JPH08266288A - ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの産生方法 - Google Patents
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの産生方法Info
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- JPH08266288A JPH08266288A JP7296322A JP29632295A JPH08266288A JP H08266288 A JPH08266288 A JP H08266288A JP 7296322 A JP7296322 A JP 7296322A JP 29632295 A JP29632295 A JP 29632295A JP H08266288 A JPH08266288 A JP H08266288A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラ
ーゼの産生。 【解決手段】 （１）Ｓｐｈｅｒｏｔｉｌｕｓ種に由来
の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を制限遺伝子を発現さ
せる宿主に導入し、（２）ＳｓｐＩ制限エンドヌクレア
ーゼをコードし発現するベクターを含む宿主を発酵さ
せ、（３）ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコー
ドし発現するベクターを含む発酵宿主からＳｓｐＩ制限
エンドヌクレアーゼを精製する段階から成るＳｓｐＩ制
限エンドヌクレアーゼのクローニング及び産生方法。
ーゼの産生。 【解決手段】 （１）Ｓｐｈｅｒｏｔｉｌｕｓ種に由来
の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を制限遺伝子を発現さ
せる宿主に導入し、（２）ＳｓｐＩ制限エンドヌクレア
ーゼをコードし発現するベクターを含む宿主を発酵さ
せ、（３）ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコー
ドし発現するベクターを含む発酵宿主からＳｓｐＩ制限
エンドヌクレアーゼを精製する段階から成るＳｓｐＩ制
限エンドヌクレアーゼのクローニング及び産生方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＳｓｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからこれらの酵素を産生
する方法に関する。
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換え
ＤＮＡ、並びに、組換えＤＮＡからこれらの酵素を産生
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に自
然に存在する酵素の１つのクラスである。このクラスの
酵素を他の夾雑細菌成分から分離して精製できれば、Ｄ
ＮＡ分子を正確なフラグメントに切断するために実験室
で制限エンドヌクレアーゼを使用することが可能であ
る。この酵素の特性は、ＤＮＡ分子を特異的に同定し、
夫々の成分遺伝子に分画し得ることである。制限エンド
ヌクレアーゼが現代遺伝学研究に不可欠なツールである
ことは証明済みである。これらは、遺伝子を操作及び分
析するための生化学的「鋏」の役割を果たし得る。
然に存在する酵素の１つのクラスである。このクラスの
酵素を他の夾雑細菌成分から分離して精製できれば、Ｄ
ＮＡ分子を正確なフラグメントに切断するために実験室
で制限エンドヌクレアーゼを使用することが可能であ
る。この酵素の特性は、ＤＮＡ分子を特異的に同定し、
夫々の成分遺伝子に分画し得ることである。制限エンド
ヌクレアーゼが現代遺伝学研究に不可欠なツールである
ことは証明済みである。これらは、遺伝子を操作及び分
析するための生化学的「鋏」の役割を果たし得る。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し該配列に結合することによって作用する。即ち、エン
ドヌクレアーゼは該配列に結合し、分子を該配列の内部
またはその一方側で開裂する。異なる制限エンドヌクレ
アーゼは異なる認識配列に親和性を有している。今日ま
での研究では数百種類の細菌種から百種類以上の異なる
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
沿った特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し該配列に結合することによって作用する。即ち、エン
ドヌクレアーゼは該配列に結合し、分子を該配列の内部
またはその一方側で開裂する。異なる制限エンドヌクレ
アーゼは異なる認識配列に親和性を有している。今日ま
での研究では数百種類の細菌種から百種類以上の異なる
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】細菌は通常、その種ごとに極めて少数の制
限エンドヌクレアーゼを有している。エンドヌクレアー
ゼはそれらが由来する細菌に従って命名されている。例
えば、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種（ＡＴＣＣ１３９２
５）はＳｓｐＩと呼ばれる制限エンドヌクレアーゼを合
成する。この酵素は配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し開裂す
る。
限エンドヌクレアーゼを有している。エンドヌクレアー
ゼはそれらが由来する細菌に従って命名されている。例
えば、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種（ＡＴＣＣ１３９２
５）はＳｓｐＩと呼ばれる制限エンドヌクレアーゼを合
成する。この酵素は配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し開裂す
る。
【０００５】理論に拘束されるつもりはないが、制限エ
ンドヌクレアーゼは本来は、細菌細胞の自己防御的役割
を果たすと考えられている。該酵素はウイルス及びプラ
スミドのような外来ＤＮＡ分子感染に対する耐性を細菌
に与える。このような耐性がなければ、外来ＤＮＡ分子
が細菌を破壊したり細菌に寄生したりするであろう。耐
性を与えるために該酵素は、認識配列が発生する度毎に
感染ＤＮＡ分子に結合し該分子を開裂する。その結果と
して分子が分解され、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮ
Ａはエキソヌクレアーゼによっていっそう分解され易く
なる。
ンドヌクレアーゼは本来は、細菌細胞の自己防御的役割
を果たすと考えられている。該酵素はウイルス及びプラ
スミドのような外来ＤＮＡ分子感染に対する耐性を細菌
に与える。このような耐性がなければ、外来ＤＮＡ分子
が細菌を破壊したり細菌に寄生したりするであろう。耐
性を与えるために該酵素は、認識配列が発生する度毎に
感染ＤＮＡ分子に結合し該分子を開裂する。その結果と
して分子が分解され、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮ
Ａはエキソヌクレアーゼによっていっそう分解され易く
なる。
【０００６】細菌防御系の第２の成分は修飾メチラーゼ
である。該酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であ
り、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し該ＤＮＡを感染外
来ＤＮＡから識別できるようにするための手段を提供す
る。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアー
ゼと同じヌクレオチド認識配列を認識してこれに結合す
るが、ＤＮＡを破壊するのでなく、配列内部の１つまた
は別のヌクレオチドをメチル基の付加によって化学的に
修飾する。メチル化された認識配列は制限エンドヌクレ
アーゼによる結合及び開裂の対象外となる。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼ活性によって常に完全に修
飾されており、従って内在する制限エンドヌクレアーゼ
に対して完全に不感受性である。制限エンドヌクレアー
ゼによる認識及び攻撃に感受性を示すのは、非修飾であ
り従って外来であると同定されるＤＮＡだけである。
である。該酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であ
り、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し該ＤＮＡを感染外
来ＤＮＡから識別できるようにするための手段を提供す
る。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアー
ゼと同じヌクレオチド認識配列を認識してこれに結合す
るが、ＤＮＡを破壊するのでなく、配列内部の１つまた
は別のヌクレオチドをメチル基の付加によって化学的に
修飾する。メチル化された認識配列は制限エンドヌクレ
アーゼによる結合及び開裂の対象外となる。細菌細胞の
ＤＮＡはその修飾メチラーゼ活性によって常に完全に修
飾されており、従って内在する制限エンドヌクレアーゼ
に対して完全に不感受性である。制限エンドヌクレアー
ゼによる認識及び攻撃に感受性を示すのは、非修飾であ
り従って外来であると同定されるＤＮＡだけである。
【０００７】遺伝子工学技術の出現に伴って現在では、
遺伝子のクローニングが可能であり、また、遺伝子がコ
ードしているタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得
られたよりも大量に産生することが可能である。制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための重
要な要件は、所望のクローンが１０−３〜１０−４とい
う低頻度で発生するときに、複合「ライブラリー」、即
ち「ショットガン」タイプのクローニング手順で得られ
たクローン集団の内部から、所望のクローンを同定し得
る簡単で確実な方法を開発することである。必要な少数
のクローンを生存させながら不要な多数のクローンを破
壊する選択的な方法が好ましい。
遺伝子のクローニングが可能であり、また、遺伝子がコ
ードしているタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得
られたよりも大量に産生することが可能である。制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための重
要な要件は、所望のクローンが１０−３〜１０−４とい
う低頻度で発生するときに、複合「ライブラリー」、即
ち「ショットガン」タイプのクローニング手順で得られ
たクローン集団の内部から、所望のクローンを同定し得
る簡単で確実な方法を開発することである。必要な少数
のクローンを生存させながら不要な多数のクローンを破
壊する選択的な方法が好ましい。
【０００８】タイプＩＩの制限修飾系は漸増頻度でクロ
ーニングされている。最初にクローニングされた系は、
制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する
手段としてバクテリオファージ感染を使用した（Ｈｈａ
ＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ３：９７−１１２，（１９
７８）；ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ １７８：７１７−７１９，（１９
８０）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５０３−１５
０７，（１９８１）。細菌中の制限−修飾系の存在は細
菌にバクテリオファージ感染に対する耐性を与えるの
で、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保有する細
胞は原則として、ファージに接触したライブラリーから
生存細胞として選択的に単離され得る。しかしながら、
この方法は高い評価を得ることはできなかった。特に、
クローニングされた制限−修飾遺伝子が選択的生存を維
持するに充分な耐性を必ずしも示さないことが知見され
た。
ーニングされている。最初にクローニングされた系は、
制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する
手段としてバクテリオファージ感染を使用した（Ｈｈａ
ＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ３：９７−１１２，（１９
７８）；ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ １７８：７１７−７１９，（１９
８０）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５０３−１５
０７，（１９８１）。細菌中の制限−修飾系の存在は細
菌にバクテリオファージ感染に対する耐性を与えるの
で、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保有する細
胞は原則として、ファージに接触したライブラリーから
生存細胞として選択的に単離され得る。しかしながら、
この方法は高い評価を得ることはできなかった。特に、
クローニングされた制限−修飾遺伝子が選択的生存を維
持するに充分な耐性を必ずしも示さないことが知見され
た。
【０００９】別のクローニング方法では、先ずプラスミ
ド由来（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として特徴付け
られる系を大腸菌クローニングプラスミドに移入する
（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７
６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ＆
Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔ
ｈｅｒｉａｕｌｔ ＆ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５
５−３５９，（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎ
ｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１
−５０９，（１９８５））。
ド由来（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として特徴付け
られる系を大腸菌クローニングプラスミドに移入する
（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７
６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ ＆
Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔ
ｈｅｒｉａｕｌｔ ＆ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５
５−３５９，（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎ
ｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１
−５０９，（１９８５））。
【００１０】より多数の系をクローニングするために使
用されている第３のクローニング方法では、活性メチラ
ーゼ遺伝子の選択を用いている（１９８６年９月３日公
開のＥＰＯ公開Ｎｏ，１９３，４１３及びＢｓｕＲＩ：
Ｋｉｓｓら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
３：６４０３−６４２１，（１９８５））。制限遺伝子
と修飾遺伝子とは緊密な連関を有しているので、しばし
ば１つの遺伝子だけを選択することによって双方の遺伝
子を含むクローンを単離し得る。しかしながらメチル化
活性に基づく選択によって完全な制限−修飾系が必ずし
も得られることはなく、ときどきはメチラーゼ遺伝子だ
けが得られる（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，
Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５，（１９８０）；Ｂｃ
ｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ ２０：１９
７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ ＆
Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ ２１：１１１−１１９，
（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４２，（１
９８３）。制限−修飾系のクローニングの概要に関して
は、例えばＬｕｎｎｅｎら，Ｇｅｎｅ ７４：２５−３
２（１９８８）及びＷｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｇｅｎ
ｅ，７４：２８１−２８５（１９８８）を参照するとよ
い。
用されている第３のクローニング方法では、活性メチラ
ーゼ遺伝子の選択を用いている（１９８６年９月３日公
開のＥＰＯ公開Ｎｏ，１９３，４１３及びＢｓｕＲＩ：
Ｋｉｓｓら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
３：６４０３−６４２１，（１９８５））。制限遺伝子
と修飾遺伝子とは緊密な連関を有しているので、しばし
ば１つの遺伝子だけを選択することによって双方の遺伝
子を含むクローンを単離し得る。しかしながらメチル化
活性に基づく選択によって完全な制限−修飾系が必ずし
も得られることはなく、ときどきはメチラーゼ遺伝子だ
けが得られる（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，
Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５，（１９８０）；Ｂｃ
ｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ ２０：１９
７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ ＆
Ｂａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ ２１：１１１−１１９，
（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４２，（１
９８３）。制限−修飾系のクローニングの概要に関して
は、例えばＬｕｎｎｅｎら，Ｇｅｎｅ ７４：２５−３
２（１９８８）及びＷｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｇｅｎ
ｅ，７４：２８１−２８５（１９８８）を参照するとよ
い。
【００１１】メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼの遺伝
子をクローニングするための別の方法は、ＤＮＡ損傷の
比色アッセイに基づく。メチラーゼをスクリーニングす
るためには、プラスミドライブラリーで宿主大腸菌ＡＰ
１−２００株を形質転換させる。メチラーゼの発現は、
ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋またはＭｒｒ＋である大腸菌
の菌株中でＳＯＳ応答反応を誘発する。ＡＰ１−２００
菌株はＭｃｒ系及びＭｒｒ系に対して温度感受性であ
り、大腸菌の損傷誘発性ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌ
ａｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレ
アーゼの遺伝子をコードしている組換えプラスミドは、
限定温度におけるｌａｃＺ遺伝子の誘発に基づいて検出
される。メチラーゼ遺伝子をコードしている形質転換体
は、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレート上で青色コロニ
ーとして検出される。（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１８３１−
１８３５，（１９９１）及びＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ
ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：１５０−
１５５（１９９１））。同様に、大腸菌ＥＲ１９９２株
は、ｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化依存
性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒが欠失してい
る。（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ”法と呼ばれる）この系に
おいては、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡに損傷
を与えるときにＳＯＳ応答を誘発する同系メチラーゼの
非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子が検出され得る。
ＳＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレ
ート上で深青色コロニーを形成する。（Ｘｕら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３９９−２４
０３（１９９４））。
子をクローニングするための別の方法は、ＤＮＡ損傷の
比色アッセイに基づく。メチラーゼをスクリーニングす
るためには、プラスミドライブラリーで宿主大腸菌ＡＰ
１−２００株を形質転換させる。メチラーゼの発現は、
ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋またはＭｒｒ＋である大腸菌
の菌株中でＳＯＳ応答反応を誘発する。ＡＰ１−２００
菌株はＭｃｒ系及びＭｒｒ系に対して温度感受性であ
り、大腸菌の損傷誘発性ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌ
ａｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレ
アーゼの遺伝子をコードしている組換えプラスミドは、
限定温度におけるｌａｃＺ遺伝子の誘発に基づいて検出
される。メチラーゼ遺伝子をコードしている形質転換体
は、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレート上で青色コロニ
ーとして検出される。（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１８３１−
１８３５，（１９９１）及びＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ
ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：１５０−
１５５（１９９１））。同様に、大腸菌ＥＲ１９９２株
は、ｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化依存
性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒが欠失してい
る。（“ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ”法と呼ばれる）この系に
おいては、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡに損傷
を与えるときにＳＯＳ応答を誘発する同系メチラーゼの
非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子が検出され得る。
ＳＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレ
ート上で深青色コロニーを形成する。（Ｘｕら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３９９−２４
０３（１９９４））。
【００１２】制限−修飾遺伝子のクローニングに関して
考えられる障害は、修飾によって保護されていない宿主
にエンドヌクレアーゼ遺伝子が導入され易いことにあ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを
単一クローンとして一緒に導入するとき、エンドヌクレ
アーゼによる宿主ＤＮＡの開裂が生じる前にメチラーゼ
による修飾が生じて宿主ＤＮＡが保護される必要があ
る。従って場合によっては、最初にメチラーゼ、次いで
エンドヌクレアーゼの順で遺伝子を順次にクローニング
するしかない。制限−修飾系のクローニングに関する別
の障害は、大腸菌のある種の菌株はシトシンまたはアデ
ニンの修飾に対して不利な反応を示すことにある。これ
らの菌株は、メチル化シトシンを含有するＤＮＡを破壊
する系（Ｒａｌｅｉｇｈ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９
０７０−９０７４（１９８６））またはメチル化アデニ
ンを含有するＤＮＡを破壊する系（Ｈｅｉｔｍａｎ ＆
Ｍｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１６９：３２４３−３
２５０，（１９８７）；Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｔｒｉｍａｒ
ｃｈｉ ＆ Ｒｅｖｅｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：
２７９−２９６（１９８９），Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ，
Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍｏｒａｎ．Ｓｌａｔｋｏ，Ｈｏｒｎ
ｓｔｒａ ＆ Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ，１７３：５２０７−５２１９（１９９１））を
有している。シトシン特異的またはアデニン特異的なメ
チラーゼ還伝子は、単独の場合にも対応するエンドヌク
レアーゼ遺伝子と一緒の場合にも、これらの菌株に容易
にクローニングできない。この問題を回避するために
は、これらの系が欠失した大腸菌の突然変異株（Ｍｃｒ
Ａ−及びＭｃｒＢ−またはＭｒｒ−）を使用することが
必要である。
考えられる障害は、修飾によって保護されていない宿主
にエンドヌクレアーゼ遺伝子が導入され易いことにあ
る。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを
単一クローンとして一緒に導入するとき、エンドヌクレ
アーゼによる宿主ＤＮＡの開裂が生じる前にメチラーゼ
による修飾が生じて宿主ＤＮＡが保護される必要があ
る。従って場合によっては、最初にメチラーゼ、次いで
エンドヌクレアーゼの順で遺伝子を順次にクローニング
するしかない。制限−修飾系のクローニングに関する別
の障害は、大腸菌のある種の菌株はシトシンまたはアデ
ニンの修飾に対して不利な反応を示すことにある。これ
らの菌株は、メチル化シトシンを含有するＤＮＡを破壊
する系（Ｒａｌｅｉｇｈ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９
０７０−９０７４（１９８６））またはメチル化アデニ
ンを含有するＤＮＡを破壊する系（Ｈｅｉｔｍａｎ ＆
Ｍｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１６９：３２４３−３
２５０，（１９８７）；Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｔｒｉｍａｒ
ｃｈｉ ＆ Ｒｅｖｅｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：
２７９−２９６（１９８９），Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ，
Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍｏｒａｎ．Ｓｌａｔｋｏ，Ｈｏｒｎ
ｓｔｒａ ＆ Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ，１７３：５２０７−５２１９（１９９１））を
有している。シトシン特異的またはアデニン特異的なメ
チラーゼ還伝子は、単独の場合にも対応するエンドヌク
レアーゼ遺伝子と一緒の場合にも、これらの菌株に容易
にクローニングできない。この問題を回避するために
は、これらの系が欠失した大腸菌の突然変異株（Ｍｃｒ
Ａ−及びＭｃｒＢ−またはＭｒｒ−）を使用することが
必要である。
【００１３】精製された制限エンドヌクレアーゼは実験
室内でＤＮＡの特性決定及び再配列を行うための有用な
ツールであり、また修飾メチラーゼも多少程度は少ない
が同様の有用ツールである。組換えＤＮＡ技術によって
これらの酵素を多量に合成する細菌株を得ることが産業
上重要な理由はここにある。このような細菌株は、精製
作業を容易にする、商業的に有用な量を産生する手段を
提供する、などの理由によって有用であろう。
室内でＤＮＡの特性決定及び再配列を行うための有用な
ツールであり、また修飾メチラーゼも多少程度は少ない
が同様の有用ツールである。組換えＤＮＡ技術によって
これらの酵素を多量に合成する細菌株を得ることが産業
上重要な理由はここにある。このような細菌株は、精製
作業を容易にする、商業的に有用な量を産生する手段を
提供する、などの理由によって有用であろう。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｓｐｈａｅ
ｒｏｔｉｌｕｓ種（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から指
定番号＃１３９２５で得られるＮＥＢ菌株＃３１５）に
由来のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラ
ーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、並びに組換え
ＤＮＡからこれらの酵素を産生する方法に関する。本発
明はまた、制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩ、即ちＤＮ
Ａ配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し矢印で示す第１の５′Ｔ
と第３の５′Ａとの間を開裂する酵素、を発現する形質
転換宿主に関する。
ｒｏｔｉｌｕｓ種（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から指
定番号＃１３９２５で得られるＮＥＢ菌株＃３１５）に
由来のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラ
ーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、並びに組換え
ＤＮＡからこれらの酵素を産生する方法に関する。本発
明はまた、制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩ、即ちＤＮ
Ａ配列ＡＡＴ▽ＡＴＴを認識し矢印で示す第１の５′Ｔ
と第３の５′Ａとの間を開裂する酵素、を発現する形質
転換宿主に関する。
【００１５】ＳｓｐＩの好ましいクローニング方法は、
ライブラリーＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ、
即ちその非メチル化認識配列を開裂する酵素、と共にイ
ンキュベートすることによって、対応するメチラーゼ遺
伝子を発現するＤＮＡを含む十分な数のライブラリーを
形成し、制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベート
したときに開裂されなかった組換えＤＮＡによって宿主
を再度形質転換し、得られた形質転換体の生存物から陽
性クローンをスクリーニングする段階を含む。
ライブラリーＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ、
即ちその非メチル化認識配列を開裂する酵素、と共にイ
ンキュベートすることによって、対応するメチラーゼ遺
伝子を発現するＤＮＡを含む十分な数のライブラリーを
形成し、制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベート
したときに開裂されなかった組換えＤＮＡによって宿主
を再度形質転換し、得られた形質転換体の生存物から陽
性クローンをスクリーニングする段階を含む。
【００１６】しかしながら、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ
種ＤＮＡの複数のライブラリーを構築した後で、メチラ
ーゼ遺伝子またはメチラーゼ遺伝子の部分及びエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の部分を得ることは可能であったが、
完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることはできなかっ
た。従って、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロ
ーニングするための代替的な戦略が必要になった。この
戦略では、宿主細胞中にメチラーゼを存在させないでベ
クターｐＡＩＩ１７中でＴ７プロモーター系の調節下に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする。
種ＤＮＡの複数のライブラリーを構築した後で、メチラ
ーゼ遺伝子またはメチラーゼ遺伝子の部分及びエンドヌ
クレアーゼ遺伝子の部分を得ることは可能であったが、
完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を得ることはできなかっ
た。従って、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロ
ーニングするための代替的な戦略が必要になった。この
戦略では、宿主細胞中にメチラーゼを存在させないでベ
クターｐＡＩＩ１７中でＴ７プロモーター系の調節下に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＳｓｐＩ制限
エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組
換えＤＮＡ、並びに、かかる組換えＤＮＡから産生され
る酵素に関する。
エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組
換えＤＮＡ、並びに、かかる組換えＤＮＡから産生され
る酵素に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】ＳｓｐＩの制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニングし発
現させるために好ましい本発明の方法は、図１、６及び
７に示されており、以下の段階を含んでいる。 Ｉ．ＳｓｐＩメチラーゼのクローニング Ａ．ライブラリーの調製 Ａ−１．実施例に詳細に記載されているようにＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＳｐｈａｅｒｏｔｉ
ｌｕｓ種の標準増殖プロトコルに従ってＳｐｈａｅｒｏ
ｔｉｌｕｓ種を増殖させる。細胞を溶解させ、ゲノムＤ
ＮＡを、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９７（１９８
９）に記載の技術によって精製する。 Ａ−２．ゲノムＤＮＡを以下の制限エンドヌクレアー
ゼ：ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及び
ＸｈｏＩで完全に消化する。 Ａ−３．これらの制限酵素フラグメントをクローニング
ベクターの対応するクローニング部位に結合する（例え
ば、ＢｇｌＩＩ生成フラグメントはＢｇｌＩＩクローニ
ング部位に結合し、他も同様である）。理想的には、ク
ローニングベクターはｐＢＩＩｓｐＩ．２、ｐＵＣ１
９、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４のように
１つまたは２つのＳｓｐＩ部位と前記クローニング部位
とを含むベクターであり、Ｍｒｒ−である大腸菌ＲＲ１
細胞またはＭｒｒ−及び／またはＭｃｒＡ−である任意
の他の大腸菌株のような適当な宿主細胞を形質転換させ
るために混合物が使用される。 Ａ−４．形質転換細胞をアンピシリン、テトラサイクリ
ン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールなどの抗
生物質を含む形質転換細胞の選択培地で平板培養する。
インキュベーション後、形質転換コロニーを単一培養物
として一緒に収集して細胞ライブラリーを作製する。 Ａ−５．細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全
に（ｉｎ ｔｏｔｏ）精製してプラスミドライブラリー
を作製する。 Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−１．Ｗａｔｓｏｎら、前出、に記載の方法と同様の
方法を用い、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種から調製した
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼによってプラスミドラ
イブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで完全消化する。メチラ
ーゼ非含有の未修飾クローンがＳｓｐＩ消化によって特
異的に破壊され、ＳｓｐＩメチラーゼクローンの相対頻
度が増加する。 Ｂ−２．選択されたＤＮＡを大腸菌ＲＲ１のような適当
な宿主に戻して形質転換させ、形質転換体を選択培地で
平板培養することによって回収する。コロニーを採取
し、それらのＤＮＡ中のＳｓｐＩ修飾遺伝子の存在を分
析する。該遺伝子を含むプラスミドを精製し、ＳｓｐＩ
制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして消化
に耐性か否かを判定する。全細胞性ＤＮＡ（染色体及び
プラスミド）も精製し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアー
ゼと共にインキュベートする。ＳｓｐＩ修飾遺伝子を保
有するクローンのＤＮＡは完全に修飾されており、プラ
スミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの双方が実質的に消化耐性で
ある。 Ｂ−３．作製したＤＮＡライブラリーを、ＥｃｏＲＩ、
ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩなどでサザンブロッテ
ィング用に調製し、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６のよう
なクローン化したメチラーゼ遺伝子でプローブする。 Ｃ．修飾メチラーゼ遣伝子のマッピング及び欠失サブク
ローンの調製 Ｃ−１．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１
４．０−Ｂ６を多数の異なる制限酵素でマッピングし
た。制限地図を図２に示す。 Ｃ−２．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１
４．０−Ｂ６を以下の制限酵素：ＰｓｔＩ、ＡｓｅＩ、
ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって消化し、
再結合した。これらの欠失サブクローンをＳｓｐＩで消
化し生存物をスクリーニングすることによってそのメチ
ラーゼ活性を検定した。これらの欠失サブクローンのい
くつかはメチラーゼ活性を有しており、残りはメチラー
ゼ活性を有していなかった。これは、推定メチラーゼ遺
伝子に相当する長さ約１．２キロ塩基の領域を示した
（図２参照）。この領域はＸｈｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部
位との間に存在した。ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＢ
ｇｌＩＩ及びＸｈｏＩによって消化した。このフラグメ
ントをｐＵＣ１８上のＳａｌＩからＢａｍＨＩ部位まで
及びｐＵＣ１９中にサブクローニングした。 Ｃ−３．最も小さいメチラーゼサブクローン、１．２Ｋ
ｂのＢｇｌＩＩからＸｈｏＩまでのフラグメント、のＤ
ＮＡ配列を決定した。この領域のＤＮＡ配列を図３に示
す。 Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、Ｓ
ｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及
び、エンドヌクレアーゼ位置のマッピング Ｄ−１．ＳｓｐＩ制限遺伝子及び修飾遺伝子を保有する
Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種の細胞からＳｓｐＩ制限エ
ンドヌクレアーゼを産生させる。細胞を発酵槽中の富裕
培地で増殖させる。細胞を遠心によって採集する。ｇａ
ｕｌｉｎミルによって細胞を破壊し、ＳｓｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を産生させる。
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を標準イオン交換法及びアフィニティクロマトグラフ
ィー法によって精製する。図４はＳｓｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼの産生スキームを示す。
ゼ遺伝子及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニングし発
現させるために好ましい本発明の方法は、図１、６及び
７に示されており、以下の段階を含んでいる。 Ｉ．ＳｓｐＩメチラーゼのクローニング Ａ．ライブラリーの調製 Ａ−１．実施例に詳細に記載されているようにＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＳｐｈａｅｒｏｔｉ
ｌｕｓ種の標準増殖プロトコルに従ってＳｐｈａｅｒｏ
ｔｉｌｕｓ種を増殖させる。細胞を溶解させ、ゲノムＤ
ＮＡを、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９７（１９８
９）に記載の技術によって精製する。 Ａ−２．ゲノムＤＮＡを以下の制限エンドヌクレアー
ゼ：ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及び
ＸｈｏＩで完全に消化する。 Ａ−３．これらの制限酵素フラグメントをクローニング
ベクターの対応するクローニング部位に結合する（例え
ば、ＢｇｌＩＩ生成フラグメントはＢｇｌＩＩクローニ
ング部位に結合し、他も同様である）。理想的には、ク
ローニングベクターはｐＢＩＩｓｐＩ．２、ｐＵＣ１
９、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４のように
１つまたは２つのＳｓｐＩ部位と前記クローニング部位
とを含むベクターであり、Ｍｒｒ−である大腸菌ＲＲ１
細胞またはＭｒｒ−及び／またはＭｃｒＡ−である任意
の他の大腸菌株のような適当な宿主細胞を形質転換させ
るために混合物が使用される。 Ａ−４．形質転換細胞をアンピシリン、テトラサイクリ
ン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールなどの抗
生物質を含む形質転換細胞の選択培地で平板培養する。
インキュベーション後、形質転換コロニーを単一培養物
として一緒に収集して細胞ライブラリーを作製する。 Ａ−５．細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全
に（ｉｎ ｔｏｔｏ）精製してプラスミドライブラリー
を作製する。 Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−１．Ｗａｔｓｏｎら、前出、に記載の方法と同様の
方法を用い、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種から調製した
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼによってプラスミドラ
イブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏで完全消化する。メチラ
ーゼ非含有の未修飾クローンがＳｓｐＩ消化によって特
異的に破壊され、ＳｓｐＩメチラーゼクローンの相対頻
度が増加する。 Ｂ−２．選択されたＤＮＡを大腸菌ＲＲ１のような適当
な宿主に戻して形質転換させ、形質転換体を選択培地で
平板培養することによって回収する。コロニーを採取
し、それらのＤＮＡ中のＳｓｐＩ修飾遺伝子の存在を分
析する。該遺伝子を含むプラスミドを精製し、ＳｓｐＩ
制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして消化
に耐性か否かを判定する。全細胞性ＤＮＡ（染色体及び
プラスミド）も精製し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアー
ゼと共にインキュベートする。ＳｓｐＩ修飾遺伝子を保
有するクローンのＤＮＡは完全に修飾されており、プラ
スミドＤＮＡ及び全ＤＮＡの双方が実質的に消化耐性で
ある。 Ｂ−３．作製したＤＮＡライブラリーを、ＥｃｏＲＩ、
ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩなどでサザンブロッテ
ィング用に調製し、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６のよう
なクローン化したメチラーゼ遺伝子でプローブする。 Ｃ．修飾メチラーゼ遣伝子のマッピング及び欠失サブク
ローンの調製 Ｃ−１．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１
４．０−Ｂ６を多数の異なる制限酵素でマッピングし
た。制限地図を図２に示す。 Ｃ−２．ＳｓｐＩメチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１
４．０−Ｂ６を以下の制限酵素：ＰｓｔＩ、ＡｓｅＩ、
ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって消化し、
再結合した。これらの欠失サブクローンをＳｓｐＩで消
化し生存物をスクリーニングすることによってそのメチ
ラーゼ活性を検定した。これらの欠失サブクローンのい
くつかはメチラーゼ活性を有しており、残りはメチラー
ゼ活性を有していなかった。これは、推定メチラーゼ遺
伝子に相当する長さ約１．２キロ塩基の領域を示した
（図２参照）。この領域はＸｈｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部
位との間に存在した。ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＢ
ｇｌＩＩ及びＸｈｏＩによって消化した。このフラグメ
ントをｐＵＣ１８上のＳａｌＩからＢａｍＨＩ部位まで
及びｐＵＣ１９中にサブクローニングした。 Ｃ−３．最も小さいメチラーゼサブクローン、１．２Ｋ
ｂのＢｇｌＩＩからＸｈｏＩまでのフラグメント、のＤ
ＮＡ配列を決定した。この領域のＤＮＡ配列を図３に示
す。 Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、Ｓ
ｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及
び、エンドヌクレアーゼ位置のマッピング Ｄ−１．ＳｓｐＩ制限遺伝子及び修飾遺伝子を保有する
Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種の細胞からＳｓｐＩ制限エ
ンドヌクレアーゼを産生させる。細胞を発酵槽中の富裕
培地で増殖させる。細胞を遠心によって採集する。ｇａ
ｕｌｉｎミルによって細胞を破壊し、ＳｓｐＩ制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を産生させる。
ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を標準イオン交換法及びアフィニティクロマトグラフ
ィー法によって精製する。図４はＳｓｐＩ制限エンドヌ
クレアーゼの産生スキームを示す。
【００１９】Ｄ−２．このように精製されたエンドヌク
レアーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で均
質であり、タンパク質は見掛け平均分子量３２，０００
ダルトンを有し、ラムダＤＮＡ上で測定した比活性はタ
ンパク質１ｍｇあたり約１４０，０００単位（またはそ
れ以上）である。 Ｄ−３．エンドヌクレアーゼのアミノ末端配列は、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａタンパク
質シークエンサー（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９
７，（１９８９））を用いて得られる。また、タンパク
質配列に基づいてＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを
作製する。 Ｄ−４．プローブを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ
種のゲノム中のメチラーゼクローンに対するエンドヌク
レアーゼの相対位置をマッピングする。図５はＳｐｈａ
ｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム中のメチラーゼ遺伝子及び
エンドヌクレアーゼ遺伝子を示す。 ＩＩ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ Ａ．ＭｃｒＡ−プレ保護宿主中の新しいライブラリーの
構築 Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＳｓｐＩ
メチラーゼ遣伝子を特異的にクローニングするためのプ
ライマーを設計し得る。２つのＰＣＲプライマーを設計
した。ＳｓｐＩメチラーゼをｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ
６から増幅し、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９のポリリンカ
ーに、ｐＵＣ１８構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５）中
ではメチラーゼ遺伝子の方向がｌａｃプロモーターと同
方向になり、ｐＵＣ１９構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ａ
８）中ではｌａｃプロモーターと逆方向になるようにサ
ブクローニングしした。 Ａ−２．ｐＡＣＹＣ１８４中で新しいＳｐｈＩ及びＸｈ
ｏＩライブラリーを作製した。これらのライブラリー
で、過発現メチラーゼ構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５またはｐ
ＳｓｐＭ−Ａ８で予め保護したＭｃｒＡ−宿主（ＥＲ１
７９７）を形質転換させた。これらのライブラリーをサ
ザンブロッティング用に調製し、エンドヌクレアーゼ遺
伝子に特異的なオリゴマーによってプローブした。これ
らのライブラリーのいずれにも検出可能なＳｓｐＩ制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子は存在しなかった。 Ｂ．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡの逆方向（ｉｎｖｅｒｓｅ）
ＰＣＲ Ｂ−１．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡをＳａｃＩＩで限定消化
することによってＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の
逆方向ＰＣＲ用鋳型を調製した。標的ＳａｃＩＩフラグ
メントは長さ約４ｋｂであり、メチラーゼ及びエンドヌ
クレアーゼの完全遺伝子をコードしていなければならな
い。消化後、ＤＮＡを希釈し再結合させて環状鋳型を形
成した。 Ｂ−２．メチラーゼ遺伝子のＡｓｅＩ部位に結合（ｆｌ
ａｎｋ）するＰＣＲプライマーを設計した。増幅を行っ
て、予想された４Ｋｂの産物を同定した。図６はゲノム
鋳型に対して逆方向ＰＣＲを行うためのスキームを示
す。 Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物をランダムプライムし、こ
れを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡの
サザンブロットをプローブした。エンドヌクレアーゼの
位置までのＰＣＲ産物をマッピングした。 Ｂ−４．ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５メチ
ラーゼ構築物によって予め保護されたコンピテントＥＲ
２２５２細胞に逆方向ＰＣＲ産物をクローニングする試
験は失敗に終わった。 Ｂ−５．逆方向ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで
切断してエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単
離した。この産物をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩからＳａｌ
Ｉまでの部位にクローニングした。 Ｂ−６．ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａ
ｌＩによって逆方向ＰＣＲ産物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ
フラグメントをマッピングし、ＳｓｐＩエンドヌクレア
ーゼ遣伝子のＮ−末端半鎖の正しい構造であることを確
認した。このエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端部分
を、既にクローニングされていたＣ−末端部分に付加す
ると、完全機能性エンドヌクレアーゼが得られた。 Ｃ．ＰＣＲの使用による制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の増幅 Ｃ−１．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端及びＣ
−末端に適したＰＣＲプライマーを設計した。Ｎ−末端
用の縮重プライマーは、遣伝子操作により作製されたＮ
ｄｅＩ部位を含むＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのタンパ
ク質配列に基づく。Ｃ−末端のプライマーは遺伝子操作
により作製されたＢａｍＨＩ部位を含む修飾メチラーゼ
のＤＮＡ配列に基づく。図７は、エンドヌクレアーゼ増
幅用プライマーが由来した場所を示す。 Ｃ−２．ｄＮＴＰ及びＭｇＳＯ４の存在下にＶｅｎｔ
ＤＮＡポリメラーゼを用い、段階Ｃ−１で得られたプラ
イマーによってＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム鋳
型を増幅させた。 Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中へのＰＣＲ産物のクローニ
ング Ｄ−１．９００塩基対のＰＣＲ産物をベクターｐＡＩＩ
１７のＮｄｅＩからＢａｍＨＩまでの部位にクローニン
グした。プラスミドｐＡＩＩ１７はｐＥＴ１１ｃに基づ
くＴ７ベクターである（Ｋｏｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２
６８：１９６５−１９７５，（１９９３））。結合産物
で大腸菌ＲＲ１及びＥＲ２１６９の双方を形質転換させ
た。双方の細胞株がＳｓｐＩメチラーゼによって予め保
護されていなかった。 Ｄ−２．ＥＲ２１６９形質転換体の９６個のコロニーを
採取し、アンピシリン含有Ｌ−寒天プレート及び１０ｍ
ＭのＩＰＴＧを加えたアンピシリン含有Ｌ−寒天プレー
トで再度平板培養した。ＩＰＴＧの存在下に増殖しなか
ったコロニーに対応するコロニーを個別に増殖させ、１
０ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。ラムダＤＮＡに対する粗
細胞抽出物のＳｓｐＩ活性を検定した。図８は、ラムダ
ＤＮＡに対して検定した粗細胞抽出物中のＳｓｐＩ活性
の写真である。
レアーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で均
質であり、タンパク質は見掛け平均分子量３２，０００
ダルトンを有し、ラムダＤＮＡ上で測定した比活性はタ
ンパク質１ｍｇあたり約１４０，０００単位（またはそ
れ以上）である。 Ｄ−３．エンドヌクレアーゼのアミノ末端配列は、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａタンパク
質シークエンサー（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９７９−９９
７，（１９８９））を用いて得られる。また、タンパク
質配列に基づいてＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを
作製する。 Ｄ−４．プローブを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ
種のゲノム中のメチラーゼクローンに対するエンドヌク
レアーゼの相対位置をマッピングする。図５はＳｐｈａ
ｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム中のメチラーゼ遺伝子及び
エンドヌクレアーゼ遺伝子を示す。 ＩＩ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニン
グ Ａ．ＭｃｒＡ−プレ保護宿主中の新しいライブラリーの
構築 Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＳｓｐＩ
メチラーゼ遣伝子を特異的にクローニングするためのプ
ライマーを設計し得る。２つのＰＣＲプライマーを設計
した。ＳｓｐＩメチラーゼをｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ
６から増幅し、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９のポリリンカ
ーに、ｐＵＣ１８構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５）中
ではメチラーゼ遺伝子の方向がｌａｃプロモーターと同
方向になり、ｐＵＣ１９構築物（構築物ｐＳｓｐＭ−Ａ
８）中ではｌａｃプロモーターと逆方向になるようにサ
ブクローニングしした。 Ａ−２．ｐＡＣＹＣ１８４中で新しいＳｐｈＩ及びＸｈ
ｏＩライブラリーを作製した。これらのライブラリー
で、過発現メチラーゼ構築物ｐＳｓｐＭ−Ｂ５またはｐ
ＳｓｐＭ−Ａ８で予め保護したＭｃｒＡ−宿主（ＥＲ１
７９７）を形質転換させた。これらのライブラリーをサ
ザンブロッティング用に調製し、エンドヌクレアーゼ遺
伝子に特異的なオリゴマーによってプローブした。これ
らのライブラリーのいずれにも検出可能なＳｓｐＩ制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子は存在しなかった。 Ｂ．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡの逆方向（ｉｎｖｅｒｓｅ）
ＰＣＲ Ｂ−１．ＳｓｐＩゲノムＤＮＡをＳａｃＩＩで限定消化
することによってＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の
逆方向ＰＣＲ用鋳型を調製した。標的ＳａｃＩＩフラグ
メントは長さ約４ｋｂであり、メチラーゼ及びエンドヌ
クレアーゼの完全遺伝子をコードしていなければならな
い。消化後、ＤＮＡを希釈し再結合させて環状鋳型を形
成した。 Ｂ−２．メチラーゼ遺伝子のＡｓｅＩ部位に結合（ｆｌ
ａｎｋ）するＰＣＲプライマーを設計した。増幅を行っ
て、予想された４Ｋｂの産物を同定した。図６はゲノム
鋳型に対して逆方向ＰＣＲを行うためのスキームを示
す。 Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物をランダムプライムし、こ
れを使用してＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡの
サザンブロットをプローブした。エンドヌクレアーゼの
位置までのＰＣＲ産物をマッピングした。 Ｂ−４．ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５メチ
ラーゼ構築物によって予め保護されたコンピテントＥＲ
２２５２細胞に逆方向ＰＣＲ産物をクローニングする試
験は失敗に終わった。 Ｂ−５．逆方向ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで
切断してエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単
離した。この産物をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩからＳａｌ
Ｉまでの部位にクローニングした。 Ｂ−６．ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａ
ｌＩによって逆方向ＰＣＲ産物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ
フラグメントをマッピングし、ＳｓｐＩエンドヌクレア
ーゼ遣伝子のＮ−末端半鎖の正しい構造であることを確
認した。このエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端部分
を、既にクローニングされていたＣ−末端部分に付加す
ると、完全機能性エンドヌクレアーゼが得られた。 Ｃ．ＰＣＲの使用による制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の増幅 Ｃ−１．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端及びＣ
−末端に適したＰＣＲプライマーを設計した。Ｎ−末端
用の縮重プライマーは、遣伝子操作により作製されたＮ
ｄｅＩ部位を含むＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのタンパ
ク質配列に基づく。Ｃ−末端のプライマーは遺伝子操作
により作製されたＢａｍＨＩ部位を含む修飾メチラーゼ
のＤＮＡ配列に基づく。図７は、エンドヌクレアーゼ増
幅用プライマーが由来した場所を示す。 Ｃ−２．ｄＮＴＰ及びＭｇＳＯ４の存在下にＶｅｎｔ
ＤＮＡポリメラーゼを用い、段階Ｃ−１で得られたプラ
イマーによってＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノム鋳
型を増幅させた。 Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中へのＰＣＲ産物のクローニ
ング Ｄ−１．９００塩基対のＰＣＲ産物をベクターｐＡＩＩ
１７のＮｄｅＩからＢａｍＨＩまでの部位にクローニン
グした。プラスミドｐＡＩＩ１７はｐＥＴ１１ｃに基づ
くＴ７ベクターである（Ｋｏｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２
６８：１９６５−１９７５，（１９９３））。結合産物
で大腸菌ＲＲ１及びＥＲ２１６９の双方を形質転換させ
た。双方の細胞株がＳｓｐＩメチラーゼによって予め保
護されていなかった。 Ｄ−２．ＥＲ２１６９形質転換体の９６個のコロニーを
採取し、アンピシリン含有Ｌ−寒天プレート及び１０ｍ
ＭのＩＰＴＧを加えたアンピシリン含有Ｌ−寒天プレー
トで再度平板培養した。ＩＰＴＧの存在下に増殖しなか
ったコロニーに対応するコロニーを個別に増殖させ、１
０ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。ラムダＤＮＡに対する粗
細胞抽出物のＳｓｐＩ活性を検定した。図８は、ラムダ
ＤＮＡに対して検定した粗細胞抽出物中のＳｓｐＩ活性
の写真である。
【００２０】上記に概説した各段階は本発明の好ましい
実施モードを示しているが、上記方法を当業界で公知の
技術に従って変更し得ることは当業者に明らかであろ
う。
実施モードを示しているが、上記方法を当業界で公知の
技術に従って変更し得ることは当業者に明らかであろ
う。
【００２１】以下の実施例は現状で実施されるのが好ま
しい本発明の実施態様を示している。実施例は単なる例
示であり、実施例によって本発明の範囲が特許請求の範
囲以外の制限を受けてはならないことは理解されよう。
しい本発明の実施態様を示している。実施例は単なる例
示であり、実施例によって本発明の範囲が特許請求の範
囲以外の制限を受けてはならないことは理解されよう。
【００２２】
【実施例】ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング Ｉ．ＳｓｐＩメチラーゼのクローニング Ａ．ライブラリーの調製 Ａ−１．ゲノムＤＮＡの精製：約５ｇのＳｐｈａｅｒｏ
ｔｉｌｕｓ種の細胞（ＡＴＣＣ＃１３９２５）を解凍
し、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プラスチック管（５
０ｍｌ）中で０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１
及び０．１ＭのＥＤＴＡ（２５ｍｌ）に再懸濁させた。
３５ｍｌの上記バッファ中に６０ｍｇのリゾチームを含
む溶液を２つの５０ｍｌプラスチック管に分割し、各々
に等しい分量（１５ｍｌ）の細胞懸濁液を添加した。溶
液を３７℃で１５分間インキュベートした。２０％スト
ック溶液からＳＤＳを添加してＳＤＳの最終濃度を１％
に調整した。２００μｌのプロテイナーゼＫ（ストック
１ｍｌあたり２０ｍｇ）を添加し、３７℃で１時間イン
キュベートした。この時点で粘性の拡散溶液が得られた
が、溶液は透明ではなかった。２ｍｌの１０％ＳＤＳ／
８％サルコシルを管に添加し（各１ｍｌ）、５５℃で２
時間加熱した。サンプルは粘性に維持されたが、完全に
透明ではなかった。サンプルをＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１、１ｍＭのＥＤＴＡ）（２リッ
トル）に一回交換して合計１６時間透析した。透析後、
溶液（９８ｍ１）を等容量のＴＥ，ｐＨ８．０で希釈
し、２つに分割し、各々に９８．０ｇのＣｓＣｌと１ｍ
ｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エチジチウムとを添加すること
によって、ＣｓＣｌ勾配溶液を調製した。２０個の管を
Ｔｉ７０ロータに入れ４４，０００ｒｐｍで４８時間遠
心した。バンドを取り出し、ＣｓＣｌ−水−飽和イソプ
ロパノールで抽出した。溶液を上記と同じバッファに透
析し、次いで、フェノール及びクロロホルムで抽出した
（各々で１回ずつ）。この溶液を再度透析してフェノー
ルを除去し、次いで電気泳動にかけた。 Ａ−２．限定消化：精製したＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断
し、以下の手順で完全消化した。５０ｍＭのＴｒｉｓ，
ｐＨ７，５と１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１００ｍＭのＮａ
Ｃｌと１ｍＭのＤＴＴとから成るバッファ中に１００μ
ｇ／ｍｌのＤＮＡを含む３００μｌの溶液を調製し、こ
の溶液を３つの管に分割した。５０単位の適当な制限酵
素を管に添加した。管を３７℃で１時間インキュベート
し、次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿させた。ペレットを３００μｌの１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再溶解
し、各１０μｌをアガロースゲル電気泳動によって分析
した。 Ａ−３．結合：フラグメント化したＤＮＡをｐＢＩＩＳ
ｐ１．２（ＸｃａＩで切断したｐＢＩＩ０１（ＡＴＣＣ
＃６７９０１）とＳｓｐＩ部位が挿入されたリンカー）
に以下のごとく結合した。ＢｇｌＩＩで消化した１０．
０μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のＤＮＡ（１００
μｌ）を、２．０μｇのＢｇｌＩＩ開裂し脱リン酸化し
たｐＢＩＩＳｐ１．２（２０．０μｌ）と混合し、エタ
ノール沈殿させた。ＤＮＡを１２，０００ｇ、４℃で１
５分間遠心し、１００μｌの７０％エタノールで１回洗
浄した。ＤＮＡを９９μｌの１×結合バッファ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１
０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）に再懸濁させ、
１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６
℃で１６時間インキュベートした。３μｌのアリコート
を使用して大腸菌ＲＲ１株を以下のごとく形質転換させ
た。各アリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント
大腸菌ＲＲ１細胞と混合し、３０分間氷上に維持した。
４２℃で２分間熱衝撃した後、細胞を１ｍｌのルリアブ
イヨン（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で希釈し、３７℃で１時間増
殖させた。 Ａ−４．一次細胞ライブラリー：形質転換した細胞培養
物を遠心し、２５０μｌの容量に再懸濁させ、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアー寒天（Ｌ−寒
天）プレートで平板培養した。３７℃で一夜インキュベ
ーション後、プレートを取り出し、約１１４，０００コ
ロニーを掻き取り、抗生物質を含む２５ｍｌのＬＢ培地
に導入した。これらの細胞から以下の手順でプラスミド
ＤＮＡを調製した。細胞を遠心によってペレット化し、
３ｇの細胞ペーストを１４ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０及び５０ｍＭ
のグルコースに再懸濁させた。懸濁液をリゾチーム中で
４．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５℃で５分間インキュベ
ートした。１％のドデシル硫酸ナトリウムと０．２Ｎの
ＮａＯＨとの２７ｍｌのアリコートを添加し、次いで溶
液を撹拌し、０℃で５分間インキュベートした。氷冷し
た２０ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム，ｐＨ４．８を添加して
ゲノムＤＮＡを沈殿させ、１０秒間穏やかに撹拌し、氷
上に５分間静置し、１２，０００×ｇで１０分間遠心し
た。上清を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム
（１：１）で抽出した。１０，０００×ｇで５分間遠心
することによって層を分離した。上層を除去し、等容量
のクロロホルムで抽出した。１０，０００×ｇで５分間
遠心することによって層を分離した。上層を除去し、２
倍容のエタノールを添加することによって核酸を沈殿さ
せた。１２，０００×ｇで２０分間遠心することによっ
て沈殿物を収集した。７０％のエタノールでペレットを
１回洗浄し、上記同様に再ペレット化した。ペレットを
真空下に乾燥し、８ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。
８ｇの塩化セシウムと０．５ｍｌの臭化エチジウム溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）とを添加することによって塩化セシウ
ムー臭化エチジウム平衡密度遠心のためのＤＮＡ溶液を
調製した。ＤＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間
遠心し、得られたプラスミドＤＮＡのバンドを注射器及
び１８ｇ針で取り出した。等容量のＣｓＣｌ−水−飽和
イソプロパノールで抽出することによって臭化エチジウ
ムを除去した。塩化セシウムを透析によって除去した。
ＤＮＡを等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）
によって抽出し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ
のＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に一夜透析した。 Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−１．一次選択及び選択されたライブラリー：１μｇ
（１２．０μｌ）のＢｇｌＩＩプラスミドライブラリー
を、２７μｌの制限エンドヌクレアーゼ消化バッファ
（１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００
μｇのウシ血清アルブミン）に希釈した。１００単位
（１μｌ）のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼを添加
し、管を３７℃で２時間インキュベートした。この時点
で７単位（１μｌ）の仔ウシ腸ホスファターゼを添加
し、反応混合物を更に３０分間インキュベートした。一
次ライブラリーの場合と同様に、この反応混合物の５μ
ｌのアリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント大
腸菌ＲＲ１細胞と混合して形質転換させ、平板培養し、
一夜増殖させた。 Ｂ−２．個別コロニーの分析：上記の形質転換によって
得られたコロニーを採取し、アンピシリン含有のＬＢ寒
天培地で平板培養した。１８個のコロニーを１０ｍｌの
培養物に増殖させ、それらに含まれるプラスミドを、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９）を応用
した以下のミニ調製物（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製手順に
よって調製した。
ｔｉｌｕｓ種の細胞（ＡＴＣＣ＃１３９２５）を解凍
し、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プラスチック管（５
０ｍｌ）中で０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１
及び０．１ＭのＥＤＴＡ（２５ｍｌ）に再懸濁させた。
３５ｍｌの上記バッファ中に６０ｍｇのリゾチームを含
む溶液を２つの５０ｍｌプラスチック管に分割し、各々
に等しい分量（１５ｍｌ）の細胞懸濁液を添加した。溶
液を３７℃で１５分間インキュベートした。２０％スト
ック溶液からＳＤＳを添加してＳＤＳの最終濃度を１％
に調整した。２００μｌのプロテイナーゼＫ（ストック
１ｍｌあたり２０ｍｇ）を添加し、３７℃で１時間イン
キュベートした。この時点で粘性の拡散溶液が得られた
が、溶液は透明ではなかった。２ｍｌの１０％ＳＤＳ／
８％サルコシルを管に添加し（各１ｍｌ）、５５℃で２
時間加熱した。サンプルは粘性に維持されたが、完全に
透明ではなかった。サンプルをＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１、１ｍＭのＥＤＴＡ）（２リッ
トル）に一回交換して合計１６時間透析した。透析後、
溶液（９８ｍ１）を等容量のＴＥ，ｐＨ８．０で希釈
し、２つに分割し、各々に９８．０ｇのＣｓＣｌと１ｍ
ｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エチジチウムとを添加すること
によって、ＣｓＣｌ勾配溶液を調製した。２０個の管を
Ｔｉ７０ロータに入れ４４，０００ｒｐｍで４８時間遠
心した。バンドを取り出し、ＣｓＣｌ−水−飽和イソプ
ロパノールで抽出した。溶液を上記と同じバッファに透
析し、次いで、フェノール及びクロロホルムで抽出した
（各々で１回ずつ）。この溶液を再度透析してフェノー
ルを除去し、次いで電気泳動にかけた。 Ａ−２．限定消化：精製したＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断
し、以下の手順で完全消化した。５０ｍＭのＴｒｉｓ，
ｐＨ７，５と１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１００ｍＭのＮａ
Ｃｌと１ｍＭのＤＴＴとから成るバッファ中に１００μ
ｇ／ｍｌのＤＮＡを含む３００μｌの溶液を調製し、こ
の溶液を３つの管に分割した。５０単位の適当な制限酵
素を管に添加した。管を３７℃で１時間インキュベート
し、次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿させた。ペレットを３００μｌの１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再溶解
し、各１０μｌをアガロースゲル電気泳動によって分析
した。 Ａ−３．結合：フラグメント化したＤＮＡをｐＢＩＩＳ
ｐ１．２（ＸｃａＩで切断したｐＢＩＩ０１（ＡＴＣＣ
＃６７９０１）とＳｓｐＩ部位が挿入されたリンカー）
に以下のごとく結合した。ＢｇｌＩＩで消化した１０．
０μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のＤＮＡ（１００
μｌ）を、２．０μｇのＢｇｌＩＩ開裂し脱リン酸化し
たｐＢＩＩＳｐ１．２（２０．０μｌ）と混合し、エタ
ノール沈殿させた。ＤＮＡを１２，０００ｇ、４℃で１
５分間遠心し、１００μｌの７０％エタノールで１回洗
浄した。ＤＮＡを９９μｌの１×結合バッファ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１
０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）に再懸濁させ、
１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６
℃で１６時間インキュベートした。３μｌのアリコート
を使用して大腸菌ＲＲ１株を以下のごとく形質転換させ
た。各アリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント
大腸菌ＲＲ１細胞と混合し、３０分間氷上に維持した。
４２℃で２分間熱衝撃した後、細胞を１ｍｌのルリアブ
イヨン（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で希釈し、３７℃で１時間増
殖させた。 Ａ−４．一次細胞ライブラリー：形質転換した細胞培養
物を遠心し、２５０μｌの容量に再懸濁させ、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアー寒天（Ｌ−寒
天）プレートで平板培養した。３７℃で一夜インキュベ
ーション後、プレートを取り出し、約１１４，０００コ
ロニーを掻き取り、抗生物質を含む２５ｍｌのＬＢ培地
に導入した。これらの細胞から以下の手順でプラスミド
ＤＮＡを調製した。細胞を遠心によってペレット化し、
３ｇの細胞ペーストを１４ｍｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０及び５０ｍＭ
のグルコースに再懸濁させた。懸濁液をリゾチーム中で
４．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５℃で５分間インキュベ
ートした。１％のドデシル硫酸ナトリウムと０．２Ｎの
ＮａＯＨとの２７ｍｌのアリコートを添加し、次いで溶
液を撹拌し、０℃で５分間インキュベートした。氷冷し
た２０ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム，ｐＨ４．８を添加して
ゲノムＤＮＡを沈殿させ、１０秒間穏やかに撹拌し、氷
上に５分間静置し、１２，０００×ｇで１０分間遠心し
た。上清を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム
（１：１）で抽出した。１０，０００×ｇで５分間遠心
することによって層を分離した。上層を除去し、等容量
のクロロホルムで抽出した。１０，０００×ｇで５分間
遠心することによって層を分離した。上層を除去し、２
倍容のエタノールを添加することによって核酸を沈殿さ
せた。１２，０００×ｇで２０分間遠心することによっ
て沈殿物を収集した。７０％のエタノールでペレットを
１回洗浄し、上記同様に再ペレット化した。ペレットを
真空下に乾燥し、８ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。
８ｇの塩化セシウムと０．５ｍｌの臭化エチジウム溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）とを添加することによって塩化セシウ
ムー臭化エチジウム平衡密度遠心のためのＤＮＡ溶液を
調製した。ＤＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間
遠心し、得られたプラスミドＤＮＡのバンドを注射器及
び１８ｇ針で取り出した。等容量のＣｓＣｌ−水−飽和
イソプロパノールで抽出することによって臭化エチジウ
ムを除去した。塩化セシウムを透析によって除去した。
ＤＮＡを等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）
によって抽出し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ
のＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に一夜透析した。 Ｂ．ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−１．一次選択及び選択されたライブラリー：１μｇ
（１２．０μｌ）のＢｇｌＩＩプラスミドライブラリー
を、２７μｌの制限エンドヌクレアーゼ消化バッファ
（１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００
μｇのウシ血清アルブミン）に希釈した。１００単位
（１μｌ）のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼを添加
し、管を３７℃で２時間インキュベートした。この時点
で７単位（１μｌ）の仔ウシ腸ホスファターゼを添加
し、反応混合物を更に３０分間インキュベートした。一
次ライブラリーの場合と同様に、この反応混合物の５μ
ｌのアリコートを２００μｌの氷冷したコンピテント大
腸菌ＲＲ１細胞と混合して形質転換させ、平板培養し、
一夜増殖させた。 Ｂ−２．個別コロニーの分析：上記の形質転換によって
得られたコロニーを採取し、アンピシリン含有のＬＢ寒
天培地で平板培養した。１８個のコロニーを１０ｍｌの
培養物に増殖させ、それらに含まれるプラスミドを、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｄｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９）を応用
した以下のミニ調製物（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）精製手順に
よって調製した。
【００２３】ミニ調製物精製手順：各培養物を以下のご
とく処理した。１．５ｍｌの一夜培養物を６，０００×
ｇで５分間遠心してペレット化した。上清を傾瀉し、細
胞ペレットを２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有の１５０μ
ｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍのグルコース，ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で５
分間維持後、２００μｌの０．２ＭのＮａＯＨ、１％の
ＳＤＳを添加し、管を振盪して細胞を溶解し、次いで氷
に載せた。５分後、１５０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウ
ム，ｐＨ４．８を添加し、振盪し、氷に載せ、更に５分
間維持した。形成された沈殿物を４℃、１２，０００×
ｇで５分間遠心した。上清を除去し、等容量のフェノー
ル／クロロホルム（１：１）によって抽出した。１０，
０００×ｇで５分間遠心することによって層を分離し
た。８８０μｌのエタノールを収容した遠心管に上清を
注入し、混合した。室温で１０分間維持した後、管を１
２，０００×ｇで１０分間遠心し、沈殿した核酸をペレ
ット化した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの７０％
エタノールー水で再度洗浄し、再度ペレット化し、真空
下に室温で３０分間乾燥した。いったん乾燥したペレッ
トを、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ含有の５０μｌの１
０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再
懸濁させ、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを
消化した。
とく処理した。１．５ｍｌの一夜培養物を６，０００×
ｇで５分間遠心してペレット化した。上清を傾瀉し、細
胞ペレットを２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有の１５０μ
ｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍのグルコース，ｐＨ８．０に再懸濁させた。室温で５
分間維持後、２００μｌの０．２ＭのＮａＯＨ、１％の
ＳＤＳを添加し、管を振盪して細胞を溶解し、次いで氷
に載せた。５分後、１５０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウ
ム，ｐＨ４．８を添加し、振盪し、氷に載せ、更に５分
間維持した。形成された沈殿物を４℃、１２，０００×
ｇで５分間遠心した。上清を除去し、等容量のフェノー
ル／クロロホルム（１：１）によって抽出した。１０，
０００×ｇで５分間遠心することによって層を分離し
た。８８０μｌのエタノールを収容した遠心管に上清を
注入し、混合した。室温で１０分間維持した後、管を１
２，０００×ｇで１０分間遠心し、沈殿した核酸をペレ
ット化した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの７０％
エタノールー水で再度洗浄し、再度ペレット化し、真空
下に室温で３０分間乾燥した。いったん乾燥したペレッ
トを、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ含有の５０μｌの１
０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再
懸濁させ、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを
消化した。
【００２４】引き続いて、プラスミドのミニ調製物をＳ
ｓｐＩ及びＢｇｌＩＩで消化することによって分析し
た。 Ｂ−３．メチラーゼ遺伝子クローン：分析したプラスミ
ドの１１％がＳｓｐＩに耐性であり長さ約９．６Ｋｂの
ＢｇｌＩＩフラグメントを保有することが判明した。こ
れらのプラスミドは機能性ＳｓｐＩ修飾メチラーゼ遺伝
子だけをコードしており制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
をコードしていないことが後で判明した。観察した他の
８９％のプラスミドはＳｓｐＩに耐性でなく、不要な
（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）フラグメントを含むかまたはベク
ターに再結合していた。ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｐｈ
Ｉ及びＸｈｏＩから成る他の４つのライブラリー中で
は、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼによる開裂に対して耐
性のクローンは全く検出されなかった。これらの４つの
ライブラリーを以下の手順でサザンブロッティング用に
調製した。１μｇのライブラリーＤＮＡをＳｓｐＩまた
はクローニング酵素（即ちＰｓｔＩライブラリー用には
ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩライブラリー用にはＥｃｏＲＩ、
など）によって消化した。未切断のライブラリーＤＮＡ
及びゲノムＤＮＡを０．７％のアガロースゲル上でクロ
ーニング酵素によって一夜消化した。ゲルに対して、
０．２５ＭのＨＣｌによる１５分間の洗浄を２回繰り返
し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌに
よる１５分間の洗浄を２回繰り返し、最後に１ＭのＮＨ
４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨによる３０分間の洗浄
を２回繰り返した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移さ
せるために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロー
スシートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨ
で湿潤させ、ゲルと同寸法の切片をゲルの片面に配置し
た。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体に上
に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの積層
体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載せ、一
番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを転移さ
せた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキングし
た。メチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６の
ニックトランスレーションを以下のごとく行って３２Ｐ
標識プローブを調製した。１μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．
０−Ｂ６を０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、
５０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１Ｍのβ−メルカプトエタ
ノール及び０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに再懸濁させた。
４μｌの各０．１ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ
Ｐを１０μｌの６５０Ｃｉ／ｍｍｏｌのα３２−Ｐのｄ
ＡＴＰと共に添加した。４ピコグラムのＤＮＡアーゼＩ
を１０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと共に添加し
た。この混合物を１６℃で３時間インキュベートした。
ｓｐＩ及びＢｇｌＩＩで消化することによって分析し
た。 Ｂ−３．メチラーゼ遺伝子クローン：分析したプラスミ
ドの１１％がＳｓｐＩに耐性であり長さ約９．６Ｋｂの
ＢｇｌＩＩフラグメントを保有することが判明した。こ
れらのプラスミドは機能性ＳｓｐＩ修飾メチラーゼ遺伝
子だけをコードしており制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
をコードしていないことが後で判明した。観察した他の
８９％のプラスミドはＳｓｐＩに耐性でなく、不要な
（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）フラグメントを含むかまたはベク
ターに再結合していた。ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｐｈ
Ｉ及びＸｈｏＩから成る他の４つのライブラリー中で
は、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼによる開裂に対して耐
性のクローンは全く検出されなかった。これらの４つの
ライブラリーを以下の手順でサザンブロッティング用に
調製した。１μｇのライブラリーＤＮＡをＳｓｐＩまた
はクローニング酵素（即ちＰｓｔＩライブラリー用には
ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩライブラリー用にはＥｃｏＲＩ、
など）によって消化した。未切断のライブラリーＤＮＡ
及びゲノムＤＮＡを０．７％のアガロースゲル上でクロ
ーニング酵素によって一夜消化した。ゲルに対して、
０．２５ＭのＨＣｌによる１５分間の洗浄を２回繰り返
し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌに
よる１５分間の洗浄を２回繰り返し、最後に１ＭのＮＨ
４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨによる３０分間の洗浄
を２回繰り返した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移さ
せるために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロー
スシートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨ
で湿潤させ、ゲルと同寸法の切片をゲルの片面に配置し
た。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体に上
に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの積層
体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載せ、一
番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを転移さ
せた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキングし
た。メチラーゼクローンｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６の
ニックトランスレーションを以下のごとく行って３２Ｐ
標識プローブを調製した。１μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．
０−Ｂ６を０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、
５０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１Ｍのβ−メルカプトエタ
ノール及び０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに再懸濁させた。
４μｌの各０．１ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ
Ｐを１０μｌの６５０Ｃｉ／ｍｍｏｌのα３２−Ｐのｄ
ＡＴＰと共に添加した。４ピコグラムのＤＮＡアーゼＩ
を１０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと共に添加し
た。この混合物を１６℃で３時間インキュベートした。
【００２５】ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５
０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（５００
ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳＡ）、２０×
ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．３ｇのＮａＣ
ｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、１０％のＳＤ
Ｓ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリダイ
ズした。室温で１時間プレハイブリダイズした後、標識
プローブを添加し、ハイブリダイゼーション段階を６８
℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわたって６８℃
の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを加えた２×Ｓ
ＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに４及び
１８時間露光した。
０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（５００
ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳＡ）、２０×
ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．３ｇのＮａＣ
ｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、１０％のＳＤ
Ｓ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリダイ
ズした。室温で１時間プレハイブリダイズした後、標識
プローブを添加し、ハイブリダイゼーション段階を６８
℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわたって６８℃
の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを加えた２×Ｓ
ＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに４及び
１８時間露光した。
【００２６】ＥｃｏＲＩライブラリーだけがプローブに
ハイブリダイズするメチラーゼクローンを含むことが判
明した。 Ｃ．ＳｓｐＩメチラーゼクローンのマッピング及び欠失
サブクローンの調製 Ｃ−１．５μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＰｓｔ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼによって以下のごとく消化し
た。５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中に１
００μｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡを含む５０μｌの溶液を
試験管に導入した。この管に、１００単位のＰｓｔＩエ
ンドヌクレアーゼを添加し、反応混合物を３７℃で２時
間インキュベートした。消化物全部を０．７％アガロー
ス分取ゲル上で泳動した。全メチラーゼ遺伝子を含有す
ると判定された約７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントから成
る選択フラグメントをゲルから切り出した。ゲルフラグ
メントを２１ゲージの針から交互に押し出して凍結させ
た。この処理を３回繰り返した。得られた混合物を４
℃、１００，０００×ｇで１時間遠心してアガロースを
ペレット化した。残りの水溶液をＮａＣｌ濃度０．４Ｍ
にし、２倍容のイソプロパノールで沈殿させた。１２，
０００×ｇで２０分間遠心することによってＤＮＡをペ
レット化し、低温の７０％エタノールで１回洗浄した。
ＤＮＡペレットを２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、
１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に再懸濁させ、等容量のフ
ェノールによって抽出した。１０，０００×ｇで１０分
間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、
等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出
し、１０，０００×ｇで１０分間遠心することによって
層を分離した。上層を除去し、等容量のクロロホルムで
抽出し、１０，０００×ｇで遠心することによって層を
分離した。水相を除去し、１／１０容量（０．２ｍｌ）
の２．７５Ｍの酢酸ナトリウムと２倍容の冷エタノール
とを添加することによってＤＮＡを沈殿させた。１２，
０００×ｇで２０分間遠心してＤＮＡをペレット化し、
冷７０％エタノールで１回洗浄した。ＤＮＡを０．５ｍ
ｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８）に再懸濁させた。 Ｃ−２．ゲル調製したＤＮＡフラグメントを以下の手順
で再結合した。５μｌの１０×結合バッファ（５０ｍＭ
のＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０
ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）をゲル調製した４
５μｌの限定消化フラグメントに添加し、１μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６℃で１６時間
インキュベートした。１、２及び３μｌのアリコートを
使用して段階Ｉ（Ａ−３）に記載のように大腸菌ＲＲ１
株を形質転換させた。形質転換した細胞培養物を遠心
し、２５０μｌ容量に再懸濁させ、１５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリン含有のＬ−寒天で平板培養した。得られ
た平板培養物を３７℃で一夜インキュベートした。 Ｃ−３．段階Ｉ（Ｂ−３）に記載の手順で複数のコロニ
ーをミニ調製すると、正しいサイズのフラグメントが含
まれることが知見された。ＰｓｔＩ欠失クローンはＳｓ
ｐＩ消化に耐性であり、従って完全メチラーゼ遺伝子を
含んでいることが判明した。
ハイブリダイズするメチラーゼクローンを含むことが判
明した。 Ｃ．ＳｓｐＩメチラーゼクローンのマッピング及び欠失
サブクローンの調製 Ｃ−１．５μｇのｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＰｓｔ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼによって以下のごとく消化し
た。５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中に１
００μｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡを含む５０μｌの溶液を
試験管に導入した。この管に、１００単位のＰｓｔＩエ
ンドヌクレアーゼを添加し、反応混合物を３７℃で２時
間インキュベートした。消化物全部を０．７％アガロー
ス分取ゲル上で泳動した。全メチラーゼ遺伝子を含有す
ると判定された約７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントから成
る選択フラグメントをゲルから切り出した。ゲルフラグ
メントを２１ゲージの針から交互に押し出して凍結させ
た。この処理を３回繰り返した。得られた混合物を４
℃、１００，０００×ｇで１時間遠心してアガロースを
ペレット化した。残りの水溶液をＮａＣｌ濃度０．４Ｍ
にし、２倍容のイソプロパノールで沈殿させた。１２，
０００×ｇで２０分間遠心することによってＤＮＡをペ
レット化し、低温の７０％エタノールで１回洗浄した。
ＤＮＡペレットを２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、
１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に再懸濁させ、等容量のフ
ェノールによって抽出した。１０，０００×ｇで１０分
間遠心することによって層を分離した。上層を除去し、
等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出
し、１０，０００×ｇで１０分間遠心することによって
層を分離した。上層を除去し、等容量のクロロホルムで
抽出し、１０，０００×ｇで遠心することによって層を
分離した。水相を除去し、１／１０容量（０．２ｍｌ）
の２．７５Ｍの酢酸ナトリウムと２倍容の冷エタノール
とを添加することによってＤＮＡを沈殿させた。１２，
０００×ｇで２０分間遠心してＤＮＡをペレット化し、
冷７０％エタノールで１回洗浄した。ＤＮＡを０．５ｍ
ｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８）に再懸濁させた。 Ｃ−２．ゲル調製したＤＮＡフラグメントを以下の手順
で再結合した。５μｌの１０×結合バッファ（５０ｍＭ
のＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０
ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）をゲル調製した４
５μｌの限定消化フラグメントに添加し、１μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を１６℃で１６時間
インキュベートした。１、２及び３μｌのアリコートを
使用して段階Ｉ（Ａ−３）に記載のように大腸菌ＲＲ１
株を形質転換させた。形質転換した細胞培養物を遠心
し、２５０μｌ容量に再懸濁させ、１５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリン含有のＬ−寒天で平板培養した。得られ
た平板培養物を３７℃で一夜インキュベートした。 Ｃ−３．段階Ｉ（Ｂ−３）に記載の手順で複数のコロニ
ーをミニ調製すると、正しいサイズのフラグメントが含
まれることが知見された。ＰｓｔＩ欠失クローンはＳｓ
ｐＩ消化に耐性であり、従って完全メチラーゼ遺伝子を
含んでいることが判明した。
【００２７】また、段階Ｉ（Ｃ−１）の記載と同様にし
て、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴ
Ｔ中でｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＡｓｅＩで消化
し、５Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地で平板培養し
た。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、
ＳｓｐＩに耐性でないことが判明した。また、ｐＳｓｐ
ＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＢａｍＨＩで消化し、７Ｋｂの
消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調
製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性で
あることが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ
６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ
中のＥｃｏＲＶで消化し、１３Ｋｂの消化産物をゲル調
製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳ
ｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明し
た。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、
５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＸｈｏＩで消
化し、次いで６．８Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結
合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平
板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化
すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明した。また、
ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＣｌａＩ及びＢｓｔＢＩ
で二重消化した。まず、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩，
ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの
酢酸カリウム及び１ｍＭのＤＴＴ中のＣｌａＩで３７℃
で消化した。次いで、５，０００単位のＢｓｔＢＩを添
加し、混合物を６５℃で１時間インキュベートした。１
１．４Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。
ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに
耐性でないことが判明した。ＳｓｐＩメチラーゼの欠失
クローンを図２にまとめる。
て、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴ
Ｔ中でｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＡｓｅＩで消化
し、５Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地で平板培養し
た。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、
ＳｓｐＩに耐性でないことが判明した。また、ｐＳｓｐ
ＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＢａｍＨＩで消化し、７Ｋｂの
消化産物をゲル調製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む培地で平板培養した。次に、ミニ調
製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性で
あることが判明した。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ
６を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ
中のＥｃｏＲＶで消化し、１３Ｋｂの消化産物をゲル調
製し、再結合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む培地で平板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳ
ｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明し
た。また、ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、
５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中のＸｈｏＩで消
化し、次いで６．８Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結
合し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平
板培養した。次に、ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化
すると、ＳｓｐＩに耐性であることが判明した。また、
ｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６をＣｌａＩ及びＢｓｔＢＩ
で二重消化した。まず、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩，
ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの
酢酸カリウム及び１ｍＭのＤＴＴ中のＣｌａＩで３７℃
で消化した。次いで、５，０００単位のＢｓｔＢＩを添
加し、混合物を６５℃で１時間インキュベートした。１
１．４Ｋｂの消化産物をゲル調製し、再結合し、１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地で平板培養した。
ミニ調製したＤＮＡをＳｓｐＩ消化すると、ＳｓｐＩに
耐性でないことが判明した。ＳｓｐＩメチラーゼの欠失
クローンを図２にまとめる。
【００２８】これらの欠失クローンの全部において、メ
チラーゼ含有ＤＮＡの最小領域はＢｇｌＩＩ部位とＸｈ
ｏＩ部位との間に存在していた。従って、５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、
１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中の５μｇのｐ
ＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を、４０単位のＢｇｌＩＩ及
び４０単位のＸｈｏＩによって１時間消化した。消化産
物を０．７％の低融点アガロースゲル上で泳動した。
１．２ＫｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをゲル
から切り出した。β−アガロースを用いて以下の手順で
ゲルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解
し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）と１ｍ
ＭのＥＤＴＡ中に導入した。６単位のβ−アガロースを
添加し、アガロースを４２℃で１時間消化した。４℃、
１５，０００×ｇで１５分間遠心することによって未消
化の糖質をペレット化した。ＤＮＡ含有上清に０．５Ｍ
のＮａＣｌを加え、２倍容のイソプロパノールを添加し
た。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却した後、１
５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを
７０％のイソプロパノールで洗浄して乾燥した。ＤＮＡ
を２０μｌのＴＥに再懸濁させた。１０μｌのＢｇｌＩ
Ｉ−ＸｈｏＩメチラーゼフラグメントを夫々ｐＵＣ１８
及びｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に結合し
た。これらの２つのメチラーゼサブクローンのＤＮＡ配
列を決定した。得られたＤＮＡ配列を図３に示す。 Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、Ｓ
ｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及
び、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼの位置のマッピング Ｄ−１．ＮＥＢ＃３１５と命名されたＳｐｈａｅｒｏｔ
ｉｌｕｓ種のＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、３７℃の
発酵槽中で、１０．０ｇ／リットルのトリプトンと、
５．０ｇ／リットルの酵母エキスと、２．０ｇ／リット
ルのＮａＣｌと、４．４ｇ／リットルのＫ２ＨＰＯ
４と、２．０ｇ／リットルのグルコースと、１０ｍｇ／
リットルのウシヘミンと、２．０ｍｇ／リットルのＮＡ
Ｄ；ＤＰＮとから成るＴＲＹ−ＹＥブイヨン培地中で増
殖させた。細胞を遠心によって収集し、細胞ペーストを
新鮮なうちに使用するかまたは−７０℃で保存した。以
後の段階はすべて４℃で行う。 Ｄ−２．細胞ペースト（２５３ｇ）を解凍し、細胞を５
００ｍｌの音波処理バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．６、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させる。 Ｄ−３．細胞をｇａｕｌｉｎミルによって破壊して懸濁
細胞１ｍｌあたり約３５ｍｇの可溶性タンパク質を遊離
させる。 Ｄ−４．１５，０００×ｇで４０分間遠心することによ
って不溶性細胞破片を除去する。 Ｄ−５．上清に５０ｇの細胞破片除去剤（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）を添加し、１０，０００×ｇで１０分間遠心する。 Ｄ−６．２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ６．９、５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ
で平衡させたホスホセルロースカラム（５×３５ｃｍ）
（ＷｈａｔｍａｎＰ−１１）に上清流体を加える。カラ
ムの２倍容の上記バッファでカラムを洗浄する。カラム
を素通りした流体を単一フラスコに収集する。ＳｓｐＩ
エンドヌクレアーゼはカラムに保持され、０．３〜０．
６ＭのＮａＣｌに溶出する。最も活性の画分をプール
し、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに対
して一夜透析する。 Ｄ−７．ホスホセルロースカラムから得られたプール
を、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ
で平衡させたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム
（２．５×２５ｃｍ）に導入し、カラムの２倍容の同じ
バッファで洗浄する。０．０５Ｍから０．８ＭまでのＮ
ａＣｌの直線勾配（総容量５００ｍｌ）を展開させ、カ
ラムに導入する。３ｍｌの画分が収集される。ラムダＤ
ＮＡに対する画分中のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ
の存在を検定する。活性画分をプールし、１００倍容の
２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍＭの
ＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに透
析する。 Ｄ−８．透析したＳｓｐＩ活性のプール（２５ｍｌ）を
１ｍｌのＭｏｎｏ ＳＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に導入し、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．
４、０．０５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴで洗浄し、同じバッファ中で５０ｍＭの
ＫＣｌから１．０ＭのＫＣｌまでの４０ｍｌの直線勾配
を展開させ、カラムに導入する。１ｍｌの画分を収集
し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在を検定
する。最も活性の４つの画分は均質であり、タンパク質
１ｍｇあたり比活性約１４０，０００単位を有し、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分子量３２，０００ダ
ルトンを有することが判明した。 Ｄ−９．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏ
ｄｅｌ ４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ｂｒ
ｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，１７：９７９−９９７，（１９８９））を用
い、４μｇの均質なＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのアミ
ノ末端タンパク質の配列を決定した。最初の３０個の残
基は分解していた。得られた最初の２５個の残基の配列
は以下の通りであった：ＳＫＡＡＹＱＤＦＴＫＸＳＬＬ
ＩＫＫＸＸＮＬＩＴＭ（配列番号１）（タンパク質配列
の１文字コードの説明に関しては表１を参照された
い）。 Ｄ−１０．タンパク質配列に基づいて、以下の配列をも
つ２個の１７ｍｅｒを作製した：５′ＧＣＮＧＣＮＴＡ
ＹＣＡＲＧＡＣＴＴ３’（配列番号２）及び５′ＧＣＮ
ＧＣＮＴＡＹＣＡＲＧＡＴＴＴ３’（配列番号３）（Ｙ
＝ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；
Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）。これらの１７ｍｅｒを使用
して、ＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕＳゲノムＤＮＡ上のエン
ドヌクレアーゼのアミノ末端の位置をマッピングした。
チラーゼ含有ＤＮＡの最小領域はＢｇｌＩＩ部位とＸｈ
ｏＩ部位との間に存在していた。従って、５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、
１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中の５μｇのｐ
ＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６を、４０単位のＢｇｌＩＩ及
び４０単位のＸｈｏＩによって１時間消化した。消化産
物を０．７％の低融点アガロースゲル上で泳動した。
１．２ＫｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをゲル
から切り出した。β−アガロースを用いて以下の手順で
ゲルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解
し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）と１ｍ
ＭのＥＤＴＡ中に導入した。６単位のβ−アガロースを
添加し、アガロースを４２℃で１時間消化した。４℃、
１５，０００×ｇで１５分間遠心することによって未消
化の糖質をペレット化した。ＤＮＡ含有上清に０．５Ｍ
のＮａＣｌを加え、２倍容のイソプロパノールを添加し
た。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却した後、１
５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを
７０％のイソプロパノールで洗浄して乾燥した。ＤＮＡ
を２０μｌのＴＥに再懸濁させた。１０μｌのＢｇｌＩ
Ｉ−ＸｈｏＩメチラーゼフラグメントを夫々ｐＵＣ１８
及びｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に結合し
た。これらの２つのメチラーゼサブクローンのＤＮＡ配
列を決定した。得られたＤＮＡ配列を図３に示す。 Ｄ．ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の調製、Ｓ
ｓｐＩエンドヌクレアーゼタンパク質の配列決定、及
び、ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼの位置のマッピング Ｄ−１．ＮＥＢ＃３１５と命名されたＳｐｈａｅｒｏｔ
ｉｌｕｓ種のＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、３７℃の
発酵槽中で、１０．０ｇ／リットルのトリプトンと、
５．０ｇ／リットルの酵母エキスと、２．０ｇ／リット
ルのＮａＣｌと、４．４ｇ／リットルのＫ２ＨＰＯ
４と、２．０ｇ／リットルのグルコースと、１０ｍｇ／
リットルのウシヘミンと、２．０ｍｇ／リットルのＮＡ
Ｄ；ＤＰＮとから成るＴＲＹ−ＹＥブイヨン培地中で増
殖させた。細胞を遠心によって収集し、細胞ペーストを
新鮮なうちに使用するかまたは−７０℃で保存した。以
後の段階はすべて４℃で行う。 Ｄ−２．細胞ペースト（２５３ｇ）を解凍し、細胞を５
００ｍｌの音波処理バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．６、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させる。 Ｄ−３．細胞をｇａｕｌｉｎミルによって破壊して懸濁
細胞１ｍｌあたり約３５ｍｇの可溶性タンパク質を遊離
させる。 Ｄ−４．１５，０００×ｇで４０分間遠心することによ
って不溶性細胞破片を除去する。 Ｄ−５．上清に５０ｇの細胞破片除去剤（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）を添加し、１０，０００×ｇで１０分間遠心する。 Ｄ−６．２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ６．９、５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ
で平衡させたホスホセルロースカラム（５×３５ｃｍ）
（ＷｈａｔｍａｎＰ−１１）に上清流体を加える。カラ
ムの２倍容の上記バッファでカラムを洗浄する。カラム
を素通りした流体を単一フラスコに収集する。ＳｓｐＩ
エンドヌクレアーゼはカラムに保持され、０．３〜０．
６ＭのＮａＣｌに溶出する。最も活性の画分をプール
し、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに対
して一夜透析する。 Ｄ−７．ホスホセルロースカラムから得られたプール
を、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ
で平衡させたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム
（２．５×２５ｃｍ）に導入し、カラムの２倍容の同じ
バッファで洗浄する。０．０５Ｍから０．８ＭまでのＮ
ａＣｌの直線勾配（総容量５００ｍｌ）を展開させ、カ
ラムに導入する。３ｍｌの画分が収集される。ラムダＤ
ＮＡに対する画分中のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ
の存在を検定する。活性画分をプールし、１００倍容の
２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、０．０５ｍＭの
ＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに透
析する。 Ｄ−８．透析したＳｓｐＩ活性のプール（２５ｍｌ）を
１ｍｌのＭｏｎｏ ＳＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に導入し、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．
４、０．０５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
１ｍＭのＤＴＴで洗浄し、同じバッファ中で５０ｍＭの
ＫＣｌから１．０ＭのＫＣｌまでの４０ｍｌの直線勾配
を展開させ、カラムに導入する。１ｍｌの画分を収集
し、ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の存在を検定
する。最も活性の４つの画分は均質であり、タンパク質
１ｍｇあたり比活性約１４０，０００単位を有し、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分子量３２，０００ダ
ルトンを有することが判明した。 Ｄ−９．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏ
ｄｅｌ ４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ｂｒ
ｏｏｋｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，１７：９７９−９９７，（１９８９））を用
い、４μｇの均質なＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのアミ
ノ末端タンパク質の配列を決定した。最初の３０個の残
基は分解していた。得られた最初の２５個の残基の配列
は以下の通りであった：ＳＫＡＡＹＱＤＦＴＫＸＳＬＬ
ＩＫＫＸＸＮＬＩＴＭ（配列番号１）（タンパク質配列
の１文字コードの説明に関しては表１を参照された
い）。 Ｄ−１０．タンパク質配列に基づいて、以下の配列をも
つ２個の１７ｍｅｒを作製した：５′ＧＣＮＧＣＮＴＡ
ＹＣＡＲＧＡＣＴＴ３’（配列番号２）及び５′ＧＣＮ
ＧＣＮＴＡＹＣＡＲＧＡＴＴＴ３’（配列番号３）（Ｙ
＝ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；
Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）。これらの１７ｍｅｒを使用
して、ＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕＳゲノムＤＮＡ上のエン
ドヌクレアーゼのアミノ末端の位置をマッピングした。
【００２９】オリゴマープローブを以下の手順でγ−３
２−Ｐによって末端標識した。５μｌのオリゴマープロ
ーブ（２５０ｎｇ）を、２０μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭ
のＤＴＴに再懸濁させる。５μｌのγ−３２−Ｐを添加
し、次いで１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添
加する。これを３７℃で３０分間インキュベートした。
２−Ｐによって末端標識した。５μｌのオリゴマープロ
ーブ（２５０ｎｇ）を、２０μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭ
のＤＴＴに再懸濁させる。５μｌのγ−３２−Ｐを添加
し、次いで１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添
加する。これを３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３０】サザンブロットを以下のごとく調製した。
１μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡをＡｓ
ｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢ
Ｉ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｖｏＲＶ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩ
によって消化した。消化物を０．７％のアガロースゲル
上で一夜泳動した。ゲルを０．２５ＭのＨＣｌで１５分
間ずつ２回洗浄し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５
ＭのＮａＣｌで夫々１５分間ずつ２回洗浄し、最後に１
ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで３０分間ず
つ２回洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移させ
るために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロース
シートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで
湿潤させ、ゲルと同寸法の１つの切片をゲルの片面に配
置した。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体
に上に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの
積層体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載
せ、一番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを
転移させた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキ
ングした。
１μｇのＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓゲノムＤＮＡをＡｓ
ｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢ
Ｉ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｖｏＲＶ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩ
によって消化した。消化物を０．７％のアガロースゲル
上で一夜泳動した。ゲルを０．２５ＭのＨＣｌで１５分
間ずつ２回洗浄し、次いで０．５ＭのＮａＯＨ、１．５
ＭのＮａＣｌで夫々１５分間ずつ２回洗浄し、最後に１
ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで３０分間ず
つ２回洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに転移させ
るために、細孔サイズ０．４５μｍのニトロセルロース
シートを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで
湿潤させ、ゲルと同寸法の１つの切片をゲルの片面に配
置した。これを高さ２インチのペーパータオルの積層体
に上に載せ、その上に別の２インチのペーパータオルの
積層体をかぶせた。積層体の上にガラスプレートを載
せ、一番上に小さい錘を載せた。一夜維持してＤＮＡを
転移させた。ニトロセルロースを８０℃で１時間ベーキ
ングした。
【００３１】ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５
０×デンハルト溶液（５００ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフ
ィコール、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳ
Ａ）、２０×ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．
３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、
１０％のＳＤＳ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレ
ハイブリダイズした。室温で１時間プレハイブリダイズ
した後、標識プローブを添加し、ハイブリダイゼーショ
ン段階を３７℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわ
たって３７℃の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを
加えた２×ＳＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィ
ルムに４日間及び７日間露光した。
０×デンハルト溶液（５００ｍｌのＨ２Ｏ中に５ｇのフ
ィコール、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのＢＳ
Ａ）、２０×ＳＳＣ（１リットルのＨ２Ｏ中の１７５．
３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム）、
１０％のＳＤＳ及び１０％の硫酸デキストラン中でプレ
ハイブリダイズした。室温で１時間プレハイブリダイズ
した後、標識プローブを添加し、ハイブリダイゼーショ
ン段階を３７℃で一夜実施した。ブロットを１時間にわ
たって３７℃の２×ＳＳＣで３回、０．１％のＳＤＳを
加えた２×ＳＳＣで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィ
ルムに４日間及び７日間露光した。
【００３２】このブロットから、ｐＳｓｐＩＭ１４．０
−Ｂ６クローンの地図、制限エンドヌクレアーゼの領域
のゲノム地図を作製した。図５は、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉ
ｌｕｓゲノム中のＳｓｐＩ制限／修飾系の領域の制限部
位の地図である。 ＩＩ．ＳｓｐＩ制限系のクローニング Ａ．ＭｃｒＡ−宿主中の新しいライブラリーの調製 Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＰＣＲプ
ライマーを設計した。Ｎ−末端用プライマーは以下の配
列：５’ＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ
ＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡ
ＣＡＣＡＡ３’（配列番号４）を有していた。Ｃ−末端
プライマーは以下の配列：５’ＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣ
ＧＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡ
３’（配列番号５）を有していた。ＳｓｐＩメチラーゼ
をｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６から以下のごとく増幅し
た。２ｎｇの鋳型ＤＮＡを、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭのｄＮＴＰ、プライ
マーに希釈し、１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ
を添加した。９５℃で１分間変性し、７２℃で１分間ア
ニーリングし、７５℃で２分間伸長させるサイクルをサ
ーマルサイクラー中で３５サイクル繰り返した。１．１
ＫｂのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をＴＥに対し
て１時間微量透析し、次いで１０μｌをＢｇｌＩＩ及び
ＸｈｏＩで以下のごとく消化した。１０μｌのＰＣＲ産
物に、２μｌの５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ
７．９、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、１
０ｍＭのＤＴＴと、４μｌのＨ２Ｏと、２４単位のＢｇ
ｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩとを添加し、３７℃で一
夜インキュベートした。
−Ｂ６クローンの地図、制限エンドヌクレアーゼの領域
のゲノム地図を作製した。図５は、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉ
ｌｕｓゲノム中のＳｓｐＩ制限／修飾系の領域の制限部
位の地図である。 ＩＩ．ＳｓｐＩ制限系のクローニング Ａ．ＭｃｒＡ−宿主中の新しいライブラリーの調製 Ａ−１．メチラーゼのＤＮＡ配列に基づいて、ＰＣＲプ
ライマーを設計した。Ｎ−末端用プライマーは以下の配
列：５’ＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ
ＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡ
ＣＡＣＡＡ３’（配列番号４）を有していた。Ｃ−末端
プライマーは以下の配列：５’ＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣ
ＧＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡ
３’（配列番号５）を有していた。ＳｓｐＩメチラーゼ
をｐＳｓｐＩＭ１４．０−Ｂ６から以下のごとく増幅し
た。２ｎｇの鋳型ＤＮＡを、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭのｄＮＴＰ、プライ
マーに希釈し、１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ
を添加した。９５℃で１分間変性し、７２℃で１分間ア
ニーリングし、７５℃で２分間伸長させるサイクルをサ
ーマルサイクラー中で３５サイクル繰り返した。１．１
ＫｂのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をＴＥに対し
て１時間微量透析し、次いで１０μｌをＢｇｌＩＩ及び
ＸｈｏＩで以下のごとく消化した。１０μｌのＰＣＲ産
物に、２μｌの５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ
７．９、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、１
０ｍＭのＤＴＴと、４μｌのＨ２Ｏと、２４単位のＢｇ
ｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩとを添加し、３７℃で一
夜インキュベートした。
【００３３】ベクターを以下のごとく調製した。５μｇ
のｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を、２０μｌ中の１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中でイ
ンキュベートし、２０単位のＢａｍＨＩと６０単位のＳ
ａｌＩとを添加した。消化物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。次にＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ
に再懸濁させた。
のｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を、２０μｌ中の１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中でイ
ンキュベートし、２０単位のＢａｍＨＩと６０単位のＳ
ａｌＩとを添加した。消化物を３７℃で１時間インキュ
ベートした。次にＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ
に再懸濁させた。
【００３４】プラスミドとＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ切断Ｐ
ＣＲ産物とを１６℃で一夜結合させた。増幅したメチラ
ーゼ構築物で大腸菌ＥＲ２２５２株を形質転換させ、コ
ンピテント細胞を調製した。（ｌａｃプロモーターの反
対方向に伸びる）ｐＵＣ１９中のメチラーゼは構築物ｐ
ＳｓｐＭ−Ａ８である。（ｌａｃプロモーターと同方向
に伸びる）ｐＵＣ１８中のメチラーゼは構築物ｐＳｓｐ
Ｍ−Ｂ５である。 Ａ−２．段階Ｉ（Ｄ−１０）で得られたデータに基づい
て、（段階Ｉ（Ａ−１）に記載のごとく調製された）精
製Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを、Ｓｐ
ｈＩまたはＸｈｏＩを用いて以下の手順で限定消化し
た。１０μｇのゲノムＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに希釈し、５０単位のＳｐｈ
ＩまたはＸｈｏＩと共に適当な管に導入した。管を３７
℃で１時間インキュベートし、次いでフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを５
０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０に再溶解させ、各１μｌの溶解物をアガ
ロースゲル電気泳動によって分析した。
ＣＲ産物とを１６℃で一夜結合させた。増幅したメチラ
ーゼ構築物で大腸菌ＥＲ２２５２株を形質転換させ、コ
ンピテント細胞を調製した。（ｌａｃプロモーターの反
対方向に伸びる）ｐＵＣ１９中のメチラーゼは構築物ｐ
ＳｓｐＭ−Ａ８である。（ｌａｃプロモーターと同方向
に伸びる）ｐＵＣ１８中のメチラーゼは構築物ｐＳｓｐ
Ｍ−Ｂ５である。 Ａ−２．段階Ｉ（Ｄ−１０）で得られたデータに基づい
て、（段階Ｉ（Ａ−１）に記載のごとく調製された）精
製Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを、Ｓｐ
ｈＩまたはＸｈｏＩを用いて以下の手順で限定消化し
た。１０μｇのゲノムＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに希釈し、５０単位のＳｐｈ
ＩまたはＸｈｏＩと共に適当な管に導入した。管を３７
℃で１時間インキュベートし、次いでフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを５
０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０に再溶解させ、各１μｌの溶解物をアガ
ロースゲル電気泳動によって分析した。
【００３５】ｐＡＣＹＣ１８４ベクターを以下の手順で
調製した。１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４を２００μｌの
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再
懸濁させた。４０単位のＳｐｈＩまたはＳａｌＩを添加
し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベートし、こ
こで４単位のｃｉｐを添加し、インキュベーションをさ
らに３０分間継続した。消化物をフェノール／クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを１００
μｌのＴＥに再懸濁させた。
調製した。１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４を２００μｌの
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再
懸濁させた。４０単位のＳｐｈＩまたはＳａｌＩを添加
し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベートし、こ
こで４単位のｃｉｐを添加し、インキュベーションをさ
らに３０分間継続した。消化物をフェノール／クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを１００
μｌのＴＥに再懸濁させた。
【００３６】結合を以下の手順で行った。ＳｐｈＩ切断
した１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳｐｈＩ切断した１０
μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合バッファ
（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）中で混
合し、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物
を１６℃で一夜インキュベートした。ＸｈｏＩ切断した
１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳａｌＩ切断し脱リン酸化
した１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合
バッファ中で混合した。１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加し、１６℃で一夜インキュベートした。Ａ−３．
ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５によって予め
保護されたＥＲ２２５２細胞を形質転換させる以外は段
階Ｉ（Ａ−４）の手順を用いて一次細胞ライブラリーを
調製した。一次細胞ライブラリーから得られたＤＮＡを
以下の制限酵素：ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、
ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓｐｈ
ＩまたはＸｈｏＩによって消化した。消化物を０．７％
のアガロースゲル上で一夜泳動した。段階Ｉ（Ｂ−３）
と同様にサザンブロッティング用ゲルを調製した。サザ
ンブロットを、段階Ｉ（Ｄ−１０）で使用したＳｓｐエ
ンドヌクレアーゼのＮ−末端用の２つの縮重オリゴによ
ってプローブした。サザンブロットからエンドヌクレア
ーゼ含有クローンは全く同定されなかった。 Ｂ．Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡの逆方
向ＰＣＲ Ｂ−１．ＰＣＲ用鋳型となるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ
種のＤＮＡを段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして調製した。
次いで、ＤＮＡをＳａｃＩＩによって以下の手順で消化
した。５μｇのゲノムＤＮＡを９５μｌの２０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−酢酸塩、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍ
Ｍの酢酸カリウム、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、５μ
ｌ（１００単位）のＳａｃＩＩを添加し、混合物を３７
℃で１時間インキュベートした。消化物をフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡペ
レットを５００μｌの１×リガーゼバッファ（５０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ
２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡ）に再懸濁させ、次いで１μｌのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを添加した。結合を１６℃で一夜進行させ
た。リガーゼを６５℃で１５分間熱失活させた。 Ｂ−２．逆方向ＰＣＲに使用したプライマーはメチラー
ゼ遣伝子内部のＤＮＡ配列に由来した。右回りの３０ｍ
ｅｒは以下の配列を有している：ＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴ
ＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号
６）。左回りのプライマーの配列はＴＴＧＧＴＣＡＣＴ
ＴＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＣＧ（配列番
号７）である。
した１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳｐｈＩ切断した１０
μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合バッファ
（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＡＴＰ）中で混
合し、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物
を１６℃で一夜インキュベートした。ＸｈｏＩ切断した
１０μｇのゲノムＤＮＡと、ＳａｌＩ切断し脱リン酸化
した１０μｇのｐＡＣＹＣ１８４とを、５０μｌの結合
バッファ中で混合した。１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加し、１６℃で一夜インキュベートした。Ａ−３．
ｐＳｓｐＭ−Ａ８またはｐＳｓｐＭ−Ｂ５によって予め
保護されたＥＲ２２５２細胞を形質転換させる以外は段
階Ｉ（Ａ−４）の手順を用いて一次細胞ライブラリーを
調製した。一次細胞ライブラリーから得られたＤＮＡを
以下の制限酵素：ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、
ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｅ
ｖｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓｐｈ
ＩまたはＸｈｏＩによって消化した。消化物を０．７％
のアガロースゲル上で一夜泳動した。段階Ｉ（Ｂ−３）
と同様にサザンブロッティング用ゲルを調製した。サザ
ンブロットを、段階Ｉ（Ｄ−１０）で使用したＳｓｐエ
ンドヌクレアーゼのＮ−末端用の２つの縮重オリゴによ
ってプローブした。サザンブロットからエンドヌクレア
ーゼ含有クローンは全く同定されなかった。 Ｂ．Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡの逆方
向ＰＣＲ Ｂ−１．ＰＣＲ用鋳型となるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ
種のＤＮＡを段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして調製した。
次いで、ＤＮＡをＳａｃＩＩによって以下の手順で消化
した。５μｇのゲノムＤＮＡを９５μｌの２０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−酢酸塩、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍ
Ｍの酢酸カリウム、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、５μ
ｌ（１００単位）のＳａｃＩＩを添加し、混合物を３７
℃で１時間インキュベートした。消化物をフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡペ
レットを５００μｌの１×リガーゼバッファ（５０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ
２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡ）に再懸濁させ、次いで１μｌのＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを添加した。結合を１６℃で一夜進行させ
た。リガーゼを６５℃で１５分間熱失活させた。 Ｂ−２．逆方向ＰＣＲに使用したプライマーはメチラー
ゼ遣伝子内部のＤＮＡ配列に由来した。右回りの３０ｍ
ｅｒは以下の配列を有している：ＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴ
ＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号
６）。左回りのプライマーの配列はＴＴＧＧＴＣＡＣＴ
ＴＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＣＧ（配列番
号７）である。
【００３７】ＳａｃＩＩ切断し再結合した１μｇのゲノ
ム鋳型（段階ＩＩ（Ｂ−１）に記載のごとく調製）を、
１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭ
ｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０
０μＭのｄＮＴＰ、プライマーと混合し、１単位のＶｅ
ｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを添加した。９５℃で１分間
変性し、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で４分
間伸長させるサイクルをサーマルサイクラー内で３０サ
イクル繰り返した。４ＫｂのＰＣＲ産物が観察された。 Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物を０．７％の低融点アガロ
ースゲル上で泳動した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出
し、ＮＥＢｌｏｔキットを用いて以下のごとくランダム
プライムした。ゲル切片は６５℃で溶解し、その測定容
量は７０μｌであった。１０μｌの１０×ランダムプラ
イミングバッファを添加し、２５０μモルのｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰを添加した。１μｌのＤＮＡ−ポ
リメラーゼＩ−クレノウフラグメントと５μｌの３２Ｐ
−７−ｄＣＴＰとを添加した。ランダムプライミング反
応を３７℃で６時間継続させた。ランダムプライムした
ＰＣＲ産物を使用して、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ
ＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩ
Ｉ、ＥｖｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、Ｐｖ
ｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩによって
消化したＳｓｐゲノムＤＮＡのサザンブロットをプロー
ブした。ハイブリダイゼーションを６８℃で一夜行っ
た。プロットを２×ＳＳＣで５回洗浄した。プロットを
Ｘ線フィルムに４時間露光し、次いで現像した。Ｓｓｐ
Ｉエンドヌクレアーゼの位置に対する逆方向ＰＣＲ産物
をマッピングした。 Ｂ−４．逆方向ＰＣＲ産物を以下の手順でｐＡＣＹＣ１
８４にクローニングした。最初に、ベクターをＥｃｏＲ
Ｖによって切断し、脱リン酸化した。８μｇのｐＡＣＹ
Ｃ１８４を１００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、６単位のＥｃｏＲＶ
を添加し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベート
した。１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼを添加し、反
応をさらに３０分間進行させた。ＤＮＡをフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。逆方向Ｐ
ＣＲによって得られたＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、
１００μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、６６μＭ
のｄＡＴＰ中で１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによってキナーゼ処理した。キナーゼ処理した逆方向
ＰＣＲ産物を次に、ＥｃｏＲＶ切断し脱リン酸化したｐ
ＡＣＹＣ１８４に以下の手順で結合した。ＥｃｏＲＶ切
断し脱リン酸化した１μｇのｐＡＣＹＣ１８４を、１×
リガーゼバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１
ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に懸濁させ
た。キナーゼ処理した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を、
８００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に添加した。結
合反応を室温で１時間進行させ、次いで５μｌを用い
て、ｐＳｓｐＭ−Ａ８及びｐＳｓｐＭ−Ｂ５で予め保護
したＥＲ２２５２細胞を形質転換させた（段階ＩＩ（Ａ
−１）と同様にして調製）。
ム鋳型（段階ＩＩ（Ｂ−１）に記載のごとく調製）を、
１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭ
ｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０
０μＭのｄＮＴＰ、プライマーと混合し、１単位のＶｅ
ｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを添加した。９５℃で１分間
変性し、６５℃で１分間アニーリングし、７２℃で４分
間伸長させるサイクルをサーマルサイクラー内で３０サ
イクル繰り返した。４ＫｂのＰＣＲ産物が観察された。 Ｂ−３．４ＫｂのＰＣＲ産物を０．７％の低融点アガロ
ースゲル上で泳動した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出
し、ＮＥＢｌｏｔキットを用いて以下のごとくランダム
プライムした。ゲル切片は６５℃で溶解し、その測定容
量は７０μｌであった。１０μｌの１０×ランダムプラ
イミングバッファを添加し、２５０μモルのｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰを添加した。１μｌのＤＮＡ−ポ
リメラーゼＩ−クレノウフラグメントと５μｌの３２Ｐ
−７−ｄＣＴＰとを添加した。ランダムプライミング反
応を３７℃で６時間継続させた。ランダムプライムした
ＰＣＲ産物を使用して、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ
ＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩ
Ｉ、ＥｖｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、Ｐｖ
ｕＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｈＩまたはＸｈｏＩによって
消化したＳｓｐゲノムＤＮＡのサザンブロットをプロー
ブした。ハイブリダイゼーションを６８℃で一夜行っ
た。プロットを２×ＳＳＣで５回洗浄した。プロットを
Ｘ線フィルムに４時間露光し、次いで現像した。Ｓｓｐ
Ｉエンドヌクレアーゼの位置に対する逆方向ＰＣＲ産物
をマッピングした。 Ｂ−４．逆方向ＰＣＲ産物を以下の手順でｐＡＣＹＣ１
８４にクローニングした。最初に、ベクターをＥｃｏＲ
Ｖによって切断し、脱リン酸化した。８μｇのｐＡＣＹ
Ｃ１８４を１００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、６単位のＥｃｏＲＶ
を添加し、消化物を３７℃で１．５時間インキュベート
した。１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼを添加し、反
応をさらに３０分間進行させた。ＤＮＡをフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。逆方向Ｐ
ＣＲによって得られたＳｓｐＩエンドヌクレアーゼを、
１００μｌの７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、６６μＭ
のｄＡＴＰ中で１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによってキナーゼ処理した。キナーゼ処理した逆方向
ＰＣＲ産物を次に、ＥｃｏＲＶ切断し脱リン酸化したｐ
ＡＣＹＣ１８４に以下の手順で結合した。ＥｃｏＲＶ切
断し脱リン酸化した１μｇのｐＡＣＹＣ１８４を、１×
リガーゼバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１
ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に懸濁させ
た。キナーゼ処理した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を、
８００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に添加した。結
合反応を室温で１時間進行させ、次いで５μｌを用い
て、ｐＳｓｐＭ−Ａ８及びｐＳｓｐＭ−Ｂ５で予め保護
したＥＲ２２５２細胞を形質転換させた（段階ＩＩ（Ａ
−１）と同様にして調製）。
【００３８】細胞をプレートから掻き取り、一次細胞ラ
イブラリーの場合と同様にしてＤＮＡを調製した（段階
Ｉ（Ａ−４））。ＤＮＡを以下の酵素：ＡｓｅＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｎｓｉ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ及びＸ
ｈｏＩで消化し、次いで０．７％のアガロースゲル上で
泳動し、サザンブロットした。サザンブロットを、配列
ＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＣＧ（配列番号８）をもつＳｓｐＩエンドヌクレ
アーゼのＣ−末端に特異的なキナーゼ処理した３０ｍｅ
ｒ（段階Ｉ（Ｄ−１０）に記載のごとくキナーゼ処理）
でプローブした。エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡは検出されなかった。 Ｂ−５．エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単
離するために、逆方向ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＢｇｌ
ＩＩによって切断した。１０μｌの逆方向ＰＣＲをＴＥ
に対して１時間微量透析した。次に、逆方向ＰＣＲ産物
を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭ
のＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ
に導入し、８単位のＢｇｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩ
を添加した。これを３７℃で１時間インキュベートし
た。６５℃で２０分間インキュベートすることによって
制限酵素を熱失活させた。これをＢａｍＨＩ及びＳａｌ
Ｉで切断しておいたｐＵＣ１９に結合した。ＢａｍＨＩ
及びＳａｌＩ切断した１００ｎｇのｐＵＣ１９をリガー
ゼバッファに再懸濁させた。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ切断
した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を添加し、４００単位
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。結合を１６℃で一
夜進行させた。２０μｌの結合産物でＥＲ２２６７を形
質転換し、８０ｎｇのＸ−ｇａｌ及び１０ｍＭのＩＰＴ
Ｇと共に５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有培地で平板
培養した。
イブラリーの場合と同様にしてＤＮＡを調製した（段階
Ｉ（Ａ−４））。ＤＮＡを以下の酵素：ＡｓｅＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｎｓｉ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ及びＸ
ｈｏＩで消化し、次いで０．７％のアガロースゲル上で
泳動し、サザンブロットした。サザンブロットを、配列
ＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＣＧ（配列番号８）をもつＳｓｐＩエンドヌクレ
アーゼのＣ−末端に特異的なキナーゼ処理した３０ｍｅ
ｒ（段階Ｉ（Ｄ−１０）に記載のごとくキナーゼ処理）
でプローブした。エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡは検出されなかった。 Ｂ−５．エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端半鎖を単
離するために、逆方向ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＢｇｌ
ＩＩによって切断した。１０μｌの逆方向ＰＣＲをＴＥ
に対して１時間微量透析した。次に、逆方向ＰＣＲ産物
を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭ
のＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ
に導入し、８単位のＢｇｌＩＩ及び２０単位のＸｈｏＩ
を添加した。これを３７℃で１時間インキュベートし
た。６５℃で２０分間インキュベートすることによって
制限酵素を熱失活させた。これをＢａｍＨＩ及びＳａｌ
Ｉで切断しておいたｐＵＣ１９に結合した。ＢａｍＨＩ
及びＳａｌＩ切断した１００ｎｇのｐＵＣ１９をリガー
ゼバッファに再懸濁させた。ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ切断
した２０μｌの逆方向ＰＣＲ産物を添加し、４００単位
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。結合を１６℃で一
夜進行させた。２０μｌの結合産物でＥＲ２２６７を形
質転換し、８０ｎｇのＸ−ｇａｌ及び１０ｍＭのＩＰＴ
Ｇと共に５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有培地で平板
培養した。
【００３９】いくつかの白色ヒロニーを採取し、１０ｍ
ｌの一夜培養物として増殖させた。これらの細胞をミニ
調製すると５０％がインサートを含むことが判明した。 Ｂ−６．インサートＤＮＡを含むと判断されたミニ調製
物（段階１１（Ｂ−５）で得られたもの）をＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩでマッピング
して、インサートがＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−
末端半鎖として正しい制限地図を有するか否かを判定し
た。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化物を得るためには、１
５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに
再懸濁させてミニ調製した１μｇのＤＮＡを２０単位の
ＢａｍＨＩまたは２０単位のＳａｌＩによって消化し
た。ＥｃｏＲＩ消化物を得るためには、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０２５％のトリトンＸ
−１００中で２０単位のＥｃｏＲＩによって消化した。
ＳａｃＩＩ消化物を得るためには、５０ｍＭの酢酸カリ
ウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７．９）、１
０ｍＭの酢酸マグネシウム及び１ｍＭのＤＴＴ中で２０
単位のＳａｃＩＩによって消化した。上記反応の各々で
はミニ調製した１μｇのＤＮＡを３７℃で１．５時間消
化した。マッピングしたインサートＤＮＡの半鎖はＳｓ
ｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端半鎖の正しい構造を
有していた。 Ｃ．ＰＣＲを用いた制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増
幅 Ｃ−１．ゲノムＤＮＡからＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子を直接増幅するために２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを設計した。遺伝子のＮ−末端用プライマー
は、段階Ｉ（Ｄ−９）で得られたような、遺伝子操作に
よって作製されたＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位を含む縮重
アミノ酸配列に基づいていた。Ｎ−末端オリゴの配列
は、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＶ
ＡＡＡＧＣＭＧＣＭＴＡＹＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡ（配
列番号９）（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｙ
＝ＣまたはＴ）である。Ｃ−末端用オリゴは、ＣＡＡＴ
ＴＴＴＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴ Ｇ
ＧＴＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧ（配列番号１
０）であった。 Ｃ−２．段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして、ＰＣＲ鋳型と
なるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを調製
した。鋳型となる１μｇのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭの
ＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、
１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、
０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭのｄ
ＮＴＰ及び１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ中に
再懸濁させた。９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間
のアニーリング及び７３℃で２分間の伸長から成るサイ
クルをサーマルサイクラー内で３０サイクル行った。完
全ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子に間違いないと考
えられる９００塩基対のＰＣＲ産物が主要産物として同
定された。
ｌの一夜培養物として増殖させた。これらの細胞をミニ
調製すると５０％がインサートを含むことが判明した。 Ｂ−６．インサートＤＮＡを含むと判断されたミニ調製
物（段階１１（Ｂ−５）で得られたもの）をＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩでマッピング
して、インサートがＳｓｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−
末端半鎖として正しい制限地図を有するか否かを判定し
た。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化物を得るためには、１
５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに
再懸濁させてミニ調製した１μｇのＤＮＡを２０単位の
ＢａｍＨＩまたは２０単位のＳａｌＩによって消化し
た。ＥｃｏＲＩ消化物を得るためには、５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０２５％のトリトンＸ
−１００中で２０単位のＥｃｏＲＩによって消化した。
ＳａｃＩＩ消化物を得るためには、５０ｍＭの酢酸カリ
ウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７．９）、１
０ｍＭの酢酸マグネシウム及び１ｍＭのＤＴＴ中で２０
単位のＳａｃＩＩによって消化した。上記反応の各々で
はミニ調製した１μｇのＤＮＡを３７℃で１．５時間消
化した。マッピングしたインサートＤＮＡの半鎖はＳｓ
ｐＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端半鎖の正しい構造を
有していた。 Ｃ．ＰＣＲを用いた制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増
幅 Ｃ−１．ゲノムＤＮＡからＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子を直接増幅するために２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを設計した。遺伝子のＮ−末端用プライマー
は、段階Ｉ（Ｄ−９）で得られたような、遺伝子操作に
よって作製されたＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位を含む縮重
アミノ酸配列に基づいていた。Ｎ−末端オリゴの配列
は、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＶ
ＡＡＡＧＣＭＧＣＭＴＡＹＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡ（配
列番号９）（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｙ
＝ＣまたはＴ）である。Ｃ−末端用オリゴは、ＣＡＡＴ
ＴＴＴＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴ Ｇ
ＧＴＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧ（配列番号１
０）であった。 Ｃ−２．段階Ｉ（Ａ−１）と同様にして、ＰＣＲ鋳型と
なるＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡを調製
した。鋳型となる１μｇのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭの
ＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、
１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｍＭのＭｇＳＯ４、
０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭのｄ
ＮＴＰ及び１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ中に
再懸濁させた。９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間
のアニーリング及び７３℃で２分間の伸長から成るサイ
クルをサーマルサイクラー内で３０サイクル行った。完
全ＳｓｐＩエンドヌクレアーゼ遺伝子に間違いないと考
えられる９００塩基対のＰＣＲ産物が主要産物として同
定された。
【００４０】９００ｂｐのＰＣＲ産物をＴＥに対して１
時間微量透析し、次いで、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ及び
ＢａｍＨＩでマッピングすることによって特性決定し
た。次にＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによって
以下のごとく消化した。７０μｌのＰＣＲ産物を１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに導
入し、４０単位のＢａｍＨＩと４０単位のＮｄｅＩとを
添加した。消化物を３７℃で１時間インキュベートし、
次いで１％の低融点アガロースゲル上で泳動した。バン
ドを切り出し、β−アガロースを用いて以下の手順でゲ
ルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解し、
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１ｍＭの
ＥＤＴＡに導入した。６単位のβ−アガラーゼを添加
し、アガロースを４２℃で１時間消化した。未消化の糖
質を４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心することに
よってペレット化した。ＤＮＡ含有上清を０．５ＭのＮ
ａＣｌに導入し、２倍容のイソプロパノールを添加し
た。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却し、その
後、１５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレ
ットを７０％イソプロパノールで洗浄し、乾燥した。Ｄ
ＮＡを２０μｌのＴＥに再懸濁させた。 Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中でのＰＣＲ産物のクローニ
ング Ｄ−１．５μｇのベクターｐＡＩＩ１７（ｐＥＴ１１ｃ
に由来のＴ７発現ベクター；Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ，Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９
３））を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、
１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ
のＤＴＴに再懸濁させた。６０単位のＮｄｅＩ及び８０
単位のＢａｍＨＩを添加し、混合物を３７℃で１時間イ
ンキュベートした。消化物を０．７％の低融点アガロー
スゲル上で泳動し、６．２Ｋｂのバンドをゲルから切り
出した。ゲルから得られたバンドを融解させ、段階ＩＩ
（Ｃ−２）と同様にβ−アガラーゼによってＤＮＡを回
収した。ＤＮＡペレットを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁さ
せた。
時間微量透析し、次いで、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ及び
ＢａｍＨＩでマッピングすることによって特性決定し
た。次にＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによって
以下のごとく消化した。７０μｌのＰＣＲ産物を１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴに導
入し、４０単位のＢａｍＨＩと４０単位のＮｄｅＩとを
添加した。消化物を３７℃で１時間インキュベートし、
次いで１％の低融点アガロースゲル上で泳動した。バン
ドを切り出し、β−アガロースを用いて以下の手順でゲ
ルからＤＮＡを回収した。ゲル切片を５５℃で融解し、
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１ｍＭの
ＥＤＴＡに導入した。６単位のβ−アガラーゼを添加
し、アガロースを４２℃で１時間消化した。未消化の糖
質を４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心することに
よってペレット化した。ＤＮＡ含有上清を０．５ＭのＮ
ａＣｌに導入し、２倍容のイソプロパノールを添加し
た。これを撹拌し、−２０℃で１５分間冷却し、その
後、１５，０００×ｇで１５分間遠心した。ＤＮＡペレ
ットを７０％イソプロパノールで洗浄し、乾燥した。Ｄ
ＮＡを２０μｌのＴＥに再懸濁させた。 Ｄ．ベクターｐＡＩＩ１７中でのＰＣＲ産物のクローニ
ング Ｄ−１．５μｇのベクターｐＡＩＩ１７（ｐＥＴ１１ｃ
に由来のＴ７発現ベクター；Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ，Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９
３））を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、
１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ
のＤＴＴに再懸濁させた。６０単位のＮｄｅＩ及び８０
単位のＢａｍＨＩを添加し、混合物を３７℃で１時間イ
ンキュベートした。消化物を０．７％の低融点アガロー
スゲル上で泳動し、６．２Ｋｂのバンドをゲルから切り
出した。ゲルから得られたバンドを融解させ、段階ＩＩ
（Ｃ−２）と同様にβ−アガラーゼによってＤＮＡを回
収した。ＤＮＡペレットを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁さ
せた。
【００４１】段階ＩＩ（Ｃ−２）で得られたＰＣＲ産物
を、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ切断したｐＡＩＩ１７に以下
のごとく結合した。ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断した
１μｇのＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断し
た１μｇのｐＡＩＩ１７とを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの
ＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡに再
懸濁させた、４００単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを
添加した。結合を１６℃で一夜進行させた。
を、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ切断したｐＡＩＩ１７に以下
のごとく結合した。ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断した
１μｇのＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断し
た１μｇのｐＡＩＩ１７とを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの
ＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのＢＳＡに再
懸濁させた、４００単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを
添加した。結合を１６℃で一夜進行させた。
【００４２】２μｌの結合産物を非プレ保護ＳｓｐＩメ
チラーゼと共に用いてＲＲ１を形質転換させ、また、同
じく２μｌを用いて同系メチラーゼの欠失したＥＲ２１
６９を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含
有培地で平板培養した。１８時間後、各プレートから９
６個のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン含有のマスタープレートで複製した。ＥＲ２１６９形
質転換体も１ｍＭのＩＰＴＧとアンピシリンとを含有す
るプレート上で複製した。１８時間後、ＩＰＴＧ上で増
殖させたＥＲ２１６９から複数のコロニーが溶解したこ
とが観察された。 Ｄ−２．ＥＲ２１６９プレートから採取した最初の１８
個のコロニーを１０ｍｌの一夜培養物として増殖させ
た。ＩＰＴＧの存在下でコロニーが溶解することが観察
されると、対応する１０ｍｌ培養物の１ｍｌを１０倍に
希釈し、対数増殖期の中期に１０ｍＭのＩＰＴＧで誘発
した。細胞培養物をＩＰＴＧの存在下で３時間増殖させ
た。１．５ｍｌの培養物を微量遠心管で遠心した。細胞
ペレットを４００μｌの２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。細胞
を１０秒間音波処理して破壊した。細胞破片を１５，０
００×ｇで５分間遠心した。ラムダＤＮＡに対する上清
のＳｓｐＩ活性を検定した。
チラーゼと共に用いてＲＲ１を形質転換させ、また、同
じく２μｌを用いて同系メチラーゼの欠失したＥＲ２１
６９を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含
有培地で平板培養した。１８時間後、各プレートから９
６個のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン含有のマスタープレートで複製した。ＥＲ２１６９形
質転換体も１ｍＭのＩＰＴＧとアンピシリンとを含有す
るプレート上で複製した。１８時間後、ＩＰＴＧ上で増
殖させたＥＲ２１６９から複数のコロニーが溶解したこ
とが観察された。 Ｄ−２．ＥＲ２１６９プレートから採取した最初の１８
個のコロニーを１０ｍｌの一夜培養物として増殖させ
た。ＩＰＴＧの存在下でコロニーが溶解することが観察
されると、対応する１０ｍｌ培養物の１ｍｌを１０倍に
希釈し、対数増殖期の中期に１０ｍＭのＩＰＴＧで誘発
した。細胞培養物をＩＰＴＧの存在下で３時間増殖させ
た。１．５ｍｌの培養物を微量遠心管で遠心した。細胞
ペレットを４００μｌの２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。細胞
を１０秒間音波処理して破壊した。細胞破片を１５，０
００×ｇで５分間遠心した。ラムダＤＮＡに対する上清
のＳｓｐＩ活性を検定した。
【００４３】ＳｓｐＩ活性のアッセイは以下の順で行っ
た。１μｇのラムダＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍ
ＭのＤＴＴに総量２０μｌに希釈した。音波処理細胞か
ら得られた１μｌの上清を添加し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。消化物を０．７％アガロースゲル上
で泳動した。７つの粗細胞抽出物のうち６つでＳｓｐＩ
活性が検出された。図８はＳｓｐＩ制限エンドヌクレア
ーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。ＳｓｐＩ
活性を有するプラスミドを増殖させ、ＣｓＣｌ調製し、
ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ３、ｐ（ｐＡＩ
Ｉ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ９、ｐ（ｐＡＩＩ１７）−
ＳｓｐＲ７．２−Ａ１０、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ
７．２−Ａ１２、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−
Ｂ１及びｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ６と命
名する。
た。１μｇのラムダＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍ
ＭのＤＴＴに総量２０μｌに希釈した。音波処理細胞か
ら得られた１μｌの上清を添加し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。消化物を０．７％アガロースゲル上
で泳動した。７つの粗細胞抽出物のうち６つでＳｓｐＩ
活性が検出された。図８はＳｓｐＩ制限エンドヌクレア
ーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。ＳｓｐＩ
活性を有するプラスミドを増殖させ、ＣｓＣｌ調製し、
ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ３、ｐ（ｐＡＩ
Ｉ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ａ９、ｐ（ｐＡＩＩ１７）−
ＳｓｐＲ７．２−Ａ１０、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ
７．２−Ａ１２、ｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−
Ｂ１及びｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ６と命
名する。
【００４４】プラスミドｐ（ｐＡＩＩ１７）ＳｓｐＲ
７．２−Ｂ１はブダペスト条約の規約に従って１９９４
年１０月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、
ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．で受託された。
７．２−Ｂ１はブダペスト条約の規約に従って１９９４
年１０月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、
ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．で受託された。
【００４５】表１はアミノ酸配列の１文字コードの説明
である。
である。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１１ 他の情報：１１位のＸ＝任意のアミノ酸 配列の特徴 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１８ 他の情報：１８位のＸ＝ｓｅｒまたはＨｉｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１９ 他の情報：１９位のＸ＝任意のアミノ酸 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：４ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：９ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：２０６１ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：オリゴヌクレオチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２．．６４４ 他の情報：これはエンドヌクレアーゼのＣ−末端部分を
示す 配列
示す 配列
【００４８】
【化１】
【００４９】
【化２】 配列番号：１２ 配列の長さ：２１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５０】
【化３】 配列番号：１３ 配列の長さ：２０６１ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６１５．．１７８０ 他の情報：これは完全メチラーゼに対応する 配列
【００５１】
【化４】
【００５２】
【化５】
【００５３】
【化６】 配列番号：１４ 配列の長さ：３８８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５４】
【化７】
【００５５】
【化８】
【００５６】
【化９】 配列番号：１５ 配列の長さ：２０９ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２０９ 配列
【００５７】
【化１０】 配列番号：１６ 配列の長さ：６９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５８】
【化１１】 配列番号：１７ 配列の長さ：２０９ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２０９ 配列
【００５９】
【化１２】 配列番号：１８ 配列の長さ：６９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００６０】
【化１３】 配列番号：１９ 配列の長さ：２０９ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２０９ 配列
【００６１】
【化１４】 配列番号：２０ 配列の長さ：６９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００６２】
【化１５】 配列番号：２１ 配列の長さ：２０９ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２０９ 配列
【００６３】
【化１６】 配列番号：２２ 配列の長さ：６９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００６４】
【化１７】
【図１】ＳｓｐＩ制限メチラーゼのクローニングスキー
ムの概略図である。
ムの概略図である。
【図２】ＢｇｌＩＩクローンの欠失を伴うＳｓｐＩメチ
ラーゼをコードする９．６ＫｂのＢｇｌＩＩフラグメン
トの制限地図である。
ラーゼをコードする９．６ＫｂのＢｇｌＩＩフラグメン
トの制限地図である。
【図３Ａ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である。
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である。
【図３Ｂ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ａの配列の続き）。
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ａの配列の続き）。
【図３Ｃ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ｂの配列の続き）。
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ｂの配列の続き）。
【図３Ｄ】エンドヌクレアーゼのＣ−末端部分のＤＮＡ
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ｃの配列の続き）。
配列（配列番号１１及び配列番号１３）及び対応するア
ミノ酸配列（配列番号１２）とＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩメ
チラーゼサブクローンの完全メチラーゼのアミノ酸配列
（配列番号１４）である（図３Ｃの配列の続き）。
【図４】ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生スキー
ムを示す。
ムを示す。
【図５】Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ種のゲノムＤＮＡの
メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の領域
のマップである。
メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の領域
のマップである。
【図６】ＳａｃＩＩ切断し再結合したゲノムＤＮＡに対
する逆方向ＰＣＲのスキームである。
する逆方向ＰＣＲのスキームである。
【図７】エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接増幅するため
に使用されたＰＣＲプライマーが由来した場所を示す地
図である。
に使用されたＰＣＲプライマーが由来した場所を示す地
図である。
【図８】プラスミドｐＡＩＩ１７中のエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を保有する大腸菌ＥＲ２１６９の細胞抽出物中
のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロー
スゲル電気泳動の写真である。
ゼ遺伝子を保有する大腸菌ＥＲ２１６９の細胞抽出物中
のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロー
スゲル電気泳動の写真である。
【図９】調製された種々のライブラリーの一覧表であ
る。
る。
【図１０Ａ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクロー
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である。
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である。
【図１０Ｂ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクロー
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ａの配列の続き）。
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ａの配列の続き）。
【図１０Ｃ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクロー
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ｂの配列の続き）。
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ｂの配列の続き）。
【図１０Ｄ】ＳｓｐＩ活性を有する４つの異なるクロー
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ｃの配列の続き）。
ンのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列（Ａ９＝配列
番号１５、１６、Ａ１０＝配列番号１７、１８、Ａ１２
＝配列番号１９、２０、及び、Ｂ１＝配列番号２１、２
２）である（図１０Ｃの配列の続き）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 単離ＤＮＡがベクターｐ（ｐＡＩＩ１
７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１から得られうることを特徴と
するＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントが挿入されたベクターから成る
組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 単離ＤＮＡがベクターｐ（ｐＡＩＩ１
７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１から得られうることを特徴と
するＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼを
コードする単離ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離ＤＮＡを含むクロ
ーニングベクター。 - 【請求項５】 クローニングベクターがｐ（ｐＡＩＩ１
７）ＳｓｐＲ７．２−Ｂ１から成ることを特徴とする請
求項４に記載のクローニングベクター。 - 【請求項６】 請求項２、４または５に記載のクローニ
ングベクターによって形質転換された宿主細胞。 - 【請求項７】 請求項２、４または５に記載のクローニ
ングベクターによって形質転換された宿主細胞をエンド
ヌクレアーゼの発現に適した条件下に培養することを包
含するＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US319621 | 1981-11-09 | ||
| US08/319,621 US5516678A (en) | 1994-10-06 | 1994-10-06 | Method for producing the SSPI restriction endonuclease and methylase |
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|---|---|
| US (1) | US5516678A (ja) |
| EP (1) | EP0707066B1 (ja) |
| JP (1) | JP3963971B2 (ja) |
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| US6025179A (en) * | 1998-08-31 | 2000-02-15 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the SnaBI restriction endonuclease and purification of the recombinant SnaBI restriction endonuclease |
| US8227231B2 (en) | 2005-08-04 | 2012-07-24 | New England Biolabs, Inc. | Restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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- 1994-10-06 US US08/319,621 patent/US5516678A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-06 DE DE69514477T patent/DE69514477T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-06 JP JP29632295A patent/JP3963971B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-06 EP EP95307106A patent/EP0707066B1/en not_active Expired - Lifetime
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| EP0707066A2 (en) | 1996-04-17 |
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