JPH08259598A - Prepared material of rice, its production and detection of rice allergen antibody - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain a prepared material of rice by fractionating an extract produced by extracting rice with an aqueous medium, fractionating the extract based on the molecular weight of a protein contained in it and combining the fractions based on their molecular weights, capable of detecting a rice allergen antibody in high sensitivity. CONSTITUTION: Polished rice such as KOSIHIKARI as a variety of rice is ground by using a grinder, passed through a sieve of 200μm to give rice flour, which is put in a triangular flask and extracted with diethyl ether. The extracted solution is centrifuged, the supernatant liquid is removed, the rice flour as the precipitate is air-dried to give de-fatted rice flour. Then, the de-fatted rice flour is stirred with a solution of a salt such as 500mM aqueous solution of sodium chloride or water for 1 hour, centrifuged, the supernatant liquid is collected to give an extracted solution of rice allergen. Then, the extracted solution is treated by gel filtration chromatography or ion exchange chromatography, fractionated based on molecular weight of protein and the fractions are combined to give the objective prepared material of rice having the ratio of protein amount with <25KD molecular weight/protein amount with >=25KD molecular weight of <=4.0.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、米調製物、その製造方
法、及び米アレルゲン抗体の検出方法に関する。本発明
による米調製物を用いると、被検試料（例えば、血清）
中の米アレルゲン抗体を、従来より特異性が高く、高感
度で、少量の被検試料を用いて検出することができ、米
アレルギーの診断を効率的に行うことができる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a rice preparation, a method for producing the same, and a method for detecting rice allergen antibodies. With the rice preparation according to the invention, test samples (eg serum)
The rice allergen antibody can be detected with high specificity, high sensitivity, and a small amount of test sample, and rice allergy can be efficiently diagnosed.

【０００２】[0002]

【従来の技術】食物アレルギーは食物の摂取によって引
き起こされる有害な免疫反応であり、皮膚炎、胃腸障
害、アナフィラキシーショック又は喘息などの症状を呈
する。近年では、このような食物アレルギー患者の増加
や症状の重症化が認められ、また同時に原因となる食物
アレルゲンが広がり、より多くの食物によって症状が引
き起こされる食物アレルギーの多重化傾向という特徴が
患者に認められている。このような状況の中で、卵、牛
乳又は大豆アレルギー患者に加えて小麦又は米アレルギ
ー患者も増加しており、各々のアレルギー患者において
アレルギー症状誘発の原因となる食物アレルゲンを迅速
かつ的確に感度よく検出し同定することは、難治化又は
多重化するアレルギーの治療にとって益々重要な意味を
持つようになっている。2. Description of the Related Art Food allergy is a harmful immune reaction caused by ingestion of food and exhibits symptoms such as dermatitis, gastrointestinal disorders, anaphylactic shock or asthma. In recent years, an increase in the number of patients with food allergies and aggravation of symptoms have been observed, and at the same time, the causative food allergens have spread, and patients are characterized by the tendency to multiple food allergies, which causes symptoms due to more food. It recognized. In such a situation, in addition to egg, milk or soybean allergy patients, wheat or rice allergy patients are also increasing, and food allergens that cause allergic symptoms are rapidly and accurately detected in each allergy patient with high sensitivity. Detecting and identifying is becoming increasingly important for the treatment of refractory or multiplex allergies.

【０００３】食物アレルゲンの同定方法は、従来から、
医師による患者への問診、食物除去負荷試験、皮膚テス
ト又は特異ＩｇＥ抗体の検出など多くの方法がある。近
年ではこれらの検査に加えてＩｇＧ４抗体の検出、リン
パ球のＩＬ２（インターロイキン２）反応性試験又はヒ
スタミン遊離試験も診断に有効とされている。特異Ｉｇ
Ｅ抗体やＩｇＧ４抗体の検出、リンパ球のＩＬ２反応性
試験又はヒスタミン遊離試験などは、患者の血液成分と
食物アレルゲンとの反応性を試験管内で検査する方法で
あり、患者に対する苦痛も食物負荷試験に比較すると少
なく、安全性が高いため今日では主要な検査方法となり
つつある。米アレルギーの診断は、米に対するＩｇＥ抗
体やＩｇＧ４抗体が血液中に存在するか否か、米アレル
ゲンに対してＩＬ２反応性が存在するか否か、米アレル
ゲンによりヒスタミン遊離があるか否かにより判定され
る。Conventional methods for identifying food allergens are as follows:
There are many methods such as a doctor's interview with a patient, a food elimination load test, a skin test, or detection of a specific IgE antibody. In recent years, in addition to these tests, detection of IgG4 antibody, IL2 (interleukin 2) reactivity test of lymphocytes, or histamine release test has been validated. Peculiar Ig
Detection of E antibody and IgG4 antibody, IL2 reactivity test of lymphocytes, histamine release test and the like are methods for in vitro testing the reactivity of blood components of a patient with food allergens, and the patient's pain and food load test. Compared to, it is becoming less and less important and is becoming a major inspection method today. Diagnosis of rice allergy is judged by whether IgE antibody or IgG4 antibody against rice is present in blood, whether IL2 reactivity to rice allergen is present, or whether histamine release is caused by rice allergen. To be done.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】米アレルギーの診断に
必要な米特異ＩｇＥ抗体や米アレルゲンに感作されたリ
ンパ球又はヒスタミンを遊離する肥満細胞や好塩基球細
胞は、生体内にごく微量にしか含まれていないため、高
感度でアレルギー反応を検出することが必要である。ア
レルギーをより早期に確実に診断することが望まれると
ともに、採血は患者に対する苦痛を伴うため、より少量
の血液にて検査することが望まれる。そのため試験管内
アレルギー検査法の検出感度の向上が重要な課題となっ
ている。アレルゲン特異ＩｇＥ抗体やＩｇＧ４抗体の検
出感度は、特異性のより高い２次抗体、すなわち、抗ヒ
トＩｇＥ抗体や抗ヒトＩｇＧ４抗体の利用、ラジオアイ
ソトープの利用、超高感度で検出可能な酵素基質や蛍光
試薬の利用等により、向上させることが可能である。こ
れらの方法はアレルゲン分子と患者血液が反応した後、
その反応を増幅して検出する方法であり、アレルゲン診
断の感度向上に有効な方法である。しかし、非特異的な
反応も増幅され、感度が高くても特異性が低下するとい
う欠点も存在している。一方、アレルゲンと患者血液成
分（ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ４抗体又はリンパ球）との結合
反応自身を高めることは、感度及び特異性の両面を向上
させるのに有効であると考えられる。しかし、これまで
にこの考え方に基づく検討は十分に行われていない。[Problems to be Solved by the Invention] The amount of mast cells and basophil cells that release histamine-sensitized lymphocytes or histamine sensitized to rice-specific IgE antibodies or rice allergens necessary for the diagnosis of rice allergy are very small in vivo. Therefore, it is necessary to detect allergic reactions with high sensitivity. It is desirable to diagnose allergy earlier and surely, and blood sampling is painful to the patient, so it is desirable to test with a smaller amount of blood. Therefore, improving the detection sensitivity of the in vitro allergy test method has become an important issue. The detection sensitivity of the allergen-specific IgE antibody or IgG4 antibody is higher than that of a secondary antibody having a higher specificity, that is, the use of an anti-human IgE antibody or an anti-human IgG4 antibody, the use of a radioisotope, or an enzyme substrate that can be detected with ultra-high sensitivity. It can be improved by using a fluorescent reagent or the like. These methods involve the reaction of the patient's blood with the allergen molecule,
It is a method of amplifying and detecting the reaction and is an effective method for improving the sensitivity of allergen diagnosis. However, there is a drawback that nonspecific reaction is also amplified and specificity is lowered even if sensitivity is high. On the other hand, enhancing the binding reaction itself between an allergen and a blood component of a patient (IgE antibody, IgG4 antibody or lymphocyte) is considered to be effective in improving both sensitivity and specificity. However, studies based on this idea have not been sufficiently conducted so far.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】米はアトピー性皮膚炎の
重症化に関与した食物アレルゲンであり、特に毎日摂取
する食物であることから、的確にその診断を行い、対処
することが臨床上きわめて重要である。本発明者は、感
度及び特異性が高く、しかも少量の血清試料にて米アレ
ルギーの診断を行うことを鋭意検討した結果、米アレル
ゲンと患者血液成分（ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ４抗体又はリ
ンパ球）との結合反応が従来よりも高められた米アレル
ゲンを用いて試験管内検査を行うことで、米アレルギー
の診断を効率よく行うことができることを見い出した。
従って、本発明は、分子量２５ＫＤ未満のタンパク質量
／分子量２５ＫＤ以上のタンパク質量の比が４．０以
下、好ましくは２．０以下、更に好ましくは１．０以下
であることを特徴とする、米調製物に関する。また、本
発明、米を塩溶液又は水によって抽出して得た抽出物
を、その中に含まれるタンパク質の分子量に基づいて分
画し、得られた各分画をタンパク質の分子量に基づいて
組み合わせることを特徴とする、前記の米調製物の製造
方法にも関する。更に、本発明は、前記の米調製物と被
検試料とを接触させ、生成される抗原抗体反応生成物を
検出することを特徴とする、被検試料内の米アレルゲン
抗体の検出方法にも関する。[Means for Solving the Problems] Rice is a food allergen involved in the aggravation of atopic dermatitis, and since it is a food that is especially consumed daily, it is extremely clinically important to accurately diagnose and deal with it. is important. The present inventor has conducted a diligent study to diagnose rice allergy with a small amount of serum sample having high sensitivity and specificity. As a result, it was found that rice allergen and patient blood components (IgE antibody, IgG4 antibody or lymphocyte) It was found that rice allergens can be efficiently diagnosed by performing in vitro tests using rice allergens having a higher binding reaction than before.
Therefore, the present invention is characterized in that the ratio of the amount of protein having a molecular weight of less than 25 KD / the amount of protein having a molecular weight of 25 KD or more is 4.0 or less, preferably 2.0 or less, more preferably 1.0 or less. Regarding the preparation. Further, according to the present invention, an extract obtained by extracting rice with a salt solution or water is fractionated based on the molecular weight of the protein contained therein, and the obtained fractions are combined based on the molecular weight of the protein. It also relates to the method for producing a rice preparation as described above, characterized in that Furthermore, the present invention also relates to a method for detecting a rice allergen antibody in a test sample, which comprises contacting the rice preparation with a test sample to detect an antigen-antibody reaction product produced. Concerned.

【０００６】以下、本発明について具体的に説明する。
本発明による米調製物は、米タンパク質組成を変化さ
せ、分子量２５ＫＤ未満のタンパク質（以下、軽量タン
パク質と称することがある）量と分子量２５ＫＤ以上の
タンパク質（以下、重量タンパク質と称することがあ
る）量とを特定の重量比とすることにより、血清などの
試料中に含まれている米アレルゲン抗体との特異的反応
性を向上させたものである。前記の比は、米から抽出処
理などにより軽量タンパク質を比較的多く除去ないし軽
減することによって調整してもよく、あるいは、米から
抽出処理などによって得た特定分子量範囲のタンパク質
を含む調製物を適宜混合して調整してもよい。The present invention will be specifically described below.
The rice preparation according to the present invention changes the composition of rice protein, and has an amount of protein having a molecular weight of less than 25 KD (hereinafter, may be referred to as lightweight protein) and an amount of protein having a molecular weight of 25 KD or more (hereinafter, may be referred to as heavy protein). By using a specific weight ratio of and, the specific reactivity with the rice allergen antibody contained in the sample such as serum is improved. The above ratio may be adjusted by removing or reducing a relatively large amount of light-weight protein from rice by an extraction treatment or the like, or a preparation containing a protein of a specific molecular weight range obtained from rice by an extraction treatment is appropriately used. You may adjust by mixing.

【０００７】本明細書において米とは、米の種実（即
ち、穀粒）から殻を取り、玄米又は白米を調製処理（例
えば、粉砕、膨化又は糊化）したものである。必要によ
り、更にエーテル類による脱脂処理を行ってもよい。本
発明による米調製物は、例えば、米を塩溶液又は水によ
って抽出して得た抽出物を、その中に含まれるタンパク
質の分子量に基づいて分画し、得られた各分画を再構成
することによって製造することができる。In the present specification, rice is obtained by removing shells from seeds (ie, grains) of rice and preparing (eg, crushing, puffing or gelatinizing) brown rice or white rice. If necessary, degreasing treatment with ethers may be further performed. In the rice preparation according to the present invention, for example, an extract obtained by extracting rice with a salt solution or water is fractionated based on the molecular weight of the protein contained therein, and each obtained fraction is reconstituted. Can be manufactured.

【０００８】塩水抽出物を得るために使用する塩として
は、無機酸（例えば、塩酸、硫酸又はリン酸）とアルカ
リ金属又はアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム）との塩を用いるこ
とができ、特に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マ
グネシウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム
又は各種のリン酸塩が好ましく、これらを単独で又は併
用することができる。塩水溶液の濃度は、３Ｍ以下、特
に１Ｍ以下であることが望ましい。３Ｍより濃度の高い
塩水溶液を用いると、アレルゲンとなるタンパク質の溶
出が十分でなくなり、しかも脱塩処理が煩雑になるので
好ましくない。The salt used to obtain the brine extract is a salt of an inorganic acid (for example, hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid) and an alkali metal or an alkaline earth metal (for example, sodium, potassium, calcium, magnesium). In particular, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sodium sulfate, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium polyphosphate or various phosphates are preferable, and these may be used alone or in combination. it can. The concentration of the salt aqueous solution is preferably 3M or less, and particularly preferably 1M or less. It is not preferable to use an aqueous salt solution having a concentration higher than 3 M, since the eluate of the protein serving as an allergen will be insufficient and the desalting treatment will be complicated.

【０００９】具体的には、米粉末に、場合により０〜
１，０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む水又はＰＢＳ
（phosphate buffered saline ）、あるいは、場合によ
り０〜１，０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む各種のバ
ッファー、例えば、０〜２００ｍＭのリン酸バッファ
ー、０〜４００ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸
塩バッファー（ｐＨ７．０〜１０．０）又は０〜４００
ｍＭの炭酸バッファー（ｐＨ８．０〜１２．０）を、例
えば米粉に対して３〜１００重量倍量で加え、１０分〜
２４時間、好ましくは１〜１６時間撹拌し、その後静置
又は遠心分離し、得られた上清をそのまま米アレルゲン
抽出液として用いることができる。[0009] Specifically, rice powder may be added with 0 to
Water or PBS containing 1,000 mM sodium chloride
(Phosphate buffered saline), or various buffers optionally containing 0 to 1,000 mM sodium chloride, for example, 0 to 200 mM phosphate buffer, 0 to 400 mM trishydroxyaminomethane hydrochloride buffer (pH 7.0 to 10) .0) or 0-400
mM carbonate buffer (pH 8.0 to 12.0) is added, for example, in an amount of 3 to 100 times the weight of rice flour, and 10 minutes to
The mixture is stirred for 24 hours, preferably 1 to 16 hours, and then left standing or centrifuged, and the obtained supernatant can be used as it is as a rice allergen extract.

【００１０】あるいは、その上清を再度、場合により０
〜１，０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む水、リン酸バ
ッファー、ＰＢＳ、０〜４００ｍＭトリスヒドロキシア
ミノメタン塩酸塩バッファー（ｐＨ７．０〜１０．０）
又は０〜４００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ８．０〜１
２．０）に透析し、その上清を米アレルゲン抽出液とし
て用いることができる。更に、いずれの米アレルゲン抽
出物も水に透析して凍結乾燥し、上記各種溶液にタンパ
ク質濃度で０．００１〜２００ｍｇ／ｍｌとなるように
再溶解させ、タンパク質濃度を調整した米アレルゲン抽
出液を得ることができる。Alternatively, the supernatant is again used, and if necessary, 0
Water containing ~ 1000 mM sodium chloride, phosphate buffer, PBS, 0-400 mM trishydroxyaminomethane hydrochloride buffer (pH 7.0-10.0)
Or 0-400 mM carbonate buffer (pH 8.0-1
It can be dialyzed to 2.0) and the supernatant can be used as a rice allergen extract. Furthermore, any rice allergen extract was dialyzed against water, freeze-dried, and redissolved in each of the above-mentioned solutions to a protein concentration of 0.001 to 200 mg / ml. Obtainable.

【００１１】これらの米アレルゲン抽出液を、次に、タ
ンパク質の分子量の大きさで分画する方法を用いて処理
する。例えば、電気泳動法（特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法）、分子量分画を行うことのできるフィルターによる
濾過、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー等によっ
て分画する。ゲル濾過クロマトグラフィーの担体として
は、無機化合物、合成樹脂、多糖類など広範囲の担体が
使用可能であり、アガロースゲル、ポリアクリルアミド
ゲル、多糖類の化学修飾物質など分子ふるいによってタ
ンパク質を分子量に応じて分画することができるものな
らばいずれでもよい。このほか、前記の米アレルゲン抽
出物にケトン類（例えば、アセトン）、エーテル類（例
えば、ジエチルエーテル）、ハロゲン化炭化水素類（例
えば、クロロホルム）、又はアルコール類（例えば、メ
タノール、エチルアルコール、ブタノール、アミルアル
コール）などの有機溶媒、グアニジン塩酸塩水溶液、あ
るいは硫酸アンモニウム水溶液の一定量を加え、特定の
分子量のタンパク質を選択的に沈殿させることにより分
画することができる。These rice allergen extracts are then treated using a method of fractionating by the molecular weight of the protein. For example, electrophoresis (especially SDS-PAGE)
Method), filtration through a filter capable of performing molecular weight fractionation, centrifugation, gel filtration chromatography, etc. As a carrier for gel filtration chromatography, a wide range of carriers such as inorganic compounds, synthetic resins, and polysaccharides can be used.Agarose gel, polyacrylamide gel, chemical modifiers for polysaccharides, etc. Any one can be used as long as it can be fractionated. In addition to the rice allergen extract, ketones (eg, acetone), ethers (eg, diethyl ether), halogenated hydrocarbons (eg, chloroform), or alcohols (eg, methanol, ethyl alcohol, butanol) may be added. , Amyl alcohol) or the like, an aqueous solution of guanidine hydrochloride or an aqueous solution of ammonium sulfate, and a protein having a specific molecular weight is selectively precipitated to fractionate the protein.

【００１２】また、上記抽出物をイオン交換クロマトグ
ラフィー担体に吸着させてから、溶出させ、米アレルゲ
ン抽出液中のタンパク質を分子量に応じて分画すること
ができる。イオン交換クロマトグラフィー担体として
は、陽イオン、陰イオン交換体のいずれも使用すること
ができ、無機化合物、合成樹脂又は多糖類など広範囲に
使用可能である。解離基の種類も制限はなく、ＤＥＡＥ
（ジエチルアミノエチール基）、ＡＥ（アミノエチール
基）、ＱＡＥ（４アミノエチール基）、ＣＭ（カルボキ
シメチール基）、ＳＰ（サルフォプロピル基）など一般
的なものを使用することができる。担体に吸着した米ア
レルゲンタンパク質の溶出は、塩化ナトリウム水溶液な
どイオン強度を上昇させる効果のある塩溶液によるイオ
ン強度の変化や溶媒のｐＨ変化によって溶出させ、分画
することができる。The extract can be adsorbed on an ion exchange chromatography carrier and then eluted to fractionate the protein in the rice allergen extract according to its molecular weight. As the ion exchange chromatography carrier, either a cation or an anion exchanger can be used, and a wide range of inorganic compounds, synthetic resins or polysaccharides can be used. There is no limitation on the type of dissociating group, and DEAE
(Diethylaminoethyl group), AE (aminoethyl group), QAE (4 aminoethyl group), CM (carboxymethyl group), SP (sulfopropyl group), and other general ones can be used. The rice allergen protein adsorbed on the carrier can be eluted and fractionated by changing the ionic strength with a salt solution having an effect of increasing the ionic strength such as an aqueous sodium chloride solution or changing the pH of the solvent.

【００１３】また、逆相クロマトグラフィー担体により
米アレルゲン抽出物を分画することができる。すなわ
ち、米アレルゲン抽出物をアセトニトリルやイソプロパ
ノールなどの有機溶媒の０〜１０％水溶液に溶解し、市
販の無極性の多孔質ポリマーに吸着させる。担体に吸着
した米アレルゲン抽出物は米アレルゲン抽出物の溶解又
はカラムへの吸着に使用した水溶液中の有機溶媒の濃度
を上昇させることで疎水性を変化させ、吸着したタンパ
ク質を溶出させ、分画することができる。溶媒のｐＨ
は、酸性側からアルカリ性まで幅広く使用可能である。Further, the rice allergen extract can be fractionated by a reversed phase chromatography carrier. That is, the rice allergen extract is dissolved in a 0 to 10% aqueous solution of an organic solvent such as acetonitrile or isopropanol and adsorbed on a commercially available nonpolar porous polymer. The rice allergen extract adsorbed on the carrier changes the hydrophobicity by increasing the concentration of the organic solvent in the aqueous solution used to dissolve the rice allergen extract or adsorb it to the column, elute the adsorbed protein, and fractionate it. can do. PH of solvent
Can be widely used from acidic to alkaline.

【００１４】以上のような方法で得られた分画物は、そ
のままで、あるいは各種溶液に対して透析したもの、あ
るいは凍結乾燥した分画物を単独であるいは適当な比率
で混合して、本発明による米調製物とすることができ
る。The fractions obtained by the above method are used as they are, or those dialyzed against various solutions, or the freeze-dried fractions are mixed singly or in an appropriate ratio to prepare a fraction. It can be a rice preparation according to the invention.

【００１５】本発明による前記米調製物を用いて、米ア
レルゲン抗体を高特異的に及び高感度で検出することが
できる。本発明の検出方法において被検試料としては、
米アレルゲン抗体を含む可能性のある試料であれば特に
限定はされないが、特には生体試料、例えば、血液、血
清又は血漿を挙げることができる。これらの被検試料と
本発明による米調製物とを接触させると、被検試料中に
米アレルゲン抗体が存在する場合には、その抗体と、米
調製物内の米アレルゲンとが抗原抗体反応により抗原抗
体生成物を形成する。この抗原抗体反応生成物を公知の
任意の免疫学的アッセイを用いて検出することができ
る。本発明方法で用いる免疫学的アッセイとしては、特
に限定されるものではないが、酵素免疫法（特に、ＥＬ
ＩＳＡ法）やラジオイムノアッセイなどの他、標識とし
て、例えば、蛍光物質又は化学発光物質などを用いるア
ッセイも用いることができ、それらの標識を公知の方法
で検出することができる。The rice preparation according to the invention can be used to detect rice allergen antibodies with high specificity and high sensitivity. The test sample in the detection method of the present invention,
The sample is not particularly limited as long as it may contain a rice allergen antibody, but a biological sample such as blood, serum or plasma can be particularly mentioned. When these test samples are contacted with the rice preparation according to the present invention, when a rice allergen antibody is present in the test sample, the antibody and the rice allergen in the rice preparation are reacted by an antigen-antibody reaction. Form the antigen-antibody product. The antigen-antibody reaction product can be detected using any known immunological assay. The immunological assay used in the method of the present invention is not particularly limited, but enzyme immunoassay (particularly EL
In addition to the ISA method) and radioimmunoassay, for example, an assay using a fluorescent substance or a chemiluminescent substance as a label can be used, and those labels can be detected by a known method.

【００１６】本発明の検出方法をＥＬＩＳＡ法によって
実施する場合には、例えば、本発明の米調製物を適当な
バッファーに溶解して得たアレルゲン液をＥＬＩＳＡプ
レートに固定し、続いて被検試料（例えば、血清試料）
をプレートに添加する。プレートを洗浄した後で、酵素
で標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を添加し、洗浄してから前
記標識酵素の基質を加え、酵素活性を測定することによ
り、被検試料中の米アレルゲン抗体を検出あるいは定量
することができる。When the detection method of the present invention is carried out by the ELISA method, for example, an allergen solution obtained by dissolving the rice preparation of the present invention in an appropriate buffer is fixed on an ELISA plate, and then a test sample is prepared. (Eg serum sample)
Is added to the plate. After washing the plate, an enzyme-labeled anti-human IgE antibody was added, and after washing, a substrate for the labeled enzyme was added and the enzyme activity was measured to detect the rice allergen antibody in the test sample or It can be quantified.

【００１７】[0017]

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。調製例１ コシヒカリの白米を粉砕器にて粉砕し、２００μｍの篩
を通した米粉末１００ｇを５００ｍｌの三角フラスコに
入れ、この米粉末にジエチルエーテル２００ｍｌを加
え、スターラーにて１０分間撹拌し、脱脂操作を行っ
た。３０分間放置してから上澄みを遠心分離（１，００
０ｘｇ）し、上清を廃棄した。遠心分離した沈殿を三角
フラスコに戻し、再度ジエチルエーテル２００ｍｌを加
えて１０分間撹拌した。遠心分離（１，０００ｘｇ）し
て上澄みを除去し、沈殿の米粉末を風乾させて脱脂米粉
末を得た。次に、脱脂米粉末２０ｇに５００ｍＭ塩化ナ
トリウム水溶液を１００ｍｌ加えて１時間撹拌した後、
遠心分離（１０，０００ｘｇ）して上清を得た。この米
アレルゲン抽出液（以下、サンプルＡと称する）を分子
量３，５００カットの透析膜にて水に対して透析し、凍
結乾燥して米アレルゲン抽出物（以下、サンプルＢと称
する）を得た。米アレルゲン抽出物（サンプルＢ）１０
０ｍｇをＰＢＳ２．５ｍｌに溶解し、０．２２μｍのフ
ィルターを通して、その濾液２．０ｍｌをゲル濾過クロ
マトグラフィーで処理した。ゲルにはバイオゲルＡ０．
５ｍ（バイオラッド社製）を用い、カラムは直径１．５
ｃｍ、長さ１２０ｃｍのエコノカラム（バイオラッド社
製）を用いた。溶出液にはＰＢＳを用いて、流速０．５
ｍｌ／ｍｉｎで米塩水抽出物を分画した。溶出液を１ｍ
ｌずつ分取して、それぞれの溶出液１０μｌにタンパク
質アッセイ試薬（バイオラッド社製）２００μｌを加
え、５９５ｎｍの吸光度を測定してタンパク質の存在を
検索した。溶出パターンから高分子領域のピークと低分
子領域のピークに分画し、高分子分画溶出液をサンプル
Ｃ、低分子分画溶出液をサンプルＤとした。The present invention will be described in detail below with reference to examples, but these do not limit the scope of the present invention. Preparation Example 1 Koshihikari white rice was crushed with a crusher, 100 g of rice powder passed through a 200 μm sieve was put into a 500 ml Erlenmeyer flask, 200 ml of diethyl ether was added to this rice powder, and the mixture was stirred for 10 minutes with a stirrer to defatted. The operation was performed. Let stand for 30 minutes and centrifuge the supernatant (1,00
0xg) and the supernatant was discarded. The centrifugally separated precipitate was returned to the Erlenmeyer flask, 200 ml of diethyl ether was added again, and the mixture was stirred for 10 minutes. The supernatant was removed by centrifugation (1,000 xg), and the precipitated rice powder was air-dried to obtain defatted rice powder. Next, after adding 100 ml of 500 mM sodium chloride aqueous solution to 20 g of defatted rice powder and stirring for 1 hour,
The supernatant was obtained by centrifugation (10,000 × g). This rice allergen extract (hereinafter referred to as sample A) was dialyzed against water with a dialysis membrane having a molecular weight of 3,500 and freeze-dried to obtain a rice allergen extract (hereinafter referred to as sample B). . Rice allergen extract (Sample B) 10
0 mg was dissolved in 2.5 ml PBS and passed through a 0.22 μm filter, and 2.0 ml of the filtrate was subjected to gel filtration chromatography. Biogel A0.
5 m (manufactured by Bio-Rad), the column diameter is 1.5
An econocolumn having a length of 120 cm and a length of 120 cm (manufactured by Bio-Rad) was used. PBS is used as the eluent and the flow rate is 0.5.
The rice salt water extract was fractionated at ml / min. 1m eluate
Aliquots of 1 were taken, 200 μl of protein assay reagent (manufactured by Bio-Rad) was added to 10 μl of each eluate, and the presence of protein was searched by measuring the absorbance at 595 nm. The elution pattern was fractionated into a peak in the high molecular region and a peak in the low molecular region, and the high molecular fraction eluate was designated as sample C and the low molecular fraction eluate was designated as sample D.

【００１８】調製例２ 平成６年度に収穫されたコシヒカリの種実を脱穀して得
た玄米を粉砕器にて粉砕し、調製例１と同様の方法によ
り脱脂米粉末を調製した。脱脂米粉末２０ｇにＰＢＳ２
００ｍｌを加え、４℃にて８時間、撹拌して抽出した
後、遠心分離（１０，０００ｘｇ）して上清を得て、こ
の上清をサンプルＥとした。この上清（サンプルＥ）１
ｍｌに等量の−２０℃に冷やしたアセトンを加え、直ち
に遠心分離（１０，０００ｘｇ）して沈殿を得た。この
沈殿を−２０℃に冷やしたアセトンで洗浄し、乾燥させ
た後、ＰＢＳ１００μｌに再溶解し、得られた溶液をサ
ンプルＦとした。 Preparation Example 2 Brown rice obtained by threshing Koshihikari seeds harvested in 1994 was crushed with a grinder, and defatted rice powder was prepared in the same manner as in Preparation Example 1. 20 g of defatted rice powder and PBS2
After adding 00 ml and stirring at 4 ° C. for 8 hours for extraction, centrifugation (10,000 × g) was performed to obtain a supernatant, which was designated as sample E. This supernatant (Sample E) 1
An equal amount of acetone cooled to -20 ° C was added to ml and immediately centrifuged (10,000 xg) to obtain a precipitate. The precipitate was washed with acetone cooled to −20 ° C., dried and then redissolved in 100 μl of PBS, and the obtained solution was designated as sample F.

【００１９】調製例３ 原料米をタイ産のインディカ米に変更し、抽出溶媒を水
としたこと以外は調製例１と同様の方法により、米アレ
ルゲン抽出上清を得て、サンプルＧとした。この抽出上
清（サンプルＧ）を５０ｍＭのトリスヒドロキシアミノ
メタン塩酸塩バッファー（ｐＨ８．５）に対して透析
し、米アレルゲン抽出液とした。この米アレルゲン抽出
液５ｍｌをフィルター濾過後、陰イオン交換樹脂カラム
（リソースＱ：ファルマシア社製）に１ｍｌ加え、８０
ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリスヒドロキシアミノ
メタン塩酸塩バッファー（ｐＨ８．５）にて未吸着の米
タンパク質を洗浄し、除去してから、５００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含む５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸
塩バッファー（ｐＨ８．５）にて吸着したタンパク質を
溶出し、この分画抽出液をサンプルＨとした。 Preparation Example 3 A rice allergen extraction supernatant was obtained in the same manner as in Preparation Example 1 except that the raw material rice was changed to Thai indica rice and the extraction solvent was water. This extraction supernatant (Sample G) was dialyzed against 50 mM trishydroxyaminomethane hydrochloride buffer (pH 8.5) to obtain a rice allergen extract. After filtering 5 ml of this rice allergen extract with a filter, 1 ml was added to an anion exchange resin column (Resource Q: Pharmacia) to obtain 80
Unadsorbed rice protein was washed with 50 mM trishydroxyaminomethane hydrochloride buffer (pH 8.5) containing mM NaCl, and then 500 mM Na was added.
The adsorbed protein was eluted with 50 mM trishydroxyaminomethane hydrochloride buffer (pH 8.5) containing Cl, and this fractionated extract was designated as sample H.

【００２０】調製例４ 日本晴の精白米を用いて、抽出溶媒を１００ｍＭ炭酸ナ
トリウムとしたこと以外は調製例１と同様の方法によ
り、米アレルゲン抽出上清を得た。この上清を水に対し
て透析し、凍結乾燥後、１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるよ
うに０．１％のテトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に
溶解し、得られた溶液をサンプルＩとした。この溶液
（サンプルＩ）をリソースＲＰＣ（ファルマシア社製：
３ｍｌ）に吸着させた。０．１％のテトラフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）水溶液にてカラムを洗浄した後、吸着したタ
ンパク質を０．１％のＴＦＡを含むイソプロパノール
（０〜６０％）で溶出して分画した。この条件でイソプ
ロパノールが２５％以上で溶出したタンパク質分画溶出
液をサンプルＪとした。 Preparation Example 4 A rice allergen extraction supernatant was obtained in the same manner as in Preparation Example 1 except that polished rice from Nipponbare was used and the extraction solvent was 100 mM sodium carbonate. The supernatant was dialyzed against water, freeze-dried, and then dissolved in a 0.1% aqueous tetrafluoroacetic acid (TFA) solution to a concentration of 10 mg / ml, and the obtained solution was designated as sample I. This solution (Sample I) was used as a resource RPC (Pharmacia:
3 ml). After washing the column with a 0.1% tetrafluoroacetic acid (TFA) aqueous solution, the adsorbed protein was fractionated by elution with isopropanol (0-60%) containing 0.1% TFA. Sample J was a protein fraction eluate in which isopropanol was eluted at 25% or more under these conditions.

【００２１】実験例１ 各調製例で得たサンプルＡ〜Ｊについて、そのサンプル
中に含まれるタンパク質の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて
解析した。各サンプルをタンパク質濃度で５ｍｇ／ｍｌ
となるように調製し、ＳＤＳ試薬を１：１に混合し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅサンプルを、泳動前に２分間、１００℃で加熱し、ゲ
ルに１０μｌの量で付与した。泳動には、第一化学薬品
社製のミニゲル・システムを用いた。ゲルには、１０〜
２０％のグラジエントゲルを用い、ゲル１枚当り４０ｍ
Ａ定電流で１時間泳動した。ＳＤＳ試薬は、最終濃度で
２％ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエタノール（２Ｍ
Ｅ）、３０％グリセリン、２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、０．０１％ブロモフェノールブルー
（ＢＰＢ）を含むように調製した。泳動後、ゲルをクー
マシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ２５０にて染色
してから、デンシトメーター（アトー社製）にて検出さ
れたバンドを測定し、２５ＫＤ未満のバンドの検出量を
２５ＫＤ以上のバンドの総量で割り（除算し）、比を求
めて比較した。結果を表１に示した。分画前の米アレル
ゲン抽出物は、その比がサンプルＡでは４．１８、サン
プルＢでは４．３４であるのに対して、分画後のサンプ
ルは、サンプルＣの０．２３をはじめ、その他サンプル
Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪなどすべて、比は４以下であっ
た。 Experimental Example 1 With respect to the samples A to J obtained in each preparation example, the composition of proteins contained in the samples was analyzed by SDS-PAGE. Protein concentration of each sample is 5 mg / ml
SDS reagent is mixed 1: 1 to prepare S
A sample for DS-PAGE was prepared. SDS-PAG
The E sample was heated at 100 ° C. for 2 minutes before running and loaded on the gel in a volume of 10 μl. A mini gel system manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. was used for the electrophoresis. 10 to gel
40m per gel, using 20% gradient gel
Electrophoresis was performed at a constant current of A for 1 hour. SDS reagent was 2% SDS, 10% 2-mercaptoethanol (2M
E), 30% glycerin, 250 mM Tris-HCl
(PH 6.8), 0.01% bromophenol blue (BPB) was included. After the electrophoresis, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250, and then the bands detected with a densitometer (manufactured by Atto) were measured. Was divided (divided) by the total amount of and the ratio was calculated and compared. The results are shown in Table 1. The ratio of the rice allergen extract before fractionation is 4.18 for sample A and 4.34 for sample B, while the fractionated samples include 0.23 of sample C, and others. All samples E, F, G, H and J etc. had a ratio of 4 or less.

【００２２】[0022]

【表１】 サンプル 比（２５ＫＤ未満／２５ＫＤ以上） Ａ ４．１８ Ｂ ４．３４ Ｃ ０．２３ Ｄ ８．９９ Ｅ ３．２５ Ｆ ０．５５ Ｇ ２．０８ Ｈ ０．７４ Ｉ ４．４５ Ｊ ０．７５ [Table 1] Sample ratio (less than 25 KD / more than 25 KD) A 4.18 B 4.34 C 0.23 D 8.99 E 3.25 F 0.55 G 2.08 H 0.74 I 4.45 J 0.75

【００２３】実験例２ 各調製例で得たサンプルＡ〜Ｊについて、米アレルギー
患者血清中のＩｇＥ抗体との反応をＥＬＩＳＡ法にて測
定した。各サンプルをＰＢＳにて１０μｇ／ｍｌとなる
ように希釈し、その希釈液１００μｌずつをＥＬＩＳＡ
プレート・マキシソープ（ヌンク社製）に加えて一昼夜
４℃にてコーティングした。ＰＢＳにて２回洗浄した
後、２％ＢＳＡを２５０μｌ加え、３７℃にて１時間ブ
ロッキングを行い、ＰＢＳにて２回洗浄した。米アレル
ギーと診断された患者血清（プール血清）あるいは健康
な成人血清（コントロール血清）を、０．２％ＢＳＡと
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０とを含むＰＢＳにて１０容量
倍に希釈し、それぞれの希釈液１００μｌを加え、室温
にて一昼夜反応させた。 Experimental Example 2 With respect to the samples A to J obtained in each preparation example, the reaction with the IgE antibody in the serum of rice allergic patients was measured by the ELISA method. Each sample was diluted with PBS to 10 μg / ml, and 100 μl of the diluted solution was added to each ELISA.
In addition to the plate maxi soap (manufactured by Nunc), coating was performed overnight at 4 ° C. After washing twice with PBS, 250 μl of 2% BSA was added, blocking was performed at 37 ° C. for 1 hour, and washing was performed twice with PBS. Serum of patient diagnosed as rice allergy (pooled serum) or healthy adult serum (control serum) was diluted 10 times by volume with PBS containing 0.2% BSA and 0.05% Tween 20, and each dilution was performed. The liquid (100 μl) was added, and the mixture was reacted overnight at room temperature.

【００２４】０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（ＰＢＳ−Ｔ）にてプレートを４回洗浄した後、２次抗
体としてビオチンを結合したヒツジ抗ヒトＩｇＥ抗体
（ベクター社製）の２，５００倍希釈液を１００μｌ加
えて、３７℃で２時間反応させた。なお抗体の希釈には
０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔを使用した。２次抗体
反応終了後、ＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、４，０００倍
希釈したアビジンを結合したペルオキシターゼ（ベーリ
ンガー社製）を加えて酵素標識化した。再度、ＰＢＳ−
Ｔにて５回洗浄し、基質溶液（０．０３４％Ｈ₂ Ｏ₂ を
加えた０．１％オルトフェニレンジアミン溶液）を１０
０μｌ加えた。３７℃にて３０分間正確に反応させた
後、４Ｎ−Ｈ₂ ＳＯ₄ を４０μｌ加えて発色を停止さ
せ、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。測定はすべて２
重に行い、その平均値を求めた。サンプルＡのＥＬＩＳ
Ａ値に対する各サンプルのＥＬＩＳＡ値、すなわち、サ
ンプルＡのＥＬＩＳＡ値を各サンプルのＥＬＩＳＡ値で
割った値を比較すると、表２に示したようにサンプル
Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ及びＩは、０．９８〜１．１倍とほぼ同
等であるのに対して、分画したサンプルＣ、Ｆ、Ｈ、及
びＪは、ＥＬＩＳＡ値が上昇し、高感度でＩｇＥ抗体が
検出されていた。これら分画後の米アレルゲン調製物
は、米の塩水抽出物よりもアレルゲン活性が高められて
いると認められた。PBS containing 0.05% Tween 20
After washing the plate four times with (PBS-T), 100 μl of a 2,500-fold diluted solution of sheep anti-human IgE antibody (Vector) bound with biotin as a secondary antibody was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours. It was made to react. PBS-T containing 0.2% BSA was used for antibody dilution. After the completion of the secondary antibody reaction, the plate was washed 5 times with PBS-T, and a 4,000-fold diluted avidin-conjugated peroxidase (Boehringer) was added for enzyme labeling. PBS- again
The substrate solution (0.1% orthophenylenediamine solution with 0.034% H ₂ O ₂ added) was washed 10 times with T.
0 μl was added. After reacting accurately at 37 ° C. for 30 minutes, 40 μl of 4N—H ₂ SO ₄ was added to stop color development, and the absorbance (490 nm) was measured. All measurements are 2
It was repeated and the average value was calculated. Sample A ELIS
When comparing the ELISA value of each sample with respect to the A value, that is, the value obtained by dividing the ELISA value of sample A by the ELISA value of each sample, as shown in Table 2, samples A, B, E, G and I showed 0. .About.98 to 1.1 times, which is almost the same as that of the fractionated samples C, F, H, and J, the ELISA value was increased, and the IgE antibody was detected with high sensitivity. It was recognized that the fractionated rice allergen preparation had higher allergen activity than the salt water extract of rice.

【００２５】[0025]

【表２】 サンプル ＩｇＥ−ＥＬＩＳＡ値 比 Ａ ０．４６２ １ Ｂ ０．４９６ １．０７４ Ｃ １．２７４ ２．７６ Ｄ ０．０６２ ０．１３ Ｅ ０．５０３ １．０９ Ｆ ０．９２７ ２ Ｇ ０．５１１ １．１１ Ｈ １．１０９ ２．４ Ｉ ０．４５５ ０．９８ Ｊ １ ２．１６ Table 2 Sample IgE-ELISA value ratio A 0.462 1 B 0.496 1.074 C 1.274 2.76 D 0.062 0.13 E 0.503 1.09 F 0.927 2 G 0 .511 1.11 H 1.109 2.4 I 0.455 0.98 J 1 2.16

【００２６】実験例３ 前記調製例１のゲル濾過クロマトグラフィーによって得
られた分画溶出液であるサンプルＣとサンプルＤとを以
下に示す所定の量で混合し、１１種の米アレルゲン調製
物を得た。すなわち、サンプルＣの１０ｍｇをＰＢＳ１
０ｍｌに溶解して、１．５ｍｌのサンプルチューブに前
記サンプルＣ溶液を１ｍｌから０．１ｍｌ刻みで０ｍｌ
まで加えた１１本のサンプルチューブを用意し、全チュ
ーブの容量が１．０ｍｌとなるように、同様に調製した
サンプルＤ溶液を０ｍｌから０．１ｍｌ刻みで１．０ｍ
ｌまで加え、各チューブの分画混合物量が１ｍｇ／ｍｌ
となるようにした。サンプルＣ溶液量を１ｍｌ（サンプ
ルＤ溶液量は０ｍｌ）としたチューブをサンプルＫ１と
し、以下サンプルＣ溶液量が減少するのに従ってサンプ
ルＫ２、サンプルＫ３と順に命名し、サンプルＣ溶液量
が０ｍｌ（サンプルＤ溶液量は１ｍｌ）の分画混合物を
サンプルＫ１１とした。 Experimental Example 3 Sample C and Sample D, which are the fractionated eluates obtained by the gel filtration chromatography of Preparation Example 1 above, were mixed in the following predetermined amounts to prepare 11 kinds of rice allergen preparations. Obtained. That is, 10 mg of sample C is added to PBS1
Dissolve in 0 ml and add the above sample C solution to a 1.5 ml sample tube from 1 ml to 0.1 ml in 0 ml increments.
The sample D solution prepared in the same manner was prepared from 0 ml to 0.1 ml in increments of 0.1 ml so that the volume of all the tubes would be 1.0 ml.
Add up to 1 and add 1mg / ml of fractionation mixture in each tube.
It was made to become. A tube having a sample C solution volume of 1 ml (sample D solution volume of 0 ml) was designated as sample K1, and as the sample C solution volume decreased, sample K2 and sample K3 were named in order, and the sample C solution volume was 0 ml (sample The fraction mixture of D solution (1 ml) was used as sample K11.

【００２７】前記の方法で調製した１１種のサンプルＫ
１〜Ｋ１１、サンプルＡ、及びサンプルＢを用いて、実
験例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量２５Ｋ
Ｄ以上及び分子量２５ＫＤ未満の２群に分けてピーク面
積値を加算した。両群の加算ピーク面積値と分子量２５
ＫＤ未満のピーク面積値を２５ＫＤ以上のピーク面積値
で除した値をＥＬＩＳＡ値とともに表３に示した。各サ
ンプルのＥＬＩＳＡ値は実験例２と同様に測定した。サ
ンプルＡ及びＢにおいて、分子量２５ＫＤ未満のタンパ
ク質量／分子量２５ＫＤ以上のタンパク質量の比は４．
１１〜４．３０の間であった。一方、サンプルＫ３の相
当する比は１．０であり、サンプルＫ１とサンプルＫ２
は１以下、サンプルＫ４は１．８２と２．０以下、Ｋ
５、Ｋ６は３．０以下、その他は４以上であり、分画前
の米アレルゲン抽出物とほぼ同じ値であった。11 samples K prepared by the above method
Using 1 to K11, Sample A, and Sample B, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Experimental Example 1 to obtain a molecular weight of 25K.
The peak area values were added to two groups of D or more and a molecular weight of less than 25 KD. Addition peak area value and molecular weight of both groups 25
The values obtained by dividing the peak area values below KD by the peak area values above 25 KD are shown in Table 3 together with the ELISA values. The ELISA value of each sample was measured in the same manner as in Experimental Example 2. In Samples A and B, the ratio of the amount of protein having a molecular weight of less than 25 KD / the amount of protein having a molecular weight of 25 KD or more is 4.
It was between 11 and 4.30. On the other hand, the corresponding ratio of sample K3 is 1.0, which means that sample K1 and sample K2
Is 1 or less, sample K4 is 1.82 and 2.0 or less, K
5, K6 was 3.0 or less, and others were 4 or more, which were almost the same values as the rice allergen extract before fractionation.

【００２８】サンプルＡのＥＬＩＳＡ値を各サンプルの
ＥＬＩＳＡ値で割った値を各サンプルで比較すると、サ
ンプルＫ１は、２．８５倍と最も高く、サンプルＫ１１
は、０．２１倍と最も低値であった。サンプルＫ１〜Ｋ
８のＥＬＩＳＡ値は、分画して再構成する前の米塩水抽
出物のＥＬＩＳＡ値よりも高値を示し、これらの米アレ
ルゲン調製物、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥでの２５ＫＤ
未満／２５ＫＤ以上のピーク値の比が４．０以下の分画
物は、米の塩水抽出物よりもアレルゲン活性が高められ
ていると認められた。When the value obtained by dividing the ELISA value of sample A by the ELISA value of each sample is compared for each sample, sample K1 has the highest value of 2.85 times, and sample K11 has the highest value.
Was the lowest value of 0.21 times. Samples K1 to K
The ELISA value of 8 was higher than the ELISA value of rice salt water extract before fractionation and reconstitution, and these rice allergen preparations, that is, 25 KD in SDS-PAGE.
It was recognized that the fractions having a peak value ratio of less than / 25 KD or more of 4.0 or less had higher allergen activity than the salt water extract of rice.

【００２９】[0029]

【表３】 サンプル IgE-ELISA値 サンプルＡに SDS-PAGEによる比 対する比 （25KD未満／25KD以上） Ａ ０．４８２ １ ４．１１ Ｂ ０．５１６ １．０７ ４．１３ Ｋ１ １．３７６ ２．８５ ０．０２ Ｋ２ １．３ ２．７ ０．６２ Ｋ３ １．２３５ ２．５６ １ Ｋ４ １ ２．０７ １．８２ Ｋ５ ０．９１５ １．９ ２．４５ Ｋ６ ０．８６２ １．７９ ２．８６ Ｋ７ ０．８１１ １・６８ ３．２４ Ｋ８ ０．５５ １．１４ ３．９１ Ｋ９ ０．４６ ０．９５ ４．１１ Ｋ１０ ０．２２４ ０．４６ ４．６３ Ｋ１１ ０．１ ０．２１ ７．６９ [Table 3] Sample IgE-ELISA value Ratio to sample A by SDS-PAGE (less than 25KD / 25KD or more) A 0.482 1 4.11 B 0.516 1.07 4.13 K1 1.376 2. 85 0.02 K2 1.3 2.7 0.62 K3 1.235 2.56 1 K4 1 2.07 1.82 K5 0.915 1.9 2.45 K6 0.862 1.79 2.86 K7 0.811 1.68 3.24 K8 0.55 1.14 3.91 K9 0.46 0.95 4.11 K10 0.224 0.46 4.63 K11 0.1 0.21 7.69

【００３０】実験例４ 前記実験例３で調製したサンプルＫ１、及びサンプルＡ
を用いて患者プール血清の検出感度をＩｇＥ−ＥＬＩＳ
Ａ法にて比較した。すなわち、各サンプルをＰＢＳにて
１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ＥＬＩＳＡプレー
ト・マキシソープ（ヌンク社製）に１００μｌずつ加え
て一昼夜４℃でプレートにコーティングした。ＰＢＳに
て２回洗浄した後、２％ＢＳＡを２５０μｌ加えて３７
℃にて１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳにて２回洗
浄後、米アレルギーと診断された患者血清（プール血
清）を０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０とを
含むＰＢＳにて５容量倍から６４０容量倍までの２倍希
釈系列を作成して、それぞれの希釈液１００μｌを加
え、室温にて一昼夜反応させた。その後の操作を実験例
２と同様に行い、ＩｇＥ抗体の検出を行った。その結果
を表４に示した。サンプルＡではＩｇＥ抗体の検出限界
は患者プール血清の１６０倍希釈液であった。一方、サ
ンプルＫ１の場合、６４０倍に希釈した患者血清にてＩ
ｇＥ抗体の検出が可能であった。以上から、サンプルＫ
１は、サンプルＡに比較して高感度でＩｇＥ抗体を検出
でき、より少量の患者血清にて検出できることが認めら
れた。また、サンプルＫ１及びサンプルＢを抗原として
用いて５人の患者血清（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）に対し
て、１６０倍の希釈倍率にて米特異ＩｇＥ抗体の検出を
試みた。その結果、表５に示したようにサンプルＢでは
ＩｇＥ抗体が検出された患者血清はなかったが、サンプ
ルＫ１では全例から米特異ＩｇＥ抗体が検出された。 Experimental Example 4 Sample K1 and Sample A prepared in Experimental Example 3 above
Detection sensitivity of patient pool serum using IgE-ELIS
The comparison was made by Method A. That is, each sample was diluted with PBS to 10 μg / ml, 100 μl of each was added to an ELISA plate maxisorp (manufactured by Nunc), and the plate was coated overnight at 4 ° C. After washing twice with PBS, add 250 μl of 2% BSA and add 37
Blocking was performed at 1 ° C for 1 hour. After washing twice with PBS, the serum of a patient diagnosed as rice allergy (pool serum) is diluted 2-fold from 5 times to 640 times with PBS containing 0.2% BSA and 0.05% Tween20. A series was prepared, 100 μl of each diluted solution was added, and the reaction was carried out at room temperature overnight. The subsequent operation was performed in the same manner as in Experimental Example 2 to detect the IgE antibody. The results are shown in Table 4. In Sample A, the IgE antibody detection limit was a 160-fold dilution of patient pool serum. On the other hand, in the case of sample K1, I was diluted with 640-fold diluted patient serum.
It was possible to detect the gE antibody. From the above, sample K
It was confirmed that the sample No. 1 can detect the IgE antibody with higher sensitivity than the sample A, and that it can be detected with a smaller amount of patient serum. In addition, using the sample K1 and the sample B as antigens, an attempt was made to detect rice-specific IgE antibody with respect to 5 patient sera (No. 1 to No. 5) at a dilution ratio of 160 times. As a result, as shown in Table 5, there was no patient serum in which IgE antibody was detected in sample B, but rice-specific IgE antibody was detected in all cases in sample K1.

【００３１】[0031]

【表４】血清希釈 サンプルＡ サンプルＫ１ ×５ ０．４９１ １ ×１０ ０．３３４ ０．７５４ ×２０ ０．２ ０．５３ ×４０ ０．１１ ０・３４９ ×８０ ０．０５ ０．２ ×１６０ ０．０２２ ０．１２２ ×３２０ ０ ０．０６６×６４０ ０ ０．０３４ [Table 4] Serum dilution Sample A Sample K1 × 5 0.491 1 × 10 0.334 0.754 × 20 0.2 0.53 × 40 0.11 0 · 349 × 80 0.05 0.2 × 160 0.022 0.122 x320 0 0.066 x640 0 0.034

【００３２】[0032]

【表５】 患者血清（×１６０） サンプルＡ サンプルＫ１ Ｎｏ．１ ０ ０．１１ Ｎｏ．２ ０ ０．２ Ｎｏ．３ ０ ０．０６ Ｎｏ．４ ０ ０・４４６ Ｎｏ．５ ０ ０．３６ [Table 5] Patient serum (× 160) Sample A Sample K1 No. 1 0 0.11 No. 20 0.2 No. 3 0 0.06 No. 4 0.446 No. 50 0.36

【００３３】表１〜表５から分子量２５ＫＤ未満のタン
パク質量／分子量２５ＫＤ以上のタンパク質量の比が
４．０以下の米アレルゲン調製物、好ましくは２．０以
下、更に好ましくは１．０以下の米アレルゲン調製物
は、分画前の米アレルゲン抽出物を用いて測定した場合
より患者血清中の米特異ＩｇＥ−ＥＬＩＳＡ値が上昇
し、従来の検査法に比較して高感度で米特異ＩｇＥ抗体
を検出することができることが分かった。From Tables 1 to 5, rice allergen preparations having a ratio of protein amount of less than 25 KD / protein amount of more than 25 KD of 4.0 or less, preferably 2.0 or less, more preferably 1.0 or less. The rice allergen preparation has a higher rice-specific IgE-ELISA value in patient serum than when measured using a pre-fractionation rice allergen extract, and the rice-specific IgE antibody has higher sensitivity than conventional test methods. It turns out that can be detected.

【００３４】[0034]

【発明の効果】本発明による米アレルゲン調製物を用い
ると、従来の米アレルゲン抽出物（米アレルゲン・エキ
ス）を用いるよりも、米アレルゲンの検査を高感度で実
施することができる。また、本発明による前記米アレル
ゲン調製物は、例えば、米のアレルゲン抽出物を分子量
分画する方法、特にゲル濾過クロマトグラフィーにて分
画し、分画物を再構成する方法、また、溶媒沈殿させる
ことによって分画する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィーで分画する方法、逆相クロマトグラフィーで分画す
る方法のいずれによっても調製することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY By using the rice allergen preparation of the present invention, the rice allergen test can be carried out with higher sensitivity than the conventional rice allergen extract (rice allergen extract). Further, the rice allergen preparation according to the present invention is, for example, a method of molecular weight fractionation of an allergen extract of rice, in particular, a method of fractionating by gel filtration chromatography to reconstitute the fraction, and also solvent precipitation. It can be prepared by any one of a method of fractionating by allowing, a method of fractionating by ion exchange chromatography, and a method of fractionating by reverse phase chromatography.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ２３Ｊ 3/14 Ａ２３Ｊ 3/14 (72)発明者 嶋田 禎祐 東京都荒川区東尾久８丁目４番１号 株式 会社アレルゲンフリー・テクノロジー研究 所内 (72)発明者 茂木 和之 東京都荒川区東尾久８丁目４番１号 株式 会社アレルゲンフリー・テクノロジー研究 所内 (72)発明者 杉山 宏 東京都荒川区東尾久８丁目４番１号 株式 会社アレルゲンフリー・テクノロジー研究 所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI Technical display location // A23J 3/14 A23J 3/14 (72) Inventor Sadasuke Shimada 8-4 Higashiohisa, Arakawa-ku, Tokyo No. 1 Allergen-free technology research institute (72) Inventor Kazuyuki Mogi 8-4-1, Higashiohisa, Arakawa-ku, Tokyo In-house allergen-free technology research (72) Inventor Hiroshi Sugiyama Hisashi Higashiohisa, Arakawa-ku, Tokyo 8-4-1 Allergen Free Technology Research Institute Co., Ltd.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 分子量２５ＫＤ未満のタンパク質量／分
子量２５ＫＤ以上のタンパク質量の比が４．０以下であ
ることを特徴とする、米調製物。1. A rice preparation, characterized in that the ratio of the amount of protein having a molecular weight of less than 25 KD / the amount of protein having a molecular weight of 25 KD or more is 4.0 or less. 【請求項２】 米を塩溶液又は水によって抽出して得た
抽出物を、その中に含まれるタンパク質の分子量に基づ
いて分画し、得られた各分画をタンパク質の分子量に基
づいて組み合わせることを特徴とする、請求項１に記載
の米調製物の製造方法。2. An extract obtained by extracting rice with a salt solution or water is fractionated based on the molecular weight of the protein contained therein, and the obtained fractions are combined based on the molecular weight of the protein. A method for producing a rice preparation according to claim 1, characterized in that 【請求項３】 分子量に基づく分画が、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィ
ー担体への吸着及び溶出処理、又は逆相クロマトグラフ
ィー担体への吸着及び溶出処理である、請求項２に記載
の方法。3. The fractionation based on molecular weight is gel filtration chromatography, solvent precipitation, adsorption and elution treatment on a carrier for ion exchange chromatography, or adsorption and elution treatment on a reversed phase chromatography carrier. The method described in. 【請求項４】 請求項１に記載の米調製物と被検試料と
を接触させ、生成される抗原抗体反応生成物を検出する
ことを特徴とする、被検試料内の米アレルゲン抗体の検
出方法。4. Detection of a rice allergen antibody in a test sample, which comprises contacting the rice preparation according to claim 1 with a test sample and detecting an antigen-antibody reaction product produced. Method. 【請求項５】 被検試料が血清である請求項４に記載の
検出方法。5. The detection method according to claim 4, wherein the test sample is serum. 【請求項６】 ＥＬＩＳＡ法による請求項４又は５に記
載の検出方法。6. The detection method according to claim 4 or 5 by an ELISA method.