JPH08253499A - Peptide or protein having glutamic acid liberation inhibitory activity - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain a new peptide or protein from spider venom referred to as FTX (fumne 1 web spider), having a specific amino acid sequence, useful as a preventive or therapeutic agent for cerevroneuropathy. CONSTITUTION: This new peptide is made up of light chain 18 amino acid residues of formula I, and the other objective new protein is made up of heavy chain 243 amino acid residues of formula II, each is obtained by extracting spider venom referred to as FTX. The peptide or protein has glutamic acid liberation inhibitory activity, thus being useful as a preventive or therapeutic agent for acute encephalopathy developing in the form of symptoms such as cerevroischemia and status epilepticus and cranical nerves system disease such as Alzheimer's disease and Huntingtons chorea. This peptide or protein is obtained by adding 1% trifluoroacetic acid to FTX, subjecting the resultant acidic FTX to a chromatography using a hydrophobic group-modified silica get carrier followed by elution with a hydrophilic organic solvent with concentration gradient to conduct a fractionation.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【従来の技術】近年興奮性アミノ酸に関する研究は、脳
虚血などの遅延性神経細胞壊死及び記憶などに密接に関
連しているという点から、ますます興味深い領域になっ
ている。 特に脳虚血による神経細胞壊死については、
虚血によって神経終末からグルタミン酸が異常に遊離さ
れ、これが一連の細胞壊死反応を惹起するものと考えら
れている[S.M.Rothman et al.,Ann.Neurol.,19 105-111
(1986),D.W.Choi.Neuron, 1 ,623-634(1988)]。よっ
て、グルタミン酸の遊離を抑制すれば、虚血性脳神経障
害の治療に極めて重要と考えられ、このような作用機序
を有する薬剤の開発が渇望されている。2. Description of the Related Art Recently, research on excitatory amino acids has become more and more interesting because it is closely related to delayed neuronal necrosis such as cerebral ischemia and memory. Especially for neuronal necrosis due to cerebral ischemia,
It is believed that ischemia causes abnormal release of glutamate from nerve endings, which triggers a series of cell necrosis reactions [SM Rothman et al., Ann. Neurol., 19 105-111.
(1986), DW Choi. Neuron, 1, 623-634 (1988)]. Therefore, suppressing the release of glutamic acid is considered to be extremely important for the treatment of ischemic cranial nerve injury, and there is a strong demand for the development of a drug having such a mechanism of action.

【０００２】一方、１９９２年Mintz等は、蜘蛛（funne
l web spider , 学名 Agelenopsis aperta)の毒液
（以下、ＦＴＸと略記する。）よりラット神経終末から
のグルタミン酸遊離を抑制するペプチド、ωーアガトキ
シンIV A(ω-AgatoxinIV A 以下、単にアガトキシンと
略記する。）を初めて見いだし、その構造を決定した
[I.Mintz et al.,Nature, 355 ,827-829(1992)]。アガ
トキシンは、アミノ酸４８残基からなるペプチドであ
り、神経終末のＰ型カルシウムチャネルを抑制すること
により、グルタミン酸の遊離を阻害するものと考えられ
ている[T.J.Turner etal., Science ,258 ,310-313 (19
92)]。更に、特開平３ー１４５５１号には、ＦＴＸから
分離した新規ペプチドが開示されており、アガトキシン
と同様の薬理作用を持つものであるということが記載さ
れている。また、９４／１５９６０には、４６残基目の
セリンがＤ体であることにより、グルタミン酸阻害活性
に加えて、選択的Ｐ型カルシウムチャネル阻害作用が発
現されることが開示されている。On the other hand, 1992 Mintz et al.
l web spider, scientific name Agelenopsis aperta) venom (hereinafter abbreviated as FTX), a peptide that suppresses glutamate release from rat nerve endings, ω-Agatoxin IV A (ω-Agatoxin IV A, hereinafter simply abbreviated as agtoxin). For the first time and determined its structure
[I. Mintz et al., Nature, 355, 827-829 (1992)]. Agatoxin is a peptide consisting of 48 amino acid residues, and is believed to inhibit the release of glutamate by suppressing P-type calcium channels at nerve endings [TJ Turner et al., Science, 258, 310-313]. (19
92)]. Further, JP-A-3-14551 discloses a novel peptide separated from FTX, and describes that it has a pharmacological action similar to that of agatoxin. In addition, 94/15960 discloses that the serine at the 46th residue is in the D-form, whereby a selective P-type calcium channel inhibitory action is expressed in addition to the glutamate inhibitory activity.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】しかし、神経終末から
のグルタミン酸遊離を阻害する作用を有するものとして
知られている化合物は、現在のところ極めて少なく、実
際に薬剤として使用するには、様々な検討課題が残され
ているというのが現状である。以上のような状況に鑑
み、本発明者等は、ＦＴＸ中の成分について、詳細な検
討を行った。まず第一にグルタミン酸遊離を阻害する粗
画分ＦＴＸから活性物質の分離・精製を試みた。第２に
その活性本体の構造解析を行った。その結果、ＦＴＸ中
よりラットシナプトソームからのグルタミンの遊離を著
名に阻害する活性物質を見いだした。本発明者等は、更
に蛋白質の構造解析を行い、該蛋白質が２本鎖構造を有
していることを明らかにし、この２本鎖構造を持つ蛋白
質のアミノ酸配列を決定し、ここに本発明を完成した。However, at present, the number of compounds known to have an action of inhibiting glutamate release from nerve endings is extremely small, and various studies have been required to actually use it as a drug. The current situation is that there are challenges. In view of the situation as described above, the present inventors have made detailed studies on the components in FTX. First, an attempt was made to separate and purify the active substance from the crude fraction FTX which inhibits the release of glutamic acid. Second, the structural analysis of the active substance was performed. As a result, an active substance that markedly inhibits the release of glutamine from rat synaptosomes was found in FTX. The present inventors further analyzed the structure of the protein, clarified that the protein had a double-stranded structure, determined the amino acid sequence of the protein having this double-stranded structure, and found the present invention. Was completed.

【０００４】[0004]

【課題を解決する手段】すなわち、本発明は、配列番号
１記載のアミノ酸配列の一部又は全部を包含するペプチ
ド又はこれと本質的に同等なペプチドであり、配列番号
２記載のアミノ酸の一部又は全部を包含する蛋白質又は
これと本質的に同等な蛋白質であり、配列番号１記載の
アミノ酸配列の一部又は全部を包含する蛋白質又はこれ
と本質的に同等な蛋白質と配列番号２記載のアミノ酸配
列の一部又は全部を包含する蛋白質又はこれと本質的に
同等な蛋白質が２本鎖を形成している蛋白質もしくはこ
の一部分からなる蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白
質、である。That is, the present invention is a peptide including a part or all of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide essentially equivalent thereto, and a part of the amino acid shown in SEQ ID NO: 2. Or a protein including all or essentially the same, and a protein including a part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein essentially equivalent thereto and the amino acid of SEQ ID NO: 2 A protein that includes a part or all of the sequence, or a protein in which a protein essentially equivalent to this forms a double chain, a protein consisting of a part thereof, or a protein essentially equivalent to this.

【０００５】本発明において、アミノ酸配列の「一部」
とは、配列番号１又は配列番号２で示される蛋白質にお
いて、蛋白質の長さが連続した少なくとも３ー５のアミ
ノ酸残基のことであるが、好ましくは６ー８アミノ酸残
基、更に好ましくは、９ー１２アミノ酸残基である。ま
た配列番号１で示される蛋白質又は配列番号２で示され
る蛋白質の一方又は両方において、蛋白質の長さが連続
した少なくとも３ー５のアミノ酸残基からなる、ジスル
フィド結合で結合した２本鎖ペプチドも、上記「一部」
の中に包含される。更に「本質的に同等」とは、構成ア
ミノ酸を既知の方法により修飾、付加、変異、置換又は
一部配列の削除したものなどを意味する。また本発明に
おいて、本発明で開示された連続したアミノ酸配列のＣ
末端又はＮ末端の一方又は両方に、ほかのアミノ酸配列
やそのほかの化合物が結合しているものや、配列番号１
記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２記載の
アミノ酸配列を有する蛋白質もしくはこれらの蛋白質が
何らかの結合により２本鎖となった蛋白質に、何らかの
結合により結合して２本鎖以上のペプチド鎖を形成して
いるものをも含むということはいうまでもない。In the present invention, "a part" of an amino acid sequence
In the protein represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, it means at least 3-5 amino acid residues having a continuous protein length, preferably 6-8 amino acid residues, more preferably 9-12 amino acid residues. Also, in one or both of the protein represented by SEQ ID NO: 1 or the protein represented by SEQ ID NO: 2, a double-chain peptide which is composed of at least 3-5 amino acid residues having continuous protein lengths and which is linked by a disulfide bond is also provided. , "Partial" above
Is included in. Further, "essentially equivalent" means that the constituent amino acids are modified, added, mutated, substituted, or partially deleted by a known method. Further, in the present invention, the C of the continuous amino acid sequence disclosed in the present invention is
Other amino acid sequences or other compounds bound to one or both of the terminal or N-terminal, or SEQ ID NO: 1
A protein having the described amino acid sequence, a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or a protein in which these proteins have been made into a double chain by some kind of bond is bound by some kind of bond to form a peptide chain of two or more chains It goes without saying that it includes what you are doing.

【０００６】本発明にかかるペプチド又は蛋白質は、ブ
ラウンリー RP-8 を用いて、既知の方法でＦＴＸから分
離・精製することができる。ＦＴＸから分離・精製する
方法としては、例えば、疎水性基修飾したシリカゲル担
体を使用し、濃度勾配のある親水性有機溶媒で溶出さ
せ、目的画分を集める方法によって、行うことができ
る。この場合の疎水性有機溶媒は、通常この分野で使用
されるあらゆるものが用いられるが、例としては、メタ
ノール、エタノール、プロピルアルコールなどの低級脂
肪族アルコールや、アセトニトリルのような低級脂肪族
ニトリルを挙げることができる。また、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こ
のように本発明のペプチドは、ＦＴＸを原料として、分
離精製することによって製造することも可能である。こ
の場合、配列番号１に記載のペプチドの９残基目のシス
テインと配列番号２記載の蛋白質の１１６残基目のシス
テインがジスルフィド結合によって２本鎖構造をとって
いる。上記方法において、分離精製における目的画分の
追跡は、調整したシナプトソームからのカルシウム依存
性のグルタミン酸の遊離を抑制する活性を指標に行えば
よい。すなわち、後述実施例に示されるように、検体に
ラット前脳からのシナプトソーム画分、ＮＡＤＰ⁺ 及
びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと略記す
る。）を添加し、３７℃で２０分間インキュベート後、
３０ｍＭ塩化カリウムで脱分極させ、シナプトソームか
ら遊離されるグルタミン酸によって精製されるＮＡＤＰ
Ｈとして測定するものである。The peptide or protein of the present invention can be separated and purified from FTX by a known method using Brownley RP-8. The method of separating and purifying from FTX can be performed, for example, by using a silica gel carrier modified with a hydrophobic group, eluting with a hydrophilic organic solvent having a concentration gradient, and collecting the target fraction. As the hydrophobic organic solvent in this case, any of those usually used in this field can be used, but examples thereof include lower aliphatic alcohols such as methanol, ethanol and propyl alcohol, and lower aliphatic nitriles such as acetonitrile. Can be mentioned. It can also be purified by ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography and the like. Thus, the peptide of the present invention can also be produced by separating and purifying FTX as a raw material. In this case, the cysteine at the 9th residue of the peptide shown in SEQ ID NO: 1 and the cysteine at the 116th residue of the protein shown in SEQ ID NO: 2 have a double-chain structure due to a disulfide bond. In the above method, the target fraction in the separation and purification can be traced by using the activity of suppressing the release of calcium-dependent glutamate from the adjusted synaptosome as an index. That is, as shown in Examples below, a synaptosome fraction from rat forebrain, NADP ⁺ and glutamate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as GDH) were added to a sample, and after incubation at 37 ° C. for 20 minutes,
NADP purified by glutamate released from synaptosomes after depolarization with 30 mM potassium chloride
It is measured as H.

【０００７】本発明にかかる蛋白質は、上記のようにＦ
ＴＸから分離精製する方法以外にも、既知の方法による
遺伝子組み替え技術あるいは、蛋白質の化学合成技術に
よって製造することもできる。要するにいずれの方法に
よって得られたものをも本発明に包含されるものであ
る。また本発明にかかる蛋白質は、２本鎖でＦＴＸから
抽出される場合が主であるが、一本鎖単独であっても本
発明に包含される。この場合、抽出された２本鎖の蛋白
質を２ーメルカプトエタノールで還元するなど、通常行
われる方法によって、１本鎖単独のものを得てもよい。
すなわち、一本鎖の蛋白質を得る方法についても特に限
定されない。本発明にかかる蛋白質の構造解析は、既知
の方法によって行うことができるが、例えば、後述の実
施例に示されるようにアミノ酸配列自動分析装置を使用
しエドマン分解法により、Ｎ末端から逐次分解を行い、
アミノ酸配列を決定することができる。この結果を配列
番号１及び２に示した。As described above, the protein according to the present invention has F
In addition to the method of separating and purifying from TX, it can also be produced by a gene recombination technique by a known method or a protein chemical synthesis technique. In short, those obtained by any method are included in the present invention. The protein according to the present invention is mainly extracted from FTX in a double chain, but a single chain alone is included in the present invention. In this case, the single-chain alone may be obtained by a commonly used method such as reducing the extracted double-stranded protein with 2-mercaptoethanol.
That is, the method for obtaining a single-stranded protein is not particularly limited. The structural analysis of the protein according to the present invention can be carried out by a known method. For example, as shown in the Examples below, sequential analysis from the N-terminus is performed by Edman degradation using an amino acid sequence automatic analyzer. Done,
The amino acid sequence can be determined. The results are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.

【０００８】[0008]

【発明の効果】以下に、本発明の有用性を示すために、
薬理実験例を掲げる。 薬理実験例 （１）グルタミン酸遊離阻害活性 ｉ）実験方法 シナプトソーム画分の調製 シナプトソーム画分の調整は、以下のとおり常法[E.G.G
ray et al.,JAnat.,96,79-88(1962)]に従った。なお、
シナプトソームの調製に使用する溶液は、す べて実験
前に９５％Ｏ₂＋５％ＣＯ₂混合ガスで十分飽和させたも
のを用いた。６週令のウィスター系雄性ラットを屠殺
後、速やかに脳を摘出し、冷カルシウムフリー タイロ
ード溶液[組成（mM)：NaCl 140 , KCl 5 , MgCl₂ 1,D-ク
゛ルコース 24 , Na-HEPES 10,pH 7.4]で冷却し、下丘と小脳
の間で二分し、その前脳を用いた。脳組織に２０倍容量
の０．３２Ｍしょ糖液を加え、ガラスホモジナイザーで
氷冷下ゆっくりとホモジナイズした。１０００×ｇ、４
℃で１０分間遠心分離後その上清を２００００×ｇ 、
４℃で２０分間遠心分離した。沈渣にカルシウムフリー
タイロード溶液を加え、３．５mg protein／mlの
濃度に懸濁させ、１００μＭとなるように塩化カルシウ
ムを添加した。カルシ ウム添加試料及び塩化カルシウ
ム添加しないカルシウム無添加試料を調製し、 それぞ
れ３７℃ で１時間インキュベートした。以上のように
して得られたシナ プトソーム画分を以下に示したグル
タミン酸誘導体阻害活性の実験に用いた。 グルタミン酸遊離阻害活性の測定 経口測定用９６穴マイクロプレートの各ウェルに検体及
び調製したシナプトソームを８０μｌ（終濃度１．４mg
protein/ml)添加し、更に、１mMＮＡＤＰ ⁺、５０Ｖ
ＧＤＨを加え、最終容量２００μｌとして３７℃で２０
分間インキュ ベートした。なおカルシウム無添加試料
には、０．２mM ＥＧＴＡを添加した。次に、３０ｍＭ
塩化カリウムを加え脱分極させ、その１０分後に９６穴
マイクロプレート用自動蛍光光度計を用いて、３５５ｎ
Ｍで励起し、４６０ｎｍでの相対蛍光強度を測定した。
実験系において、カルシウム添加試料とカルシウム無添
加試料０．２mM ＥＧＴＡとの蛍光値の差が、カルシウ
ム依存性のグルタミン酸の遊離量となるため、検体のグ
ルタミン酸遊離の阻害率は、下記に示した数式により算
定した。The effects of the present invention will be shown below.
Examples of pharmacological experiments are listed. Example of Pharmacological Experiment (1) Glutamic Acid Release Inhibitory Activity i) Experimental Method Preparation of Synaptosome Fraction Preparation of synaptosome fraction is carried out by the following conventional method [EGG
ray et al., JAnat., 96, 79-88 (1962)]. In addition,
The solutions used for the preparation of synaptosomes were all sufficiently saturated with a mixed gas of 95% O ₂ + 5% CO ₂ before the experiment. After slaughtering 6-week-old male Wistar rats, the brain was rapidly removed, and a cold calcium-free Tyrode's solution [composition (mM): NaCl 140, KCl 5, MgCl ₂ 1, D-glucose 24, Na-HEPES 10] was used. , pH 7.4] and bisected between the inferior colliculus and the cerebellum and used its forebrain. A 20-fold volume of 0.32 M sucrose solution was added to the brain tissue, and the mixture was homogenized slowly with a glass homogenizer under ice cooling. 1000 x g, 4
After centrifugation at ℃ for 10 minutes, the supernatant was
Centrifuge for 20 minutes at 4 ° C. Calcium-free Tyrode's solution was added to the precipitate to obtain 3.5 mg protein / ml.
Suspended to a concentration, calcium chloride was added to 100 μM. A calcium-added sample and a calcium-free sample to which calcium chloride was not added were prepared and each was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The synaptosome fraction obtained as described above was used in the experiment of glutamate derivative inhibitory activity shown below. Measurement of Glutamic Acid Release Inhibitory Activity 80 μl (final concentration 1.4 mg) of the sample and the prepared synaptosome were added to each well of the 96-well microplate for oral measurement
protein / ml), 1 mM NADP ⁺ , 50 V
Add GDH to a final volume of 200 μl at 37 ° C for 20
Incubated for a minute. Note that 0.2 mM EGTA was added to the calcium-free sample. Next, 30 mM
Depolarize by adding potassium chloride, and 10 minutes after that, using an automatic fluorometer for 96-well microplate, 355n
Excitation with M was performed and the relative fluorescence intensity at 460 nm was measured.
In the experimental system, the difference in fluorescence value between the calcium-added sample and the calcium-free sample 0.2 mM EGTA is the amount of calcium-dependent release of glutamic acid, and therefore the inhibition rate of glutamic acid release of the sample is calculated by the following formula. Calculated by

【０００９】ii）実験結果 上記の方法で行った結果を表１に示した。Ii) Experimental Results Table 1 shows the results obtained by the above method.

【００１０】[0010]

【化１】 Embedded image

【００１１】精製したペプチドは、ＦＴＸ換算で１００
００倍希釈液及び１０００倍希釈液相当濃度において、
カルシウム依存性グルタミン酸の遊離を著明に抑制し、
その抑制は、濃度依存的であった。上記の結果より、本
発明にかかる蛋白質は、グルタミン酸遊離阻害作用を有
することが明らかとなった。よって、本発明にかかるペ
プチドは、脳虚血や癲癇重積状態などの病態で発生する
急性の脳障害又はアルツハイマー、ハンチントン舞踏症
などの慢性疾患などに代表される脳神経疾患治療剤とし
て用いることができるほか、脳神経生理の解明試薬とし
ても非常に有用なものであるということができる。更に
本発明にかかるペプチドは、毒性が低く安全性が高いの
で、その意味からも、本発明は有用であるといえる。The purified peptide is 100 in terms of FTX.
At a concentration equivalent to a 00-fold diluted solution and a 1000-fold diluted solution,
Remarkably suppresses the release of calcium-dependent glutamate,
The inhibition was concentration dependent. From the above results, it was revealed that the protein of the present invention has a glutamate release inhibitory action. Therefore, the peptide according to the present invention can be used as a therapeutic agent for cranial nerve diseases represented by acute brain damage or Alzheimer's disease, chronic disease such as Huntington's chorea, etc. that occur in pathological conditions such as cerebral ischemia and status epilepticus. Besides, it can be said that it is also very useful as a reagent for clarifying the neurophysiology of the brain. Furthermore, since the peptide according to the present invention has low toxicity and high safety, it can be said that the present invention is useful also in that sense.

【００１２】本発明にかかる蛋白質を医薬として使用す
る場合は、非経口投与により投与されるが、通常は、注
射などとして投与される。投与量は、症状の程度、患者
の年齢、性別、体重、薬剤に対する感受性差、投与の時
期、投与の間隔、医薬製剤の性質などによって異なり、
特に限定されないが、通常成人１回０．１μｇ／ｋｇー
３００μｇ／ｋｇが好ましい。注射剤を調製する場合に
は、主薬に、必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、懸濁化
剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤又は保存剤などを
添加し、常法により静脈、皮下、筋肉内注射剤とする。
その際必要に応じて、常法により凍結乾燥物とすること
も可能である。When the protein of the present invention is used as a medicine, it is administered parenterally, but usually it is administered by injection or the like. The dose varies depending on the degree of symptoms, age, sex, weight of the patient, difference in sensitivity to drugs, timing of administration, intervals of administration, properties of pharmaceutical preparations, etc.
Although not particularly limited, it is usually preferably 0.1 μg / kg-300 μg / kg per adult. When preparing an injection, a pH adjusting agent, a buffering agent, a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizing agent, an isotonicity agent, a preservative, etc. are added to the main drug as necessary, and intravenous injection is carried out by a conventional method. , Subcutaneous or intramuscular injection.
At that time, if necessary, a freeze-dried product can be prepared by a conventional method.

【００１３】懸濁化剤としての例を挙げれば、メチルセ
ルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセル
ロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレートなどを挙げることができる。溶解補助
剤としては、たとえば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリエチ
レンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ
油脂肪酸エチルエステルなどを挙げることができる。ま
た、安定化剤として例えば、亜硫酸ナトリウム、メタ亜
硫酸ナトリウム、エーテルなどが、保存剤としては、例
えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸
エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロ
クレゾールなどを挙げることができる。Examples of suspending agents include methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethyl cellulose, and polyoxyethylene sorbitan monolaurate. Examples of the solubilizing agent include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyethylene sorbitan monolaurate, macrogol, and castor oil fatty acid ethyl ester. Examples of the stabilizer include sodium sulfite, sodium metasulfite, ether and the like, and examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol and chlorocresol. it can.

【００１４】[0014]

【実施例】本発明を更に詳述するために、以下に本発明
の実施例を掲げるが、本発明は、これに限定されないこ
とはいうまでもない。EXAMPLES In order to describe the present invention in more detail, examples of the present invention will be given below, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.

【００１５】実施例１ （１）本発明にかかる蛋白質の精製 ＦＴＸ２０μｌに１％トリフルオロ酢酸２μｌを加え酸
性として後、これを高速液体クロマトグラフィーに供
し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したブラ
ウンリーＲＰ−８（４．６mm径×２５cm長）に吸着させ
た。同溶液と６０％アセトニトリル水溶液による濃度勾
配溶出法により活性成分を溶出した。以下に示した図１
はその溶出パターンであり、横軸は、濃度勾配溶出後の
経過時間、縦軸は、吸光度を示した。図１で黒く塗りつ
ぶしたグルタミン酸遊離阻害活性を有する画分を集め、
凍結乾燥により溶媒を除去した。得られた物質につい
て、レーザーデソープション飛行時間型質量分析計にて
分析を行ったところ、分子量約３００００ダルトンの単
一成分として認められた。Example 1 (1) Purification of protein according to the present invention After adding 2 μl of 1% trifluoroacetic acid to 20 μl of FTX to acidify it, it was subjected to high performance liquid chromatography and equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution. It was adsorbed on the prepared Brownley RP-8 (4.6 mm diameter × 25 cm length). The active ingredient was eluted by a concentration gradient elution method using the same solution and a 60% acetonitrile aqueous solution. Figure 1 shown below
Is the elution pattern, the horizontal axis represents the elapsed time after elution of the concentration gradient, and the vertical axis represents the absorbance. Fractions having glutamate release inhibitory activity, which are filled in black in FIG. 1, are collected,
The solvent was removed by freeze-drying. When the obtained substance was analyzed by a laser desorption time-of-flight mass spectrometer, it was recognized as a single component having a molecular weight of about 30,000 daltons.

【００１６】（２）構造解析 本物質約１００ピコモルを用いて、気相プロテインシー
クエンサー（島津製作所）によりアミノ酸末端側から確
認された。また、本物質を２ーメルカプトエタノールを
用いて還元した後、前述の質量分析計にて分析を行った
ところ、分子量が約２８０００ダルトンと約２０００ダ
ルトンの２成分が検出された。すなわち本物質はジスル
フィド結合によって結合した２本鎖蛋白質であることが
判明した。上記の方法で得られた１本鎖のペプチドのそ
れぞれのアミノ酸配列決定は、クレストフィールド（Cr
estfield)等の方法に従い還元カルボキサミドメチル化
した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化した
バイダックＣ４カラム（４．６mm径×１５cm長）に吸着
させ、同溶液と８０％アセトニトリルによる濃度勾配溶
出法により本物質を図２に示すように軽鎖と重鎖に分離
精製した。分離した両鎖について各々を気相プロテイン
シークエンサーを用いてアミノ末端側からのアミノ酸配
列解析を行った。その結果、軽鎖に関しては、配列表の
配列番号１に示すように、１８残基のアミノ酸配列を決
定した。重鎖に関しては、更にリシルエンドペプチダー
ゼ、黄色ブドウ球菌由来Ｖ８プロテアーゼ、アルギニル
エンドペプチダーゼ、アスパラギニルエンドペプチダー
ゼにより、断片ペプチドを調製し、各ペプチドのアミノ
酸配列を解析し、以下の配列番号２のアミノ末端から２
４３残基のアミノ酸配列を決定した。更にこの構造解析
に際し、軽鎖の９残基目のシステインと重鎖の１１６残
基目のシステインがジスルフィド結合することにより２
本鎖を形成すること、重鎖の３１残基目のシステインと
４７残基目のシステイン、１５９残基目のシステインと
１８１残基目のシステイン及び１９０残基目のシステイ
ンと２１９残基目のシステインがジスルフィド結合して
いることも判明した。(2) Structural analysis Using about 100 picomoles of this substance, it was confirmed from the amino acid terminal side by a gas phase protein sequencer (Shimadzu Corporation). Further, when this substance was reduced with 2-mercaptoethanol and analyzed by the above-mentioned mass spectrometer, two components having a molecular weight of about 28,000 daltons and about 2000 daltons were detected. That is, this substance was found to be a double-stranded protein bound by a disulfide bond. The amino acid sequence of each of the single-chain peptides obtained by the above method was determined by crest field (Cr
estfield) and the like, followed by reducing carboxamide methylation and adsorbing on a Vydac C4 column (4.6 mm diameter x 15 cm length) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution, and a concentration gradient of the same solution and 80% acetonitrile. This substance was separated and purified into a light chain and a heavy chain by the elution method as shown in FIG. Each of the separated chains was analyzed for amino acid sequence from the amino terminal side using a gas phase protein sequencer. As a result, as for the light chain, the amino acid sequence of 18 residues was determined as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Regarding the heavy chain, fragment peptides were prepared by lysyl endopeptidase, S. aureus-derived V8 protease, arginyl endopeptidase, and asparaginyl endopeptidase, and the amino acid sequence of each peptide was analyzed. 2 from the amino terminus
The amino acid sequence of 43 residues was determined. Furthermore, in this structural analysis, the cysteine at the 9th residue of the light chain and the cysteine at the 116th residue of the heavy chain were disulfide-bonded to
Forming a main chain, cysteine at residue 31 and cysteine at residue 47 of heavy chain, cysteine at residue 159, cysteine at residue 181 and cysteine at residue 190 and cysteine at residue 219 It was also found that cysteine was disulfide-bonded.

【００１７】[0017]

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Glu Val Ala Thr Val Lys Asn Cys Gly Lys Lys Leu Leu Ala Thr 1’ 5’ 10’ 15’ Pro Arg 18’[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 18 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Val Glu Val Ala Thr Val Lys Asn Cys Gly Lys Lys Leu Leu Ala Thr 1'5 ' 10 '15' Pro Arg 18 '

【００１８】配列番号：２ 配列の長さ：２４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Val Gly Gly Lys Thr Ala Lys Phe Gly Asp Tyr Pro Trp Met Val 1 5 10 15 Ser Ile Gln Gln Lys Asn Lys Lys Gly Thr Phe Asp His Ile Cys Gly 20 25 30 Gly Ala Ile Ile Asn Val Asn Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Phe 35 40 45 Asp Gln Pro Ile Val Lys Ser Asp Tyr Arg Ala Tyr Val Gly Leu Arg 50 55 60 Ser Ile Leu His Thr Lys Glu Asn Thr Val Gln Arg Leu Glu Leu Ser 65 70 75 80 Lys Ile Val Leu His Pro Gly Tyr Lys Pro Lys Lys Asp Pro Asp Asp 85 90 95 Ile Ala Leu Ile Lys Val Ala Lys Pro Ile Val Ile Gly Asn Tyr Ala 100 105 110 Asx Gly Ile Cys Val Pro Lys Gly Val Thr Asn Pro Glu Gly Asn Ala 115 120 125 Thr Val Ile Gly Trp Gly Lys Ile Ser Ser Gly Gly Lys Gln Val Asn 130 135 140 Thr Leu Gln Glu Val Thr Ile Pro Ile Ile Pro Trp Lys Lys Cys Lys 145 150 155 160 Glu Ile Tyr Gly Asp Glu Phe Ser Glu Phe Glu Tyr Ser Gln Ile Thr 165 170 175 Pro Tyr Met Ile Cys Ala Gly Ala Glu Gly Lys Asp Ser Cys Gln Ala 180 185 190 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Phe Gln Ile Asp Ala Asn Gly Val Ala Thr 195 200 205 Leu Ile Gly Thr Val Ala Asn Gly Ala Asp Cys Gly Tyr Lys His Tyr 210 215 220 Pro Gly Val Tyr Met Lys Val Ser Ser Tyr Thr Asn Trp Met Ser Lys 225 230 235 240 Asn Met Val 243SEQ ID NO: 2 Sequence length: 243 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Ile Val Gly Gly Lys Thr Ala Lys Phe Gly Asp Tyr Pro Trp Met Val 1 5 10 15 Ser Ile Gln Gln Lys Asn Lys Lys Gly Thr Phe Asp His Ile Cys Gly 20 25 30 Gly Ala Ile Ile Asn Val Asn Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Phe 35 40 45 Asp Gln Pro Ile Val Lys Ser Asp Tyr Arg Ala Tyr Val Gly Leu Arg 50 55 60 Ser Ile Leu His Thr Lys Glu Asn Thr Val Gln Arg Leu Glu Leu Ser 65 70 75 80 Lys Ile Val Leu His Pro Gly Tyr Lys Pro Lys Lys Asp Pro Asp Asp 85 90 95 Ile Ala Leu Ile Lys Val Ala Lys Pro Ile Val Ile Gly Asn Tyr Ala 100 105 110 Asx Gly Ile Cys Val Pro Lys Gly Val Thr Asn Pro Glu Gly Asn Ala 115 120 125 Thr Val Ile Gly Trp Gly Lys Ile Ser Ser Gly Gly Lys Gln Val Asn 130 135 140 Thr Leu Gln Glu Val Thr Ile Pro Ile Ile Pro Trp Lys Lys Cys Lys 145 150 155 160 Glu Ile Tyr Gly Asp Glu Phe Ser Glu Phe Glu Tyr Ser Gln Ile Thr 165 170 175 Pro Tyr Met Ile Cys Ala Gly Ala Glu Gly Lys Asp Ser Cys Gln Ala 180 185 190 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Phe Gln Ile Asp Ala Asn Gly Val Ala Thr 195 200 205 Leu Ile Gly Thr Val Ala Asn Gly Ala Asp Cys Gly Tyr Lys His Tyr 210 215 220 Pro Gly Val Tyr Met Lys Val Ser Ser Tyr Thr Asn Trp Met Ser Lys 225 230 235 240 Asn Met Val 243

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明にかかるペプチドの第１段階精製クロマ
トパターンを示す。縦軸の吸光度は、２７９nmで測定し
ており、１．０ＡＵＦＳで示してある。FIG. 1 shows a first-stage purification chromatographic pattern of a peptide according to the present invention. Absorbance on the vertical axis is measured at 279 nm and is shown as 1.0 AUFS.

【図２】本発明にかかるペプチドの第２段階精製クロマ
トパターンを示す。縦軸の吸光度は、２７９nmで測定し
ており、０．０５ＡＵＦＳで示してある。FIG. 2 shows a second-stage purification chromatographic pattern of the peptide according to the present invention. Absorbance on the vertical axis is measured at 279 nm and is shown as 0.05 AUFS.

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成８年３月１３日[Submission date] March 13, 1996

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing

【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All drawings

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【図１】 FIG.

【図２】 [Fig. 2]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西沢 幸夫 茨城県つくば市松代４ー６ー32 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yukio Nishizawa 4-6-32 Matsushiro Tsukuba, Ibaraki

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】配列番号１記載のアミノ酸配列の一部又は
全部を包含するペプチド又はこれと本質的に同等なペプ
チド。1. A peptide including a part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide essentially equivalent thereto. 【請求項２】配列番号２記載のアミノ酸の一部又は全部
を包含する蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白質。2. A protein containing a part or all of the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 or a protein essentially equivalent thereto. 【請求項３】配列番号１記載のアミノ酸配列の一部又は
全部を包含する蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白質
と配列番号２記載のアミノ酸配列の一部又は全部を包含
する蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白質が２本鎖を
形成している蛋白質もしくはこの一部分からなる蛋白質
又はこれと本質的に同等な蛋白質。3. A protein containing part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein essentially equivalent thereto and a protein containing part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or this A protein in which an essentially equivalent protein forms a double chain, a protein consisting of a part thereof, or a protein essentially equivalent thereto. 【請求項４】配列番号１記載のアミノ酸配列の一部又は
全部を包含する蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白質
と配列番号２記載のアミノ酸配列の一部又は全部を包含
する蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋白質がジスルフ
ィド結合によって２本鎖を形成している蛋白質もしくは
この一部分からなる蛋白質又はこれと本質的に同等な蛋
白質。4. A protein containing part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein essentially equivalent thereto and a protein containing part or all of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or this A protein in which an essentially equivalent protein forms a double chain by a disulfide bond, a protein consisting of a part thereof, or a protein essentially equivalent thereto. 【請求項５】請求項１記載のグルタミン酸阻害活性蛋白
質。5. The glutamic acid inhibitory activity protein according to claim 1. 【請求項６】請求項２記載のグルタミン酸遊離阻害活性
蛋白質。6. The glutamic acid release inhibitory protein according to claim 2. 【請求項７】請求項３記載のグルタミン酸遊離阻害活性
蛋白質。7. The glutamic acid release inhibitory activity protein according to claim 3. 【請求項８】請求項１、請求項２又は請求項３記載の蛋
白質を有効成分とするグルタミン酸遊離阻害活性作用が
有効な疾患の予防・治療剤。 【産業上の利用分野】本発明は、グルタミン酸遊離阻害
活性を有する医薬として有用な新規蛋白質に関する。8. A prophylactic / therapeutic agent for a disease, which contains the protein according to claim 1, claim 2 or claim 3 as an active ingredient and has an effective glutamic acid release inhibitory activity. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel protein having a glutamate release inhibitory activity and useful as a medicine.