JPH0829428A - Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cell - Google Patents
Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cellInfo
- Publication number
- JPH0829428A JPH0829428A JP6191727A JP19172794A JPH0829428A JP H0829428 A JPH0829428 A JP H0829428A JP 6191727 A JP6191727 A JP 6191727A JP 19172794 A JP19172794 A JP 19172794A JP H0829428 A JPH0829428 A JP H0829428A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insoluble carrier
- antibody
- monoclonal antibody
- cells
- covalently bound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、第一に、光化学反応に
より白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を共有
結合させた不溶性担体と、それを用いた細胞および末梢
血リンパ球の分画方法および定量方法に関する。本発明
は第二に、光化学反応により白血球分化抗原に対するモ
ノクローナル抗体を共有結合させた不溶性担体を用い
た、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉ
ｌｌｅｒ ｃｅｌｌの誘導方法に関する。本発明は第三
に、パルプを含有する繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention is, firstly, an insoluble carrier to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by a photochemical reaction, and a method of fractionating and quantifying cells and peripheral blood lymphocytes using the same. Regarding Secondly, the present invention uses Lymphokine Activated Ki using an insoluble carrier to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by a photochemical reaction.
It relates to a method for inducing ller cells. The present invention thirdly relates to a method for fractionating hematopoietic stem cells using a fiber product containing pulp.
【０００２】１）骨髄液中に混在する白血球の除去 骨髄移植による副作用は、移植中或いは移植後短時間内
に生じる即時型と遅発型に大別される。これらの副作用
は、骨髄液中に混在する白血球が原因となる免疫学的機
序により発現する。即時型には、非溶血性発熱反応があ
り、遅発型には、骨髄移植後の移植片対宿主病（ｇｒａ
ｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶ
ＨＤ）、免疫変調作用等がある。宿主にとって外来の異
物に対する反応は、抗原提示細胞を介してＴリンパ球に
よって認識される。抗原提示細胞に共通する性質は、細
胞表面に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩお
よびクラスＩＩ分子をもっている。ヒトでは、それぞ
れ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱとして表現される。Ｍ
ＨＣクラスＩ分子は、すべての有核細胞および血小板上
に発現しており、クラスＩＩ分子は骨髄由来の一定の細
胞、特にマクロファージ、Ｂリンパ球、皮膚のランゲル
ハンス細胞、樹状細胞にのみ発現している。骨髄移植に
よる同種免疫は、通常、レシピエントの抗原提示細胞が
レシピエントのＴリンパ球に対して、ドナーのＨＬＡ抗
原を提示するのではなく、骨髄液中に含まれるドナーの
抗原提示細胞が抗原を提示し、レシピエントのＴリンパ
球によって非自己と認識される。すなわち、レシピエン
トＴリンパ球受容体は、抗原提示細胞のクラスＩＩペプ
チド複合体と結合し、更に、アクセサリーリガンドであ
るＬＦＡ−Ｉ／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２／ＬＦＡ−３の結
合によって反応が補助される。この結果、Ｔリンパ球
（ＣＤ４細胞）は活性化され、ＩＬ−１ ＩＬ−４ Ｉ
Ｌ−５等、種々のサイトカインを産生し、Ｂリンパ球の
反応が起こり、抗体産生が生じ、同種免疫が成立する。
この成立の条件を考えれば、白血球および血小板を除い
た骨髄を移植することは、クラスＩＩ分子をもつドナー
抗原提示細胞が存在しない為、同種免疫は生じない。 ２）幹細胞の分離 急性白血病や悪性リンパ腫に対する自家骨髄移植に於い
ては、採取した自家骨髄細胞中に混入した腫瘍細胞が、
自家骨髄移植後の再発の原因になることが予想される
為、抗癌剤の使用が行なわれる場合や、モノクローナル
抗体によるｉｎｖｉｔｒｏ ｐｕｒｇｉｎｇが行なわれ
る場合がある。−方、造血幹細胞に発現しているＣＤ３
４抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、造血幹細
胞をｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎする方法も試
みられている。造血幹細胞を濃縮する方法には、骨髄細
胞からＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体によ
り、特異的にＣＤ３４＋細胞を吸着させ、他の細胞を除
去した後、ＣＤ３４＋細胞をｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎする方法がある。この方法を応用した市販
の装置には、磁気ビーズ法によるＤｙｎａ−ｂｅａｄｓ
（Ｄｙｎａｌ社）、ＣＤ３４抗原に対するモノクローナ
ル抗体を非特異吸着させたフラスコを用いて選別する、
パンニング法であるＭｉｃｒｏＣＥＬＬｅｃｔｏｒ（Ａ
ＩＳ社）、ＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体を
固定化したゲルを充填したカラムを用いたＣＥＰＲＡＴ
Ｅ ＬＣ（ＣｅｌｌＰｒｏ社）の３種類がある。これら
市販の装置を用いれば、ＣＤ３４＋細胞をおよそ１００
倍に濃縮することが可能である。濃縮後のＣＤ３４陽性
率はおよそ６５％、ＣＤ３４＋細胞の回収率はおよそ３
５％、白血球の除去率はおよそ８０％である。以上の様
に、ＣＤ３４＋細胞の回収率が悪いこと、白血球、血小
板および癌細胞の除去率が充分でないこと等の理由か
ら、現在は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｕｒｇｉｎｇやｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎの有用性が臨床試験
研究によって、広汎に容認されるには至っていない。 ３）モノクローナル抗体の剥離 ＣＤ３４抗原に対するモノクローナル抗体を非特異吸着
させた、上記市販担体のもう一つの欠点は、リガンドで
あるモノクローナル抗体の剥離である。本発明の発明者
は、既に、前記のリガンド剥離の欠点を克服すべく、光
反応により、抗生物質を担体に共有結合させる方法を考
案し出願に及んだ。今回、本発明の発明者は、光化学反
応により白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を
共有結合させた担体が、前記のリガンド剥離の欠点を克
服することが可能であることを見い出した。 ４）リンパ球の活性化 免疫担当細胞をＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−
２）と共に培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）細胞を誘導して、こ
れらの細胞を用いる養子免疫療法がある。ＬＡＫ細胞
は、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＮＫ細胞に抵抗性を示す腫瘍
細胞のみならず、自己の新鮮腫瘍細胞に対しても細胞障
害性を示し、広いスペクトラムを持つＫｉｌｌｅｒ細胞
であることが示されている。しかしながらＬＡＫ療法に
は、高濃度のＩＬ−２による副作用や、長期間の培養に
よる感染の危険を伴うという問題がある。今回、本発明
の発明者は、光化学反応により白血球分化抗原に対する
モノクローナル抗体を共有結合させた担体を用いて、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで免疫担当細胞をＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉ
ｎ−２（ＩＬ−２）と共に培養する方法が、リガンド剥
離の欠点および高濃度のサイトカインよる副作用の問題
を克服することが可能であることを見い出した。1) Removal of leukocytes mixed in bone marrow fluid The side effects of bone marrow transplantation are roughly classified into immediate type and delayed type which occur during transplantation or within a short time after transplantation. These side effects are expressed by an immunological mechanism caused by leukocytes mixed in the bone marrow fluid. The immediate type has a non-hemolytic fever, and the late type has a graft-versus-host disease (gra-vs) after bone marrow transplantation.
ft versus host disease; GV
HD), immunomodulating action, etc. The reaction to foreign substances foreign to the host is recognized by T lymphocytes via antigen-presenting cells. A common property of antigen presenting cells is that they have major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules on the cell surface. In humans, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, respectively.
It is expressed as R, HLA-DP, and HLA-DQ. M
HC class I molecules are expressed on all nucleated cells and platelets, while class II molecules are expressed only on certain cells of bone marrow origin, especially macrophages, B lymphocytes, cutaneous Langerhans cells, dendritic cells. ing. In allogeneic immunization by bone marrow transplantation, usually, the antigen-presenting cells of the recipient do not present the HLA antigens of the donor to the T lymphocytes of the recipient, but the antigen-presenting cells of the donor contained in the bone marrow fluid are the antigen. And is recognized as non-self by the recipient's T lymphocytes. That is, the recipient T lymphocyte receptor binds to the class II peptide complex of antigen-presenting cells, and the reaction is assisted by the binding of LFA-I / ICAM-1 and CD2 / LFA-3, which are accessory ligands. It As a result, T lymphocytes (CD4 cells) are activated and IL-1 IL-4 I is activated.
Various cytokines such as L-5 are produced, B lymphocyte reaction occurs, antibody production occurs, and allogeneic immunity is established.
Considering the conditions for this establishment, transplantation of bone marrow excluding leukocytes and platelets does not cause allogeneic immunity because donor antigen-presenting cells having class II molecules do not exist. 2) Separation of stem cells In autologous bone marrow transplantation for acute leukemia and malignant lymphoma, tumor cells mixed in the collected autologous bone marrow cells are
Since it is expected to cause recurrence after autologous bone marrow transplantation, an anticancer agent may be used, or in vitro purging with a monoclonal antibody may be performed. -CD3 expressed on hematopoietic stem cells
A method of positively selecting hematopoietic stem cells using a monoclonal antibody against 4 antigens has also been attempted. To enrich hematopoietic stem cells, CD34 + cells are specifically adsorbed from bone marrow cells with a monoclonal antibody against the CD34 antigen, other cells are removed, and then the CD34 + cells are positively differentiated.
There is a way to make an election. Commercially available devices to which this method is applied include Dyna-beads produced by the magnetic bead method.
(Dynal), selecting using a flask in which a monoclonal antibody against the CD34 antigen is nonspecifically adsorbed,
The panning method MicroCELLector (A
IS company), CEPRAT using a column packed with a gel on which a monoclonal antibody against CD34 antigen is immobilized
There are three types of ELC (CellPro). Using these commercially available devices, approximately 100 CD34 + cells can be obtained.
It is possible to double the concentration. The CD34 positive rate after concentration is about 65%, and the CD34 + cell recovery rate is about 3
5%, white blood cell removal rate is about 80%. As described above, due to the poor recovery rate of CD34 + cells and insufficient removal rate of white blood cells, platelets and cancer cells, at present, in vitro purging and po
The usefulness of sitative selection has not been widely accepted by clinical trial studies. 3) Peeling off of monoclonal antibody Another drawback of the above-mentioned commercially available carrier having non-specifically adsorbed the monoclonal antibody against the CD34 antigen is peeling off of the monoclonal antibody which is a ligand. The inventor of the present invention has already devised and applied for a method of covalently bonding an antibiotic to a carrier by a photoreaction in order to overcome the above-mentioned drawbacks of ligand exfoliation. The inventor of the present invention has now found that a carrier to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by a photochemical reaction can overcome the above-mentioned drawbacks of ligand detachment. 4) Activation of lymphocytes Interleukin-2 (IL-
2) cultured with Lymphokine Activ
There is adoptive immunotherapy that induces aerated Killer (LAK) cells and uses these cells. It has been shown that LAK cells are Killer cells having broad spectrum, showing cytotoxicity not only to tumor cells resistant to Classical NK cells but also to their own fresh tumor cells. However, LAK therapy has a problem that side effects due to high concentration of IL-2 and risk of infection due to long-term culture are involved. This time, the inventor of the present invention uses a carrier to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by a photochemical reaction to
Interleuki immunocompetent cells in n vitro
It has been found that the method of culturing with n-2 (IL-2) can overcome the drawbacks of ligand detachment and the side effects due to high concentrations of cytokines.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする問題点】本発明の発明者は、
光反応により白血球分化抗原に対するモノクローナル抗
体を共有結合させた担体が、従来品および従来法と比較
して、細胞を効率良く吸着することを 見い出し出願に
及んだ。しかも、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
による測定の結果、当該担体からはリガンドの剥離は認
められなかった。すなわち本発明は、 １）他家骨髄液から殆どの白血球および血小板を除去
し、他家骨髄移植時に同種免疫を回避できる担体および
方法を提供する。 ２）造血性幹細胞含有自家骨髄液および他家骨髄液か
ら、幹細胞を完全に純化できる担体および方法を提供す
る。 ３）白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体が剥離
しない末梢血リンパ球分離用担体および末梢血リンパ球
の分離方法を提供する。 ４）白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体が剥離
しない、リンパ球活性化用担体およびリンパ球活性化の
方法を提供する。 ５）パルプを含有する繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法を提供する。ことに関する。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention
The inventors have found that a carrier to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by a photoreaction efficiently adsorbs cells as compared with conventional products and conventional methods, and applied to the application. Moreover, enzyme immunoassay (EIA)
As a result of the measurement by the above method, no exfoliation of the ligand was observed from the carrier. That is, the present invention provides 1) a carrier and method capable of removing most leukocytes and platelets from allogeneic bone marrow fluid and avoiding allogeneic immunity during allogeneic bone marrow transplantation. 2) To provide a carrier and method capable of completely purifying stem cells from autologous bone marrow fluid containing hematopoietic stem cells and allogeneic bone marrow fluid. 3) To provide a carrier for separating peripheral blood lymphocytes from which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen does not exfoliate, and a method for separating peripheral blood lymphocytes. 4) To provide a carrier for lymphocyte activation and a method for lymphocyte activation in which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is not detached. 5) A method for fractionating hematopoietic stem cells using a fiber product containing pulp is provided. Regarding things.
【０００５】従来の担体へのリガンドの固定化方法に
は、 １）リガンドが部分的な修飾を受けることにより、リガ
ンドの高次構造や活性中心等が部分的に破壊される恐れ
がある。 ２）リガンドの自由な動きが制限されることにより、被
検検体との相互作用が起こりにくくなり、その結果リガ
ンドの活性の低下が起こる。 ３）リガンドに優れた活性と安定性を与える固定化条件
を見つけることが困難である。 ４）リガンドを非特異吸着により固定化した場合には、
リガンドが剥離し易い。等の欠点があった。一方、フェ
ニルアジド基は、紫外線照射により高反応性の中間体で
あるナイトレンを経由し、近傍の炭素等と共有結合する
ことが知られている（吉本薫：フォトポリマーハンドブ
ック：工業調査会１９８９）。また、人工臓器に生体適
合性を付与する方法として、材料表面の改質方法（特
願、平２−２０６５７３）が知られている。同方法は、
デバイスの表面にアジド基を介して、アルブミン等の蛋
白質を共有結合させることにより、生体適合性を付与す
る方法である。In the conventional methods for immobilizing a ligand on a carrier, 1) there is a possibility that the higher-order structure of the ligand, the active center, etc. may be partially destroyed by the partial modification of the ligand. 2) The free movement of the ligand is restricted, so that the interaction with the test sample is less likely to occur, and as a result, the activity of the ligand is reduced. 3) It is difficult to find immobilization conditions that give the ligand excellent activity and stability. 4) When the ligand is immobilized by nonspecific adsorption,
The ligand is easy to peel off. And the like. On the other hand, it is known that a phenyl azide group is covalently bonded to carbon and the like in the vicinity via a nitrene which is a highly reactive intermediate upon irradiation with ultraviolet rays (Kaoru Yoshimoto: Photopolymer Handbook: Industrial Research Society 1989). . Further, as a method for imparting biocompatibility to an artificial organ, a method for modifying the surface of a material (Japanese Patent Application No. 2-206573) is known. The method is
This is a method of imparting biocompatibility by covalently binding a protein such as albumin to the surface of the device via an azide group.
【０００６】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体の強固な結合に応用することを考案した。即
ち、本発明の発明者は、リガンドの固定化について鋭意
検討した結果、 ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗布
した後、被固定化白血球分化抗原に対するモノクローナ
ル抗体を塗布し、更に光を照射することからなる白血球
分化抗原に対するモノクローナル抗体の固定化方法。 ｂ）不溶性担体の表面にｏ−ニトロベンジルエステル基
を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカル
ボキシル基を生成させ、更に、水溶性縮合剤を用いて、
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化学結合
させる方法とからなる白血球分化抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の固定化方法。 ｃ）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、更に光を照
射することことからなる、白血球分化抗原に対するモノ
クローナル抗体の固定化方法。によりリガンドである白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を担体に容易
に、強固に固定化できることを発見し、本発明を完成し
た。The inventor of the present invention has devised to apply the ultraviolet irradiation method of the phenylazide group to the strong binding of the monoclonal antibody to the leukocyte differentiation antigen. That is, the inventor of the present invention has conducted diligent studies on immobilization of a ligand, and as a result, a) after applying a compound having an azido group on the surface of an insoluble carrier, and then applying a monoclonal antibody against an immobilized leukocyte differentiation antigen, A method for immobilizing a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen, which comprises irradiating with light. b) After forming a thin film of a copolymer having an o-nitrobenzyl ester group on the surface of an insoluble carrier, a carboxyl group is generated by light irradiation, and a water-soluble condensing agent is further used.
A method for immobilizing a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen, which comprises chemically bonding a monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen. c) p-azidobenzoyloxy in buffer
A method for immobilizing a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen, which comprises applying a phenylazide group-introduced monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen to a carrier to be immobilized by reacting with succinimide and then irradiating light. Thus, the inventors have found that a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen, which is a ligand, can be easily and firmly immobilized on a carrier, and completed the present invention.
【０００７】[0007]
【発明の効果】本発明は、 （ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗
布した後、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体
溶液を塗布し、更に光を照射することことからなる、白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の共有結合方
法。 （ｂ）不溶性担体の表面にｏ−ニトロベンジルエステル
基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカ
ルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を用いて白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化学結合さ
せる方法とからなる、白血球分化抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の共有結合方法。 ｃ）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、更に光を照
射することことからなる、白血球分化抗原に対するモノ
クローナル抗体の共有結合方法。 （ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により、
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を共有結合
したことを特徴とする、不溶性担体および実験器具。 （ｅ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を分画する方法。 （ｆ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を分画除去する方法。 （ｇ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により調
製した不溶性担体を用いて、細胞を定量する方法。 （ｈ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を共有結合した不溶性担体と、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と末梢血リンパ球とをｉｎ
ｖｉｔｒｏにより培養し，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌを誘導する方
法。 ｉ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗Ｃ
Ｄ４抗体を共有結合した不溶性担体または、ＣＤ８抗体
を共有結合した不溶性担体を用いて、末梢血リンパ球か
らＣＤ４＋細胞を分画した後、分画したＣＤ４＋細胞を
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と共に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
により培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌを誘導する方法。 （ｊ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３４抗体を共有結合した不溶性担体、および抗ＣＤ
３８抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−
Ａ抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−Ｂ
抗体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−Ｃ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗
体を共有結合した不溶性担体および、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗
体を共有結合した不溶性担体および、ｓｉｎｇｌｅ ｃ
ｅｌｌ ｄｉｐｏｓｉｔｉｎｇ ｕｎｉｔとを用いて造
血幹細胞を分画する方法。 （ｋ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の方法により抗
ＣＤ３４抗体を共有結合した不溶性担体、および抗ＣＤ
３８抗体を共有結合した不溶性担体および、血しょう分
離器を用いて、造血幹細胞を分画する方法。 （ｌ）（ｊ）または（ｋ）の方法により分画した造血幹
細胞をサイトカインと共にｉｎ ｖｉｔｒｏ法により増
殖する方法。 （ｍ）不溶性担体が、ポリビニルアルコール、およびセ
ルロース、およびポリアクリルアミド、およびポリアク
リル酸、およびメタクリル酸、およびポリメチルメタク
リレート、およびポリイソプロピルアクリルアミド、お
よびポリエステル、およびポリアミド、およびポリエチ
レン、およびポリプロピレン、およびポリスチレンの中
から選択されたことを特徴とする（ｃ）の不溶性担体お
よび実験器具。 （ｎ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ３で
あることを特徴とする繊維製品。 （ｏ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ３で
あることを特徴とする繊維製品を充填したカラム。 （ｐ）１０〜９０％のパルプを含有し、その繊維径が３
〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／ｃｍ３で
あることを特徴とする繊維製品を用いた造血幹細胞の分
画方法。 （ｑ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）記載の方法によ
り調製した不溶性担体および（ｎ）記載の繊維製品を用
いて、細胞および末梢血リンパ球を分画する方法。より
なる。本発明に関わる共有結合方法により、白血球分化
抗原に対するモノクローナル抗体の活性を失うことな
く、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を容易
に、堅固に共有結合することが可能になる。また、本発
明に関わる共有結合方法により、白血球分化抗原に対す
るモノクローナル抗体を共有結合した実験器具から、白
血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を剥離させる
ことなく、幹細胞を分画することや、リンパ球を活性化
することが可能である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention comprises: (a) coating a compound having an azide group on the surface of an insoluble carrier, then coating a monoclonal antibody solution against a leukocyte differentiation antigen, and further irradiating with light. A method for covalently binding a monoclonal antibody to an antigen. (B) After forming a thin film of a copolymer having an o-nitrobenzyl ester group on the surface of an insoluble carrier, a carboxyl group is generated by light irradiation, and a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is further produced using a water-soluble condensing agent. A method for covalently binding a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen, which comprises chemically bonding. c) p-azidobenzoyloxy in buffer
A method for covalently binding a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen, which comprises applying a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen having a phenylazide group introduced thereto by reacting with succinimide, and then irradiating with light. (D) By the method of (a) or (b) or (c),
An insoluble carrier and an experimental device, which are characterized in that a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bonded. (E) A method of fractionating cells using the insoluble carrier prepared by the method of (a) or (b) or (c). (F) A method of fractionating and removing cells using the insoluble carrier prepared by the method of (a) or (b) or (c). (G) A method of quantifying cells using the insoluble carrier prepared by the method of (a) or (b) or (c). (H) an insoluble carrier to which an anti-CD3 antibody (OKT3) is covalently bound by the method of (a) or (b) or (c),
interleukin-2 and peripheral blood lymphocytes in
Cultured in vitro, Lymphokine A
A method for inducing a activated Killer cell. i) anti-C by the method of (a) or (b) or (c)
After fractionating CD4 + cells from peripheral blood lymphocytes using an insoluble carrier to which D4 antibody was covalently bound or an insoluble carrier to which CD8 antibody was covalently bound, the fractionated CD4 + cells together with interleukin-2 in vitro.
Cultured with Lymphokine Activat
A method for inducing ed Killer cell. (J) Insoluble carrier covalently bound with anti-CD34 antibody by the method of (a) or (b) or (c), and anti-CD
38 antibody covalently bound to an insoluble carrier and anti-HLA-
Insoluble carrier covalently bound to antibody A and anti-HLA-B
Insoluble carrier covalently bound with antibody, insoluble carrier covalently bound with anti-HLA-C antibody, insoluble carrier covalently bound with anti-HLA-DR antibody, insoluble carrier covalently bound with anti-HLA-DP antibody, and anti-HLA -Insoluble carrier covalently bound to DQ antibody and single c
A method of fractionating hematopoietic stem cells by using an ell disposing unit. (K) Insoluble carrier covalently bound with anti-CD34 antibody by the method of (a) or (b) or (c), and anti-CD
38. A method of fractionating hematopoietic stem cells using an insoluble carrier to which 38 antibody is covalently bound and a plasma separator. (L) A method of proliferating hematopoietic stem cells fractionated by the method of (j) or (k) together with cytokines by an in vitro method. (M) Insoluble carriers include polyvinyl alcohol, cellulose, polyacrylamide, polyacrylic acid, methacrylic acid, polymethylmethacrylate, polyisopropylacrylamide, polyester, polyamide, polyethylene, polypropylene, and polystyrene. (C) an insoluble carrier and a laboratory device, which are selected from among: (N) Containing 10 to 90% of pulp and having a fiber diameter of 3
A fiber product having a fiber density of 0.3 to 1.5 g / cm 3 at a particle size of ˜50 μm. (O) Contains 10 to 90% of pulp and its fiber diameter is 3
A column packed with a fiber product, characterized in that the fiber density is ˜50 μm, and the fiber density is 0.3 to 1.5 g / cm 3 . (P) Contains 10 to 90% of pulp and its fiber diameter is 3
A method for fractionating hematopoietic stem cells using a fiber product, which has a fiber density of ˜50 μm and a fiber density of 0.3 to 1.5 g / cm 3 . (Q) A method for fractionating cells and peripheral blood lymphocytes using the insoluble carrier prepared by the method according to (a) or (b) or (c) and the fiber product according to (n). Consists of. By the covalent binding method according to the present invention, it becomes possible to easily and firmly covalently bind a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen without losing the activity of the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen. Further, according to the covalent binding method according to the present invention, it is possible to fractionate stem cells and activate lymphocytes from an experimental device to which a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound, without peeling the monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen. It is possible to
【０００８】本発明では、最初に担体表面にアジド基を
有するポリマーや、低分子化合物を塗布する。使用する
ポリマーとしては、アジド基を導入したスチレン、アジ
ド基を含有するメタクリレート類等のビニルモノマー単
独重合体、アジド基含有モノマーとスチレン、アクリル
アミド等のアジド基を含有しないビニルモノマーとの共
重合体が考えられるが、安定性を考慮すると、スチレ
ン、メチルメタクリレート、ジメチルアクリルアミドと
の共重合体が特に好ましい。これらの共重合体における
アジド基の割合は、モル比で１０〜２０％存在すること
が好ましい。前記ポリマーの分子量は、数平均分子量で
１００，０００以上であることが好ましい。また、アジ
ド基を有する低分子化合物としては、ビスアジド化合物
や、イオン性基等が考えられるが、必ずしもこれらに限
定されるものではない。これらのアジド基を有する低分
子化合物では、白血球分化抗原に対するモノクローナル
抗体を安定に固定化させる為に、アジド基を２個以上含
有することが望まれる。白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を固定化する材料としては、プラスチッ
ク、ガラス、セラミック、繊維、紙、合成紙、中空糸、
金属等が考えられるが、これらに限定される訳ではな
く、また、それらの形状、表面の状態等には、何等制限
はない。In the present invention, first, a polymer having an azide group or a low molecular weight compound is applied to the surface of a carrier. As the polymer to be used, styrene having an azido group introduced, a homopolymer of a vinyl monomer such as methacrylate containing an azide group, a copolymer of a monomer containing an azide group and a vinyl monomer not containing an azide group such as styrene or acrylamide. However, considering stability, a copolymer with styrene, methylmethacrylate, or dimethylacrylamide is particularly preferable. The proportion of azido groups in these copolymers is preferably 10 to 20% in terms of molar ratio. The number average molecular weight of the polymer is preferably 100,000 or more. The low molecular weight compound having an azide group may be a bisazide compound, an ionic group, or the like, but is not necessarily limited thereto. These low molecular weight compounds having an azide group are desired to contain two or more azido groups in order to stably immobilize a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen. Materials for immobilizing monoclonal antibodies against leukocyte differentiation antigens include plastic, glass, ceramics, fibers, paper, synthetic paper, hollow fibers,
Metals and the like are conceivable, but are not limited to these, and there is no limitation on their shape, surface condition, and the like.
【０００９】アジド基を有する化合物は、ポリマーで
も、低分子化合物であっても、揮発性有機溶媒に溶解
し、被固定化表面に塗布、乾燥することにより実施する
ことが可能である。塗布により、形成される皮膜の厚さ
は、ポリマーの場合は、０．１〜３．０μｍであること
が好ましい。低分子の場合は、分子層が複数になる様に
塗布することが好ましい。本発明によって固定化される
白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体は、分画し
ようとする細胞および末梢血リンパ球によって、自由に
選択することが可能である。これらの白血球分化抗原に
対するモノクローナル抗体を被固定化担体に存在させる
方法には、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体
の溶液に被固定化担体を浸漬し、白血球分化抗原に対す
るモノクローナル抗体を被固定化担体に吸着させる方法
が考えられる。The compound having an azide group, whether it is a polymer or a low molecular weight compound, can be dissolved in a volatile organic solvent, applied to the surface to be immobilized and dried. The thickness of the coating formed by coating is preferably 0.1 to 3.0 μm in the case of a polymer. In the case of low molecular weight, it is preferable to apply so that the molecular layers are plural. The monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen immobilized by the present invention can be freely selected depending on the cells to be fractionated and peripheral blood lymphocytes. The method of allowing the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen to be present on the immobilization carrier is to immerse the immobilization carrier in a solution of the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen and to adsorb the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen onto the immobilization carrier. The method of making it possible is considered.
【００１０】次に、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体の存在する被固定化担体に紫外線を照射するこ
とにより、短時間で固定化が完了する。使用される光源
としては、水銀灯等が考えられる。白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体の水溶液または、コロイド溶液
または、懸濁液に被固定化担体を浸漬し、白血球分化抗
原に対するモノクローナル抗体を被固定化担体に吸着さ
せた後に紫外線を照射する場合には、必ずしも溶液を乾
燥させる必要はない。紫外線照射に特に限定される条件
はないが、被固定化白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体を防御する為には、３２０ｎｍよりも長波長の
光を照射することが好ましい。紫外線を照射した後、固
定化されなかった白血球分化抗原に対するモノクローナ
ル抗体は洗浄により除去する。洗浄に使用される溶媒に
も特に制限はない。Next, the immobilization on which the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen is present is irradiated with ultraviolet rays to complete the immobilization in a short time. The light source used may be a mercury lamp or the like. An aqueous solution of a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen, or a colloidal solution, or a suspension is immersed in an immobilized carrier, and the monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen is adsorbed to the immobilized carrier, and then irradiated with ultraviolet rays, It is not always necessary to dry the solution. Although there is no particular limitation on the irradiation of ultraviolet rays, irradiation with light having a wavelength longer than 320 nm is preferable in order to protect the monoclonal antibody against the immobilized leukocyte differentiation antigen. After irradiation with ultraviolet rays, the monoclonal antibody to the leukocyte differentiation antigen that has not been immobilized is removed by washing. The solvent used for washing is also not particularly limited.
【００１１】以上の操作からなる本発明によれば、白血
球分化抗原に対するモノクローナル抗体と塗布したポリ
マー間との共有結合、更に、塗布したポリマー間とポリ
マー内との架橋が生成する為、被固定化担体が安定して
存在し続ける。被固定化担体がプラスチックの場合に
は、被固定化担体の表面と塗布した白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体との間に共有結合が生成する
為、被固定化担体が更に安定して存在し続ける。アジド
基を有する化合物が低分子化合物である場合にも、化学
療法剤と塗布した低分子化合物間との共有結合、更に、
塗布した低分子化合物間の架橋が生成する為、被固定化
担体が安定して存在し続ける。According to the present invention comprising the above operations, a covalent bond is formed between a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen and a coated polymer, and further, a crosslink is formed between the coated polymer and the inside of the polymer, so that immobilization is performed. The carrier remains stable and present. When the carrier to be immobilized is plastic, a covalent bond is formed between the surface of the carrier to be immobilized and the applied monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen, so that the carrier to be immobilized continues to exist more stably. Even when the compound having an azido group is a low molecular weight compound, a covalent bond between the chemotherapeutic agent and the applied low molecular weight compound,
Since the cross-linking between the applied low molecular weight compounds is generated, the immobilized carrier continues to exist stably.
【００１２】[0012]
【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。 《実施例１．》 ｉ）アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液２０ｍｌに、３−ニトロスチレ
ン５ｇを懸濁させ、更に、エタノールに溶解したＳｎＣ
ｌ３ ２Ｈ２Ｏ溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温
で一夜、反応させた。ＮａＯＨにより中和し、固体成分
を濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテ
ル層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体
を得た。同中間体を１０％硫酸溶液１０ｍｌに溶解し、
氷冷し１ＮのＮａＮＯ２水溶液を添加した。２時間後
に、ＮａＮ３水溶液を添加し、室温に戻した後、３時間
攪拌した。酢酸エチルにより抽出し、抽出液を０．１Ｎ
ＮａＨＣＯ３水溶液と精 製水で洗浄し、ＭｇＳＯ４
を添加し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム／ヘ
キサン（１／４）混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラム
で精製した。溶媒を留去し、３−アジドスチレンを得
た。 ｉｉ）アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン１モルとスチレン４モルとをベンゼンで
５倍に希釈し、０．０１当量のＮ，Ｎ’−アゾビスイソ
ブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加、脱気、封管し、６
０℃で４時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、
沈殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収し
た。得られた共重合体の数平均分子量は、１０万であっ
た。 ｉｉｉ）抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルムの調製 前記方法により合成したアジドスチレン−スチレン共重
合体をアセトンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶
液１００ｍｌを１ｍ２のポリエチレンテレフタレート
（ＰＥＴ）フィルムの両面に塗布、乾燥し、アジドスチ
レン−スチレン共重合体の皮膜を形成した。リン酸緩衝
液に０．０１％の割合で溶解した抗ＣＤ３４抗体溶液
に、前記処理をしたＰＥＴフィルムを１時間浸漬し、抗
ＣＤ３４抗体を吸着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線
を１分間照射した。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水
で水洗、乾燥した。EXAMPLES The present invention will be described in more detail by way of examples.
The present invention is not limited to the embodiments. << Example 1. >> i) Synthesis of azidostyrene 5 g of 3-nitrostyrene was suspended in 20 ml of a mixed solution of ethanol and concentrated hydrochloric acid, and SnC was dissolved in ethanol.
l 3 2H 2 O solution was added with vigorous stirring, at room temperature overnight, and allowed to react. The mixture was neutralized with NaOH, solid components were filtered off, and the product was extracted with ether from the filtrate. After drying the ether layer with MgSO 4 , concentrated sulfuric acid was added to obtain an intermediate. The intermediate was dissolved in 10 ml of 10% sulfuric acid solution,
After ice-cooling, a 1N NaNO 2 aqueous solution was added. After 2 hours, an aqueous NaN 3 solution was added, and the mixture was returned to room temperature and then stirred for 3 hours. Extract with ethyl acetate and extract with 0.1N
Washed with aqueous NaHCO 3 solution and purified water, MgSO 4
Was added and dried. The solvent was distilled off, and the residue was dissolved in a chloroform / hexane (1/4) mixed solvent and purified by a silica gel column. The solvent was distilled off to obtain 3-azidostyrene. ii) Synthesis of azidostyrene-styrene copolymer 1 mol of azidostyrene and 4 mol of styrene were diluted 5 times with benzene, and 0.01 equivalent of N, N'-azobisisobutyronitrile (AIBN) was added. , Degas, seal tube, 6
Polymerization was carried out at 0 ° C. for 4 hours. After allowing to cool, pour into methanol,
The precipitated azidostyrene-styrene copolymer was recovered. The number average molecular weight of the obtained copolymer was 100,000. iii) Preparation of anti-CD34 antibody-immobilized PET film The azidostyrene-styrene copolymer synthesized by the above method was dissolved in acetone to prepare a 1% solution. 100 ml of this solution was applied on both sides of a 1 m 2 polyethylene terephthalate (PET) film and dried to form a film of azidostyrene-styrene copolymer. The treated PET film was immersed in an anti-CD34 antibody solution dissolved in a phosphate buffer at a ratio of 0.01% for 1 hour to adsorb the anti-CD34 antibody, and then irradiated with ultraviolet rays for 1 minute using a high-pressure mercury lamp. did. Next, the PET film was washed with purified water and dried.
【００１３】《実施例２．》抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥ
Ｔフィルム充填カラムを用いた増血幹細胞の吸着実施例
１．で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルムを
１ｃｍ２四方に切断した後、１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、
更に、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄、乾燥
し、パイロジェンフリーのカラムに充填した。次に、パ
イロジェンフリーの１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ １６
４０培地で安定化させた。次に、Ｇ−ＣＳＦを５日間投
与後に採血した末梢血液１，０００ｍｌからＦｉｃｏｌ
ｌ Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて分
画し、１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に浮
遊したリンパ球画分１０ｍｌを前記カラムにａｐｐｌｙ
し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下させた。流出液を１ｍｌ
づつ分画した。各画分についてコールター社製フローサ
イトメトリーを用いて、抗ＣＤ３４抗体と反応する細胞
の検出を行なった。その結果、各画分から抗ＣＤ３４抗
体と反応する細胞は検出されず、ＣＤ４およびＣＤ８抗
体と反応する細胞が検出された。従って、末梢血液中の
増血幹細胞はすべて、抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィ
ルム充填カラムに吸着された。また、白血球画分は抗Ｃ
Ｄ３４抗体固定化ＰＥＴフィルム充填カラムには全く吸
着されなかった。Example 2 》 Anti-CD34 antibody-immobilized PE
Adsorption of hematopoietic stem cells using a T film packed column Example 1. The anti-CD34 antibody-immobilized PET film prepared in 1. was cut into 1 cm 2 squares, and then washed with 1N NaOH,
Furthermore, it was thoroughly washed with pyrogen-free purified water, dried, and packed in a pyrogen-free column. Next, RPMI 16 containing pyrogen-free 10% PBS
Stabilized in 40 medium. Next, Ficol was collected from 1,000 ml of peripheral blood collected after administration of G-CSF for 5 days.
l Paque (Pharmacia) was used for fractionation, and 10 ml of the lymphocyte fraction suspended in RPMI 1640 medium containing 10% PBS was applied to the column.
Then, it was made to flow down at a flow rate of 1 ml / min. 1 ml of effluent
Fractionated one by one. For each fraction, cells reacting with the anti-CD34 antibody were detected by using Coulter flow cytometry. As a result, cells reacting with the anti-CD34 antibody were not detected in each fraction, and cells reacting with the CD4 and CD8 antibodies were detected. Therefore, all the hematopoietic stem cells in the peripheral blood were adsorbed on the anti-CD34 antibody-immobilized PET film packed column. The white blood cell fraction is anti-C
It was not adsorbed at all on the column packed with the D34 antibody-immobilized PET film.
【００１４】《実施例３．》 ｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌに
ｐ−アジド安息香酸１０ｇを溶解、氷冷し、トリエチル
アミン８．５ｍｌを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブチ
ル８．３ｍｌを添加した。次に、ＤＭＦ３００ｍｌにヒ
ドロキシルエチルメタクリレート５．２ｍｌを溶解し、
前記溶液に添加し、６０℃で５時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し、１０％クエン酸水溶
液、精製水、４％ＮａＨＣＯ３水溶液で順次洗浄し、無
水ＮａＳＯ４を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレ
ートを得た。 ｉｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート１ｍｏｌとメチルメタクリレート４ｍｏ
ｌとをＤＭＦで２倍に希釈し、０．０１等量のＡＩＢＮ
を添加、脱気、封管し、６０℃で３時間重合した。冷却
後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したアジドベン
ゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート重合体を得た。得られた共重合体の数平均分子量は
１５万であった。 ｉｉｉ）抗ＣＤ４抗体固定化フラスコの調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶液各３０μ
ｌをポリアクリルアミド製フラスコの内面に塗布、乾燥
し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート共重合体の皮膜を形成した。前記処
理をしたポリアクリルアミド製フラスコの内面に、リン
酸緩衝液に０．０１％の割合で溶解した抗ＣＤ４抗体溶
液２００μｌを添加し、ＣＤ４抗体溶液を吸着させ、電
子線加速器（加速電圧２ＭｅＶ、電子線電流１ｍＡ）を
用いて、電子線を３０秒間照射した。次に、当該ポリア
クリルアミド製フラスコを精製水で水洗、乾燥した。Example 3 >> i) Synthesis of azidobenzoyloxyethyl methacrylate p-azidobenzoic acid 10 g was dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) 100 ml, ice-cooled, triethylamine 8.5 ml was added, and further isobutyl chloroformate 8.3 ml. Was added. Next, 5.2 ml of hydroxylethyl methacrylate was dissolved in 300 ml of DMF,
It was added to the above solution and stirred at 60 ° C. for 5 hours. The solvent was distilled off, ethyl acetate was added, extraction was performed, and the mixture was washed successively with 10% citric acid aqueous solution, purified water and 4% NaHCO 3 aqueous solution, and anhydrous NaSO 4 was added and dried. After the solvent was distilled off, the residue was dissolved in chloroform and purified with a silica gel column. The solvent was distilled off to obtain azidobenzoyloxyethyl methacrylate. ii) Azidobenzoyloxyethyl methacrylate-
Synthesis of methyl methacrylate copolymer 1 mol of azidobenzoyloxyethyl methacrylate and 4 mol of methyl methacrylate synthesized by the above method
1 and 2 times diluted with DMF, 0.01 equivalent of AIBN
Was added, degassed, sealed, and polymerized at 60 ° C. for 3 hours. After cooling, it was poured into a large amount of ethyl ether to obtain a precipitated azidobenzoyloxyethyl methacrylate-methyl methacrylate polymer. The number average molecular weight of the obtained copolymer was 150,000. iii) Preparation of anti-CD4 antibody-immobilized flask The azidobenzoyloxyethylmethacrylate-methylmethacrylate copolymer synthesized by the above method was dissolved in acetone to prepare a 1% solution. This solution is 30μ each
1 was applied to the inner surface of a polyacrylamide flask and dried to form a film of azidobenzoyloxyethyl methacrylate-methyl methacrylate copolymer. On the inner surface of the treated polyacrylamide flask, 200 μl of an anti-CD4 antibody solution dissolved in a phosphate buffer at a ratio of 0.01% was added to adsorb the CD4 antibody solution, and an electron beam accelerator (accelerating voltage 2 MeV, The electron beam was irradiated for 30 seconds using an electron beam current of 1 mA). Next, the polyacrylamide flask was washed with purified water and dried.
【００１５】《実施例４．》 ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌ
ｅｒ ｃｅｌｌの誘導 末梢血から沈殿法に従い、末梢血リンパ球を分離した。
次に、実施例３．で調製した抗ＣＤ４抗体固定化フラス
コを用いて、ＣＤ４＋末梢血リンパ球を分離し、ＩＬ−
２、自己血しょう、後期ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇ
ｅｎと共に２週間培養した。２週間後に前記操作により
得られた細胞（１ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ラ
ジオアイソトープ（５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム）標
識した、ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ−
Ｓ３：１ｘ１０２ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ｐｏｋｅｗ
ｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ（１μｇ／ｍｌ）とをｍｉｃｒ
ｏｔｅｓｔ ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌに取り、炭酸ガス培
養器で８時間培養した。キラー活性の検量は、リンパ球
浮遊液の代りにＲＰＭＩ １６４０培地を添加したもの
を０％、リンパ球浮遊液の代りに２％ＳＤＳを添加した
ものを１００％とした。キラー活性の検量の結果、８時
間後にｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ内の
Ｈｅｌａ細胞は消滅し、ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌの誘導が確認さ
れた。Example 4 》 Lymphokine-activated kill
Induction of er cell Peripheral blood lymphocytes were separated from peripheral blood according to the precipitation method.
Next, in Example 3. The CD4 + peripheral blood lymphocytes were separated using the anti-CD4 antibody-immobilized flask prepared by
2, autologous plasma, late pokeweed mitog
Cultured with en for 2 weeks. Two weeks later, cells (1 × 10 4 cells / well) obtained by the above-mentioned procedure and radioisotope ( 51 Cr-sodium chromate) -labeled human cervical cancer-derived Hela cells (Hela-
S3: 1 × 10 2 cells / well) and pokew
Seed mitogen (1 μg / ml) with micr
It was taken in an otest plate well and cultured in a carbon dioxide incubator for 8 hours. The killer activity was calibrated at 0% when RPMI 1640 medium was added instead of the lymphocyte suspension, and at 100% when 2% SDS was added instead of the lymphocyte suspension. As a result of the killer activity calibration, Hela cells in the microtest plate well disappeared after 8 hours, and lymphokine-act was detected.
Induction of an ivated killer cell was confirmed.
【００１６】《実施例５．》 抗ＣＤ４抗体固定化不織布の調製 ラジカル重合により、２−（４−アジドベンゾイルオキ
シ）エチルメタクリレート：スチレン：ｏ−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体（仕込モル比３：６：
１）（以下ＰＡＳＮ）を合成した。デュポン社製不織布
（Ｓｏｎｔａｒａ８００５）に、前記ＰＡＳＮを塗布、
薄膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不織布
に０．０１％の抗ＣＤ４抗体と水溶性カルボジイミドを
含有するリン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で１６時間反応
させた。次に当該不織布を１ＭのＮａＣｌ水溶液および
リン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。Example 5 Preparation of Non-CD4 Antibody-Immobilized Nonwoven Fabric By radical polymerization, terpolymer of 2- (4-azidobenzoyloxy) ethyl methacrylate: styrene: o-nilobenzyl acrylate (molar ratio of 3: 6:
1) (hereinafter PASN) was synthesized. The PASN is applied to a DuPont non-woven fabric (Sonara 8005),
After forming the thin film, it was irradiated with ultraviolet rays. Next, the nonwoven fabric was immersed in a phosphate buffer containing 0.01% of anti-CD4 antibody and water-soluble carbodiimide, and reacted at 37 ° C. for 16 hours. Next, the nonwoven fabric was washed and dried with a 1 M NaCl aqueous solution and a phosphate buffer solution.
【００１７】《実施例６．》 末梢血リンパ球の分離 実施例５で調製した抗ＣＤ４抗体固定化不織布１０ｇを
カラムに充填した。次に、当該カラム３％のストレプト
マイシンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した後、
パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄し、無菌的に
乾燥した。続いて、当該カラムをガンマ線滅菌した。多
発性硬化症患者から採血した血液から血しょう分離器を
用いて、血しょうを分離した。当該血しょう５０ｍｌを
上記カラムにアプライし、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流出
させた。カラム流出血しょうをプールし、コールター社
製フローサイトメトリーにより分析した。その結果、カ
ラム流出血しょうからは、ＣＤ４＋細胞（リンパ球）は
検出されなかった。Example 6 >> Separation of peripheral blood lymphocytes The column was filled with 10 g of the anti-CD4 antibody-immobilized nonwoven fabric prepared in Example 5. Next, after thoroughly washing the column with a phosphate buffer containing 3% streptomycin,
It was thoroughly washed with pyrogen-free purified water and aseptically dried. Subsequently, the column was sterilized with gamma rays. Plasma was separated from blood collected from a patient with multiple sclerosis using a plasma separator. 50 ml of the plasma was applied to the column and allowed to flow out at a flow rate of 1 ml / min. Column hemorrhage was pooled and analyzed by Coulter flow cytometry. As a result, CD4 + cells (lymphocytes) were not detected in the column hemorrhage plasma.
【００１８】《実施例７．》 抗ＣＤ３４抗体固定化不織布の調製 デュポン社製不織布（Ｓｏｎｔａｒａ ８００５）に、
ポリイソプロピルアクリルアミドを塗布、薄膜を形成し
た後電子線を照射し、ポリイソプロピルアクリルアミド
をグラフト重合した。当該不織布に、ＰＡＳＮ を塗
布、薄膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不
織布に１％の抗ＣＤ３４抗体と水溶性カルボジイミドを
含有するリン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で１６時間反応
させた。次に当該不織布を１ＭのＮａＣｌ水溶液および
リン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。Example 7. >> Preparation of Anti-CD34 Antibody-Immobilized Nonwoven Fabric A non-woven fabric (Sontara 8005) manufactured by DuPont Co.,
After coating polyisopropylacrylamide and forming a thin film, it was irradiated with an electron beam, and polyisopropylacrylamide was graft-polymerized. PASN was applied to the nonwoven fabric to form a thin film, which was then irradiated with ultraviolet rays. Next, the nonwoven fabric was dipped in a phosphate buffer containing 1% of anti-CD34 antibody and water-soluble carbodiimide, and reacted at 37 ° C. for 16 hours. Next, the nonwoven fabric was washed and dried with a 1 M NaCl aqueous solution and a phosphate buffer solution.
【００１９】《実施例８．》 抗ＣＤ３４＋細胞の分離 実施例７で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化不織布１０ｇ
をカラムに充填した。次に、当該カラムを３％のストレ
プトマイシンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した
後、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗浄し、無菌
的に乾燥した。続いて、当該カラムをガンマ線滅菌し
た。Ｇ−ＣＳＦを３日間投与した健常人から採血した血
液から血しょう分離器を用いて、血しょうを分離した。
当該血しょう５０ｍｌを前記カラムにアプライし、１ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で流出させた。当該カラムを１００ｍ
ｌのリン酸緩衝液で充分に洗浄した後、当該カラムを３
７℃で３０分インキュベートした後、当該カラムを３７
℃に加温したリン酸緩衝液１００ｍｌで洗浄し、ＣＤ３
４＋細胞を回収した。カラム流出血しょうをプールし、
コールター社製フローサイトメトリーにより分析した。
その結果、カラム流出血しょうからは、ＣＤ３４＋細胞
は検出されなかった。上記健常人から採血し、カラム処
理を行なわない血しょうについて、同様にフローサイト
メトリー分析を行なった。その結果、ＣＤ３４＋細胞が
検出された。Example 8. >> Separation of anti-CD34 + cells 10 g of anti-CD34 antibody-immobilized non-woven fabric prepared in Example 7
Was packed in the column. Next, the column was thoroughly washed with a phosphate buffer containing 3% streptomycin, then thoroughly washed with pyrogen-free purified water, and aseptically dried. Subsequently, the column was sterilized with gamma rays. Plasma was separated from blood collected from a healthy person who had been administered G-CSF for 3 days, using a plasma separator.
Apply 50 ml of the plasma to the column and apply 1m
Flow out at a flow rate of 1 / min. The column is 100m
After thoroughly washing with 1 l of phosphate buffer, the column was washed with 3
After incubating for 30 minutes at 7 ° C., the column is incubated at 37 ° C.
Wash with 100 ml of phosphate buffer warmed to ℃, CD3
4 + cells were collected. Pool the column hemorrhage
The analysis was performed by Coulter flow cytometry.
As a result, CD34 + cells were not detected in the column hemorrhage plasma. Blood was collected from the healthy person and plasma was not subjected to column treatment, and similarly subjected to flow cytometric analysis. As a result, CD34 + cells were detected.
【００２０】《実施例９．》 ＣＤ３４＋細胞の分離 規定量のＧ−ＣＳＦを５日間投与後に採血した末梢血液
１，０００ｍｌからＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）を用いて分画し、１０％ＰＢＳを含
むＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊したリンパ球画分１０
ｍｌをデュポン社製不織布（Ｓｏｎｔａｒａ ８００
５：未処理）充填カラムにアプライし、１ｍｌ／ｍｉｎ
の流速で流出させた。次に、当該カラムを１００ｍｌの
リン酸緩衝液で充分に洗浄し、白血球を流出させた後、
非流出画分を物理的に溶出させ、プールした。プールし
た画分をコールター社製フローサイトメトリーにより分
析した。その結果、プールした画分からは、アプライ画
分の９５％のＣＤ３４＋細胞と５％の白血球画分が検出
された。Example 9. >> Separation of CD34 + cells From 1000 ml of peripheral blood collected after administration of a specified amount of G-CSF for 5 days, Ficoll Paque (Pha
lymphocyte fraction 10 suspended in RPMI 1640 medium containing 10% PBS and fractionated using 10% PBS.
ml non-woven fabric manufactured by DuPont (Sontara 800
5: Untreated) Apply to packed column, 1 ml / min
At a flow rate of Next, after thoroughly washing the column with 100 ml of a phosphate buffer to allow leukocytes to flow out,
The non-runoff fractions were physically eluted and pooled. Pooled fractions were analyzed by Coulter flow cytometry. As a result, 95% of CD34 + cells and 5% of white blood cell fraction in the applied fraction were detected from the pooled fractions.
【００２１】《実施例１０．》 ＣＤ３４細胞の定量 実施例３の方法に準じて９６穴マイクロタイタープレー
トを調製した。当該マイクロタイタープレートに骨髄液
からＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅにより調製したリンパ球
画分１００μｌを分取し、室温で３０分インキュベート
した。次に当該マイクロタイタープレートの各穴をリン
酸緩衝液２００μｌで３回洗浄した。次に当該マイクロ
タイタープレートの各穴に酵素標識抗ＣＤ３４抗体２０
０μｌを分取し、室温で３０分インキュベートした。次
に当該マイクロ タイタープレートの各穴をリン酸緩衝
液２００μｌで３回洗浄した。次に当該マイクロタイタ
ープレートの各穴に酵素基質液２００μｌを分取し、室
温で３０分イソキュベートした。３０分後に、当該マイ
クロタイタープレートの各穴に反応停止液２００μｌを
分取し反応を停止した。標準ＣＤ３４細胞を用いて同様
の操作を行ない、描いた検量線から、ＣＤ３４細胞の量
を求めた。Example 10 >> Quantification of CD34 cells According to the method of Example 3, a 96-well microtiter plate was prepared. 100 μl of the lymphocyte fraction prepared by Ficoll Paque was collected from the bone marrow fluid into the microtiter plate and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, each well of the microtiter plate was washed 3 times with 200 μl of phosphate buffer. Next, the enzyme-labeled anti-CD34 antibody 20 was added to each hole of the microtiter plate.
0 μl was taken out and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, each well of the microtiter plate was washed 3 times with 200 μl of phosphate buffer. Next, 200 μl of the enzyme substrate solution was dispensed into each hole of the microtiter plate, and was incubated at room temperature for 30 minutes. After 30 minutes, 200 μl of the reaction stop solution was dispensed into each hole of the microtiter plate to stop the reaction. The same operation was performed using standard CD34 cells, and the amount of CD34 cells was determined from the drawn calibration curve.
【００２２】《実施例１１．》 抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィルム充填カラムを用い
た増血幹細胞の吸着 実施例１．で調製した抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴフィ
ルムを１ｃｍ２四方に切断した後、１Ｎ ＮａＯＨで洗
浄し、更に、パイロジェンフリーの精製水で充分に洗
浄、乾燥し、パイロジェンフリーのカラムに充填した。
次に、パイロジェンフリーの１０％ＰＢＳを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で安定化させた。次に、規定量のＧ−Ｃ
ＳＦを５日間投与した健康人末梢血液１，０００ｍｌか
らＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を用いて分画し、１０％ＰＢＳを含むＲＰＭＩ １
６４０培地に浮遊したリンパ球画分１０ｍｌにラジオア
イソトープ（５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム）標識した
ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ−Ｓ３：１
ｘ１０４ｃｅｌｌｓ）を混合した後、前記カラムにａｐ
ｐｌｙし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下させ、流出液を１
ｍｌづつ分画した。各画分についてコールター社製フロ
ーサイトメトリーを用いて、抗ＣＤ３４抗体と反応する
細胞の検出を行なった。その結果、各画分から抗ＣＤ３
４抗体と反応する細胞およびラジオアイソトープ標識し
たヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞は検出されず、ＣＤ
４およびＣＤ８抗体と反応する細胞が検出された。従っ
て、末梢血液中の増血幹細胞はすべて、抗ＣＤ３４抗体
固定化ＰＥＴフィルム充填カラムに吸着された。また、
白血球画分およびラジオアイソトープ標識したヒト子宮
頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞は抗ＣＤ３４抗体固定化ＰＥＴ
フィルム充填カラムには全く吸着されなかった。Example 11 >> Adsorption of hematopoietic stem cells using a column packed with an anti-CD34 antibody-immobilized PET film Example 1. The anti-CD34 antibody-immobilized PET film prepared in 1. was cut into 1 cm 2 squares, washed with 1N NaOH, further thoroughly washed with pyrogen-free purified water, dried, and packed in a pyrogen-free column.
Next, RPM containing pyrogen-free 10% PBS
Stabilized with I1640 medium. Next, a specified amount of G-C
RPMI 1 containing 10% PBS was fractionated from 1,000 ml of peripheral blood of a healthy person who had been administered SF for 5 days using Ficoll Paque (manufactured by Pharmacia).
Human cervical cancer-derived Hela cells (Hela-S3: 1) labeled with radioisotope ( 51 Cr-sodium chromate) in 10 ml of a lymphocyte fraction suspended in 640 medium.
x10 4 cells) and mixed with the column.
ply and let it flow down at a flow rate of 1 ml / min.
Fractionation was performed for each ml. For each fraction, cells reacting with the anti-CD34 antibody were detected by using Coulter flow cytometry. As a result, anti-CD3 was extracted from each fraction.
Cells reacting with 4 antibody and radioisotope-labeled human cervical cancer-derived Hela cells were not detected, and CD
Cells reactive with 4 and CD8 antibody were detected. Therefore, all the hematopoietic stem cells in the peripheral blood were adsorbed on the anti-CD34 antibody-immobilized PET film packed column. Also,
Hela cells derived from human cervical cancer labeled with leukocyte fraction and radioisotope were anti-CD34 antibody-immobilized PET.
It was not adsorbed on the film packed column at all.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 光化学反応による、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の担体への共有結合方法と、そ の担体を用いた細胞の分画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉ ｌｌｅｒ ｃｅｌｌの誘導方法。 ─────────────────────────────────────────────────── ───Continued from the front page (54) [Title of the Invention] A method for covalently binding a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen to a carrier by a photochemical reaction, a method for fractionating and quantifying cells using the carrier, and Lymphokine Activated Method for inducing Killer cell.
Claims (17)
合物を塗布した後、白血球分化抗原に対するモノクロー
ナル抗体溶液を塗布し、更に光を照射することことから
なる、白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体の共
有結合方法。1. A covalent bond of a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen, which comprises coating a compound having an azide group on the surface of an insoluble carrier, coating a solution of a monoclonal antibody against the leukocyte differentiation antigen, and irradiating with light. Method.
エステル基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射
によりカルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を
用いて白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を化
学結合させる方法とからなる、白血球分化抗原に対する
モノクローナル抗体の共有結合方法。2. A monoclonal film against a leukocyte differentiation antigen using a water-soluble condensing agent after forming a thin film of a copolymer having an o-nitrobenzyl ester group on the surface of an insoluble carrier and then generating a carboxyl group by light irradiation. A method for covalently binding a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen, which comprises chemically binding the antibody.
ｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることに
より、フェニルアジド基を導入した白血球分化抗原に対
するモノクローナル抗体を被固定化担体に塗布した後、
更に光を照射することことからなる、白血球分化抗原に
対するモノクローナル抗体の共有結合方法。3. A p-azidobenzoy in a buffer solution.
A monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen having a phenylazide group introduced therein is applied to an immobilization carrier by reacting with loxy succinimide,
A method of covalently binding a monoclonal antibody to a leukocyte differentiation antigen, which comprises irradiating with light.
項３記載の方法により、白血球分化抗原に対するモノク
ローナル抗体を共有結合したことを特徴とする、不溶性
担体および実験器具。4. An insoluble carrier and a laboratory instrument, wherein a monoclonal antibody against a leukocyte differentiation antigen is covalently bound by the method according to claim 1, 2, or 3.
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、細
胞を分画する方法。5. A method for fractionating cells using an insoluble carrier prepared by the method according to claim 1, 2, or 3.
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、細
胞を分画除去する方法。6. A method for fractionating and removing cells using the insoluble carrier prepared by the method according to claim 1, 2, or 3.
項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、分
画した細胞を定量する方法。7. A method for quantifying fractionated cells using an insoluble carrier prepared by the method according to claim 1, 2, or 3.
項３記載の方法により抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を共有
結合した不溶性担体と、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２と
末梢血リンパ球とをｉｎ ｖｉｔｒｏにより培養し、Ｌ
ｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅ
ｒ ｃｅｌｌを誘導する方法。8. An in vitro culture of an insoluble carrier to which an anti-CD3 antibody (OKT3) is covalently bound, interleukin-2, and peripheral blood lymphocytes by the method according to claim 1, 2, or 3. Then L
ymphokine Activated Kille
A method of inducing r cell.
項３記載の方法により抗ＣＤ４抗体を共有結合した不溶
性担体または、ＣＤ８抗体を共有結合した不溶性担体を
用いて、末梢血リンパ球からＣＤ４＋細胞を分画した
後、分画したＣＤ４＋細胞をｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
２と共に，ｉｎ ｖｉｔｒｏにより培養し、Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅ
ｌｌを誘導する方法。9. From peripheral blood lymphocytes using an insoluble carrier covalently bound to an anti-CD4 antibody or an insoluble carrier covalently bound to a CD8 antibody by the method according to claim 1, 2, or 3. CD4 + cells were fractionated, fractionated CD4 + cells interleukin-
2 and cultured in vitro to produce Lymph
kine Activated Killer ce
A method of inducing ll.
項３記載の方法により抗ＣＤ３４抗体を共有結合した不
溶性担体、および抗ＣＤ３８抗体を共有結合した不溶性
担体および、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を共有結合した不溶性担
体および、抗ＨＬＡ−Ｂ抗体を共有結合した不溶性担体
および、抗ＨＬＡ−Ｃ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体を共有結合した不溶性担体お
よび、ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｐｏｓｉｔｉｎｇ
ｕｎｉｔとを用いて造血幹細胞を分画する方法。10. An insoluble carrier covalently bound with an anti-CD34 antibody, an insoluble carrier covalently bound with an anti-CD38 antibody, and an anti-HLA-A antibody by the method according to claim 1, 2, or 3. Insoluble carrier covalently bound, anti-HLA-B antibody covalently bound insoluble carrier, anti-HLA-C antibody covalently bound insoluble carrier, and anti-HLA-DR antibody covalently bound insoluble carrier, and anti-HLA-DP Insoluble carrier covalently bound with antibody, insoluble carrier covalently bound with anti-HLA-DQ antibody, and single cell disposing
A method of fractionating hematopoietic stem cells using unit.
項３記載の方法により抗ＣＤ３４抗体を共有結合した不
溶性担体、および抗ＣＤ３８抗体を共有結合した不溶性
担体および、血しょう分離器、および請求項１４記載の
繊維製品を用いて造血幹細胞を分画する方法。11. An insoluble carrier covalently bound with an anti-CD34 antibody by the method according to claim 1, 2, or 3, and an insoluble carrier covalently bound with an anti-CD38 antibody, and a plasma separator, and A method for fractionating hematopoietic stem cells using the fiber product according to claim 14.
により分画した造血幹細胞をサイトカインと共にｉｎ
ｖｉｔｒｏ法により増殖する方法。12. A hematopoietic stem cell fractionated by the method according to claim 10 or 11 in combination with a cytokine.
A method of proliferating by the vitro method.
およびセルロース、およびポリアクリルアミド、および
ポリアクリル酸、およびメタクリル酸、およびポリメチ
ルメタクリレート、およびポリイソプロピルアクリルア
ミド、およびポリエステル、およびポリアミド、および
ポリエチレン、およびポリプロピレン、およびポリスチ
レンの中から選択されたことを特徴とする請求項４記載
の不溶性担体および実験器具。13. The insoluble carrier is polyvinyl alcohol,
And cellulose, and polyacrylamide, and polyacrylic acid and methacrylic acid, and polymethylmethacrylate, and polyisopropylacrylamide, and polyester, and polyamide, and polyethylene, and polypropylene, and polystyrene, and The insoluble carrier and the laboratory instrument according to claim 4.
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／
ｃｍ３であることを特徴とする繊維製品。14. A pulp containing 10 to 90%, a fiber diameter of 3 to 50 μm, and a fiber density of 0.3 to 1.5 g /
A textile product characterized by being cm 3 .
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５ｇ／
ｃｍ３であることを特徴とする繊維製品を充填したカラ
ム。15. A pulp containing 10 to 90%, a fiber diameter of 3 to 50 μm, and a fiber density of 0.3 to 1.5 g /
A column packed with a textile product, characterized in that it is cm 3 .
維径が３〜５０μｍで、繊維密度が０．３〜１．５８／
ｃｍ３であることを特徴とする繊維製品を用いた造血幹
細胞の分画方法。16. A pulp containing 10 to 90% of a fiber having a fiber diameter of 3 to 50 μm and a fiber density of 0.3 to 1.58 /
A method for fractionating hematopoietic stem cells using a fiber product, which is characterized in that the size is cm 3 .
項３記載の方法により調製した不溶性担体および請求項
１４記載の繊維製品を用いて、細胞を分画する方法。17. A method for fractionating cells using the insoluble carrier prepared by the method according to claim 1, 2 or 3, and the fiber product according to claim 14.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6191727A JPH0829428A (en) | 1994-07-11 | 1994-07-11 | Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6191727A JPH0829428A (en) | 1994-07-11 | 1994-07-11 | Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0829428A true JPH0829428A (en) | 1996-02-02 |
Family
ID=16279491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6191727A Pending JPH0829428A (en) | 1994-07-11 | 1994-07-11 | Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0829428A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003101611A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Japan Envirochemicals, Ltd. | Isolation material for hormone disrupting substance, method of concentrating and method of clean-up |
| WO2005085857A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Nisshinbo Industries, Inc. | Immobilized biomolecule and method of detecting substance capable of interacting with biomolecule |
| JP2011520111A (en) * | 2008-05-09 | 2011-07-14 | リュー，ジーピン | Molecular detection system |
-
1994
- 1994-07-11 JP JP6191727A patent/JPH0829428A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003101611A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Japan Envirochemicals, Ltd. | Isolation material for hormone disrupting substance, method of concentrating and method of clean-up |
| WO2005085857A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Nisshinbo Industries, Inc. | Immobilized biomolecule and method of detecting substance capable of interacting with biomolecule |
| JP2011520111A (en) * | 2008-05-09 | 2011-07-14 | リュー，ジーピン | Molecular detection system |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0701130B1 (en) | Device and process for cell capture and recovery | |
| US20210115401A1 (en) | Methods and Materials for the Generation of Regulatory T Cells | |
| Dainiak et al. | Methods in cell separations | |
| JP3137633B2 (en) | Dissociation of cells from affinity matrix | |
| EP1377609B1 (en) | Mhc molecule constructs and their uses for diagnosis and therapy | |
| CA2330678C (en) | Method of direct selection of antigen-specific t cells | |
| US5773224A (en) | Immunoselection system for cell elution | |
| US7598081B2 (en) | Materials and procedures for the purification of cells | |
| AU2002240818A1 (en) | MHC molecule constructs and their uses for diagnosis and therapy | |
| US6143508A (en) | Device and process for cell capture and recovery | |
| Kawanishi et al. | K-cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in chronic active liver disease | |
| JPH0829428A (en) | Covalent bonding method of monoclonal antibody against white corpuscle-differentiated antigen to carrier by photochemical reaction, fractional quantitative determining method of cell using this carrier, and guiding method of lymphokine activated killer cell | |
| CN113150981A (en) | Method for simulating influence of cytokine release on indirect target cell phenotype in vitro | |
| JP2006158305A (en) | Adsorbent for separating cell, adsorbent module for separating cell and method for separating cell | |
| JPH07120452A (en) | Selective separation method for cell | |
| JPH07113799A (en) | Selective separating method for cell | |
| JPH06269499A (en) | Cell separation and its device | |
| WO2023161961A1 (en) | A system and method for t cell activation and immunomodulation | |
| JPH1033165A (en) | Selective separation of hematopoietic undifferentiated cell and separator | |
| JPS61227798A (en) | Separation of cell | |
| JPH09322757A (en) | Cell separating purification material, cell separating purifier and cell separating purification | |
| JPH09107956A (en) | Cell culture starting composition and its production |