JPH0843391A - Measuring method for antigen antibody reaction - Google Patents
Measuring method for antigen antibody reactionInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は抗原・抗体反応の測定方
法に関する。詳しくは、磁性粒子および標識粒子を用い
る抗原・抗体反応の測定方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring an antigen-antibody reaction. Specifically, it relates to a method for measuring an antigen-antibody reaction using magnetic particles and labeled particles.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定
法が種々の疾病の早期検出法や、極微量の物質の検出法
として知られている。高感度な免疫測定法には種々の方
法があり、抗体または抗原に対し標識物質としての、放
射性同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などを
結合して用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などが知られてい
る。また、ラテックス等の不溶性担体粒子に担持された
抗体または抗原と、それに対応する抗原または抗体とを
反応させ、その反応に伴う反応混合物の透過光の変化か
ら抗原抗体反応の速度を測定する方法（ＬＰＩＡ）が知
られている。2. Description of the Related Art Conventionally, an immunoassay method utilizing an antigen-antibody reaction has been known as an early detection method for various diseases and a detection method for a trace amount of a substance. There are various methods for highly sensitive immunoassays, such as a radioimmunoassay (RIA) in which a radioactive isotope (RI), an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like as a labeling substance is bound to an antibody or an antigen, Enzyme immunoassay (EIA), fluorescent immunoassay (FI
A), luminescence immunoassay (LIA) and the like are known. In addition, a method of reacting an antibody or antigen supported on insoluble carrier particles such as latex and the corresponding antigen or antibody, and measuring the rate of the antigen-antibody reaction from the change in transmitted light of the reaction mixture accompanying the reaction ( LPIA) is known.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかし、かかる従来技
術は種々の問題を持つ。たとえば、ＲＩＡはＲＩの取扱
いおよび廃棄に対する制約がある。ＬＰＩＡは簡便性、
操作性などに優れた方法であるが、検出感度の改良が望
まれている。ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡなどは取扱いの安
全性については有利であるが、検出感度はＲＩＡに若干
劣る。また、ＥＩＡは酵素反応を伴うため取扱いもＦＩ
Ａほど簡便ではない。ＬＩＡも、分離後、発光させるた
めに水酸化ナトリウムなどの試薬を加える必要があるた
めＦＩＡに比べると複雑であるという欠点があった。However, such a conventional technique has various problems. For example, RIA has constraints on RI handling and disposal. LPIA is simple,
Although this method is excellent in operability, improvement in detection sensitivity is desired. EIA, FIA, LIA, etc. are advantageous in handling safety, but their detection sensitivity is slightly inferior to RIA. Also, since EIA involves an enzymatic reaction, handling is FI.
Not as simple as A. The LIA also has a drawback that it is more complicated than the FIA because a reagent such as sodium hydroxide needs to be added in order to emit light after the separation.
【０００４】ところで、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡなどの
方法は、通常、反応結合物と未反応物を分離、洗浄する
操作（Ｂ／Ｆ分離）を必要とするが、これらの方法にお
いて、測定操作を煩雑にし、時間のかかるものにしてい
る主な原因はこれらのＢ／Ｆ分離である。Ｂ／Ｆ分離と
しては、通常、チューブ、マイクロタイターウェルなど
の反応管から、未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗
浄液の供給、インキュベーション、洗浄液の廃棄という
洗浄操作を数回繰り返すことが行われている。By the way, methods such as EIA, FIA and LIA usually require an operation (B / F separation) of separating and washing a reaction binder and an unreacted material. These B / F separations are the main cause of making it cumbersome and time consuming. For B / F separation, usually, after discarding a reaction solution containing an unreacted substance from a reaction tube such as a tube or a microtiter well, a washing operation of supplying a washing solution, incubating, and discarding the washing solution is repeated several times. Has been done.
【０００５】Ｂ／Ｆ分離を比較的迅速、簡便に行うため
にメンブレン、グラスファイバーなどのフィルターを利
用したものがある。これらは、液の流れる方向が一方向
であるため（液の廃棄時に吸い出す必要がない）、洗浄
工程に必要とする時間も短くてすみ、また、自動化など
装置化しやすい特徴がある。しかしながら、これらの方
法にも、種々の問題点がある。[0005] In order to perform B / F separation relatively quickly and easily, there is a filter that uses a filter such as a membrane or glass fiber. Since the flow direction of the liquid is one direction (there is no need to suck it out when discarding the liquid), the time required for the cleaning process can be short, and the device can be easily automated, for example. However, these methods also have various problems.
【０００６】フィルターに一次抗体又は抗原を直接結合
させたものでは、フィルターと測定したい項目とが対応
している必要があり、フィルターの保管、供給などを考
えると自動化装置とする場合に問題がある。また、ラテ
ックス等の微粒子に一次抗体または抗原を結合し、反応
後、フィルターに捕集するタイプのものでは、フィルタ
ー上に孔径より大きい粒子を捕集するものと、フィルタ
ーへの粒子の吸着を利用するものがある。前者では、フ
ィルターが目詰まりすることにより二次抗体などの標識
物が完全に洗浄しきれなくて、バックグラウンドの上昇
を生じる可能性がある。また、後者では、フィルターへ
の吸着の原因が解明されていないため、粒子を完全に捕
集しているかどうかの判断、また、吸着しやすい素材を
用いることによるバックグラウンドの上昇などの問題が
残る。また、フィルター内部への吸着を利用するため、
ＥＩＡには応用できるが、ＦＩＡの場合、励起光がとど
かない可能性もあり応用できない。In the case where the primary antibody or the antigen is directly bound to the filter, the filter and the item to be measured need to correspond to each other, and there is a problem in the case of using an automated device in consideration of storage and supply of the filter. . In addition, in the type that binds primary antibody or antigen to fine particles such as latex and collects it on the filter after reaction, it uses the one that collects particles larger than the pore size on the filter and the adsorption of particles to the filter There is something to do. In the former case, the filter may become clogged and the labeled substances such as the secondary antibody may not be completely washed out, which may cause an increase in the background. Also, in the latter, the cause of adsorption to the filter has not been elucidated, so there are problems such as determination as to whether particles are completely collected, and background increase due to the use of materials that are easily adsorbed. . Also, because it uses the adsorption inside the filter,
Although it can be applied to EIA, FIA cannot be applied because the excitation light may not reach.
【０００７】一方、Ｂ／Ｆ分離の改良法として、磁性粒
子を用いたものも種々報告されている。この方法は、磁
力を利用して磁性粒子を集める操作を迅速、簡便にでき
る特徴がある。しかしながら、標識としてＲＩを用いる
もの以外の、酵素、蛍光色素、化学発光性色素、あるい
はそれらを標識した不溶性担体粒子を使用する系では、
いずれも最終的には光学的計測を必要とするため最終測
定液中に残存する磁性粒子の光学的計測に与える影響が
大きいことが知られている。On the other hand, various methods using magnetic particles have been reported as an improved method for B / F separation. This method is characterized in that the operation of collecting magnetic particles using magnetic force can be performed quickly and easily. However, in systems other than those using RI as a label, enzymes, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, or insoluble carrier particles labeled with them,
It is known that all of them require optical measurement in the end, and thus have a great influence on the optical measurement of the magnetic particles remaining in the final measurement liquid.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、磁性粒子を用いること
により迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が実施でき、かつ、標識
粒子を用いることにより通常のＦＩＡよりも測定感度を
上昇させた免疫分析方法を見出した。即ち本発明の要旨
は、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を用いる抗原
抗体反応の測定方法において、不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子に抗原抗体反応による特異的結合を解
離させる解離液を加えて該不溶性標識粒子を解離させ、
解離した該不溶性標識粒子の標識強度を測定する方法に
存する。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that B / F separation can be carried out rapidly and simply by using magnetic particles, and that labeled particles are used. As a result, an immunoassay method has been found in which the measurement sensitivity is higher than that of ordinary FIA. That is, the gist of the present invention is a method for measuring an antigen-antibody reaction using insoluble magnetic particles and insoluble labeled particles, wherein the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are added with a dissociation solution that dissociates a specific bond due to the antigen-antibody reaction. Dissociate insoluble labeled particles,
The method consists in measuring the labeling intensity of the dissociated insoluble labeled particles.
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を用いる
抗原抗体反応の測定方法としては、例えば、以下のよう
な方法が挙げられる。 方法１：下記の工程からなる抗原・抗体反応の測定方
法。 （ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）工程（ａ）と同一の測定しようとする抗原又は抗
体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性標識粒子か
らなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した
該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。The present invention will be described in detail below. In the present invention, examples of the method for measuring the antigen-antibody reaction using insoluble magnetic particles and insoluble labeled particles include the following methods. Method 1: A method for measuring an antigen / antibody reaction comprising the following steps. (A) a first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying an antibody or an antigen against the antigen or antibody to be measured,
The antigen or antibody to be measured is reacted in the liquid medium of the reaction container. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) A second reagent consisting of insoluble labeled particles carrying an antibody or an antigen against the same antigen or antibody to be measured as in step (a), and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) And react in a liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１０】方法２：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。 （ａ）測定しようとする抗体に対する抗原を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）測定しようとする抗体の免疫グロブリンクラスと
特異的に反応する物質を担持させた不溶性標識粒子から
なる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した該
不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 2: A method for measuring an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (A) The first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying an antigen for the antibody to be measured is reacted with the antibody to be measured in the liquid medium of the reaction container. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) a second reagent composed of insoluble labeled particles carrying a substance that specifically reacts with the immunoglobulin class of the antibody to be measured, and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) React in liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１１】方法３：下記の工程からなる抗体の測定方
法。 （ａ）測定しようとする抗体に対する抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）測定しようとする抗体と特異的に結合する抗原を
担持させた不溶性標識粒子からなる第２試薬と、工程
（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液
体媒体中で反応させる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 3: An antibody measuring method comprising the following steps. (A) A first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying an antibody against the antibody to be measured is reacted with the antibody to be measured in a liquid medium in a reaction container. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) In a liquid medium, a second reagent consisting of insoluble labeled particles carrying an antigen that specifically binds to the antibody to be measured and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) React. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１２】方法４：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。 （ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）測定しようとする抗原又は抗体と同じ特異性を有
する抗原又は抗体を担持させた不溶性標識粒子からなる
第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶
性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 4: A method for measuring an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (A) a first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying an antibody or an antigen against the antigen or antibody to be measured,
The antigen or antibody to be measured is reacted in the liquid medium of the reaction container. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) a second reagent consisting of insoluble labeled particles carrying an antigen or antibody having the same specificity as the antigen or antibody to be measured, and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) React in liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１３】方法５：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。 （ａ）測定しようとする抗原又は抗体と同一の抗原又は
抗体を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
該測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は抗原
の一定量とを、該測定しようとする抗原又は抗体の存在
下反応容器の液体媒体中で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）工程（ａ）で不溶性磁性粒子に担持した該抗原又
は抗体と反応した該抗体又は抗原と反応しうる物質を担
持させた不溶性標識粒子からなる第２試薬と、工程
（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液
体媒体中で反応させる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 5: A method for measuring an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (A) a first reagent comprising insoluble magnetic particles carrying the same antigen or antibody as the antigen or antibody to be measured,
A fixed amount of an antibody or an antigen against the antigen or antibody to be measured is reacted in the liquid medium of a reaction container in the presence of the antigen or antibody to be measured. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) Reaction of step (b) with a second reagent consisting of insoluble labeled particles carrying the antibody or a substance capable of reacting with the antigen reacted with the antigen or antibody carried on the insoluble magnetic particles in step (a) The insoluble magnetic particles attached to the container wall are reacted in a liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１４】方法６：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。 （ａ）測定しようとする抗原に対する抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、ビオチンで標識し
た該測定しようとする抗原と同一の抗原の一定量とを、
該測定しようとする抗原の存在下反応容器の液体媒体中
で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）アビジンまたは抗ビオチン抗体を担持させた不溶
性標識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器
壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応さ
せる。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 6: A method for measuring an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (A) a first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying an antibody against the antigen to be measured, and a fixed amount of the same antigen labeled with biotin as the antigen to be measured,
The reaction is performed in the liquid medium of the reaction container in the presence of the antigen to be measured. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) The second reagent consisting of insoluble labeled particles carrying avidin or anti-biotin antibody and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) are reacted in a liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１５】方法７：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。 （ａ）測定しようとする抗体と同一の抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、ビオチンで標識し
た該測定しようとする抗体に対する抗原の一定量とを、
該測定しようとする抗体の存在下反応容器の液体媒体中
で反応させる。 （ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。 （ｃ）アビジン又は抗ビオチン抗体を担持させた不溶性
標識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁
に付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させ
る。 （ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。Method 7: A method for measuring an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (A) a first reagent composed of insoluble magnetic particles carrying the same antibody as the antibody to be measured, and a fixed amount of an antigen against the antibody to be measured labeled with biotin,
The reaction is carried out in the liquid medium of the reaction container in the presence of the antibody to be measured. (B) The insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed. (C) A second reagent composed of insoluble labeled particles carrying an avidin or anti-biotin antibody and the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall of step (b) are reacted in a liquid medium. (D) The insoluble magnetic particles of step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field to remove the liquid medium and unreacted insoluble labeled particles, and then the insoluble labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles are removed. Measure the label strength.
【００１６】本発明で使用する不溶性磁性粒子は、たと
えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）、三二酸化鉄（γ−Ｆ
ｅ2 Ｏ3 ）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケ
ル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケ
ル、マンガンなどの合金からなる微粒子またはこれらの
磁性粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニ
トリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メ
チル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートな
どの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリ
ルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２
−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオ
キシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシ
プロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメ
タクリレートなどの架橋した親水性重合体、またはそれ
ぞれのモノマーの２−４種程度の共重合体などのラテッ
クス、ゼラチン、リポソームまたは、上記磁性微粒子を
ラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化
した粒子などが用いられる。The insoluble magnetic particles used in the present invention are, for example, ferric tetroxide (Fe 3 O 4 ), ferric sesquioxide (γ-F).
e 2 O 3 ), various ferrites, fine particles made of metals such as iron, manganese, nickel, cobalt and chromium, alloys such as cobalt, nickel and manganese, or polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacryl containing these magnetic particles inside. Hydrophobic polymers such as ronitrile, polymethyl methacrylate, polycapramide, polyethylene terephthalate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2
-Oxyethyl methacrylate), poly (2,3-dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), cross-linked hydrophilic polymers such as polyethylene glycol methacrylate, or 2-4 of each monomer. A latex such as a copolymer of several kinds, gelatin, a liposome, or particles obtained by immobilizing the above magnetic fine particles on the surface of a latex, gelatin, a liposome, or the like is used.
【００１７】不溶性磁性粒子の粒径は０．０５μｍ〜５
μｍのものが用いられ、０．１μｍ〜１μｍの範囲内の
粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。本発明で使用
される不溶性標識粒子に担持させる標識としては、既に
種々のものが知られており、本発明でも特に制限はされ
ない。好ましくは、蛍光色素、酵素、化学発光性色素が
挙げられる。酵素標識では、たとえばペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が良く利
用される。また、蛍光色素としては、たとえば、ユーロ
ピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓ
ｍ）などの希土類キレートや、フィコシアニン、フィコ
エリスリンなどのフィコビリプロテイン、フルオレッセ
イン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−
メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマ
リンなどが知られている。また、化学発光性色素では、
例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソル
ミノール、あるいはこれらの誘導体などがある。The particle size of the insoluble magnetic particles is 0.05 μm to 5 μm.
The insoluble magnetic particles having a particle size in the range of 0.1 μm to 1 μm are preferable. Various labels are already known as the labels to be carried on the insoluble labeled particles used in the present invention, and the present invention is not particularly limited. Preferred are fluorescent dyes, enzymes, and chemiluminescent dyes. For enzyme labeling, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, β-galactosidase, luciferase, etc. are often used. Examples of fluorescent dyes include europium (Eu), terbium (Tb) and samarium (S).
m) and other rare earth chelates, phycocyanin, phycobiliproteins such as phycoerythrin, fluorescein, tetramethylrhodamine, Texas red, 4-
Methylumbelliferone, 7-amino-4-methylcoumarin and the like are known. Also, with chemiluminescent dyes,
For example, there are acridinium ester, luminol, isoluminol, and derivatives thereof.
【００１８】これらの標識を施す不溶性担体粒子として
は、反応させる時に用いる液体媒体に実質的に不溶性
で、０．０５〜５μｍ、好ましくは０．１〜１μｍの平
均粒径を有するものが用いられる。担体粒子の材質は上
記不溶性磁性粒子で述べたものと同様に、ポリスチレ
ン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、
ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレ
ンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルア
ミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリ
レート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ
（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエ
チレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性
重合体、またはそれぞれのモノマーの２−４種程度の共
重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームに加え
て、赤血球のような生体成分、金コロイドのような金属
コロイド粒子等が用いられる。As the insoluble carrier particles to be labeled, those which are substantially insoluble in the liquid medium used for the reaction and have an average particle size of 0.05 to 5 μm, preferably 0.1 to 1 μm are used. . The material of the carrier particles are the same as those described for the insoluble magnetic particles, polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile,
Hydrophobic polymers such as polymethylmethacrylate, polycapramide, polyethylene terephthalate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinylpyrrolidone,
Polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate),
Crosslinked hydrophilic polymer such as poly (2,3-dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), polyethylene glycol methacrylate, or a copolymer of about 2-4 kinds of each monomer. In addition to latex, gelatin, liposomes, etc., biological components such as red blood cells, metal colloid particles such as gold colloid, and the like are used.
【００１９】不溶性担体粒子に標識を担持させる方法と
しては、粒子表面の官能基を利用して化学的に結合させ
る方法、粒子を重合して合成する際に、標識を加えて粒
子内部に封じ込める方法、粒子内部または表面に物理的
に吸着、封入させる方法、あらかじめ、タンパク質、ペ
プチドなどと物理的または化学的に標識を結合させてお
いてからそのタンパク質、ぺプチドを粒子に固定化する
方法などがある。たとえば、特開昭５４−１０１４３９
号公報には希土類キレートをＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オク
チルホスフィンオキシド）との協同抽出法を利用して有
機高分子のラテックスの内部に閉じ込める方法が述べら
れている。これに従って作製した標識粒子は標識強度、
安定性共に良好である。As a method of supporting the label on the insoluble carrier particles, a method of chemically bonding the functional groups on the surface of the particle, a method of adding a label and encapsulating the particles inside the particles when polymerizing and synthesizing the particles , A method of physically adsorbing and encapsulating on the inside or the surface of a particle, a method of physically or chemically binding a label to a protein or peptide in advance, and then immobilizing the protein or peptide on the particle. is there. For example, JP-A-54-101439
The publication describes a method of confining a rare earth chelate inside a latex of an organic polymer by utilizing a cooperative extraction method with TOPO (tri-n-octylphosphine oxide). Labeled particles produced in accordance with this, label strength,
Both stability is good.
【００２０】本発明において、不溶性磁性粒子及び不溶
性標識粒子に担持させる抗体としては通常ＩｇＧが用い
られるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいは
ジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元
剤を用いて、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどの
低分子化したものを用いても良い。また、ＩｇＧだけで
なくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子
化したフラグメントを用いても良い。また、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも適用できる。
モノクローナル抗体を用いる時は、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原のように繰り返し構造をもつタンパク質や、ＣＡ
１９−９抗原のように分子内にエピトープを複数持つ抗
原に対してはモノクローナル抗体は１種類以上で使用で
きる。また、認識エピトープの異なるものを２種類以上
組み合わせても使用できる。In the present invention, IgG is usually used as the antibody to be carried on the insoluble magnetic particles and the insoluble labeled particles, but a digestive enzyme such as pepsin or papain or a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol is used to remove F Low molecular weight compounds such as (ab ′) 2 , Fab ′, and Fab may be used. Further, not only IgG but also IgM or a fragment obtained by lowering the molecular weight of IgM by the same treatment as IgG may be used. Further, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be applied.
When using a monoclonal antibody, a protein having a repetitive structure such as hepatitis B virus surface antigen or CA
One or more kinds of monoclonal antibodies can be used for antigens having a plurality of epitopes in the molecule such as 19-9 antigen. Also, two or more kinds having different recognition epitopes can be used in combination.
【００２１】一方、担持させる抗原としては、たとえば
タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂
質、花粉、遺伝子工学的に産生された組換えタンパク
質、薬物など種々のものが挙げられる。即ち、本発明で
言う「抗原」とは、人、あるいは動物に対し抗体産生を
惹起する能力のあるすべての物質のうち、例えば診断等
特別の目的の下に選択された単一あるいは複数の物質、
ないしはそれらを含有する混合物が挙げられる。On the other hand, examples of the antigen to be carried include various substances such as proteins, polypeptides, steroids, polysaccharides, lipids, pollen, recombinant proteins produced by genetic engineering and drugs. That is, the term "antigen" used in the present invention means, of all substances capable of inducing antibody production in humans or animals, for example, a single substance or a plurality of substances selected under a special purpose such as diagnosis. ,
Or a mixture containing them.
【００２２】本発明においては、測定しようとする物質
が抗体の場合、不溶性磁性粒子に測定しようとする抗体
に対する抗原を担持させ、不溶性標識粒子に測定しよう
とする抗体の免疫グロブリンクラスと特異的に反応する
物質を担持させることもできる（上記方法２）。不溶性
磁性粒子を担持させる抗原としては上記と同様のものが
挙げられる。不溶性標識粒子に担持させる抗体の免疫グ
ロブリンクラスと特異的に反応する物質としては、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの
抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成
分の一種であるＣｌｑ等のように、ある種の抗体分子の
特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質を言
う。In the present invention, when the substance to be measured is an antibody, the insoluble magnetic particles are caused to carry an antigen against the antibody to be measured, and the insoluble labeled particles are specifically bound to the immunoglobulin class of the antibody to be measured. It is also possible to support a substance that reacts (method 2 above). Examples of the antigen that carries the insoluble magnetic particles include the same ones as described above. Examples of the substance that specifically reacts with the immunoglobulin class of the antibody carried by the insoluble labeled particles include Ig
G, IgA, IgM, IgD, IgE or antibodies against their antibody light chain portions, protein A or a component of complement such as Clq and the like, selectively recognizing and binding characteristics of certain antibody molecules A substance that has the ability to
【００２３】さらに、本発明においては、測定しようと
する物質が抗体の場合、不溶性磁性粒子に測定しようと
する抗体に対する抗体を担持させ、不溶性標識粒子に測
定しようとする抗体と特異的に結合する抗原を担持させ
ることもできる（上記方法３）。不溶性磁性粒子に担持
させる測定しようとする抗体に対する抗体（以下、後者
の抗体を便宜上「抗体’」と略すことがある）とは、測
定しようとする抗体に対するいわゆる免疫グロブリンと
称するタンパク、および測定しようとする抗体の免疫グ
ロブリンクラスと特異的に反応する物質を意味する。Further, in the present invention, when the substance to be measured is an antibody, the insoluble magnetic particles are caused to carry an antibody against the antibody to be measured, and the insoluble labeled particles are specifically bound to the antibody to be measured. It is also possible to carry an antigen (method 3 above). An antibody against an antibody to be measured carried on insoluble magnetic particles (hereinafter, the latter antibody may be abbreviated as “antibody” ”for convenience) is a protein called an immunoglobulin against the antibody to be measured, and a protein to be measured. Means a substance that specifically reacts with the immunoglobulin class of the antibody.
【００２４】前者を担持させる場合、通常ＩｇＧクラス
の免疫グロブリンが用いられるが、ペプシン、パパイン
などの消化酵素、あるいはジチオスレイトール、メルカ
プトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ′）2
化、Ｆａｂ′化、Ｆａｂ化する等の低分子化したものを
用いても良い。また、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＭ、ある
いはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメ
ントを用いても良い。また、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体のいずれも適用可能である。When carrying the former, immunoglobulins of the IgG class are usually used. However, digesting enzymes such as pepsin and papain, or reducing agents such as dithiothreitol and mercaptoethanol are used to prepare F (ab ') 2
It is also possible to use a polymer having a low molecular weight such as a compound, a Fab ′ compound, or a Fab compound. Further, not only IgG, but also IgM or a fragment obtained by lowering the molecular weight of IgM by the same treatment as IgG may be used. Further, both polyclonal antibody and monoclonal antibody can be applied.
【００２５】後者を担持させる場合は上記と同様のもの
が挙げられる。不溶性標識粒子に担持させる測定しよう
とする抗体と特異的に結合する抗原とは、上記で挙げた
通りである。本発明において、不溶性標識粒子に、測定
しようとする抗原または抗体と同じ特異性を有する抗原
または抗体が担持される場合（上記方法４）、これら
は、前述のとおり物理的または化学的に固定化される。
本発明における「特異性を有する」とは、測定しようと
する物質が抗原である場合、前述した抗原と生物学的あ
るいは生理学的に同一なものとして生体に非自己として
認識され、抗体の産生を導く物質全般を指す。測定しよ
うとする物質が抗体である場合は、かかる抗体の免疫グ
ロブリンクラスと反応するもの、すなわちＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの抗体軽鎖
部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成分の一種
であるＣｌｑ等のように、ある種の抗体分子の特徴を選
択的に認識して結合する能力を有する物質を言う。When carrying the latter, the same ones as described above can be mentioned. The antigen specifically bound to the antibody to be measured, which is carried on the insoluble labeled particles, is as described above. In the present invention, when the insoluble labeled particles carry an antigen or antibody having the same specificity as the antigen or antibody to be measured (the above method 4), these are physically or chemically immobilized as described above. To be done.
In the present invention, "having specificity" means that when the substance to be measured is an antigen, it is recognized as non-self by the living body as biologically or physiologically identical to the above-mentioned antigen, and the production of antibody is Refers to all substances that lead. When the substance to be measured is an antibody, a substance that reacts with the immunoglobulin class of such an antibody, that is, IgG, Ig
Ability to selectively recognize and bind features of certain antibody molecules, such as A, IgM, IgD, IgE or antibodies against their antibody light chain, protein A or Clq which is one of the complement components. Refers to a substance having.
【００２６】また、本発明の上記方法５において標識粒
子に固定化する不溶性磁性粒子に担持した抗原又は抗体
と反応した抗体又は抗原と反応し得る物質としては、上
記不溶性磁性粒子で挙げたような抗体（ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体いずれも可）または抗原に加
え、上記のような抗体の免疫グロブリンクラスと特異的
に反応する物質、アビジン又はストレプトアビジン等の
抗ビオチン抗体が挙げられる。Further, in the above-mentioned Method 5 of the present invention, the antigen carried on the insoluble magnetic particles immobilized on the labeled particles or the antibody reacting with the antibody or the substance capable of reacting with the antigen is the same as those mentioned above for the insoluble magnetic particles. In addition to an antibody (either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) or an antigen, a substance that specifically reacts with the immunoglobulin class of the antibody as described above, or an anti-biotin antibody such as avidin or streptavidin can be used.
【００２７】不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子に上
記のような抗原、抗体等を担持させる方法としては、こ
れらの物質を物理的に吸着させるか、あるいは化学的に
担持させることにより行われる。物理的に吸着させる方
法としては、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子に、
抗原、抗体等を直接固定化する方法、アルブミンなどの
他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固
定化する方法が挙げられる。As a method of supporting the above-mentioned antigens, antibodies and the like on the insoluble magnetic particles and the insoluble labeled particles, these substances are physically adsorbed or chemically supported. As a method of physically adsorbing, insoluble magnetic particles and insoluble labeled particles,
Examples include a method of directly immobilizing an antigen, an antibody and the like, and a method of chemically binding to another protein such as albumin and then adsorbing and immobilizing it.
【００２８】化学的に担持させる方法としては、不溶性
磁性粒子および不溶性標識粒子の表面に存在するアミノ
基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、
アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾すること
により抗原分子、抗体分子等と結合させることができる
官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子
と抗原分子、抗体分子等の間にスペーサー分子を化学結
合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタ
ンパク質に抗原、抗体等を化学結合させた後、そのタン
パク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。As the method of chemically supporting, the amino group, the carboxyl group, the mercapto group, the hydroxyl group, which are present on the surface of the insoluble magnetic particles and the insoluble labeled particles,
A method of directly immobilizing on a particle by using a functional group capable of binding to an antigen molecule, an antibody molecule, etc. by chemically modifying an aldehyde group, an epoxy group, etc., a particle and an antigen molecule, an antibody molecule, etc. Examples of the method include a method of immobilizing a spacer molecule by chemical bond between them, a method of chemically bonding an antigen, an antibody, etc. to another protein such as albumin, and then chemically bonding the protein to particles.
【００２９】その他、固定化したい抗原、抗体等と特異
的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡ、な
ど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、
目的の抗原、抗体等を結合させることにより粒子表面に
固定化する方法も挙げられる。一般的に担持される抗
原、抗体等の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官
能基量等により異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍ
ｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇであ
る。In addition, after physically or chemically binding a substance (for example, antibody, protein A, etc.) that specifically binds to an antigen or antibody to be immobilized on the particle surface,
There is also a method of immobilizing it on the surface of the particle by binding a target antigen, antibody or the like. Generally, the amount of antigens, antibodies, etc. carried is different depending on the surface area of the insoluble carrier particles used, the amount of functional groups, etc.
g-500 mg, preferably 10 mg-100 mg.
【００３０】不溶性標識粒子において標識と上記抗体、
抗原等を担持する順序には特に制限はないが、標識を担
持した後、抗体、抗原等を担持するのが好ましい。次に
本発明の代表的反応系を例にして、本発明についてさら
に詳細に説明する。試料溶液中の抗原を測定することを
目的とし、不溶性磁性粒子に該抗原に対する抗体、ま
た、標識として蛍光色素を用い、該不溶性蛍光色素標識
粒子に該抗原に対する抗体を担持させた粒子を用いた系
として説明する。Label in the insoluble labeled particle and the above-mentioned antibody,
The order of supporting the antigens and the like is not particularly limited, but it is preferable to carry the antibody, the antigens and the like after carrying the label. Next, the present invention will be described in more detail by taking a typical reaction system of the present invention as an example. For the purpose of measuring the antigen in the sample solution, an antibody against the antigen was used as the insoluble magnetic particles, and a fluorescent dye was used as a label, and particles in which the antibody against the antigen was carried on the insoluble fluorescent dye labeled particles were used. Described as a system.
【００３１】まず測定しようとする抗原を含むと考えら
れる試料溶液と、該抗原に対する抗体を担持させた不溶
性磁性粒子（第１試薬) とを反応容器の液体媒体中で混
合し反応させる（第一反応) 。反応開始時の混合は十分
に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め
放置して反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応
と同様にｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９にて行
う。温度については、２〜５０℃の範囲で実施可能であ
るが、望ましくは室温乃至は３７〜４０℃で反応させ
る。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意である
が、感度、操作性を考慮して、通常３〜６０分の範囲で
設定される。これらの反応条件は、以降の工程について
も同様である。First, a sample solution considered to contain an antigen to be measured and insoluble magnetic particles (first reagent) carrying an antibody against the antigen are mixed and reacted in a liquid medium of a reaction vessel (first Reaction). The mixing at the start of the reaction needs to be sufficiently performed, but after the uniform mixing, the mixing may be stopped and allowed to react. The reaction is carried out at pH 5 to 10, preferably pH 7 to 9 as in the general immunochemical reaction. Regarding the temperature, it can be carried out in the range of 2 to 50 ° C., but preferably the reaction is carried out at room temperature to 37 to 40 ° C. The reaction time is arbitrary from immediately after the reaction to one day and night, but is usually set in the range of 3 to 60 minutes in consideration of sensitivity and operability. These reaction conditions are the same for the subsequent steps.
【００３２】目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液
が用いられる。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス
（ヒドロキシメチル) アミノメタン等が用いられるが、
中性から弱アルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用
可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、
塩化ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタン
パク質が添加される。A buffer is usually used to maintain the desired pH. As the buffer solution, for example, phosphoric acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, etc. are used,
Most neutral to weakly alkaline buffers can be used. Often, to avoid non-specific reactions,
Salts such as sodium chloride and proteins such as bovine serum albumin are added.
【００３３】この時、不溶性磁性粒子は反応液に対して
０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．
１重量％となるように使用される。不溶性磁性粒子と試
料とを混合すると、試料中に含まれる抗原が粒子表面上
の抗体と結合する。次いで、磁場の作用により、不溶性
磁性粒子を反応液から分離し、反応容器壁に付着させ
る。残存する反応液を除いた後、必要に応じて洗浄工程
（適当な洗浄液を加え、攪拌し、直ちに磁場を付与して
分離後、溶液を除く) を数回繰り返す。その後、分離し
た不溶性磁性粒子と第一反応と同一の測定しようとする
抗原に対する抗体を担持させた不溶性蛍光色素標識粒子
（第２試薬) とを混合し第一反応と同様にして液体媒体
中で反応させる（第二反応) 。不溶性蛍光色素標識粒子
も、上記の不溶性磁性粒子と同様に緩衝液に懸濁させて
使用される。このとき不溶性蛍光色素標識粒子は反応液
中に０．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．０
００１〜０．０１重量％で用いられる。At this time, the insoluble magnetic particles are contained in the reaction solution in an amount of 0.0001 to 1% by weight, preferably 0.001 to 0.
It is used so as to be 1% by weight. When the insoluble magnetic particles and the sample are mixed, the antigen contained in the sample binds to the antibody on the particle surface. Then, by the action of the magnetic field, the insoluble magnetic particles are separated from the reaction solution and attached to the wall of the reaction vessel. After removing the remaining reaction solution, the washing step (adding an appropriate washing solution, stirring, immediately applying a magnetic field for separation, and removing the solution) is repeated several times, if necessary. Then, the separated insoluble magnetic particles and the insoluble fluorescent dye-labeled particles (second reagent) carrying an antibody against the same antigen to be measured as in the first reaction are mixed, and in a liquid medium in the same manner as in the first reaction. React (second reaction). The insoluble fluorescent dye-labeled particles are also used by suspending them in a buffer solution like the above-mentioned insoluble magnetic particles. At this time, the insoluble fluorescent dye-labeled particles are contained in the reaction solution in an amount of 0.00001 to 0.1% by weight, preferably 0.0
It is used in an amount of 001 to 0.01% by weight.
【００３４】不溶性磁性粒子と不溶性蛍光色素標識粒子
とを混合すると上記第一反応で不溶性磁性粒子と結合し
た抗原が、蛍光粒子表面上の抗体と結合する。次いで磁
場の作用により不溶性磁性粒子を反応液から分離し反応
容器壁に付着させる。残存する反応液を除いた後、必要
に応じて洗浄工程を数回繰り返す。その後、分離した不
溶性磁性粒子に最終分散液を加え、懸濁液として、該溶
液に含まれる不溶性蛍光色素標識粒子の量を、蛍光色素
に固有の励起光を照射し、放出される蛍光強度を計測す
ることにより測定する。例えば、Ｅｕキレートを標識色
素とした場合、励起光は３００〜３８０ｎｍまたは２４
０〜２７０ｍｍの紫外光であり、蛍光は６００〜６３０
ｎｍ（６１５ｎｍに極大値を有する) である。When the insoluble magnetic particles and the insoluble fluorescent dye-labeled particles are mixed, the antigen bound to the insoluble magnetic particles in the first reaction is bound to the antibody on the surface of the fluorescent particles. Then, the insoluble magnetic particles are separated from the reaction solution by the action of the magnetic field and attached to the wall of the reaction vessel. After removing the remaining reaction solution, the washing step is repeated several times if necessary. After that, the final dispersion liquid is added to the separated insoluble magnetic particles, and as a suspension, the amount of the insoluble fluorescent dye-labeled particles contained in the solution is irradiated with excitation light specific to the fluorescent dye, and the emitted fluorescence intensity is adjusted. Measure by measuring. For example, when Eu chelate is used as the labeling dye, the excitation light is 300 to 380 nm or 24
UV light of 0 to 270 mm and fluorescence of 600 to 630
nm (having a maximum value at 615 nm).
【００３５】この時、最終的に残った標識粒子の蛍光強
度の測定を磁性粒子を分散させた懸濁液の状態で行う
と、分散している磁性粒子による光学的な妨害により正
確な計測は困難である。すなわち、磁性粒子濃度が高す
ぎると計測を極めて困難なものにするため、使用する磁
性粒子濃度に制限が生じてしまう。この点を改善するた
め、本発明は、上記最終分散液のかわりに抗原・抗体反
応による特異的な結合を解離させることのできる解離液
を加え、混合後、磁場の作用により不溶性磁性粒子を液
体媒体から分離し、計測に影響しない反応容器壁に付着
させ、特異的結合を解離して遊離した標識粒子のみを計
測することによって、より正確な標識粒子強度の計測を
可能とした。At this time, if the fluorescence intensity of the finally remaining labeled particles is measured in the state of a suspension in which the magnetic particles are dispersed, accurate measurement is not possible due to optical interference by the dispersed magnetic particles. Have difficulty. That is, if the concentration of magnetic particles is too high, the measurement becomes extremely difficult, so that the concentration of magnetic particles to be used is limited. In order to improve this point, in the present invention, a dissociation liquid capable of dissociating a specific bond due to an antigen-antibody reaction is added in place of the final dispersion liquid, and after mixing, the insoluble magnetic particles are liquidized by the action of a magnetic field. By separating from the medium and adhering to the wall of the reaction vessel that does not affect the measurement, and dissociating the specific bond and measuring only the released labeled particles, more accurate measurement of the labeled particle intensity was made possible.
【００３６】粒子状のものが存在するいわゆる懸濁液で
は、光学的計測は不利であることは広く知られている。
また、免疫測定法において標識した不溶性担体粒子を用
いた場合、免疫反応、分離、次いで、洗浄後、最終的に
残存している粒子は一般的に不溶性磁性粒子の方がかな
り高い比率で存在するため、解離して遊離した不溶性標
識粒子の影響は磁性粒子に比べて小さく、光散乱などを
起こして計測に影響するレベルではない。従って磁性粒
子のみでも計測系から除去する効果は極めて大きい。It is widely known that optical measurement is disadvantageous in so-called suspensions in which particles are present.
When labeled insoluble carrier particles are used in the immunoassay, the particles that finally remain after the immunoreaction, separation, and washing are generally present in a considerably higher proportion of the insoluble magnetic particles. Therefore, the effect of the insoluble labeled particles that have been dissociated and released is smaller than that of the magnetic particles, and is not at a level that causes light scattering or the like and affects the measurement. Therefore, the effect of removing only magnetic particles from the measurement system is extremely large.
【００３７】抗原・抗体反応による特異的な結合を解離
される条件としては、アフィニティークロマトグラフィ
ー等で種々のものが知られている（例えば、”Ａｆｉｎ
ｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ＆ ｍｅｔｈｏｄｓ” Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 参照）が、本
発明の解離液としても、これらで知られている条件が利
用できる。即ち、本発明で使用される解離液としては、
塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッ
ファー等の酸性溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液、
３Ｎ塩化ナトリウム、４．５Ｍ塩化マグネシウム等の高
イオン強度溶液、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔ
ｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液、ジオキサン、エ
チレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝
液、トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピッ
クイオンや尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が
挙げられる。Various conditions such as affinity chromatography are known as conditions for dissociating the specific bond due to the antigen-antibody reaction (eg, "Afin").
ity Chromatography princi
plus & methods "Pharmacia
LKB Biotechnology) can also be used as the dissociation solution of the present invention under the conditions known in these. That is, as the dissociation liquid used in the present invention,
Acidic solutions such as hydrochloric acid, sulfuric acid, propionic acid, acetic acid, glycine / hydrochloric acid buffer, alkaline solutions such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, diethylamine, etc.
High ionic strength solution such as 3N sodium chloride, 4.5M magnesium chloride, SDS, TritonX-100, T
Examples thereof include a surfactant-containing solution such as ween 20, a buffer solution containing a substance that reduces the polarity such as dioxane and ethylene glycol, and a buffer solution containing chaotropic ions such as trichloroacetic acid and thiocyanate, urea and guanidine hydrochloride.
【００３８】なお解離液を加える量は１反応容器あたり
５０μｌ〜１ｍｌである。抗原または抗体を定量する場
合は、予め抗原又は抗体濃度既知品を、或は抗原又は抗
体基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試
料の抗原又は抗体濃度に対して図示すれば該抗原又は抗
体の検量線が得られるので、濃度未知試料の反応定量値
から該抗原又は抗体の濃度が求められる。The amount of the dissociation solution added is 50 μl to 1 ml per reaction vessel. In the case of quantifying an antigen or an antibody, if an antigen or antibody concentration known product or an antigen or antibody reference product is measured in advance as a sample, and the obtained quantitative value is graphically shown against the antigen or antibody concentration of the sample Since a calibration curve for the antigen or antibody is obtained, the concentration of the antigen or antibody can be obtained from the reaction quantitative value of the sample of unknown concentration.
【００３９】磁場のかけ方に関しては、第一反応後の不
溶性磁性粒子を約１〜３分程度で、また、同様に第二反
応後の不溶性蛍光色素標識粒子と結合した不溶性磁性粒
子も約１〜３分程度で分離できるような磁場の強度及び
反応系の形状が好ましい。分離に要する時間が短すぎる
と、一般に感度、再現性の低下を招き、長すぎると操作
性を悪化させる。こうした理由から反応系の大きさは比
較的小さい方が扱い易い。９６穴マイクロプレートなど
は個々のウェルのサイズは小さく、ウェル間の隙間に小
磁石を置けば、マイクロプレートを利用したＥＩＡと同
様にマイクロプレートリーダを用いて容易に抗原又は抗
体を定量できるので本発明の実施に適した反応容器のた
めの材料である。また、ポリスチレン、アクリルなどの
プラスチックや、ガラスで作成したチューブ、キュベッ
トなども本発明に適した反応容器のための材料である。
磁石としては、永久磁石、電磁石等を使用する。Regarding the method of applying a magnetic field, the insoluble magnetic particles after the first reaction take about 1 to 3 minutes, and similarly, the insoluble magnetic particles bound to the insoluble fluorescent dye-labeled particles after the second reaction also take about 1 minute. The strength of the magnetic field and the shape of the reaction system are preferably such that they can be separated in about 3 minutes. If the time required for separation is too short, sensitivity and reproducibility are generally deteriorated, and if too long, operability is deteriorated. For this reason, it is easier to handle the reaction system with a smaller size. In 96-well microplates, the size of individual wells is small, and if a small magnet is placed in the gap between the wells, the antigen or antibody can be easily quantified using a microplate reader as in EIA using microplates. A material for a reaction vessel suitable for carrying out the invention. Further, plastics such as polystyrene and acrylic, tubes made of glass, cuvettes and the like are also materials for the reaction vessel suitable for the present invention.
A permanent magnet, an electromagnet, or the like is used as the magnet.
【００４０】[0040]
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において使用した洗浄液の組成はす
べて同一で、５０ｍＭトリス、０．９％ ＮａＣｌ、
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０からなり、解離
液は０．１Ｎ ＮａＯＨ、０．１％ ＳＤＳからなる。 実施例１ 平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗ＴＳＨモノクローナル抗体をカルボジイミドを用
いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ、
緩衝液に、０．０５％、０．４％の濃度で懸濁させ、Ｍ
ｇラテックス試薬を作成した。The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
The compositions of the washing solutions used in the following examples were all the same: 50 mM Tris, 0.9% NaCl,
It consists of 0.1% Tween 20, pH 9.0, and the dissociation solution consists of 0.1N NaOH, 0.1% SDS. Example 1 Polystyrene latex containing magnetic material having an average particle size of 0.7 μm (hereinafter referred to as Mg latex, manufactured by Rhone Poulin).
Then, the anti-TSH monoclonal antibody was immobilized by a chemical bonding method using carbodiimide, and then treated with bovine serum albumin (BSA) to stabilize the particles,
Suspend in a buffer solution at concentrations of 0.05% and 0.4%, and
g Latex reagent was made.
【００４１】希土類キレートのＥｕ−ＴＴＡ（テノイル
トリフルオロアセトン) 化合物（イーストマンコダック
社) １×１０-4モルとＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィ
ンオキシド) （同仁化学) ２×１０-4モルをアセトン４
０ｇに溶解した後、平均粒径０．６５３μｍのポリスチ
レンラテックス（Ｓｅｒａｄｙｎ社) ３ｇを水４０ｍｌ
に懸濁させたものを混合し、エバポレーターによりアセ
トンを除去することにより、ラテックス粒子にＥｕ−キ
レート化合物をＴＯＰＯと協同抽出し、Ｅｕキレート標
識ラテックス（以下、Ｅｕラテックスとする。) を作製
した。Eu-TTA (thenoyltrifluoroacetone) compound (Eastman Kodak Company) (1 × 10 -4 mol) and TOPO (trioctylphosphine oxide) (Dojindo) (2 × 10 -4 mol) as a rare earth chelate were added to acetone (4).
After being dissolved in 0 g, 3 g of polystyrene latex having an average particle size of 0.653 μm (Seradyn) was added to 40 ml of water.
The Eu-chelate compound was co-extracted with TOPO into latex particles by removing the acetone by an evaporator to prepare an Eu chelate-labeled latex (hereinafter referred to as Eu latex).
【００４２】ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様
に化学結合法で、Ｍｇラテックスに固定化したものとは
別のエピトープを認識する抗ＴＳＨモノクローナル抗体
を固定化し、ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化
させ、緩衝液に、０．００３％の濃度で懸濁させ、Ｅｕ
ラテックス試薬を作成した。ヒトＴＳＨ標準液（Ｚｙｍ
ｅｄ社）を正常ウサギ血清含有緩衝液で希釈して、０、
０．１、０．３、１、３ＩＵ／Ｌの標準液を作成した。As in the case of Mg latex, Eu latex was also chemically bound to an anti-TSH monoclonal antibody that recognizes an epitope different from that immobilized on Mg latex, and the particles were stabilized by treating with BSA. And suspend in a buffer solution at a concentration of 0.003%, and
A latex reagent was created. Human TSH standard solution (Zym
ed) was diluted with a normal rabbit serum-containing buffer to give 0,
Standard solutions of 0.1, 0.3, 1, 3 IU / L were prepared.
【００４３】標準液４０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液
２５０μＬ、上記２種の濃度のＭｇラテックス試薬４０
μＬを加えた後撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次
に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液
から分離し、上清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記
Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間
免疫反応を行わせた。Standard solution 40 μL, BSA-containing Tris buffer solution 250 μL, Mg latex reagent 40 having the above two concentrations
After adding μL, the mixture was stirred, and an immunoreaction was performed for 5 minutes. Next, using a magnet, the Mg latex in the reaction cell was separated from the reaction solution, and after removing the supernatant, 250 μL of the buffer solution and 40 μl of the Eu latex reagent were added and stirred to carry out an immune reaction for 10 minutes. .
【００４４】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。上清
を除去し、洗浄液を加えて撹拌する。この分離、洗浄工
程を３回繰り返した後、Ｍｇラテックスを磁石で分離
し、上清を除去し、最終分散液として洗浄液３００μＬ
を加え撹拌した後、懸濁液の蛍光強度を測定する場合
（分散系）と、最終分散液に解離液を３００μＬ加えて
撹拌した後、磁石を用いて反応セル壁にＭｇラテックス
を分離した後、遊離したＥｕラテックスの蛍光強度を測
定する場合（解離系）の２とおりについて比較した。The Mg latex in the reaction cell is separated from the reaction solution by using a magnet, the remaining reaction solution is removed, 300 μL of the washing solution is added, stirred and immediately separated by the magnet. Remove the supernatant, add the wash solution and stir. After repeating this separation and washing process three times, the Mg latex was separated with a magnet, the supernatant was removed, and 300 μL of the washing liquid was used as the final dispersion liquid.
When the fluorescence intensity of the suspension is measured (dispersion system) after adding and stirring, and after adding 300 μL of the dissociation solution to the final dispersion and stirring, after separating the Mg latex on the reaction cell wall using a magnet , And the case of measuring the fluorescence intensity of the released Eu latex (dissociation system) was compared.
【００４５】最終サンプル中のＥｕラテックスの量は、
３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を計測す
ることにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと光電子
増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間分解蛍
光測定装置を用いて測定した結果を図１に示した。図
中、分散系でＭｇラテックス濃度が０．０５％を□で、
解離系でＭｇラテックス濃度が０．０５％を◆で、分散
系でＭｇラテックス濃度が０．４％を■で、解離系でＭ
ｇラテックス濃度が０．４％を◇で表す。The amount of Eu latex in the final sample is
It was measured by measuring the fluorescence at 615 nm with respect to the excitation light at 340 nm. FIG. 1 shows the result of measurement using a time-resolved fluorescence measuring device self-made by an Xe flash lamp and a photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics KK). In the figure, □ indicates that the Mg latex concentration is 0.05% in the dispersion system,
In the dissociation system, the Mg latex concentration is 0.05% ◆, in the dispersion system, the Mg latex concentration is 0.4%, and in the dissociation system M
g indicates that the latex concentration is 0.4%.
【００４６】Ｍｇラテックス濃度が０．０５％の場合
は、分散系でも解離系でも大差ない結果が得られたが、
Ｍｇラテックス濃度が０．４％の場合、分散系では、残
存したＭｇラテックスの光散乱等の影響を受けて蛍光強
度は非常に小さい値になっているが、解離液を用いた系
ではＭｇラテックスの影響を受けないので良好な蛍光強
度が計測された。 実施例２ 平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、遺伝子組換え法により産生したＢ型肝炎ウイルスコ
ア抗原（ＨＢｃＡｇ）（化学及血清療法研究所）をカル
ボジイミドを用いて、化学結合方により固定化した後、
ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液
に、０．０５％の濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬
を作成した。When the Mg latex concentration was 0.05%, no significant difference was obtained between the dispersion system and the dissociation system.
When the concentration of Mg latex is 0.4%, in the dispersion system, the fluorescence intensity is extremely small due to the influence of light scattering of the remaining Mg latex, but in the system using the dissociation solution, the Mg latex is Good fluorescence intensity was measured because it was not affected by. Example 2 Magnetic substance-containing polystyrene latex having an average particle size of 0.7 μm (hereinafter referred to as Mg latex, manufactured by Rhone Poulenc).
After immobilizing the hepatitis B virus core antigen (HBcAg) (Chemical and Serum Therapy Research Institute) produced by the gene recombination method by carbodiimide by a chemical bonding method,
The particles were stabilized by treatment with BSA and suspended in a buffer solution at a concentration of 0.05% to prepare a Mg latex reagent.
【００４７】実施例１で作成したＥｕラテックスに抗Ｈ
ＢｃＡｇモノクローナル抗体をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．００３％
の濃度で懸濁させ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｒ
ＩＡ法で抗ＨＢｃＡｇ抗体を測定済の、陽性検体２検
体、陰性検体１検体を用いて特異性を調べた。Anti-H was added to the Eu latex prepared in Example 1.
The BcAg monoclonal antibody was immobilized by carbodiimide by the chemical bonding method and then treated with BSA to stabilize the particles, and the amount of 0.003% was added to the buffer solution.
The Eu latex reagent was prepared by suspending at a concentration of. R
The specificity was examined using 2 samples of the positive sample and 1 sample of the negative sample for which the anti-HBcAg antibody had been measured by the IA method.
【００４８】検体１０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液２
５０μＬ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μＬを加えた後
撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を用い
て反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、上
清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記Ｅｕラテックス
試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間免疫反応を行わ
せた。Sample 10 μL, BSA-containing Tris buffer 2
After adding 50 μL and 40 μL of the above-mentioned Mg latex reagent, the mixture was stirred and immunoreacted for 5 minutes. Next, using a magnet, the Mg latex in the reaction cell was separated from the reaction solution, and after removing the supernatant, 250 μL of the buffer solution and 40 μl of the Eu latex reagent were added and stirred to carry out an immune reaction for 10 minutes. .
【００４９】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。この
分離、洗浄工程を２回繰り返した後、Ｍｇラテックスを
磁石で分離し、上清を除去し、最終分散液として０．１
％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯＨ３００μＬを加え、撹
拌して免疫反応によりＭｇラテックスと結合しているＥ
ｕラテックスを解離させた後、磁石でＭｇラテックスを
分離した上清中のＥｕラテックスの蛍光強度を測定し
た。The Mg latex in the reaction cell is separated from the reaction solution by using a magnet, the remaining reaction solution is removed, 300 μL of the washing solution is added, stirred and immediately separated by the magnet. After repeating this separation and washing step twice, the Mg latex was separated with a magnet, the supernatant was removed, and the final dispersion liquid was added to 0.1
Add 300 μL of 0.1N NaOH containing 10% SDS, stir, and bind with Mg latex by immunoreaction E
After dissociating the u latex, the fluorescence intensity of the Eu latex in the supernatant obtained by separating the Mg latex with a magnet was measured.
【００５０】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を表１に示し
た。阻害法であるため、陰性検体では高い蛍光強度、陽
性検体では低い蛍光強度が観測された。The amount of Eu latex contained in the supernatant sample was measured by measuring the fluorescence at 615 nm with respect to the excitation light at 340 nm. Table 1 shows the results of measurement using a time-resolved fluorescence measuring device self-made by an Xe flash lamp and a photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics KK). Because of the inhibition method, a high fluorescence intensity was observed in the negative sample and a low fluorescence intensity was observed in the positive sample.
【００５１】[0051]
【表１】 [Table 1]
【００５２】実施例３ 平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗Ｔ３モノクローナル抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．０５％の
濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬を作成した。Example 3 Magnetic substance-containing polystyrene latex having an average particle diameter of 0.7 μm (hereinafter referred to as Mg latex, manufactured by Rhone Poulenc).
, Anti-T3 monoclonal antibody (Scantibody
es Laboratory) was immobilized by a chemical bonding method using carbodiimide, and then the particles were stabilized by treating with BSA and suspended in a buffer solution at a concentration of 0.05% to prepare a Mg latex reagent. did.
【００５３】実施例１で作成したＥｕラテックスにＴ３
（Ｓｉｇｍａ）をカルボジイミドを用いて、化学結合法
により固定化した後、ＢＳＡで処理することにより粒子
を安定化させ、緩衝液に、０．００３％の濃度で懸濁さ
せ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｔ３を緩衝液に溶
解した０、１．５６、６．２５、２５、１２５ｎｇ／ｍ
ｌの標準液を用いて、反応性を調べた。T3 was added to the Eu latex prepared in Example 1.
(Sigma) was immobilized by a chemical bonding method using carbodiimide, and then the particles were stabilized by treating with BSA and suspended in a buffer solution at a concentration of 0.003% to prepare an Eu latex reagent. did. T3 dissolved in buffer 0, 1.56, 6.25, 25, 125 ng / m
The reactivity was investigated using 1 standard solution.
【００５４】検体４０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液２
５０μＬ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μＬを加えた後
撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を用い
て反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、上
清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記Ｅｕラテックス
試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間免疫反応を行わ
せた。40 μL of sample, Tris buffer solution 2 containing BSA
After adding 50 μL and 40 μL of the above-mentioned Mg latex reagent, the mixture was stirred and immunoreacted for 5 minutes. Next, using a magnet, the Mg latex in the reaction cell was separated from the reaction solution, and after removing the supernatant, 250 μL of the buffer solution and 40 μl of the Eu latex reagent were added and stirred to carry out an immune reaction for 10 minutes. .
【００５５】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。この
分離、洗浄工程を２回繰り返した後、Ｍｇラテックスを
磁石で分離し、上清を除去し、最終分散液として０．１
％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯＨ３００μＬを加え、撹
拌して免疫反応によりＭｇラテックスと結合しているＥ
ｕラテックスを解離させた後、磁石でＭｇラテックスを
分離した上清中のＥｕラテックスの蛍光強度を測定し
た。The Mg latex in the reaction cell is separated from the reaction solution by using a magnet, the remaining reaction solution is removed, 300 μL of the washing solution is added, stirred and immediately separated by the magnet. After repeating this separation and washing step twice, the Mg latex was separated with a magnet, the supernatant was removed, and the final dispersion liquid was added to 0.1
Add 300 μL of 0.1N NaOH containing 10% SDS, stir, and bind with Mg latex by immunoreaction E
After dissociating the u latex, the fluorescence intensity of the Eu latex in the supernatant obtained by separating the Mg latex with a magnet was measured.
【００５６】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を図２に示し
た。阻害法であるため、検体中のＴ３濃度が高くなれば
なるほど、低い蛍光強度が観察された。The amount of Eu latex contained in the supernatant sample was measured by measuring the fluorescence at 615 nm with respect to the excitation light at 340 nm. FIG. 2 shows the results of measurement using a time-resolved fluorescence measuring device that was self-produced with a Xe flash lamp and a photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics KK). Since this is an inhibition method, the lower the T3 concentration in the sample, the lower the fluorescence intensity was observed.
【００５７】実施例４ 平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗Ｔ４モノクローナル抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．０５％の
濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬を作成した。Example 4 A magnetic substance-containing polystyrene latex having an average particle size of 0.7 μm (hereinafter referred to as Mg latex, manufactured by Rhone Poulenc).
In addition, anti-T4 monoclonal antibody (Scantibody
es Laboratory) was immobilized by a chemical bonding method using carbodiimide, and then the particles were stabilized by treating with BSA and suspended in a buffer solution at a concentration of 0.05% to prepare a Mg latex reagent. did.
【００５８】実施例１で作成したＥｕラテックスに抗ビ
オチン抗体（Ｓｉｇｍａ）をカルボジイミドを用いて、
化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理すること
により粒子を安定化させ、緩衝液に、０．００３％の濃
度で懸濁させ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｔ４を
ビオチン化試薬ＮＨＳ−ＬＣ−ＢｉｏｔｉｎＩＩ（Ｐｉ
ｅｒｃｅ社）を用いてビオチン標識し、トリス緩衝液で
５×１０-10ｍｏｌ／ｌに希釈して、標識抗原溶液とし
た。An anti-biotin antibody (Sigma) was added to the Eu latex prepared in Example 1 using carbodiimide.
After being immobilized by the chemical bonding method, the particles were stabilized by treating with BSA and suspended in a buffer solution at a concentration of 0.003% to prepare an Eu latex reagent. T4 is biotinylated reagent NHS-LC-BiotinII (Pi
erce) and labeled with biotin and diluted with Tris buffer to 5 × 10 −10 mol / l to prepare a labeled antigen solution.
【００５９】Ｔ４を緩衝液に溶解した０、１０、３０、
１００、３００、１０００ｎｇ／ｍｌの標準液を用い
て、反応性を調べた。検体２０μＬ、ＢＳＡ含有トリス
緩衝液２００μＬ、上記標識抗原溶液４０μＬ、上記Ｍ
ｇラテックス試薬４０μＬを加えた後撹拌し、５分間免
疫反応を行わせた。0, 10, 30, T4 dissolved in buffer
The reactivity was investigated using 100, 300 and 1000 ng / ml standard solutions. Sample 20 μL, BSA-containing Tris buffer 200 μL, labeled antigen solution 40 μL, M
After adding 40 μL of g latex reagent, the mixture was stirred and immunoreacted for 5 minutes.
【００６０】次に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテ
ックスを反応液から分離し、上清を除いた後、緩衝液２
５０μＬ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪
拌し、１０分間免疫反応を行わせた。磁石を用いて反応
セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、残りの反
応液を除去し、洗浄液を３００μＬ加え、攪拌し、直ち
に磁石で分離する。この分離、洗浄工程を２回繰り返し
た後、Ｍｇラテックスを磁石で分離し、上清を除去し、
最終分散液として０．１％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯ
Ｈ３００μＬを加え、撹拌して免疫反応によりＭｇラテ
ックスと結合しているＥｕラテックスを解離させた後、
磁石でＭｇラテックスを分離した上清中のＥｕラテック
スの蛍光強度を測定した。Next, the Mg latex in the reaction cell was separated from the reaction solution using a magnet, the supernatant was removed, and then the buffer solution 2 was added.
50 μL and 40 μl of the above Eu latex reagent were added and stirred, and an immunoreaction was carried out for 10 minutes. The Mg latex in the reaction cell is separated from the reaction solution using a magnet, the remaining reaction solution is removed, 300 μL of the washing solution is added, and the mixture is stirred and immediately separated with a magnet. After repeating this separation and washing process twice, the Mg latex is separated with a magnet and the supernatant is removed.
0.1N NaO containing 0.1% SDS as final dispersion
After adding 300 μL of H and stirring to dissociate the Eu latex bound to the Mg latex by an immune reaction,
The fluorescence intensity of Eu latex in the supernatant obtained by separating Mg latex with a magnet was measured.
【００６１】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を図３に示し
た。阻害法であるため、検体中のＴ４濃度が高くなれば
なるほど、低い蛍光強度が観察された。The amount of Eu latex contained in the supernatant sample was measured by measuring the fluorescence at 615 nm with respect to the excitation light at 340 nm. FIG. 3 shows the result of measurement using a time-resolved fluorescence measuring device that was self-made using a Xe flash lamp and a photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics KK). Since this is an inhibition method, lower fluorescence intensity was observed as the T4 concentration in the sample increased.
【００６２】[0062]
【発明の効果】本発明方法によれば、磁性粒子および標
識粒子を用いることにより、迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が
実施でき、かつ、通常のＦＩＡよりも測定感度を上昇さ
せて抗原、抗体反応を測定することができるだけでな
く、抗原抗体反応の特異的結合を解離させて遊離した標
識粒子のみを計測するため、磁性粒子の影響を受けるこ
となく、より正確な標識強度の計測が可能である。EFFECTS OF THE INVENTION According to the method of the present invention, by using magnetic particles and labeled particles, B / F separation can be carried out quickly and simply, and the measurement sensitivity can be increased more than that of ordinary FIA, and antigens and antibodies Not only the reaction can be measured, but only the labeled particles released by dissociating the specific bond of the antigen-antibody reaction are measured, so that more accurate measurement of the labeling intensity is possible without being affected by the magnetic particles. is there.
【図１】実施例１で解離液での解離を行った場合と行わ
なかった場合の反応液の蛍光強度とＴＳＨ濃度との関係
を表す図である。FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the fluorescence intensity of a reaction solution and the TSH concentration when dissociation with a dissociation solution was performed and when dissociation was not performed in Example 1.
【図２】実施例３の検体中のＴ３濃度と蛍光強度との関
係を表す図である。FIG. 2 is a diagram showing a relationship between T3 concentration in a sample and fluorescence intensity in Example 3.
【図３】実施例４の検体中のＴ４濃度と蛍光強度との関
係を表す図である。FIG. 3 is a diagram showing a relationship between T4 concentration in a sample and fluorescence intensity in Example 4.
Claims (3)
用いる抗原抗体反応の測定方法において、不溶性磁性粒
子と反応した不溶性標識粒子に抗原抗体反応による特異
的結合を解離させる解離液を加えて該不溶性標識粒子を
解離させ、解離した該不溶性標識粒子の標識強度を測定
する方法。1. A method for measuring an antigen-antibody reaction using insoluble magnetic particles and insoluble labeled particles, wherein the insoluble labeled particles that have reacted with the insoluble magnetic particles are added with a dissociation solution that dissociates a specific bond due to the antigen-antibody reaction. A method of dissociating particles and measuring the labeling intensity of the dissociated insoluble labeled particles.
酵素標識粒子または化学発光性色素標識粒子であること
を特徴とする請求項１に記載の方法。2. The insoluble labeled particles are fluorescent dye labeled particles,
The method according to claim 1, which is an enzyme-labeled particle or a chemiluminescent dye-labeled particle.
高イオン強度溶液、界面活性剤含有溶液、極性を下げる
物質を含有する緩衝液、尿素および塩酸グアニジンを含
有する緩衝液またはカオトロピックイオンを含有する緩
衝液であることを特徴とする請求項１記載の方法。3. The dissociation solution is an acidic solution, an alkaline solution,
2. A high ionic strength solution, a surfactant-containing solution, a buffer solution containing a substance that reduces the polarity, a buffer solution containing urea and guanidine hydrochloride, or a buffer solution containing chaotropic ions. Method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17835894A JPH0843391A (en) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | Measuring method for antigen antibody reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17835894A JPH0843391A (en) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | Measuring method for antigen antibody reaction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0843391A true JPH0843391A (en) | 1996-02-16 |
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ID=16047099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17835894A Pending JPH0843391A (en) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | Measuring method for antigen antibody reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
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