JPH0827193A - Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man - Google Patents

Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man

Info

Publication number
JPH0827193A
JPH0827193A JP6161548A JP16154894A JPH0827193A JP H0827193 A JPH0827193 A JP H0827193A JP 6161548 A JP6161548 A JP 6161548A JP 16154894 A JP16154894 A JP 16154894A JP H0827193 A JPH0827193 A JP H0827193A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
human
cytochrome
derived
derived cytochrome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP6161548A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Yoshihiko Funae
良彦 舩江
Susumu Imaoka
進 今岡
Yasushi Matsuki
泰 松木
Koji Hayashi
浩司 林
Yoshiyasu Yabusaki
義康 藪崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to JP6161548A priority Critical patent/JPH0827193A/en
Publication of JPH0827193A publication Critical patent/JPH0827193A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

PURPOSE:To obtain the antibody capable of accurately and simply determining a cytochrome P450 molecule species in a living body, because of specifically recognizing the specific cytochrome P450 molecule species originated from a man. CONSTITUTION:The antibody substantially not exhibiting cross reactivity with cytochrome P450 molecule species originated from other men and recognizing the cytochrome P4502B6 originated from a man is obtained by collecting blood from a mammalian immunologically sensitized with the cytochrome P4502B6 originated from the man as an antigen, separating the antibody from the blood and subsequently purifying the antibody. The cytochrome P4502B6 originated from the man is obtained by extracting from a yeast as a transformant expressing the cytochrome P4502B6 originated from the man and subsequently purifying the extracted cytochrome P4502B6.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明はヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６を認識する抗体に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to human-derived cytochrome P.
It relates to an antibody that recognizes 4502B6.

【０００２】[0002]

【従来の技術】チトクロムＰ４５０は生体が取り込んだ
薬物、異物、環境汚染物質などの酸化的代謝（解毒およ
び代謝活性化）、生体内生理活性物質の生合成など極め
て多彩な反応に関与する要因の１つとして、チトクロム
Ｐ４５０が互いに重複した基質特異性を有する多数の分
子種から構成されることが挙げられる。そして、生体に
薬物を投与すると、特定のチトクロムＰ４５０分子種が
誘導されることがよく知られている。一方、新規薬物の
開発においては、ヒトにおける薬物の代謝、効果、毒性
を早期に予測、評価することが極めて重要な課題であ
る。そのためにはヒト生体内のチトクロムＰ４５０分子
種の分布および存在量を知る必要がある。そして近年、
チトクロムＰ４５０には動物種差や人種差があることが
明らかになってきており、たとえば特定の薬物を代謝す
るチトクロムＰ４５０分子種を遺伝的に欠損する人種の
場合、薬物の効果が強く、さらには副作用を生じること
などの症例が報告されるようになってきた。また、生体
内のチトクロムＰ４５０分子種の量は高血圧や糖尿病な
どの病態により変動することも知られるようになった。2. Description of the Related Art Cytochrome P450 is a factor involved in a wide variety of reactions such as oxidative metabolism (detoxification and metabolic activation) of drugs, foreign substances and environmental pollutants taken up by the living body, biosynthesis of physiologically active substances in vivo. One is that cytochrome P450s are composed of multiple molecular species with substrate specificities that overlap with each other. It is well known that administration of a drug to a living body induces a specific cytochrome P450 molecular species. On the other hand, in the development of new drugs, early prediction and evaluation of drug metabolism, effects, and toxicity in humans are extremely important subjects. For that purpose, it is necessary to know the distribution and abundance of cytochrome P450 molecular species in the human body. And in recent years
It has become clear that cytochrome P450 has differences in animal species and races. For example, in the case of a race that genetically lacks a cytochrome P450 molecular species that metabolizes a specific drug, the effect of the drug is strong and Cases such as side effects have come to be reported. It has also become known that the amount of cytochrome P450 molecular species in the living body varies depending on the pathological condition such as hypertension and diabetes.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】こうした状況から、ヒ
トにおける薬物の代謝、効果、毒性等の早期予測、評価
をより正確に行うために生体内のチトクロムＰ４５０分
子種を正確にしかも簡便に定量する方法が望まれてい
る。こうした課題を解決するために、ラット、ウサギな
どの実験動物のチトクロムＰ４５０分子種を認識する抗
体を用いることも考えられるが、チトクロムＰ４５０に
は動物種間による相違があることおよび必ずしも目的の
チトクロムＰ４５０分子種のみを特異的に認識する能力
がないことから、必ずしも正確な評価とはなり得ない。
従って、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の定量を
正確に行うためにヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種
を認識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４５０分子
種のみを特異的に認識する抗体が必要であった。Under these circumstances, in order to more accurately predict and evaluate the metabolism, effect, toxicity, etc. of drugs in humans, it is possible to quantify cytochrome P450 molecular species in vivo accurately and simply. A method is desired. In order to solve these problems, it is possible to use an antibody that recognizes a cytochrome P450 molecular species of experimental animals such as rat and rabbit. However, there are differences in the cytochrome P450 between animal species and the required cytochrome P450. Since it is not capable of specifically recognizing only a molecular species, it cannot always be an accurate evaluation.
Therefore, in order to accurately quantify human-derived cytochrome P450 molecular species, an antibody that recognizes human-derived cytochrome P450 molecular species and specifically recognizes only a specific cytochrome P450 molecular species of interest has been required. .

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、こうした
状況を鑑み、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を認
識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４５０分子種の
みを特異的に認識する抗体を作製するために、組換えＤ
ＮＡ技術を用いることによって所望の抗体を得ることに
成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を発現する形質転換体
である酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトク
ロムＰ４５０２Ｂ６を抗原として免疫感作化した哺乳動
物から血液を採取し、該血液から分離・精製して得られ
うる、他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対し
て交差反応性を実質的に示さないことを特徴とするヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を認識する抗体（以
下、本発明抗体と記す。）を提供するものである。In view of such circumstances, the present inventors have prepared an antibody that recognizes a human-derived cytochrome P450 molecular species and specifically recognizes only a specific cytochrome P450 molecular species of interest. In order to do recombinant D
We succeeded in obtaining the desired antibody by using NA technology, and completed the present invention. That is, the present invention collects blood from a mammal immunized with human-derived cytochrome P450 2B6 as an antigen, which has been extracted and purified from yeast, which is a transformant expressing human-derived cytochrome P450 2B6. An antibody that recognizes human-derived cytochrome P450 2B6, which does not substantially show cross-reactivity with other human-derived cytochrome P450 molecular species that can be obtained by separation and purification (hereinafter referred to as the antibody of the present invention. Is provided).

【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明でいう「ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を認
識する抗体」とは、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ
６以外の他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対
して交差反応性を実質的に示さないものであればいかな
る方法によって得てもよいが、哺乳動物を免疫感作する
ために用いられる抗原は、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６以外の他のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子
種を実質的に混入しないヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｂ６を用いる必要がある。ここで、ヒト由来のチトク
ロムＰ４５０２Ｂ６はヒトの肝臓からも精製することは
できるが、得られるチトクロムＰ４５０はどうしても類
似のチトクロムＰ４５０分子種が若干混在してしまい、
単一な状態にまで精製することはきわめて難しい。特に
含量が少ないにもかかわらず、重要な薬物の代謝に関与
するチトクロムＰ４５０分子種の場合、単一な状態にま
で精製は不可能である。このような試料を抗原として用
いれば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６以外の他
のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種に対して交差反
応性を実質的に示さない抗体を製造することはできな
い。また仮にきわめて単一な状態にまで精製できたとし
ても得られる量がきわめて少量なために哺乳動物を充分
に免疫感作することができない、もしくはきわめて低い
抗体価のものしか得られない等の問題が生じる。また、
そもそもヒトの肝臓を大量に入手することは倫理的、技
術的に不可能に近く、現実的ではない。これに対して、
本発明で用いた方法は、組換えＤＮＡ技術によって特定
のチトクロムＰ４５０分子種のみを発現する形質転換体
である酵母から哺乳動物を免疫感作するために用いられ
る抗原を抽出および精製する方法であって、これによっ
てヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６以外の他のヒト
由来のチトクロムＰ４５０分子種を実質的に混入しない
ような高い純度のヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６
を大量に、しかも容易に得ることができる。The present invention will be described in more detail below. The "antibody that recognizes human-derived cytochrome P450 2B6" in the present invention means human-derived cytochrome P450 2B.
Other than 6, any human-derived cytochrome P450 molecular species may be obtained by any method as long as it does not substantially show cross-reactivity. The antigen used to immunize a mammal is , Human-derived cytochrome P45
Human-derived cytochrome P450 other than 02B6, which does not substantially contaminate other human-derived cytochrome P450 molecular species
It is necessary to use 2B6. Here, human-derived cytochrome P450 2B6 can be purified also from human liver, but the obtained cytochrome P450 is inevitably mixed with similar cytochrome P450 molecular species,
It is extremely difficult to purify to a single state. In the case of cytochrome P450 molecular species which is involved in the metabolism of important drugs although it is particularly small in content, purification to a single state is impossible. If such a sample is used as an antigen, it is not possible to produce an antibody that does not substantially show cross-reactivity with other human-derived cytochrome P450 molecular species other than human-derived cytochrome P450 2B6. Further, even if it could be purified to an extremely single state, the amount obtained would be so small that it would not be possible to sufficiently immunize a mammal, or that only a very low antibody titer could be obtained. Occurs. Also,
In the first place, obtaining a large amount of human liver is ethically and technically impossible and impractical. On the contrary,
The method used in the present invention is a method of extracting and purifying an antigen used for immunizing a mammal from yeast, which is a transformant expressing only a specific cytochrome P450 molecular species, by recombinant DNA technology. As a result, a human-derived cytochrome P450 2B6 of high purity that does not substantially contaminate other human-derived cytochrome P450 molecular species other than human-derived cytochrome P450 2B6.
Can be obtained in large quantities and easily.

【０００６】具体的には、（１）ヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０２Ｂ６をコードする遺伝子をクローニングし、
（２）クローニングした遺伝子を酵母で発現させるため
の発現プラスミドを構築し、（３）構築した酵母発現プ
ラスミドを酵母に導入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６を発現する組換え体酵母を作製し、（４）作製
した組換え体酵母を培養し、これを破砕後、酵母ミクロ
ソーム画分を調製し、（５）該画分を界面活性剤等を用
いて可溶化後、得られる可溶化上清をオクチルアミノセ
ファロースカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラ
ムクロマトグラフィー等の各種カラムクロマトグラフィ
ーによって精製し、（６）精製したヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｂ６を抗原として哺乳動物を免疫感作化
し、（７）該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液
から本発明抗体を分離・精製する、方法があげられる。Specifically, (1) a gene encoding human-derived cytochrome P450 2B6 was cloned,
(2) An expression plasmid for expressing the cloned gene in yeast is constructed, (3) the constructed yeast expression plasmid is introduced into yeast, and human-derived cytochrome P45
Recombinant yeast expressing 02B6 is prepared, (4) the prepared recombinant yeast is cultured, and after crushing this, a yeast microsome fraction is prepared, and (5) the fraction is treated with a surfactant or the like. After solubilization using, the resulting solubilized supernatant was purified by various column chromatography such as octylamino sepharose column chromatography, anion exchange column chromatography, and hydroxyapatite column chromatography, and (6) purified human-derived Examples include a method of immunizing a mammal with cytochrome P450 2B6 as an antigen, (7) collecting blood from the mammal, and isolating and purifying the antibody of the present invention from the collected blood.

【０００７】上記の「ヒト由来のチトクロムＰ４５０２
Ｂ６をコードする遺伝子」の塩基配列は配列表中の配列
番号３で示されており、ヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｂ６をコードする遺伝子は市販のヒト肝細胞由来のｃ
ＤＮＡライブラリーからＰＣＲなど通常の方法を用いて
単離することができる。The above-mentioned "human-derived cytochrome P4502"
The nucleotide sequence of the “gene encoding B6” is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and is derived from human cytochrome P450.
The gene encoding 2B6 is c derived from commercially available human hepatocytes.
It can be isolated from a DNA library using a conventional method such as PCR.

【０００８】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６をコ
ードする遺伝子を酵母で発現させるためのプロモーター
としては、通常の酵母発現系において用いられるプロモ
ーターであれば特に制限されるものではないが、例えば
酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以
下、ＡＤＨプロモーターと記す）、グリセルアルデヒド
ー３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモ−タ−（以下、Ｇ
ＡＰＤＨプロモーターと記す）、フォスフォグリセリン
酸キナーゼ遺伝子のプロモ−タ−（以下、ＰＧＫプロモ
ーターと記す）等をあげることができる。なお、ＡＤＨ
プロモーターは、例えば酵母ＡＤＨ１プロモーターおよ
び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡ
Ｈ５（Washington Research Foundationから入手可能、
Ammerer ら、Methods in Enzymology, 101 (p.192-20
1)）から通常の遺伝子操作方法により調製することがで
きる。酵母ＡＤＨ１プロモーターは、Washington Resea
rch Foundation の米国特許第299,733 に含まれてお
り、米国において、工業的、商業的目的で使用する場合
は権利者からの権利許諾を必要とする。上記の酵母内で
発現させるためのプロモーターおよび前記のヒト由来の
Ｐ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を
含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組換え方法を
用いて構築することができる。例えば、ヒト由来のＰ４
５０分子種をコードするcDNAを特開平2-211880等に記載
されるＡＤＨプロモーターとターミネーターを保有する
酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位に
挿入することにより構築する方法等をあげることができ
る。The promoter for expressing the gene encoding human-derived cytochrome P450 2B6 in yeast is not particularly limited as long as it is a promoter used in a usual yeast expression system. For example, yeast alcohol dehydrogenase. Gene promoter (hereinafter referred to as ADH promoter), glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase gene promoter (hereinafter referred to as G
Examples thereof include an APDH promoter), a promoter of a phosphoglycerate kinase gene (hereinafter referred to as a PGK promoter), and the like. In addition, ADH
The promoter is, for example, a yeast expression vector pAA having the yeast ADH1 promoter and the terminator.
H5 (available from Washington Research Foundation,
Ammerer et al., Methods in Enzymology, 101 (p.192-20
It can be prepared from 1)) by a conventional gene manipulation method. The yeast ADH1 promoter is the Washington Resea
Included in US Patent No. 299,733 of the rch Foundation and requires license from the right holder for industrial or commercial use in the United States. The yeast expression plasmid containing the above-mentioned promoter for expression in yeast and the above-mentioned gene having a nucleotide sequence encoding a human-derived P450 molecular species can be constructed by a conventional gene recombination method. For example, human-derived P4
A method of constructing by inserting a cDNA encoding 50 molecular species into the HindIII site of the yeast expression vector pAAH5N having the ADH promoter and terminator described in JP-A-2-211880 and the like can be mentioned.

【０００９】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を発
現する組換え体酵母は、構築された酵母発現プラスミド
を、例えばプロトプラスト法等の通常の方法によって酵
母に導入することで得ることができる。本発明システム
において用いられる酵母菌株としては、例えばサッカロ
ミセス・セレビジェー(Saccharomyces cerevisiae)等を
あげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレ
ビジェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられ
る。Recombinant yeast expressing human-derived cytochrome P450 2B6 can be obtained by introducing the constructed yeast expression plasmid into yeast by a conventional method such as the protoplast method. Examples of the yeast strain used in the system of the present invention include Saccharomyces cerevisiae. Preferred is Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (ATCC38626).

【００１０】組換え体酵母からのチトクロムＰ４５０分
子種の抽出および精製は、例えば、J.Biochem., Vol 9
8. No.1. p167-175 (1985) 等に記載された通常の方法
に従い行うことができる。具体的には、作製した組換え
体酵母を培養し、得られた酵母を溶菌酵素等によるスフ
ェロプラスト化後、超音波破砕する。遠心分離によって
酵母ミクロソーム画分を調製し、該画分を界面活性剤お
よびコール酸ナトリウム等を用いて可溶化後（必要に応
じて硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール等
による沈殿を行う）、得られる可溶化上清をオクチルア
ミノセファロースカラムクロマトグラフィー、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイ
トカラムクロマトグラフィー等の各種カラムクロマトグ
ラフィーによって精製する。なお高速液体クロマトグラ
フィー装置で分離・精製することが適している。Extraction and purification of cytochrome P450 molecular species from recombinant yeast is described, for example, in J. Biochem., Vol 9
8. No.1. Can be performed according to the usual method described in p167-175 (1985). Specifically, the produced recombinant yeast is cultured, the obtained yeast is spheroplasted with a lytic enzyme or the like, and then ultrasonically disrupted. A yeast microsome fraction was prepared by centrifugation, solubilized with a detergent and sodium cholate, etc. (precipitation with ammonium sulfate, polyethylene glycol, etc., if necessary), and then solubilized. The residue is purified by various column chromatography such as octylamino sepharose column chromatography, anion exchange column chromatography and hydroxyapatite column chromatography. It is suitable to separate and purify with a high performance liquid chromatography device.

【００１１】本発明抗体の作製は、このようにして精製
したヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を抗原として
哺乳動物を免疫感作化し、該哺乳動物から血液を採取
し、採取した血液から本発明抗体を分離・精製すること
により行うことができる。例えばマウス、ハムスター、
モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の哺乳
動物を免疫するには、例えばJ.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM 70
(6) 1025-1027 (1987)等に記載されるW.H.Newsome等の
通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原の１回また
はそれ以上の投与により行われる。例えば、７ないし３
０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与
等が好ましい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．
０５から２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮下投
与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与
等を選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしく
は皮下に行われうる注射が好ましい投与形態である。さ
らに皮下注射と腹腔内注射の組み合わせが特に好まし
い。なおこの場合、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フ
ロイントアジュバント（Aracel A.Bayol F 結核死菌を
混合したもの）、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid
A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(C
ell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕、水酸化
アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を
含有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶
解して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上
記のようなアジュバントを使用しないこともある。ここ
でアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異
的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。そして、上記の哺乳動物を０．５ないし４ケ月間処
置せずに放置した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から
少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇
してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施す
る。例えば１００μｇないし１０００μｇ、特に５０μ
ｇないし５００μｇの抗原の投与量でもう１回の投与が
行われる。最後の投与の１ないし２ケ月間後に免疫感作
した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該
血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリ
エチレングリコールを用いることによる沈澱、ゲルろ過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィ
ー等の通常の方法によって分離・精製することにより、
ポリクローナル抗血清として本発明抗体を得ることがで
きる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理す
ることによって補体系の不活性化を実施してもよい。The antibody of the present invention is prepared by immunizing a mammal with human-derived cytochrome P450 2B6 thus purified, collecting blood from the mammal, and separating the antibody of the present invention from the collected blood. -Can be performed by purification. Mouse, hamster,
For immunizing mammals such as guinea pigs, chickens, rats, rabbits and dogs, for example, J.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM 70
(6) It is carried out by using an ordinary immunization method such as WH Newsome described in 1025-1027 (1987) etc. by, for example, one or more administrations of the antigen. For example, 7 to 3
Administration on day 0, especially 2 or 3 times at intervals of 12 to 16 days is preferred. The dose may be, for example, about 0.
As a guideline, use about 05 to 2 mg. The route of administration can be selected from subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration and the like, but injection which can be performed intravenously, intraperitoneally or subcutaneously is preferable. is there. Furthermore, a combination of subcutaneous injection and intraperitoneal injection is particularly preferable. In this case, the antigen is an appropriate buffer such as complete Freund's adjuvant (mixed with Aracel A. Bayol F. tuberculosis killed bacteria), RAS [MPL (Monophosphoryl Lipid
A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (C
ell Wall Skeleton) Adjuvant system], sodium phosphate buffer containing one of the commonly used adjuvants such as aluminum hydroxide, physiological saline, etc., and used, depending on the route of administration, conditions, etc. The adjuvant as described above may not be used. Here, the adjuvant means a substance that nonspecifically enhances an immune response to the antigen when administered together with the antigen. Then, after leaving the above mammals without treatment for 0.5 to 4 months, a small amount of serum of the mammals is sampled from an ear vein or the like to measure the antibody titer. When the antibody titer rises, the antigen is administered a suitable number of times depending on the situation. For example 100 μg to 1000 μg, especially 50 μg
Another dose is given at a dose of g to 500 μg of antigen. One or two months after the last administration, blood is collected from the immunized mammal by a conventional method, and the blood is subjected to, for example, centrifugation, precipitation by using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, Ion exchange chromatography,
By separating and purifying by a usual method such as chromatography such as affinity chromatography,
The antibody of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum. The serum may be treated at 56 ° C. for 30 minutes to inactivate the complement system.

【００１２】また、上記の免疫感作した哺乳動物から免
疫適格Ｂ細胞が単離され、該免疫適格Ｂ細胞が連続的に
細胞***し得る腫瘍細胞と融合され、生成する融合物が
単離され、そして選択の後、所望の抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞がクローン化され、そしてモノクローナ
ル抗体を製造するために該ハイブリドーマ細胞が試験管
内または生体内で培養されることにより、ヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｂ６以外の他のヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０分子種に対して交差反応性を実質的に示さな
い高度の特異性および親和性を有する本発明抗体も製造
することができる。Immunocompetent B cells are isolated from the immunized mammals described above, the immunocompetent B cells are fused with tumor cells capable of continuous cell division, and the resulting fusion product is isolated. , And, after selection, the hybridoma cells that produce the desired antibody are cloned, and the hybridoma cells are cultured in vitro or in vivo to produce the monoclonal antibody, to produce a human-derived cytochrome P4502B6 other than Antibodies of the invention having a high degree of specificity and affinity that do not substantially show cross-reactivity with other human-derived cytochrome P450 molecular species can also be produced.

【００１３】本発明抗体は、ヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｂ６以外の他のヒト由来のチトクロム分子種に対
して交差反応性を実質的に示さないことを特徴とする新
規な抗体である。ここで「ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６以外の他のヒト由来のチトクロム分子種に対し
て交差反応性を実質的に示さない」とは、目的とするヒ
ト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６と異なる分子種のヒ
ト由来のチトクロムＰ４５０に対して、交差反応性が約
１／４未満、好ましくは約１／２０未満、そしてより好
ましくは１／１００未満であるような選択的認識が実質
的に可能であることを意味する。ここで、交差反応性の
程度は、例えばヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を
後述するイムノブロット法によって検出することができ
る基質蛋白質濃度を１とした時に他のヒト由来のチトク
ロム分子種が同方法によって検出されてくる濃度をＣと
すれば、１／Ｃのように決定される。また、ヒト由来の
チトクロムＰ４５０２Ｂ６を発現する形質転換体である
酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６を抗原として免疫感作化した哺乳動物から
血液を採取し、該血液から分離・精製して得られる血清
の希釈率が１０- 4 においてもヒト由来のチトクロムＰ
４５０分子種を認識する能力を有する。The antibody of the present invention is human-derived cytochrome P4.
It is a novel antibody characterized by exhibiting substantially no cross-reactivity to cytochrome molecular species of human origin other than 502B6. Here, "human-derived cytochrome P45
It does not substantially show cross-reactivity with other human-derived cytochrome P450 other than 02B6, "means that the target human-derived cytochrome P450 2B6 crosses with a human-derived cytochrome P450 having a different molecular species. It is meant that selective recognition is substantially possible such that the reactivity is less than about 1/4, preferably less than about 1/20, and more preferably less than 1/100. Here, the degree of cross-reactivity can be detected by, for example, human-derived cytochrome P4502B6 by the immunoblotting method described later, and when the substrate protein concentration is 1, other human-derived cytochrome molecular species are detected by the same method. If the incoming density is C, it is determined as 1 / C. Further, human-derived cytochrome P extracted and purified from yeast, which is a transformant expressing human-derived cytochrome P450 2B6.
The 4502B6 Blood was collected from immunized Sakuka mammals as an antigen, the dilution of serum that is obtained by separation and purification from blood is 10 - cytochrome P also derived from humans in 4
It has the ability to recognize 450 molecular species.

【００１４】本発明抗体の利用としては、ヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｂ６に作用させた本発明抗体または
該抗体に対する抗体を、それら抗体が有する標識によっ
て検出することによってヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｂ６を免疫学的に検出する方法をあげることができ
る。具体的には、例えば、イムノブロット法、免疫沈降
による分離法、間接競合阻害法（ELISA 法）、細胞また
は組織の免疫学的染色法等によってヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｂ６を分析する方法をあげることができ
る。該分析方法は、簡便でかつ迅速に処理できる精度の
高い分析方法である。例えば、以下の方法によって行う
ことができる。The antibody of the present invention can be used by detecting the antibody of the present invention which has acted on human-derived cytochrome P450 2B6 or an antibody against the antibody by a label carried by the antibody, thereby producing human-derived cytochrome P450.
A method for immunologically detecting 2B6 can be mentioned. Specific examples include methods for analyzing human-derived cytochrome P4502B6 by immunoblotting, separation by immunoprecipitation, indirect competitive inhibition (ELISA), immunological staining of cells or tissues, and the like. it can. The analysis method is a simple and highly accurate analysis method that can be processed quickly. For example, it can be performed by the following method.

【００１５】Ｉ．イムノブロット法 固体支持材に結合される試料に存在するヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｂ６を本発明抗体（第１抗体）によっ
て認識させ、その抗体を検出する方法である。試料を結
合させる固体支持材としては、膜、シート、フィルター
等の形状にされたニトロセルロースが一般的に使用され
るが、試料の吸着がよくかつその試料に存在するヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６の抗原性を消失させない
ものであれば特に制限はない。ニトロセルロースを使用
する場合、試料のニトロセルロースへの結合は、例えば
リン酸緩衝生理食塩水等の適当な緩衝液に試料を溶解し
て得られた溶液をニトロセルロース上にスポットする。
なお、定量化のためのスポット量は、抗原であるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６に対する本発明抗体（第
１抗体）の量が過剰になるような量が望ましく、１μｌ
／３ｍｍ角程度がよい。このようにしてスポットされた
ニトロセルロースを約１分間から約２４時間、適当な湿
度条件下でインキュベートする。インキュベート後、ス
ポットした部位以外への非特異的な吸着を防止するため
に、試料を結合させた固体支持材を本発明抗体（第１抗
体）によって認識されない高分子量担体分子、すなわ
ち、本発明抗体（第１抗体）の製造において用いられな
い高分子量担体分子（ヤギ、ウシ等の別種の動物の血清
アルブミンやスキムミルク）を含む溶液と約２０分間か
ら約２４時間、室温下でインキュベートすることによっ
て該高分子量担体分子で固体支持材の表面を覆う。イン
キュベート後、得られた固体支持材をよく洗浄して遊離
状態にある上記の高分子量担体分子を除去する。このよ
うに調製された固体支持材を本発明抗体（第１抗体）を
含む調製液と混合した後、約１０分間から約３時間、振
とうしながらインキュベートする。なお本発明抗体（第
１抗体）を含む調製液とは、本発明抗体（第１抗体）を
遊離の状態で、蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の溶液中
に存在しうる調製液をいう。このようにして、試料に存
在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を本発明抗
体（第１抗体）によって認識させる。つぎに、その抗体
を検出する方法について説明する。本発明抗体（第１抗
体）が、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ等の酵素等で標識されている場合には、インキュベ
ート後、遊離の状態にある本発明抗体（第１抗体）を洗
浄によって除去してから、上記の標識酵素の基質を作用
させて、発色等で反応を測定することによって本発明抗
体（第１抗体）を検出することができる。例えば、 ペ
ルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸
化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−
フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を
生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合に
は、基質として、たとえば２，２'−アシド−ジ−（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ
Ｓ）等を用いる。また、本発明抗体（第１抗体）を認識
しかつ結合する酵素あるいはラジオアイソトープ等で標
識された第２抗体を使用する場合には、インキュベート
後、遊離の状態にある本発明抗体（第１抗体）を洗浄に
よって除去してから、第２抗体とインキュベートする。
この酵素等で標識された第２抗体としては、例えばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素を結合
した第１抗体（本発明抗体）に対する抗体をあげること
ができる。具体的な例としては、第１抗体（本発明抗
体）としてウサギ抗血清を使用する場合、第２抗体とし
ては、アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ免疫
グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を
好ましくあげることができる。なお、該ウサギＩｇＧヤ
ギＩｇＧは市販されており、容易に入手可能である。第
２抗体の検出としては、上記の標識された本発明抗体
（第１抗体）の場合と同様な方法をあげることができ
る。I. Immunoblotting method This is a method in which human-derived cytochrome P450 2B6 present in a sample bound to a solid support is recognized by the antibody of the present invention (first antibody) and the antibody is detected. Nitrocellulose in the form of a membrane, sheet, filter or the like is generally used as a solid support for binding the sample, but the human-derived cytochrome P450 2B6 antigen that has good sample adsorption and is present in the sample. There is no particular limitation as long as it does not lose the sex. When nitrocellulose is used, the binding of the sample to nitrocellulose involves spotting the solution on the nitrocellulose obtained by dissolving the sample in a suitable buffer such as phosphate buffered saline.
The amount of spots for quantification is preferably such that the amount of the antibody of the present invention (first antibody) with respect to the human-derived cytochrome P450 2B6, which is an antigen, becomes excessive.
Approximately 3 mm square is preferable. The nitrocellulose spotted in this way is incubated under suitable humidity conditions for about 1 minute to about 24 hours. After the incubation, in order to prevent non-specific adsorption to a site other than the spotted site, the solid support to which the sample is bound is not recognized by the antibody of the present invention (first antibody) as a high molecular weight carrier molecule, that is, the antibody of the present invention. By incubating at room temperature for about 20 minutes to about 24 hours with a solution containing a high molecular weight carrier molecule (serum albumin or skim milk of another animal such as goat or cow) which is not used in the production of (first antibody), The surface of the solid support is covered with high molecular weight carrier molecules. After the incubation, the obtained solid support material is thoroughly washed to remove the above-mentioned high molecular weight carrier molecules in a free state. The solid support material thus prepared is mixed with a preparation liquid containing the antibody of the present invention (first antibody), and then incubated with shaking for about 10 minutes to about 3 hours. The preparation containing the antibody of the present invention (first antibody) refers to a preparation which may exist in a solution such as distilled water, a buffer solution, or physiological saline in a free state of the antibody of the present invention (first antibody). Say. In this way, human-derived cytochrome P450 2B6 present in the sample is recognized by the antibody of the present invention (first antibody). Next, a method for detecting the antibody will be described. The antibody of the present invention (first antibody) is, for example, an enzyme such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, etc. In the case of being labeled with, after the incubation, the free antibody of the present invention (first antibody) is removed by washing, and then the substrate of the above-mentioned labeling enzyme is allowed to act, and the reaction is measured by color development or the like. By doing so, the antibody of the present invention (first antibody) can be detected. For example, in the case of labeling with peroxidase, hydrogen peroxide is used as a substrate and diaminobenzidine or O- is used as a coloring reagent.
Combines with phenylenediamine to give a brown or yellow color. When labeled with glucose oxidase, for example, 2,2′-acid-di- (3
-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABT
S) or the like is used. When a second antibody labeled with an enzyme or a radioisotope that recognizes and binds to the antibody of the present invention (first antibody) is used, the antibody of the present invention in a free state after incubation (the first antibody) ) Is removed by washing and then incubated with the second antibody.
Examples of the secondary antibody labeled with this enzyme or the like include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, etc. An antibody to the first antibody (the antibody of the present invention) to which the enzyme of (1) is bound can be mentioned. As a specific example, when a rabbit antiserum is used as the first antibody (antibody of the present invention), an alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin (IgG) goat immunoglobulin (IgG) is preferable as the second antibody. I can give you. The rabbit IgG and goat IgG are commercially available and can be easily obtained. For detection of the second antibody, the same method as in the case of the labeled antibody of the present invention (first antibody) can be mentioned.

【００１６】ＩＩ．免疫沈降による分離法 試料に存在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を
本発明抗体（第１抗体）によって認識させ、その抗体と
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６からなる免疫複合
体を精製することによって試料からヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｂ６のみを分離し、分離したヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｂ６をゲル電気泳動法、酵素活性測
定、イムノブロット法等の方法によってヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｂ６の検出に利用する。まず、試料と
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６に対する本発明抗
体（第１抗体）を、たとえば、約１時間から約２４時
間、４℃で撹拌しながら混合することによって免疫複合
体を形成させる。この際の試料と本発明抗体（第１抗
体）との混合比としては、例えば１：８程度をあげるこ
とができるが、試料に存在するヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６によって適宜増減される。つぎに形成され
た免疫複合体に、抗体に特異的に結合しかつ抗体および
抗体と結合しているヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ
６を溶液中から分離することができる２次試薬を添加
し、この混合物をインキュベートすることによって、免
疫複合体と２次試薬からなる複合体を形成させ、これを
回収する。ここで２次試薬としては、たとえば、プロテ
インＡ，プロテインＧ等の抗体と結合する細菌細胞壁蛋
白質または抗免疫グロブリン抗体があげられる。なお、
これら２次試薬は不溶性の支持材に結合されたものを用
いると免疫複合体と２次試薬からなる複合体の回収（遠
心分離、洗浄等）がきわめて容易である。不溶性の支持
材は、非常に広範囲のデザインを有し、そして使用に際
して意図された特定の目的に応じて非常に異なる形状を
有することができる。たとえば、ビーズ、皿、球、プレ
ート、小型ロッド、セル、小型ボトル、小型チューブ、
ファイバー、ネット等をあげることができる。具体的な
例としては、アガロース等の多糖体（たとえば、セファ
ロース、バイオゲル等）からなるビーズや透明プラスチ
ック材料、たとえばポリ塩化ビニルまたはポリスチレン
からなるミクロタイタープレート、ポリスチレンおよび
ポリスチレンラテックスからなる小球、チューブまたは
ロッド等が使用可能である。つぎに回収された複合体を
加熱処理等の操作によってヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６を遊離させる。そして遊離の状態にあるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６をゲル電気泳動法、酵素
活性測定、イムノブロット法等の方法によって検出すれ
ばよい。II. Separation method by immunoprecipitation Human-derived cytochrome P450 2B6 present in a sample is recognized by the antibody of the present invention (first antibody), and an immune complex consisting of the antibody and human-derived cytochrome P450 2B6 is purified to obtain a human-derived cytochrome P4502B6 from the sample. Only cytochrome P4502B6 is separated, and the separated human-derived cytochrome P4502B6 is used for detection of human-derived cytochrome P4502B6 by methods such as gel electrophoresis, enzyme activity measurement and immunoblotting. First, an immune complex is formed by mixing the sample and the antibody of the present invention (first antibody) against human-derived cytochrome P450 2B6, for example, for about 1 to about 24 hours with stirring at 4 ° C. The mixing ratio of the sample to the antibody of the present invention (first antibody) at this time may be, for example, about 1: 8, and human-derived cytochrome P present in the sample.
It is increased or decreased by 4502B6. Human-derived cytochrome P4502B specifically bound to the antibody and bound to the antibody and the antibody thus formed
A secondary reagent capable of separating 6 from the solution is added, and the mixture is incubated to form a complex consisting of the immune complex and the secondary reagent, which is recovered. Here, examples of the secondary reagent include a bacterial cell wall protein that binds to an antibody such as protein A and protein G, or an anti-immunoglobulin antibody. In addition,
If these secondary reagents bound to an insoluble support material are used, the recovery of the complex consisting of the immune complex and the secondary reagent (centrifugation, washing, etc.) is extremely easy. Insoluble support materials have a very wide range of designs and can have very different shapes depending on the particular purpose for which they are intended. For example, beads, dishes, spheres, plates, small rods, cells, small bottles, small tubes,
Fiber, net, etc. can be mentioned. Specific examples include beads made of polysaccharides such as agarose (eg, sepharose, biogel, etc.) and transparent plastic materials such as microtiter plates made of polyvinyl chloride or polystyrene, spheres made of polystyrene and polystyrene latex, and tubes. Alternatively, a rod or the like can be used. Next, the recovered complex is subjected to a treatment such as a heat treatment to give human-derived cytochrome P45.
Release 02B6. Then, the human-derived cytochrome P450 2B6 in a free state may be detected by a method such as gel electrophoresis, enzyme activity measurement, immunoblotting.

【００１７】ＩＩＩ．間接競合阻害法（ELISA 法） 基本的には、固体支持材に結合される抗原であるヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６と試料中に含まれるヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６との競合、例えば固体
支持材に結合される抗原であるヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６と標識が施されている第２抗体によって認
識される第１抗体の遊離抗原であるヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｂ６との競合に基づいている。これに関連
して、固体支持材への抗原の結合は直接、あるいはスペ
ーサーおよび／または第１抗体（すなわち、本発明抗
体）によって認識されない高分子量担体分子を介して起
こり得る。ここで、第１抗体（すなわち、本発明抗体）
によって認識されない高分子量担体分子とは、第１抗体
の製造において用いられない高分子量担体分子のことで
ある。これは本発明抗体がポリクローナルである場合に
重要である。抗原の直接または間接的な結合に用いられ
る固体支持材としては、たとえばミクロタイタープレー
トまたは試験管のプラスチック表面、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリ塩化ビニル、ガラスまたはプラスチ
ック等からなるビーズ表面、ろ紙、デキストラン、セル
ロースもしくはニトロセルロースまたはその他の類似の
材料の細片の表面等をあげることができる。これらの固
体支持材に、抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｂ６を直接、あるいはスペーサーおよび／または第１
抗体（本発明抗体）によって認識されない高分子量担体
分子を介して間接的に結合する（以下、コーティングと
記す。）には、例えば、あらかじめ、グルタルアルデヒ
ドまたは臭化シアン等を用いる通常の方法によって固体
支持材の活性化を行う。用いられるコーティング液とし
ては、例えば１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む約１０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ=7.4）等をあげることができ
る。コーティングの条件として、例えば抗原であるヒト
由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６のコーティング液内の
濃度は、約０．０５μｇ／mlから約１μｇ／ml等を好ま
しくあげることができる。またコーティング時間として
は、例えば約６時間ないし２４時間をあげることができ
る。なお、上記の具体的な例としては、例えば固体支持
材としてポリスチレン製の９６穴ミクロタイタープレー
トを使用することができる。このようにして得られる固
体支持材に直接または間接的に結合するヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｂ６は次に、試料中に含まれる検出す
べき抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６お
よび第１抗体（本発明抗体）を含有する試験溶液と混合
され、該混合物はインキュベートされる。なお、試料中
に含まれる検出すべき抗原であるヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０２Ｂ６は、この際に遊離の形態で、水溶液、生
理食塩水、緩衝液または生体試料等の成分として存在し
得る。約１０分間ないし約２時間のインキュベート後
に、混合物は第１抗体（本発明抗体）を認識し、そして
結合する酵素等で標識された第２抗体とインキュベート
される。この酵素等で標識された第２抗体としては、例
えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、
グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵
素を結合した第１抗体（本発明抗体）に対する抗体をあ
げることができる。具体的な例としては、第１抗体（本
発明抗体）としてウサギ抗血清を使用する場合、第２抗
体としては、ペルオキシダーゼを結合した抗ウサギ免疫
グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を
好ましくあげることができる。なお、該ウサギＩｇＧヤ
ギＩｇＧは市販されており、容易に入手可能である。ペ
ルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸
化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−
フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を
生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合に
は、基質として、たとえば２，2'−アシド−ジ−（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）
等を用いる。また本発明は、ヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｂ６の免疫学的検出・分析用キットを包含する。
上記の試験キットは、たとえば次の構成成分を含有し得
る：(1) ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を直接、
あるいはスペーサーおよび／または第１抗体（本発明抗
体）によって認識されない高分子量担体分子を介して間
接的に結合する固体支持材、(2) 本発明抗体を含有する
試薬、(3) 本発明抗体に対する標識された抗体を含有す
る試薬、すなわち第１抗体（本発明抗体）を認識し、そ
して結合する酵素等で標識された第２抗体を含有する試
薬。さらに補助的に、(4) ヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６の標準化溶液、(5) 緩衝液、(6) 非特異的吸着
および凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面活性
剤等の添加剤、および(7)ピペット、反応容器、計算曲
線等を含めるとよい。上記の固体支持材は、非常に広範
囲のデザインを有し、そして使用に際して意図された特
定の目的に応じて非常に異なる形状を有することができ
る。例えば、皿、球、プレート、小型ロッド、セル、小
型ボトル、小型チューブ、ファイバー、ネット等をあげ
ることができる。具体的な例としては、透明プラスチッ
ク材料、たとえばポリ塩化ビニルまたはポリスチレンか
らなるミクロタイタープレート、ポリスチレンおよびポ
リスチレンラテックスからなる小球、チューブまたはロ
ッド等が使用可能である。III. Indirect competitive inhibition method (ELISA method) Basically, competition between human-derived cytochrome P4502B6, which is an antigen bound to a solid support, and human-derived cytochrome P4502B6 contained in a sample, for example, bound to a solid support. Human-derived cytochrome P, which is an antigen
It is based on competition with human-derived cytochrome P4502B6, which is the free antigen of the first antibody recognized by 4502B6 and the labeled second antibody. In this context, the binding of the antigen to the solid support can occur directly or via a spacer and / or a high molecular weight carrier molecule that is not recognized by the first antibody (ie the antibody of the invention). Here, the first antibody (that is, the antibody of the present invention)
High molecular weight carrier molecules that are not recognized by are those that are not used in the production of the first antibody. This is important when the antibody of the present invention is polyclonal. Solid supports used for direct or indirect binding of antigens include, for example, microtiter plate or test tube plastic surfaces, polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride, glass or plastic bead surfaces, filter paper, dextran, cellulose. Alternatively, the surface of strips of nitrocellulose or other similar material may be mentioned. Human-derived cytochrome P450, which is an antigen, is added to these solid supports.
2B6 directly or with a spacer and / or first
For indirectly binding (hereinafter referred to as coating) via a high-molecular-weight carrier molecule that is not recognized by the antibody (the antibody of the present invention), for example, glutaraldehyde, cyanogen bromide, or the like is used as a solid substance by a conventional method. Activate the support material. The coating liquid used is, for example, about 10 mM containing 140 mM sodium chloride.
Examples of the buffer include mM phosphate buffer (pH = 7.4). As a coating condition, for example, the concentration of human-derived cytochrome P450 2B6, which is an antigen, in the coating solution is preferably about 0.05 μg / ml to about 1 μg / ml. The coating time can be, for example, about 6 hours to 24 hours. As a specific example of the above, for example, a 96-well microtiter plate made of polystyrene can be used as the solid support material. The human-derived cytochrome P450 2B6 directly or indirectly bound to the solid support thus obtained is then the human-derived cytochrome P450 2B6 which is the antigen to be detected contained in the sample and the first antibody (the antibody of the present invention). ) Is mixed with the test solution, and the mixture is incubated. The human-derived cytochrome P450 2B6, which is the antigen to be detected, contained in the sample may be present in a free form at this time as a component such as an aqueous solution, physiological saline, a buffer solution or a biological sample. After incubation for about 10 minutes to about 2 hours, the mixture is incubated with a second antibody labeled with an enzyme or the like that recognizes and binds to the first antibody (the antibody of the present invention). Examples of the second antibody labeled with this enzyme or the like include, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, β-
D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase,
An antibody to the first antibody (the antibody of the present invention) to which an enzyme such as glucose-6-phosphate dehydrogenase is bound can be mentioned. As a specific example, when a rabbit antiserum is used as the first antibody (antibody of the present invention), as the second antibody, anti-rabbit immunoglobulin (IgG) and goat immunoglobulin (IgG) conjugated with peroxidase are preferred. be able to. The rabbit IgG and goat IgG are commercially available and can be easily obtained. When labeled with peroxidase, hydrogen peroxide is used as a substrate and diaminobenzidine or O-is used as a coloring reagent.
Combines with phenylenediamine to give a brown or yellow color. When labeled with glucose oxidase, for example, 2,2′-acid-di- (3-
Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)
Etc. are used. The present invention also relates to human-derived cytochrome P4.
502B6 immunological detection / analysis kit is included.
The above test kit may contain the following components, for example: (1) human-derived cytochrome P450 2B6 directly,
Alternatively, a solid support material indirectly bound through a spacer and / or a high molecular weight carrier molecule that is not recognized by the first antibody (the antibody of the present invention), (2) a reagent containing the antibody of the present invention, (3) against the antibody of the present invention A reagent containing a labeled antibody, that is, a reagent containing a second antibody labeled with an enzyme or the like that recognizes and binds to the first antibody (the antibody of the present invention). (4) Human-derived cytochrome P45
02B6 standardized solution, (5) buffer solution, (6) polypeptide that prevents non-specific adsorption and aggregate formation, additives such as surfactants, and (7) pipette, reaction vessel, calculation curve, etc. Good to include. The solid supports described above have a very wide range of designs and can have very different shapes depending on the particular purpose for which they are intended. For example, a plate, a ball, a plate, a small rod, a cell, a small bottle, a small tube, a fiber, a net and the like can be mentioned. As a specific example, a transparent plastic material such as a microtiter plate made of polyvinyl chloride or polystyrene, a small ball made of polystyrene and polystyrene latex, a tube or a rod can be used.

【００１８】ＩＶ． 細胞または組織の免疫学的染色法 固定された細胞または組織標本中に存在するヒト由来の
チトクロムＰ４５０２Ｂ６を本発明抗体（第１抗体）に
よって認識させ、その抗体を検出する方法であり、細胞
または組織中の存在量、局在状態を調べるのに役立つ。
調べたい細胞または組織を固定し、光学顕微鏡または電
子顕微鏡等の観察が可能な標本を作製する。細胞または
組織の固定に使用する試薬は、顕微鏡下での観察に適し
たもので、かつ抗原であるヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６を認識する本発明抗体の能力を消失させないも
のであれば特に制限はないが、好ましくは３．７％ホル
マリン液、１００％メタノール、１００％エタノール、
４％パラホルムアルデヒド溶液、１％グルタールアルデ
ヒド溶液等があげられる。そして固定された細胞または
組織標本を約３０分間から約２４時間、４℃でインキュ
ベートすることによって、固定された細胞または組織標
本中に存在するヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を
本発明抗体（第１抗体）によって認識させる。つぎに、
その抗体を検出する方法について説明する。本発明抗体
（第１抗体）が、たとえばペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ等の酵素等で標識されている場合には、
インキュベート後、遊離の状態にある本発明抗体（第１
抗体）を洗浄によって除去してから、上記の標識酵素の
基質を作用させて、発色等で反応を測定することによっ
て本発明抗体（第１抗体）を検出することができる。例
えば、 ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質
として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジン
またはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色ま
たは黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識され
る場合には、基質として、例えば２，2'−アシド−ジ−
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢ
ＴＳ）等を用いる。また、本発明抗体（第１抗体）を認
識しかつ結合する酵素等で標識された第２抗体を使用す
る場合には、インキュベート後、遊離の状態にある本発
明抗体（第１抗体）を洗浄によって除去してから、第２
抗体とインキュベートする。この酵素等で標識された第
２抗体としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ等の酵素を結合した第１抗体（本発明抗
体）に対する抗体をあげることができる。具体的な例と
しては、第１抗体（本発明抗体）としてウサギ抗血清を
使用する場合、第２抗体としては、ペルオキシダーゼを
結合した抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グ
ロブリン（ＩｇＧ）を好ましくあげることができる。な
お、該ウサギＩｇＧヤギＩｇＧは市販されており、容易
に入手可能である。第２抗体の検出としては、上記の標
識された本発明抗体（第１抗体）の場合と同様な方法を
あげることができる。以下、実施例を挙げて本発明を説
明するが、本発明は下記の実施例にのみ限定されないこ
とは言うまでもない。IV. Immunological Staining Method for Cells or Tissues A method for recognizing human-derived cytochrome P450 2B6 present in fixed cells or tissue specimens by the antibody of the present invention (first antibody) and detecting the antibody. It is useful for investigating the abundance and the localized state in.
The cells or tissues to be examined are fixed, and a specimen that can be observed with an optical microscope or an electron microscope is prepared. Reagents used for fixing cells or tissues are suitable for observation under a microscope, and are human-derived cytochrome P45 that is an antigen.
There is no particular limitation as long as it does not abolish the ability of the antibody of the present invention to recognize 02B6, but 3.7% formalin solution, 100% methanol, 100% ethanol,
4% paraformaldehyde solution, 1% glutaraldehyde solution, etc. may be mentioned. Then, by incubating the fixed cell or tissue sample for about 30 minutes to about 24 hours at 4 ° C., the human-derived cytochrome P450 2B6 present in the fixed cell or tissue sample is transferred to the antibody of the present invention (first antibody). To recognize. Next,
A method for detecting the antibody will be described. The antibody of the present invention (first antibody) is an enzyme such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, etc. If labeled with
After incubation, the antibody of the present invention in a free state (first
The antibody of the present invention (first antibody) can be detected by removing the antibody) by washing, then allowing the substrate of the above-mentioned labeling enzyme to act, and measuring the reaction by color development or the like. For example, when labeled with peroxidase, it combines with hydrogen peroxide as a substrate and diaminobenzidine or O-phenylenediamine as a coloring reagent to give a brown or yellow color. When labeled with glucose oxidase, for example, 2,2'-acid-di-
(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (AB
TS) or the like is used. When a second antibody labeled with an enzyme or the like that recognizes and binds to the antibody of the present invention (first antibody) is used, the free antibody of the present invention (first antibody) is washed after incubation. Removed by the second
Incubate with antibody. Examples of the secondary antibody labeled with this enzyme or the like include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, etc. An antibody to the first antibody (the antibody of the present invention) to which the enzyme of (1) is bound can be mentioned. As a specific example, when a rabbit antiserum is used as the first antibody (antibody of the present invention), as the second antibody, anti-rabbit immunoglobulin (IgG) and goat immunoglobulin (IgG) conjugated with peroxidase are preferred. be able to. The rabbit IgG and goat IgG are commercially available and can be easily obtained. For detection of the second antibody, the same method as in the case of the labeled antibody of the present invention (first antibody) can be mentioned. Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to the following examples.

【００１９】[0019]

【実施例】【Example】

製造例１ ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６をコー
ドする塩基配列を有する遺伝子の取得 市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech
社）から配列番号１〜２記載のヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６遺伝子クローニング用プライマーを用いた
ＰＣＲ法を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｂ６をコードするｃＤＮＡを得た。得られたｃＤ
ＮＡの塩基配列および検定アミノ酸配列を配列番号３に
記載した。Production Example 1 Acquisition of gene having nucleotide sequence encoding human-derived cytochrome P450 2B6 Commercially available human liver-derived cDNA library (Clontech
Human-derived cytochrome P described in SEQ ID NOS: 1 and 2
Human-derived cytochrome P4 by using PCR method using 4502B6 gene cloning primer
A cDNA encoding 502B6 was obtained. The obtained cd
The nucleotide sequence of NA and the test amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 3.

【００２０】 製造例２ 酵母発現プラスミドの構築：ｐ２Ｂ６ 図１にヒトＰ４５０２Ｂ６酵母内発現プラスミドの構築
方法を示す。配列番号１〜２で示すプライマーを用い
て、ＰＣＲ法により、ヒトＰ４５０２Ｂ６遺伝子全タン
パク質コーディング領域を増幅した。得られた断片は、
ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断してｐＵＣＡ（pUC19 が有
するEcoRI 部位をHindIII 部位に改変し、形成されたHi
ndIII とHindIII 部位の間のクローニングサイトを下記
のクローニングサイト（化１）：Production Example 2 Construction of yeast expression plasmid: p2B6 FIG. 1 shows a method for constructing a human P450 2B6 yeast expression plasmid. The human P450 2B6 gene whole protein coding region was amplified by the PCR method using the primers shown in SEQ ID NOS: 1 and 2. The resulting fragment is
It was cut with XbaI and BamHI to change the pUCA (EcoRI site of pUC19 into a HindIII site to form Hi
The cloning site between the ndIII and HindIII sites is the following cloning site (Chemical formula 1):

【化１】 に交換することにより作製されたサブクローン用のプラ
スミド）にサブクローン化した。これをＨｉｎｄ IIIで
部分消化し、ｐＡＡＨ５Ｎベクターに挿入し、ヒトＰ４
５０２Ｂ６の酵母発現プラスミドｐ２Ｂ６を構築した。Embedded image Subcloning to the plasmid for subclones prepared by exchanging This was partially digested with HindIII and inserted into pAAH5N vector, and human P4
The 502B6 yeast expression plasmid p2B6 was constructed.

【００２１】製造例３ 形質転換酵母菌体の作製 ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％
グルコース）１.０mlにサッカロミセス・セレビシェー
ＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠
心分離（5000Xg、10分間) により集菌した。得られた菌
体を1.０mlの０.２Ｍ ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再
度遠心分離（5000Xg、10分間) し、得られたペレットに
２０μｌの１Ｍ ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリ
エチレングリコール4000溶液、約１.０μｇのヒトＰ４
５０酵母内発現プラスミドｐ２Ｂ６を含む１０μｌの溶
液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時
間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加え
て撹拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（2.0％
グルコース、0.67％窒素源アミノ酸不含（Nitrogenbase
w/o amino acids, Difco製）、20μｇ／mlヒスチジ
ン、2.0％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベ
ートし、上記の酵母発現プラスミドを保有する形質転換
酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内でヒト由
来のチトクロムＰ４５０ ２Ｂ６を発現させる形質転換
酵母菌体を作製した。Production Example 3 Preparation of transformed yeast cells YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2%
Saccharomyces cerevisiae strain AH22 was inoculated into 1.0 ml of glucose), shaken at 30 ° C. for 18 hours, and then collected by centrifugation (5000 × g, 10 minutes). The obtained cells were suspended in 1.0 ml of 0.2M LiC1 solution and then centrifuged again (5000Xg, 10 minutes), and the resulting pellet was mixed with 20 µl of 1M LiC1 solution and 30 µl of 70% polyethylene glycol 4000. Solution, about 1.0 μg of human P4
10 μl of solution containing 50 yeast expression plasmid p2B6 was added. After mixing this well, it was incubated at 30 ° C. for 1 hour, 140 μl of sterilized water was further added, and the mixture was stirred. Add this solution to SD synthetic medium plate (2.0%
Glucose, 0.67% nitrogen source amino acid free (Nitrogenbase
w / o amino acids, manufactured by Difco), 20 μg / ml histidine, 2.0% agar), and incubated at 30 ° C. for 3 days to select the transformed yeast cells carrying the above yeast expression plasmid. In this way, transformed yeast cells expressing human-derived cytochrome P450 2B6 in yeast were prepared.

【００２２】製造例４ 酵母内で発現したヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｂ６の定量 製造例３によって作製されたヒトＰ４５０２Ｂ６を発現
させる形質転換酵母菌体の培養液（ＳＤ合成培地、菌体
濃度約1.５×１０7 菌体／ml）２００mlを集菌し、該菌
体を１０mlの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）を懸濁した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し
た。得られたペレットを新たに２.０mlの１００ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.0 ）に懸濁し、２本のキュベ
ットに1.０mlずつ分注した。サンプル側のキュベットに
一酸化炭素を吹き込んだ後、両キュベット内にジチオナ
イト５−１０mgを添加し、撹拌したのち４００−５００
ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母内に存在するヒトＰ
４５０２Ｂ６濃度を算出した。各種の形質転換酵母菌体
におけるヒトＰ４５０２Ｂ６の発現量は約１０5 −約１
０6 分子／菌体のレベルであった。Production Example 4 Quantification of human-derived cytochrome P450 2B6 expressed in yeast A culture solution of transformed yeast cells expressing the human P450 2B6 produced in Production Example 3 (SD synthesis medium, cell concentration about 1.5). 200 ml of (× 10 7 cells / ml) was collected and 10 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.
0) was suspended and then centrifuged (5000 × g, 10 minutes). The obtained pellet was newly suspended in 2.0 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and dispensed into two cuvettes by 1.0 ml each. After blowing carbon monoxide into the cuvette on the sample side, 5-10 mg of dithionite was added to both cuvettes and stirred, and then 400-500.
nm difference spectrum is measured, and human P present in yeast is
The 4502B6 concentration was calculated. The expression level of human P450 2B6 in various transformed yeast cells is about 10 5 to about 1.
The level was 0 6 molecules / cell.

【００２３】製造例５ 形質転換酵母菌体からのミクロ
ソーム画分の調製 製造例３によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４
５０２Ｂ６を発現させる形質転換酵母菌体の培養液（Ｓ
Ｄ合成培地、菌体濃度約1.０×１０8 菌体／ml）３.８
ｌを集菌し、得られた菌体を４００mlの緩衝液Ａ（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），２Ｍ ソルビトー
ル，０.１ｍＭ ＤＴＴ，０.２ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁
し、１６０mg ザイモリエイス 100,000（zymolyase100
T 和光純薬社製)を加え、３０℃で６０分間インキュベ
ートした。遠心分離（5000×ｇ、１０分間）して得られ
たスフェロプラストを１００mlの緩衝液Ａに懸濁した
後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。同じ遠心分
離操作をもう一度繰り返してスフェロプラストの洗浄を
行った後、スフェロプラストを２００mlの緩衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5），0.65Ｍ ソルビト
ール，0.1ｍＭＤＴＴ）に懸濁し超音波破砕（５０Ｗ，
５分間）した。該破砕物を遠心分離（9000×ｇ、２０分
間）して、上清画分を得た。また、これをさらに遠心分
離（125000×ｇ、７０分間）して沈澱を集め、０.１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（pH7.4）１０mlに再懸濁するこ
とによりミクロソーム画分を得た。Production Example 5 Preparation of Microsome Fraction from Transformed Yeast Cells Human-derived cytochrome P4 produced in Production Example 3
A culture solution of transformed yeast cells expressing 502B6 (S
D synthetic medium, cell concentration about 1.0 × 10 8 cells / ml) 3.8
1 was collected, and the obtained bacterial cells were mixed with 400 ml of buffer solution A (10
Suspended in mM Tris-HCl (pH 7.5), 2M sorbitol, 0.1 mM DTT, 0.2 mM EDTA), 160 mg Zymolyase 100,000 (zymolyase100)
T Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 60 minutes. The spheroplasts obtained by centrifugation (5000 xg, 10 minutes) were suspended in 100 ml of buffer solution A and then centrifuged (5000 xg, 10 minutes). The same centrifugation operation was repeated once again to wash the spheroplasts, and then the spheroplasts were washed with 200 ml of the buffer solution (10
Suspend in mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.65 M sorbitol, 0.1 mM DTT and sonicate (50 W,
5 minutes). The crushed product was centrifuged (9000 xg, 20 minutes) to obtain a supernatant fraction. This was further centrifuged (125,000 xg, 70 minutes) to collect the precipitate,
The microsome fraction was obtained by resuspending in 10 ml of potassium phosphate buffer (pH 7.4).

【００２４】製造例６ ミクロソーム画分からのヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６の精製 製造例５で取得したヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ
６を含むミクロソーム画分（約３００mg）を１ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍＭＰＭＳＦ、２０％グ
リセロールを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.
2、緩衝液Ｂ）で３mg/mlに希釈し、コール酸ナトリウム
を最終濃度０．６％になるように滴下し、４℃ ３０分
放置し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を可溶化
した。可溶化液を遠心分離（２０００００ｘｇ、３０
分）した後、上清を０．５％コール酸ナトリウムを含む
緩衝液Ｂで平衡化したオクチルアミノセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）１５mlを充填したカラムに通し、
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を担体に吸着させ
た。緩衝液Ｂでカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去
した後、緩衝液Ｂに０．２％ポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル（花王社製、商品名エマルゲン９１
１）を添加した緩衝液にてヒト由来のチトクロムヒトＰ
４５０２Ｂ６を溶出させた。活性画分を集め、２０％グ
リセロールを含む０．０２Ｍトリス−酢酸緩衝液（pH7.
2、緩衝液Ｃ）に対して１晩透析した。その後、０．４
％ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（花王社
製、商品名エマルゲン９１１）を添加した緩衝液Ｃで平
衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー社製）ＨＰＬＣカ
ラムに供したところヒト由来のチトクロムヒトＰ４５０
２Ｂ６は非吸着画分に溶出された。続いて、０．２％ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル（花王社製、
商品名エマルゲン９１１）、０．２％コール酸ナトリウ
ム、２０％グリセロールを含む０．０１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH7.2緩衝液Ｄ）で平衡化したハイドロキ
シアパタイト（高研社製）ＨＰＬＣカラムに供し、緩衝
液Ｄでカラムを充分に洗浄し、非吸着部分を除去した
後、リン酸ナトリウム直線濃度勾配法にてヒト由来のチ
トクロムヒトＰ４５０２Ｂ６を溶出した。続いて、活性
画分を集め、２０％グリセロールを含む０．０１Ｍリン
酸緩衝液（pH7.2、緩衝液Ｅ）で平衡化したハイドロキ
シアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）ＨＰＬＣカラムに
供し、緩衝液Ｅにて充分に洗浄し、０．０５％コール酸
ナトリウム、２０％グリセロールを含む０．３５Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液でヒト由来のチトクロムヒトＰ４５
０２Ｂ６を溶出させ、活性画分を集め、精製ヒト由来の
チトクロムヒトＰ４５０２Ｂ６を得た。Production Example 6 Purification of human-derived cytochrome P4502B6 from microsomal fraction Human-derived cytochrome P4502B obtained in Production Example 5
The microsome fraction (about 300 mg) containing 6 was added to 1 mM DT.
T, 1 mM EDTA, 0.25 mM PMSF, 20% glycerol in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.
2. Diluted to 3 mg / ml with buffer solution B), sodium cholate was added dropwise to a final concentration of 0.6% and left at 4 ° C. for 30 minutes to solubilize human-derived cytochrome P450 2B6. Centrifuge the solubilized solution (200000 xg, 30
Octylamino sepharose 4B equilibrated with buffer B containing 0.5% sodium cholate.
Pass through a column filled with 15 ml (Pharmacia),
Human-derived cytochrome P450 2B6 was adsorbed on a carrier. The column was thoroughly washed with buffer solution B to remove non-adsorbed components, and then 0.2% polyoxyethylene nonylphenyl ether (manufactured by Kao, trade name Emulgen 91) was added to buffer solution B.
Human-derived cytochrome human P in a buffer containing 1)
4502B6 was eluted. The active fractions were collected, and 0.02M Tris-acetate buffer solution (pH 7.
2, dialyzed against buffer C) overnight. Then 0.4
% Polyoxyethylene nonyl phenyl ether (manufactured by Kao, trade name Emulgen 911) was added to a DEAE-5PW (manufactured by Tosoh) HPLC column equilibrated with buffer C, and human-derived cytochrome human P450 was obtained.
2B6 was eluted in the non-adsorbed fraction. Then, 0.2% polyoxyethylene nonyl phenyl ether (manufactured by Kao Corporation,
Trade name: Emulgen 911), 0.2M sodium cholate, 20% glycerol on a hydroxyapatite (manufactured by Koken) HPLC column equilibrated with 0.01M sodium phosphate buffer (pH 7.2 buffer D). Then, the column was thoroughly washed with buffer solution D to remove the non-adsorbed portion, and then human-derived cytochrome human P4502B6 was eluted by the sodium phosphate linear concentration gradient method. Subsequently, the active fractions were collected and subjected to a hydroxyapatite (Bio-Rad) HPLC column equilibrated with a 0.01 M phosphate buffer solution (pH 7.2, buffer solution E) containing 20% glycerol to give a buffer solution. After thorough washing with E, human-derived cytochrome human P45 was treated with 0.35 M sodium phosphate buffer containing 0.05% sodium cholate and 20% glycerol.
02B6 was eluted and the active fractions were collected to obtain purified human-derived cytochrome human P450 2B6.

【００２５】製造例７ 哺乳動物の免疫感作化工程およ
び本発明抗体取得工程 製造例６によって得られた精製ヒト由来のチトクロムＰ
４５０２Ｂ６を１mg／mlの濃度になるように生理食塩水
に溶解した。この水溶液２mlにあらかじめ４２℃から４
３℃にインキュベートされたＲＡＳ〔MPL(Monophosphor
yl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycola
te)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕
（Sigma 社製）４０μｌを加え、よく混合した。得られ
た混合物をニュージーランドホワイト種ウサギ（雌、１
４週齢、平均２．４kg）一羽あたり１mlの液量投与し
た。その内訳は、１００μｌずつ背部１０ケ所に皮下投
与であった。その後、３週間後、５週間後に再度初回の
１／２量を同様に投与した。この間ウサギの耳静脈から
少量の血液をサンプリングし、抗体価を測定した。２回
目の投与後に抗体価が上昇したため、２回目投与の約２
週間後に免疫感作した供試ウサギの頸動脈から全採血
し、得られた血液をセパラピットチューブ（積水化学社
製）に入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、遠
心分離（3000rpm 、20min 、室温）して上清を回収する
ことにより、抗血清を得た。さらに得られた抗血清を５
６℃で３０分間処理し、補体系の不活性化を行った。こ
れを（第１）抗体として下記の試験に用いた。Production Example 7 Mammary immunization step and step of obtaining antibody of the present invention Purified human-derived cytochrome P obtained in Production Example 6
4502B6 was dissolved in physiological saline to a concentration of 1 mg / ml. Add 2 ml of this aqueous solution from 42 ° C to 4
RAS [MPL (Monophosphor
yl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycola
te) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system)
40 μl (Sigma) was added and mixed well. The resulting mixture was applied to New Zealand White rabbits (female, 1
(4 weeks old, average 2.4 kg) 1 ml of liquid was administered per bird. The breakdown was 100 μl each subcutaneously administered to 10 sites on the back. Then, after 3 weeks and 5 weeks, the first half amount was again administered in the same manner. During this period, a small amount of blood was sampled from the rabbit ear vein and the antibody titer was measured. Since the antibody titer increased after the second administration, about 2
After a week, whole blood was collected from the carotid artery of the immunized test rabbit, and the obtained blood was placed in a separapit tube (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) and incubated at 37 ° C. for 2 hours, followed by centrifugation (3000 rpm, 20 min The antiserum was obtained by collecting the supernatant at room temperature). Furthermore, the obtained antiserum was 5
The complement system was inactivated by treatment at 6 ° C for 30 minutes. This was used as the (first) antibody in the following test.

【００２６】試験例１ 本発明抗体を用いたイムノブロ
ット法によるヒト由来のチトクロム２Ｂ６の分析 製造例１から６によって得られてヒト由来のチトクロム
２Ｂ６および同様な方法に準じて得られた他のヒト由来
のチトクロムＰ４５０分子種９種類（チトクロムＰ４５
０１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１
８、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）に対し、製造例７で
得た本発明抗体を用いてイムノブロッティングを行っ
た。ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１、１Ａ２、２
Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｄ６、２
Ｅ１および３Ａ４をそれぞれ0.5 から1pmol をＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動（40mA、1 時間）し
た。このゲルにニトロセルロース膜を重ね、転写用緩衝
液（25mM Tris 、192mM グリシン、20% メタノール）中
に浸した状態で、BIO-RAD 社製のブロッティング装置に
より、4 ℃、20mA、15時間処理し、泳動したタンパク質
をニトロセルロース膜へと移動させた。得られたニトロ
セルロース膜は、TBS ＋Tween20 溶液（50mM Tris-HCl
(pH7.5)、200mM NaCl、0.05% Tween20 ）で洗浄した
後、3%のゼラチンを含むTBS ＋Tween20 溶液中で、37
℃、40分間インキュベートし、その後、1%ゼラチンを含
むTBS ＋Tween20 溶液で1000倍希釈した本発明抗体と、
37℃、1 時間反応させた。反応後、TBS ＋Tween20 溶液
で4 回洗浄後、3%のゼラチンを含むTBS ＋Tween20 溶液
中で、37℃、20分間インキュベートし、その後、1%ゼラ
チンを含むTBS ＋Tween20 溶液で、2500倍希釈した1
2 5 I 標識したProteinA（アマシャム社製）と、37℃、
1 時間反応させた。反応後、TBS ＋Tween20 で4 回洗浄
後、風乾し、富士フィルム社製のイメージングプレート
にて15時間露光し、富士フィルム社製のBAS2000 システ
ムにて検出した。本発明抗体は、上記10種のヒト由来の
チトクロムＰ４５０のうち、２Ｂ６のみと特異的に反応
した（表１および図２参照）。Test Example 1 Analysis of human-derived cytochrome 2B6 by immunoblotting using the antibody of the present invention Human-derived cytochrome 2B6 obtained in Production Examples 1 to 6 and other humans obtained according to a similar method 9 types of derived cytochrome P450 molecular species (cytochrome P45
01A1, 1A2, 2A6, 2C8, 2C9, 2C1
8, 2D6, 2E1 and 3A4) were subjected to immunoblotting using the antibody of the present invention obtained in Production Example 7. Human-derived cytochrome P450 1A1, 1A2, 2
A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2D6, 2
E1 and 3A4 (0.5 to 1 pmol) were electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel (40 mA, 1 hour). A nitrocellulose membrane was overlaid on this gel, and immersed in a transfer buffer solution (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol) and treated with a BIO-RAD blotting device at 4 ° C, 20 mA for 15 hours. The migrated protein was transferred to a nitrocellulose membrane. The resulting nitrocellulose membrane was a TBS + Tween20 solution (50 mM Tris-HCl).
(pH7.5), 200 mM NaCl, 0.05% Tween20), and then 37% in TBS + Tween20 solution containing 3% gelatin.
Incubated at 40 ° C for 40 minutes, and then diluted with the antibody of the present invention 1000 times with TBS + Tween20 solution containing 1% gelatin,
The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, was washed 4 times with TBS + Tween20 solution, TBS + Tween20 solution containing 3% gelatin, 37 ° C., for 20 minutes, then at TBS + Tween20 solution containing 1% gelatin was diluted 2500-fold 1
25 I-labeled Protein A (manufactured by Amersham), 37 ° C,
Allowed to react for 1 hour. After the reaction, the plate was washed 4 times with TBS + Tween20, dried in air, exposed for 15 hours on an imaging plate manufactured by Fuji Film Co., and detected by BAS2000 system manufactured by Fuji Film Co., Ltd. The antibody of the present invention specifically reacted with only 2B6 of the above 10 human-derived cytochrome P450s (see Table 1 and FIG. 2).

【００２７】比較例１ 比較例抗体を用いたイムノブロ
ット法によるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の分
析 市販品であるラット由来のチトクロムＰ４５０分子種を
認識する抗体（比較例抗体）を用いた場合は、上記の試
験例１と同様な方法に準じて行った。上記のようにして
得られたニトロセルロース膜を、4%ブロックエース（雪
印乳業社製）溶液中で、室温、1 時間インキュベート
し、その後、0.4%ブロックエース溶液で500 倍希釈した
ラット由来のチトクロムＰ４５０を認識する抗体それぞ
れと、室温、1 時間反応させた。反応後、0.1% Tween2
0、0.4%ブロックエース溶液で3 回洗浄後、0.4%ブロッ
クエース溶液で5000倍希釈したアルカリフォスファター
ゼ標識抗ヤギIgG ウサギ血清と、室温、1 時間反応させ
た。反応後、0.1% Tween20、0.4% ブロックエース溶液
で3 回洗浄、さらにAP溶液（10mM Tris-HCl(pH9.6)、0.
1M NaCl 、5mM MgCl2 ）で1 回洗浄し、その後同溶液に
NBT （シグマ社製）、BCIP（シグマ社製）を加えた基質
溶液中に入れて発色させた。ラット由来のチトクロムＰ
４５０分子種をを認識する抗体それぞれとの反応交差性
を表１を示す。ラット由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ１
を認識する抗体は、10種のヒト由来のチトクロムＰ４５
０のうち、２Ａ６、２Ｃ８の２分子種と強く反応し、２
Ｂ６、２Ｃ９、２Ｄ６の３分子種とも反応した。ラット
由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ６を認識する抗体は、２
Ｃ８、２Ｃ９の２分子種と強く反応し、２Ａ６、２Ｃ１
８、２Ｅ１の３分子種とも反応した。ラット由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ１１を認識する抗体は、２Ａ６、２
Ｃ８、２Ｃ９の３分子種と反応した。ラット由来のチト
クロムＰ４５０２Ｃ１３を認識する抗体は、２Ｃ８、２
Ｃ９の２分子種と強く反応し、２Ａ６、２Ｃ１８、２Ｅ
１の３分子種とも反応した。ラット由来のチトクロムＰ
４５０２Ｅ１を認識する抗体は、２Ｅ１と強く反応し、
２Ａ６とも反応した。ラット由来のチトクロムＰ４５０
３Ａ２を認識する抗体は、３Ａ４と強く反応した。以
上、異なる動物種由来のチトクロムＰ４５０分子種を認
識する抗体では、特定のヒト由来のチトクロムＰ４５０
分子種のみと特異的に反応しなかった。Comparative Example 1 Analysis of Human-derived Cytochrome P450 Molecular Species by Immunoblotting Using Comparative Example Antibodies When a commercially available rat antibody recognizing cytochrome P450 molecular species (comparative example antibody) is used, The same procedure as in Test Example 1 above was performed. The nitrocellulose membrane obtained as described above was incubated in a 4% Block Ace (Yukirushi Dairy Co., Ltd.) solution at room temperature for 1 hour, and then diluted 500-fold with a 0.4% Block Ace solution to give rat-derived cytochromes. Each antibody that recognizes P450 was reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, 0.1% Tween2
After washing three times with 0, 0.4% Block Ace solution, the mixture was reacted with alkaline phosphatase-labeled anti-goat IgG rabbit serum diluted 5000-fold with 0.4% Block Ace solution at room temperature for 1 hour. After the reaction, wash 3 times with 0.1% Tween20, 0.4% block ace solution, and then add AP solution (10 mM Tris-HCl (pH 9.6), 0.
Wash once with 1M NaCl, 5mM MgCl2) and then add to the same solution.
NBT (manufactured by Sigma) and BCIP (manufactured by Sigma) were added to a substrate solution for color development. Rat-derived cytochrome P
Table 1 shows the reaction cross-reactivity with each of the antibodies that recognize 450 molecular species. Rat-derived cytochrome P450 2B1
Antibodies that recognize human are 10 types of human-derived cytochrome P45.
Reacts strongly with 2 molecular species of 2A6 and 2C8 among 0
It also reacted with 3 molecular species of B6, 2C9, and 2D6. Antibodies that recognize rat-derived cytochrome P450 2C6 are 2
Reacts strongly with two molecular species of C8 and 2C9, 2A6 and 2C1
It also reacted with 3 molecular species of 8 and 2E1. Antibodies that recognize rat-derived cytochrome P450 2C11 are 2A6, 2
Reacted with 3 molecular species of C8 and 2C9. Antibodies that recognize rat-derived cytochrome P450 2C13 are 2C8, 2
Reacts strongly with 2 molecular species of C9, 2A6, 2C18, 2E
It also reacted with the three molecular species of 1. Rat-derived cytochrome P
The antibody that recognizes 4502E1 reacts strongly with 2E1,
It also reacted with 2A6. Rat-derived cytochrome P450
The antibody that recognizes 3A2 reacted strongly with 3A4. As described above, in the antibodies that recognize cytochrome P450 molecular species derived from different animal species, specific human-derived cytochrome P450
It did not react specifically with only the molecular species.

【００２８】[0028]

【表１】 １）＋＋＋を１００％とした時、＋＋は２５％程度、＋は５％程度、無印は１％ 程度未満の反応を示すことを表す。 ２）N.D は未試験。[Table 1] 1) When ++ is defined as 100%, ++ indicates a reaction of about 25%, + indicates a reaction of about 5%, and no mark indicates a reaction of less than about 1%. 2) ND has not been tested.

【００２９】試験例２ 間接競合阻害法によるヒト由来
のチトクロムＰ４５０２Ｂ６の分析 ポリスチレン製の９６穴ミクロタイタープレートに、製
造例６によって得られたヒト由来のチトクロムＰ４５０
２Ｂ６を１０μｇ／mlの濃度で含むコーティング液（塩
化ナトリウムを１４０mg／ｌの濃度で含む１０mMのリン
酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)）
を 0.1ml／ウェルの割合で添加した後、４℃で一晩イン
キュベートした。そしてコーティング液を除去した後、
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６によってコーティ
ングされたミクロタイタープレートを１０mMのリン酸緩
衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)中に浸
すことにより３回洗浄し、該ミクロタイタープレートの
上面を下にしてペーパータオル上で軽く打ちつけること
によりプレート内の水分を除去した。次に、該ミクロタ
イタープレートにブロッキング液（ブロックエース、雪
印乳業社製）を 0.1ml／ウェルの割合で添加した後、室
温で４時間インキュベートした。そして再びミクロタイ
タープレートを0.05％(w/v) の Tween20を含む１０mMの
リン酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.
4)を用いて３回洗浄した。次に、製造例７によって得ら
れた抗体（第１抗体）をブロッキング液で１０ないし１
０8 倍希釈し、上記のミクロタイタープレートに 0.1ml
／ウェルの割合で添加した後、室温で１時間インキュベ
ートした。そして第１抗体調製液を除去した後、0.05％
(w/v) の Tween20を含む１０mMのリン酸緩衝液（ＮａＨ
2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 、pH7.4)を用いて３回洗浄し
た。次に、市販のアルカリフォスファターゼを結合した
抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン
（ＩｇＧ）（生化学工業社製）を、 0.5mg／mlの濃度で
ブロッキング液で４０００倍に希釈した第２抗体調製液
を上記のミクロタイタープレートに、 0.1ml／ウェルの
割合で添加した後、室温で１時間インキュベートした。
そして第２抗体調製液を除去した後、0.05％(w/v) の T
ween２０を含む１０mMのリン酸緩衝液（ＮａＨ2 ＰＯ4
−Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ7.4)を用いて３回洗浄し、該ミ
クロタイタープレートの上面を下にしてペーパータオル
上で軽く打ちつけることによりプレート内の水分を除去
した。次に、アルカリホスファＢ−テストワコーキット
（和光純薬社製）を用いて、該試薬（p-ニトロフェニルリン 酸二
ナトリウム ）および0.1 Ｍの炭酸塩緩衝液（pH9.8 ）を上記
のミクロタイタープレートに各々、 0.1ml／ウェルの割
合で添加した後、該ミクロタイタープレートを室温で３
０分間インキュベートした。そして0.2 Ｎの水酸化ナト
リウム溶液0.1ml を加えることにより、酵素反応を停止
し、ミクロタイタープレート内の発色をマルチスキャニ
ングスペクトロフォトメーター（大日本製薬社製）を用
いて、４０５nmでの吸光度を測定した。その結果、図３
に示す曲線が得られた。Test Example 2 Analysis of Human-derived Cytochrome P450 2B6 by Indirect Competitive Inhibition Method Human-derived cytochrome P450 obtained in Production Example 6 was placed on a polystyrene 96-well microtiter plate.
Coating solution containing 2B6 at a concentration of 10 μg / ml (10 mM phosphate buffer solution containing sodium chloride at a concentration of 140 mg / l (NaH2 PO4 -Na2 HPO4, pH 7.4))
Was added at a rate of 0.1 ml / well and then incubated at 4 ° C. overnight. And after removing the coating liquid,
Microtiter plates coated with human-derived cytochrome P450 2B6 were washed 3 times by immersing them in 10 mM phosphate buffer (NaH2 PO4 -Na2 HPO4, pH 7.4), with the top side of the microtiter plate facing down. Moisture in the plate was removed by tapping gently on a paper towel. Next, a blocking solution (Block Ace, manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) was added to the microtiter plate at a rate of 0.1 ml / well, followed by incubation at room temperature for 4 hours. Then, the microtiter plate was again placed on a 10 mM phosphate buffer solution (NaH2 PO4 -Na2 HPO4, pH 7.) containing 0.05% (w / v) Tween20.
It wash | cleaned 3 times using 4). Next, the antibody (first antibody) obtained in Production Example 7 was treated with a blocking solution at 10 to 1
0 8-fold diluted, 0.1 ml in microtiter plates the
/ Well, and then incubated at room temperature for 1 hour. After removing the first antibody preparation, 0.05%
(w / v) Tween20 10 mM phosphate buffer (NaH
It was washed 3 times with 2 PO4 -Na2 HPO4, pH 7.4). Next, a second antibody obtained by diluting commercially available alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin (IgG) goat immunoglobulin (IgG) (manufactured by Seikagaku Corporation) with blocking solution at a concentration of 4000 times. The prepared solution was added to the above microtiter plate at a rate of 0.1 ml / well, and then incubated at room temperature for 1 hour.
After removing the second antibody preparation, 0.05% (w / v) T
10 mM phosphate buffer containing ween 20 (NaH2 PO4
-Washed 3 times with Na2 HPO4, pH 7.4) and tapped on paper towel with the top side of the microtiter plate facing down to remove water in the plate. Next, using an alkaline phospha B-test Wako kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the reagent (p-nitrophenyl phosphate disodium salt) and 0.1 M carbonate buffer solution (pH 9.8) were added as described above. After adding 0.1 ml / well to each microtiter plate, the microtiter plate was incubated at room temperature for 3 times.
Incubated for 0 minutes. Then, the enzymatic reaction was stopped by adding 0.1 ml of 0.2 N sodium hydroxide solution, and the color development in the microtiter plate was measured by measuring the absorbance at 405 nm using a multi-scanning spectrophotometer (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). did. As a result, FIG.
The curve shown in was obtained.

【００３０】[0030]

【発明の効果】本発明は、ヒト由来のチトクロムＰ４５
０分子種を認識しかつ目的とする特定なチトクロムＰ４
５０分子種のみを特異的に認識する抗体を提供する。そ
して本発明抗体を用いることによって生体内のチトクロ
ムＰ４５０分子種を正確にしかも簡便に定量することが
可能となった。The present invention is directed to human-derived cytochrome P45.
Specific cytochrome P4 that recognizes 0 molecular species and is the target
An antibody that specifically recognizes only 50 molecular species is provided. The use of the antibody of the present invention has made it possible to accurately and easily quantify cytochrome P450 molecular species in vivo.

【配列表】[Sequence list]

【００３１】配列番号：１ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：1本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 CCTCTAGAAAATGGAACTCAGCGTCCTCCT 30SEQ ID NO: 1 Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear sequence 1 CCTCTAGAAAATGGAACTCAGCGTCCTCCT 30

【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：1本鎖 トポロジー：直線状 配列 1 GGGGATCCTGAATGACCCTGGAATCCTTTG 30SEQ ID NO: 2 Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear sequence 1 GGGGATCCTGAATGACCCTGGAATCCTTTG 30

【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：１４７６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 1 ATG GAA CTC AGC GTC CTC CTC TTC CTT GCA CTC CTC ACA GGA CTC 45 1 Met Glu Leu Ser Val Leu Leu Phe Leu Ala Leu Leu Thr Gly Leu 15 46 TTG CTA CTC CTG GTT CAG CGC CAC CCT AAC ACC CAT GAC CGC CTC 90 16 Leu Leu Leu Leu Val Gln Arg His Pro Asn Thr His Asp Arg Leu 30 91 CCA CCA GGG CCC CGC CCT CTG CCC CTT TTG GGA AAC CTT CTG CAG 135 31 Pro Pro Gly Pro Arg Pro Leu Pro Leu Leu Gly Asn Leu Leu Gln 45 136 ATG GAT AGA AGA GGC CTA CTC AAA TCC TTT CTG AGG TTC CGA GAG 180 46 Met Asp Arg Arg Gly Leu Leu Lys Ser Phe Leu Arg Phe Arg Glu 60 181 AAA TAT GGG GAC GTC TTC ACG GTA CAC CTG GGA CCG AGG CCC GTG 225 61 Lys Tyr Gly Asp Val Phe Thr Val His Leu Gly Pro Arg Pro Val 75 226 GTC ATG CTG TGT GGA GTA GAG GCC ATA CGG GAG GCC CTT GTG GAC 270 76 Val Met Leu Cys Gly Val Glu Ala Ile Arg Glu Ala Leu Val Asp 90 271 AAG GCT GAG GCC TTC TCT GGC CGG GGA AAA ATC GCC ATG GTC GAC 315 91 Lys Ala Glu Ala Phe Ser Gly Arg Gly Lys Ile Ala Met Val Asp 105 316 CCA TTC TTC CGG GGA TAT GGT GTG ATC TTT GCC AAT GGA AAC CGC 360 106 Pro Phe Phe Arg Gly Tyr Gly Val Ile Phe Ala Asn Gly Asn Arg 120 361 TGG AAG GTG CTT CGG CGA TTC TCT GTG ACC ACT ATG AGG GAC TTC 405 121 Trp Lys Val Leu Arg Arg Phe Ser Val Thr Thr Met Arg Asp Phe 135 406 GGG ATG GGA AAG CGG AGT GTG GAG GAG CGG ATT CAG GAG GAG GCT 450 136 Gly Met Gly Lys Arg Ser Val Glu Glu Arg Ile Gln Glu Glu Ala 150 451 CAG TGT CTG ATA GAG GAG CTT CGG AAA TCC AAG GGG GCC CTC ATG 495 151 Gln Cys Leu Ile Glu Glu Leu Arg Lys Ser Lys Gly Ala Leu Met 165 496 GAC CCC ACC TTC CTC TTC CAG TCC ATT ACC GCC AAC ATC ATC TGC 540 166 Asp Pro Thr Phe Leu Phe Gln Ser Ile Thr Ala Asn Ile Ile Cys 180 541 TCC ATC GTC TTT GGA AAA CGA TTC CAC TAC CAA GAT CAA GAG TTC 585 181 Ser Ile Val Phe Gly Lys Arg Phe His Tyr Gln Asp Gln Glu Phe 195 586 CTG AAG ATG CTG AAC TTG TTC TAC CAG ACT TTT TCA CTC ATC AGC 630 196 Leu Lys Met Leu Asn Leu Phe Tyr Gln Thr Phe Ser Leu Ile Ser 210 631 TCT GTA TTC GGC CAG CTG TTT GAG CTC TTC TCT GGC TTC TTG AAA 675 211 Ser Val Phe Gly Gln Leu Phe Glu Leu Phe Ser Gly Phe Leu Lys 225 676 TAC TTT CCT GGG GCA CAC AGG CAA GTT TAC AAA AAC CTG CAG GAA 720 226 Tyr Phe Pro Gly Ala His Arg Gln Val Tyr Lys Asn Leu Gln Glu 240 721 ATC AAT GCT TAC ATT GGC CAC AGT GTG GAG AAG CAC CGT GAA ACC 765 241 Ile Asn Ala Tyr Ile Gly His Ser Val Glu Lys His Arg Glu Thr 255 766 CTG GAC CCC AGC GCC CCC AAG GAC CTC ATC GAC ACC TAC CTG CTC 810 256 Leu Asp Pro Ser Ala Pro Lys Asp Leu Ile Asp Thr Tyr Leu Leu 270 811 CAC ATG GAA AAA GAG AAA TCC AAC GCA CAC AGT GAA TTC AGC CAC 855 271 His Met Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ala His Ser Glu Phe Ser His 285 856 CAG AAC CTC AAC CTC AAC ACG CTC TCG CTC TTC TTT GCT GGC ACT 900 286 Gln Asn Leu Asn Leu Asn Thr Leu Ser Leu Phe Phe Ala Gly Thr 300 901 GAG ACC ACC AGC ACC ACT CTC CGC TAC GGC TTC CTG CTC ATG CTC 945 301 Glu Thr Thr Ser Thr Thr Leu Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Met Leu 315 946 AAA TAC CCT CAT GTT GCA GAG AGA GTC TAC AGG GAG ATT GAA CAG 990 316 Lys Tyr Pro His Val Ala Glu Arg Val Tyr Arg Glu Ile Glu Gln 330 991 GTG ATT GGC CCA CAT CGC CCT CCA GAG CTT CAT GAC CGA GCC AAA 1035 331 Val Ile Gly Pro His Arg Pro Pro Glu Leu His Asp Arg Ala Lys 345 1036 ATG CCA TAC ACA GAG GCA GTC ATC TAT GAG ATT CAG AGA TTT TCC 1080 346 Met Pro Tyr Thr Glu Ala Val Ile Tyr Glu Ile Gln Arg Phe Ser 360 1081 GAC CTT CTC CCC ATG GGT GTG CCC CAC ATT GTC ACC CAA CAC ACC 1125 361 Asp Leu Leu Pro Met Gly Val Pro His Ile Val Thr Gln His Thr 375 1126 AGC TTC CGA GGG TAC ATC ATC CCC AAG GAC ACA GAA GTA TTT CTC 1170 376 Ser Phe Arg Gly Tyr Ile Ile Pro Lys Asp Thr Glu Val Phe Leu 390 1171 ATC CTG AGC ACT GCT CTC CAT GAC CCA CAC TAC TTT GAA AAA CCA 1215 391 Ile Leu Ser Thr Ala Leu His Asp Pro His Tyr Phe Glu Lys Pro 405 1216 GAC GCC TTC AAT CCT GAC CAC TTT CTG GAT GCC AAT GGG GCA CTG 1260 406 Asp Ala Phe Asn Pro Asp His Phe Leu Asp Ala Asn Gly Ala Leu 420 1261 AAA AAG ACT GAA GCT TTT ATC CCC TTC TCC TTA GGG AAG CGG ATT 1305 421 Lys Lys Thr Glu Ala Phe Ile Pro Phe Ser Leu Gly Lys Arg Ile 435 1306 TGT CTT GGT GAA GGC ATC GCC CGT GCG GAA TTG TTC CTC TTC TTC 1350 436 Cys Leu Gly Glu Gly Ile Ala Arg Ala Glu Leu Phe Leu Phe Phe 450 1351 ACC ACC ATC CTC CAG AAC TTC TCC ATG GCC AGC CCC GTG GCC CCA 1395 451 Thr Thr Ile Leu Gln Asn Phe Ser Met Ala Ser Pro Val Ala Pro 465 1396 GAA GAC ATC GAT CTG ACA CCC CAG GAG TGT GGT GTG GGC AAA ATA 1440 466 Glu Asp Ile Asp Leu Thr Pro Gln Glu Cys Gly Val Gly Lys Ile 480 1441 CCC CCA ACA TAC CAG ATC CGC TTC CTG CCC CGC TGA 1476 481 Pro Pro Thr Tyr Gln Ile Arg Phe Leu Pro Arg *** 492SEQ ID NO: 3 Sequence length: 1476 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear sequence 1 ATG GAA CTC AGC GTC CTC CTC TTC CTT GCA CTC CTC ACA GGA CTC 45 1 Met Glu Leu Ser Val Leu Leu Phe Leu Ala Leu Leu Thr Gly Leu 15 46 TTG CTA CTC CTG GTT CAG CGC CAC CCT AAC ACC CAT GAC CGC CTC 90 16 Leu Leu Leu Leu Val Gln Arg His Pro Asn Thr His Asp Arg Leu 30 91 CCA CCA GGG CCC CGC CCT CTG CCC CTT TTG GGA AAC CTT CTG CAG 135 31 Pro Pro Gly Pro Arg Pro Leu Pro Leu Leu Gly Asn Leu Leu Gln 45 136 ATG GAT AGA AGA GGC CTA CTC AAA TCC TTT CTG AGG TTC CGA GAG 180 46 Met Asp Arg Arg Gly Leu Leu Lys Ser Phe Leu Arg Phe Arg Glu 60 181 AAA TAT GGG GAC GTC TTC ACG GTA CAC CTG GGA CCG AGG CCC GTG 225 61 Lys Tyr Gly Asp Val Phe Thr Val His Leu Gly Pro Arg Pro Val 75 226 GTC ATG CTG TGT GGA GTA GAG GCC ATA CGG GAG GCC CTT GTG GAC 270 76 Val Met Leu Cys Gly Val Glu Ala Ile Arg Glu Ala Leu Val Asp 90 271 AAG GCT GAG GCC TTC TCT GGC CGG GGA AAA ATC GCC ATG GTC GAC 315 91 Lys Ala Glu Ala Phe Ser Gly Arg Gly Lys Ile Ala Met Val Asp 105 316 CCA TTC TTC CGG GGA TAT GGT GTG ATC TTT GCC AAT GGA AAC CGC 360 106 Pro Phe Phe Arg Gly Tyr Gly Val Ile Phe Ala Asn Gly Asn Arg 120 361 TGG AAG GTG CTT CGG CGA TTC TCT GTG ACC ACT ATG AGG GAC TTC 405 121 Trp Lys Val Leu Arg Arg Phe Ser Val Thr Thr Met Arg Asp Phe 135 406 GGG ATG GGA AAG CGG AGT GTG GAG GAG CGG ATT CAG GAG GAG GCT 450 136 Gly Met Gly Lys Arg Ser Val Glu Glu Arg Ile Gln Glu Glu Ala 150 451 CAG TGT CTG ATA GAG GAG CTT CGG AAA TCC AAG GGG GCC CTC ATG 495 151 Gln Cys Leu Ile Glu Glu Leu Arg Lys Ser Lys Gly Ala Leu Met 165 496 GAC CCC ACC TTC CTC TTC CAG TCC ATT ACC ACC GCC AAC ATC ATC TGC 540 166 Asp Pro Thr Phe Leu Phe Gln Ser Ile Thr Ala Asn Ile Ile Cys 180 541 TCC ATC GTC TTT GGA AAA CGA TTC CAC TAC CAA GAT CAA GAG TTC 585 181 Ser Ile Val Phe Gly Lys Arg Phe His Tyr Gln Asp Gln Glu Phe 195 586 CTG AAG ATG CTG AAC TTG TTC TAC CAG ACT TTT TCA CTC ATC AGC 630 196 Leu Lys Met Leu Asn Leu Phe Tyr G ln Thr Phe Ser Leu Ile Ser 210 631 TCT GTA TTC GGC CAG CTG TTT GAG CTC TTC TCT GGC TTC TTG AAA 675 211 Ser Val Phe Gly Gln Leu Phe Glu Leu Phe Ser Gly Phe Leu Lys 225 676 TAC TTT CCT GGG GCA CAC AGG CAA GTT TAC AAA AAC CTG CAG GAA 720 226 Tyr Phe Pro Gly Ala His Arg Gln Val Tyr Lys Asn Leu Gln Glu 240 721 ATC AAT GCT TAC ATT GGC CAC AGT GTG GAG AAG CAC CGT GAA ACC 765 241 Ile Asn Ala Tyr Ile Gly His Ser Val Glu Lys His Arg Glu Thr 255 766 CTG GAC CCC AGC GCC CCC AAG GAC CTC ATC GAC ACC TAC CTG CTC 810 256 Leu Asp Pro Ser Ala Pro Lys Asp Leu Ile Asp Thr Tyr Leu Leu 270 811 CAC ATG GAA AAA GAG AAA TCC AAC GCA CAC AGT GAA TTC AGC CAC 855 271 His Met Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ala His Ser Glu Phe Ser His 285 856 CAG AAC CTC AAC CTC AAC ACG CTC TCG CTC TTC TTT GCT GGC ACT 900 286 Gln Asn Leu Asn Leu Asn Thr Leu Ser Leu Phe Phe Ala Gly Thr 300 901 GAG ACC ACC AGC ACC ACT CTC CGC TAC GGC TTC CTG CTC ATG CTC 945 301 Glu Thr Thr Ser Thr Thr Leu Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Met Leu 315 946 AAA TAC CCT C AT GTT GCA GAG AGA GTC TAC AGG GAG ATT GAA CAG 990 316 Lys Tyr Pro His Val Ala Glu Arg Val Tyr Arg Glu Ile Glu Gln 330 991 GTG ATT GGC CCA CAT CGC CCT CCA GAG CTT CAT GAC CGA GCC AAA 1035 331 Val Ile Gly Pro His Arg Pro Pro Glu Leu His Asp Arg Ala Lys 345 1036 ATG CCA TAC ACA GAG GCA GTC ATC TAT GAG ATT CAG AGA TTT TCC 1080 346 Met Pro Tyr Thr Glu Ala Val Ile Tyr Glu Ile Gln Arg Phe Ser 360 1081 GAC CTT CTC CCC ATG GGT GTG CCC CAC ATT GTC ACC CAA CAC ACC 1125 361 Asp Leu Leu Pro Met Gly Val Pro His Ile Val Thr Gln His Thr 375 1126 AGC TTC CGA GGG TAC ATC ATC CCC AAG GAC ACA GAA GTA TTT CTC 1170 376 Ser Phe Arg Gly Tyr Ile Ile Pro Lys Asp Thr Glu Val Phe Leu 390 1171 ATC CTG AGC ACT GCT CTC CAT GAC CCA CAC TAC TTT GAA AAA CCA 1215 391 Ile Leu Ser Thr Ala Leu His Asp Pro His Tyr Phe Glu Lys Pro 405 1216 GAC GCC TTC AAT CCT GAC CAC TTT CTG GAT GCC AAT GGG GCA CTG 1260 406 Asp Ala Phe Asn Pro Asp His Phe Leu Asp Ala Asn Gly Ala Leu 420 1261 AAA AAG ACT GAA GCT TTT ATC CCC TTC TCC TTA GGG A AG CGG ATT 1305 421 Lys Lys Thr Glu Ala Phe Ile Pro Phe Ser Leu Gly Lys Arg Ile 435 1306 TGT CTT GGT GAA GGC ATC GCC CGT GCG GAA TTG TTC CTC TTC TTC 1350 436 Cys Leu Gly Glu Gly Ile Ala Arg Ala Glu Leu Phe Leu Phe Phe 450 1351 ACC ACC ATC CTC CAG AAC TTC TCC ATG GCC AGC CCC GTG GCC CCA 1395 451 Thr Thr Ile Leu Gln Asn Phe Ser Met Ala Ser Pro Val Ala Pro 465 1396 GAA GAC ATC GAT CTG ACA CCC CAG GAG TGT GGT GTG GGC AAA ATA 1440 466 Glu Asp Ile Asp Leu Thr Pro Gln Glu Cys Gly Val Gly Lys Ile 480 1441 CCC CCA ACA TAC CAG ATC CGC TTC CTG CCC CGC TGA 1476 481 Pro Pro Thr Tyr Gln Ile Arg Phe Leu Pro Arg * ** 492

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６遺伝子を
含む酵母発現プラスミド（ｐ２Ｂ６）の構築方法を示す
図である。FIG. 1 is a diagram showing a method for constructing a yeast expression plasmid (p2B6) containing a human-derived cytochrome P450 2B6 gene.

【図２】本発明抗体のヒト由来のチトクロムＰ４５０分
子種に対する交差反応性を示す図である。矢印がヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６との反応を示すバンドで
ある。なお、他のバンドは電気泳動のための試料作製
（ＳＤＳ処理）時に生じるヒト由来のチトクロムＰ４５
０２Ｂ６の分解物との反応を示すバンドである。FIG. 2 shows the cross-reactivity of the antibody of the present invention with human-derived cytochrome P450 molecular species. The arrow indicates a band showing a reaction with human-derived cytochrome P450 2B6. The other bands are human-derived cytochrome P45 generated during sample preparation (SDS treatment) for electrophoresis.
It is a band showing a reaction with a decomposition product of 02B6.

【図３】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を認識す
る本発明抗体の抗体価を示す図である。図から、ヒト由
来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を発現する形質転換体で
ある酵母から抽出および精製されたヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０２Ｂ６を抗原として免疫感作化した哺乳動物
から血液を採取し、該血液から分離・精製して得られる
血清の希釈率が１０- 4 においてもヒト由来のチトクロ
ムＰ４５０分子種を認識する能力を充分に有することが
明らかであり、本発明抗体が高い抗体価であることがわ
かる。FIG. 3 is a graph showing the antibody titer of the antibody of the present invention that recognizes human-derived cytochrome P450 2B6. From the figure, blood was collected from a mammal immunized with human-derived cytochrome P450 2B6 as an antigen, which was extracted and purified from yeast, which is a transformant expressing human-derived cytochrome P450 2B6, and separated and purified from the blood. serum dilutions obtained by 10 - even 4 is found to have sufficient ability to recognize the cytochrome P450 molecular species of human origin, it is understood that the present invention the antibody is a high titer.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 林 浩司 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 藪崎 義康 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Reference number within the agency FI Technical display location G01N 33/53 D (C12N 1/19 C12R 1: 865) (72) Inventor Koji Hayashi Takarazuka, Hyogo Prefecture 4-2-1 Takashi Ichi, Sumitomo Kagaku Kogyo Co., Ltd. (72) Inventor Yoshiyasu Yabuzaki 4-2-1 Takashi, Takarazuka-shi, Hyogo Sumitomo Kagaku Kogyo Co., Ltd.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を発
現する形質転換体である酵母から抽出および精製された
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を抗原として免疫
感作化した哺乳動物から血液を採取し、該血液から分離
・精製して得られうる、他のヒト由来のチトクロムＰ４
５０分子種に対して交差反応性を実質的に示さないこと
を特徴とするヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を認
識する抗体。1. Blood is collected from a mammal immunized with human-derived cytochrome P450 2B6 as an antigen and extracted and purified from yeast, which is a transformant expressing human-derived cytochrome P450 2B6, and separated from the blood. -Other human-derived cytochrome P4 that can be obtained by purification
An antibody recognizing human-derived cytochrome P450 2B6, which has substantially no cross-reactivity with 50 molecular species. 【請求項２】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を発
現する形質転換体である酵母から抽出および精製された
ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｂ６を抗原として免疫
感作化した哺乳動物から血液を採取し、該血液から分離
・精製して得られる血清の希釈率が１０- 4 においても
ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を認識する能力を
有することを特徴とする請求項１記載のヒト由来のチト
クロムＰ４５０２Ｂ６を認識する抗体。2. Blood is collected from a mammal immunized with human-derived cytochrome P450 2B6 extracted and purified from yeast, which is a transformant expressing human-derived cytochrome P450 2B6, and separated from the blood. and purified by dilution of the resulting serum is 10 - 4 according to claim 1, wherein the human-derived antibodies recognizing cytochrome P4502B6 of also characterized by having the ability to recognize the cytochrome P450 molecular species derived from humans in.
JP6161548A 1994-07-13 1994-07-13 Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man Pending JPH0827193A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6161548A JPH0827193A (en) 1994-07-13 1994-07-13 Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6161548A JPH0827193A (en) 1994-07-13 1994-07-13 Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0827193A true JPH0827193A (en) 1996-01-30

Family

ID=15737207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6161548A Pending JPH0827193A (en) 1994-07-13 1994-07-13 Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH0827193A (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985542A (en) * 1996-05-20 1999-11-16 Sumitomo Chemical Company, Limited Diagnostic kit
WO2001092538A1 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Method of detecting and quantifying human p450 molecular species and probe and kit for this method

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985542A (en) * 1996-05-20 1999-11-16 Sumitomo Chemical Company, Limited Diagnostic kit
WO2001092538A1 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Method of detecting and quantifying human p450 molecular species and probe and kit for this method

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1190873A (en) Recombinant monoclonal antibodies
US7241608B2 (en) Cat kidney disease marker
KR100756117B1 (en) Monoclonal antibody, hybridoma, i?unoassay method and diagnosis kit
JP3837711B2 (en) Early detection method for lysosomal storage diseases
US20050277157A1 (en) Organ transplant rejection and associated conditions
KR19990067153A (en) Monoclonal Antibodies Specific to Prostaglandin Di Synthase
CA2088354C (en) Pancreas-elastasis-1-specific antibody, a process for obtaining it and a test kit containing such antibodies
Cooper et al. Colocalization of discoidin-binding ligands with discoidin in developing Dictyostelium discoideum
JPH0827197A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502a4 originated from man
JP3403406B2 (en) Peptides of casein macropeptide, antibodies and uses of these peptides
AU2006213411A1 (en) Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay
JPH0827194A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502e1 originated from man
JP2005533086A5 (en)
JPH0827193A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502b6 originated from man
JPH0827198A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502c8 originated from man
JPH0827196A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502c9 originated from man
JP3978226B2 (en) Immunoassay to identify alcoholics and monitor alcohol consumption
JPH0827195A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502a6 originated from man
JPH0827199A (en) Antibody recognizing cytochrome p4502d6 originated from man
US5622837A (en) Pancreas elastase 1-specific antibody, a process for obtaining it, and a test kit containing such antibody
JPH08143599A (en) Antibody capable of recognizing human-derived cytochrome p4501a1
JPH10226700A (en) Immunoassay for detecting mia
US5985542A (en) Diagnostic kit
JP3345507B2 (en) Method for measuring asialoglycoprotein receptor and measuring reagent used therefor
JPH08143600A (en) Antibody capable of recognizing human-derived cytochrome p4501a2