JPH083055A - Production of sustained release preparation - Google Patents
Production of sustained release preparationInfo
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- JPH083055A JPH083055A JP6153279A JP15327994A JPH083055A JP H083055 A JPH083055 A JP H083055A JP 6153279 A JP6153279 A JP 6153279A JP 15327994 A JP15327994 A JP 15327994A JP H083055 A JPH083055 A JP H083055A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、水溶性ポリペプチドを
生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤
に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a sustained-release preparation prepared by allowing a water-soluble polypeptide to penetrate a biodegradable matrix.
【従来の技術】蛋白質（ポリペプチドとも称する）は生
体において種々の薬理作用を示すことが知られており、
このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手
法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞、あるいはハム
スターなどの生体を用いて大量に生産させ、医薬品とし
ての応用が図られている。これらの蛋白質医薬品の例と
してはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガン
マ）、インターロイキン２、エリスロポエチン、顆粒球
コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。し
かしながら、これらの蛋白質は一般的に生体内での半減
期が短いために、頻回投与が必要であり注射に伴う患者
の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解
決するために徐放製剤を開発する種々の試みがなされて
いる。サイトカインに代表される蛋白質の投与は治療効
果を判定しながら慎重に投与する必要があるため、１週
間から２週間程度の放出期間を有する注射可能な徐放製
剤特にマイクロカプセル徐放製剤の開発が望まれてい
る。しかしながら、一般的に蛋白質は熱、有機溶媒，強
いせん断力などにより変性し、その生物活性が低下する
ことが知られている。例えば、蛋白質水溶液を６０℃で
２０分間加熱することによりその生物活性が急速に失わ
れる場合がある。また、より低い温度である５０℃でも
１時間程度加熱することによりその生物活性が低下して
しまう場合もある。同様にエタノール、ジクロルメタン
などの有機溶媒によっても蛋白質の生物活性が低下する
場合があることが知られている。2. Description of the Related Art It is known that proteins (also called polypeptides) exhibit various pharmacological actions in the living body,
Some of these have been produced in large quantities using organisms such as Escherichia coli, yeast, animal cells, or hamsters due to the development of genetic engineering and cell engineering techniques, and are being applied as pharmaceuticals. Examples of these protein drugs include interferon (alpha, beta, gamma), interleukin 2, erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and the like. However, since these proteins generally have a short half-life in vivo, frequent administration is required and the physical burden on patients due to injection cannot be ignored. Various attempts have been made to develop sustained-release preparations to solve this problem. Since it is necessary to carefully administer proteins represented by cytokines while determining their therapeutic effects, the development of injectable sustained-release preparations, particularly microcapsule sustained-release preparations, having a release period of about 1 to 2 weeks has been developed. Is desired. However, it is generally known that proteins are denatured by heat, organic solvent, strong shearing force, etc., and their biological activity is reduced. For example, heating the aqueous protein solution at 60 ° C. for 20 minutes may cause rapid loss of its biological activity. Further, even at a lower temperature of 50 ° C., the biological activity may be reduced by heating for about 1 hour. Similarly, it is known that the biological activity of a protein may be reduced by an organic solvent such as ethanol or dichloromethane.
【０００２】ＷＯ９３／０６８７２号公報には骨形成蛋
白質の長期間にわたる放出を可能にする生体内分解性ポ
リマーで作成した空隙のある粒子、骨形成蛋白質、およ
び自己血凝集塊を組み合わせた製剤の技術が開示されて
いる。本技術においては主薬である骨形成蛋白質は投与
直前に粒子に吸着させ、さらに自己血を加え凝集塊を形
成させることにより放出を制御する手法が取られてい
る。徐放期間は数週間程度である。自己血を使用するた
めに一般的に使用ではない。ジャーナル・オブ・コント
ロールド・リリース（Journal of Controlled Releas
e），２３巻，１５７頁，（１９９３年）（A. Supersax
o et al.）には、生体内分解性ポリマーを用いて空隙率
の大きいマイクロカプセルを作製した後、高分子物質を
染み込ませることにより有機溶媒と高分子物質を接触さ
せずにマイクロカプセル内に取り込む技術が記載されて
いる。具体的には使用されるポリ乳酸は疎水性であるた
め、最初に有機溶媒である５０％エタノールを用いてマ
イクロカプセルを湿らせた後に水で置換し、さらに高分
子物質の溶液で置換する操作を行っている。特開平５−
３２５５９号公報には医薬組成物の構成成分と生理学的
活性物質とを有機溶剤中に溶解するか、又は、医薬組成
物の構成成分と生理学的活性物質とを有機媒体又は水性
媒体中に均一に分散し、これを乾燥することによる医薬
組成物の製造方法が開示されている。[0003] WO 93/06872 discloses a formulation in which void-forming particles made of a biodegradable polymer enabling the long-term release of bone morphogenetic proteins, bone morphogenetic proteins, and autologous hemagglutination are combined. The technology is disclosed. In the present technology, a method of controlling the release by adsorbing the bone morphogenetic protein, which is the main drug, to the particles immediately before administration, and further adding autologous blood to form an aggregate, is adopted. The sustained release period is about several weeks. Not commonly used to use autologous blood. Journal of Controlled Releas
e), 23, 157, (1993) (A. Supersax
o et al.) prepared a microcapsule with a large porosity using a biodegradable polymer, and then impregnated the macromolecule into the microcapsule without contacting the organic solvent with the macromolecule. The technology to incorporate is described. Specifically, since the polylactic acid used is hydrophobic, an operation of first wetting the microcapsules with 50% ethanol, which is an organic solvent, then substituting with water, and then substituting with a polymer solution It is carried out. Japanese Patent Laid-Open No. 5-
No. 32559 discloses that the constituents of the pharmaceutical composition and the physiologically active substance are dissolved in an organic solvent, or the constituents of the pharmaceutical composition and the physiologically active substance are uniformly dispersed in an organic medium or an aqueous medium. A method for producing a pharmaceutical composition by dispersing and drying this is disclosed.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】上記のように蛋白質な
どの生物活性を保持しながら徐放性製剤を製造する種々
の試みがなされているものの、薬物のマトリックスへの
浸透効率。薬物の初期バーストの抑制、長期間にわたる
一定の薬物放出速度等の点で、まだ満足すべきものでは
ない。Although various attempts have been made to produce sustained-release preparations while retaining the biological activity of proteins and the like as described above, the penetration efficiency of the drug into the matrix is high. In terms of suppression of initial burst of drug, constant drug release rate over a long period of time, etc., it is not yet satisfactory.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の問題
点を解決するため鋭意研究をおこなったところ、生体内
に投与後の消失が約１〜３週間程度の生体内分解性ポリ
マーで予め微粒子状の生体内分解性マトリックスを製造
し、該生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチド
を水中で浸透させて得られる製剤を生体内に投与するこ
とにより、水溶性ポリペプチドの血液中濃度を約１〜２
週間持続させることが可能になることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果本発明を完成した。すな
わち、本発明は、（１）水溶性ポリペプチドを生体内分
解性マトリックスに水中で浸透させることを特徴とする
徐放性製剤の製造法、（２）生体内分解性マトリックス
が生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金
属塩とを混合して製造される第１項記載の徐放性製剤の
製造法、（３）脂肪族カルボン酸が脂肪族モノカルボン
酸である第２項記載の徐放性製剤の製造法、（４）金属
塩が多価金属塩である第２項記載の徐放性製剤の製造
法、（５）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリッ
クスに水中で浸透させ、ついで乾燥する第１項記載の徐
放性製剤の製造法、（６）乾燥が凍結乾燥である第５項
記載の徐放性製剤の製造法、（７）水溶性ポリペプチド
がサイトカインである第１項記載の徐放性製剤の製造
法、（８）サイトカインがインターフェロンである第７
項記載の徐放性製剤の製造法、（９）生体内分解性マト
リックスが微粒子状である第１項記載の徐放性製剤の製
造法、（１０）生体内分解性マトリックスが生体内分解
性ポリマーから製造される第１項記載の徐放性製剤の製
造法、（１１）生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエス
テルである第１０項記載の徐放性製剤の製造法、（１
２）脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸か
ら誘導される共重合体である第１１項記載の徐放性製剤
の製造法、（１３）共重合体が乳酸−グリコール酸共重
合体である第１２項記載の徐放性製剤の製造法、（１
４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに
浸透させてなる徐放性製剤、（１５）生体内分解性マト
リックスが生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カル
ボン酸金属塩とを混合して製造される第１４項記載の徐
放性製剤、および（１６）注射用である第１４項記載の
徐放性製剤に関する。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have conducted extensive studies to solve the above-mentioned problems, and found that biodegradable polymers which disappeared in vivo after administration for about 1 to 3 weeks. The concentration of the water-soluble polypeptide in blood can be obtained by preliminarily producing a biodegradable matrix in the form of fine particles, and injecting a preparation obtained by allowing the water-soluble polypeptide to penetrate into the biodegradable matrix in water. About 1-2
The present invention has been completed as a result of further research based on the finding that it can be maintained for a week. That is, the present invention provides (1) a method for producing a sustained-release preparation, which comprises permeating a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix in water, and (2) the biodegradable matrix is biodegradable. The method for producing a sustained-release preparation according to item 1, which is produced by mixing a polymer and a water-soluble metal salt of aliphatic carboxylic acid, (3) the item 2 in which the aliphatic carboxylic acid is an aliphatic monocarboxylic acid The method for producing a sustained-release preparation described in (4), the method for producing a sustained-release preparation as described in (2), wherein the metal salt is a polyvalent metal salt, and (5) a water-soluble polypeptide in a biodegradable matrix in water. The method for producing the sustained-release preparation according to item 1, which is followed by drying, and (6) the method for producing the sustained-release preparation according to item 5, wherein the drying is freeze-drying. The method for producing a sustained-release preparation according to item 1, which is a cytokine, (8) site The Inn is an interferon 7
The method for producing a sustained release preparation according to item 1, (9) The method for producing a sustained release preparation according to item 1, wherein the biodegradable matrix is in the form of fine particles, and (10) the biodegradable matrix is biodegradable. (11) A method for producing a sustained-release preparation, which is produced from a polymer, (11) A method for producing a sustained-release preparation, as described in (10), wherein the biodegradable polymer is an aliphatic polyester.
2) The method for producing a sustained release preparation according to item 11, wherein the aliphatic polyester is a copolymer derived from α-hydroxycarboxylic acid, and (13) The copolymer is a lactic acid-glycolic acid copolymer. Item 12. A method for producing a sustained-release preparation according to item 12,
4) A sustained-release preparation in which a water-soluble polypeptide is impregnated into a biodegradable matrix, (15) The biodegradable matrix is prepared by mixing a biodegradable polymer and a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt. The sustained-release preparation according to Item 14, which is manufactured by the method, and (16) The sustained-release preparation according to Item 14, which is for injection.
【０００５】本発明における水溶性ポリペプチドは、好
ましくは分子量約２００〜約５０,０００の水溶性ポリ
ペプチドである。水溶性ポリペプチドは、さらに好まし
くは分子量約５,０００〜約４０,０００の水溶性ポリペ
プチドである。水溶性ポリペプチドは、ホルモン作用を
有し、内分泌されるものであればよい。このような水溶
性ポリペプチドとしては、例えばサイトカイン，造血因
子，各種増殖因子，酵素などが挙げられる。サイトカイ
ンとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙
げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェ
ロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン
（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカイ
ンとしては、例えばインターロイキン（ＩＬ−１），腫
瘍壊死因子などが挙げられる。造血因子としては、例え
ばエリスロポエチン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ
ＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ），トロンボポエチン，血小板増殖刺激因子，メガカ
リオサイトポテンシエーターなどが挙げられる。各種増
殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細
胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー
（例、ＦＧＦ−９など）〔モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biolog
y），１３巻，７号，４２５１頁（１９９３年）〕，神
経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリ
ー，インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−
２など），骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこ
れらのファミリーなどが挙げられる。酵素としては、例
えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ），テ
ィシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）
などが挙げられる。また、上記以外にも、例えば成長ホ
ルモン，インスリン，ナトリウム利尿ペプチド，ガスト
リン，プロラクチン，副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴ
Ｈ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），ヒト絨毛ゴ
ナドトロピン（ＨＣＧ），モチリン，カリクレイン，膵
臓再生に関与するタンパク質であるRegタンパク質〔特
公平１−１３２３８８号公報、フェブス・レターズ（FE
BS Letters），２７２巻，８５頁（１９９０年）〕など
も本発明の水溶性ポリペプチドとして用いられる。水溶
性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組み換えに
より製造されたものでもよい。水溶性ポリペプチドは、
上記した水溶性ポリペプチドに限定されるものではな
い。すなわち、水溶性ポリペプチドは、糖鎖を有してい
ても有していなくてもよく、構造の異なる糖鎖を有して
いてもよい。さらに、水溶性ポリペプチドは、上記した
水溶性ポリペプチドの突然変異物質、誘導体（作動性、
拮抗性）、またはフラグメントであってもよい。The water-soluble polypeptide in the present invention is preferably a water-soluble polypeptide having a molecular weight of about 200 to about 50,000. The water-soluble polypeptide is more preferably a water-soluble polypeptide having a molecular weight of about 5,000 to about 40,000. The water-soluble polypeptide may have a hormonal action and be endocrine. Examples of such water-soluble polypeptides include cytokines, hematopoietic factors, various growth factors, enzymes and the like. Examples of cytokines include lymphokines and monokines. Examples of lymphokines include interferons (alpha, beta, gamma), interleukins (IL-2 to IL-12), and the like. Examples of monokine include interleukin (IL-1) and tumor necrosis factor. Examples of hematopoietic factors include erythropoietin and granulocyte colony stimulating factor (GC).
SF), macrophage colony stimulating factor (M-CS
F), thrombopoietin, platelet growth stimulating factor, megakaryocyte potentiator and the like. Examples of various growth factors include basic or acidic fibroblast growth factor (FGF) or their families (eg, FGF-9, etc.) [Molecular and Cellular Biolog.
y), 13, 7, 4251 (1993)], nerve cell growth factor (NGF) or a family thereof, insulin-like growth factor (eg, IGF-1, IGF-).
2, etc.), a factor involved in bone growth (BMP), or a family of these. Examples of the enzyme include superoxide dismutase (SOD), tissue plasminogen activator (TPA)
And the like. In addition to the above, for example, growth hormone, insulin, natriuretic peptide, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACT)
H), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin (HCG), motilin, kallikrein, and Reg protein which is a protein involved in pancreatic regeneration [Japanese Patent Publication 1- No. 132388, Febbs Letters (FE
BS Letters), 272, 85 (1990)] and the like are also used as the water-soluble polypeptide of the present invention. The water-soluble polypeptide may be naturally-occurring or produced by gene recombination. The water-soluble polypeptide is
It is not limited to the above water-soluble polypeptides. That is, the water-soluble polypeptide may or may not have a sugar chain, and may have a sugar chain having a different structure. Further, the water-soluble polypeptide is a mutant substance or derivative (agonist, agonist,
Antagonistic) or fragments.
【０００６】水溶性ポリペプチドは、好ましくはサイト
カインなどである。該サイトカインとしては、例えばリ
ンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカイ
ンとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベー
タ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１
２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばイ
ンターロイキン（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げ
られる。水溶性ポリペプチドは、さらに好ましくはリン
ホカインである。該リンホカインとしては、例えばイン
ターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インター
ロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。
水溶性ポリペプチドは、特に好ましくはインターフェロ
ン（アルファ，ベータ，ガンマ）などである。The water-soluble polypeptide is preferably a cytokine or the like. Examples of the cytokine include lymphokines and monokines. Examples of lymphokines include interferon (alpha, beta, gamma) and interleukin (IL-2 to IL-1).
2) and the like. Examples of monokine include interleukin (IL-1) and tumor necrosis factor. The water-soluble polypeptide is more preferably lymphokine. Examples of the lymphokines include interferons (alpha, beta, gamma), interleukins (IL-2 to IL-12) and the like.
The water-soluble polypeptide is particularly preferably interferon (alpha, beta, gamma) and the like.
【０００７】本発明において、生体内分解性マトリック
スは微粒子状であることが好ましい。生体内分解性マト
リックスは、通常の皮下あるいは筋肉内注射に使用され
る注射針を通過するものであればよく、該生体内分解性
マトリックスの粒子径は、例えば平均径として約０．１
〜３００μm、好ましくは約１〜１５０μm、特に好まし
くは約２〜１００μmである。In the present invention, the biodegradable matrix is preferably in the form of fine particles. The biodegradable matrix may be one that can be passed through an injection needle used for ordinary subcutaneous or intramuscular injection, and the particle size of the biodegradable matrix is, for example, about 0.1 as an average diameter.
˜300 μm, preferably about 1-150 μm, particularly preferably about 2-100 μm.
【０００８】生体内分解性マトリックスは、例えば生体
内分解性ポリマーから自体公知の方法によって製造され
る。このような方法としては、例えば以下に示す水中乾
燥法，相分離法，噴霧乾燥法あるいはこれらに準じる方
法などが挙げられる。生体内分解性マトリックスは、好
ましくは生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボ
ン酸金属塩とを混合することにより製造される。 （イ）水中乾燥法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法） 内水相として、例えば水あるいは水溶性成分を含有する
水溶液を使用する。該水溶性成分としては、例えば無機
塩類（例、食塩，燐酸水素ナトリウム，燐酸水素２ナト
リウムなど）、糖類（例、マンニトール，ブドウ糖，イ
ヌリンなど）、有機塩類（例、炭酸ナトリウム，炭酸マ
グネシウム，酢酸アンモニウムなど）、アミノ酸（例、
グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）などが挙げら
れる。水溶性成分の水溶液中の濃度は、例えば約０.１
〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０.５〜５％（ｗ／
ｖ）である。特に水溶性成分が食塩である場合には、例
えば０.９％（ｗ／ｖ）の生理食塩水を使用することが
好ましい。また、内水相に上記水溶性成分の代わりに炭
酸カルシウムなどを分散させてもよい。好ましくは、水
溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含有する水溶液が内水相
として用いられる。該金属塩の水溶液中の濃度は各金属
塩の溶解度によって異なるが、例えば約１０〜９０％
（ｗ／ｖ）、好ましくは約２０〜８０％（ｗ／ｖ）であ
る。上記した水あるいは水溶性成分を含有する水溶液
を、α−ヒドロキシカルボン酸から合成される重合体、
共重合体などの生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中
に乳化，分散し、Ｗ／Ｏ型乳化物（エマルション）を作
る。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は生
体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の種類によって
異なるが、一般的には約０.０１〜９０％（ｗ／ｗ）か
ら選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの
濃度は、さらに好ましくは約０.１〜８０％（ｗ／ｗ）
である。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度
は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ／ｗ）である。水
あるいは水溶性成分を含有する水溶液と生体内分解性ポ
リマー有機溶媒溶液との比率は１：１,０００（ｖ／
ｖ）〜１：１（ｖ／ｖ）、好ましくは１：１００（ｖ／
ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１：５０（ｖ
／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）である。乳化操作は、公知の
分散方法が用いられる。該方法は、例えばタービン型攪
拌機、ホモジナイザーなどを用いて行われる。ついで、
このようにして調製されたＷ／Ｏ型エマルションをさら
に水相中（外水相）に加えて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション
を形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性マト
リックスを調製する。油相溶媒の蒸発は、例えばタービ
ン型攪拌機などを用いて攪拌することにより行う。この
際の水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,００
０倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,００
０倍から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００
倍から選ばれる。The biodegradable matrix is produced, for example, from a biodegradable polymer by a method known per se. Examples of such a method include an in-water drying method, a phase separation method, a spray drying method or a method similar thereto, which will be described below. The biodegradable matrix is preferably produced by mixing a biodegradable polymer and a water-soluble metal salt of an aliphatic carboxylic acid. (A) In-water drying method (W / O / W method) As the inner aqueous phase, for example, water or an aqueous solution containing a water-soluble component is used. Examples of the water-soluble component include inorganic salts (eg, common salt, sodium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, etc.), sugars (eg, mannitol, glucose, inulin, etc.), organic salts (eg, sodium carbonate, magnesium carbonate, acetic acid). Ammonium, etc.), amino acids (eg,
Glycine, arginine, histidine, etc.) and the like. The concentration of the water-soluble component in the aqueous solution is, for example, about 0.1.
-10% (w / v), preferably about 0.5-5% (w /
v). Particularly when the water-soluble component is salt, it is preferable to use, for example, 0.9% (w / v) physiological saline. Further, calcium carbonate or the like may be dispersed in the inner aqueous phase instead of the water-soluble component. Preferably, an aqueous solution containing a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt is used as the inner aqueous phase. The concentration of the metal salt in the aqueous solution varies depending on the solubility of each metal salt, but is, for example, about 10 to 90%.
(W / v), preferably about 20-80% (w / v). An aqueous solution containing the above water or a water-soluble component, a polymer synthesized from α-hydroxycarboxylic acid,
A biodegradable polymer such as a copolymer is emulsified and dispersed in an organic solvent solution to prepare a W / O type emulsion. The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution varies depending on the molecular weight of the biodegradable polymer and the type of organic solvent, but is generally selected from about 0.01 to 90% (w / w). The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution is more preferably about 0.1 to 80% (w / w)
Is. The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution is particularly preferably about 1 to 70% (w / w). The ratio of water or an aqueous solution containing a water-soluble component to a biodegradable polymer organic solvent solution is 1: 1,000 (v /
v) to 1: 1 (v / v), preferably 1: 100 (v /
v) to 1: 5 (v / v), particularly preferably 1:50 (v
/ V) to 1: 5 (v / v). A known dispersion method is used for the emulsification operation. The method is performed using, for example, a turbine stirrer, a homogenizer, or the like. Then,
The W / O emulsion thus prepared is further added to the aqueous phase (outer aqueous phase) to form a W / O / W emulsion, and then the oil phase solvent is evaporated to form a biodegradable matrix. Prepare. Evaporation of the oil phase solvent is performed by stirring using, for example, a turbine type stirrer. The volume of the water phase at this time is generally about 1 to 10,000 of the volume of the oil phase.
It is selected from 0 times. More preferably, about 2 to 5,000
It is selected from 0 times. Particularly preferably, it is about 5 to 2,000.
Selected from double.
【０００９】上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該
乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成で
きるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばア
ニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキ
シエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レ
シチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。こ
れらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用して
もよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／
ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約
０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に
好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いら
れる。前記の内水相に水溶性成分の代わりに炭酸カルシ
ウムを分散させた場合には、外水相に稀塩酸を添加する
ことにより炭酸カルシウムは溶解する。また、外水相中
に、内水相で用いた水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同
一または異なった水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を加え
てもよい。この際、外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸
金属塩の濃度が約０.０１〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに
好ましくは約０.１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように水
溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加することが好まし
い。外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度を
変えることにより、生体内分解性マトリックスからの水
溶性脂肪族カルボン酸金属塩の溶出をコントロールする
こともできる。このようにして得られた生体内分解性マ
トリックスを遠心分離あるいは濾過して分取した後、生
体内分解性マトリックスの表面に付着している乳化剤な
どを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分
散して凍結乾燥する。得られた生体内分解性マトリック
スの表面は、平滑ではなく、大小様々な穴が存在し、生
体内分解性マトリックス内部にまでその穴が通じている
ものもある。生体内分解性マトリックス中のこれらの穴
の容積の占める割合（空隙率）は、例えば水銀圧入法あ
るいはＢＥＴ法により定量可能である。空隙率は、内水
相中の成分、その濃度、内水相溶液と生体内分解性ポリ
マー有機溶媒溶液との比率、外水相体積と油相体積の比
率、外水相の温度などで異なり、また、生体内分解性マ
トリックス内部での穴の構造は異なる。生体内分解性マ
トリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量
は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／
ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、
特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。な
お、生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボ
ン酸金属塩の含量は、金属として原子吸光法等の方法に
より金属として定量される。An emulsifier may be added to the outer water phase. The emulsifier may be any one that can form a generally stable O / W emulsion. Specific examples thereof include anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxyethylene castor oil derivatives, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethylcellulose, lecithin, gelatin, hyaluronic acid and the like. One of these may be used, or some of them may be used in combination. The concentration at the time of use is about 0.001 to 20% (w /
It can be appropriately selected from the range of w). More preferably, it is used in the range of about 0.01 to 10% (w / w). It is particularly preferably used in the range of about 0.05-5% (w / w). When calcium carbonate is dispersed in the inner aqueous phase instead of the water-soluble component, calcium carbonate is dissolved by adding dilute hydrochloric acid to the outer aqueous phase. Further, a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt which is the same as or different from the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt used in the inner aqueous phase may be added to the outer water phase. At this time, the concentration of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the outer aqueous phase is about 0.01 to 20% (w / w), more preferably about 0.1 to 10% (w / w). It is preferable to add a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt to. The elution of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt from the biodegradable matrix can be controlled by changing the concentration of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the external water phase. The biodegradable matrix thus obtained is separated by centrifugation or filtration, and then the emulsifier and the like adhering to the surface of the biodegradable matrix is repeatedly washed several times with distilled water and distilled again. Disperse in water and freeze-dry. The surface of the obtained biodegradable matrix is not smooth, and there are holes of various sizes, and some of the holes extend to the inside of the biodegradable matrix. The proportion of the volume of these holes (porosity) in the biodegradable matrix can be quantified by, for example, the mercury intrusion method or the BET method. The porosity varies depending on the components in the inner water phase, their concentrations, the ratio of the inner water phase solution to the biodegradable polymer organic solvent solution, the ratio of the outer water phase volume to the oil phase volume, the outer water phase temperature, etc. Moreover, the structure of the holes inside the biodegradable matrix is different. The content of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the biodegradable matrix is preferably about 0.01 to 10% (w / w) as metal.
w), more preferably about 0.05-7% (w / w),
Particularly preferred is about 0.1 to 5% (w / w). The content of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the biodegradable matrix is quantified as a metal by a method such as an atomic absorption method.
【００１０】（ロ）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法） 本発明において、生体内分解性マトリックスを製造する
方法として内水相を用いない方法がある。該方法におい
ては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製
する。この際、有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマー
の濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の
種類などによって異なるが、一般的には約０.０１〜９
０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内
分解性ポリマーの濃度は、さらに好ましくは約０.１〜
８０％（ｗ／ｗ）である。有機溶媒溶液中の生体内分解
性ポリマーの濃度は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ
／ｗ）である。生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中
に炭酸カルシウムを添加，分散させてもよい。この際、
炭酸カルシウムの添加量は、炭酸カルシウム：生体内分
解性ポリマーの重量比が約５：１〜約１：１００，好ま
しくは約２：１〜約１：１０となるようにする。好まし
くは、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に水溶性
脂肪族カルボン酸金属塩を添加、分散させる。この際、
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の添加量は、水溶性脂肪
族カルボン酸金属塩：生体内分解性ポリマーの重量比が
約５：１〜約１：１００，好ましくは約２：１〜約１：
５０，さらに好ましくは約１：１〜約１：１０となるよ
うにする。ついで、このようにして調製された有機溶媒
溶液をさらに水相中に加え、タービン型攪拌機などを用
いてＯ／Ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸
発させ生体内分解性マトリックスを調製する。この際の
水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,０００倍
から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,０００倍
から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００倍か
ら選ばれる。(B) In-water drying method (O / W method) In the present invention, as a method for producing a biodegradable matrix, there is a method which does not use an internal water phase. In the method, first, a solution of a biodegradable polymer in an organic solvent is prepared. At this time, the concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution varies depending on the molecular weight of the biodegradable polymer, the type of the organic solvent, etc., but is generally about 0.01-9.
It is selected from 0% (w / w). The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution is more preferably about 0.1-
80% (w / w). The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution is particularly preferably about 1 to 70% (w
/ W). Calcium carbonate may be added and dispersed in the organic solvent solution of the biodegradable polymer. On this occasion,
The amount of calcium carbonate added is such that the weight ratio of calcium carbonate: biodegradable polymer is about 5: 1 to about 1: 100, preferably about 2: 1 to about 1:10. Preferably, the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt is added and dispersed in the organic solvent solution of the biodegradable polymer. On this occasion,
The amount of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt added is such that the weight ratio of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt: biodegradable polymer is about 5: 1 to about 1: 100, preferably about 2: 1 to about 1. :
50, more preferably about 1: 1 to about 1:10. Then, the organic solvent solution thus prepared is further added to the aqueous phase, an O / W emulsion is formed using a turbine stirrer, etc., and then the oil phase solvent is evaporated to prepare a biodegradable matrix. To do. At this time, the volume of the aqueous phase is generally selected from about 1 to 10,000 times the volume of the oil phase. More preferably, it is selected from about 2-5,000 times. Particularly preferably, it is selected from about 5-2,000 times.
【００１１】上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該
乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成で
きるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばア
ニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキ
シエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レ
シチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。こ
れらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用して
もよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／
ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約
０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に
好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いら
れる。また、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に
炭酸カルシウムを添加，分散させる場合には、外水相中
に希塩酸を添加する。また、外水相中に、生体内分解性
ポリマーの有機溶媒溶液中に添加、分散した水溶性脂肪
族カルボン酸金属塩と同一または異なった水溶性脂肪族
カルボン酸金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度が約０.０１〜２
０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜１０％
（ｗ／ｗ）となるように水溶性脂肪族カルボン酸金属塩
を添加することが好ましい。外水相中の水溶性脂肪族カ
ルボン酸金属塩の濃度を変えることにより、生体内分解
性マトリックスからの水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の
溶出をコントロールすることもできる。さらに、生体内
分解性マトリックスを製造する方法として、生体内分解
性ポリマーの有機溶媒溶液を、水溶性脂肪族カルボン酸
金属塩を含有する外水相に加え、前記と同様にしてＯ／
Ｗエマルションを形成させる方法が挙げられる。このよ
うにして得られた生体内分解性マトリックスを遠心分離
あるいは濾過して分取した後、生体内分解性マトリック
スの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り
返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸
金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１
０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％
（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）
である。An emulsifier may be added to the outer water phase. The emulsifier may be any one that can form a generally stable O / W emulsion. Specific examples thereof include anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxyethylene castor oil derivatives, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethylcellulose, lecithin, gelatin, hyaluronic acid and the like. One of these may be used, or some of them may be used in combination. The concentration at the time of use is about 0.001 to 20% (w /
It can be appropriately selected from the range of w). More preferably, it is used in the range of about 0.01 to 10% (w / w). It is particularly preferably used in the range of about 0.05-5% (w / w). When calcium carbonate is added and dispersed in the organic solvent solution of the biodegradable polymer, dilute hydrochloric acid is added to the outer aqueous phase. Further, a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt which is the same as or different from the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt added and dispersed in the organic solvent solution of the biodegradable polymer may be added to the outer aqueous phase. At this time, the concentration of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the external water phase is about 0.01-2.
0% (w / w), more preferably about 0.1-10%
It is preferable to add a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt so as to be (w / w). The elution of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt from the biodegradable matrix can be controlled by changing the concentration of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the external water phase. Further, as a method for producing a biodegradable matrix, a solution of a biodegradable polymer in an organic solvent is added to an outer aqueous phase containing a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, and O /
The method of forming W emulsion is mentioned. The biodegradable matrix thus obtained is separated by centrifugation or filtration, and then the emulsifier and the like adhering to the surface of the biodegradable matrix is repeatedly washed several times with distilled water and distilled again. Disperse in water and freeze-dry.
The content of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the biodegradable matrix is preferably about 0.01 to 1 as a metal.
0% (w / w), more preferably about 0.05-7%
(W / w), particularly preferably about 0.1-5% (w / w)
Is.
【００１２】（ハ）相分離法（コアセルベーション法） 相分離法により生体内分解性マトリックスを製造する場
合には、上記のＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解
性ポリマーの有機溶媒溶液にコアセルベーション剤を攪
拌下徐々に加え、生体内分解性ポリマーを析出、固化さ
せる。該コアセルベーション剤はｗ／ｏエマルションあ
るいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液の体積の約
０.０１〜１,０００倍の体積量が加えられる。さらに好
ましくは、約０.０５〜５００倍の体積量である。特に
好ましくは、約０.１〜２００倍の体積量である。コア
セルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーの溶
媒に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合
物で、ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的
には、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン
油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘ
キサン、ｎ−ヘプタンなどが挙げられる。これらは２種
以上混合して用いてもよい。このようにして得られた生
体内分解性マトリックスを濾過して分取した後、ヘプタ
ン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除
去する。さらに、水中乾燥法と同様の方法で洗浄を行
い、ついで生体内分解性マトリックスを凍結乾燥する。
溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うこ
とができる。このような方法としては、例えばプロペラ
型攪拌機あるいはマグネチックスターラーなどで攪拌し
ながら常圧もしくは徐々に減圧して溶媒を蒸発させる方
法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調
節しながら溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。生
体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金
属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０
％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ
／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）であ
る。(C) Phase Separation Method (Coacervation Method) When the biodegradable matrix is produced by the phase separation method, the W / O emulsion or the solution of the biodegradable polymer in an organic solvent is used as a core cell. The basation agent is gradually added with stirring to precipitate and solidify the biodegradable polymer. The coacervation agent is added in a volume of about 0.01 to 1,000 times the volume of the w / o emulsion or the solution of the biodegradable polymer in the organic solvent. More preferably, the volume is about 0.05 to 500 times. Particularly preferably, the volume is about 0.1 to 200 times. The coacervation agent may be a polymer-based, mineral oil-based, or vegetable oil-based compound that is miscible with the solvent of the biodegradable polymer and does not dissolve the polymer. Specific examples thereof include silicone oil, sesame oil, soybean oil, corn oil, cottonseed oil, coconut oil, linseed oil, mineral oil, n-hexane, n-heptane and the like. You may use these in mixture of 2 or more types. The biodegradable matrix thus obtained is collected by filtration and then repeatedly washed with heptane or the like to remove the coacervation agent. Further, washing is performed by the same method as the in-water drying method, and then the biodegradable matrix is freeze-dried.
The solvent can be removed by a method known per se. As such a method, for example, a method of evaporating the solvent by stirring with a propeller stirrer or a magnetic stirrer at atmospheric pressure or gradually reducing the pressure, or by evaporating the solvent while adjusting the degree of vacuum using a rotary evaporator or the like Method etc. are mentioned. The content of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt in the biodegradable matrix is preferably about 0.01 to 10 as a metal.
% (W / w), more preferably about 0.05-5% (w
/ W), particularly preferably about 0.1-5% (w / w).
【００１３】水中乾燥法およびコアセルベーション法で
の製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を
加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニト
ール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーン
スターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金
属塩などの水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラー
ゲン等等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリ
ウム等の無機塩類などが挙げられる。In the production by the in-water drying method and the coacervation method, an anti-agglomeration agent may be added to prevent the particles from aggregating. Examples of the aggregation preventing agent include mannitol, lactose, glucose, starches (eg, corn starch, etc.), water-soluble polysaccharides such as hyaluronic acid or alkali metal salts thereof, proteins such as glycine, fibrin and collagen, sodium chloride, Examples thereof include inorganic salts such as sodium hydrogen phosphate.
【００１４】（ニ）噴霧乾燥法 噴霧乾燥法によって生体内分解性マトリックスを製造す
る場合には、水あるいは水溶性成分を含む水溶液と生体
内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは
生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、ノズルを用い
てスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧
し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発さ
せ、微粒状の生体内分解性カプセルを調製する。該ノズ
ルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回
転ディスク型等がある。この際、所望によって水あるい
は水溶性成分を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを
含むＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマー
の有機溶媒溶液と同時に、生体内分解性マトリックスの
凝集防止を目的として前述の凝集防止剤の水溶液を別ノ
ズルより噴霧することも有効である。生体内分解性マト
リックスは、好ましくは、水溶性脂肪族カルボン酸金属
塩を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏ
エマルションあるいは水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を
含む生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を用いて製造
される。このようにして得られた生体内分解性マトリッ
クスは、必要であれば、加温・減圧下生体内分解性マト
リックス中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
本発明において用いられる生体内分解性マトリックス中
の残留有機溶媒量は、約１,０００ppm以下、好ましくは
約５００ppm以下、さらに好ましくは２５０ppm以下、特
に好ましくは約１００ppm以下である。(D) Spray drying method When a biodegradable matrix is produced by a spray drying method, W / O emulsion or biodegradation containing water or an aqueous solution containing a water-soluble component and a biodegradable polymer is used. A solution of a water-soluble polymer in an organic solvent is sprayed into the drying chamber of a spray drier (spray dryer) using a nozzle, and the organic solvent in the atomized droplets is volatilized in an extremely short time, resulting in a fine granular biodegradable capsule. To prepare. Examples of the nozzle include a two-fluid nozzle type, a pressure nozzle type, and a rotating disk type. At this time, if desired, at the same time as W / O emulsion containing water or an aqueous solution containing a water-soluble component and a biodegradable polymer or an organic solvent solution of the biodegradable polymer, to prevent aggregation of the biodegradable matrix. It is also effective to spray the above-mentioned aqueous solution of the aggregation preventing agent from another nozzle. The biodegradable matrix is preferably W / O containing an aqueous solution containing a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt and a biodegradable polymer.
It is manufactured using an emulsion or an organic solvent solution of a biodegradable polymer containing a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt. The biodegradable matrix thus obtained is further subjected to removal of water and organic solvent in the biodegradable matrix under heating and reduced pressure, if necessary.
The amount of residual organic solvent in the biodegradable matrix used in the present invention is about 1,000 ppm or less, preferably about 500 ppm or less, more preferably 250 ppm or less, and particularly preferably about 100 ppm or less.
【００１５】本発明における生体内分解性マトリックス
に用いられる原料は、好ましくは生体内分解性ポリマー
である。生体内分解性ポリマーとしては、水に難溶また
は不溶である高分子重合物、例えば脂肪族ポリエステル
〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール
酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等、バリン酸、ロイシン
酸）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、
ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種
以上から合成された重合体、共重合体、あるいはこれら
の混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポ
リアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン
酸等）が挙げられる。あるいはこれらの混合物が挙げら
れる。重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何
れでもよい。The raw material used for the biodegradable matrix in the present invention is preferably a biodegradable polymer. As the biodegradable polymer, a high molecular weight polymer which is hardly soluble or insoluble in water, for example, aliphatic polyester [eg, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc., valic acid, leucic acid ), Hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.),
Polymers, copolymers, or mixtures thereof synthesized from at least one kind of hydroxytricarboxylic acid (eg, citric acid, etc.)], poly-α-cyanoacrylic acid ester, polyamino acid (eg, poly-γ-) Benzyl-L-glutamic acid and the like). Alternatively, a mixture thereof may be used. The type of polymerization may be random, block or graft.
【００１６】生体内分解性ポリマーは、好ましくは脂肪
族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類
（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒド
ロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシ
トリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合
成された重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕
である。上記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキ
シカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ
酪酸等）の１種以上から合成された重合体、共重合体が
確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好まし
い。脂肪族ポリエステルは、さらに好ましくはα−ヒド
ロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロ
キシ酪酸等）の１種以上から合成された共重合体であ
る。特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、
グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の２種以上か
ら合成された共重合体である。また、本発明における生
体内分解性ポリマーは、公知の方法で製造され、かつ通
常の注射針を用いて投与可能な生体内分解性マトリック
スに成型された時に、エタノールなどの有機溶媒を使用
せずに水が該生体内分解性マトリックスに浸透し、膨潤
させることが可能なものが好ましい。The biodegradable polymer is preferably an aliphatic polyester [eg, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acid. (Eg, a polymer synthesized from one or more kinds such as citric acid, etc.), a copolymer, or a mixture thereof]
Is. Among the above-mentioned aliphatic polyesters, polymers and copolymers synthesized from one or more kinds of α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.) have reliable biodegradability and biocompatibility. It is preferable from the viewpoint. The aliphatic polyester is more preferably a copolymer synthesized from one or more kinds of α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.). Particularly preferably α-hydroxycarboxylic acids (eg,
It is a copolymer synthesized from two or more of glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.). Further, the biodegradable polymer in the present invention is produced by a known method, and when molded into a biodegradable matrix that can be administered using a usual injection needle, without using an organic solvent such as ethanol. It is preferable that water can penetrate into the biodegradable matrix and swell.
【００１７】上記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−
体、Ｌ−体、およびＤ、Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−
体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２５／７５の範
囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−
体（モル％）が約６０／４０〜３０／７０の範囲のヒド
ロキシカルボン酸である。上記α−ヒドロキシカルボン
酸類の共重合体の例としては、例えばグリコール酸と他
のα−ヒドロキシ酸類との共重合体が挙げられ、該α−
ヒドロキシ酸としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、バリ
ン酸、ロイシン酸が好ましい。α−ヒドロキシカルボン
酸類の共重合体は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重
合体または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体
である。α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、特
に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体である。The above α-hydroxycarboxylic acids are D-
Body, L-body, and D, L-body may be used, but D-
Those having a ratio of body / L-body (mol%) of about 75/25 to 25/75 are preferable. More preferably, D-form / L-
It is a hydroxycarboxylic acid having a body (mol%) in the range of about 60/40 to 30/70. Examples of the α-hydroxycarboxylic acid copolymers include, for example, copolymers of glycolic acid and other α-hydroxy acids.
As the hydroxy acid, lactic acid, 2-hydroxybutyric acid, valic acid and leucic acid are preferable. The α-hydroxycarboxylic acid copolymer is preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer or a 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer. The α-hydroxycarboxylic acid copolymer is particularly preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer.
【００１８】乳酸−グリコール酸共重合体において、そ
の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は約１００
／０〜４０／６０が好ましい。さらに好ましくは、組成
比が約９０／１０〜４５／５５の場合である。特に好ま
しくはその組成比約６０／４０〜４５／５５である。上
記グリコール酸と乳酸の共重合体の重量平均分子量は約
３,０００〜１２,０００が好ましい。さらに好ましく
は、約４,０００〜１０,０００である。本発明において
該共重合体を用いて製造した生体内分解性マトリックス
への水溶性ポリペプチドの浸透および生体内に投与後の
生体内分解性マトリックスの消失速度は、組成比および
重量平均分子量の組み合わせにより影響を受ける。生体
内に投与（皮下投与など）された後の消失期間が約２週
間であり、生体内分解性カプセルへの水の浸透に問題が
無いものとして、例えば組成比約５０／５０で重量平均
分子量が約４,０００〜９,０００、好ましくは約５,０
００〜９,０００のものが挙げられる。本発明におい
て、組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−
グリコール酸共重合体を任意の割合で混合して用いても
よい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グ
リコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子
量が約６,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組
成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０
で重量平均分子量が約４,０００の乳酸−グリコール酸
共重合体との混合物が挙げられる。混合する際の重量比
は、好ましくは約２５／７５から約７５／２５である。
また、乳酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均
分子量／数平均分子量）は約１.２から約４.０が好まし
い。さらに好ましくは、約１.５から約３.５である。乳
酸−グリコール酸共重合体は、自体公知の製造法、例え
ば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って
合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成され
たものが好ましい。In the lactic acid-glycolic acid copolymer, the composition ratio (lactic acid / glycolic acid) (mol%) is about 100.
/ 0 to 40/60 is preferable. More preferably, the composition ratio is about 90/10 to 45/55. Particularly preferably, the composition ratio is about 60/40 to 45/55. The weight average molecular weight of the copolymer of glycolic acid and lactic acid is preferably about 3,000 to 12,000. More preferably, it is about 4,000 to 10,000. In the present invention, the rate of permeation of a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix produced using the copolymer and the disappearance rate of the biodegradable matrix after in vivo administration is a combination of a composition ratio and a weight average molecular weight. Affected by. Assuming that the disappearance period after administration in vivo (subcutaneous administration, etc.) is about 2 weeks and there is no problem in permeation of water into the biodegradable capsule, for example, a composition ratio of about 50/50 and a weight average molecular weight. Is about 4,000 to 9,000, preferably about 5.0
The thing of 00 to 9,000 is mentioned. In the present invention, two types of lactic acid having different composition ratios and weight average molecular weights
You may mix and use a glycolic acid copolymer in arbitrary ratios. As such an example, for example, a lactic acid-glycolic acid copolymer having a composition ratio (lactic acid / glycolic acid) (mol%) of about 75/25 and a weight average molecular weight of about 6,000, and a composition ratio (lactic acid / glycol acid). Acid) (mol%) is about 50/50
And a mixture with a lactic acid-glycolic acid copolymer having a weight average molecular weight of about 4,000. The weight ratio upon mixing is preferably about 25/75 to about 75/25.
The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid copolymer is preferably about 1.2 to about 4.0. More preferably, it is about 1.5 to about 3.5. The lactic acid-glycolic acid copolymer can be synthesized according to a method known per se, for example, the method described in JP-A-61-28521. The copolymer is preferably synthesized by catalyst-free dehydration polycondensation.
【００１９】２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合
体において、グリコール酸が約１０〜７５モル％、残り
が２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましい。さらに好
ましくは、グリコール酸が約２０〜７５モル％である場
合である。特に好ましくは、グリコール酸が約３０〜７
０モル％である場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリ
コール酸共重合体の重量平均分子量は、約２,０００〜
２０,０００が好ましい。重量平均分子量は、さらに好
ましくは約３,０００〜１０,０００である。重量平均分
子量は、特に好ましくは約４,０００〜８,０００であ
る。これらのグリコール酸共重合体の分散度（重量平均
分子量／数平均分子量）は、約１.２〜４.０が好まし
い。分散度は、特に好ましくは約１.５〜３.５である。
本グリコール酸共重合体は自体公知の製造法、例えば、
特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（無触媒下
の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下の脱水重縮合反応
による製造方法）に従って合成できる。該共重合体は無
触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。In the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer, it is preferable that the glycolic acid is about 10 to 75 mol% and the balance is 2-hydroxybutyric acid. More preferably, glycolic acid is about 20 to 75 mol%. Particularly preferably, glycolic acid is about 30-7.
This is the case when it is 0 mol%. The weight average molecular weight of the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer is about 2,000-
20,000 is preferred. The weight average molecular weight is more preferably about 3,000 to 10,000. The weight average molecular weight is particularly preferably about 4,000 to 8,000. The degree of dispersion (weight average molecular weight / number average molecular weight) of these glycolic acid copolymers is preferably about 1.2 to 4.0. The dispersity is particularly preferably about 1.5 to 3.5.
This glycolic acid copolymer is a production method known per se, for example,
It can be synthesized according to the method described in JP-A-61-28521 (production method by dehydration polycondensation reaction in the absence of a catalyst or dehydration polycondensation reaction in the presence of an inorganic solid acid catalyst). The copolymer is preferably synthesized by catalyst-free dehydration polycondensation.
【００２０】上記したグリコール酸共重合体は、さらに
ポリ乳酸と混合して使用されてもよい。該ポリ乳酸とし
ては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでも
よいが、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２
０／８０の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、
Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜２５／７５
の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、Ｄ−体、Ｌ
−体（モル％）が約５５／４５〜２５／７５の範囲のポ
リ乳酸である。該ポリ乳酸は、重量平均分子量が約１,
５００〜１０,０００のものが好ましい。さらに好まし
くは、重量平均分子量が約２,０００〜８,０００の範囲
のポリ乳酸である。特に好ましくは、重量平均分子量が
約３,０００〜６,０００の範囲のポリ乳酸である。ま
た、ポリ乳酸の分散度は約１.２〜４.０が好ましい。ポ
リ乳酸の分散度は、特に好ましくは、約１.５〜３.５で
ある。ポリ乳酸の製造法については、乳酸の二量体であ
るラクタイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合す
る方法が知られている。本発明で使用する比較的低分子
のポリ乳酸を得るためには、乳酸を直接脱水重縮合する
方法が好ましい。該方法は、例えば特開昭６１−２８５
２１号公報に記載されている。グリコール酸共重合体と
ポリ乳酸を混合して使用する場合、その混合比は、例え
ば約１０／９０〜９０／１０（重量％）の範囲である。
混合比は、好ましくは約２０／８０〜８０／２０（重量
％）の範囲である。さらに好ましくは、約３０／７０〜
７０／３０（重量％）の範囲である。The glycolic acid copolymer may be mixed with polylactic acid before use. The polylactic acid may be any of D-form, L-form, and a mixture thereof, but the D-form and L-form (mol%) are about 75/25 to 2.
The range of 0/80 is preferable. More preferably,
D-form and L-form (mol%) are about 60/40 to 25/75
The range of polylactic acid. Particularly preferred is D-form, L
-Polylactic acid in the form (mol%) in the range of about 55/45 to 25/75. The polylactic acid has a weight average molecular weight of about 1,
Those of 500 to 10,000 are preferable. More preferred is polylactic acid having a weight average molecular weight in the range of about 2,000 to 8,000. Particularly preferred is polylactic acid having a weight average molecular weight in the range of about 3,000 to 6,000. The polylactic acid preferably has a dispersity of about 1.2 to 4.0. The dispersity of polylactic acid is particularly preferably about 1.5 to 3.5. As a method for producing polylactic acid, a method of ring-opening polymerization of lactide which is a dimer of lactic acid and a method of dehydration polycondensation of lactic acid are known. In order to obtain the relatively low molecular weight polylactic acid used in the present invention, a method of directly dehydrating and polycondensing lactic acid is preferable. The method is described in, for example, JP-A-61-285.
No. 21 publication. When the glycolic acid copolymer and polylactic acid are used as a mixture, the mixing ratio is, for example, in the range of about 10/90 to 90/10 (% by weight).
The mixing ratio is preferably in the range of about 20/80 to 80/20 (% by weight). More preferably, from about 30/70
It is in the range of 70/30 (% by weight).
【００２１】本発明において、無触媒脱水重縮合で合成
される生体内分解性ポリマーは、末端に遊離のカルボキ
シル基を有する。末端に遊離のカルボキシル基を有する
生体内分解性ポリマーは、ＧＰＣ測定による数平均分子
量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する重
合体である。約１〜３ｇの生体内分解性ポリマーをアセ
トン（２５ml）とメタノール（５ml）との混合溶媒に溶
解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中
のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリ
ウム溶液で室温での撹拌下、速やかに滴定して末端基定
量による数平均分子量を次式で算出した。 末端基定量による数平均分子量 ＝ 20,000 Ａ／Ｂ Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ） Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水
酸化カリウム溶液（ｍｌ） 以下、これを末端基定量による数平均分子量と表記す
る。例えば１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒
脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基
を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と
末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これ
に対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成
され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない
重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測
定による数平均分子量を大きく上回る。この相違によっ
て末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は末端に
遊離カルボキシル基を有しない重合体と明確に区別する
ことができる。In the present invention, the biodegradable polymer synthesized by catalyst-free dehydration polycondensation has a free carboxyl group at the terminal. The biodegradable polymer having a free carboxyl group at the terminal is a polymer in which the number average molecular weight determined by GPC and the number average molecular weight determined by the end group determination are substantially the same. About 1 to 3 g of biodegradable polymer was dissolved in a mixed solvent of acetone (25 ml) and methanol (5 ml), and phenolphthalein was used as an indicator to adjust the carboxyl group in this solution to 0.05N alcoholic potassium hydroxide solution. With stirring at room temperature, the mixture was rapidly titrated to calculate the number average molecular weight by quantifying the end group by the following formula. Number average molecular weight by end group quantification = 20,000 A / B A: mass of biodegradable polymer (g) B: 0.05N alcoholic potassium hydroxide solution added by the end of titration (ml) It is expressed as the number average molecular weight by quantification. For example, in a polymer synthesized from one or more kinds of α-hydroxy acids by a non-catalytic dehydration polycondensation method and having a free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight measured by GPC and the number average molecular weight measured by the end group are almost the same. To do. On the other hand, in a polymer synthesized from a cyclic dimer by a ring-opening polymerization method using a catalyst and having essentially no free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight measured by the end group is the number average molecular weight measured by GPC. Much higher than the molecular weight. Due to this difference, the polymer having a free carboxyl group at the terminal can be clearly distinguished from the polymer having no free carboxyl group at the terminal.
【００２２】末端基定量による数平均分子量が絶対値で
あるのに対してＧＰＣ測定による数平均分子量は各種分
析、解析条件（例えば移動相の種類、カラムの種類、基
準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）に
よって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困
難であるが、例えばＧＰＣ測定による数平均分子量と末
端基定量による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末
端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均
分子量の約０．５〜２倍の範囲内であることをいう。好
ましくは、約０.８〜１.５倍の範囲内であることをい
う。また、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定
による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量に
よる数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約
２倍を越える場合をいう。本発明においては、ＧＰＣ測
定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量
とがほぼ一致する重合体が好ましい。本明細書での重量
平均分子量および数平均分子量とは、重量平均分子量が
１２０,０００、５２,０００、２２,０００、９,２０
０、５,０５０、２,９５０、１,０５０、５８０、１６
２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミ
エーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポ
リスチレン換算の重量平均分子量および数平均分子量を
意味する。測定はＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ２（昭
和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所
製）を使用、移動相としてクロロホルムを用いた。ま
た、分散度は、（重量平均分子量／数平均分子量）によ
り算出される。While the number average molecular weight determined by quantification of end groups is an absolute value, the number average molecular weight determined by GPC measurement is various analysis and analysis conditions (for example, selection of mobile phase type, column type, reference substance, slice width, Since it is a relative value that fluctuates depending on the selection of the baseline, etc., it is difficult to make a unique numerical value. It means that the number average molecular weight determined by quantification is within a range of about 0.5 to 2 times the number average molecular weight determined by GPC. It is preferably within the range of about 0.8 to 1.5 times. The term "number average molecular weight determined by end group quantitatively significantly higher than the number average molecular weight determined by GPC" means that the number average molecular weight determined by terminal group determination exceeds about twice the number average molecular weight determined by GPC measurement. In the present invention, a polymer in which the number average molecular weight measured by GPC and the number average molecular weight measured by end group determination are substantially the same is preferable. The weight average molecular weight and the number average molecular weight in the present specification mean that the weight average molecular weight is 120,000, 52,000, 22,000, 9,20.
0, 5,050, 2,950, 1,050, 580, 16
2 means the polystyrene-equivalent weight average molecular weight and number average molecular weight measured by gel permeation chromatography (GPC) using 9 kinds of polystyrene as reference substances. For the measurement, GPC column KF804L x2 (manufactured by Showa Denko) and RI monitor L-3300 (manufactured by Hitachi Ltd.) were used, and chloroform was used as a mobile phase. Further, the dispersity is calculated by (weight average molecular weight / number average molecular weight).
【００２３】水溶性脂肪族カルボン酸金属塩は、水溶性
であり、かつ生体に悪影響を及ぼさない脂肪族カルボン
酸金属塩であれば特に限定されない。水溶性脂肪族カル
ボン酸金属塩は、好ましくは常温（約２０℃）で水に対
する溶解度が約２０mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属
塩、さらに好ましくは溶解度が約１００mg／ml以上の脂
肪族カルボン酸金属塩、特に好ましくは溶解度が約２０
０mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩である。水溶性
の脂肪族カルボン酸金属塩において、脂肪族カルボン酸
は、好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸で
ある。脂肪族カルボン酸としては、例えば脂肪族モノカ
ルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸
等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、飽和あ
るいは不飽和のいずれであってもよい。脂肪族モノカル
ボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族
モノカルボン酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草
酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン
酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂
肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール
酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）が
挙げられる。脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素
数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン
酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸
等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン
酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコ
ン酸等）が挙げられる。脂肪族トリカルボン酸として
は、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン
酸（例、トリカルバリル酸、１,２,３−ブタントリカル
ボン酸等）が挙げられる。上記した脂肪族カルボン酸
は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このよう
な例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン
酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙
げられる。脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノ
カルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好まし
くは炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸、特
に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボ
ン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例と
しては、例えば酢酸等が挙げれる。The water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt is not particularly limited as long as it is water-soluble and does not adversely affect the living body. The water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt is preferably an aliphatic carboxylic acid metal salt having a solubility in water of about 20 mg / ml or more at room temperature (about 20 ° C.), and more preferably an aliphatic carboxylic acid having a solubility of about 100 mg / ml or more. Acid metal salts, particularly preferably having a solubility of about 20.
It is an aliphatic carboxylic acid metal salt of 0 mg / ml or more. In the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, the aliphatic carboxylic acid is preferably an aliphatic carboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms. Examples of the aliphatic carboxylic acid include aliphatic monocarboxylic acid, aliphatic dicarboxylic acid, and aliphatic tricarboxylic acid. These aliphatic carboxylic acids may be saturated or unsaturated. Examples of the aliphatic monocarboxylic acid include saturated aliphatic monocarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms (eg, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, etc.) And unsaturated aliphatic monocarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms (eg, acrylic acid, propiolic acid, methacrylic acid, crotonic acid, isocrotonic acid, etc.). Examples of the aliphatic dicarboxylic acid include saturated aliphatic dicarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms (eg, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, etc.) and unsaturated aliphatic dicarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms. Examples thereof include acids (eg, maleic acid, fumaric acid, citraconic acid, mesaconic acid, etc.). Examples of the aliphatic tricarboxylic acid include saturated aliphatic tricarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms (eg, tricarballylic acid, 1,2,3-butanetricarboxylic acid, etc.). The above-mentioned aliphatic carboxylic acid may have 1 or 2 hydroxyl groups, and examples thereof include glycolic acid, lactic acid, glyceric acid, tartronic acid, malic acid, tartaric acid and citric acid. To be The aliphatic carboxylic acid is preferably an aliphatic monocarboxylic acid. The aliphatic carboxylic acid is more preferably a saturated aliphatic monocarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms, and particularly preferably a saturated aliphatic monocarboxylic acid having 2 to 3 carbon atoms. Particularly preferred specific examples of the aliphatic carboxylic acid include acetic acid and the like.
【００２４】水溶性脂肪族カルボン酸金属塩における金
属塩としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、
カリウム等）塩、銅（I価）塩等の単価金属塩、アルカ
リ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）塩、亜
鉛（II価）塩、鉄（II価，III価）塩、銅（II価）塩、
スズ（II価，IV価）塩、アルミニウム（II価，III価）
塩等の多価金属塩が挙げられる。金属塩は、好ましくは
多価金属塩である。金属塩は、特に好ましくはカルシウ
ム塩、亜鉛塩である。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の
具体例を挙げれば、例えば酢酸ナトリウム，酢酸カリウ
ム，酢酸カルシウム，酢酸亜鉛，プロピオン酸ナトリウ
ム，プロピオン酸カルシウム，グリコール酸ナトリウ
ム，グリコール酸亜鉛，乳酸ナトリウム，乳酸カルシウ
ム，乳酸亜鉛，酒石酸ナトリウム，酒石酸亜鉛，クエン
酸ナトリウム等である。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩
の特に好ましい具体例を挙げれば、酢酸カルシウム、酢
酸亜鉛等である。上記した水溶性脂肪族カルボン酸金属
塩と同様にして水溶性芳香族カルボン酸金属塩も用いら
れる。水溶性芳香族カルボン酸金属塩の具体例を挙げれ
ば、例えば安息香酸ナトリウム，安息香酸亜鉛，サリチ
ル酸ナトリウム，サリチル酸亜鉛等である。生体内分解
性マトリックスの製造の際に使用する有機溶媒は、沸点
が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒とし
ては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（エ
タノール、メタノール）、アセトニトリル等が挙げられ
る。これらは混合して用いられてもよい。有機溶媒は、
好ましくはジクロロメタン、アセトニトリルである。The metal salt of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt is, for example, an alkali metal (eg, sodium,
Potassium, etc.), monovalent metal salts such as copper (I valent) salts, alkaline earth metal (eg, calcium, magnesium etc.) salts, zinc (II valent) salts, iron (II valent, III valent) salts, copper ( II value) salt,
Tin (II value, IV value) salt, Aluminum (II value, III value)
Examples thereof include polyvalent metal salts such as salts. The metal salt is preferably a polyvalent metal salt. The metal salt is particularly preferably a calcium salt or a zinc salt. Specific examples of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt include, for example, sodium acetate, potassium acetate, calcium acetate, zinc acetate, sodium propionate, calcium propionate, sodium glycolate, zinc glycolate, sodium lactate, calcium lactate, Examples include zinc lactate, sodium tartrate, zinc tartrate and sodium citrate. Specific preferred examples of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt include calcium acetate and zinc acetate. A water-soluble aromatic carboxylic acid metal salt is also used in the same manner as the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt. Specific examples of the water-soluble aromatic carboxylic acid metal salt include sodium benzoate, zinc benzoate, sodium salicylate, zinc salicylate and the like. The organic solvent used in the production of the biodegradable matrix preferably has a boiling point of 120 ° C. or lower. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (eg, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, etc.), alcohols (ethanol, methanol), acetonitrile and the like. These may be used as a mixture. The organic solvent is
Dichloromethane and acetonitrile are preferred.
【００２５】本発明の徐放性製剤は、水溶性ポリペプチ
ドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させること
により製造することができる。該徐放性製剤（例、マイ
クロカプセル）は、例えば以下のような操作によって製
造することができる。以下、このようにして製造される
徐放性製剤を単にマイクロカプセルと称する場合があ
る。 １）水溶性ポリペプチドの水溶液を調製する ２）生体内分解性マトリックスを１）の水溶液に接触さ
せ、生体内分解性マトリックス内部に該水溶液を浸透さ
せる ３）必要に応じて生体内分解性マトリックスに浸透され
ない水溶性ポリペプチドと生体内分解性マトリックスと
を分離する（洗浄操作） ４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに
浸透させてなる徐放性製剤（例、マイクロカプセル）を
乾燥させる 上記した水溶性ポリペプチドの水溶液に、水溶性ポリペ
プチドの溶解度を上げるため、あるいは水溶性ポリペプ
チドの生物活性を維持するために、生体内に注入しうる
塩類、例えば無機塩類（例、食塩，燐酸一水素ナトリウ
ムなど）、有機塩類（例、酢酸アンモニアなど）、アミ
ノ酸（例、グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）な
どを添加してもよい。上記した塩類は薬物の至適ｐＨ付
近になるように複数組み合わされてもよい。この際、ｐ
Ｈは一般的には中性あるいは弱酸性になるように調整さ
れるが、塩基性に調製される場合もある。該塩類の濃度
は水溶性ポリペプチドの水溶液の張度が生理食塩水を基
準として約１／５０〜５倍になるように調整される。好
ましくは約１／２５〜３倍である。また、Tween 80 な
どの界面活性剤を添加してもよい。該界面活性剤の濃度
は約０.０００１〜０.２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約
０.００１〜約０.１％（ｗ／ｖ）が使用される。The sustained-release preparation of the present invention can be produced by permeating a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix in water. The sustained-release preparation (eg, microcapsule) can be produced, for example, by the following operation. Hereinafter, the sustained-release preparation produced in this manner may be simply referred to as microcapsules. 1) Prepare an aqueous solution of a water-soluble polypeptide 2) Contact the biodegradable matrix with the aqueous solution of 1) to allow the aqueous solution to penetrate into the biodegradable matrix 3) Biodegradable matrix as necessary To separate biodegradable matrix from water-soluble polypeptide that does not permeate into the body (washing operation) 4) Dry sustained-release preparation (eg, microcapsule) obtained by permeating water-soluble polypeptide into biodegradable matrix In order to increase the solubility of the water-soluble polypeptide or to maintain the biological activity of the water-soluble polypeptide, an aqueous solution of the above-mentioned water-soluble polypeptide, such as inorganic salts (eg, salt , Sodium monohydrogen phosphate, etc., organic salts (eg, ammonia acetate, etc.), amino acids (eg, glycine, arginine, hist) Gin, etc.) may be added. A plurality of the above-mentioned salts may be combined so that the optimum pH of the drug can be obtained. At this time, p
H is generally adjusted to be neutral or weakly acidic, but it may be adjusted to be basic. The concentration of the salt is adjusted so that the aqueous solution of the water-soluble polypeptide has a tonicity of about 1/50 to 5 times that of physiological saline. It is preferably about 1/25 to 3 times. In addition, a surfactant such as Tween 80 may be added. The concentration of the surfactant used is about 0.0001 to 0.2% (w / v), preferably about 0.001 to about 0.1% (w / v).
【００２６】また、水溶性ポリペプチドの水溶液に血清
アルブミンを添加してもよい。血清アルブミンを添加す
ることにより、水溶性ポリペプチドの溶解度が上がり、
水溶性ポリペプチドの生物活性を保持できる。血清アル
ブミンは水溶性ポリペプチドの水溶液に添加してもよ
く、あるいは水溶性ポリペプチドと予め混合してあって
もよい。血清アルブミンは人血清アルブミンが好まし
く、人血液から分離精製されてもよくあるいは遺伝子工
学的手法で生産されるものでもよい。水溶性ポリペプチ
ドと血清アルブミンの混合比（重量比）は、例えば約
１：１,０００〜約１００：１、好ましくは約１：１０
０〜約１０：１である。水溶液中の水溶性ポリペプチド
の濃度は特に限定されないが、単位重量あたりの生体内
分解性マトリックスになるべく多量の水溶性ポリペプチ
ドを浸透させるためには、水溶性ポリペプチドの溶解度
以下でなるべく濃い濃度が好ましい。該溶解度は塩濃
度、温度、添加物の有無によっても異なる。一般に生体
内分解性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチド
の濃度により徐放性製剤の水溶性ポリペプチド放出パタ
ーンが異なることが知られており、この観点からも水溶
性ポリペプチド濃度は選択される。水溶性ポリペプチド
濃度は、一般的には約１００μg／ml〜約５００mg／m
l，好ましくは約１〜３００mg／ml，さらに好ましくは
約５〜１００mg／mlである。Serum albumin may be added to the aqueous solution of the water-soluble polypeptide. The addition of serum albumin increases the solubility of water-soluble polypeptides,
The biological activity of the water-soluble polypeptide can be retained. Serum albumin may be added to an aqueous solution of the water-soluble polypeptide or may be premixed with the water-soluble polypeptide. Human serum albumin is preferable as the serum albumin, which may be separated and purified from human blood or may be produced by a genetic engineering method. The mixing ratio (weight ratio) of the water-soluble polypeptide and serum albumin is, for example, about 1: 1,000 to about 100: 1, preferably about 1:10.
0 to about 10: 1. The concentration of the water-soluble polypeptide in the aqueous solution is not particularly limited, but in order to permeate as much of the water-soluble polypeptide as possible into the biodegradable matrix per unit weight, the concentration of the water-soluble polypeptide should be as high as possible below the solubility of the water-soluble polypeptide. Is preferred. The solubility also depends on the salt concentration, temperature, and the presence or absence of additives. It is generally known that the water-soluble polypeptide release pattern of a sustained-release preparation differs depending on the concentration of the water-soluble polypeptide that has penetrated into the biodegradable matrix. From this viewpoint as well, the water-soluble polypeptide concentration is selected. . The water-soluble polypeptide concentration is generally about 100 μg / ml to about 500 mg / m 2.
1, preferably about 1 to 300 mg / ml, more preferably about 5 to 100 mg / ml.
【００２７】生体内分解性マトリックスが生体内分解性
ポリマーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合する
ことにより製造される場合、生体内分解性マトリックス
に水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透させる際の水溶液
のｐＨは、生体内分解性マトリックスに含有される水溶
性脂肪族カルボン酸金属塩の種類、水溶性ポリペプチド
の等電点等によって異なるので一概には言えないが、好
ましくは約３〜９、さらに好ましくは約３〜８である。
ｐＨの調整は、例えば無機酸（例、塩酸等）、有機酸
（例、酢酸等）等の酸、例えば水酸化アルカリ金属
（例、水酸化ナトリウム等）等のアルカリにより適宜行
えばよい。ここにおいて、使用される酸またはアルカリ
の量は、酸またはアルカリの電離度、強度、および目的
とするｐＨにより、適宜用いればよい。水溶性脂肪族カ
ルボン酸金属塩として特に酢酸ナトリウム、酢酸亜鉛ま
たは酢酸カルシウム等は、中性付近のｐＨで生体内分解
性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透さ
せることができるため好ましい。水溶性ポリペプチドを
生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる操作は、
例えば水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マト
リックスとを混合させることにより行われる。水溶性ポ
リペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとを混
合する際の混合順序は水溶性ポリペプチドの生物活性が
保持される限り、任意に選択できる。例えば、水溶性ポ
リペプチドの水溶液に生体内分解性マトリックスを浸漬
してもよいし、生体内分解性マトリックスに水溶性ポリ
ペプチドの水溶液を添加してもよい。When the biodegradable matrix is produced by mixing a biodegradable polymer and a water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, when the biodegradable matrix is permeated with an aqueous solution of the water-soluble polypeptide. The pH of the aqueous solution may vary depending on the type of the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt contained in the biodegradable matrix, the isoelectric point of the water-soluble polypeptide, etc., but cannot be generally stated, but it is preferably about 3 to 10. 9, more preferably about 3-8.
The pH may be adjusted appropriately with an acid such as an inorganic acid (eg, hydrochloric acid), an organic acid (eg, acetic acid), or an alkali such as an alkali metal hydroxide (eg, sodium hydroxide). Here, the amount of the acid or alkali used may be appropriately used depending on the ionization degree of the acid or alkali, the strength, and the target pH. As the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, sodium acetate, zinc acetate, calcium acetate or the like is particularly preferable because the biodegradable matrix can be permeated with the aqueous solution of the water-soluble polypeptide at a pH around neutral. The operation of permeating a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix in water is
For example, it is performed by mixing an aqueous solution of a water-soluble polypeptide with a biodegradable matrix. The order of mixing the aqueous solution of the water-soluble polypeptide and the biodegradable matrix can be arbitrarily selected as long as the biological activity of the water-soluble polypeptide is retained. For example, the biodegradable matrix may be immersed in the aqueous solution of the water-soluble polypeptide, or the aqueous solution of the water-soluble polypeptide may be added to the biodegradable matrix.
【００２８】水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解
性マトリックスの混合比率は、生体内分解性マトリック
スに十分に水溶性ポリペプチドの水溶液が浸透するよう
に、水溶性ポリペプチドの水溶液の過剰量が使用され
る。すなわち、すべての生体内分解性マトリックスが水
溶性ポリペプチドの水溶液に浸るように調製される。水
溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックス
との重量比は、生体内分解性マトリックスの空隙率が異
なるために、一概には決められないが、好ましくは約
１：１０〜約２０：１、さらに好ましくは約１：５〜約
１０：１である。しかし、一般には生体内分解性マトリ
ックスに浸透されない水溶性ポリペプチドは再使用され
ず、貴重な水溶性ポリペプチドのロスを少なくするた
め、最小必要限の水溶性ポリペプチドの水溶液が使用さ
れる。水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マト
リックスとの混合は、通常、容器を用いて行われる。こ
のような容器としては、水溶性ポリペプチドの吸着が少
ないものが好まれ、例えばシリコナイズ（シリコン化処
理）したガラスが挙げられる。また、水溶性ポリペプチ
ドの生物活性を損なわないように表面処理した合金（ス
テンレスあるいはチタン）なども好まれる。The mixing ratio of the aqueous solution of the water-soluble polypeptide and the biodegradable matrix is such that the excess amount of the aqueous solution of the water-soluble polypeptide is sufficient so that the aqueous solution of the water-soluble polypeptide permeates the biodegradable matrix. used. That is, all biodegradable matrices are prepared soaked in an aqueous solution of a water-soluble polypeptide. The weight ratio between the aqueous solution of the water-soluble polypeptide and the biodegradable matrix cannot be unconditionally determined because the porosity of the biodegradable matrix is different, but it is preferably about 1:10 to about 20: 1. , And more preferably about 1: 5 to about 10: 1. However, in general, water-soluble polypeptides that do not penetrate the biodegradable matrix are not reused, and in order to reduce the loss of valuable water-soluble polypeptides, the minimum necessary aqueous solution of water-soluble polypeptides is used. Mixing the aqueous solution of the water-soluble polypeptide and the biodegradable matrix is usually performed using a container. As such a container, a container that is less likely to adsorb a water-soluble polypeptide is preferred, and for example, a glass which has been siliconized (siliconized) can be mentioned. Further, an alloy (stainless steel or titanium) whose surface is treated so as not to impair the biological activity of the water-soluble polypeptide is also preferable.
【００２９】混合操作としては例えば水溶性ポリペプチ
ドの水溶液に生体内分解性マトリックスを添加し、静置
あるいは水溶性ポリペプチドの生物活性を失わない程度
の軽い攪拌操作を加えることにより行われる。該操作に
おいて、水溶性ポリペプチドの水溶液が過度に起泡しな
い程度に真空減圧してもよい。該混合操作は水溶性ポリ
ペプチドの生物活性を損なわないあるいは生体内分解性
マトリックスの構成成分である生体内分解性ポリマーが
分解しない温度が採用され、通常は室温で行なわれ、好
ましくは冷所で行なわれる。混合操作における温度は、
具体的には約１〜３０℃，好ましくは約４〜２５℃であ
る。混合操作の時間は生体内分解性マトリックスの量、
生体内分解性ポリマーの組成，分子量，温度その他の要
因により異なるが、数時間から数十時間である。具体的
には、例えば約４℃で約１０〜１００時間，約２５℃で
約５〜５０時間が好ましい。この時間は水溶性ポリペプ
チドの生物活性を失わない範囲および、生体内分解性ポ
リマーが必要以上に加水分解しない範囲で任意に選択さ
れる。生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマ
ーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することに
より製造された場合、混合時間が短縮される。具体的に
は、混合時間は、例えば約４℃で約０.５〜２４時間，
約２５℃で約０.５〜５時間である。The mixing operation is carried out, for example, by adding the biodegradable matrix to the aqueous solution of the water-soluble polypeptide and allowing it to stand or to carry out a light stirring operation to the extent that the biological activity of the water-soluble polypeptide is not lost. In the operation, vacuum decompression may be performed so that the aqueous solution of the water-soluble polypeptide does not foam excessively. The mixing operation is carried out at a temperature at which the biological activity of the water-soluble polypeptide is not impaired or the biodegradable polymer that is a constituent of the biodegradable matrix is not decomposed, and it is usually performed at room temperature, preferably in a cool place. Done. The temperature in the mixing operation is
Specifically, it is about 1 to 30 ° C, preferably about 4 to 25 ° C. The time of the mixing operation depends on the amount of biodegradable matrix,
The time is several hours to several tens of hours, depending on the composition of the biodegradable polymer, the molecular weight, the temperature and other factors. Specifically, for example, about 4 ° C. for about 10 to 100 hours and about 25 ° C. for about 5 to 50 hours are preferable. This time is arbitrarily selected within the range in which the biological activity of the water-soluble polypeptide is not lost and the range in which the biodegradable polymer is not hydrolyzed more than necessary. When the biodegradable matrix is made by mixing the biodegradable polymer and the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, the mixing time is shortened. Specifically, the mixing time is, for example, about 4 ° C. for about 0.5 to 24 hours,
It is about 0.5 to 5 hours at about 25 ° C.
【００３０】混合操作の後に必要があれば洗浄操作を加
えてよい。該洗浄操作により生体内分解性マトリックス
に浸透されなかった水溶性ポリペプチドは除去される。
洗浄方法としては種々の方法が考えられるが、生体内分
解性マトリックスを破壊しない方法、および生体内分解
性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチドが生体
内分解性マトリックス外に流出せず、かつその生物活性
を失わない方法が採用される。例えば混合操作終了後に
洗浄液を添加し、遠心分離あるいは濾過によりマイクロ
カプセルと洗浄液を分離する操作を繰り返す。本操作に
おける洗浄液は蒸留水、あるいは塩（例、リン酸水素ナ
トリウム，塩化ナトリウム等）、糖（例、マンニトール
等）を含んだ水溶液が使用される。洗浄液は、好ましく
はマンニトールを含んだ水溶液である。このようにして
得られたマイクロカプセルは、ついで乾燥される。乾燥
方法としては、例えば凍結乾燥，真空乾燥などが挙げら
れる。乾燥方法としては、特に凍結乾燥が好ましい。ま
た、乾燥操作における粒子同士の凝集を防ぐために凝集
防止剤を含んだ洗浄液を使用してもよい。該凝集防止剤
としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ
糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）などの水溶性
多糖、ヒアルロン酸などのムコ多糖類、グリシン，フィ
ブリン，コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム，リン
酸水素ナトリウム等の無機塩類、レシチンなどのリン脂
質などが挙げられる。If necessary, a washing operation may be added after the mixing operation. By the washing operation, the water-soluble polypeptide that has not penetrated into the biodegradable matrix is removed.
Although various methods can be considered as a washing method, a method of not destroying the biodegradable matrix, and a water-soluble polypeptide that has penetrated into the biodegradable matrix do not flow out of the biodegradable matrix, and A method that does not lose biological activity is adopted. For example, after the mixing operation is completed, the washing solution is added, and the operation of separating the washing solution from the microcapsules by centrifugation or filtration is repeated. As the washing liquid in this operation, distilled water or an aqueous solution containing a salt (eg, sodium hydrogen phosphate, sodium chloride, etc.) and a sugar (eg, mannitol, etc.) is used. The washing solution is preferably an aqueous solution containing mannitol. The microcapsules thus obtained are then dried. Examples of the drying method include freeze drying and vacuum drying. Freeze-drying is particularly preferable as the drying method. Further, a cleaning liquid containing an anti-agglomeration agent may be used to prevent the particles from aggregating during the drying operation. Examples of the aggregation preventing agent include water-soluble polysaccharides such as mannitol, lactose, glucose, starches (eg, corn starch, etc.), mucopolysaccharides such as hyaluronic acid, proteins such as glycine, fibrin, collagen, sodium chloride, phosphate. Examples thereof include inorganic salts such as sodium hydrogen and phospholipids such as lecithin.
【００３１】乾燥操作において乾燥時の温度は水溶性ポ
リペプチドの生物活性を損なわず、マイクロカプセルの
破壊しない任意の温度が採用される。好ましくは、用い
られた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で該
マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温
度に加熱する。ガラス転移温度とは示差走査熱量計（Ｄ
ＳＣ）を用い、加温速度毎分約１０または２０℃で昇温
した際に得られる中間点ガラス転移温度（Ｔｍｇ）をい
う。好ましい加温温度としてはガラス転移温度より、約
２〜１０℃程度高い温度が採用される。このような温度
は、例えば約２５〜５０℃，好ましくは約３０〜４５℃
である。加熱時間は、加熱温度、処理するマイクロカプ
セル量などにより異なるが、一般的にはマイクロカプセ
ル自体の温度が所定の温度に達した後、数十時間、好ま
しくは約２４時間以内である。該加熱方法は特に限定さ
れないが、マイクロカプセルが均一に加熱される方法で
あればいかなる方法を用いてもよい。具体例として、例
えば恒温槽中で加熱する方法、マイクロ波で加熱する方
法などが挙げられる。該乾燥操作によりマイクロカプセ
ルを温血動物に投与後の初期の放出を抑制することが可
能になる。In the drying operation, the drying temperature may be any temperature that does not impair the biological activity of the water-soluble polypeptide and does not destroy the microcapsules. Preferably, it is heated to a temperature above the glass transition temperature of the biodegradable polymer used so that the particles of the microcapsules do not adhere to each other. What is the glass transition temperature? Differential scanning calorimeter (D
SC) is the midpoint glass transition temperature (Tmg) obtained when the temperature is raised at a heating rate of about 10 or 20 ° C. per minute. As a preferable heating temperature, a temperature about 2 to 10 ° C. higher than the glass transition temperature is adopted. Such a temperature is, for example, about 25 to 50 ° C, preferably about 30 to 45 ° C.
Is. The heating time varies depending on the heating temperature, the amount of microcapsules to be treated, etc., but is generally several tens hours, preferably about 24 hours after the temperature of the microcapsules themselves reaches a predetermined temperature. The heating method is not particularly limited, but any method may be used as long as it can uniformly heat the microcapsules. Specific examples include a method of heating in a constant temperature bath and a method of heating with a microwave. The drying operation makes it possible to suppress the initial release of the microcapsules after administration to warm-blooded animals.
【００３２】本発明においては、水溶性ポリペプチドを
生体内分解性マトリックスに浸透させる際に有機溶媒を
使用せず、また、過度の過熱を行わないため、製剤化過
程において水溶性ポリペプチドの生物活性が損なわれる
ことは少ない。ここでいう有機溶媒は、例えばハロゲン
化炭化水素，アルコール類，アセトニトリル，氷酢酸な
どである。また、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用い
ることにより、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マト
リックス内に効率よく浸透させることができる。本発明
の徐放性製剤は、例えば注射剤として用いる場合、長期
間、例えば約１週間〜１カ月にわたり、ほぼ一定速度の
徐放性を示す。本発明の徐放性製剤中の水溶性ポリペプ
チドの含有量は、例えば徐放性製剤がマイクロカプセル
である場合、マイクロカプセルを適当な溶媒で溶解し、
マイクロカプセル中に含有される水溶性ポリペプチドを
ＨＰＬＣなどのクロマトグラフあるいはエンザイムイミ
ュノアッセイなどの免疫学的測定法により分離定量する
方法、あるいは分離された水溶性ポリペプチドの生物活
性を測定する方法などで決定される。マイクロカプセル
中の生体内分解性ポリマーに対する水溶性ポリペプチド
の含有率は、一般的に約０.１〜３０％（ｗ／ｗ）、好
ましくは約１〜２０％（ｗ／ｗ）である。In the present invention, since the organic solvent is not used when permeating the water-soluble polypeptide into the biodegradable matrix, and since excessive heating is not performed, the organism of the water-soluble polypeptide is formulated in the process of formulation. Activity is rarely impaired. The organic solvent mentioned here is, for example, a halogenated hydrocarbon, alcohols, acetonitrile, glacial acetic acid, or the like. Further, by using the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, the water-soluble polypeptide can be efficiently permeated into the biodegradable matrix. When used as an injection, the sustained-release preparation of the present invention exhibits sustained release at a substantially constant rate for a long period of time, for example, about 1 week to 1 month. The content of the water-soluble polypeptide in the sustained-release preparation of the present invention is, for example, when the sustained-release preparation is microcapsules, the microcapsules are dissolved in a suitable solvent,
Method for separating and quantifying water-soluble polypeptide contained in microcapsules by chromatograph such as HPLC or immunological assay such as enzyme immunoassay, or method for measuring biological activity of separated water-soluble polypeptide It is decided by. The content of the water-soluble polypeptide with respect to the biodegradable polymer in the microcapsules is generally about 0.1 to 30% (w / w), preferably about 1 to 20% (w / w).
【００３３】本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカ
プセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質と
して種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例、筋肉内、皮
下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直
腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル
剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散
剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与す
ることができる。本発明において、徐放性製剤は特に注
射用であることが好ましい。例えば徐放性製剤がマイク
ロカプセルである場合、マイクロカプセルを注射剤とす
るには、マイクロカプセルを分散剤（例、Tween 80、HC
O-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、
アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多
糖類、硫酸プロタミンなど）、保存剤（例、メチルパラ
ベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナ
トリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖な
ど）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン，クロロブタノー
ルなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン
油などの植物油あるいは中鎖脂肪酸トリグリセライド
〔例、ミグリオール８１２（フルス・アクチエンゲゼル
シャフト社）等〕またはこれらにレシチンなどのリン脂
質を混合したものと共に分散して油性懸濁剤として実際
に使用できる徐放性注射剤とする。The sustained-release preparation of the present invention is formulated into various dosage forms, for example, as microcapsules or by using microcapsules as a raw material, and parenteral preparations (eg, intramuscular, subcutaneous, injectable agents into organs or the like) or Implants, transmucosal agents for nasal cavity, rectum, uterus, etc.), oral agents (eg, capsules (eg, hard capsules, soft capsules, etc.), granules, solid preparations such as powders, suspensions, etc. Solution, etc.) and the like. In the present invention, the sustained release preparation is particularly preferably for injection. For example, when the sustained-release preparation is a microcapsule, the microcapsule can be made into an injection by using the microcapsule as a dispersant (eg, Tween 80, HC
Surfactant such as O-60, carboxymethyl cellulose,
Polysaccharides such as sodium alginate and sodium hyaluronate, protamine sulfate, etc.), preservatives (eg, methylparaben, propylparaben, etc.), isotonic agents (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose, etc.), local anesthetics ( Xylocaine hydrochloride, chlorobutanol, etc.) or the like as an aqueous suspension agent, or vegetable oil such as sesame oil, corn oil or medium chain fatty acid triglyceride [eg, Miglyol 812 (Frus Actiengeselshaft Co., Ltd.)] or lecithin Dispersed together with a mixture of phospholipids, a sustained-release injection that can be actually used as an oily suspension is prepared.
【００３４】徐放性製剤が例えばマイクロカプセルであ
る場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤とし
て使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲
であればよく、例えば粒子径として約０.１から３００
μｍの範囲が挙げられる。好ましくは、約１から１５０
μｍの範囲の粒子径である。さらに好ましくは、約２か
ら１００μｍの範囲の粒子径である。上記したマイクロ
カプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にす
る方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方
法等が挙げられるが、特に限定されない。本発明の徐放
性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、
ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用い
ることができる。本発明の徐放性製剤の適応は、使用す
る水溶性ポリペプチドにより異なる。本発明の徐放性製
剤は、水溶性ポリペプチドが、例えばインターフェロン
アルファである場合は、ウィルス性肝炎（例、Ｃ型肝
炎，ＨＢｅ抗原陽性Ｂ型慢性活動性肝炎など），癌
（例、腎癌，多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチ
ンの場合は貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−Ｃ
ＳＦの場合は好中球減少症（例、制癌剤治療時），感染
症など、ＩＬ−２の場合は癌（例、血管内皮腫など）、
ＦＧＦの場合は消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合は血
小板減少症など、ＮＧＦの場合は老人性痴呆，神経病
（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合は血栓症など、
インスリンの場合は糖尿病など、腫瘍壊死因子の場合は
癌などの治療または予防に有効である。When the sustained-release preparation is, for example, a microcapsule, the particle size of the microcapsule may be within a range satisfying the degree of dispersion and needle-passability when used as a suspension injection, for example, particles. Diameter is about 0.1 to 300
The range of μm can be mentioned. Preferably about 1 to 150
The particle size is in the range of μm. More preferably, the particle size is in the range of about 2 to 100 μm. Examples of the sterile preparation of the above-mentioned microcapsules include a method of making all the manufacturing steps aseptic, a method of sterilizing with gamma rays, a method of adding a preservative, and the like, but are not particularly limited. The sustained-release preparation of the present invention has low toxicity and is a mammal (eg, human, cow, pig, dog,
It can be safely used for cats, mice, rats, rabbits, etc.). The adaptation of the sustained-release preparation of the present invention depends on the water-soluble polypeptide used. In the sustained-release preparation of the present invention, when the water-soluble polypeptide is interferon alpha, viral hepatitis (eg, hepatitis C, HBe antigen-positive chronic active hepatitis B, etc.), cancer (eg, kidney) Cancer, multiple myeloma, etc.), erythropoietin, anemia (eg, renal dialysis anemia, etc.), G-C
In case of SF, neutropenia (eg, during treatment with anti-cancer drug), infection, etc .; in case of IL-2, cancer (eg, hemangioendothelioma, etc.),
In the case of FGF, gastrointestinal ulcer, etc., in the case of FGF-9, thrombocytopenia, etc., in the case of NGF, senile dementia, neuropathies, etc., and in the case of TPA, thrombosis, etc.
Insulin is effective in treating or preventing diabetes, and tumor necrosis factor is effective in treating or preventing cancer.
【００３５】徐放性製剤の投与量は、水溶性ポリペプチ
ドの種類と含量、水溶性ポリペプチド放出の持続時間、
対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、含有さ
れる水溶性ポリペプチドの薬理効果が発揮される量であ
ればよい。水溶性ポリペプチドの１回当たりの投与量と
しては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、
水溶性ポリペプチドの種類によって異なるが、好ましく
は、成人１人当たり約０.０００１〜１０mg／kg体重の
範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約
０.０００５〜１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことが
できる。徐放性製剤の投与量は成人１人，１回当たり好
ましくは、約０.０００５〜５０mg／kg体重の範囲から
適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.００２
５〜１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。
投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、水溶性ポ
リペプチドの種類と含量、剤型、水溶性ポリペプチド放
出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選
ぶことができる。本発明の製剤の保存は常温あるいは冷
所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう
常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるも
のである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所と
は１５℃以下を意味する。The dose of the sustained-release preparation depends on the kind and content of the water-soluble polypeptide, the duration of release of the water-soluble polypeptide,
The amount varies depending on the target disease, target animal, etc., but may be any amount as long as the pharmacological effect of the water-soluble polypeptide contained therein is exerted. The dose per administration of the water-soluble polypeptide is, for example, when the sustained-release preparation is a one-week type preparation,
Although it depends on the kind of the water-soluble polypeptide, it can be appropriately selected from the range of about 0.0001 to 10 mg / kg body weight per adult. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.0005 to 1 mg / kg body weight. The dose of the sustained-release preparation can be appropriately selected from the range of about 0.0005 to 50 mg / kg body weight per adult, preferably once. More preferably about 0.002
It can be appropriately selected from the range of 5 to 10 mg / kg body weight.
The frequency of administration can be appropriately selected once a week, once every two weeks, etc. depending on the type and content of the water-soluble polypeptide, dosage form, duration of release of the water-soluble polypeptide, target disease, target animal, etc. . The preparation of the present invention may be stored at room temperature or in a cold place, but preferably in a cold place. The room temperature or the cold place mentioned here is defined in the Japanese Pharmacopoeia. That is, the normal temperature means 15 to 25 ° C, and the cold place means 15 ° C or lower.
【００３６】[0036]
【実施例】以下に参考例、実施例および比較例を挙げて
本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を
限定するものではない。以下、％は特記しない限り重量
／容量パーセントを示す。 実施例１ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,４００、ＧＰＣ測定による数平均分子量 ２,９０
０、末端基定量による数平均分子量２,２００、和光純
薬工業製）２.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に
溶解した液に加えて溶解した。内水相として注射用生理
食塩水１mlを加え、ホモジナイザー（ポリトロン）で約
３０秒間攪拌した。予め１８℃に調節しておいた０.１
％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学
製）水溶液５００ml中に注入し、タービン型ホモミキサ
ーを用い、４,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとし
た。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌し
てジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた後、遠
心分離機（05PR-22、日立製作所）を用いて２,０００rp
mで捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心
分離を行った。捕集された乳酸-グリコール酸共重合体
マトリックスは少量の蒸留水を加えて再分散した後、こ
の分散液を凍結乾燥して粉末として得られた。ポリエチ
レン製試験管にインターフェロンアルファの１.０８×
１０9 ＩＵ（人血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量
し、２００μlの蒸留水で溶解した。これに前記のマイ
クロカプセル２００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵
庫で約４日間静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加え
て約１分間静かに攪拌する。約２,０００rpmで５分間遠
心分離操作を行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰
り返すことにより、洗浄操作を行なった。得られたマイ
クロカプセルにＤ−マンニトール４４mgを加え、蒸留水
２mlを添加し、ゆっくりと攪拌する。その後、得られる
分散液を真空乾燥した（温度；４０℃／６時間）。EXAMPLES The present invention will be described more specifically below with reference to Reference Examples, Examples and Comparative Examples, but these do not limit the present invention. Hereinafter,% means weight / volume percent unless otherwise specified. Example 1 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,400 measured by GPC, number average molecular weight 2,90 measured by GPC
0, number average molecular weight of 2,200 by quantitative determination of end groups, 2.0 g of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to and dissolved in 5.3 g (4 ml) of dichloromethane. As an inner aqueous phase, 1 ml of physiological saline for injection was added and stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds. 0.1 adjusted to 18 ℃ in advance
% (W / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Gosei Kagaku) aqueous solution (500 ml), and a W / O / W emulsion was prepared at 4,000 rpm using a turbine homomixer. This W / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to volatilize dichloromethane to solidify the oil phase, and then use a centrifuge (05PR-22, Hitachi) at 2,000 rp.
collected by m. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. The collected lactic acid-glycolic acid copolymer matrix was redispersed by adding a small amount of distilled water, and then the dispersion was freeze-dried to obtain a powder. Interferon alfa 1.08 × in a polyethylene test tube
10 9 IU (containing about 25 mg of human serum albumin) was weighed and dissolved in 200 μl of distilled water. The above-mentioned microcapsules (200 mg) were added thereto, and the containers were tightly closed and then allowed to stand in a refrigerator at 4-8 ° C. for about 4 days. After this operation, 5 ml of distilled water is added and gently stirred for about 1 minute. After centrifugation at about 2,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded. A washing operation was performed by repeating this operation three times. To the obtained microcapsules, 44 mg of D-mannitol was added, 2 ml of distilled water was added, and the mixture was slowly stirred. Then, the resulting dispersion was dried under vacuum (temperature: 40 ° C./6 hours).
【００３７】実施例２ 実施例１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体マ
トリックスを粉末として得た。ポリエチレン製試験管に
インターフェロンアルファの１.０８×１０9 ＩＵ（人
血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量し、２００μl
の蒸留水で溶解した。これに前記のマイクロカプセル２
００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵庫で約３０時間
静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加えて約１分間静
かに攪拌する。約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を
行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰り返すことに
より、洗浄操作を行なった。得られたマイクロカプセル
に０.１％ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１８０万）
水溶液を１mlを添加し、ゆっくりと攪拌した。その後、
得られる分散液を凍結乾燥した（１６時間）。Example 2 In the same manner as in Example 1, a lactic acid-glycolic acid copolymer matrix was obtained as a powder. Interferon alfa 1.08 × 10 9 IU (containing about 25 mg of human serum albumin) was weighed into a polyethylene test tube, and 200 μl
Dissolved in distilled water. And the microcapsule 2
After adding 00 mg and sealing the container, the mixture was allowed to stand in a refrigerator at 4 to 8 ° C for about 30 hours. After this operation, 5 ml of distilled water is added and gently stirred for about 1 minute. Centrifugation was performed for 5 minutes at about 1,000 rpm, and the supernatant was discarded. A washing operation was performed by repeating this operation three times. 0.1% sodium hyaluronate (molecular weight 1.8 million) was added to the obtained microcapsules.
1 ml of the aqueous solution was added, and the mixture was slowly stirred. afterwards,
The resulting dispersion was freeze dried (16 hours).
【００３８】実施例３ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸カルシウム４ｇ
を添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌
し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調
節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG
-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タ
ービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／
Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを
室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相
を固化させた。ついで、余剰の炭酸カルシウムを除去す
るために１Ｎ塩酸１０mlを添加した。約２,０００rpmで
遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を
捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を
行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の
蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥し
て粉末（約２.０g）を得た。ガラス製試験管にインター
フェロンアルファ凍結乾燥粉末４mg（約８×１０8ＩＵ
（国際単位））を秤量し、１０mＭ塩酸溶液２mlで溶解
した。これに前記の生体内分解性マトリックス５０mgを
添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社
製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に蒸
留水４mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,
０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨て
た（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作を行
なった）。得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプ
セル（約４８mg）を得た。得られたマイクロカプセル中
のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイク
ロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブ
ロックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキ
ング剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（Ｅ
ＩＡ）によりインターフェロンアルファを定量した。そ
の結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロン
アルファ５７０万ＩＵを含有していた。Example 3 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. 4 g of calcium carbonate in this solution
After adding, was stirred for about 30 seconds with a vortex mixer to obtain an S / O emulsion. 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG
-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.) was poured into 800 ml of an aqueous solution, and a turbine homomixer was used to perform S / O / at 6,000 rpm.
It was a W emulsion. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Then 10 ml of 1N hydrochloric acid was added to remove excess calcium carbonate. Centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Interferon alfa freeze-dried powder 4 mg (about 8 × 10 8 IU in a glass test tube)
(International unit)) was weighed and dissolved with 2 ml of 10 mM hydrochloric acid solution. The biodegradable matrix (50 mg) was added thereto, and the mixture was rotatively mixed on a low profile roller (manufactured by Life Science) at 4 ° C. for about 1 day. After the operation, 4 ml of distilled water was added and gently stirred for about 1 minute, and then about 1,
The mixture was centrifuged at 000 rpm for 5 minutes and the supernatant was discarded (the washing operation was performed by repeating this operation twice). The resulting dispersion was freeze-dried to obtain microcapsules (about 48 mg). In order to examine the interferon alpha content in the obtained microcapsules, the microcapsules were extracted with a 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) (blocking agent for immunological experiment) solution containing 10% acetonitrile, followed by enzyme immunology. Measurement method (E
Interferon alpha was quantified by IA). As a result, 1 mg of microcapsules contained 5.7 million IU of interferon alpha.
【００３９】実施例４ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和
物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホ
モジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／
Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節してお
いた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日
本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型
ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマル
ションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５
時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化さ
せた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-2
2、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分
散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解
性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、
この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。ガ
ラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末
６mg（約１.２×１０9ＩＵ（国際単位））を秤量し、
０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内
分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイ
ルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日
間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１
０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,００
０rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた
（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行な
った）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール
３０mgおよび蒸留水０.５mlを加え、ゆっくりと攪拌し
た後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、マイクロカプセル
（約３１０mg）を得た。得られたマイクロカプセル中の
インターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロ
カプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロ
ックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキン
グ剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（イン
ターフェロン抗体を用いるサンドイッチ法、以下、ＥＩ
Ａと略す）によりインターフェロンアルファを定量し
た。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフ
ェロンアルファ２３０万ＩＵを含有していた。Example 4 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight measured by GPC 5,100, number average molecular weight measured by GPC 2,570,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. 0.4 g of zinc acetate (dihydrate) was added to this solution, and the mixture was shaken for 2 hours and then stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to give S /
O emulsion. This was poured into 800 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution which had been adjusted to 18 ° C. in advance, and a turbine homomixer was used at 6,000 rpm. This was an S / O / W emulsion. This S / O / W emulsion is used at room temperature for 5
The mixture was stirred for a period of time to evaporate dichloromethane, and the oil phase was solidified. Centrifuge at approximately 2,000 rpm (05PR-2
(2, Hitachi) The supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. After adding a small amount of distilled water to the collected biodegradable matrix and redispersing it,
This dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Weigh 6 mg of interferon alpha lyophilized powder (about 1.2 × 10 9 IU (international unit)) into a glass test tube,
It was dissolved in 3 ml of a 0.5 mM hydrochloric acid solution. The above biodegradable matrix (300 mg) was added thereto, and the mixture was rotatively mixed on a low profile roller (manufactured by Life Science) at 4 ° C. for about 1 day. After the operation, 5% mannitol aqueous solution 1
Add 0 ml and stir gently for about 1 minute, then about 2,000
Centrifugation was performed at 0 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded (the washing operation was performed by repeating this operation 3 times). D-mannitol (30 mg) and distilled water (0.5 ml) were added to the obtained microcapsules, and the mixture was slowly stirred and the resulting suspension was freeze-dried to give microcapsules (about 310 mg). In order to examine the interferon alpha content in the obtained microcapsules, the microcapsules were extracted with a 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) (blocking agent for immunological experiment) solution containing 10% acetonitrile, followed by enzyme immunology. Assay (sandwich method using interferon antibody, hereinafter referred to as EI
Interferon alpha was quantified by A). As a result, 1 mg of microcapsules contained 2.3 million IU of interferon alpha.
【００４０】実施例５ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和
物）８００mg含有水溶液１mlを添加した後、ホモジナイ
ザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマル
ションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.
１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化
学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキ
サーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションと
した。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌
してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約
２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立
製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さ
らに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリ
ックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散
液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。ガラス製試
験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を６mg
（約１.２×１０9ＩＵ）秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３ml
で溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３
００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイ
エンス社製）上で１０℃にて約１日間回転混合した。該
操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１時
間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分
離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返
すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られるマイ
クロカプセルを凍結乾燥した。マイクロカプセル中のイ
ンターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカ
プセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロッ
クエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩ
Ａによりインターフェロンアルファを定量した。その結
果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアル
ファ７８万ＩＵを含有していた。Example 5 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. To this solution was added 1 ml of an aqueous solution containing 800 mg of zinc acetate (dihydrate), and the mixture was stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to give a W / O emulsion. This was adjusted to 18 ° C in advance.
It was poured into 800 ml of a 1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution, and a W / O / W emulsion was prepared at 6,000 rpm using a turbine homomixer. The W / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). 6 mg of interferon alfa lyophilized powder in a glass test tube
(Approximately 1.2 × 10 9 IU) Weigh and add 3 ml of 0.5 mM hydrochloric acid solution
It was dissolved in. In addition to the above-mentioned biodegradable matrix 3
00 mg was added, and the mixture was rotatively mixed on a low profile roller (manufactured by Life Science) at 10 ° C. for about 1 day. After this operation, 10 ml of a 5% mannitol aqueous solution was added, and the mixture was gently stirred for about 1 hour, and then centrifuged at about 1,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded (the washing operation was repeated twice. Was done). The resulting microcapsules were freeze dried. To examine the interferon alpha content in the microcapsules, the microcapsules were extracted with 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) solution containing 10% acetonitrile, and then EI
Interferon alpha was quantified by A. As a result, 1 mg of microcapsules contained 780,000 IU of interferon alpha.
【００４１】実施例６ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ(４m
l) に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１
水和物）０.４ｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロ
ン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。
これを予め１８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリ
ビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８
００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、
６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ
／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロ
メタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpm
で遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清
を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離
を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量
の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥
して粉末（約２.０g）を得た。ガラス製試験管にインタ
ーフェロンアルファ凍結乾燥粉末を４mg（８×１０8Ｉ
Ｕ）秤量し、１mＭ塩酸溶液２mlで溶解した。これに前
記の生体内分解性マトリックス５０mgを添加し、ロープ
ロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃に
て約１日間回転混合した。該操作後に４mlの蒸留水を加
えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５
分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を
２回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。つ
いで、得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプセル
（約４８mg）を得た。得られたマイクロカプセル中のイ
ンターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカ
プセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロッ
クエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩ
Ａによりインターフェロンアルファを定量した。その結
果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアル
ファを９４０万ＩＵ含有していた。Example 6 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g of dichloromethane 5.3 g (4 m
l) and dissolved. Add calcium acetate (1
Hydrate) (0.4 g) was added, and the mixture was stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to give an S / O emulsion.
0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution adjusted to 18 ° C in advance 8
Pour into 00 ml and use a turbine homomixer,
An S / O / W emulsion was prepared at 6,000 rpm. This S
The / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to strip off dichloromethane and solidify the oil phase. About 2,000 rpm
Centrifuge operation was performed at (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Add 4 mg (8 × 10 8 I) of interferon alpha lyophilized powder to a glass test tube.
U) Weighed and dissolved in 2 ml of 1 mM hydrochloric acid solution. The biodegradable matrix (50 mg) was added thereto, and the mixture was rotatively mixed on a low profile roller (manufactured by Life Science) at 4 ° C. for about 1 day. After the operation, 4 ml of distilled water was added and gently stirred for about 1 minute, and then 5 rpm at about 1,000 rpm.
Centrifugation was performed for 1 minute, and the supernatant was discarded (the washing operation was performed by repeating this operation twice). Then, the resulting dispersion was freeze-dried to obtain microcapsules (about 48 mg). In order to examine the interferon alpha content in the obtained microcapsules, the microcapsules were extracted with 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) solution containing 10% acetonitrile, and then EI
Interferon alpha was quantified by A. As a result, 1 mg of microcapsules contained 9.4 million IU of interferon alpha.
【００４２】実施例７ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和
物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、ホモジナ
イザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマ
ルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた
０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合
成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモ
ミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルショ
ンとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間
撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させ
た。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-2
2、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分
散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解
性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、
この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。ガ
ラス製試験管に生体内分解性マトリックス５０mgを秤量
し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムによりｐＨを調整し
た２mg／mlインターフェロンアルファ溶液（約４.０×
１０8ＩＵ）（ｐＨは約２、約４、約５、約８の４段
階）を添加した後、４℃で２４時間回転混合することに
より、生体内分解性マトリックスにインターフェロンア
ルファを浸透させた。約１,０００rpmで遠心分離操作を
行い、上清を除去した後、蒸留水４mlで２回洗浄し、蒸
留水０.５mlを加えた後、凍結乾燥した。Example 7 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight measured by GPC 5,100, number average molecular weight measured by GPC 2,570,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. 0.4 g of zinc acetate (dihydrate) was added to this solution, and the mixture was shaken for 2 hours and then stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an S / O emulsion. This was poured into 800 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution which had been adjusted to 18 ° C. in advance, and a turbine homomixer was used at 6,000 rpm. This was an S / O / W emulsion. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifuge at approximately 2,000 rpm (05PR-2
(2, Hitachi) The supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. After adding a small amount of distilled water to the collected biodegradable matrix and redispersing it,
This dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). 50 mg of biodegradable matrix was weighed in a glass test tube and the pH was adjusted with hydrochloric acid or sodium hydroxide to prepare a 2 mg / ml interferon alpha solution (about 4.0 x
Interferon-alpha was permeated into the biodegradable matrix by adding 10 8 IU) (4 steps of pH about 2, about 4, about 5, and about 8) and rotatively mixing at 4 ° C. for 24 hours. . After centrifugation at about 1,000 rpm to remove the supernatant, the mixture was washed twice with 4 ml of distilled water, added with 0.5 ml of distilled water, and freeze-dried.
【００４３】実施例８ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１
水和物）０.４ｇを添加した後、ホモジナイザー（ポリ
トロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得
た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）
ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶
液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用
い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。こ
のＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジク
ロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,００
０rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）
上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心
分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに
少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結
乾燥して粉末（約４.０g）を得た。ついで、実施例７と
同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにイ
ンターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行っ
た。Example 8 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. Add calcium acetate (1
(Hydrate) (0.4 g) was added, and the mixture was stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an S / O emulsion. 0.1% (w / w) adjusted to 18 ℃ in advance
It was poured into 800 ml of an aqueous solution of polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.) and a S / O / W emulsion was prepared at 6,000 rpm using a turbine homomixer. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. About 2,000
Centrifuge operation at 0 rpm (05PR-22, Hitachi)
The supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 4.0 g). Then, in the same manner as in Example 7, interferon alfa was permeated into the biodegradable matrix at various pHs and freeze-dried.
【００４４】実施例９ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸ナトリウム（３
水和物）０.２ｇを添加し、２時間振とうした後、これ
をホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、
Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節し
ておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-4
0、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、ター
ビン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗ
エマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室
温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を
固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない
（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸
留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生
体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散
した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を
得た。ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体
内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸
透させ、凍結乾燥を行った。Example 9 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight measured by GPC 5,100, number average molecular weight measured by GPC 2,570,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. Sodium acetate (3
Hydrate) 0.2 g was added, and the mixture was shaken for 2 hours and then stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds,
It was an S / O emulsion. 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-4
0, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Co., Ltd.) Injected into 800 ml of an aqueous solution, and using a turbine homomixer, S / O / W at 6,000 rpm
It was an emulsion. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Then, in the same manner as in Example 7, interferon alfa was permeated into the biodegradable matrix at various pHs and freeze-dried.
【００４５】実施例１０ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和
物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホ
モジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／
Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節してお
いた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日
本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型
ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマル
ションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５
時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化さ
せた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-2
2、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分
散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解
性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、
この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。ガ
ラス製試験管にインターロイキン２（２０μg）を含有
する水溶液２mlを秤量し、ついで、これに前記の生体内
分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイ
ルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約５時
間回転混合した。なお、インターロイキン２は、特開昭
６１−７８７９９号公報に記載の方法により製造し、特
開昭６０−１１５５２８号公報に記載の精製法で精製し
た、Ｎ末端にメチオニンが結合しているものと結合して
いないものとの混合物を用いた。該操作後に５％マンニ
トール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、つ
いで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上
清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄
操作をおこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−
マンニトール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、
ゆっくりと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾
燥した。Example 10 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight measured by GPC 5,100, number average molecular weight measured by GPC 2,570,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. 0.4 g of zinc acetate (dihydrate) was added to this solution, and the mixture was shaken for 2 hours and then stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to give S /
O emulsion. This was poured into 800 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution which had been adjusted to 18 ° C. in advance, and a turbine homomixer was used at 6,000 rpm. This was an S / O / W emulsion. This S / O / W emulsion is used at room temperature for 5
The mixture was stirred for a period of time to evaporate dichloromethane, and the oil phase was solidified. Centrifuge at approximately 2,000 rpm (05PR-2
(2, Hitachi) The supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. After adding a small amount of distilled water to the collected biodegradable matrix and redispersing it,
This dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). 2 ml of an aqueous solution containing interleukin 2 (20 μg) was weighed in a glass test tube, and then 300 mg of the above-mentioned biodegradable matrix was added to this, and the mixture was heated to 4 ° C. on a low profile roller (Life Science). And mixed by rotation for about 5 hours. The interleukin 2 is produced by the method described in JP-A-61-78799 and purified by the purification method described in JP-A-60-115528, in which methionine is bound to the N-terminal. And a mixture of those not bound with. After this operation, 10 ml of a 5% mannitol aqueous solution was added, and the mixture was gently stirred for about 1 minute, and then centrifuged at about 2,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded (the washing operation was repeated 3 times. Was done). D- in the obtained microcapsules
Add 30 mg mannitol, dissolve in 0.5 ml distilled water,
Stir slowly. Then the resulting suspension was freeze-dried.
【００４６】実施例１１ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,８００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,８０５、
和光純薬工業製）５.０ｇと安息香酸亜鉛７８２ｍｇを
ジクロロメタン６.６２５ｇ(５ml)に添加し、室温で３
時間振盪し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１
８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリビニルアルコ
ール（EG-40、日本合成化学製）水溶液１,０００ｍｌ中
に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００r
pmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエ
マルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮
散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離
操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。
これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。
捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を
加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末
（約２.０g）を得た。ガラス製試験管にインターフェロ
ンアルファ凍結乾燥粉末を２mg（１.７×１０8ＩＵ）秤
量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の
生体内分解性マトリックス３０２mgを添加し、ロープロ
ファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で１５℃に
て約５時間回転混合した。該操作後に５％マンニトール
水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約
２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨
てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を
おこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニ
トール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、ゆっく
りと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、
マイクロカプセル（約３１０mg）を得た。得られたマイ
クロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べ
るため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含
有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で
抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファ
を定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりイ
ンターフェロンアルファを３６１万ＩＵ含有していた。 実施例１２ 安息香酸亜鉛をサリチル酸亜鉛９９５ｍｇとする以外は
実施例１１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体
のマトリックスを粉末として得た。ついで、マトリック
ス３０４mgを用いること以外は実施例１１と同様にし
て、マイクロカプセルを得た。マイクロカプセル１mgあ
たりインターフェロンアルファを１９３万ＩＵ含有して
いた。Example 11 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), GPC measurement weight average molecular weight 5,800, GPC measurement number average molecular weight 2,805,
5.0 g of Wako Pure Chemical Industries) and 782 mg of zinc benzoate were added to 6.625 g (5 ml) of dichloromethane, and the mixture was mixed at room temperature for 3 hours.
It was shaken for a time to obtain an S / O emulsion. This one in advance
It was poured into 1,000 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution which had been adjusted to 8 ° C., and 6,000 r using a turbine homomixer.
S / O / W emulsion at pm. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded.
This was again dispersed in distilled water and further centrifuged.
A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). 2 mg (1.7 × 10 8 IU) of interferon-alpha freeze-dried powder was weighed in a glass test tube and dissolved in 3 ml of 0.5 mM hydrochloric acid solution. The biodegradable matrix (302 mg) was added thereto, and the mixture was rotatively mixed on a low profile roller (manufactured by Life Science Co., Ltd.) at 15 ° C. for about 5 hours. After this operation, 10 ml of a 5% mannitol aqueous solution was added, and the mixture was gently stirred for about 1 minute, and then centrifuged at about 2,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded (the washing operation was repeated 3 times. Was done). To the obtained microcapsules, 30 mg of D-mannitol was added, dissolved with 0.5 ml of distilled water, and slowly stirred. Then freeze-dry the resulting suspension,
Microcapsules (about 310 mg) were obtained. In order to examine the interferon alpha content in the obtained microcapsules, the microcapsules were extracted with a 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) solution containing 10% acetonitrile, and then interferon alpha was quantified by EIA. As a result, 1 mg of microcapsules contained 3.61 million IU of interferon alpha. Example 12 A matrix of lactic acid-glycolic acid copolymer was obtained as a powder in the same manner as in Example 11 except that zinc benzoate was zinc salicylate 995 mg. Then, microcapsules were obtained in the same manner as in Example 11 except that 304 mg of matrix was used. Each mg of microcapsules contained 1.93 million IU of interferon alpha.
【００４７】比較例１ インターフェロンアルファ凍結乾燥粉末２mgを０.５％
牛アルブミン含有りん酸緩衝生理食塩水溶液２mlに溶解
した（ＥＩＡによる測定で１.７５億ＩＵ／mlの濃
度）。 比較例２ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に２ｇ／mlの濃度に調
整した塩化亜鉛水溶液０.５mlを添加した後、ホモジナ
イザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマ
ルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた
０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合
成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモ
ミキサーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルショ
ンとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間
撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させ
た。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-2
2、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分
散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解
性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、
この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。つ
いで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性
マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、
凍結乾燥を行った。Comparative Example 1 Interferon alfa freeze-dried powder 2 mg 0.5%
It was dissolved in 2 ml of a phosphate buffered saline solution containing bovine albumin (concentration of 175 billion IU / ml as measured by EIA). Comparative Example 2 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. After adding 0.5 ml of an aqueous zinc chloride solution adjusted to a concentration of 2 g / ml to this solution, the mixture was stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain a W / O emulsion. This was poured into 800 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry) aqueous solution which had been adjusted to 18 ° C. in advance, and a turbine homomixer was used at 6,000 rpm. It was a W / O / W emulsion. The W / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifuge at approximately 2,000 rpm (05PR-2
(2, Hitachi) The supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. After adding a small amount of distilled water to the collected biodegradable matrix and redispersing it,
This dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Then, in the same manner as in Example 7, the biodegradable matrix was permeated with interferon alfa at various pHs,
Lyophilization was performed.
【００４８】比較例３ 乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０
／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量
５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、
和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４
ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸亜鉛０.２ｇを
添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌
し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調
節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG
-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タ
ービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／
Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを
室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相
を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない
（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。再び蒸留水に
分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分
解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した
後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得
た。ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内
分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透
させ、凍結乾燥を行った。Comparative Example 3 Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50
/ 50 (mol%), weight average molecular weight 5,900 by GPC measurement, number average molecular weight 2,600 by GPC measurement,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4.0 g, dichloromethane 5.3 g (4
ml) and dissolved. After adding 0.2 g of zinc carbonate to this solution, it was stirred for about 30 seconds with a vortex mixer to obtain an S / O emulsion. 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG
-40, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.) was poured into 800 ml of an aqueous solution, and a turbine homomixer was used to perform S / O / at 6,000 rpm.
It was a W emulsion. This S / O / W emulsion was stirred at room temperature for 5 hours to vaporize dichloromethane to solidify the oil phase. Centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. After dispersing again in distilled water, further centrifugation was performed. A small amount of distilled water was added to the collected biodegradable matrix for redispersion, and this dispersion was freeze-dried to obtain a powder (about 2.0 g). Then, in the same manner as in Example 7, interferon alfa was permeated into the biodegradable matrix at various pHs and freeze-dried.
【００４９】実験例１ 実施例１で得られたマイクロカプセル約４０mgを０.５m
lの分散媒（２.５mgのカルボキシメチルセルロース、
０.５mgのポリソルベート ８０、２５mgのマンニトール
を溶解した蒸留水）に分散して８週齢雄性ＳＤラットの
背部皮下に２２Ｇ注射針で投与した（マイクロカプセル
としての投与量１３３mg／kg）。投与後一定時間毎にラ
ット尾部より採血し、血清中のインターフェロンアルフ
ァの濃度を酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）で測定したと
ころほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。 実験例２ 実施例２で得られたマイクロカプセル約３０mgを用い、
実験例１と同様にして、ラットに投与し、血清中のイン
ターフェロンアルファの濃度を酵素免疫学的測定法（Ｅ
ＩＡ）で測定したところほぼ一定の血中濃度が一週間持
続した。Experimental Example 1 About 40 mg of the microcapsules obtained in Example 1 was added to 0.5 m.
l dispersion medium (2.5 mg carboxymethylcellulose,
It was dispersed in 0.5 mg of polysorbate 80 and 25 mg of mannitol dissolved in distilled water) and administered subcutaneously to the back of 8-week-old male SD rats with a 22 G needle (dosage as microcapsules: 133 mg / kg). Blood was collected from the rat tail at regular intervals after administration, and the serum interferon alpha concentration was measured by enzyme immunoassay (EIA). Experimental Example 2 Using about 30 mg of the microcapsules obtained in Example 2,
It was administered to rats in the same manner as in Experimental Example 1, and the serum interferon alpha concentration was assayed by enzyme immunoassay (E.
When measured by IA), a substantially constant blood concentration lasted for one week.
【００５０】実験例３ 実施例４で得られたマイクロカプセル約２２mgおよび実
施例５で得られたマイクロカプセル約６４mgをそれぞれ
分散媒０.５ml（５mgのカルボキシメチルセルロース、
２mgのポリソルベート ８０（界面活性剤）、２５mgの
マンニトールを蒸留水１リットルに溶かした溶液）に分
散して、８週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に１８Ｇ注射
針で投与した（ラット１匹あたり約５,０００万ＩＵの
インターフェロンアルファを投与したことになる）。投
与後一定時間毎にラット尾部より採血し、血清中のイン
ターフェロンアルファの濃度をＥＩＡで測定した。対照
として比較例１で得られたインターフェロンアルファ水
溶液をラットに皮下投与した（ラット１匹あたりのイン
ターフェロンアルファ投与量：約５,０００万ＩＵ）。
比較例１のマイクロカプセル投与群では投与後３日目の
血清中インターフェロンが検出限界程度に低下していた
が、実施例４および実施例５のマイクロカプセル投与群
では初期の高い血中濃度に引き続きほぼ一定の血中濃度
が一週間持続した。Experimental Example 3 About 22 mg of the microcapsules obtained in Example 4 and about 64 mg of the microcapsules obtained in Example 5 were each added to 0.5 ml of a dispersion medium (5 mg of carboxymethylcellulose,
2 mg of polysorbate 80 (surfactant) and 25 mg of mannitol dissolved in 1 liter of distilled water) were dispersed and administered to the back of 8-week-old male SD rats subcutaneously with an 18 G needle (about one rat). 50 million IU of interferon alfa has been administered). Blood was collected from the rat tail at regular intervals after administration, and the concentration of interferon alpha in the serum was measured by EIA. As a control, the interferon-alpha aqueous solution obtained in Comparative Example 1 was subcutaneously administered to rats (interferon-alpha dose per rat: about 50 million IU).
In the microcapsule administration group of Comparative Example 1, serum interferon on the 3rd day after administration was decreased to the detection limit, but in the microcapsule administration groups of Example 4 and Example 5, the initial high blood concentration continued. An almost constant blood concentration lasted for one week.
【００５１】実験例４ 生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルフ
ァの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン
含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと
各種亜鉛塩との関係を調べた。具体的な方法を以下に示
す。実施例７（酢酸亜鉛）、比較例２（塩化亜鉛）およ
び比較例３（炭酸亜鉛）で得られたマイクロカプセル
を、１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエ
ース溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロ
ンアルファを定量した。その結果、図１に示すように、
酢酸亜鉛を用いた場合には、インターフェロンアルファ
が物理的に比較的安定であるｐＨ条件下で、インターフ
ェロンアルファの浸透効率が良好であった。 実験例５ 生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルフ
ァの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン
含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと
酢酸カルシウム塩との関係を調べた。以下、実験例３と
同様に行った。その結果、図２に示すように、インター
フェロンアルファが物理的に比較的安定であるｐＨ条件
下で、インターフェロンアルファの浸透効率が良好であ
った。Experimental Example 4 The relationship between the pH of the interferon alfa solution and various zinc salts on the permeation efficiency of interferon alfa into the biodegradable matrix (interferon content in microcapsules) was investigated. The specific method is shown below. The microcapsules obtained in Example 7 (zinc acetate), Comparative Example 2 (zinc chloride) and Comparative Example 3 (zinc carbonate) were extracted with a 25% block ace solution containing 10% acetonitrile and then interferon by EIA. Alpha was quantified. As a result, as shown in FIG.
When zinc acetate was used, the penetration efficiency of interferon alfa was good under the pH conditions where interferon alfa was physically relatively stable. Experimental Example 5 The relationship between the pH of the interferon alfa solution and the calcium acetate salt on the permeation efficiency of interferon alfa into the biodegradable matrix (interferon content in microcapsules) was investigated. Thereafter, the same procedure as in Experimental Example 3 was performed. As a result, as shown in FIG. 2, the permeation efficiency of interferon alfa was good under the pH condition where interferon alfa was physically relatively stable.
【００５２】[0052]
【発明の効果】本発明の製造法によれば、水溶性ポリペ
プチドを有機溶媒に接触させずに生体内分解性マトリッ
クスに浸透させることができ、水溶性ポリペプチドの生
物活性を損なわずに製剤化することが可能である。ま
た、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用いることによ
り、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックス内
に効率よく浸透させることができる。本発明の徐放性製
剤は、例えば注射剤として用いる場合、数日〜１ケ月以
内（例えば約１〜２週間）にわたり優れた徐放性を示
す。EFFECTS OF THE INVENTION According to the production method of the present invention, a water-soluble polypeptide can be permeated into a biodegradable matrix without contact with an organic solvent, and a pharmaceutical preparation can be prepared without impairing the biological activity of the water-soluble polypeptide. Is possible. Further, by using the water-soluble aliphatic carboxylic acid metal salt, the water-soluble polypeptide can be efficiently permeated into the biodegradable matrix. When the sustained-release preparation of the present invention is used as an injection, for example, it exhibits excellent sustained-release properties over a period of several days to 1 month (for example, about 1 to 2 weeks).
【図１】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に
及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと各種亜鉛塩との関
係を示す。図中、●は酢酸亜鉛（実施例７）を、○は塩
化亜鉛（比較例２）を、△は炭酸亜鉛（比較例３）を示
す。1 shows the relationship between the pH of an interferon solution and various zinc salts on the interferon content in microcapsules. In the figure, ● indicates zinc acetate (Example 7), ○ indicates zinc chloride (Comparative Example 2), and Δ indicates zinc carbonate (Comparative Example 3).
【図２】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に
及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと酢酸カルシウム
（実施例８）との関係を示す。FIG. 2 shows the relationship between the pH of an interferon solution and calcium acetate (Example 8) on the interferon content in microcapsules.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/52 Ｊ 38/21 47/12 Ｃ 47/34 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/66 Ｈ (72)発明者 山本 一路 奈良県奈良市あやめ池南１丁目７番10− 116号─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication location A61K 9/52 J 38/21 47/12 C 47/34 C A61K 37/66 H (72) Invention Ichirō Yamamoto 1-7-10-116 Ayame Ikenami, Nara City, Nara Prefecture
Claims (16)
ックスに水中で浸透させることを特徴とする徐放性製剤
の製造法。1. A method for producing a sustained-release preparation, which comprises permeating a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix in water.
ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合し
て製造される請求項１記載の徐放性製剤の製造法。2. The method for producing a sustained release preparation according to claim 1, wherein the biodegradable matrix is produced by mixing a biodegradable polymer and a water-soluble metal salt of an aliphatic carboxylic acid.
である請求項２記載の徐放性製剤の製造法。3. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 2, wherein the aliphatic carboxylic acid is an aliphatic monocarboxylic acid.
徐放性製剤の製造法。4. The method for producing a sustained release preparation according to claim 2, wherein the metal salt is a polyvalent metal salt.
ックスに水中で浸透させ、ついで乾燥する請求項１記載
の徐放性製剤の製造法。5. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 1, wherein the water-soluble polypeptide is permeated into a biodegradable matrix in water and then dried.
性製剤の製造法。6. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 5, wherein the drying is freeze-drying.
請求項１記載の徐放性製剤の製造法。7. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 1, wherein the water-soluble polypeptide is a cytokine.
求項７記載の徐放性製剤の製造法。8. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 7, wherein the cytokine is interferon.
る請求項１記載の徐放性製剤の製造法。9. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 1, wherein the biodegradable matrix is in the form of fine particles.
性ポリマーから製造される請求項１記載の徐放性製剤の
製造法。10. The method for producing a sustained release preparation according to claim 1, wherein the biodegradable matrix is produced from a biodegradable polymer.
テルである請求項１０記載の徐放性製剤の製造法。11. The method for producing a sustained release preparation according to claim 10, wherein the biodegradable polymer is an aliphatic polyester.
ルボン酸から誘導される共重合体である請求項１１記載
の徐放性製剤の製造法。12. The method for producing a sustained release preparation according to claim 11, wherein the aliphatic polyester is a copolymer derived from α-hydroxycarboxylic acid.
である請求項１２記載の徐放性製剤の製造法。13. The method for producing a sustained-release preparation according to claim 12, wherein the copolymer is a lactic acid-glycolic acid copolymer.
リックスに浸透させてなる徐放性製剤。14. A sustained-release preparation obtained by permeating a water-soluble polypeptide into a biodegradable matrix.
性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合
して製造される請求項１４記載の徐放性製剤。15. The sustained release preparation according to claim 14, wherein the biodegradable matrix is produced by mixing a biodegradable polymer and a water-soluble metal salt of an aliphatic carboxylic acid.
剤。16. The sustained-release preparation according to claim 14, which is for injection.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15327994A JP3761594B2 (en) | 1993-07-05 | 1994-07-05 | Manufacturing method of sustained-release preparation |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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