JPH08294391A - Fused protein of dihydrofolic acid reductase-antigen polypeptide of chlamydia pneumoniae, dna coding for the same, recombinant vector containing the same dna, transformer containing the same recombinant vector and production of anti-chlamydia pneumoniae antibody - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain the subject protein for producing antibody and antigen for diagnosis, etc., of infection of Chlamydia pneumoniae by binding a dihyrofolic acid reductase having a specific amino acid sequence and an antigen peptide of Chlamydia pneumoniae. CONSTITUTION: This fused protein of dihydrofolic acid reductase-antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae comprises binding a polypeptide B containing contained at least five amino acid sequences into a polypeptide having an amino acid sequence expressed by formula II directly or through amino acid sequence expressed by formula I. The fused protein is useful for production, etc., of anti-Chlamydia pneumoniae antibody and antigen polpypeptides, etc., effectively utilized for producing a diagnostics for Chlamydia pneumoniae infectious diseases. The fused protein is obtained by binding DNA coding for dihydrofolic acid reductase to DNA coding for antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae and expressing the bound DNA in a host.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素
−クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タ
ンパク質、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む
組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換
体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法に
関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・ニュー
モニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用され
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a dihydrofolate reductase-Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide fusion protein, a DNA encoding the same, a recombinant vector containing the DNA, and a transformant containing the recombinant vector. And a method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is effectively used in the pharmaceutical industry, particularly in the manufacture of a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection.

【０００２】[0002]

【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。2. Description of the Related Art As a bacterium belonging to the genus Chlamydia, species (Species) such as Chlamydia trachomatis, Chlamydia sittaci, Chlamydia pneumoniae are known. Chlamydia trachomatis is a causative bacterium that causes trachoma, sexually transmitted lymphogranuloma, genitourinary tract infection, inclusion body conjunctivitis, neonatal pneumonia, etc. Is a causative bacterium of respiratory infections, atypical pneumonia and the like.

【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。The symptoms of respiratory tract infections caused by Chlamydia pneumoniae are similar to those of infections caused by Mycoplasma pneumoniae and influenza viruses, and are therefore easily misdiagnosed. Therefore, development of a simple diagnostic method for Chlamydia pneumoniae has been desired.

【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。Diagnosis of infectious diseases is usually made definite by detecting the presence of causative bacteria at the site of infection or the like, or by detecting the presence of antibodies (against the causative bacteria) in serum or other body fluids. The former is called antigen test, the latter is called antibody test,
Both have important clinical significance, and as an antibody test for Chlamydia pneumoniae, a method of detecting the presence of an antibody using the basic bodies of Chlamydia pneumoniae is known.

【０００５】一方、大腸菌においてタンパク質を大量に
発現させることのできるプラスミドとして、ｐＢＢＫ１
０ＭＭが知られている（特開平４−１１７２８４号公
報）。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、ＤＨＦＲと略す）と抗アレルギー性ペプチドとの融
合タンパク質を発現させることができる。ここで得られ
る融合タンパク質にはＤＨＦＲの酵素活性も保持されて
いるので、融合タンパク質の精製はＤＨＦＲの特性と活
性を利用して容易に行うことがてきる。On the other hand, as a plasmid capable of expressing a large amount of protein in E. coli, pBBK1
0MM is known (Japanese Patent Laid-Open No. 4-117284). This plasmid can express a fusion protein of dihydrofolate reductase (hereinafter abbreviated as DHFR) and an antiallergic peptide. Since the fusion protein obtained here also retains the enzymatic activity of DHFR, the fusion protein can be easily purified by utilizing the characteristics and activity of DHFR.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】しかし、クラミジア属
細菌は培養が困難であり、基本小体を取得するのが容易
ではない。本発明は、クラミジア属細菌を検出するため
の抗原ポリペプチドを大量に合成する技術を提供するこ
とを目的とする。[Problems to be Solved by the Invention] However, it is difficult to culture Chlamydia bacteria and it is not easy to obtain elementary bodies. An object of the present invention is to provide a technique for synthesizing a large amount of an antigen polypeptide for detecting Chlamydia bacteria.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、ク
ラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt１１
ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、
これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア
・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラ
ミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感
染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大
腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλ
ファージを精製し、そのＤＮＡを取得した。そして、遺
伝子組換え技術を利用してこのλファージのＤＮＡと上
述のプラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭから組換えプラスミド
ベクターｐＣＰＮ６０２３を構築し、本発明を完成し
た。[Means for Solving the Problems] First, the present inventors extracted genomic DNA from Chlamydia pneumoniae and partially digested it with a restriction enzyme to obtain the phage vector λgt11.
Insert into DNA to create genomic DNA library,
This was infected with Escherichia coli Y1090r- strain, a colony of infected Escherichia coli expressing the Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide was screened using a Chlamydia pneumoniae-specific monoclonal antibody, and λ phage was extracted from the positively infected E. coli. Repeat the operation λ
The phage was purified and its DNA was obtained. Then, a recombinant plasmid vector pCPN6023 was constructed from the DNA of this λ phage and the above-mentioned plasmid pBBK10MM using a gene recombination technique, and the present invention was completed.

【０００８】すなわち、本発明は、下記（１）〜（１
０）に関するものである。 （１）配列番号１のポリペプチドに、直接又は介在アミ
ノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチドの中の連
続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・
ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質。 （２）ポリペプチドＢが配列番号２のポリペプチドから
アミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプチドであ
る、上記（１）記載の融合タンパク質。 （３）ポリペプチドＢが配列番号２のポリペプチドの中
のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されてい
るポリペプチドである、上記（１）記載の融合タンパク
質。 （４）融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の融合タンパ
ク質。 （５）融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列から
なるポリペプチドである、上記（１）記載の融合タンパ
ク質。 （６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の融合タン
パク質をコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤＮ
Ａ。 （７）上記（６）のＤＮＡを含む組換えベクター。 （８）組換えベクターがｐＣＰＮ６０２３プラスミドで
ある上記（７）記載の組換えベクター。 （９）上記（７）又は上記（８）記載の組換えベクター
を含む形質転換体。 （１０）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の融合タ
ンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。That is, the present invention provides the following (1) to (1
0). (1) Dihydrofolate reductase in which a polypeptide B containing at least 5 consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is bound to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 directly or via an intervening amino acid sequence -Chlamydia
Pneumoniae antigen polypeptide fusion protein. (2) The fusion protein according to (1) above, wherein the polypeptide B is a polypeptide lacking 1 to 320 amino acids from the polypeptide of SEQ ID NO: 2. (3) The fusion protein according to (1) above, wherein the polypeptide B is a polypeptide in which 1 to 100 amino acids in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids. (4) The fusion protein according to (1) above, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. (5) The fusion protein according to (1) above, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. (6) DNA encoding the fusion protein according to any one of (1) to (5) above or DN complementary thereto
A. (7) A recombinant vector containing the DNA of (6) above. (8) The recombinant vector according to (7) above, which is a pCPN6023 plasmid. (9) A transformant containing the recombinant vector according to (7) or (8) above. (10) A method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody, which comprises using the fusion protein according to any one of (1) to (5) above as an antigen.

【０００９】以下、本発明の詳細を、１．形質転換体の
作製、２．融合タンパク質の製造方法、３．得られた融
合タンパク質、４．融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ、及び、５．融合タンパク質を抗原として用いる抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法、の順に説明す
る。The details of the present invention are as follows. Preparation of transformants, 2. 2. Method for producing fusion protein, 3. The resulting fusion protein, 4. DN encoding a fusion protein
A, and 5. The method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody using the fusion protein as an antigen will be described in this order.

【００１０】１．形質転換体の作製 １．１ クラミジア・ニューモニエの培養 培養したＨＬ細胞から細胞浮遊液を調製し、培養上清を
除去した後にクラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
してこれを培養し、遠心分離してクラミジア・ニューモ
ニエ感染ＨＬ細胞を取得する。クラミジア・ニューモニ
エとしては、例えばクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37
巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用でき
る。 １．２ クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離し、クラミジア・ニューモニエの基本小体に相
当するバンドを回収する。[0010] 1. Preparation of transformants 1.1 Cultivation of Chlamydia pneumoniae A cell suspension was prepared from cultivated HL cells, the culture supernatant was removed, and then a suspension of Chlamydia pneumoniae was added to culture and centrifuge. To obtain HL cells infected with Chlamydia pneumoniae. Examples of Chlamydia pneumoniae include Chlamydia pneumoniae YK41
Stocks (Kanamoto et al .: Microbiological Immunology, 37
Volume, 495-498, 1993 (Y. Kanamoto et al., Microbio
l. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993)) can be used. 1.2 Purification of basic bodies of Chlamydia pneumoniae HL cells infected with Chlamydia pneumoniae are disrupted, centrifuged, and the supernatant is recovered. This supernatant is added to a continuous density gradient solution using urographin (made by Schering) and centrifuged to collect a band corresponding to the elementary bodies of Chlamydia pneumoniae.

【００１１】１．３ クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡの調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
（以下、ＴＥ緩衝液という）に懸濁し、１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナ
ーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノー
ルを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さら
にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノー
ル沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤ
ＮＡを取得する。1.3 Preparation of Chlamydia pneumoniae Genomic DNA The basic bodies of Chlamydia pneumoniae were treated with 1 mM ED.
10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing TA
The suspension is suspended in (hereinafter referred to as TE buffer), 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) aqueous solution and 1 mg / ml proteinase K aqueous solution are added and kept warm to dissolve the elementary bodies.
0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) saturated phenol is added, and the mixture is stirred and centrifuged to collect the aqueous layer. Further, RNA degrading enzyme (RNase) treatment, phenol / chloroform / isoamyl alcohol treatment and ethanol precipitation treatment were performed, and Chlamydia pneumoniae genome D
Get NA.

【００１２】１．４ ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの
作製 ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。このＤＮＡ
断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt
11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、
市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλ
gt１１ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ラ
イブラリーを作製する。1.4 Preparation of Genomic DNA Expression Library Genomic DNA was digested with restriction enzymes AccI, HaeIII and Al.
Digested with uI, phenol / chloroform / isoamyl alcohol treatment and ethanol precipitation treatment, partial digestion D
Get NA. A linker, adenosine 5'-triphosphat, was added to the partially digested DNA.
e, hereinafter abbreviated as ATP) and T4 ligase to add a linker to the partially digested DNA. this,
10 mM containing 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA
Chroma Spin 60 with Tris-HCl buffer as mobile phase
It is applied to a 00 (Chroma spin 6000) column, the eluate is collected, and a fraction containing a DNA fragment of 1 kbp to 7 kbp is collected. ATP and T4 polynucleotide kinase are added to the obtained fractions and reacted to phosphorylate the 5'end of the DNA fragment. The reaction solution was treated with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and ethanol, and then 5 ′.
A DNA fragment whose ends are phosphorylated is obtained. This DNA
Λgt that had been previously cleaved with the restriction enzyme EcoRI into the fragment
11DNA, ATP and T4 ligase are added and reacted,
The recombinant λ obtained using a commercially available packaging kit
The gt11 DNA is packaged to create a genomic DNA expression library.

【００１３】１．５ 抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発
現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、
挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質
をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィ
ルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応さ
せ、洗浄し、次いでフィルターを抗クラミジア・ニュー
モニエモノクローナル抗体と反応させる。抗クラミジア
・ニューモニエモノクローナル抗体としては、例えば、
ハイブリドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗
体がある。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダ
ーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応さ
せる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加
して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化
水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノー
ル溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィ
ルターを洗浄し、風乾させる。1.5 D encoding an antigenic polypeptide
Cloning of NA A culture solution of E. coli Y1090r- strain was infected with the genomic DNA expression library, cultured on an agar medium, and immersed in an isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) aqueous solution using a nitrocellulose filter. ,
The protein produced in the cells by the expression of the inserted DNA is attached to the nitrocellulose filter. The filter is blocked with bovine serum albumin, washed, and then the filter is reacted with anti-Chlamydia pneumoniae monoclonal antibody. Examples of anti-Chlamydia pneumoniae monoclonal antibodies include:
There is a monoclonal antibody produced by hybridoma 60A23. After the reaction, the filter is washed and reacted with an anti-mouse IgG antibody labeled with an enzyme such as peroxidase. After the reaction, the filter is washed and a color-developing substrate solution is added to react. As the color-developing substrate solution, for example, a solution containing an aqueous solution of hydrogen peroxide and a methanol solution of 4-chloro-1-naphthol can be used. After the reaction, the filter is washed and air dried.

【００１４】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、抗ク
ラミジア・ニューモニエモノクローナル抗体反応性のク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドを発現するλ
ファージを取得する。A plaque on the agar medium corresponding to the color development spot of the filter is identified, and λ phage contained in the plaque is obtained. The above procedure is repeated until all the plaques have reacted with the above-mentioned monoclonal antibody, the DNA encoding the antigen polypeptide is cloned, and the anti-Chlamydia pneumoniae monoclonal antibody reactive Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide is expressed by λ.
Get the phage.

【００１５】１．６ クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの取得 取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt１１に挿入されたＤ
ＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt
１１・フォワード・プライマー（λgt１１ forward pri
mer）及びλgt11・リバース・プライマー（λgt１１ re
verse primer）（いずれも宝酒造株式会社製）があり、
タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック
・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase）
がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法と
して知られており、詳細は「サムブロック他編集、モレ
キュラー・クローニング 第２版（コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samblook
et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を文
献″モレキュラー・クローニング″という）に記載され
ている。1.6 Acquisition of DNA Encoding Chlamydia pneumoniae Antigen Polypeptide The obtained λ phage is infected with Escherichia coli Y1090r-strain and cultured to produce a large amount of λ phage. DNA is obtained and purified from λ phage using a commercially available kit. A primer, Taq Polymerase (Taq Poly
merase) and deoxynucleotides, heat,
The process of cooling and heat retention was repeated, and D inserted in λgt11
Amplify NA. Examples of the primer include λgt
11 forward primer (λgt11 forward pri
mer) and λgt11 reverse primer (λgt11 re
verse primer) (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)
Examples of tack polymerases include AmpliTaq DNA Polymerase
There is. The general method of this DNA amplification method is known as the PCR method, and the details are described in "Samblock et al., Edited by Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory) (1989)" (J. Samblook).
et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press (1989), hereinafter referred to as the document "Molecular Cloning".

【００１６】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製品)
を使用することができる。また、塩基配列を決定はタッ
クポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクル
シークエンス法で行うことができ、この方法を用いるに
は、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されてい
るキットを使用することができる。また、分析にあって
は市販の機械、例えば３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ
（アプライドバイオシステムズ社）を利用することがで
きる。The amplified DNA is obtained, and the base sequence is determined and analyzed. A commercially available kit can be used to obtain the DNA, for example, Wizard PCR Prep kit (Promega product).
Can be used. The nucleotide sequence can be determined by a fluorescent label terminator cycle sequence method using tack polymerase, and a kit sold by Perkin-Elmer Japan Co. can be used for this method. In the analysis, a commercially available machine, for example, a 373A type DNA sequencer (Applied Biosystems) can be used.

【００１７】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。After the nucleotide sequence is determined, the obtained DNA nucleotide sequence is analyzed by gene sequence analysis software to edit, link, and estimate the amino acid translation region. As the gene sequence analysis software, "DNASIS" (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) can be used. As a result of the analysis, when a full-length gene has not been obtained, DNA before and after the already obtained DNA is obtained by genome walking. To perform genome walking, Takara Shuzo
It is possible to use a kit sold by Co., Ltd.

【００１８】１．７ ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの調
製 ＤＨＦＲをコードするＤＮＡは、そのＤＮＡを含むプラ
スミドベクターから制限酵素を用いてそのＤＮＡを切り
出すか、あるいはそのＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡ
やゲノムＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いて
ＰＣＲ法を行ってそのＤＮＡを増幅することによって取
得する。前者の方法では、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミドベ
クターｐＢＢＫ１０ＭＭや本発明の組換えベクターでも
あるｐＣＰＮ６０２３を利用することができる。ｐＢＢ
Ｋ１０ＭＭを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２
３９４として、また、ｐＣＰＮ６０２３を含む大腸菌は
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９０８として、いずれも工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。こ
れらの大腸菌(プラスミド保持菌)からプラスミドを取得
するには、通常のプラスミドＤＮＡ取得方法に従えば良
く、この方法は文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを用いる
場合は制限酵素としてＢａｍＨＩ及びとＸｈｏＩを使用
し、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出せばよい。1.7 Preparation of DNA Encoding DHFR DNA encoding DHFR can be excised from a plasmid vector containing the DNA using a restriction enzyme, or can be a plasmid DNA containing the DNA.
Alternatively, genomic DNA is used as a template and PCR is performed using appropriate primers to amplify the DNA. In the former method, DNA encoding DHFR
As the plasmid vector containing, for example, the plasmid vector pBBK10MM or pCPN6023 which is the recombinant vector of the present invention can be used. pBB
E. coli containing K10MM has accession number FERM BP-2
Escherichia coli containing 394 and pCPN6023 under the deposit number FERM P-14908 are both deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology. To obtain a plasmid from these Escherichia coli (plasmid-carrying bacteria), an ordinary method for obtaining plasmid DNA may be used, and this method is described in the document "Molecular Cloning". When the plasmid pBBK10MM is used, BamHI and XhoI are used as restriction enzymes, and a DNA fragment of about 4.6 Kbp may be excised.

【００１９】後者の方法では、プラスミドＤＮＡとして
例えば前述のｐＢＢＫ１０ＭＭやｐＣＰＮ６０２３をそ
のまま利用することができ、ゲノムＤＮＡとしては例え
ば枯草菌のゲノムＤＮＡを使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡを取得するには通常のゲノムＤＮＡ取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの５′末端と３′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号５の塩基配列の１番目から２０番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと４６１番目から
４８０番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すること
ができる。In the latter method, for example, the above-mentioned pBBK10MM or pCPN6023 can be used as the plasmid DNA as it is, and the genomic DNA of Bacillus subtilis can be used as the genomic DNA. In order to obtain genomic DNA, a general method for obtaining genomic DNA may be followed, and this method is described in the document "Molecular Cloning". The primers used in the latter method were 5'end and 3'end of DNA encoding DHFR.
It can be designed and synthesized in consideration of the base sequence at the end. For example, an oligonucleotide having a sequence from 1st to 20th of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence from 461st to 480th can be used. These oligonucleotides can be chemically synthesized using a commercially available DNA synthesizer.

【００２０】１．８ ＤＨＦＲ−クラミジア・ニューモ
ニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質
転換体の作製 上記１．６で取得したクラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡと、上記１．７で取得し
たＤＨＦＲをコードするＤＮＡを、市販のキットを使用
して連結する。その際、必要に応じ、リンカーを使用す
る。市販のキットとしては例えば、ＤＮＡライゲーショ
ンキット(宝酒造)を用いることができる。連結によって
得られたＤＮＡが複製起点をもたず、プラスミドとして
は機能しない場合はこのＤＮＡを新たなプラスミドベク
ターに挿入する。この新たなプラスミドベクターとして
は、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等を使用すること
ができる。1.8 D encoding the DHFR-Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide fusion protein
Preparation of Recombinant Vector Containing NA and Preparation of Transformant Containing It The DNA encoding the Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide obtained in 1.6 above and the DNA encoding DHFR obtained in 1.7 above , Using a commercially available kit. At that time, a linker is used if necessary. As a commercially available kit, for example, a DNA ligation kit (Takara Shuzo) can be used. When the DNA obtained by ligation does not have a replication origin and does not function as a plasmid, this DNA is inserted into a new plasmid vector. As this new plasmid vector, for example, pBR322, pUC18 or the like can be used.

【００２１】上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換
体を作製する。大腸菌由来のプラスミドを使用する場合
は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば大
腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主を
コンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ
１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造から
販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質
転換体を作製する方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。得られた形質転換体を培養し
てコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮ
Ａを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル
電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質
転換体を選択する。このようにして作製されたプラスミ
ドベクターとしては、例えばｐＣＰＮ６０２３プラスミ
ドがある。このようにして作製された形質転換体をとし
ては、前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った
大腸菌ＨＢ１０１株がある。The reaction product of the above ligation is put into a host to prepare a transformant. When a plasmid derived from Escherichia coli is used, Escherichia coli can be used as a host, and for example, Escherichia coli HB101 strain can be used. This host is treated so as to become competent cells. E. coli HB
Competent cells obtained by processing 101 strains are sold by Takara Shuzo. A method for producing a transformant by adding the reaction product of the above ligation to a host is described in the document "Molecular Cloning". The resulting transformants were cultured to form colonies, and plasmid DN was used from each colony.
A is obtained, cleaved with the appropriate restriction enzymes and analyzed by agarose gel electrophoresis to select transformants with the desired recombinant plasmid. An example of the plasmid vector produced in this manner is pCPN6023 plasmid. The transformant thus prepared is the Escherichia coli HB101 strain containing the above-mentioned recombinant vector pCPN6023.

【００２２】２．融合タンパク質の製造方法 本発明の融合タンパク質を製造する場合は、形質転換体
の培養、形質転換体の破砕、ストレプトマイシン処理、
硫安沈殿、及びメソトリキセート(以下、ＭＴＸと略す)
結合アフィニティークロマトグラフィー、の各工程を行
う。形質転換体の培養は、その形質転換体が成長しうる
培地でこの融合タンパク質が形質転換体内に十分蓄積さ
れるまで適温で培養器を振とうする。形質転換体として
前述の組換えベクターｐＣＰＮ６０２３が入った大腸菌
ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを含むＬ
Ｂ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、この培養
液をアンピシリン及びトリメトプリムを含むＴＢ培地等
に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する。ＴＢ培
地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニング″
に記載されている。培養した形質転換体を破砕するに
は、遠心分離で形質転換体を集め、緩衝液に懸濁し、こ
れに超音波を照射する。形質転換体が大腸菌の場合は、
上記懸濁液にリゾチームを加え、ＳＤＳを含む緩衝液を
加えることよって菌体を溶菌させてもよい。形質転換体
の破砕後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得
する。この上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、
しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈
殿物として除去し、上清を取得する。この上清をＭＴＸ
−アガロースカラムに流し、融合タンパク質をカラムに
吸着させ、その後葉酸を含む溶出液を利用して融合タン
パク質を溶出する。2. Method for producing fusion protein In the case of producing the fusion protein of the present invention, culture of the transformant, disruption of the transformant, treatment with streptomycin,
Ammonium sulfate precipitation and mesotrixate (hereinafter abbreviated as MTX)
Each step of binding affinity chromatography is performed. The transformant is cultured by shaking the incubator at an appropriate temperature until the fusion protein is sufficiently accumulated in the transformant in a medium in which the transformant can grow. When the E. coli HB101 strain containing the above-mentioned recombinant vector pCPN6023 is used as a transformant, L containing ampicillin is used.
The cells are cultivated with shaking in B medium at 37 ° C. overnight, and then this culture solution is inoculated into TB medium containing ampicillin and trimethoprim and further cultivated with shaking overnight at 37 ° C. For the preparation method of TB medium, refer to the document "Molecular Cloning".
It is described in. In order to disrupt the cultured transformants, the transformants are collected by centrifugation, suspended in a buffer and irradiated with ultrasonic waves. When the transformant is E. coli,
Lysozyme may be added to the above suspension, and the cells may be lysed by adding a buffer containing SDS. After disruption of the transformant, centrifugation is performed to remove cell debris and obtain a supernatant. Streptomycin sulfate was added to this supernatant,
By stirring for a while and centrifuging, the nucleic acid is removed as a precipitate, and the supernatant is obtained. This supernatant is MTX
-Run on an agarose column to adsorb the fusion protein to the column and then elute the fusion protein using an eluate containing folic acid.

【００２３】３．得られた融合タンパク質 本発明の融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチド
に、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２
のポリペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ
酸配列を含むポリペプチドＢが結合したものである。配
列番号１のポリペプチドは融合タンパク質のうち、ＤＨ
ＦＲ部分である。配列番号２のポリペプチドの中の連続
した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポリペプチド
Ｂは、望ましくは２０個以上、より望ましくは１００個
以上、さらに望ましくは２００個以上のアミノ酸からな
るものがよい。ポリペプチドＢとしては、例えば配列番
号２のポリペプチドを使用することができるし、配列番
号２のポリペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落し
ているポリペプチドや配列番号２のポリペプチドの中の
アミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換されている
ポリペプチドを使用することもできる。配列番号２のポ
リペプチドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポ
リペプチドとしては、例えば、配列番号２のポリペプチ
ドの２０３〜４３９番目のアミノ酸配列からなるものが
ある。3. Obtained Fusion Protein The fusion protein of the present invention comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 1 directly or via an intervening amino acid sequence, SEQ ID NO: 2
Polypeptide B containing at least 5 contiguous amino acid sequences among the above polypeptides is bound. Among the fusion proteins, the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is DH
It is the FR part. The polypeptide B containing at least 5 consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is preferably composed of 20 or more, more preferably 100 or more, and further preferably 200 or more amino acids. . As the polypeptide B, for example, the polypeptide of SEQ ID NO: 2 can be used, and among the polypeptide of SEQ ID NO: 2 lacking 1 to 320 amino acids or the polypeptide of SEQ ID NO: 2 It is also possible to use polypeptides in which 1 to 100 amino acids have been replaced by other amino acids. Examples of the polypeptide lacking 1 to 320 amino acids from the polypeptide of SEQ ID NO: 2 include those having the amino acid sequence of 203 to 439 of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, for example.

【００２４】配列番号２のポリペプチドの中のアミノ酸
１〜１００個が他のアミノ酸で置換されているポリペプ
チドとしては、配列番号２のポリペプチドの中の任意の
箇所のアミノ酸を類似の性質をもつ他のアミノ酸に置換
したポリペプチドがあり、例えば、配列番号２のポリペ
プチドの５４４番目のアミノ酸であるチロシンがフェニ
ルアラニンに置換されたポリペプチドがある。As a polypeptide in which 1 to 100 amino acids in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids, amino acids at arbitrary positions in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 have similar properties. There is a polypeptide in which another amino acid is substituted, for example, a polypeptide in which tyrosine which is the 544th amino acid in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is substituted with phenylalanine.

【００２５】ポリペプチドＢとしては、例えば、配列番
号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが使用でき
る。また、ポリペプチドＢとしては、配列番号２のポリ
ペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列
を含むポリペプチドに、１〜２０個のアミノ酸が結合し
たものも含まれる。このようなポリペプチドＢとして
は、例えば、配列番号２のポリペプチドの２０３〜４３
９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末端
に、リジン−グリシン−フェニルアラニン−グルタミン
酸−ロイシン−プロリン−トリプトファン−グリシン−
プロリン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギンから
なるポリペプチドが付加したポリペプチドがある。介在
アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ロイシ
ン、ロイシン−メチオニンからなるアミノ酸配列、グル
タミン−フェニルアラニン−グルタミン酸−プロリン−
ロイシン−アルギニン−グルタミン酸−グリシン−バリ
ン−アルギニンからなるアミノ酸配列等がある。As the polypeptide B, for example, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be used. The polypeptide B also includes a polypeptide having at least 5 consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 to which 1 to 20 amino acids are bound. Examples of such a polypeptide B include, for example, 203 to 43 of the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
At the C-terminal of the polypeptide consisting of the 9th amino acid sequence, lysine-glycine-phenylalanine-glutamic acid-leucine-proline-tryptophan-glycine-
There is a polypeptide to which a polypeptide consisting of proline-leucine-isoleucine-asparagine has been added. The intervening amino acid sequence is not particularly limited, and examples thereof include an amino acid sequence consisting of leucine and leucine-methionine, glutamine-phenylalanine-glutamic acid-proline-
There is an amino acid sequence consisting of leucine-arginine-glutamic acid-glycine-valine-arginine and the like.

【００２６】本発明の融合タンパク質の具体例として
は、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドや
配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあ
る。上記融合タンパク質の中では、配列番号３のアミノ
酸配列からなるポリペプチドが望ましい。Specific examples of the fusion protein of the present invention include a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Among the above fusion proteins, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is desirable.

【００２７】４．融合タンパク質をコードするＤＮＡ 融合タンパク質をコードするＤＮＡは、融合タンパク質
のアミノ酸配列に対応する遺伝暗号から構成される種々
のものが利用できる。4. DNA encoding the fusion protein As the DNA encoding the fusion protein, various DNAs having a genetic code corresponding to the amino acid sequence of the fusion protein can be used.

【００２８】５．融合タンパク質を抗原として用いる抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法 クラミジア・ニューモニエ抗体を製造するには、本発明
の融合タンパク質を抗原としてマウスを免疫し、そのひ
臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを作
製し、その中からクラミジア・ニューモニエの５３ＫＤ
ａの抗原ポリペプチドを認識するハイブリドーマを選択
し、これを培養することによって得ることができる。骨
髄腫細胞株としては、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）やＰ３／ＮＳＩ／１−
Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）を使用すること
ができる。抗原として本発明の融合タンパク質を使用す
ること以外は、マウスを免疫して抗体を得る公知の一般
的手法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗体を製造
する。5. Method for producing anti-Chlamydia pneumoniae antibody using fusion protein as an antigen To produce a Chlamydia pneumoniae antibody, a fusion protein of the present invention is used as an antigen to immunize a mouse, and its spleen cells are fused with a myeloma cell line to form a hybridoma. And make 53KD of Chlamydia pneumoniae
It can be obtained by selecting a hybridoma that recognizes the antigen polypeptide of a and culturing it. Examples of myeloma cell lines include P3X63Ag8.653
(ATCC CRL-1580) and P3 / NSI / 1-
Ag4-1 (ATCC TIB-18) can be used. An anti-Chlamydia pneumoniae antibody is produced according to a known general method of immunizing a mouse to obtain an antibody, except that the fusion protein of the present invention is used as an antigen.

【００２９】[0029]

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

【００３０】実施例１ クラミジア・ニューモニエ６０
Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという）マグネシウム不含（−）液５
mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢ
Ｓを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨
てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペ
ッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調
製した。Example 1 Chlamydia pneumoniae 60
Preparation of DNA Encoding K Antigen Polypeptide (A) Culturing of Host Cell (HL Cell) HL cells grown in advance on the bottom surface of a plastic culture flask (75 cm ² ) were phosphate buffered saline (hereinafter , PBS) magnesium-free (-) liquid 5
PB containing 0.1% (w / v) trypsin after washing with ml
After adding 5 ml of S to the whole cell surface and discarding the liquid, it was incubated at 37 ° C for 10 minutes, 5 ml of Dulbecco's MEM medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum was added, and HL cells were pipetted. Was peeled off to prepare a cell suspension.

【００３１】７５cm²のプラスチック製培養フラスコで
培養するときは、培養フラスコに上記細胞浮遊液１ml及
び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培
地１５〜２０mlを加え、また、６ウェルプラスチック製
培養容器で培養するときは、上記細胞浮遊液８mlと１０
％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混
合液４mlずつを各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
ス雰囲気下で培養した。When culturing in a 75 cm ² plastic culture flask, 1 ml of the above cell suspension and 15-20 ml of Dulbecco's MEM medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum were added to the culture flask, and 6-well plastic was used. When culturing in a culture vessel, make 8 ml and 10 ml of the above cell suspension.
4 ml of a mixed solution with 292 ml of Dulbecco's MEM medium containing% fetal bovine serum was added to each well, and the cells were cultured in a 5% (v / v) carbon dioxide atmosphere.

【００３２】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエ ＹＫ４
１の培養 ６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖した
ＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これに前述
のクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株の浮遊液〔クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１保存液を、１リットルあ
たり庶糖７５ｇ、リン酸一カリウム０．５２ｇ、リン酸
二カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを含
む水溶液（以下、ＳＰＧという）で１２ないし２４倍に
希釈し、超音波で１分間処理し、２，０００rpmで３分
間遠心分離した上清〕を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した
（以下、これをクラミジア・ニューモニエＹＫ４１保存
液という）。(B) Chlamydia pneumoniae YK4
Cultivation of 1 The culture supernatant of HL cells grown in a 6-well plastic culture container (on the bottom) was removed with a pipette, and 1 liter of the suspension of the Chlamydia pneumoniae YK41 strain described above [Chlamydia pneumoniae YK41 stock solution was Dilute 12 to 24 times with an aqueous solution (hereinafter referred to as SPG) containing 75 g of sucrose, 0.52 g of monopotassium phosphate, 1.22 g of dipotassium phosphate and 0.72 g of glutamic acid, and treat with ultrasonic waves for 1 minute, 2 ml per well] of the supernatant obtained by centrifugation at 2,000 rpm for 3 minutes,
Centrifugal adsorption was performed at 2,000 rpm for 1 hour. After centrifugal adsorption, remove Chlamydia pneumoniae suspension, and 1 μg / ml
Add 4 ml of Dulbecco's MEM medium containing cycloheximide and 10% (v / v) fetal bovine serum to each well, and add 5%.
(V / v) Culture was carried out at 36 ° C. for 3 days in a carbon dioxide atmosphere. After culturing, the cells were peeled off with a sterilized silicon piece, and the cells were collected. This was centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes, the precipitate was resuspended in SPG, and stored at -70 ° C (hereinafter, referred to as Chlamydia pneumoniae YK41 stock solution).

【００３３】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１
の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０
分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに
懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操
作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。(C) Chlamydia pneumoniae YK41
Purification of elementary bodies of Chlamydia pneumoniae Y stored at -70 ° C
The K41-infected frozen HL cell suspension was thawed and homogenized with a Teflon homogenizer. 10 at 2,500 rpm
Centrifuged for minutes and the supernatant was collected. The precipitate was suspended in SPG again and the same operation was performed to collect the supernatant. The same operation was performed twice more, and the obtained supernatants were collected and combined.

【００３４】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧを加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離
した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧに懸濁した。遠心分離
管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と
０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％か
ら５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度
勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rp
mで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ Ｙ
Ｋ４１の基本小体に相当するバンドを回収し、これをＳ
ＰＧで２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分
離した。得られた沈殿をＳＰＧに懸濁し、タンパク質濃
度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用
い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保
存した。Separately, 0.03 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.4) containing 50% (w / v) sucrose in a centrifuge tube, and then 3 volumes of urographine 76% (Schering Co.) and 0.03 M Tris. -A mixed solution with 7 volumes of hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was overlaid, and the supernatant previously collected was carefully overlaid thereon and centrifuged at 8,000 rpm for 1 hour. Fifty
A 0.03 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) layer containing 0.1% (w / v) sucrose and a precipitate were collected, and SPG of the same volume was added to the collected liquid, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes. The supernatant was discarded and the precipitate was suspended in SPG. In a centrifuge tube, a continuous density gradient liquid of urographine 76% (made by Schering) and 0.03M Tris-HCl buffer (pH 7.4) from 35% to 50% (volume ratio of the former to the total amount) was prepared. Then, the suspension is layered on this, and
Centrifuge at m for 1 hour. Chlamydia pneumoniae Y
The band corresponding to the basic body of K41 was collected and was collected as S
It was diluted 2-fold with PG and centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes. The obtained precipitate was suspended in SPG, the protein concentration was measured (using a protein measurement kit manufactured by Bio-Rad, using bovine serum albumin as a standard), and then stored at -70 ° C.

【００３５】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという）３００μｌを加え、ボルテックスミキサー
でよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分
離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。(D) Chlamydia pneumoniae YK-4
Preparation of genomic DNA of 1 strain 300 μl of suspension of elementary bodies of the above purified Chlamydia pneumoniae YK-41 strain (protein concentration: 1.37 mg
/ ml) was centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 5 minutes.
The precipitate was suspended by adding 500 μl of 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer pH 8.0 (hereinafter referred to as TE buffer) containing 1 mM EDTA. Repeat the same centrifugation again to precipitate 3 times.
Suspended in 00 μl TE buffer. 1% SDS aqueous solution 3
0 μl and 30 μl of 1 mg / ml proteinase K aqueous solution were added and incubated at 56 ° C. for 30 minutes to dissolve the elementary bodies. 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)
350 μl of saturated phenol was added, mixed well with a vortex mixer, and then centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 5 minutes to recover an aqueous layer (extraction of DNA). This extraction operation was repeated once again. Add 2 μl of 10 mg / ml RNase solution and incubate at 37 ℃ for 2 hours.
A was disassembled. 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.
0) 25: 24: 1 (volume ratio) mixture of saturated phenol, chloroform and isoamyl alcohol (hereinafter referred to as P
300 μl of CI) was added, mixed well with a vortex mixer, and centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 5 minutes to collect an aqueous layer. This operation was repeated 5 times in total.

【００３６】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させたのち、４℃、１２，００
０rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール
水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈
管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥さ
せ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に
保存した。To the obtained solution, 1/10 volume of 10 M ammonium acetate aqueous solution and 2 volumes of ethanol were added and allowed to stand for 5 minutes to precipitate DNA, and then at 4 ° C. for 12,000.
Centrifuge at 0 rpm for 5 minutes. For precipitation, 600 μl of 70% ethanol aqueous solution was added and mixed, and the mixture was mixed at 4 ° C. for 12,000.
The washing with centrifugation at rpm for 5 minutes was repeated twice. The precipitate was left to stand for 15 minutes with the lid of the centrifuge tube open, to dry the precipitate, and 200 μl of TE was added to dissolve the precipitate, which was stored at -20 ° C.

【００３７】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製 ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。(E) Preparation of genomic DNA expression library M-buffer 1 for restriction enzyme was added to 100 μl of genomic DNA solution.
0 μl, restriction enzyme mixture (AccI, HaeIII and 1
10 μl of 0.4 μl each of AluI diluted with 50/50 and 20 μl of TE were mixed), and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. It should be noted that the reaction time of the above 20 minutes is 1 kbp to 7 k for DNA.
Pre-tested with a small amount of genomic DNA at the time it was degraded to partially digested DNA of bp size. 100 μl of PCI was added to the above reaction solution, mixed well with a vortex mixer, and centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 5 minutes to collect an aqueous layer. To this, 10μ of 3M sodium acetate solution
1 and 220 μl of ethanol were added and the mixture was allowed to stand at −80 ° C. for 15 minutes to precipitate a partially digested DNA. 4 ° C, 12,
After centrifuging at 000 rpm for 5 minutes and discarding the supernatant,
To the precipitate, 500 μl of 70% aqueous ethanol solution was added and mixed, and the mixture was again centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and the precipitate was dried under reduced pressure.

【００３８】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。20 μl of purified water was added to the partially digested DNA obtained.
19 μl of the linker (14 μl) of linker (20 pmole / μl) shown in the following chemical formula 1 and 10 mM AT
P 4.5 μl, 50 mM MgCl ₂ , 50 mM dithiothreitol and 500 μg / ml bovine serum albumin-containing 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.6, hereinafter referred to as 10-fold concentration ligation buffer) 4.5 μl, purified water 2 μl and 1 μl of T4 ligase were added and reacted at 16 ° C. for 4 hours to add a linker.

【化１】 Embedded image

【００３９】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ Ａ
ＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という）２０μ
ｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、
３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン
酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた
後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層
を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３
Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００
μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離
し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶
かした。The partially digested DNA to which a linker has been added,
It was applied to a Chroma spin 6000 column having a mobile phase of 10 mM Tris-HCl buffer containing 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA. Two drops of the eluate were collected, and a part of each fraction was analyzed by 0.8% agarose gel electrophoresis to obtain 1 kbp.
A fraction containing a 7 kbp DNA fragment was collected from. To the obtained fraction 144 μl, purified water 13 μl, 10 mM A
TP 20 μl, 0.1 M MgCl ₂ , 50 mM dithiothreitol, 1 mM spermidine hydrochloride and 1 mM
0.5M Tris-HCl buffer containing EDTA (pH 7.6,
Hereinafter referred to as 10 times concentration phosphorylation reaction buffer) 20μ
1 and 3 μl of T4 polynucleotide kinase,
The reaction was carried out at 37 ° C for 30 minutes to phosphorylate the 5'end of the DNA fragment. After adding 200 μl of PCI and shaking well, the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm for 5 minutes to collect the aqueous layer. 20 mg / ml glycogen aqueous solution 1 μl, 3
20 μl of M sodium acetate aqueous solution and ethanol 400
μl was added to precipitate nucleotides. 4 ° C, 12,
The mixture was centrifuged at 000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, 200 μl of 70% ethanol was added to the precipitate and mixed, the mixture was centrifuged again, the supernatant was discarded, the precipitate was air dried, and 1 μl of purified water was added to dissolve it.

【００４０】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt１１ ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタ
ジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲー
ション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μ
ｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、
４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapac
k）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）
を用い、得られた組換えλgt１１ＤＮＡをパッケージン
グした。0.6 μl of this solution was previously added with the restriction enzyme Eco.
Λgt11 DNA cleaved with RI (1 μg / μl, Stratagene) 1 μl, 10-fold concentration ligation buffer 0.5 μl, 10 mM ATP 0.5 μ
1, 0.4 μl of T4 ligase and 2 μl of purified water were added,
The reaction was carried out at 4 ° C overnight. Then, Gigapac
k) II Gold packaging kit (Stratagene)
The obtained recombinant λgt11 DNA was packaged using.

【００４１】（Ｆ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング 大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養したのち、これを２，０００rp
mで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt１１（ＤＮＡライブラ
リー）懸濁液を０．１〜１０μｌ加え、３７℃で２０分
間インキューベートし、大腸菌にλgt１１を感染させ
た。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５ml
に、上記λgt１１感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ
寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２
℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１
０ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフ
ィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で
１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に
３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィル
ターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び
０．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗
浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。(F) DN encoding the antigen polypeptide
Cloning of A. One platinum loop of E. coli Y1090r- strain was treated with 10 mM MgS.
LB (containing 5 g of NaCl, 10 g of polypeptone and 5 g of yeast extract in 1 L of water) containing 3 ml of O ₄ , 0.2% maltose and 50 μg / ml ampicillin was inoculated into a medium,
After culturing with shaking at 37 ° C overnight, this was 2,000 rp.
Centrifuge at m for 10 minutes. 10 mM for precipitation (E. coli)
9 ml of an aqueous MgSO ₄ solution was added and mixed, 0.35 ml of this E. coli suspension was taken, 0.1 to 10 μl of a λgt11 (DNA library) suspension was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 20 minutes, E. coli was infected with λgt11. 2.5 ml of liquid LB agar medium pre-heated to 47 ℃
To the above, λgt11-infected E. coli was added, and this was immediately added to LB.
Spread on agar medium. 42 after the upper agar medium has solidified
Incubate at ℃ for 3-4 hours, and 1 when plaque is observed.
A nitrocellulose filter (φ82 mm) immersed in a 0 mM IPTG aqueous solution was placed on the upper layer agar medium and cultured at 37 ° C. for 12 hours. After asymmetrically puncturing the needle with black ink at three points to mark the filter, the filter was removed from the agar medium, and 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20 was added. (Hereinafter, referred to as TTBS buffer solution) was washed 3 times. The agar medium was stored in the refrigerator.

【００４２】フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５〜１０μg/mlの抗クラミジア・ニューモニエ
モノクローナル抗体（６０Ａ２３）のＴＴＢＳ溶液に浸
し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５
０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）
中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ
緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発
色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水
溶液６０μｌと０．３％ ４−クロロ−１−ナフトール
のメタノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温
で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルター
をとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。Filter containing 150 mM NaCl 2
0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) (hereinafter TBS
It was immersed in a 0.1% bovine serum albumin-containing solution (referred to as a buffer) and shaken at 37 ° C. for 1 hour to carry out a blocking reaction. Then, the filter was washed twice with TTBS buffer, and then immersed in a TTBS solution of 5 to 10 μg / ml of anti-Chlamydia pneumoniae monoclonal antibody (60A23) and shaken at 37 ° C. for 1 hour. Filter TTBS
After washing three times with buffer, the peroxidase-labeled (5
0ng / ml) anti-mouse IgG antibody solution (TTBS buffer)
Shake at 37 ° C for 1 hour. Filter TTBS
After washing three times with a buffer solution and three times with a TBS buffer solution, a chromogenic substrate solution (60 ml of a 30% hydrogen peroxide aqueous solution and 20 ml of a methanol solution of 0.3% 4-chloro-1-naphthol in 100 ml of the TBS buffer solution). In addition, it was dipped in (prepared) and left at room temperature for about 30 minutes. When the color was sufficiently developed, the filter was taken out, washed with purified water and air-dried.

【００４３】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、抗クラミジア・ニュ
ーモニエモノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドを発現するλファージが得ら
れ、これを６０−２Ｓλファージと命名した。Plaques on the agar medium corresponding to the color development spots on the filter were searched and identified, and the agar in this portion was pierced with a Pasteur pipette to recover the plaques. The recovered plaque was 0.1M with 1 drop of chloroform added.
It was taken in 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) (hereinafter referred to as SM buffer) containing NaCl, 8 mM magnesium sulfate and 0.01% gelatin, and left overnight at 4 ° C. to extract λ phage in the plaque. . The above procedure was repeated until the plaques were all reacted with the above monoclonal antibody, and the DNA encoding the antigen polypeptide was cloned. Thus, a λ phage expressing an anti-Chlamydia pneumoniae monoclonal antibody-reactive Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide was obtained, which was designated as 60-2Sλ phage.

【００４４】（Ｇ）６０−２Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製 前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５〜１０μｌを加え、３７℃で２０
分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３
７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬ
Ｂ培地５０ｍｌに接種し、λファージによる大腸菌の溶
菌が起こるまで３７℃で５〜７時間振とう培養した。２
５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０
分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁
液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard λ preps キッ
ト（プロメガ社）を用いて精製した。(G) Cultivation of 60-2Sλ phage and DN
A Purification The plaques were formed in the same manner as described in (F) above, one plaque was collected, placed in 100 μl of SM buffer and left at 4 ° C. overnight to extract λ phage. LB
E. coli Y1090r-strain 250μ cultured overnight in culture medium
Add 5-10 μl of λ phage solution to 1 and add 20 at 37 ° C.
After allowing to stand for a minute, E. coli was infected with λ phage. 3 in advance
L containing 10 mM magnesium sulfate warmed to 7 ° C
B culture medium (50 ml) was inoculated and shake-cultured at 37 ° C. for 5 to 7 hours until lysis of Escherichia coli by λ phage occurred. Two
Add 50 μl of chloroform and add 10 at 3,000 rpm.
Centrifugation was performed to remove E. coli cell debris to obtain a λ phage suspension. The λ phage DNA was purified using the Wizard λ preps kit (Promega).

【００４５】（Ｈ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅 ６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度 反応用緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μ
ｌ、２０ｎＭ λgt１１ forward primer（宝酒造株式
会社）１μｌ、２０ｎＭ λgt１１ reverse primer
（宝酒造株式会社）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase
０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２〜３滴重層し
た。９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７３℃ ２分の
サイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡ
を増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル
電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社）で精製した。(H) Amplification of DNA encoding Chlamydia pneumoniae antigen polypeptide In a microtube for 600 μl, purified water (61.5 μm) was added.
1, 10-fold concentration reaction buffer (500 mM KCl,
Tris-HCl buffer containing 15 mM MgCl ₂ , 0.01% gelatin, pH 8.3) 10 μl, 20 mM dNT
P 1 μl, 53-3Sλ phage DNA solution 0.1 μ
1, 20 nM λgt11 forward primer (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 μl, 20 nM λgt11 reverse primer
(Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 μl, AmpliTaq DNA Polymerase
0.5 μl was added and a few drops of mineral oil were overlaid. Incubation of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 73 ° C for 2 minutes was repeated 30 times,
Was amplified. After the reaction, perform 1.2% low temperature melting agarose gel electrophoresis and cut out the amplified DNA,
d Purified with PCR Prep Kit (Promega).

【００４６】（Ｉ）ＤＮＡ塩基配列分析 ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフ
トウェアエンジニアリング社）を用いて、編集、連結、
アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。(I) DNA Nucleotide Sequence Analysis The DNA nucleotide sequence analysis is carried out by using a DNA amplified by PCR as a template and performing a sequencing reaction by a fluorescent labeled terminator cycle sequence method using Taq DNA polymerase to obtain a 373A type DNA sequencer (Applied Bio Systems). The obtained DNA base sequence was edited, ligated, and edited using gene sequence analysis software "DNASIS" (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.).
The amino acid translation region was estimated.

【００４７】実施例２ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドの
融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクタ
ーの作製、及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを制限酵素ＢａｍＨＩとＸ
ｈｏＩで切断し、１．２％低温融解アガロースゲル電気
泳動を行い、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出して
精製した。これに、配列番号６及び配列番号７のＤＮＡ
断片を添加し、プラスミドｐＡＤＡ４３１を構築した。
一方、６０−２ＳλファージＤＮＡを制限酵素EcoRIで
切断し、これに、プラスミドｐＡＤＡ４３１の制限酵素
ＭｕｎＩ消化物を添加し、ライゲーションして、組換え
プラスミドベクターをｐＣＰＮ６０２３を構築した。こ
のプラスミドベクターは、ＤＨＦＲのＣ末端に介在配列
を介してクラミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポ
リペプチド（熱ショックタンパク質）の一部を含むポリ
ペプチドを連結した融合タンパク質を発現させるもので
ある。この融合タンパク質の推定アミノ酸配列はを配列
番号４のようになっていた。Example 2 Construction of Recombinant Vector Containing DNA Encoding Fusion Protein of DHFR and Polypeptide Containing Part of Chlamydia pneumoniae Antigen Polypeptide and Construction of Transformant Containing it Plasmid pBBK10MM is restricted Enzymes BamHI and X
It was cleaved with hoI, subjected to 1.2% low temperature melting agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 4.6 Kbp was cut out and purified. In addition to this, DNAs of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7
The fragment was added to construct plasmid pADA431.
On the other hand, the 60-2Sλ phage DNA was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, and the digested product of the restriction enzyme MunI of the plasmid pADA431 was added thereto and ligated to construct a recombinant plasmid vector pCPN6023. This plasmid vector expresses a fusion protein in which a polypeptide containing a part of the Chlamydia pneumoniae 60KDa antigen polypeptide (heat shock protein) is linked to the C-terminus of DHFR via an intervening sequence. The deduced amino acid sequence of this fusion protein was as shown in SEQ ID NO: 4.

【００４８】実施例３ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認 プラスミドｐＣＰＮ６０２３を保持する大腸菌ＨＢ１０
１株１白金耳を５０mg/lのアンピシリンを含むＬＢ培地
３mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地１０μｌに１０μｌのローディング緩衝液
（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％メルカプ
トエタノール、２０％グリセロール、５％ＳＤＳを含む
０．１５６Ｍトリス塩酸緩衝液、pH６．８）を加え、８
０℃で５分間加熱した後、反応液を５−２０％ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、１０％メタノー
ル、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．３Ｍ
トリス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、
０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２５ｍＭトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、０．
０５％ドデシル硫酸ナトリウム、４０ｍＭアミノカプロ
ン酸を含む２５ｍＭトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜１枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、４０ｍＭアミノカプロン酸を含む２５ｍＭト
リス水溶液で湿らせたろ紙２枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして２．５mA/cm²の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
０．１％牛血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液に入れ、
室温で１時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、ハイブ
リドーマ６０Ａ２３が生産するモノクローナル抗体溶液
（５〜１０μg/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で３７℃、１
時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体溶液（５０ng/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で
３７℃1時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（１００mlのTB
S緩衝液に６０μｌの３０％過酸化水素水溶液と２０ml
の４−クロロ−１−ナフトール メタノール溶液を混合
する）に入れ、室温で３０分間反応させた。ニトロセル
ロース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。こ
の結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発色
したバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ６０２３を
もつ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエに反応するモ
ノクローナル抗体と反応することのできる６０ＫＤａ抗
原を発現していることが示された。Example 3 Confirmation of Fusion Protein of DHFR and Polypeptide Containing Part of Chlamydia pneumoniae 53KDa Antigen Polypeptide Escherichia coli HB10 carrying plasmid pCPN6023
One platinum loop of each strain was inoculated into 3 ml of LB medium containing 50 mg / l of ampicillin, and shake-cultured overnight at 37 ° C. 10 μl of a loading buffer solution (0.01% bromophenol blue, 10% mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.156 M Tris-HCl buffer solution containing 5% SDS, pH 6.8) was added to 10 μl of the medium containing this E. coli, 8
After heating at 0 ° C. for 5 minutes, the reaction solution was subjected to 5-20% polyacrylamide gradient gel electrophoresis. 0.3M containing 10% methanol and 0.05% sodium dodecyl sulfate on the anode plate of the semi-dry blotting apparatus.
One piece of filter paper moistened with Tris solution, 10% methanol,
A piece of filter paper moistened with a 25 mM Tris aqueous solution containing 0.05% sodium dodecyl sulfate, 10% methanol, 0.1%.
1 sheet of nitrocellulose membrane moistened with a 25 mM Tris aqueous solution containing 05% sodium dodecyl sulfate and 40 mM aminocaproic acid, polyacrylamide gel after the above electrophoresis, and 2 sheets of filter paper moistened with a 25 mM Tris aqueous solution containing 40 mM aminocaproic acid. In this order, the cathode plates were set and a current was passed at a current density of ^2.5 mA / cm ² for 1 hour to transfer the protein in the polyacrylamide gel to the nitrocellulose membrane. Put this nitrocellulose membrane in TBS buffer containing 0.1% bovine serum albumin,
It was left standing for 1 hour or more at room temperature to perform blocking. The nitrocellulose membrane was washed twice with TTBS buffer and then at 37 ° C. in a monoclonal antibody solution produced by hybridoma 60A23 (in 5 to 10 μg / ml TTBS buffer) at 1 ° C.
Shake for time. The nitrocellulose membrane was washed 3 times with TTBS buffer, and then shaken in a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody solution (in 50 ng / ml TTBS buffer) at 37 ° C. for 1 hour. Nitrocellulose membrane TTB
After washing 3 times with S buffer, chromogenic substrate solution (100 ml TB
20 ml of 60 μl 30% hydrogen peroxide solution in S buffer
4-chloro-1-naphthol methanol solution was mixed) and reacted at room temperature for 30 minutes. The nitrocellulose membrane was taken out, washed with purified water and air dried. As a result, a colored band was observed at a position corresponding to the size of the fusion protein, and Escherichia coli having the plasmid pCPN6023 expresses the 60 KDa antigen capable of reacting with the monoclonal antibody reactive with Chlamydia pneumoniae. Was shown.

【００４９】実施例４ クラミジア・ニューモニエの６
０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得 プラスミドｐＣＰＮ６０２３と前述のλgt１１のＤＮＡ
ライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行い、クラ
ミジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全
体をコードするＤＮＡを取得する。このＤＮＡにコード
されているアミノ酸配列は配列刃番号２のようになって
いる。Example 4 Chlamydia pneumoniae 6
Acquisition of DNA encoding the entire 0KDa antigen polypeptide Plasmid pCPN6023 and DNA of λgt11 described above
Genome walking is performed using the library to obtain the DNA encoding the entire 60 KDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae. The amino acid sequence encoded by this DNA is as shown in Sequence No. 2.

【００５０】実施例５ ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、
及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭと前記クラミジア・ニュー
モニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードする
ＤＮＡを用い、実施例２と同様にしてＤＨＦＲとクラミ
ジア・ニューモニエの６０ＫＤａ抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質のアミノ酸配列はを配列番号３のようになってい
る。Example 5 Construction of recombinant vector containing DNA encoding fusion protein of DHFR and whole Chlamydia pneumoniae 60 KDa antigen polypeptide,
And the production of a transformant containing the same. Using the plasmid pBBK10MM and the DNA encoding the entire 60 KDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae, a fusion protein of DHFR and the entire 60 KDa antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae was prepared in the same manner as in Example 2. A recombinant vector containing a DNA encoding the above and a transformant containing the recombinant vector are prepared. The amino acid sequence of this fusion protein is shown in SEQ ID NO: 3.

【００５１】実施例６ 融合タンパク質を抗原として用
いる、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造 （Ａ）骨髄腫細胞株の培養及び継代 骨髄腫細胞株はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８０）を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニ
ン、０．５μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去
剤、大日本製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後
の１週間は通常の培地で培養する。Example 6 Production of anti-Chlamydia pneumoniae antibody using fusion protein as antigen (A) Culture and passage of myeloma cell line Myeloma cell line was P3X63Ag8.653 (ATCC
CRL-1580) is cultured in RPMI1640 medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum and subcultured. Two weeks before cell fusion, 0.13 mM 8-azaguanine, 0.5 μg / ml MC-210 (mycoplasma remover, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10% (v / v) fetal bovine serum were used. The cells are cultured for 1 week in RPMI1640 medium containing the above, and then for 1 week thereafter in a normal medium.

【００５２】（Ｂ）マウスの免疫 タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心
分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁す
る。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマ
ウスの背中の皮下に注射する（この日を０日目とす
る）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質
の濃度が２７０μg/mlの上記融合タンパク質の懸濁液１
００μｌをマウスの腹腔内に注射し、更に、６９日目に
タンパク質の濃度が８００μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌをマ
ウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取り出し、細
胞融合に供する。(B) Immunization of Mouse 200 μl of the above-mentioned fusion protein suspension having a protein concentration of 270 μg / ml was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and 200 μl of PBS was added to the precipitate to resuspend it. To this, 200 μl of Freund's complete adjuvant is added to make an emulsion, and 150 μl of the emulsion is subcutaneously injected into the back of the mouse (this day is designated as day 0). Suspension 1 of the above fusion protein having a protein concentration of 270 μg / ml on the 14th, 34th and 49th days
00 μl was intraperitoneally injected into a mouse, and further, on day 69, 50 μl of a suspension of the above fusion protein having a protein concentration of 800 μg / ml, and on day 92, 100 μl of the same suspension was intraperitoneally injected into a mouse. On day 95, the spleen is removed and subjected to cell fusion.

【００５３】（Ｃ）細胞融合 上記脾臓から得られる脾細胞１０⁸個に対して骨髄腫細
胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め３７℃に保温してある３０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置する。７００rp
mで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０m
lを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるように
ガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００rpmで５
分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlのＨ
ＡＴ培地を加え、５分間放置する。更に１０〜２０mlの
ＨＡＴ培地を加え、３０分間放置し、骨髄腫細胞濃度が
３．３×１０⁵/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細胞
を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプラ
スチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注する。５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日
後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２
滴加える。[0053] The myeloma cells 10 ⁷ taken in a round bottom glass tube, mixed well (C) with respect to splenocytes ⁸ obtained from cell fusion the spleen,
Centrifuge at 1400 rpm for 5 minutes, remove the supernatant and mix the cells better. 30% pre-insulated at 37 ℃
(W / v) RPMI16 containing polyethylene glycol
Add 0.4 ml of 40 medium and let stand for 30 seconds. 700rp
After centrifugation at m for 6 minutes, RPMI1640 medium 10m
Add 1 l, slowly rotate the glass tube so that the polyethylene glycol is mixed well, and spin at 1400 rpm for 5
Centrifuge for minutes, remove the supernatant completely, and add 5 ml of H to the precipitate.
Add AT medium and let stand for 5 minutes. Add 10 to 20 ml of HAT medium, leave it for 30 minutes, add HAT medium to a myeloma cell concentration of 3.3 × 10 ⁵ / ml, suspend the cells, and use a Pasteur pipette to 96 wells. Dispense 2 drops into each well of a plastic culture vessel. 5%
(V / v) Culturing at 36 ° C. in a carbon dioxide atmosphere, and after 1 day, 7 days, and 14 days, 1 to 2 HAT medium was added to the wells.
Add drops.

【００５４】（Ｄ）抗体生産細胞のスクリーニング 上記融合タンパク質をタンパク質濃度が１〜１０μg/ml
となるように０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ソーダ含有
０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に懸濁し、
０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩
衝液（pH９．６）に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が１〜１０μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μ
ｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０
を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェ
ルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１０
０μｌを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ
加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツ
ィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに
２５ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置する。０．０
２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回
洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μ
ｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、
９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製
培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２mlを加え、同様に培
養する。(D) Screening of antibody-producing cells The above fusion protein has a protein concentration of 1 to 10 μg / ml.
Suspended in 0.05M sodium bicarbonate buffer (pH 9.6) containing 0.02% (w / v) sodium azide,
The solution was dialyzed against 0.05M sodium bicarbonate buffer (pH 9.6) containing 0.02% sodium azide, and then diluted to a protein concentration of 1 to 10 μg / ml. 50μ in the well of the plate
Take l and let stand overnight at 4 ° C. to adsorb the antigen. Supernatant was removed and 0.02% (w / v) Tween 20 was added to the wells.
PBS (150 μl) is added and left for 3 minutes, then removed and washed. After further washing once, PBS10 containing 1% (v / v) bovine serum albumin in the well
Add 0 μl and leave at 4 ° C. or more overnight to perform blocking. After removing the PBS containing bovine serum albumin,
After washing twice with PBS containing 0.02% (w / v) Tween 20, 50 μl of the culture supernatant of the fused cells was added to the wells.
In addition, leave at room temperature for 2 hours. Similarly, after washing three times with PBS containing 0.02% (w / v) Tween 20, 25 ng / ml of peroxidase-labeled goat anti-mouse Ig was added to the wells.
Add 50 μl of G antibody and leave at room temperature for 2 hours. 0.0
Similarly, after washing 3 times with PBS containing 2% (w / v) Tween 20, 50 μl of ABTS solution (KPL) was added to the wells.
1 and left at room temperature for 15 minutes to 1 hour to allow color reaction
The absorbance at 405 nm is measured with a photometer for 96-well EIA plate. Then, the cells in the positive wells are collected with a Pasteur pipette, transferred to a 24-well plastic culture container, added with 1 to 2 ml of HAT medium, and cultured in the same manner.

【００５５】（Ｅ）限界希釈法によるクローニング ２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた２株の
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個/mlとな
るようそれぞれをＨＴ培地で希釈する。別にＨＴ培地に
懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラ
スチック製培養容器に１〜２×１０⁵個／ウェルとり、
これに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個/ml）を５０
μｌ／ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気
下、３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日後
にＨＴ培地を１〜２滴／ウェル加える。細胞の増殖が見
られたウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記（Ｄ）
の「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方法で抗
体の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジア
・ニューモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得す
る。これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体を製造する。(E) Cloning by limiting dilution method The cell concentration of the two fused cells grown in a 24-well plastic culture vessel was measured, and each was diluted with HT medium so that the number of cells was 20 cells / ml. . Separately, 4 to 6-week-old mouse thymocytes suspended in HT medium were taken in a 96-well plastic culture container at 1-2 × 10 ⁵ cells / well,
Add 50 of the above fused cells (cell concentration is 20 cells / ml) to this.
Add 1 μl / well each, incubate at 36 ° C. in a 5% (v / v) carbon dioxide atmosphere, and add 1 to 2 drops / well of HT medium 1 day, 7 days, and 14 days thereafter. 50 μl of the culture supernatant of the well in which cell proliferation was observed was collected and
Confirm antibody production in the same manner as in "Screening of antibody-producing cells". Cells in which there are only single cell colonies in the well, which produce antibodies that react with the elementary bodies and which grow fast, are harvested from the wells and subsequently grown in 24-well plastic culture vessels. Further, the same cloning operation is repeated to obtain a hybridoma that produces an anti-Chlamydia pneumoniae antibody. This is cultured, and an anti-Chlamydia pneumoniae antibody is produced from the culture supernatant.

【００５６】[0056]

【発明の効果】請求項１記載の融合タンパク質は、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査等に利用できる。請求
項２記載の融合タンパク質は、請求項１記載の融合タン
パク質の効果を奏し、さらに、アミノ酸配列の長さが短
いため、担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を多く
することができ、感度の高い診断薬の製造に利用でき
る。請求項３記載の融合タンパク質は、請求項１記載の
融合タンパク質の効果を奏し、さらに、タンパク質分解
酵素による分解を受けにくい構造をつくることができる
ので安定性に優れており、抗原として安定性に優れる。
請求項４記載の融合タンパク質は、請求項１記載の融合
タンパク質の効果を奏し、さらに、クラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチド全体を有するので、抗体検査
やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて
適切である。請求項５記載の融合タンパク質は、請求項
１記載の融合タンパク質の効果を奏し、さらに、クラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの抗原部分を有
するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の
正確な診断に極めて適切である。請求項６記載のＤＮＡ
は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア
・ニューモニエの感染の診断等に好適な請求項１〜５記
載の融合タンパクを製造するのに利用できる。請求項７
記載の組換えベクターは、クラミジア・ニューモニエの
抗体検査やクラミジア・ニューモニエの感染の診断等に
好適な融合タンパクを製造するのに適している。請求項
８記載の組換えベクターは、請求項７記載の組換えベク
ターの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエ
の抗原ポリペプチドの抗原部分を有する融合タンパクを
発現させることができるので、抗原ポリペプチドの製造
に極めて適している。請求項９記載の形質転換体は、ク
ラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニュ
ーモニエの感染の診断等に好適な融合タンパクを製造す
るのに適している。請求項１０記載の抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体の製造方法は、クラミジア・ニューモニ
エの感染の診断薬製造に好適である。EFFECT OF THE INVENTION The fusion protein according to claim 1 can be used for antibody testing of Chlamydia pneumoniae. The fusion protein according to claim 2 exhibits the effect of the fusion protein according to claim 1, and further, since the length of the amino acid sequence is short, the number of antigen peptides that can be immobilized on a carrier or the like can be increased and the sensitivity can be increased. It can be used for the production of high diagnostic agents. The fusion protein according to claim 3 exerts the effect of the fusion protein according to claim 1, and since it can form a structure that is less susceptible to degradation by proteolytic enzymes, it has excellent stability and is stable as an antigen. Excel.
The fusion protein according to claim 4 exhibits the effect of the fusion protein according to claim 1, and further has the entire antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae, and therefore is extremely suitable for antibody tests and accurate diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection. is there. The fusion protein according to claim 5 exerts the effect of the fusion protein according to claim 1, and further has an antigen portion of the antigen polypeptide of Chlamydia pneumoniae, and therefore is extremely useful for antibody tests and accurate diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection. Appropriate. DNA according to claim 6.
Can be used for producing the fusion protein according to any one of claims 1 to 5, which is suitable for an antibody test for Chlamydia pneumoniae and a diagnosis for infection with Chlamydia pneumoniae. Claim 7
The recombinant vector described is suitable for producing a fusion protein suitable for antibody testing for Chlamydia pneumoniae, diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection, and the like. The recombinant vector according to claim 8 exhibits the effects of the recombinant vector according to claim 7, and can express a fusion protein having an antigenic portion of the antigenic polypeptide of Chlamydia pneumoniae. Is very suitable for manufacturing. The transformant according to claim 9 is suitable for producing a fusion protein suitable for antibody tests for Chlamydia pneumoniae, diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection, and the like. The method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody according to claim 10 is suitable for producing a diagnostic agent for Chlamydia pneumoniae infection.

【００５７】[0057]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：1 配列の長さ：160 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 160 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide sequence Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160

【００５８】配列番号：2 配列の長さ：544 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 1 5 10 15 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 20 25 30 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 35 40 45 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 65 70 75 80 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 85 90 95 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 100 105 110 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 115 120 125 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 130 135 140 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 145 150 155 160 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 165 170 175 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 180 185 190 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 195 200 205 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 210 215 220 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 225 230 235 240 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 245 250 255 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 260 265 270 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 275 280 285 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 290 295 300 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 305 310 315 320 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 325 330 335 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 340 345 350 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 370 375 380 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 385 390 395 400 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 405 410 415 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 420 425 430 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile Ile Leu Lys Ala 435 440 445 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 450 455 460 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 485 490 495 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 500 505 510 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 515 520 525 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 530 535 540 544SEQ ID NO: 2 Sequence length: 544 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide sequence Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 1 5 10 15 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 20 25 30 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 35 40 45 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 65 70 75 80 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 85 90 95 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 100 105 110 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 115 120 125 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 130 135 140 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 145 150 155 160 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 165 170 175 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 180 185 190 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 195 200 205 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 210 215 220 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 225 230 235 240 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 245 250 255 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 260 265 270 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 275 280 285 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 290 295 300 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 305 310 315 320 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 325 330 335 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 340 345 350 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 370 375 380 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 385 390 395 400 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 405 410 415 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 420 425 430 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile Ile Leu Lys Ala 435 440 445 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 450 455 460 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 485 490 495 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 500 505 510 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 515 520 525 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 530 535 540 544

【００５９】 配列番号：３ 配列の長さ：704 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 165 170 175 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 180 185 190 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 195 200 205 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 210 215 220 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 225 230 235 240 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 245 250 255 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 260 265 270 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 275 280 285 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 290 295 300 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 325 330 335 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 340 345 350 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 355 360 365 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 370 375 380 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 385 390 395 400 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 405 410 415 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 420 425 430 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 435 440 445 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 450 455 460 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 465 470 475 480 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 485 490 495 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 500 505 510 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 515 520 525 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 530 535 540 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Val Asp Asp Ala Gln 545 550 555 560 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 565 570 575 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 580 585 590 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile Ile Leu Lys Ala 595 600 605 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 610 615 620 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 625 630 635 640 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 645 650 655 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 660 665 670 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 675 680 685 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 690 695 700 704SEQ ID NO: 3 Sequence length: 704 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide sequence Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Met Ala Ala Lys Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 165 170 175 His Lys Gly Val Lys Thr Leu Ala Gle Ala Val Lys Val Thr Leu Gly 180 185 190 Pro Lys Gly Arg His Val Val Ile Asp Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gln 195 200 205 Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp 210 215 220 Lys His Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys 225 230 235 240 Thr Ala Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 245 250 255 Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Gly Leu Arg Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn 260 265 270 Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Lys Val Val Val 275 280 285 Asp Glu Leu Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His His Lys Glu Ile 290 295 300 Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Asn Asp Ser Glu Ile Gly Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ala Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asn Gly Ser Ile Thr 325 330 335 Val Glu Glu Ala Lys Gly Phe Glu Thr Val Leu Asp Val Val Glu Gly 340 345 350 Met Asn Phe Asn Arg Gly Tyr Leu Ser Ser Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 355 360 365 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 370 375 380 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val LeuGln Gln Val 385 390 395 400 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 405 410 415 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 420 425 430 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 435 440 445 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 450 455 460 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 465 470 475 480 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 485 490 495 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 500 505 510 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 515 520 525 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 530 535 540 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Val Asp Asp Ala Gln 545 550 555 560 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 565 570 575 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 580 585 590 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Ile Gly Thr Arg Ile IleLeu Lys Ala 595 600 605 Leu Thr Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Ser Asn Ala Gly Lys Glu Gly 610 615 620 Ala Ile Ile Cys Gln Gln Val leu Ala Arg Ser Ala Asn Glu Gly Tyr 625 630 635 640 Asp Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Thr Asp Met Ile Asp Ala Gly Ile Leu 645 650 655 Asp Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ile 660 665 670 Ala Gly Leu Leu Leu Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ala Asp Ile Pro Glu 675 680 685 Glu Lys Ser Ser Ser Ala Pro Ala Met Pro Ser Ala Gly Met Asp Tyr 690 695 700 704

【００６０】配列番号：4 配列の長さ：419 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Gln Phe Glu Pro leu Arg Glu Gly Val Arg Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 165 170 175 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 180 185 190 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 195 200 205 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 210 215 220 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 225 230 235 240 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 245 250 255 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 260 265 270 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 290 295 300 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 305 310 315 320 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 325 330 335 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 340 345 350 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 355 360 365 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 370 375 380 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 385 390 395 400 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro 405 410 415 Leu Ile Asn 419SEQ ID NO: 4 Sequence length: 419 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide sequence Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Gln Phe Glu Pro leu Arg Glu Gly Val Arg Tyr Phe Ser Thr Asn Pro 165 170 175 Glu Thr Gln Glu Cys Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Ile Tyr Asp 180 185 190 Lys Lys Ile Ser Gly Ile Lys Asp Phe Leu Pro Val Leu Gln Gln Val 195 200 205 Ala Glu Ser Gly Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Glu Ile Glu Gly 210 215 220 Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Arg 225 230 235 240 Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met 245 250 255 Leu Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Leu Val Ser Glu Glu 260 265 270 Leu Gly Met Lys Leu Glu Asn Thr Thr Leu Ala Met Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Lys Lys Val Ile Val Thr Lys Glu Asp Thr Thr Ile Val Glu Gly Leu 290 295 300 Gly Asn Lys Pro Asp Ile Gln Ala Arg Cys Asp Asn Ile Lys Lys Gln 305 310 315 320 Ile Glu Asp Ser Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg 325 330 335 Leu Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Arg Val Gly Ala Ala 340 345 350 Thr Glu Ile Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg val Asp Asp Ala Gln 355 360 365 His Ala Thr Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Leu Pro Gly Gly Gly 370 375 380 Thr Ala Leu Val Arg Cys Ile Pro Thr Leu Glu Ala Phe Leu Pro Met 385 390 395 400 Leu Ala Asn Glu Asp Glu Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro 405 410 415 Leu Ile Asn 419

【００６１】配列番号：5 配列の長さ：480 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 Genomic DNA 配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160SEQ ID NO: 5 Sequence length: 480 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Sequence type: Other nucleic acid Genomic DNA sequence ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 G GT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160

【００６２】配列番号：6 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC 35SEQ ID NO: 6 Sequence length: 35 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC 35

【００６３】配列番号：7 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG ３
５SEQ ID NO: 7 Sequence length: 35 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG 3
5

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/04 21/04 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ 33/571 33/571 // Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/295 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/295 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (54)【発明の名称】 ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク質、それを コードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、 及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Office reference number FI technical display location C12P 21/02 C12P 21/02 C 21/04 21/04 G01N 33/53 G01N 33/53 D 33 / 569 33/569 F 33/571 33/571 // A61K 49/00 A61K 49/00 A C07K 14/295 8517-4H C07K 14/295 C12N 9/02 C12N 9/02 (C12N 15/09 ZNA C12R 1 : 01) (C12P 21/02 C12R 1:19) (54) Title of the Invention Dihydrofolate reductase-Chlamydia pneumoniae antigen-polypeptide fusion protein, DNA encoding the same, recombinant vector containing the DNA, Transformant containing the recombinant vector, and method for producing anti-Chlamydia pneumoniae antibody

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号１のポリペプチドに、直接又は
介在アミノ酸配列を介して、配列番号２のポリペプチド
の中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドＢが結合した、ジヒドロ葉酸還元酵素−クラ
ミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチド融合タンパク
質。1. A dihydrofolic acid wherein a polypeptide B comprising at least 5 consecutive amino acid sequences in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is bound to the polypeptide of SEQ ID NO: 1 directly or via an intervening amino acid sequence. Reductase-Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide fusion protein. 【請求項２】 ポリペプチドＢが配列番号２のポリペプ
チドからアミノ酸１〜３２０個が欠落しているポリペプ
チドである、請求項１記載の融合タンパク質。2. The fusion protein according to claim 1, wherein the polypeptide B is a polypeptide lacking 1 to 320 amino acids from the polypeptide of SEQ ID NO: 2. 【請求項３】 ポリペプチドＢが配列番号２のポリペプ
チドの中のアミノ酸１〜１００個が他のアミノ酸で置換
されているポリペプチドである、請求項１記載の融合タ
ンパク質。3. The fusion protein according to claim 1, wherein the polypeptide B is a polypeptide in which 1 to 100 amino acids in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids. 【請求項４】 融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の融合
タンパク質。4. The fusion protein according to claim 1, wherein the fusion protein is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 【請求項５】 融合タンパク質が配列番号４のアミノ酸
配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の融合
タンパク質。5. The fusion protein according to claim 1, wherein the fusion protein is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤ
ＮＡ。6. A DNA encoding the fusion protein according to claim 1 or D complementary thereto.
NA. 【請求項７】 請求項６のＤＮＡを含む組換えベクタ
ー。7. A recombinant vector containing the DNA of claim 6. 【請求項８】 組換えベクターがｐＣＰＮ６０２３プラ
スミドである請求項７記載の組換えベクター。8. The recombinant vector according to claim 7, which is the pCPN6023 plasmid. 【請求項９】 請求項７又は請求項８記載の組換えベク
ターを含む形質転換体。9. A transformant containing the recombinant vector according to claim 7. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれかに記載の融合
タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造方法。10. A method for producing an anti-Chlamydia pneumoniae antibody, which comprises using the fusion protein according to claim 1 as an antigen.