JPH08256794A - カルシウム測定用試薬 - Google Patents
カルシウム測定用試薬Info
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- JPH08256794A JPH08256794A JP1235496A JP1235496A JPH08256794A JP H08256794 A JPH08256794 A JP H08256794A JP 1235496 A JP1235496 A JP 1235496A JP 1235496 A JP1235496 A JP 1235496A JP H08256794 A JPH08256794 A JP H08256794A
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- phospholipase
- calcium
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ホスホリパーゼＤのカルシウムによる活性化
を利用したバリウムイオンを含有するカルシウム測定系
で、ｐＨの異なる２種類の試薬を用いることで、より正
確な測定を可能にする。 【構成】 ２種類からなる試薬形態をとる試薬のｐＨを
一方をｐＨ３〜７、他方をｐＨ７〜１０と限定したホス
ホリパーゼＤを使用したカルシウム測定系。
を利用したバリウムイオンを含有するカルシウム測定系
で、ｐＨの異なる２種類の試薬を用いることで、より正
確な測定を可能にする。 【構成】 ２種類からなる試薬形態をとる試薬のｐＨを
一方をｐＨ３〜７、他方をｐＨ７〜１０と限定したホス
ホリパーゼＤを使用したカルシウム測定系。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、カルシウム測定用試
薬に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
血液、尿等の主として生体中のカルシウムイオンを測定
するためのカルシウムイオン測定用試薬に関するもので
ある。
薬に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
血液、尿等の主として生体中のカルシウムイオンを測定
するためのカルシウムイオン測定用試薬に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】現在、臨床検査の分野においては、体液
中のカルシウムの測定は様々な疾患の診断に用いられて
いる。カルシウムは生体内での細胞機能や、血液凝固機
能に重要な役割を果たしている。また、ヒト血漿中のカ
ルシウムの量は非常に厳密に調節されているといわれて
おり、異常低値および高値を知ることでの診断的意義は
大きい。例えば、低カルシウム血症としては、低タンパ
ク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠
乏症、副甲状腺機能低下症等の疾患があり、高カルシウ
ム血症としては、骨髄腫、ビタミンＤ中毒症、副甲状腺
機能亢進症、腎不全等の疾患の可能性があることから、
カルシウム量の測定はこれらの診断に有効に用いること
ができる。
中のカルシウムの測定は様々な疾患の診断に用いられて
いる。カルシウムは生体内での細胞機能や、血液凝固機
能に重要な役割を果たしている。また、ヒト血漿中のカ
ルシウムの量は非常に厳密に調節されているといわれて
おり、異常低値および高値を知ることでの診断的意義は
大きい。例えば、低カルシウム血症としては、低タンパ
ク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠
乏症、副甲状腺機能低下症等の疾患があり、高カルシウ
ム血症としては、骨髄腫、ビタミンＤ中毒症、副甲状腺
機能亢進症、腎不全等の疾患の可能性があることから、
カルシウム量の測定はこれらの診断に有効に用いること
ができる。
【０００３】従来、このように診断に有効な体液中のカ
ルシウム測定法としては、以下の方法がよく用いられて
いる。 原子吸光法 比色法 酵素法 このうちの原子吸光法は、特定の機器を必要とする機
器分析法であり、また、比色法はオルトクレゾールフ
タレインコンプレキソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略称す
る）に代表されるキレート発色法によるものである。そ
して近年では、これらの方法に加えて、カルシウムイオ
ンによる酵素の活性化ないし阻害を利用した酵素法が
報告されてもいる。すなわち、例えば特開昭６２−１９
５２９７号公報、特開平４−１８７０９８号公報にはカ
ルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用
した測定法、特開昭６２−３６１９９号公報にはカルモ
ジュリンにカルシウムが結合し、他の酵素を活性化する
のを利用した測定法、特開平２−２７６５９７号公報に
はカルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利
用した測定法が提案されている。
ルシウム測定法としては、以下の方法がよく用いられて
いる。 原子吸光法 比色法 酵素法 このうちの原子吸光法は、特定の機器を必要とする機
器分析法であり、また、比色法はオルトクレゾールフ
タレインコンプレキソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略称す
る）に代表されるキレート発色法によるものである。そ
して近年では、これらの方法に加えて、カルシウムイオ
ンによる酵素の活性化ないし阻害を利用した酵素法が
報告されてもいる。すなわち、例えば特開昭６２−１９
５２９７号公報、特開平４−１８７０９８号公報にはカ
ルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用
した測定法、特開昭６２−３６１９９号公報にはカルモ
ジュリンにカルシウムが結合し、他の酵素を活性化する
のを利用した測定法、特開平２−２７６５９７号公報に
はカルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利
用した測定法が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、以上の
通りの従来の方法には、依然として解決すべき課題が残
されていた。まず、の原子吸光法の場合には、その実
施のための機器は高価であり、また煩雑な検体の前処理
を必要とする場合がある等の不都合があった。のキレ
ート発色法では、検体中のマグネシウムの影響をうける
ことや、温度や測定時間によって吸光度が変化するこ
と、発色の至適ｐＨが生体成分と大きく異なること、低
温度で測定値がマイナスになること等の欠点があった。
また、の酵素法のうち、α−アミラーゼの活性化を利
用したものでは特異性は優れているが感度が低く、また
価格が高いという問題がある。
通りの従来の方法には、依然として解決すべき課題が残
されていた。まず、の原子吸光法の場合には、その実
施のための機器は高価であり、また煩雑な検体の前処理
を必要とする場合がある等の不都合があった。のキレ
ート発色法では、検体中のマグネシウムの影響をうける
ことや、温度や測定時間によって吸光度が変化するこ
と、発色の至適ｐＨが生体成分と大きく異なること、低
温度で測定値がマイナスになること等の欠点があった。
また、の酵素法のうち、α−アミラーゼの活性化を利
用したものでは特異性は優れているが感度が低く、また
価格が高いという問題がある。
【０００５】さらに、特開平４−１８７０９８公報に記
載の２価金属塩および界面活性剤の存在下でホスホリパ
ーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用してカル
シウムイオンを測定する方法は、その特異性に優れ、測
定感度も実用に耐えるものであったが、２価金属のうち
バリウムイオンを使用した試薬では、時間経過に対して
吸光度変化が直線的に進まずに正確な測定が困難である
という問題があり、マンガンイオンを使用した試薬では
冷蔵保存とともにブランク値の上昇が認められるという
問題があった。
載の２価金属塩および界面活性剤の存在下でホスホリパ
ーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用してカル
シウムイオンを測定する方法は、その特異性に優れ、測
定感度も実用に耐えるものであったが、２価金属のうち
バリウムイオンを使用した試薬では、時間経過に対して
吸光度変化が直線的に進まずに正確な測定が困難である
という問題があり、マンガンイオンを使用した試薬では
冷蔵保存とともにブランク値の上昇が認められるという
問題があった。
【０００６】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであって、酵素法の特徴を生かしつつ、従来
法の欠点を解消し、前記のホスホリパーゼＤのカルシウ
ムイオンによる活性化を利用した測定で、バリウムイオ
ンを使用した際の反応の直線性を向上させ、かつ冷蔵保
存中に試薬ブランクが上昇せずに正確で信頼できる測定
値を得ることのできる、新しいカルシウム測定方法を提
供することを目的としている。
されたものであって、酵素法の特徴を生かしつつ、従来
法の欠点を解消し、前記のホスホリパーゼＤのカルシウ
ムイオンによる活性化を利用した測定で、バリウムイオ
ンを使用した際の反応の直線性を向上させ、かつ冷蔵保
存中に試薬ブランクが上昇せずに正確で信頼できる測定
値を得ることのできる、新しいカルシウム測定方法を提
供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この発明の発明者は、こ
のような課題を解決するために鋭意検討した結果、バリ
ウムイオンを使用する反応系に緩衝液を２種類以上組み
合わせ、適切な試薬構成にすることで、反応が時間に対
して定量的に進むことを見出し、この知見を踏まえてこ
の発明を完成した。
のような課題を解決するために鋭意検討した結果、バリ
ウムイオンを使用する反応系に緩衝液を２種類以上組み
合わせ、適切な試薬構成にすることで、反応が時間に対
して定量的に進むことを見出し、この知見を踏まえてこ
の発明を完成した。
【０００８】すなわち、この発明は、上記の課題を解決
するものとして、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＤ
の基質、バリウムイオン及び複数の緩衝液を含む組成を
２種類の試薬系としたカルシウム測定用試薬であって、
２種類の試薬のいずれか一方のｐＨが３〜７、他方のｐ
Ｈが７〜１０であることを特徴とするカルシウム測定用
試薬を提供する。
するものとして、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＤ
の基質、バリウムイオン及び複数の緩衝液を含む組成を
２種類の試薬系としたカルシウム測定用試薬であって、
２種類の試薬のいずれか一方のｐＨが３〜７、他方のｐ
Ｈが７〜１０であることを特徴とするカルシウム測定用
試薬を提供する。
【０００９】
【作用】この発明の上記の通りのカルシウム測定用試薬
では、従来のホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによ
る活性化を利用したカルシウムイオンの測定用試薬の成
分のうちの２価金属をバリウムイオンとし、緩衝液を２
種類以上組み合わせて使用することで得られ、リン脂
質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性
剤および２価金属塩からなり、適宜、必要に応じてその
他の通常用いられる賦活剤等の添加剤が含有される。
では、従来のホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによ
る活性化を利用したカルシウムイオンの測定用試薬の成
分のうちの２価金属をバリウムイオンとし、緩衝液を２
種類以上組み合わせて使用することで得られ、リン脂
質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性
剤および２価金属塩からなり、適宜、必要に応じてその
他の通常用いられる賦活剤等の添加剤が含有される。
【００１０】この発明に使用される緩衝液は、各酵素、
ホスホリパーゼＤの基質、カルシウムに作用する２価金
属その他賦活剤等が溶解し、また酵素活性を維持し、所
定のｐＨが得られるものであればいかなるものを用いて
もよいが、酵素の安定性と２価金属の安定性から、また
反応を経時変化につれて定量的に進行させるため、２種
類の試薬形態からなる試薬においては一方をｐＨ３〜
７、他方をｐＨ７〜１０と２種類の緩衝剤を使用するの
が望ましい。一方の緩衝液のｐＨを３より低くすると、
反応が経時変化につれて定量的に進行せず、反応の初期
速度は速いが時間経過とともに速度が低下し、また、他
方のｐＨを１０より高くすると、反応が定量的に進行す
るまでの時間が長くなるという傾向が認められる。具体
的にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ
ｉｓ）、イミダゾール、トリエタノールアミンなどの緩
衝液や、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノメタンスルフォン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン−
１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルフォ
ン酸），ジハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、２−モルフォ
リノエタンスルフォン酸，ジハイドレート（ＭＥＳ）、
Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルフォン酸
（ＣＡＰＳ）をはじめとするグッド緩衝液等が挙げられ
る。濃度は１〜１０００ｍＭとして使用すればよいが、
価格等の面から濃度２０〜５００ｍＭとして使用するこ
とが望ましい。
ホスホリパーゼＤの基質、カルシウムに作用する２価金
属その他賦活剤等が溶解し、また酵素活性を維持し、所
定のｐＨが得られるものであればいかなるものを用いて
もよいが、酵素の安定性と２価金属の安定性から、また
反応を経時変化につれて定量的に進行させるため、２種
類の試薬形態からなる試薬においては一方をｐＨ３〜
７、他方をｐＨ７〜１０と２種類の緩衝剤を使用するの
が望ましい。一方の緩衝液のｐＨを３より低くすると、
反応が経時変化につれて定量的に進行せず、反応の初期
速度は速いが時間経過とともに速度が低下し、また、他
方のｐＨを１０より高くすると、反応が定量的に進行す
るまでの時間が長くなるという傾向が認められる。具体
的にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ
ｉｓ）、イミダゾール、トリエタノールアミンなどの緩
衝液や、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノメタンスルフォン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン−
１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルフォ
ン酸），ジハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、２−モルフォ
リノエタンスルフォン酸，ジハイドレート（ＭＥＳ）、
Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルフォン酸
（ＣＡＰＳ）をはじめとするグッド緩衝液等が挙げられ
る。濃度は１〜１０００ｍＭとして使用すればよいが、
価格等の面から濃度２０〜５００ｍＭとして使用するこ
とが望ましい。
【００１１】２種類の試薬のうち一方の試薬は、上記の
緩衝液を使用しｐＨ７〜１０とし、ホスフォリパーゼ
Ｄ、パーオキシダーゼを含有する。他方の試薬はｐＨを
３〜７とし、リン脂質を含有する。バリウムイオンやコ
リンオキシダーゼ、その他賦活剤等の添加剤は、第１試
薬、第２試薬のどちらに含まれてもよい。２価金属とし
て使用するバリウムイオンとしては、塩化バリウムや硫
酸バリウムなどのバリウム塩が考えられるが、好ましく
は溶解性やｐＨ等の点から塩化バリウムが望ましい。
緩衝液を使用しｐＨ７〜１０とし、ホスフォリパーゼ
Ｄ、パーオキシダーゼを含有する。他方の試薬はｐＨを
３〜７とし、リン脂質を含有する。バリウムイオンやコ
リンオキシダーゼ、その他賦活剤等の添加剤は、第１試
薬、第２試薬のどちらに含まれてもよい。２価金属とし
て使用するバリウムイオンとしては、塩化バリウムや硫
酸バリウムなどのバリウム塩が考えられるが、好ましく
は溶解性やｐＨ等の点から塩化バリウムが望ましい。
【００１２】また、この発明に使用されるホスホリパー
ゼＤは、いずれのものでも使用でき、例えばキャベツ、
ニンジン、ブタ膵臓等の動植物由来、ストレプトマイセ
ス・クロモフスカス(Streptomyces chromofuscus) 等の
微生物由来のものが挙げられるが、好ましくは安定性、
入手の容易さ、ロット間のばらつきの少なさ等より、ス
トレプトマイセス・クロモフスカス等微生物由来のもの
が望ましい。
ゼＤは、いずれのものでも使用でき、例えばキャベツ、
ニンジン、ブタ膵臓等の動植物由来、ストレプトマイセ
ス・クロモフスカス(Streptomyces chromofuscus) 等の
微生物由来のものが挙げられるが、好ましくは安定性、
入手の容易さ、ロット間のばらつきの少なさ等より、ス
トレプトマイセス・クロモフスカス等微生物由来のもの
が望ましい。
【００１３】ホスホリパーゼＤの基質としては、ホスフ
ォリパーゼＤと反応した後分光学的な検出に導くことの
できる反応生成物を生じるものであればいずれのものを
用いてもよく、例えばリゾレシチン、レシチン、スフィ
ンゴミエリン等のリン脂質が挙げられるが、好ましくは
入手が容易で水溶性に優れ品質が安定している点でリゾ
レシチンが望ましい。
ォリパーゼＤと反応した後分光学的な検出に導くことの
できる反応生成物を生じるものであればいずれのものを
用いてもよく、例えばリゾレシチン、レシチン、スフィ
ンゴミエリン等のリン脂質が挙げられるが、好ましくは
入手が容易で水溶性に優れ品質が安定している点でリゾ
レシチンが望ましい。
【００１４】ホスホリパーゼＤの反応によって生じる生
成物を検出することのできる反応系としてはいずれのも
のでも使用可能であるが、例えばホスホリパーゼＤの基
質にリゾレシチンを用いた場合にはホスホリパーゼＤと
の反応によって生じるコリンをコリンオキシダーゼ・ペ
ルオキシダーゼ共役系にてキノン型色素の生成に導き、
これを分光学的に測定する方法が挙げられる。
成物を検出することのできる反応系としてはいずれのも
のでも使用可能であるが、例えばホスホリパーゼＤの基
質にリゾレシチンを用いた場合にはホスホリパーゼＤと
の反応によって生じるコリンをコリンオキシダーゼ・ペ
ルオキシダーゼ共役系にてキノン型色素の生成に導き、
これを分光学的に測定する方法が挙げられる。
【００１５】この試薬の各成分は、例えば、ホスホリパ
ーゼＤを０．０００１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．
００５〜２．０Ｕ／ｍｌ、リゾレシチンを０．２〜１
０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｍ
ｌ、ホスホリパーゼＤの活性に作用するバリウムイオン
を１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭ、さらにもう１
種別の２価金属を１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍ
Ｍ、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤を１
種あるいは２種以上混合して０．００１〜５重量パーセ
ント、好ましくは０．０１〜０．５重量％使用すればよ
い。
ーゼＤを０．０００１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．
００５〜２．０Ｕ／ｍｌ、リゾレシチンを０．２〜１
０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｍ
ｌ、ホスホリパーゼＤの活性に作用するバリウムイオン
を１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭ、さらにもう１
種別の２価金属を１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍ
Ｍ、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤を１
種あるいは２種以上混合して０．００１〜５重量パーセ
ント、好ましくは０．０１〜０．５重量％使用すればよ
い。
【００１６】次に、この試薬の測定原理を、ホスホリパ
ーゼＤの基質としてリゾレシチンを用いた場合を代表例
として次に示す。
ーゼＤの基質としてリゾレシチンを用いた場合を代表例
として次に示す。
【００１７】
【化１】
【００１８】この式におけるホスホリパーゼＤの活性発
現にはカルシウムイオンの存在が必須であり、ホスホリ
パーゼＤの活性はカルシウムイオンの濃度に比例して上
昇する。ここに、この発明のバリウムイオンを作用させ
ると、カルシウムイオン測定域が大幅に拡大する効果が
得られる。最終的に生成したコリンを、コリンオキシダ
ーゼと反応させて発生する過酸化水素を過酸化水素電極
で測定するか、コリンオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ
共役系にてキノン型色素の生成に導き、これを分光光学
的に測定するか、またはコリンキナーゼ共役系に導くこ
とでその活性を分光光学的に測定することによってカル
シウムイオンを定量することができる。特にコリンオキ
シダーゼ・ペルオキシダーゼを用いる方法は特別な酵素
や装置を必要としないという点で日常の検査業務に適し
ている。その原理を以下に示す。
現にはカルシウムイオンの存在が必須であり、ホスホリ
パーゼＤの活性はカルシウムイオンの濃度に比例して上
昇する。ここに、この発明のバリウムイオンを作用させ
ると、カルシウムイオン測定域が大幅に拡大する効果が
得られる。最終的に生成したコリンを、コリンオキシダ
ーゼと反応させて発生する過酸化水素を過酸化水素電極
で測定するか、コリンオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ
共役系にてキノン型色素の生成に導き、これを分光光学
的に測定するか、またはコリンキナーゼ共役系に導くこ
とでその活性を分光光学的に測定することによってカル
シウムイオンを定量することができる。特にコリンオキ
シダーゼ・ペルオキシダーゼを用いる方法は特別な酵素
や装置を必要としないという点で日常の検査業務に適し
ている。その原理を以下に示す。
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
【００２１】上記で用いられるコリンオキシダーゼとし
ては例えばアースロバクタ・グロビホルミス、アルカリ
ゲネス属等微生物由来のものが挙げられ、その濃度とし
ては例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１．０
〜４０Ｕ／ｍｌである。またペルオキシダーゼとしては
例えば西洋ワサビ由来のものが挙げられ、その濃度とし
ては例えば０．１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５
〜１００Ｕ／ｍｌで用いることが望ましい。フェノール
系化合物としては、例えばフェノール、トルイジン、ア
ニシジン、アニリンおよびそれらの誘導体が挙げられ
る。その濃度としては０．１〜１００ｍＭ、好ましくは
１〜４０ｍＭである。色原体としては例えば４−アミノ
アンチピリンが挙げられるが、その濃度は０．１〜２０
０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭである。
ては例えばアースロバクタ・グロビホルミス、アルカリ
ゲネス属等微生物由来のものが挙げられ、その濃度とし
ては例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１．０
〜４０Ｕ／ｍｌである。またペルオキシダーゼとしては
例えば西洋ワサビ由来のものが挙げられ、その濃度とし
ては例えば０．１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５
〜１００Ｕ／ｍｌで用いることが望ましい。フェノール
系化合物としては、例えばフェノール、トルイジン、ア
ニシジン、アニリンおよびそれらの誘導体が挙げられ
る。その濃度としては０．１〜１００ｍＭ、好ましくは
１〜４０ｍＭである。色原体としては例えば４−アミノ
アンチピリンが挙げられるが、その濃度は０．１〜２０
０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭである。
【００２２】そして、この発明の試薬を用いてカルシウ
ムイオンを定量するには、例えばまずホスホリパーゼ
Ｄ、コリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノー
ル系化合物およびその他の賦活剤を含有するｐＨ７〜１
０の試薬溶液とサンプルをあらかじめ混合し２５〜３７
℃で予備加温した後、リゾレシチン、４−アミノアンチ
ピリン、バリウムイオンおよびその他の賦活剤を含有す
るｐＨ３〜７の試薬溶液を添加し、フェノール系化合物
により任意に設定できる４００〜７００ｎｍの波長で吸
光度の上昇速度を測定すればよい。あるいは、リゾレシ
チン、４−アミノアンチピリンおよびその他の賦活剤を
含有するｐＨ３〜７の試薬とサンプルをあらかじめ混合
し２５〜３７℃で予備加温した後、ホスホリパーゼＤ、
コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、バリウムイオ
ン、フェノール系化合物およびその他の賦活剤を含有す
るｐＨ７〜１０の試薬溶液を添加し同様に４００〜７０
０ｎｍの任意の波長で吸光度の上昇速度を測定すればい
い。
ムイオンを定量するには、例えばまずホスホリパーゼ
Ｄ、コリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノー
ル系化合物およびその他の賦活剤を含有するｐＨ７〜１
０の試薬溶液とサンプルをあらかじめ混合し２５〜３７
℃で予備加温した後、リゾレシチン、４−アミノアンチ
ピリン、バリウムイオンおよびその他の賦活剤を含有す
るｐＨ３〜７の試薬溶液を添加し、フェノール系化合物
により任意に設定できる４００〜７００ｎｍの波長で吸
光度の上昇速度を測定すればよい。あるいは、リゾレシ
チン、４−アミノアンチピリンおよびその他の賦活剤を
含有するｐＨ３〜７の試薬とサンプルをあらかじめ混合
し２５〜３７℃で予備加温した後、ホスホリパーゼＤ、
コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、バリウムイオ
ン、フェノール系化合物およびその他の賦活剤を含有す
るｐＨ７〜１０の試薬溶液を添加し同様に４００〜７０
０ｎｍの任意の波長で吸光度の上昇速度を測定すればい
い。
【００２３】
【実施例】次に、この発明を実施例により具体的に説明
するが、この発明は以下の例によって限定されるもので
はない。なお、以下の実施例で使用した試薬成分は次の
通りである。試薬成分 リゾレシチン（卵黄由来）はシグマ社より、ホスホリパ
ーゼＤ、コリンオキシダーゼは旭化成社より、ペルオキ
シダーゼは東洋紡績社より、Ｎ−エチル−スルフォプロ
ピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルフォプロピル−ｍ−トルイジン（ＡＤＰＳ）は同仁
化学研究所より、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（Ｔｒｉｓ）、イミダゾール、トリエタノールアミ
ンなどの緩衝液や、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノメタンスルフォン酸（ＴＥＳ）、ピペ
ラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパン
スルフォン酸）、ジハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、２−
モルフォリノエタンスルフォン酸，ジハイドレート（Ｍ
ＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスス
フォン酸（ＣＡＰＳ）をはじめとするグッド緩衝液も同
仁化学研究所より購入した。ヒトコントロール血清はオ
ーソダイアグノスティック社より、オーソリキッドノー
マルＶを購入した。他の試薬品は市販の特級試薬を使用
した。実施例１ 以下の第１試薬および第２試薬を用意した。
するが、この発明は以下の例によって限定されるもので
はない。なお、以下の実施例で使用した試薬成分は次の
通りである。試薬成分 リゾレシチン（卵黄由来）はシグマ社より、ホスホリパ
ーゼＤ、コリンオキシダーゼは旭化成社より、ペルオキ
シダーゼは東洋紡績社より、Ｎ−エチル−スルフォプロ
ピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルフォプロピル−ｍ−トルイジン（ＡＤＰＳ）は同仁
化学研究所より、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（Ｔｒｉｓ）、イミダゾール、トリエタノールアミ
ンなどの緩衝液や、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノメタンスルフォン酸（ＴＥＳ）、ピペ
ラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパン
スルフォン酸）、ジハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、２−
モルフォリノエタンスルフォン酸，ジハイドレート（Ｍ
ＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスス
フォン酸（ＣＡＰＳ）をはじめとするグッド緩衝液も同
仁化学研究所より購入した。ヒトコントロール血清はオ
ーソダイアグノスティック社より、オーソリキッドノー
マルＶを購入した。他の試薬品は市販の特級試薬を使用
した。実施例１ 以下の第１試薬および第２試薬を用意した。
【００２４】 第１試薬； Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ８０ｍＭ，ｐＨ８．０ ホスホリパーゼＤ ０．１Ｕ／ｍｌ （ストレプトマイセス・クロモフスカス， Ｌｏｔ．ＰＬＤ−００３−Ａ） コリンオキシダーゼ ２．０Ｕ／ｍｌ （アルカリゲネス属、Ｌｏｔ．ＣＯＤ−００２−Ｂ） ペルオキシダーゼ １０．０Ｕ／ｍｌ （西洋ワサビ、グレードIII 、Ｌｏｔ．２５５３０） ＴＯＰＳ ２．０ｍＭ 第２試薬； ＴＥＳ緩衝液 ３００ｍＭ，ｐＨ６．０ リゾレシチン ４．０ｍｇ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ３ｍＭ 塩化バリウム １５ｍＭ この第１試薬０．７５ｍｌに試料０．０１ｍｌ（既知濃
度のカルシウムイオン標準液）を加え、あらかじめ３７
℃で予備加熱し、次いで第２試薬０．５ｍｌを加え、３
７℃、５４６ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化を
測定した。
度のカルシウムイオン標準液）を加え、あらかじめ３７
℃で予備加熱し、次いで第２試薬０．５ｍｌを加え、３
７℃、５４６ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化を
測定した。
【００２５】図１にはカルシウム濃度と吸光度変化速度
との相関を示した。カルシウム濃度３０ｍｇ／ｄｌまで
の従来法に見られない良好な直線性を有することが判明
した。また図２には、反応の経時変化を示した。時間経
過に対して直線的に反応が進むことが確認された。比較例１ 実施例１の組成のうち、緩衝液をＰＯＰＳＯ（ｐＨ７．
７ １４０ｍＭ）とした試薬の反応の経時変化を測定し
た。その結果を図３に示した。この測定系においては、
時間経過に対して反応が直線的に進んでないことがわか
る。反応が直線的に進むことは、測定値の再現性および
正確さに影響してくると思われ、正しい測定値を得るた
めには第２図のような反応の経時変化をしめすことが重
要である。反応が直線的に進むかどうかで、試薬の同時
再現性が異なってくる。
との相関を示した。カルシウム濃度３０ｍｇ／ｄｌまで
の従来法に見られない良好な直線性を有することが判明
した。また図２には、反応の経時変化を示した。時間経
過に対して直線的に反応が進むことが確認された。比較例１ 実施例１の組成のうち、緩衝液をＰＯＰＳＯ（ｐＨ７．
７ １４０ｍＭ）とした試薬の反応の経時変化を測定し
た。その結果を図３に示した。この測定系においては、
時間経過に対して反応が直線的に進んでないことがわか
る。反応が直線的に進むことは、測定値の再現性および
正確さに影響してくると思われ、正しい測定値を得るた
めには第２図のような反応の経時変化をしめすことが重
要である。反応が直線的に進むかどうかで、試薬の同時
再現性が異なってくる。
【００２６】実施例１と比較例１のヒトコントロール血
清（オーソノーマルリキッドＶ）をサンプルとした際の
同時再現性試験における変動係数を示したものが表１で
ある。
清（オーソノーマルリキッドＶ）をサンプルとした際の
同時再現性試験における変動係数を示したものが表１で
ある。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例２ 次の通りの第１試薬と第２試薬を用意した。 第１試薬； ＰＯＰＳＯ緩衝液 ８０ｍＭ，ｐＨ７．７ ホスホリパーゼＤ ０．１Ｕ／ｍｌ （ストレプトマイセス・クロモフスカス， Ｌｏｔ．ＰＬＤ−００３−Ａ） ペルオキシダーゼ １０．０Ｕ／ｍｌ （西洋ワサビ、グレードIII 、Ｌｏｔ．２５５３０） ＴＯＰＳ ２．０Ｕ／ｍｌ 塩化バリウム ８．０ｍＭ 第２試薬； ＭＥＳ緩衝液 ３００ｍＭ，ｐＨ６．０ コリンオキシダーゼ ２．０Ｕ／ｍｌ （アルカリゲネス属、Ｌｏｔ．ＣＯＤ−００２−Ｂ） リゾレシチン ４．０ｍｇ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ３ｍＭ 実施例１の緩衝液の種類をＴｒｉｓ−ＨＣｌからＰＯＰ
ＳＯへ、ＴＥＳからＭＥＳに変更した場合のカルシウム
濃度と吸光度変化速度との相関を示したものが図４であ
る。実施例１と同様の良好な直線性を有することが確認
された。比較例２ 実施例１の塩化バリウムを代表とするバリウムイオンの
かわりにマンガンイオンを添加した試薬では、冷蔵保存
中にマンガンイオンによる試薬の呈色が認められた。こ
れは、試薬のブランク値の上昇を意味するため、測定す
る度に検量線を得る必要性がでてくる。これに対し、バ
リウムイオンを使用した実施例１に示した測定用試薬で
は、試薬のブランク値の上昇は認められなかった。
ＳＯへ、ＴＥＳからＭＥＳに変更した場合のカルシウム
濃度と吸光度変化速度との相関を示したものが図４であ
る。実施例１と同様の良好な直線性を有することが確認
された。比較例２ 実施例１の塩化バリウムを代表とするバリウムイオンの
かわりにマンガンイオンを添加した試薬では、冷蔵保存
中にマンガンイオンによる試薬の呈色が認められた。こ
れは、試薬のブランク値の上昇を意味するため、測定す
る度に検量線を得る必要性がでてくる。これに対し、バ
リウムイオンを使用した実施例１に示した測定用試薬で
は、試薬のブランク値の上昇は認められなかった。
【００２９】実施例１と比較例２の第１試薬の保存日数
とブランク値の関係を示したものが表２である。
とブランク値の関係を示したものが表２である。
【００３０】
【表２】
【００３１】比較例３〜５ 実施例１の第１試薬の緩衝液にＴＥＳ（ｐＨ９．０ ４
０ｍＭ）、第２試薬の緩衝液にＰ−トルエンスルフォン
酸−Ｐ−ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０ １００ｍＭ）
を用いた試薬（比較例３）、実施例１の第１試薬、第２
試薬の緩衝液にＭＥＳ（ｐＨ６．０ １００ｍＭ）を用
いた試薬（比較例４）、実施例１の第１試薬の緩衝液に
ＭＥＳ（ｐＨ６．０ １００ｍＭ）、第２試薬の緩衝液
にＣＡＰＳ（ｐＨ１１ １００ｍＭ）を用いた試薬（比
較例５）では、反応が経時変化に対して直線的に進ま
ず、ヒトコントロール血清（オーソノーマルリキッド
Ｖ）をサンプルとした際の同時再現性試験における変動
係数はいずれも表３に示したように、実施例１に比べて
著しく大きく、このことからも、この発明方法が有用で
あることが確認された。
０ｍＭ）、第２試薬の緩衝液にＰ−トルエンスルフォン
酸−Ｐ−ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．０ １００ｍＭ）
を用いた試薬（比較例３）、実施例１の第１試薬、第２
試薬の緩衝液にＭＥＳ（ｐＨ６．０ １００ｍＭ）を用
いた試薬（比較例４）、実施例１の第１試薬の緩衝液に
ＭＥＳ（ｐＨ６．０ １００ｍＭ）、第２試薬の緩衝液
にＣＡＰＳ（ｐＨ１１ １００ｍＭ）を用いた試薬（比
較例５）では、反応が経時変化に対して直線的に進ま
ず、ヒトコントロール血清（オーソノーマルリキッド
Ｖ）をサンプルとした際の同時再現性試験における変動
係数はいずれも表３に示したように、実施例１に比べて
著しく大きく、このことからも、この発明方法が有用で
あることが確認された。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【発明の効果】この発明により、簡単な操作で精度よく
連続して生体液中のカルシウムイオン濃度定量出来るよ
うになった。またホスホリパーゼＤに作用する２価金属
をバリウムイオンとすることで、正確で保存安定性に優
れ、また、生体液中に含有されている塩類や金属イオン
等による影響を受けないためにカルシウムイオン測定用
試薬の性能が飛躍的に向上した。この発明は、自動分析
機に応用可能な方法であり、臨床検査の分野において従
来にはなかった有利な試薬を提供できるものである。
連続して生体液中のカルシウムイオン濃度定量出来るよ
うになった。またホスホリパーゼＤに作用する２価金属
をバリウムイオンとすることで、正確で保存安定性に優
れ、また、生体液中に含有されている塩類や金属イオン
等による影響を受けないためにカルシウムイオン測定用
試薬の性能が飛躍的に向上した。この発明は、自動分析
機に応用可能な方法であり、臨床検査の分野において従
来にはなかった有利な試薬を提供できるものである。
【図１】実施例１の検量線を示す図である。
【図２】実施例１の経時変化を示す図である。
【図３】比較例１の経時変化を示す図である。
【図４】実施例２の検量線を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＤの
基質、バリウムイオン及び複数の緩衝液を含む組成を２
種類の試薬系としたカルシウム測定用試薬であって、２
種類の試薬系のいずれか一方のｐＨが３〜７、他方のｐ
Ｈが７〜１０であることを特徴とするカルシウム測定用
試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1235496A JPH08256794A (ja) | 1995-01-27 | 1996-01-26 | カルシウム測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1148095 | 1995-01-27 | ||
| JP7-11480 | 1995-04-21 | ||
| JP1235496A JPH08256794A (ja) | 1995-01-27 | 1996-01-26 | カルシウム測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08256794A true JPH08256794A (ja) | 1996-10-08 |
Family
ID=26346912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1235496A Pending JPH08256794A (ja) | 1995-01-27 | 1996-01-26 | カルシウム測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08256794A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
-
1996
- 1996-01-26 JP JP1235496A patent/JPH08256794A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050614 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20051018 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |