectin-peroxidase.

こうして得られた各糖鎖変異tPAの糖鎖含有フラグメ
ントは0.1M重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し，トリプ
シン（Warthington,U.S.A.）を加え,37℃,6時間の酵素
消化を行い，上記の高速液体クロマトグラフィーの条件
でさらに分離精製する。各溶出ピークについてアミノ酸
配列を分析し，糖鎖の結合したアミノ酸を決定する。The sugar chain-containing fragments of each sugar chain-mutated tPA thus obtained were dissolved in 0.1 M ammonium bicarbonate aqueous solution, trypsin (Warthington, USA) was added, and enzymatic digestion was performed at 37 ° C for 6 hours. It is further separated and purified under the conditions of chromatography. The amino acid sequence of each elution peak is analyzed to determine the amino acid to which the sugar chain is bound.

（５）実施例 以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。(5) Examples The present invention will be described more specifically by the examples described below.

実施例１ （ａ）183番GlyをSerに,186番SerをThrに置換するため
のDNAプラスミドの調製 図２に示したようにZem99よりM13mp18/Bam Zem99を作
製した。すなわち,Zem99をBamH1にて切断し,Bgl II制限
酵素切断部位を含む約2.4KbpのDNA断片を回収する。こ
のDNA断片とM13mp18（ファルマシア（株））のBamH1切
断断片とを結合させ，二本鎖M13DNAとし，大腸菌へ形質
転換しM13mp18/Bam Zem99RFおよび一本鎖M13mp18/Bam Z
em99を得た。Example 1 (a) Preparation of DNA plasmid for substituting Ser for 183 Gly and Thr for 186 Ser As shown in FIG. 2, M13mp18 / Bam Zem99 was prepared from Zem99. That is, Zem99 is cut with BamH1 to recover a DNA fragment of about 2.4 Kbp containing the Bgl II restriction enzyme cleavage site. This DNA fragment was ligated with the BamH1 cleavage fragment of M13mp18 (Pharmacia Co.) to give double-stranded M13DNA, which was transformed into E. coli and transformed with M13mp18 / Bam Zem99RF and single-stranded M13mp18 / Bam Z.
got em99.

次に,tPAの¹⁸³GlyをSerに，¹⁸⁶SerをThrに置換する目
的で式:5′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA3′のオリ
ゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリゴヌク
レオチドプライマーとしM13mp18/Bam Zem99とにより部
位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニングし，部位
特異的な変異の生じたファージを得た。このファージよ
り一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩基配列を
確認し,M13−6000とした。Next, for the purpose of substituting ¹⁸³ Gly of tPA with Ser and ¹⁸⁶ Ser with Thr, an oligonucleotide of the formula: 5′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA3 ′ was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer and site-specific with M13mp18 / Bam Zem99. Mutagenesis was performed and screened to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA nucleotide sequencing, and it was designated as M13-6000.

さらに二本鎖M13DNAを得,M13−6000RFとした。 In addition, double-stranded M13 DNA was obtained and designated as M13-6000RF.

次に図３に示したようにM13−6000RFよりZem99−6000
を調製した。すなわち,M13−6000RFをBgl II,Apalにて
切断し1.4KbpのDNA断片を回収し，この断片とZem99をBg
l II,Apalにて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質
転換し，プラスミドを回収しZem99−6000を得た。Next, as shown in Fig. 3, from M13-6000RF, Zem99-6000
Was prepared. That is, M13-6000RF was cleaved with Bgl II and Apal to recover a 1.4 Kbp DNA fragment, and this fragment and Zem99 were added to Bg
The fragments cleaved with II and Apal were ligated, transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-6000.

なお,Zem99−6000の変異tPAコーディング領域のDNA配
列およびそのアミノ酸配列を図７−1,図７−2,図７−３
に示す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia co
li RR1−Zem99−6000は微工研寄託番号FERM P−9126で
ある。The DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6000 and its amino acid sequence are shown in Figure 7-1, Figure 7-2, and Figure 7-3.
Shown in In addition, Escherichia co transformed with Escherichia co
li RR1-Zem99-6000 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9126.

ｂ）糖鎖変異tPA 得られたZem99−6000とpSV2−dhfrとでBHK⁵⁷⁰細胞株
（ts,tk^-）をLoyterの方法により形質転換し，限界希釈
法でクローニングし，培養上清を抗体カラムにチャージ
し，最終物質No.6000を得た。No.6000について糖鎖の結
合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列にお
けるアミノ酸位置番号117番,184番,448番のAsnに糖鎖が
結合しており，特に184番の糖鎖結合が不均一になりや
すいと考えられる問題が解決されていることが判明し
た。b) carbohydrate mutation tPA obtained Zem99-6000 and pSV2-dhfr and in BHK ⁵⁷⁰ cell line (ts, tk ^-) was transformed by the Loyter methods, and cloned by limiting dilution, the culture supernatant antibody column The final material No. 6000 was obtained. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 6000, the sugar chain was bound to Asn at amino acid positions 117, 184 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA. It turns out that the problems that are likely to be non-uniform have been resolved.

実施例２ ａ）119番SerをMetに置換するためのDNAプラスミドの調
製 図４に示したようにpDR1496よりM13tg130−W RFを作
製した。Example 2 a) Preparation of DNA plasmid for replacing Ser 119 with Met As shown in FIG. 4, M13tg130-W RF was prepared from pDR1496.

すなわちpDR1496をSph I,Xba Iにて切断し,Bgl II制
限酵素切断部位を含む約2.1KbpのDNA断片を回収した。
このDNA断片とM13tg130RFのSph I,Xba I切断断片とを結
合させ，二本鎖M13DNAとし，大腸菌へ形質転換しM13tg1
30−W RF及び一本鎖M13tg130−Ｗを得た。That is, pDR1496 was digested with Sph I and Xba I, and a DNA fragment of about 2.1 Kbp containing the Bgl II restriction enzyme cleavage site was recovered.
This DNA fragment was ligated with the Sph I and Xba I cleavage fragment of M13tg130RF to form double-stranded M13 DNA, which was transformed into E. coli and transformed into M13tg1.
30-W RF and single-stranded M13tg130-W were obtained.

次に,tPAの¹¹⁹SerをMetに置換させる目的で式:5′GGC
CAACGCCATGGAGTTCCAGTT3′のオリゴヌクレオチドを合成
し，これを変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーと
し一本鎖M13tg130−Ｗとにより部位特異的な変異誘発を
行ない，スクリーニングし，部位特異的な変異の生じた
ファージを得た。このファージより一本鎖M13DNAを得,D
NA塩基配列決定により塩基配列を確認し，更に二本鎖M1
3DNAを得,M13tg130−W16 RFとした。Next, in order to replace ¹¹⁹ Ser of tPA with Met, the formula: 5′GGC
CAACGCCATGGAGTTCCAGTT 3'oligonucleotide was synthesized, site-specific mutagenesis was performed by using this as a mutagenic oligonucleotide primer and single-stranded M13tg130-W, and a phage with site-specific mutation was obtained. . Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage and D
The nucleotide sequence was confirmed by NA sequencing, and the double-stranded M1
3 DNA was obtained and designated as M13tg130-W16 RF.

次に図５に示した様にM13tg130−W16 RFよりZem99−6
300を調製した。Next, as shown in Fig. 5, from M13tg130-W16 RF, Zem99-6
300 was prepared.

すなわちM13tg130−W16 RFをBgl II,Apalにて切断し
1.4KbpのDNA断片を回収しこの断片と,Zem99をBgl II,Ap
alにて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，
プラスミドを回収しZem99−6300を得た。That is, cut M13tg130-W16 RF with Bgl II, Apal.
A 1.4 Kbp DNA fragment was recovered, and this fragment and Zem99 were added to Bgl II, Ap.
The fragment cut with al was ligated and transformed into E. coli,
The plasmid was recovered to obtain Zem99-6300.

なおZem99−6300の変異tPAコーディング領域のDNA配
列およびそのアミノ酸配列を図８−1,図８−2,図８−３
に示す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia co
li RR1−Zem99−6300は微工研寄託番号FERM P−9127で
ある。The DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6300 and its amino acid sequence are shown in Figure 8-1, Figure 8-2, and Figure 8-3.
Shown in In addition, Escherichia co transformed with Escherichia co
li RR1-Zem99-6300 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9127.

ｂ）糖鎖変異tPA Zem99−6300を使用し，実施例１のｂ）項の記載と同
様にして最終物質No.6300を得た。No.6300について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号184番と448番のAsnにのみ糖
鎖が結合しており,117番のAsnには糖鎖が結合していな
いことが判明した。b) Using sugar chain mutation tPA Zem99-6300, the final substance No. 6300 was obtained in the same manner as described in item b) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 6300, the sugar chain was bound only to Asn at amino acid positions 184 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Turned out not to.

実施例３ ａ）119番SerをMetに置換し，かつ96番GlnをAsnに,98番
Ile をThrに置換するためのDNAプラスミドの調製 実施例１のａ）で作製したM13mp18/Bam Zem99を用意
した。Example 3 a) Replacing Ser No. 119 with Met, and Gln 96 with Asn, No. 98
Preparation of DNA plasmid for replacing Ile with Thr The M13mp18 / Bam Zem99 prepared in a) of Example 1 was prepared.

次に,tPAの⁹⁶GlnをAsnに⁹⁸IleをThrに置換させる目的
で式:5′CCTGTAGCTGGTACCGTTGTCCTCGTA3′のオリゴヌク
レオチドを合成し，これを変異誘発性オリゴヌクレオチ
ドプライマーとしM13mp18/Bam Zem99とにより部位特異
的な変異誘発を行ない，スクリーニングし，部位特異的
な変異の生じたファージを得る。このファージより一本
鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩基配列を確認
し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13m62.5 RFとした。（図
６） M13m62.5 RFをBgl II,Nar Iにて，また実施例２の
ａ）で作製したM13tg130−W16 RFをNar I,Apa Iにて切
断し，それぞれ331bp, 1068bpのDNA断片を回収する。こ
れらのDNAとZem99のBgl II,Apa I切断断片を結合させ，
大腸菌に形質転換し，プラスミドを回収しZem99−6400
を得た。（図６） なおZem99−6400の変異tPAコーディング領域のDNA配
列およびそのアミノ酸配列を図９−1,図９−2,図９−３
に示す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia co
li RR1−Zem99−6400は微工研寄託番号FERM P−9128で
ある。Next, in order to replace ⁹⁶ Gln of tPA with Asn and ⁹⁸ Ile with Thr, an oligonucleotide of the formula: 5′CCTGTAGCTGGTACCGTTGTCCTCGTA3 ′ was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer with M13mp18 / Bam Zem99 in a site-specific manner. Mutagenesis is performed and screened to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA nucleotide sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained and designated as M13m62.5 RF. (FIG. 6) M13m62.5 RF was cleaved with Bgl II and Nar I, and M13tg130-W16 RF prepared in Example 2 a) was cleaved with Nar I and Apa I to obtain 331 bp and 1068 bp DNA fragments, respectively. to recover. By ligating these DNA with the Bgl II and Apa I cleavage fragments of Zem99,
Transformed into E. coli and recovered the plasmid, Zem99-6400
I got (FIG. 6) The DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6400 and its amino acid sequence are shown in FIG. 9-1, FIG. 9-2, and FIG. 9-3.
Shown in In addition, Escherichia co transformed with Escherichia co
li RR1-Zem99-6400 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9128.

ｂ）糖鎖変異tPA Zem99−6400を使用し，実施例１のｂ）項の記載と同
様にして最終物質No.6400を得た。No.6400について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号98番,184番,448番のAsnに糖
鎖が結合しており,117番のAsnには糖鎖が結合していな
いことが判明した。b) Using sugar chain mutation tPA Zem99-6400, the final substance No. 6400 was obtained in the same manner as described in item b) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 6400, the sugar chain was bound to Asn at amino acid positions 98, 184, and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Was found not to bind.

（６）発明の効果 以下の実験例によって本発明の効果を示す。(6) Effects of the Invention The effects of the present invention will be shown by the following experimental examples.

実験例１ 試料と方法 実施例１〜３で得られたNo.6000,No.6300,No.6400を
検体試料とし，また天然tPAを対照試料とした。３％マ
ニトール,3％アスパラギン酸および３％アルギニンを含
むpH6.0の水溶液に各試料を溶解し,Sprague−Dawley系
雄性ラット（体重230〜270g）に各々0.4mg/kgずつを大
腿部静脈内に投与し，経時的に頸静脈から0.5mlずつ採
血し，少量の3.8％クエン酸を添加して遠心分離し，血
漿を得た。血漿中の各tPA濃度はサンドイッチ法による
酵素免疫測定法で測定した。Experimental Example 1 Sample and Method No. 6000, No. 6300, and No. 6400 obtained in Examples 1 to 3 were used as sample samples, and natural tPA was used as a control sample. Each sample was dissolved in a pH 6.0 aqueous solution containing 3% mannitol, 3% aspartic acid and 3% arginine, and 0.4 mg / kg of each was injected into male Sprague-Dawley rats (body weight 230 to 270 g) in the femoral vein. It was administered intraperitoneally, and 0.5 ml of blood was collected from the jugular vein over time, a small amount of 3.8% citric acid was added, and centrifugation was performed to obtain plasma. Each tPA concentration in plasma was measured by the enzyme immunoassay method by the sandwich method.

結果 結果を図10に示す。図10は各試料についての血漿中濃
度の経時的推移を示すグラフであり，図中●印線，○印
線，△印線，▲印線は，それぞれ天然tPA,No.6000,No.6
300,No.6400における結果を示す。図10において各試料
濃度の経時的推移はtwo−compartment modelで解析され
る。消失半減期T1/2（α）およびT1/2（β）を求めた。
その結果を表１に示す。表中の数値は３例の平均値であ
り，単位minである。Results Results are shown in FIG. Figure 10 is a graph showing the time course of plasma concentration for each sample. In the figure, ●, ○, △, and ▲ are the natural tPA, No.6000, and No.6, respectively.
The results for 300 and No. 6400 are shown. In Fig. 10, the time course of each sample concentration is analyzed by a two-compartment model. The elimination half-lives T1 / 2 (α) and T1 / 2 (β) were determined.
The results are shown in Table 1. Numerical values in the table are average values of 3 cases and are in units of min.

図10および表１より本発明糖鎖変異tPAが血中濃度消
失において天然tPAを格段に改善したものとなっている
ことが判明する。 From FIG. 10 and Table 1, it is found that the sugar chain mutant tPA of the present invention is a marked improvement of natural tPA in the disappearance of the blood concentration.

実験例２ 実施例１〜３で得られたNo.6000,No.6300,No.6400を
検体試料とし，また天然tPAを対照試料とした。各試料
約500μｇにpH7.12緩衝液（イオン強度0.05）を溶解液
として加え,26℃で５分間攪拌し,8時間振とうしてから
遠心分離し，上澄液についてHPLC（UV220nm）により蛋
白量を求め溶解度を定めた。結果を表２に示す。表中の
数値はmg/mlによって示される。Experimental Example 2 No. 6000, No. 6300, and No. 6400 obtained in Examples 1 to 3 were used as sample samples, and natural tPA was used as a control sample. A pH 7.12 buffer solution (ionic strength 0.05) was added as a solution to about 500 μg of each sample, stirred at 26 ° C for 5 minutes, shaken for 8 hours, and then centrifuged. The supernatant was subjected to HPLC (UV220 nm) for protein analysis. The amount was determined and the solubility was determined. Table 2 shows the results. Numerical values in the table are given in mg / ml.

表２より本発明糖鎖変異tPAは医療目的に応じて溶解
度を適宜に調節できるものとなっていることが判明す
る。 It is clear from Table 2 that the sugar chain variant tPA of the present invention can appropriately adjust the solubility according to the medical purpose.

実験例３ 試料と方法 実施例１〜３で得られたNo.6000,No.6300,No.6400を
検体試料とし，また天然tPAを対照試料とした。アトム
静脈カテーテル（4Fr,3.5cm）に3cm長の絹糸を入れ，注
入用シリンジに結合させておく。別に血液と3.8％クエ
ン酸ナトリウムを9:1に混合してヒトクエン酸血液を用
意し，この液0.5mlに¹²⁵Iでラベルしたフィブリノーゲ
ン（25μCi/50μｌ生理食塩水）,0.25M塩化カルシウム5
0μl,トロンビン5U/10μｌを加える。得られる溶液16μ
ｌを前記注入用シリンジに吸いとってカテーテル内に注
ぎ，室温60分間放置する。絹糸をカテーテルからとり出
し，生理食塩水で洗浄してから放射活性を測定し，スタ
ート時のフィブリン血栓値とした。次にこの絹糸をSpra
gue−Dawley系雄ラット（200−300g）の頸動静脈（AVシ
ャント）内に入れ，続いて計算量の試料を1mlの溶解液
に希釈したものを同ラットの大腿静脈より投与し,2時間
経過後に絹糸をとりだし，放射活性を測定して残存フィ
ブリン血栓値とした。下式により血栓残存率（％）を求
めた。Experimental Example 3 Sample and Method No. 6000, No. 6300, and No. 6400 obtained in Examples 1 to 3 were used as sample samples, and natural tPA was used as a control sample. Insert a 3 cm long silk thread into the atom vein catheter (4 Fr, 3.5 cm) and connect it to the injection syringe. Separately, prepare human citrate blood by mixing blood and 3.8% sodium citrate at a ratio of 9: 1. 0.5 ml of this solution was labeled with ¹²⁵ I fibrinogen (25 μCi / 50 μl physiological saline), 0.25 M calcium chloride 5
Add 0 μl, thrombin 5U / 10 μl. The resulting solution 16μ
1 is sucked into the injection syringe, poured into the catheter, and left at room temperature for 60 minutes. The silk thread was taken out from the catheter, washed with physiological saline, and then the radioactivity was measured to obtain the fibrin thrombosis value at the start. Next, this silk thread
gue-Dawley male rats (200-300g) were placed in the jugular vein (AV shunt), and then a calculated amount of the sample diluted with 1 ml of lysate was administered through the femoral vein of the same rat for 2 hours. After that, the silk thread was taken out and the radioactivity was measured to obtain the residual fibrin thrombosis value. The residual rate of thrombus (%) was calculated by the following formula.

結果 結果を図11に示す。図11は試料の投与量と血栓残存率
との関係を示すグラフであり，図中，実線（−），点線
（……），一点鎖線 二点鎖線 はそれぞれ天然tPA,No.6000,No.6300,No.6400について
の三例の平均値の結果を示す。 Results Results are shown in FIG. Fig. 11 is a graph showing the relationship between the dose of the sample and the residual rate of thrombus. In the figure, the solid line (-), the dotted line (...), and the dashed line Dash-dotted line Shows the results of the average value of three cases for natural tPA, No.6000, No.6300, and No.6400, respectively.

図11より本発明糖鎖変異tPAは天然tPAと同程度に血栓
溶解活性を有することが判明する。From FIG. 11, it is revealed that the sugar chain mutant tPA of the present invention has thrombolytic activity to the same extent as natural tPA.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

図１はZem99の制限酵素マップである。 図２はM13mp18/Bam Zem99の構築図である。 図３はZem99−6000の構築図である。 図４はM13tg130−W RFの構築図である。 図５はZem99−6300の構築図である。 図６はZem99−6400の構築図である。 図７−1,図７−2,図７−３はZem99−6000の変異tPAコー
ディング領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列であ
る。 図８−1,図８−2,図８−３はZem99−6300の変異tPAコー
ディング領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列であ
る。 図９−1,図９−2,図９−３はZem99−6400の変異tPAコー
ディング領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列であ
る。 図10は血漿中濃度の経時的推移を示すグラフである。 図11は投与量と血栓残存率の関係を示すグラフである。Figure 1 is a restriction enzyme map of Zem99. FIG. 2 is a construction diagram of M13mp18 / Bam Zem99. FIG. 3 is a construction diagram of Zem99-6000. FIG. 4 is a construction diagram of M13tg130-W RF. FIG. 5 is a construction diagram of Zem99-6300. FIG. 6 is a construction diagram of Zem99-6400. FIG. 7-1, FIG. 7-2, and FIG. 7-3 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6000 and its amino acid sequence. 8-1, FIG. 8-2, and FIG. 8-3 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6300 and its amino acid sequence. 9-1, 9-2, and 9-3 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-6400 and its amino acid sequence. FIG. 10 is a graph showing the time course of plasma concentration. FIG. 11 is a graph showing the relationship between dose and residual rate of thrombus.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 欧州特許公開178105（ＥＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 23Ｐ．3701 −3707（1984)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI technical display location (C12N 9/64 Z C12R 1:91) (56) References European Patent Publication 178105 (EP, A) Biochemistry 23P. 3701-3707 (1984)

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】天然tPAのアミノ酸位置番号183番のGlyお
よび186番のSerをそれぞれSerおよびThrに置換された変
異tPA。1. A mutant tPA obtained by substituting Gly at amino acid position No. 183 and Ser at amino acid position 186 of natural tPA with Ser and Thr, respectively.