JPH08291198A - Peptide mixture having infection protecting action in vivo and composition containing the same peptide mixture - Google Patents
Peptide mixture having infection protecting action in vivo and composition containing the same peptide mixtureInfo
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- JPH08291198A JPH08291198A JP7094893A JP9489395A JPH08291198A JP H08291198 A JPH08291198 A JP H08291198A JP 7094893 A JP7094893 A JP 7094893A JP 9489395 A JP9489395 A JP 9489395A JP H08291198 A JPH08291198 A JP H08291198A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】この発明は、ラクトフェリン加水
分解物より分画され、生体内において感染防御作用を有
し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物（以下糖鎖ペプチ
ド混合物と記載する）と、この糖鎖ペプチド混合物を有
効成分として含有する食品、医薬品または飼料等の組成
物に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
それ自体生体外では全く抗菌活性を示さず、ヒトおよび
動物に経口的に投与することにより、生体内において細
菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染
を防御し、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管
からの微生物の臓器侵入等の疾病を予防する効果を有す
るラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物と、この糖
鎖ペプチド混合物を有効成分として含有する組成物に関
するものである。This invention relates to a peptide mixture (hereinafter referred to as a sugar chain peptide mixture) which is fractionated from a lactoferrin hydrolyzate, has an in vivo protective action, and has a sugar chain. The present invention relates to a composition such as a food, a drug or a feed containing a glycopeptide mixture as an active ingredient. More specifically, the present invention is
It does not show any antibacterial activity in vitro itself, and by oral administration to humans and animals, it protects against infection by pathogenic microorganisms such as bacteria, viruses, molds, yeasts, etc. in vivo and causes diarrhea, food poisoning, and bacteria. The present invention relates to a lactoferrin-derived sugar chain peptide mixture having an effect of preventing diseases such as enteritis, sepsis, and invasion of microorganisms from the digestive tract, and a composition containing the sugar chain peptide mixture as an active ingredient.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近代における衛生、栄養の向上、または
抗生物質等を用いた化学療法の発展により、細菌、ウイ
ルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症は著し
く減少した。しかしながら、耐性微生物の出現により、
新たな抗生物質の開発が常に余儀なくされており、抗生
物質投与によるショック死、菌交代症等の副作用の深刻
な問題を惹起している。従って、安全で副作用のない新
たな抗菌剤または感染防御剤の開発が期待されている。2. Description of the Related Art Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and yeasts have been remarkably reduced due to modern hygiene, improvement of nutrition, and development of chemotherapy using antibiotics. However, due to the emergence of resistant microorganisms,
The development of new antibiotics is always inevitable, causing serious problems of side effects such as shock death and bacterial symptomatosis due to antibiotic administration. Therefore, it is expected to develop a new antibacterial agent or infection preventive agent that is safe and has no side effects.
【０００３】ラクトフェリンは涙、唾液、末梢血、乳汁
中に含まれている鉄結合性糖蛋白質であり、従来より大
腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物
に対して生体外で抗菌作用を示すことが知られている
［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of P
ediatrics ）、第９４巻、第１〜９ページ、１９７９
年］。Lactoferrin is an iron-binding glycoprotein contained in tears, saliva, peripheral blood, and milk, and has conventionally exhibited an antibacterial action against harmful microorganisms such as Escherichia coli, Candida, Clostridia, etc. in vitro. It is known that [Journal of Pediatrics (Journal of P
ediatrics), Vol. 94, pp. 1-9, 1979
Year].
【０００４】ラクトフェリンに結合している糖鎖の機能
については、ヒトラクトフェリンの加水分解物からクロ
マトグラフィーにより精製して得られた糖ペプチドに赤
痢菌（Shigella flexneri ）の腸管粘膜細胞への付着を
生体外で阻害する活性が認められている［インフェクシ
ョン・アンド・イミュニティー（Infection and Immuni
ty）、第３５巻、第１１１０〜１１１８ページ、１９８
２年］。また、ラクトフェリンの糖鎖構造は生物種の間
で差異のあることが明らかにされている［バイオキミー
（Biochimie ）、第７０巻、第１４５９〜１４６９ペー
ジ、１９８８年］が、ウシラクトフェリン由来糖鎖ペプ
チドの生体内における生理活性に関する報告は現在に至
るまで全くなされていない。Regarding the function of the sugar chain bound to lactoferrin, the glycopeptide obtained by purifying the hydrolyzate of human lactoferrin by chromatography was found to adhere to Shigella flexneri intestinal mucosal cells in vivo. Inhibition activity is recognized outside [Infection and Immunity (Infection and Immuni
ty), vol. 35, pages 1110-1118, 198.
2 years]. Further, it has been clarified that the sugar chain structure of lactoferrin is different among biological species [Biochimie, Vol. 70, pp. 1459-1469, 1988]. Up to the present, no report has been made on the physiological activity of the in vivo.
【０００５】一方、ウシラクトフェリンの生理作用につ
いては、病原性大腸菌の腸管粘膜への付着に対する阻止
作用［第２５回日本無菌生物ノートバイオロジー学会総
会、抄録第２２ページ、、１９９２年］、リゾチーム共
存下での大腸菌の菌体凝集活性［ジャーナル・オブ・ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー（Journal of Agricultural and Biological Chemi
stry）、第５３巻、第１７０５〜１７０６ページ、１９
８９年］等が報告されている。さらに、ラクトフェリ
ン、その加水分解物およびラクトフェリン由来の抗菌性
ペプチドについては、、アポラクトフェリンおよびリゾ
チームを有効成分とする抗菌性組成物（特開昭６２ー２
４９９３１号公報）、ラクトフェリン加水分解物を有効
成分とする抗菌剤（特開昭５ー３２００６８号公報）、
抗菌性ペプチドおよび抗菌剤（特開平５ー９２９９４号
公報）、病原性菌付着防止剤およびそれを含有する飲食
品（特開平３ー２２０１３０号公報）等、多くの食品、
医薬品への応用例が報告されている。On the other hand, regarding the physiological action of bovine lactoferrin, the inhibitory action against the adhesion of pathogenic Escherichia coli to the intestinal mucosa [The 25th Annual Meeting of the Society for Aseptic Biology in Japan, Abstract, page 22, 1992], coexistence with lysozyme Agglutination activity of Escherichia coli under the following conditions [Journal of Agricultural and Biological Chemi
stry), Vol. 53, pp. 1705-1706, 19
1989] and the like are reported. Furthermore, regarding lactoferrin, its hydrolyzate, and antibacterial peptides derived from lactoferrin, an antibacterial composition containing apolactoferrin and lysozyme as active ingredients (JP-A-62-2)
49931), an antibacterial agent containing a lactoferrin hydrolyzate as an active ingredient (JP-A-5-320068),
Many foods such as antibacterial peptides and antibacterial agents (Japanese Patent Laid-Open No. 5-92994), pathogenic bacteria adhesion preventive agents and foods and drinks containing the same (Japanese Patent Laid-Open No. 3-220130),
An example of application to a pharmaceutical has been reported.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
ラクトフェリンおよびラクトフェリン関連物質は、いず
れも生体外で抗菌活性が既に確認されたものであり、そ
れ自体生体外では抗菌活性を示さない糖鎖ペプチド混合
物、特にラクトフェリン加水分解物から分画された糖鎖
ペプチド混合物の生理活性は全く知られておらず、その
用途に関する報告も皆無である。However, the above-mentioned lactoferrin and lactoferrin-related substances have already been confirmed to have antibacterial activity in vitro, and a mixture of glycopeptides that does not exhibit antibacterial activity in vitro per se. Especially, the physiological activity of the sugar chain peptide mixture fractionated from the lactoferrin hydrolyzate is not known at all, and there is no report on its use.
【０００７】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、経口的に摂取しても安全であり、
生体内における細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性
微生物による感染症を効果的に防御するペプチド混合物
と、このペプチド混合物を有効成分として含有する組成
物を提供することを目的としている。The present invention has been made in view of the above circumstances, and is safe to be taken orally,
It is an object of the present invention to provide a peptide mixture that effectively protects against infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and yeasts in vivo, and a composition containing the peptide mixture as an active ingredient.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】この発明は、前記の課題
を解決するものとして、ラクトフェリン加水分解物より
分画され、次のａ）〜ｄ） ａ）生体内で病原性微生物による感染を防御すること、 ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、 ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であることおよび、 ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、の理化
学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプ
チド混合物を提供する。[Means for Solving the Problems] The present invention, in order to solve the above-mentioned problems, is fractionated from a lactoferrin hydrolyzate, and the following a) to d) a) are protected against infection by pathogenic microorganisms in vivo. B) has no antibacterial activity in vitro, c) has a molecular weight of 42,000 or less as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and d) has a sugar content of 20% (weight) or more. And a peptide mixture having physicochemical and biological activities, and having a sugar chain.
【０００９】また、このペプチド混合物は、ラクトフェ
リン加水分解物から生体外で抗菌作用を有するペプチド
を分画除去した残渣より分画されたペプチド混合物であ
ることを望ましい態様としてもいる。さらにこの発明
は、ラクトフェリン加水分解物より分画され、次のａ）
〜ｄ） ａ）生体内で病原性微生物による感染を防御すること、 ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、 ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であること、および ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、の理化
学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプ
チド混合物を有効成分として含有する組成物をも提供す
る。It is also preferable that the peptide mixture is a peptide mixture fractionated from a residue obtained by fractionating and removing a peptide having an antibacterial activity in vitro from a lactoferrin hydrolyzate. Furthermore, this invention is fractionated from lactoferrin hydrolyzate, and
-D) a) Protecting from infection by pathogenic microorganisms in vivo, b) Having no antibacterial activity in vitro, and c) Molecular weight measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis is 42,000 or less. And d) a sugar content of 20% (by weight) or more, which also has a physicochemical and biological activity, and a composition containing a peptide mixture having a sugar chain as an active ingredient. .
【００１０】そして、この組成物においては、ペプチド
混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％
（重量。以下断りのない限り同じ）含有されていること
を望ましい態様としてもいる。以下、この発明について
詳しく説明する。この発明の糖鎖ペプチド混合物の出発
物質となるラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、
牛乳、脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換
クロマトグラフィー）により分離したラクトフェリン、
それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフ
ェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン
等の金属で結合させた金属飽和若しくは部分飽和ラクト
フェリン、またはこれらの混合物であり、公知の方法に
より調製することができる。出発物質となるラクトフェ
リンは、ウシ由来のものが最も望ましいが、ヒト、ヤ
ギ、ヒツジ、水牛等から得られるものであってもよい。Further, in this composition, the peptide mixture contains at least 0.01% in the state of use.
It is also desirable that the content (weight; the same unless otherwise noted) be contained. Hereinafter, the present invention will be described in detail. Lactoferrin, which is the starting material of the glycopeptide mixture of the present invention, is commercially available lactoferrin,
Lactoferrin separated from milk, skim milk, whey, etc. by a conventional method (for example, ion exchange chromatography),
Apolactoferrin dehydroferred with hydrochloric acid, citric acid, etc., metal saturated or partially saturated lactoferrin in which apolactoferrin is bound with a metal such as iron, copper, zinc, manganese, or a mixture thereof, prepared by a known method. can do. The starting material, lactoferrin, is most preferably derived from bovine, but may be obtained from human, goat, sheep, buffalo and the like.
【００１１】この発明の糖鎖ペプチド混合物を得るため
に用いられるラクトフェリン加水分解物は、例えば、特
開平５ー２３８９４８号公報に記載の方法により製造す
ることができる。ラクトフェリンの加水分解にはどのよ
うなプロテアーゼを用いてもよいが、糖鎖ペプチド混合
物の高い感染防御活性が得られるペプシンまたはトリプ
シンが望ましい。The lactoferrin hydrolyzate used for obtaining the glycopeptide mixture of the present invention can be produced, for example, by the method described in JP-A-5-238948. Any protease may be used for the hydrolysis of lactoferrin, but pepsin or trypsin, which gives a high protective activity against infection of the glycopeptide mixture, is preferable.
【００１２】また、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、
ラクトフェリンの加水分解物から（例えば疎水性クロマ
トグラフィーによって）生体外で抗菌性を有するペプチ
ドを分画した残渣として得られるペプチドの混合物から
分画することもできる。この発明の糖鎖ペプチド混合物
は、これらのラクトフェリンの加水分解物またはペプチ
ドの混合物から、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性
クロマトグラフィー、限外濾過等の常法により分画する
ことができる。分画した糖鎖ペプチド混合物は、常法
（例えば、減圧加熱濃縮、真空濃縮、膜濃縮等）により
濃縮した濃縮液に、またはこの濃縮液を常法（例えば、
噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等）により乾燥した粉末
に、加工することもできる。The glycopeptide mixture of the present invention also comprises
It can also be fractionated from a mixture of peptides obtained as a residue of in vitro antimicrobial peptide fractionation from lactoferrin hydrolysates (eg by hydrophobic chromatography). The sugar chain peptide mixture of the present invention can be fractionated from these lactoferrin hydrolyzates or peptide mixtures by conventional methods such as gel filtration chromatography, affinity chromatography, and ultrafiltration. The fractionated glycan peptide mixture is concentrated into a concentrated solution by a conventional method (for example, heat concentration under reduced pressure, vacuum concentration, membrane concentration, etc.) or this concentrated solution is subjected to a conventional method (eg
It can also be processed into a powder that has been dried by spray drying, vacuum drying, freeze drying, and the like.
【００１３】分画して得られた糖鎖ペプチド混合物は、
未分画のラクトフェリンおよびラクトフェリン加水分解
物から分離された公知の抗菌性ペプチドと比較して、よ
り多くの糖を含有していること、および後記する試験例
から明らかなように、そのものは生体外において全く抗
菌活性を示さないこと、の顕著な相違を有している。な
お、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリン
の加水分解後に、酵素を加熱失活させるため、既に殺菌
されているが、必要があればさらに加熱殺菌することも
できる。The glycopeptide mixture obtained by fractionation is
Compared with the known antibacterial peptide isolated from unfractionated lactoferrin and lactoferrin hydrolyzate, it contains more sugar, and as is clear from the test examples described below, it itself is in vitro. , Shows no antibacterial activity at all. The sugar chain peptide mixture of the present invention is already sterilized in order to deactivate the enzyme by heating after hydrolysis of lactoferrin, but it can be further sterilized by heating if necessary.
【００１４】以上のようにして得られたラクトフェリン
由来の糖鎖ペプチド混合物は、 ａ）生体内で病原性微生物による感染を防御すること ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であること ｄ）糖含有量が２０％以上であることの理化学的および
生物学的性質を有している。The lactoferrin-derived sugar chain peptide mixture obtained as described above is a) capable of preventing infection by pathogenic microorganisms in vivo b) having no antibacterial activity in vitro c) SDS- The molecular weight measured by polyacrylamide electrophoresis is 42,000 or less. D) It has physicochemical and biological properties that the sugar content is 20% or more.
【００１５】その他に、この発明の糖鎖ペプチド混合物
は、ラクトフェリンをプロテアーゼで加水分解し、分画
操作によって得られた糖鎖ペプチド混合物であるから、
水溶性、耐熱性、低抗原性、消化吸収性等に優れ、かつ
副作用もないという優れた特徴を有している。次に、こ
の発明の組成物について説明する。この発明の組成物
は、通常の加工食品、加工乳、乳性飲料、育児用ミル
ク、治療用ミルク、通常の飼料、飼料用ミルク、通常の
医薬品、経腸または経管栄養剤等、経口的または経管的
に摂取可能な食品、飼料、医薬品等であり、その形態は
溶液状、流動状、半固形状、固形状、粉末等どのような
形態であってもよい。経腸または経管栄養剤としては、
普通流動食、ブレンダー食、濃厚流動食等の完全流動
食、低蛋白流動食、低コレステロール流動食、低ナトリ
ウム流動食、治療乳、成分栄養流動食等の特殊流動食で
あってもよい。In addition, the sugar chain peptide mixture of the present invention is a sugar chain peptide mixture obtained by fractionating lactoferrin by hydrolysis with a protease.
It has excellent characteristics such as excellent water solubility, heat resistance, low antigenicity, digestive and absorbability, and no side effects. Next, the composition of the present invention will be described. The composition of the present invention is an ordinary processed food, processed milk, milk-based beverage, infant milk, therapeutic milk, ordinary feed, feed milk, ordinary medicine, enteral or tube feeding, etc. Alternatively, they are foods, feeds, pharmaceuticals, and the like that can be taken by tube, and the form thereof may be any form such as solution form, fluid form, semi-solid form, solid form, and powder form. For enteral or tube feeding,
It may be a special liquid food such as a normal liquid food, a blender food, a concentrated liquid food, a complete liquid food, a low protein liquid food, a low cholesterol liquid food, a low sodium liquid food, a therapeutic milk, and a component nutrition liquid food.
【００１６】この発明の組成物には、糖鎖ペプチド混合
物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％、望
ましくは０．１〜１％含有されている。使用時の状態と
は、各種組成物を摂取のために調整した状態を意味し、
例えば、粉末組成物の場合、所定濃度で水に溶解した状
態である。この発明の組成物に添加する糖鎖ペプチド混
合物は、加熱による変性がほとんどないので、食品、医
薬品、飼料等への添加は、製造工程のいずれの段階であ
っても可能である。この発明の組成物は、糖鎖ペプチド
混合物を含有し、病原性微生物による感染を防御する効
果がある。The composition of the present invention contains at least 0.01%, and preferably 0.1 to 1% of the glycopeptide mixture in the state of use. The state at the time of use means a state in which various compositions are adjusted for ingestion,
For example, a powder composition is in a state of being dissolved in water at a predetermined concentration. Since the glycopeptide mixture added to the composition of the present invention is hardly denatured by heating, it can be added to foods, pharmaceuticals, feeds, etc. at any stage of the production process. The composition of the present invention contains a glycopeptide mixture and has an effect of preventing infection by a pathogenic microorganism.
【００１７】次に試験例を示してこの発明をさらに詳し
く説明する。 試験例１ この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の調製法を
調べるために行った。すなわち、チーズホエーから分離
した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）を以下の方
法により加水分解した。 １）ペプシンで加水分解する場合 ラクトフェリンを精製水に５〜１０％の濃度に溶解し、
ｐＨを３．０に調整し、ラクトフェリンの約３％の市販
の豚ペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）
を添加して均一に混合し、３７℃で約４時間保持し、の
ち加熱して酵素を失活させた。次いでｐＨを中性に調整
し、不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶
液を得た。 ２）トリプシン、プロナーゼ等の中性プロテアーゼによ
って分解する場合 ラクトフェリン溶液のｐＨを中性とした後にラクトフェ
リンの１〜５％の酵素を添加して前記と同様に加水分解
した。 ３）分画 前記１）および２）のラクトフェリン分解物を常法によ
り凍結乾燥し、乾燥粉末を１０〜３０％の濃度でを精製
水に溶解し、ゲル濾過材を充填したカラムで分画した。
分画した各フラクションの糖含量を測定し、糖を含有す
るフラクションを混合し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混
合物を得た。なお、分画方法としては、ゲル濾過クロマ
トグラフィーの他、限外濾過膜を用いた方法、レクチン
固定化担体を用いた親和性クロマトグラフィー等、糖鎖
ペプチド混合物を分画できれば、どのような方法であっ
てもよい。 ４）得られた糖鎖ペプチド混合物 前記のとおり得られたラクトフェリン由来の糖鎖ペプチ
ド混合物は次のａ）〜ｄ）の理化学的および生物学的性
質を有することが、後記する試験方法により確認され
た。 ａ）病原性微生物による感染を防御すること、 ｂ）生体外で抗菌作用を有さないこと、 ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であること、 ｄ）糖含有量が２０％以上であること。 試験例２ この試験では、病原性微生物感染モデルマウスを作出
し、生体内におけるこの発明の糖鎖ペプチド混合物の感
染防御能を評価した。The present invention will be described in more detail with reference to test examples. Test Example 1 This test was conducted in order to investigate a method for preparing the glycopeptide mixture of the present invention. That is, commercially available lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) separated from cheese whey was hydrolyzed by the following method. 1) Hydrolysis with pepsin Dissolve lactoferrin in purified water to a concentration of 5-10%,
The pH was adjusted to 3.0 and about 3% of lactoferrin was commercially available pig pepsin (1: 10,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
Was added and mixed uniformly, and the mixture was kept at 37 ° C. for about 4 hours and then heated to deactivate the enzyme. Next, the pH was adjusted to neutral and the insoluble matter was removed by filtration to obtain a lactoferrin degradation product solution. 2) Decomposition by neutral protease such as trypsin and pronase After the pH of the lactoferrin solution was made neutral, 1 to 5% of lactoferrin enzyme was added and hydrolyzed in the same manner as above. 3) Fractionation The lactoferrin degradation products of 1) and 2) above were freeze-dried by a conventional method, the dry powder was dissolved in purified water at a concentration of 10 to 30%, and fractionated by a column packed with a gel filtration material. .
The sugar content of each of the fractionated fractions was measured, and the sugar-containing fractions were mixed and freeze-dried to obtain a sugar chain peptide mixture. As a fractionation method, in addition to gel filtration chromatography, a method using an ultrafiltration membrane, an affinity chromatography using a lectin-immobilized carrier, etc. May be 4) Obtained glycopeptide mixture The lactoferrin-derived glycopeptide mixture obtained as described above was confirmed to have the following physicochemical and biological properties a) to d) by the test method described below. It was a) protection against infection by pathogenic microorganisms, b) no antibacterial activity in vitro, c) molecular weight measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis of 42,000 or less, d) sugar content. The amount is 20% or more. Test Example 2 In this test, a model mouse infected with a pathogenic microorganism was created and the in vivo defense ability of the glycopeptide mixture of the present invention was evaluated.
【００１８】公知の腸管病原性大腸菌（Escherichia co
li O111 ：東京大学医科学研究所から分譲された菌株。
以下単に大腸菌と記載する）をマウスに胃内投与し、高
頻度に感染を惹起するモデルマウスを作出した。すなわ
ち、４週令の無菌マウス（ビニールアイソレーター中で
交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２０匹を
１０匹づつ２群に分け、別々のビニールアイソレーター
中で糞食防止ネットを敷設したケージに入れ、放射線滅
菌した固形飼料Ｆ−２（船橋農場製）および滅菌水を自
由摂取させて１週間飼育した。Known enteropathogenic E. coli (Escherichia co
li O111: A strain distributed from the Institute of Medical Science, University of Tokyo.
Hereinafter, simply referred to as Escherichia coli) was intragastrically administered to mice to produce model mice that frequently induce infection. That is, four-week-old germ-free mice (mated and maintained in a vinyl isolator), BALB / c, female, 20 mice were divided into 2 groups of 10 mice each, and a fecal-prevention net was laid in each vinyl isolator. The cage was placed in a cage and radiation-sterilized solid feed F-2 (manufactured by Funabashi Farm) and sterilized water were freely ingested and raised for 1 week.
【００１９】ブレイン・ハート・インヒュージョン液体
培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で前記大腸菌を
２４時間静置培養し、培養液を遠心分離し、リン酸緩衝
生理食塩水（ｐＨ７．０）で菌体を３回洗浄し、同リン
酸緩衝生理食塩水で５×１０ 10／ｍｌの生菌濃度で懸濁
した。次いで、１群のマウスに菌液０．２ｍｌを、他の
１群にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）０．２ｍ
ｌをゾンデで胃内に単回投与した。菌投与後、両群のマ
ウスを前記飼料でさらに２４時間飼育した。飼育終了後
のマウスの死亡数を調べ、各群の感染死亡率を比較し
た。Brain Heart Infusion Liquid
The E. coli was added to the medium (Becton Dickinson)
Incubate for 24 hours in static culture, centrifuge the culture, and add phosphate buffer
The bacterial cells were washed 3 times with physiological saline (pH 7.0), and
5 × 10 with acid buffered saline TenSuspension at a viable cell concentration of 1 ml
did. Then, 0.2 ml of the bacterial solution was
Phosphate buffered saline (pH 7.0) 0.2m for 1 group
1 was administered intragastrically with a sonde once. After administration of the bacteria,
Uss were bred for an additional 24 hours on the above diet. After breeding
The number of mortality of mice in
Was.
【００２０】その結果、大腸菌投与群の死亡頭数は、７
／１０（１０匹中７匹が死亡したことを示す。以下特に
断りのない限り同じ）であったのに対し、非投与群の死
亡頭数は０／１０であった。 試験例３ この試験は、前記病原性微生物感染モデルマウスに対す
る糖鎖ペプチド混合物の生体内における感染防御能を調
べるために行った。As a result, the number of deaths in the E. coli-administered group was 7
/ 10 (7 out of 10 died. The same applies hereafter unless otherwise specified), whereas the number of deaths in the non-administered group was 0/10. Test Example 3 This test was performed in order to examine the in-vivo infection-protecting ability of the glycopeptide mixture against the pathogenic microorganism-infected model mouse.
【００２１】試験例２と同一の方法により作成した無菌
雌マウス、５０匹を１０匹づつ５群に分け、別々のビニ
ールアイソレーター中で糞食防止ネットを敷設したケー
ジに入れた。実施例１の方法により製造した糖鎖ペプチ
ド混合物を０、０．０１、０．１、１または５％の各濃
度で無菌水に添加し、フィルターユニット（ナルゲン社
製）で再度除菌した。この溶液および放射線滅菌した固
形飼料Ｆ−２（船橋農場製）を無菌マウスに１週間自由
摂取させた。Aseptic female mice, 50 mice prepared by the same method as in Test Example 2, were divided into 5 groups of 10 mice each, and the mice were placed in cages provided with a fecal-prevention net in separate vinyl isolators. The glycopeptide mixture produced by the method of Example 1 was added to sterile water at each concentration of 0, 0.01, 0.1, 1 or 5%, and the bacteria were sterilized again with a filter unit (Nalgen). This solution and radiation-sterilized solid feed F-2 (manufactured by Funabashi Farm) were allowed to freely ingest aseptic mice for 1 week.
【００２２】試験例２と同一の方法ですべての群に前記
大腸菌を投与し、各群を前記と同一の飼料でさらに２４
時間飼育し、のち感染死亡頭数を比較した。この試験の
結果は表１に示すとおりである。表１の結果からこの発
明の糖鎖ペプチド混合物は０．０１％、望ましくは０．
１％以上の添加濃度で病原性大腸菌による感染を顕著に
抑制することが認められた。The above-mentioned Escherichia coli was administered to all groups by the same method as in Test Example 2, and each group was further fed with the same feed as described above for 24
The animals were bred for an hour, and then the number of deaths due to infection was compared. The results of this test are shown in Table 1. From the results in Table 1, the sugar chain peptide mixture of the present invention is 0.01%, preferably 0.
It was found that the addition concentration of 1% or more remarkably suppressed infection by pathogenic Escherichia coli.
【００２３】一方、対照として卵白アルブミン（シグマ
社製）から、試験例１と同一のペプシン加水分解により
調製した糖鎖を有するペプチド混合物を無菌水に５％の
濃度で添加し、同様に試験したが、感染死亡頭数は７／
１０であり、感染防御効果は認められなかった。なお、
他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物
を用いて同様の試験を行ったが、ほぼ同様の感染防御効
果が認められた。On the other hand, as a control, a peptide mixture having a sugar chain prepared by the same pepsin hydrolysis as in Test Example 1 from ovalbumin (manufactured by Sigma) was added to sterile water at a concentration of 5%, and the same test was conducted. However, the number of deaths due to infection was 7 /
It was 10, and no infection protective effect was observed. In addition,
Similar tests were carried out using the glycopeptide mixture of the present invention produced by another method, but almost the same protective effect against infection was observed.
【００２４】[0024]
【表１】 [Table 1]
【００２５】試験例４ この試験は、生体外におけるこの発明の糖鎖ペプチド混
合物の抗菌活性を調べるために行った。１％バクトペプ
トン（ディフコ・ラボラトリー社製）水からなる液体培
地２ｍｌに、０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で段階的に
この発明の糖鎖ペプチド混合物（実施例１と同一の方法
により製造）を添加し、大腸菌を１０6 ／ｍｌの生菌数
濃度で接種し、３７℃で１６時間静置培養した。培養後
の供試菌の発育状態を６６０ｎｍの吸光度で測定した結
果、糖鎖ペプチド混合物をいずれの濃度に添加した場合
にも供試菌の増殖抑制は認められず、この糖鎖ペプチド
混合物には生体外における抗菌活性は全く存在しないこ
とが認められた。Test Example 4 This test was carried out to examine the antibacterial activity of the glycopeptide mixture of the present invention in vitro. The glycopeptide mixture of the present invention (manufactured by the same method as in Example 1) was gradually added to 2 ml of a liquid medium consisting of 1% bactopeptone (manufactured by Difco Laboratories) in a concentration range of 0 to 50 mg / ml. After the addition, Escherichia coli was inoculated at a viable cell concentration of 10 6 / ml, and statically cultured at 37 ° C for 16 hours. As a result of measuring the growth state of the test bacterium after culturing with the absorbance at 660 nm, no growth inhibition of the test bacterium was observed at any concentration of the sugar chain peptide mixture. It was found that there was no antibacterial activity in vitro.
【００２６】一方、対照として用いた未分解のラクトフ
ェリンは２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全
に阻止し、またラクトフェリンのペプシン分解物は２０
０μｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全に阻止し
た。なお、他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプ
チド混合物についても同様の試験を行ったが、いずれも
生体外における抗菌活性は全く認められなかった。 試験例５ この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量
および分子量を調べるために行った。 １）糖含有量 実施例１と同一の方法により製造したこの発明の糖鎖ペ
プチド混合物の糖含有量を次の方法により測定した。On the other hand, undegraded lactoferrin used as a control completely inhibited the growth of the test bacteria at a concentration of 2 mg / ml or more, and the pepsin degradation product of lactoferrin was 20.
At a concentration of 0 μg / ml or more, the growth of the test bacteria was completely inhibited. The same test was carried out on the glycopeptide mixture of the present invention produced by another method, but no in vitro antibacterial activity was observed. Test Example 5 This test was carried out to examine the sugar content and molecular weight of the glycopeptide mixture of the present invention. 1) Sugar content The sugar content of the sugar chain peptide mixture of the present invention produced by the same method as in Example 1 was measured by the following method.
【００２７】糖鎖ペプチド混合物溶液０．２ｍｌを試験
管にとり、５％フェノール水溶液０．２ｍｌを添加混合
した後、濃硫酸（精密分析用。和光純薬工業社製）１ｍ
ｌをすばやく添加してよく混合し、この溶液の４９０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。糖含有量は、同時に標準
ガラクトース（和光純薬工業社製）溶液を用いて測定し
た検量線から求めた。After taking 0.2 ml of the glycopeptide mixture solution into a test tube and adding and mixing 5 ml of a 5% phenol aqueous solution, concentrated sulfuric acid (for precision analysis, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 m
490n of this solution
The absorbance at m was measured. The sugar content was determined from a calibration curve that was simultaneously measured using a standard galactose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution.
【００２８】その結果、この発明の糖鎖ペプチド混合物
の糖含有量は、２５％であった。なお、他の方法により
製造した糖鎖ペプチド混合物においても糖含有量は、い
ずれも２０％以上であり、未分画のラクトフェリン加水
分解物の糖含量１１％と比較して顕著に多いことが判明
した。 ２）分子量 実施例１および実施例２と同一の方法により製造したこ
の発明の糖鎖ペプチド混合物の分子量を次の方法により
測定した。As a result, the sugar content of the sugar chain peptide mixture of the present invention was 25%. It should be noted that the sugar content was 20% or more in each of the sugar chain peptide mixtures produced by other methods, which was found to be remarkably higher than the sugar content of 11% of the unfractionated lactoferrin hydrolyzate. did. 2) Molecular weight The molecular weight of the glycopeptide mixture of the present invention produced by the same method as in Example 1 and Example 2 was measured by the following method.
【００２９】１５〜２５％の濃度勾配を有するＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（第一化学薬品社
製）に糖鎖ペプチド混合物１０μｇを供給し、常法によ
り電気泳動を行った。また、分子量測定マーカー（第一
化学薬品社製）を同時に供給し、これらのマーカーの泳
動距離との比較から、供試した糖鎖ペプチド混合物の分
子量を求めた。SDS-with a concentration gradient of 15-25%
10 μg of the sugar chain peptide mixture was supplied to a polyacrylamide gel for electrophoresis (manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.), and electrophoresis was performed by a conventional method. Further, a molecular weight measurement marker (manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) was supplied at the same time, and the molecular weight of the glycopeptide mixture tested was determined by comparison with the migration distances of these markers.
【００３０】その結果は、図１に示すとおりであった。
図１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真であ
り、レーン１からレーン４は、それぞれマーカー、未分
解のウシラクトフェリン、実施例１の糖鎖ペプチド混合
物および実施例２の糖鎖ペプチド混合物である。図１か
ら明らかなとおり、実施例１および実施例２のこの発明
の糖鎖ペプチド混合物の分子量は、それぞれ１４，００
０以下および４２，０００以下であった。なお、他の方
法により製造した糖鎖ペプチド混合物の分子量は、いず
れも４２，０００以下であり、未分解のラクトフェリン
の分子量８０，０００と比較して極めて小さいことが判
明した。 試験例６ この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の急性毒性
を調べるために行った。 １）使用動物 ６週令のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購
入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ各３
群、計６群（１群５匹）に分けた。 ２）試験方法 実施例１と同様の方法で製造した糖鎖ペプチド混合物を
注射用水（大塚製薬社製）に１０％の濃度で溶解し、体
重１ｋｇ当たり１０００または２０００ｍｇの割合で金
属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、２週間観察
して急性毒性を試験した。なお、対照として雄および雌
の各１群に注射用水を体重１００ｇ当たり２ｇの割合で
同様に経口投与した。 ３）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなように、この糖鎖ペプチド混合物を１０００ｍ
ｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投
与した群に死亡例は認められなかった。従って、この糖
鎖ペプチド混合物のＬＤ50は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重
以上であり、毒性は極めて低いことが認められた。な
お、他の製造方法により得られたこの発明の糖鎖ペプチ
ド混合物についても試験を行ったが、ほぼ同様の結果が
得られた。The results are shown in FIG.
FIG. 1 is an SDS-polyacrylamide electrophoresis photograph. Lanes 1 to 4 are a marker, undegraded bovine lactoferrin, a sugar chain peptide mixture of Example 1 and a sugar chain peptide mixture of Example 2, respectively. As is apparent from FIG. 1, the molecular weights of the glycopeptide mixtures of the present invention of Example 1 and Example 2 were 14.0 million, respectively.
It was 0 or less and 42,000 or less. It was found that the molecular weights of the glycopeptide mixtures produced by other methods were all 42,000 or less, which was extremely small compared to the molecular weight of undegraded lactoferrin of 80,000. Test Example 6 This test was conducted to examine the acute toxicity of the glycopeptide mixture of the present invention. 1) Animals used Six-week-old CD (SD) strain rats (purchased from Japan SLC) were used.
The group was divided into 6 groups (5 animals per group). 2) Test method A glycopeptide mixture produced by the same method as in Example 1 was dissolved in water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) at a concentration of 10%, and a needle with a metal ball was added at a rate of 1000 or 2000 mg per 1 kg of body weight. Was used for single oral gavage and observed for 2 weeks to test acute toxicity. As a control, water for injection was similarly orally administered to each one group of male and female at a rate of 2 g per 100 g of body weight. 3) Test results The results of this test are shown in Table 2. As is clear from Table 2, this glycopeptide mixture was treated with 1000 m
No deaths were observed in the groups administered at the ratio of g / kg body weight and 2000 mg / kg body weight. Therefore, the LD 50 of this glycopeptide mixture was 2000 mg / kg body weight or more, and it was confirmed that the toxicity was extremely low. The test was also performed on the glycopeptide mixture of the present invention obtained by another production method, but almost the same results were obtained.
【００３１】[0031]
【表２】 [Table 2]
【００３２】試験例７ この試験は、実際に試作したこの発明の組成物と対照の
組成物について、感染予防効果を比較するために行っ
た。 １）試料の調製 実施例３と同一の方法によりこの発明の組成物を調製し
た（試料１）。Test Example 7 This test was carried out in order to compare the infection-preventing effect between the actually prototyped composition of the present invention and the control composition. 1) Preparation of Sample A composition of the present invention was prepared by the same method as in Example 3 (Sample 1).
【００３３】これとは別に実施例３と同一の方法により
調製した中間製品粉末０．５ｋｇに蔗糖（ホクレン製）
６８ｇ、ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）６ｇお
よびアミノ酸混合粉末（味の素社製）３ｇを添加し、均
一に混合し、粉末状の組成物約０．５６ｋｇを得た（試
料２）。 ２）試験方法 ２種類の試料を、それぞれ別個に１５％の濃度で水に溶
解し、摂取時の状態で糖鎖ペプチド混合物を、０．１６
％（試料１）または０％（試料２）含有する試料（経腸
栄養剤）を調製し、オートクレーブで常法により加熱殺
菌した。この２種類の試料を無菌パックに分注し、無菌
水および固形飼料の代わりに使用し、試験例３と同様の
方法により４週令の無菌マウス（ビニールアイソレータ
ー中で交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌各１
０匹に自由摂取させた。飼育１週間目に両群のマウスに
試験例２と同一の方法で調製した大腸菌の菌液（生菌濃
度５×１０10／ｍｌ）０．２ｍｌをゾンデで胃内に単回
投与した。各群を上記と同様の経腸栄養剤でさらに飼育
し、２４時間後のマウスの感染死亡頭数を試験した。 ３）試験結果 その結果、感染死亡頭数は、試料２を投与した群では８
／１０であったのに対し、この発明の糖鎖ペプチド混合
物を含む試料１を投与した群では１／１０であり、この
発明の組成物により病原性微生物感染が、顕著に抑制さ
れることが認められた。Separately from this, 0.5 kg of intermediate product powder prepared by the same method as in Example 3 was added to sucrose (made by Hokuren).
68 g, whey protein enzymatic degradation product (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) 6 g, and amino acid mixed powder (Ajinomoto Co., Inc.) 3 g were added and uniformly mixed to obtain about 0.56 kg of a powdery composition (Sample 2). 2) Test method Two kinds of samples were separately dissolved in water at a concentration of 15%, and a glycopeptide mixture was added in an amount of 0.16 when dissolved.
% (Sample 1) or 0% (Sample 2) -containing sample (enteral nutrient) was prepared and sterilized by heating in an autoclave by a conventional method. These two types of samples were dispensed into a sterile pack and used in place of sterile water and solid feed, and 4-week-old sterile mice (bred and maintained in a vinyl isolator) by the same method as in Test Example 3. , BALB / c, female 1 each
0 animals were allowed to ingest freely. One week after the breeding, 0.2 ml of a bacterial solution of Escherichia coli (viable cell concentration: 5 × 10 10 / ml) prepared by the same method as in Test Example 2 was intragastrically administered once to the mice of both groups by a sonde. Each group was further bred with the same enteral nutrient as above, and the number of dead mice infected after 24 hours was examined. 3) Test results As a result, the number of infected deaths was 8 in the group administered with sample 2.
/ 10, whereas it was 1/10 in the group to which the sample 1 containing the glycopeptide mixture of the present invention was administered, and the composition of the present invention significantly suppresses pathogenic microbial infection. Admitted.
【００３４】[0034]
【実施例】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細か
つ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定され
るものではない。 実施例１ チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永
乳業社製）１ｋｇを精製水９ｌに溶解し、１規定の塩酸
を添加してｐＨを３．０に調整し、市販の豚ペプシン
（１：１０，０００。和光純薬工業社製）３０ｇを添加
して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、のち８５℃
で１０分間加熱して酵素を失活させた。次いで、１規定
水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、不
溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得
た。このラクトフェリン分解物溶液を凍結乾燥し、ラク
トフェリン分解物の粉末約９６０ｇを得た。The present invention will be described in more detail and specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples. Example 1 1 kg of a commercially available lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) separated from cheese whey was dissolved in 9 l of purified water, 1N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 3.0, and commercially available pork pepsin (1: 10,000. Wako Pure Chemical Industries Ltd.) 30g was added and mixed uniformly, and kept at 37 ° C for 4 hours, and then 85 ° C.
The enzyme was inactivated by heating for 10 minutes. Next, 1N sodium hydroxide was added to adjust the pH to 7.0, the insoluble matter was removed by filtration, and a lactoferrin degradation product solution was obtained. This lactoferrin degradation product solution was freeze-dried to obtain about 960 g of a powder of the lactoferrin degradation product.
【００３５】前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解
し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５
０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０
ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶
出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラ
クションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前
記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域
に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合
し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥
し、糖鎖ペプチド混合物約１５ｇを得た。40 g of the powder was dissolved in 400 ml of purified water, and Sephadex (trademark; manufactured by Pharmacia) G-5.
Column packed with 0 and pre-equilibrated with purified water (diameter 20
(cm x height 55 cm) at a flow rate of 65 ml / min, the eluate was collected as 100 ml fractions, and the absorbance at 280 nm and the sugar content (by the same method as in Test Example 5) of each fraction were measured. . All of the sugar-containing fractions eluted in the high molecular weight region were mixed, concentrated with a reverse osmosis membrane (manufactured by Asahi Kasei) and freeze-dried to obtain about 15 g of a sugar chain peptide mixture.
【００３６】得られた糖鎖ペプチド混合物について、前
記の各試験例と同様の方法により試験した結果、生体外
における抗菌性活性は全く存在せず、糖含有量は２５％
であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含量１
１％の約２．３倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって測定した糖鎖ペプチド混
合物の分子量は１４，０００以下に分布していることが
確認された。 実施例２ チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永
乳業社製）１ｋｇを精製水９リットルに溶解し、ｐＨを
中性に調整し、市販の豚トリプシン（１，０００単位／
ｍｇ。シグマ社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３
７℃で４時間保持し、のち８５℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。不溶物を濾過して除去し、ラクトフェ
リン分解物溶液を得た。このラクトフェリン分解物溶液
を凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約９６０ｇ
を得た。The sugar chain peptide mixture thus obtained was tested in the same manner as in the above-mentioned test examples. As a result, there was no in vitro antibacterial activity, and the sugar content was 25%.
And the sugar content of unfractionated lactoferrin hydrolyzate 1
It was about 2.3 times 1%. Moreover, it was confirmed that the molecular weight of the sugar chain peptide mixture measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was distributed at 14,000 or less. Example 2 1 kg of commercially available lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) separated from cheese whey was dissolved in 9 liters of purified water to adjust the pH to neutral, and commercially available pork trypsin (1,000 units /
mg. 30 g of Sigma) was added and mixed uniformly, and 3
It was kept at 7 ° C for 4 hours and then heated at 85 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme. The insoluble matter was removed by filtration to obtain a lactoferrin degradation product solution. This lactoferrin degradation product solution was freeze-dried, and 960 g of lactoferrin degradation product powder.
I got
【００３７】前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解
し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５
０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０
ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶
出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラ
クションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前
記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域
に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合
し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥
し、糖鎖ペプチド混合物約２０ｇを得た。これら一連の
分画操作を３回反復し、合計約６０ｇの糖鎖ペプチド混
合物の粉末を得た。40 g of the powder was dissolved in 400 ml of purified water, and Sephadex (trademark; manufactured by Pharmacia) G-5.
Column packed with 0 and pre-equilibrated with purified water (diameter 20
(cm x height 55 cm) at a flow rate of 65 ml / min, the eluate was collected as 100 ml fractions, and the absorbance at 280 nm and the sugar content (by the same method as in Test Example 5) of each fraction were measured. . All the sugar-containing fractions eluted in the high molecular weight region were mixed, concentrated with a reverse osmosis membrane (manufactured by Asahi Kasei Corp.), and freeze-dried to obtain about 20 g of a sugar chain peptide mixture. These series of fractionation operations were repeated 3 times to obtain a total of about 60 g of the glycopeptide mixture powder.
【００３８】得られた糖鎖ペプチド混合物について、前
記と同様の方法により試験した結果、生体外における抗
菌性活性は全く存在せず、糖含量は２０％であり、未分
画のラクトフェリン加水分解物の糖含有量１１％の約
１．８倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により測定した糖鎖ペプチド混合物の分子
量は４２，０００以下に分布していることが確認され
た。 実施例３ ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１．２ｋｇ、デ
キストリン（昭和産業社製）３．６ｋｇ並びに少量の水
溶性ビタミンおよびミネラルを、水２０ｋｇを注入した
タンク内で溶解し、水相を調製した。一方、大豆サラダ
油（太陽油脂社製）０．３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社
製）０．８５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）０．
２５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．０２ｋｇ、脂肪
酸モノグリセリド（花王社製）０．０２ｋｇおよび少量
の脂溶性ビタミンを混合物を均一に混合し、油相を調製
した。The resulting oligosaccharide peptide mixture was tested in the same manner as described above. As a result, there was no in vitro antibacterial activity, the sugar content was 20%, and an unfractionated lactoferrin hydrolyzate was obtained. Was about 1.8 times the sugar content of 11%. Moreover, it was confirmed that the molecular weight of the sugar chain peptide mixture measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was distributed to 42,000 or less. Example 3 1.2 kg of enzymatically decomposed product of whey protein (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), 3.6 kg of dextrin (Showa Sangyo Co., Ltd.) and a small amount of water-soluble vitamins and minerals were dissolved in a tank filled with 20 kg of water, and water was added. The phases were prepared. On the other hand, soybean salad oil (Taiyo Yushi Co., Ltd.) 0.3 kg, palm oil (Taiyo Yushi Co., Ltd.) 0.85 kg, safflower oil (Taiyo Yushi Co., Ltd.)
An oil phase was prepared by uniformly mixing 25 kg, lecithin (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) 0.02 kg, fatty acid monoglyceride (manufactured by Kao) 0.02 kg and a small amount of fat-soluble vitamin.
【００３９】タンク内の水相に油相を添加し、撹拌して
混合し、７０℃に加温し、ホモゲナイザーより１５０ｋ
ｇ／ｃｍ2 の圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌
し、濃縮し、噴霧乾燥し、中間製品粉末約３．５ｋｇを
得た。この中間製品粉末２．５ｋｇに蔗糖（ホクレン
製）０．３４ｋｇ、実施例２と同一の方法により製造し
た糖鎖ペプチド混合物の粉末３０ｇおよびアミノ酸混合
粉末（味の素社製）１５ｇを添加して均一に混合し、粉
末状の経腸栄養剤約２．８ｋｇを得た。The oil phase was added to the water phase in the tank, and the mixture was stirred and mixed, heated to 70 ° C., and heated to 150 k from a homogenizer.
Homogenized at a pressure of g / cm 2 , sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, concentrated and spray dried to give about 3.5 kg of intermediate product powder. To 2.5 kg of this intermediate product powder, 0.34 kg of sucrose (manufactured by Hokuren), 30 g of a powder of the glycopeptide mixture manufactured by the same method as in Example 2 and 15 g of an amino acid mixed powder (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) were added and uniformly added. The mixture was mixed to obtain about 2.8 kg of powdery enteral nutritional supplement.
【００４０】[0040]
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明の
糖鎖ペプチド混合物と、これを有効成分として含有する
組成物は、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管
からの微生物の臓器侵入等の細菌、ウイルス、かび、酵
母等の病原性微生物による感染症からヒトおよび動物を
防御する効果を有する。これらの使用により、抗生物質
等の投与量を減少させ、それらによる副作用を緩和する
ことが可能となる。As described in detail above, the glycopeptide mixture of the present invention and the composition containing the same as the active ingredient are effective for diarrhea, food poisoning, bacterial enteritis, sepsis, invasion of microorganisms from the digestive tract, and the like. It has the effect of protecting humans and animals from infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as bacteria, viruses, fungi and yeasts. By using these, it becomes possible to reduce the dose of antibiotics and the like and alleviate their side effects.
【図１】この発明の糖鎖ペプチド混合物の、図面に代わ
るＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真である。FIG. 1 is an SDS-polyacrylamide electrophoretic photograph of the mixture of glycopeptides of the present invention, which is a substitute for a drawing.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新 光一郎 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Shin Koichiro 5-1-83 Higashihara, Zama City, Kanagawa Prefecture Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Claims (4)
れ、次のａ）〜ｄ） ａ）生体内で病原性微生物による感染を防御すること、 ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、 ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であること、および ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、の理化
学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプ
チド混合物。1. The following a) to d) a) fractionated from lactoferrin hydrolyzate, a) to prevent infection by pathogenic microorganisms in vivo, b) to show no antibacterial activity in vitro, c ) Has a molecular weight measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis of 42,000 or less, and d) has a sugar content of 20% (weight) or more, and has physicochemical and biological activities, and A peptide mixture having a sugar chain.
抗菌作用を有するペプチドを分画除去した残渣より分画
されたペプチド混合物である請求項１に記載のペプチド
混合物。2. The peptide mixture according to claim 1, which is a peptide mixture fractionated from a residue obtained by fractionating and removing a peptide having an antibacterial activity in vitro from a lactoferrin hydrolyzate.
れ、次のａ）〜ｄ） ａ）生体内で病原性微生物による感染を防御すること、 ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、 ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分
子量が４２，０００以下であること、および ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、の理化
学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプ
チド混合物を有効成分として含有する組成物。3. Fractionated from a lactoferrin hydrolyzate, the following a) to d) a) to prevent infection by pathogenic microorganisms in vivo, b) to show no antibacterial action in vitro, c. ) Has a molecular weight measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis of 42,000 or less, and d) has a sugar content of 20% (weight) or more, and has physicochemical and biological activities, and A composition comprising a peptide mixture having a sugar chain as an active ingredient.
て少なくとも０．０１％（重量）含有されている請求項
３に記載の組成物。4. The composition according to claim 3, wherein the peptide mixture contains at least 0.01% (by weight) in a state of use.
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| JPH08291198A true JPH08291198A (en) | 1996-11-05 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09215472A (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-19 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Composition of absorbefacient saccharides |
| WO2002045750A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Combination drugs |
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