JPH08252099A - Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus and detection kit - Google Patents
Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus and detection kitInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、感染症対策上重要
なメチシリン耐性ブドウ球菌、とりわけメチシリン耐性
黄色ブドウ球菌を検出する方法及び検出用キットに関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method and a detection kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus, particularly methicillin-resistant Staphylococcus aureus, which is important for controlling infectious diseases.
【０００２】[0002]
【従来の技術】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、
ＭＲＳＡ）は日本国内における細菌検査で検出されるブ
ドウ球菌の５０％以上を占め、院内感染の原因菌として
特に注意が必要とされている。この菌はβ−ラクタム薬
をはじめとするほとんど全ての抗生物質に耐性を示し、
効果的な薬剤は少ない。一般に感染症が疑われたときに
予防的に投与される抗生物質のほとんどはＭＲＳＡに効
果がなく、かえってＭＲＳＡ感染を進めることにもなり
かねず、検査材料からＭＲＳＡを迅速かつ正確に検出・
同定することは、感染症の予防・治療にあたって極めて
重要であると考えられている。2. Description of the Related Art Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (hereinafter referred to as
MRSA accounts for 50% or more of staphylococci detected by a bacterial test in Japan, and requires special attention as a causative bacterium of nosocomial infection. This bacterium is resistant to almost all antibiotics, including β-lactam drugs,
There are few effective drugs. In general, most antibiotics that are prophylactically administered when an infectious disease is suspected have no effect on MRSA and may even lead to MRSA infection. Therefore, MRSA can be detected quickly and accurately from test materials.
Identification is considered to be extremely important in the prevention and treatment of infectious diseases.
【０００３】ＭＲＳＡの同定は従来、臨床材料から分離
された菌について培養試験で薬剤感受性を見ることによ
り行われている。しかし、培養試験で薬剤感受性を見る
場合は、分離培養に１日以上、感受性試験に１日以上を
必要とする。加えて、ＭＲＳＡの薬剤耐性の発現は複雑
な制御を受けており、培養試験ではＭＲＳＡを見逃すこ
ともある。The identification of MRSA has hitherto been carried out by observing the drug susceptibility of a bacterium isolated from clinical material in a culture test. However, when drug sensitivity is observed in a culture test, one day or more is required for the isolation culture, and one day or more is required for the sensitivity test. In addition, the expression of drug resistance of MRSA is under complicated control, and MRSA may be overlooked in culture tests.
【０００４】そこで、ＭＲＳＡの耐性の本体であるＰＢ
Ｐ−２′という新たな細胞壁合成酵素の設計遺伝子であ
るｍｅｃＡ遺伝子を検出することによって感受性試験の
結果を待たずに、かつ培養のぶれに関係なくＭＲＳＡの
判定を行える方法がポリメラーゼ増幅反応（以下、ＰＣ
Ｒ；特開昭６０−２８１号公報参照）を応用して開発さ
れ〔生方ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
０，Ｐ．１７２８−１７３３（１９９２）〕、すでに実
用化もされている。Therefore, the main body of MRSA resistance is PB.
By detecting the mecA gene, which is a new cell wall synthase design gene called P-2 ′, MRSA can be determined without waiting for the result of the susceptibility test and regardless of the shake of the culture. , PC
R; see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-281). Clin. Microbiol. Three
0, P. 1728-1733 (1992)], which has already been put to practical use.
【０００５】しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は黄色ブドウ球菌
だけでなく他のブドウ球菌（コアグラーゼ陰性ブドウ球
菌：以下、ＣＮＳ）も有していることがあり、薬剤感受
性に配慮した感染症対策という立場からはメチシリン耐
性ＣＮＳ（以下、ＭＲ−ＣＮＳ）とＭＲＳＡとを区別す
ることが重要となってきた。特に、黄色ブドウ球菌はブ
ドウ球菌の中でも毒性が高くＣＮＳに比べて臨床的重要
度が高いと考えられていることから、検出されたブドウ
球菌が黄色ブドウ球菌であるか否かが依然重要な情報と
して必要と考えられており、ｍｅｃＡ遺伝子を検出及び
同定すると同時にＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別するこ
とが要望されていた。However, the mecA gene may have not only Staphylococcus aureus but also other staphylococci (coagulase-negative staphylococci: hereinafter, CNS). It has become important to distinguish between resistant CNS (hereinafter MR-CNS) and MRSA. In particular, since Staphylococcus aureus is considered to be highly virulent among Staphylococcus and has a higher clinical importance than CNS, it is still important information whether the detected Staphylococcus is Staphylococcus aureus. It has been considered necessary to detect and identify the mecA gene, and at the same time, to distinguish MRSA from MR-CNS.
【０００６】ＰＣＲは遺伝子の検出と同定を迅速かつ高
感度に行う手段として有用であり、これを用いて黄色ブ
ドウ球菌特異的な遺伝子とｍｅｃＡ遺伝子を同一反応で
増幅することは理論的には可能であるが、これを同一反
応容器中で実施しようとするとき、別々の遺伝子を増幅
するプライマーを単純に４種組み合わせただけでは満足
のいく特異的な遺伝子増幅が得られるとは限らないのが
実状である。すなわち、ＰＣＲにおいて２つ以上の遺伝
子を一度に増幅する場合（多重ＰＣＲ）においては、プ
ライマー同士の増幅反応を含む目的以外の遺伝子の非特
異的増幅反応の頻度が高くなるのが一般的である。たと
えば４つのプライマーを用いて同時にＰＣＲ反応を行う
とき、４つのプライマーの解離温度（Ｔｍ）を合わせる
こと、また４つのプライマーがとりうる組み合わせにお
いてそれぞれの配列が相補的とならないように設計する
ことなどは当然のことであるが、これらを十分に考慮し
て設計した場合においても予期せぬ反応効率の低下や、
非特異的増幅物の生成などが見られることがあり〔Ｃｈ
ａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅ
ｓ．１６，Ｐ．１１１４１−１１１５６（１９８８）；
Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ，Ｐ．２７２−２８１，Ｉｎｎｉｓ他編集，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｅｄｗａｒｄｓ
ら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ３，Ｐ．５６５−５７５（１９９４）〕、特異
的なプライマーの組み合わせを得ることは容易ではなか
った。PCR is useful as a means for rapid and highly sensitive detection and identification of a gene, and it is theoretically possible to amplify a gene specific to S. aureus and a mecA gene in the same reaction using this. However, when trying to carry out this in the same reaction vessel, it is not always possible to obtain satisfactory specific gene amplification simply by combining four kinds of primers that amplify different genes. It is the actual situation. That is, in the case of amplifying two or more genes at once in PCR (multiplex PCR), the frequency of nonspecific amplification reaction of genes other than the purpose including amplification reaction between primers is generally high. . For example, when performing PCR reaction simultaneously using four primers, match the dissociation temperatures (Tm) of the four primers, and design such that the respective sequences are not complementary in the combinations that the four primers can take. Is a matter of course, even when designed with due consideration of these factors, unexpected reduction in reaction efficiency,
The formation of non-specific amplification products may be observed [Ch
amberrain et al., Nucleic AcidRe
s. 16, P.I. 11141-11156 (1988);
Chamberlain et al., PCR Protocol
s, P. 272-281, Edited by Innis et al., Acad
emic Press (1990); Edwards
Et al., PCRMethod and Applicati
ons 3, P. 565-575 (1994)], it was not easy to obtain a specific primer combination.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ＰＣＲを利用し、ＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別し
て検出する、迅速かつ簡便な方法を提供することにあ
る。SUMMARY OF THE INVENTION It is, therefore, an object of the present invention to provide a rapid and simple method which utilizes PCR to detect MRSA and MR-CNS separately.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らはＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳとをＰＣＲ法にて区
別して検出するためのプライマーの設計について種々の
検討を行い、メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子を増
幅するプライマー２種と、黄色ブドウ球菌を他のブドウ
球菌群から識別するマーカーとして知られているプロテ
インＡ〔Ｆｏｒｓｇｒｅｎ，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７５，Ｐ．４８１−
４９０（１９６９）；Ｈｊｏｌｍら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ．２８，Ｐ．７３−７６〕の遺伝子であるｓｐ
ａ遺伝子を増幅するプライマー２種とを組み合わせるこ
とを考案した。しかし、検査を迅速かつ簡便なものとす
ることを考慮するとＰＣＲの反応時間が長すぎずかつ高
感度を保つことが必要であり、そのためにはＰＣＲによ
る遺伝子増幅で得られるＤＮＡの長さが４０塩基対から
３００塩基対の範囲であるプライマーの組み合わせ中か
ら選択することが望ましく、加えて、その中から非特異
的増幅反応をともなわず双方の遺伝子を増幅し得るプラ
イマーの組み合わせを得ることは容易ではなかった。Under such circumstances, the present inventors have conducted various studies on the design of primers for distinguishing and detecting MRSA and MR-CNS by the PCR method, and showed mecA showing methicillin resistance. Two kinds of primers for amplifying a gene and protein A known as a marker for distinguishing Staphylococcus aureus from other Staphylococcus group [Forsgren, Acta Pathol.
Microbiol. Scand. 75, P.I. 481-
490 (1969); Hjolm et al., FEBS Let.
ters. 28, P.P. 73-76] gene, sp
It was devised to combine with two kinds of primers for amplifying a gene. However, in consideration of making the test quick and simple, it is necessary that the reaction time of PCR is not too long and the sensitivity is high. For that purpose, the length of DNA obtained by gene amplification by PCR is 40 or less. It is desirable to select from among primer combinations in the range of base pairs to 300 base pairs, and in addition, it is easy to obtain primer combinations capable of amplifying both genes without nonspecific amplification reaction. Was not.
【０００９】そこで本発明者らは上記の条件を満足させ
るべく更に検討を重ねた結果、ｍｅｃＡ遺伝子特異的な
ＰＣＲプライマーとして下記（１）及び（２）で示され
る配列のオリゴヌクレオチドを用い、ｓｐａ遺伝子特異
的なＰＣＲプライマーとして下記（３）及び（４）で示
されるオリゴヌクレオチドを用いれば、ＭＲＳＡがＭＲ
−ＮＣＳと明確に区別して検出できることを見出し、本
発明を完成するに至った。Then, the present inventors have conducted further studies to satisfy the above conditions, and as a result, as a PCR primer specific to the mecA gene, the oligonucleotides of the sequences shown in (1) and (2) below were used, and spa was used. When the oligonucleotides shown in (3) and (4) below are used as gene-specific PCR primers, MRSA
-The inventors have found that they can be detected by being clearly distinguished from NCS, and have completed the present invention.
【００１０】すなわち、本発明は下記の塩基配列
（１）、（２）、（３）及び（４）； （１）5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′ （２）5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′ （３）5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′ （４）5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′ 〔式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、
Ｔはチミンを示し、任意のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れていてもよい〕で表わされる４種のオリゴヌクレオチ
ドを遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴
とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法を提供す
るものである。That is, the present invention provides the following nucleotide sequences (1), (2), (3) and (4); (1) 5'AGAAATGACTGAACGTCCG 3 '(2) 5'GCGATCAATGTTACCGTAG 3' (3) 5'TACATGTCGTTAAACCTGGTG. 3 ′ (4) 5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3 ′ [wherein A is adenine, G is guanine, C is cytosine,
T represents thymine, and any T may be substituted with uracil (U)] as a gene amplification reaction primer, and a method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Is provided.
【００１１】また、本発明は上記４種のオリゴヌクレオ
チドを含有することを特徴とするメチシリン耐性黄色ブ
ドウ球菌検出用キットを提供するものである。The present invention also provides a kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus, which comprises the above-mentioned four kinds of oligonucleotides.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】本発明に用いるプライマーのう
ち、上記塩基配列（１）及び（２）で表わされるオリゴ
ヌクレオチド〔以下、プライマー（１）、プライマー
（２）と称す〕は、松橋らによって報告されているｍｅ
ｃＡ遺伝子の配列〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２
１，Ｐ．１６７−１７１（１９８７）〕から選択された
ものであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に
合成することができる。一方、上記塩基配列（３）及び
（４）で表わされるオリゴヌクレオチド〔以下、プライ
マー（３）、プライマー（４）と称す〕は、Ｆｉｎｃｋ
−Ｂａｒｂａｎｃｏｎらによって報告されているｓｐａ
遺伝子の配列〔ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．９１，Ｐ．１−８（１９９２）〕から選択されたも
のであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合
成することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Among the primers used in the present invention, the oligonucleotides represented by the above-mentioned base sequences (1) and (2) [hereinafter referred to as primer (1) and primer (2)] are described by Matsuhashi et al. Reported me
Sequence of cA gene [FEBS Letters 22
1, P. 167-171 (1987)], and can be chemically synthesized using, for example, an automatic DNA synthesizer. On the other hand, the oligonucleotides represented by the above nucleotide sequences (3) and (4) [hereinafter referred to as primer (3) and primer (4)] are
-Spa reported by Barbancon et al.
Gene sequence [FEMS Microbiol. Let
t. 91, P.I. 1-8 (1992)], and can be chemically synthesized using, for example, an automatic DNA synthesizer.
【００１３】本発明のＭＲＳＡの検出法は、前記４種の
プライマーを組み合わせて用いる以外は、通常のＰＣＲ
法に従って行われる。すなわち、検体に前記４種のプラ
イマー及びポリメラーゼを用い、１本鎖ＤＮＡへの変性
処理、アニーリング及び伸長反応を数十回繰り返した後
増幅された遺伝子を検出することにより行われる。The detection method of MRSA of the present invention is a conventional PCR except that the above-mentioned four kinds of primers are used in combination.
It is done according to the law. That is, it is carried out by using the above-mentioned four kinds of primers and a polymerase as a sample, repeating denaturation treatment into single-stranded DNA, annealing and extension reaction several tens times, and then detecting the amplified gene.
【００１４】本発明の検出法における検体としては、各
種臨床検査材料、血液、膿汁、喀痰、髄液、咽頭拭い
液、糞便、尿など、あるいはそれらから得られた細菌培
養液、単離・培養された細菌コロニーなどを用いること
ができる。検査にはこれらの材料からＰＣＲの試料とな
るブドウ球菌の核酸成分を抽出することが必要である
が、そのための方法としてはアルカリや界面活性剤を用
いる方法、プロテイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素を用
いる方法等が利用できる。また、リゾスタフィンやアク
ロモペプチダーゼといった、ブドウ球菌に特有な膜の分
解を行う酵素の使用は核酸の抽出効率を上げ、検査の感
度を上げることができる。As the sample in the detection method of the present invention, various clinical test materials, blood, pus, sputum, cerebrospinal fluid, pharyngeal swab, feces, urine, etc., or a bacterial culture solution obtained from them, isolation / culture Bacterial colonies etc. can be used. For the inspection, it is necessary to extract the nucleic acid component of Staphylococcus, which is a PCR sample, from these materials. As a method for this, a method using an alkali or a surfactant, or a proteinase such as proteinase K is used. Methods etc. can be used. In addition, the use of enzymes such as lysostaphin and achromopeptidase, which are characteristic of staphylococcal membranes for degrading membranes, can increase the extraction efficiency of nucleic acids and increase the sensitivity of the test.
【００１５】これらの核酸抽出溶液はその一部をそのま
まＰＣＲに供することもできるが、核酸の精製や濃縮の
操作を加えることでＰＣＲの感度を上げることも可能で
ある。精製や濃縮のための方法としては、フェノールな
どの有機溶媒を蛋白質の変性剤として用いる方法、その
他の特異的な蛋白質変性剤を用いる方法〔Ｂｅｕｔｌｅ
ｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９，Ｐ．１６６
（１９９０）〕、捕獲・濃縮用のプローブを固定したラ
テックス粒子など担体を用いる方法〔特開昭６３−１１
７２６２号公報〕などが挙げられる。Although a part of these nucleic acid extraction solutions can be directly subjected to PCR, it is also possible to increase the sensitivity of PCR by adding nucleic acid purification or concentration operations. As a method for purification or concentration, a method of using an organic solvent such as phenol as a protein denaturant, or a method of using other specific protein denaturant [Beutle
r. et al., BioTechniques 9, P.R. 166
(1990)], a method of using a carrier such as latex particles having a probe for capturing and concentrating [JP-A-63-11].
No. 7262].
【００１６】ＰＣＲに用いるポリメラーゼとしては、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いるのが好ましい。１本鎖ＤＮＡへの変性処
理は熱処理が好ましい。好ましいＰＣＲ条件としては、
例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、温度サイクル
条件は、９０℃〜９６℃で１０秒〜６０秒、より好まし
くは９２℃で１５秒の変性工程、５０℃〜６５℃で１０
秒〜６０秒、より好ましくは６０℃〜６５℃で１５秒の
アニーリング工程、７２℃で０秒〜６０秒、より好まし
くは５秒〜１５秒の伸長工程の繰り返しを行う方法が挙
げられる。The polymerase used for PCR is preferably a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase. The denaturing treatment for single-stranded DNA is preferably heat treatment. Preferred PCR conditions include:
For example, using a thermostable DNA polymerase, the temperature cycle conditions are 90 ° C. to 96 ° C. for 10 seconds to 60 seconds, more preferably 92 ° C. for 15 seconds for denaturation step, and 50 ° C. to 65 ° C. for 10 seconds.
Examples include a method of repeating an annealing step for 60 seconds to 60 seconds, more preferably 60 ° C. to 65 ° C. for 15 seconds, and an extension step at 72 ° C. for 0 seconds to 60 seconds, more preferably 5 seconds to 15 seconds.
【００１７】本発明におけるプライマーを用いたＰＣＲ
によるＤＮＡ増幅の判定は、生成した増幅ＤＮＡのサイ
ズを電気泳動で確認する方法や、ニトロセルロース膜な
どに反応物を固定し目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な
配列を持つ標識プローブとハイブリダイゼーションを行
わせる方法などで可能であるが、より簡便にＤＮＡ増幅
の判定を行うには、識別可能な標識を施したプライマー
を用いてＰＣＲを行い、標識された増幅ＤＮＡを固相に
捕獲して識別する方法が有利である。PCR using the primers of the present invention
The determination of the DNA amplification by the method is performed by confirming the size of the generated amplified DNA by electrophoresis, or by immobilizing the reaction product on a nitrocellulose membrane or the like and hybridizing with a labeled probe having a sequence complementary to the sequence of the target amplified DNA. However, in order to more easily determine the DNA amplification, PCR is carried out using a primer having an identifiable label, and the labeled amplified DNA is captured on a solid phase. A method of identification is advantageous.
【００１８】増幅ＤＮＡを捕獲して識別する方法として
は、標識に特異的に結合する物質をあらかじめ固定した
固相を用いる方法〔特開平１−２５２３００号公報〕、
目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ捕獲プロ
ーブをあらかじめ固相に固定しておき、ハイブリダイゼ
ーションによって特異的な結合を行わせる方法などがあ
り、そのための固相としては、マイクロタイターウエ
ル、あるいはビーズなどを用いることができるが、一度
に多検体を処理するにはマイクロタイターウエルを使用
するのが有利である。As a method for capturing and distinguishing amplified DNA, a method using a solid phase on which a substance that specifically binds to a label is immobilized in advance [JP-A-1-252300],
There is a method in which a capture probe having a sequence complementary to the sequence of the target amplified DNA is immobilized on a solid phase in advance, and specific binding is carried out by hybridization. As a solid phase therefor, a microtiter well is used. Alternatively, beads or the like can be used, but it is advantageous to use a microtiter well in order to process many samples at one time.
【００１９】ところで、臨床検体を直接の試料として検
査を行うときには、試料中にブドウ球菌が存在したとし
てもその数が少なくＰＣＲにおいてもＤＮＡ増幅のため
の温度サイクルを相当数繰り返す必要があることが考え
られる。こうした場合には、十分に検討して得たプライ
マーを用いた場合でさえも、非特異的な増幅ＤＮＡが生
じる危険を完全に拭うことはできず、増幅ＤＮＡの捕獲
には捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを利用す
ることが望ましい。捕獲プローブのマイクロタイターウ
エルへの固定には川井らの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０９，Ｐ．６３−６
９〕などを用いることができる。By the way, when conducting a test using a clinical specimen as a direct sample, even if Staphylococcus is present in the sample, the number thereof is small and it is necessary to repeat a considerable number of temperature cycles for DNA amplification in PCR. Conceivable. In such a case, the risk of non-specifically amplified DNA cannot be completely wiped out even with the use of primers that have been thoroughly studied, and the capture of the amplified DNA cannot be performed with a capture probe. It is desirable to utilize hybridization. The method of Kawai et al. [Analytical] was used to fix the capture probe to the microtiter well.
Biochemistry 209, P.M. 63-6
9] and the like can be used.
【００２０】[0020]
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００２１】実施例１（プライマーの選択） （１）検体の調製 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＴＫ７８４株及び大腸菌
をそれぞれＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で培養
し、ＳＤＳ−フェノール法でＤＮＡを抽出・調製した。Example 1 (Selection of Primer) (1) Preparation of Specimens Methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain TK784 and Escherichia coli were each cultured in Mueller-Hinton medium, and DNA was extracted and prepared by SDS-phenol method.
【００２２】（２）プライマーの合成と標識 プライマーとするオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列か
ら設計したｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー（Ｍ１〜Ｍ
１２）及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１〜Ｓ
４）をアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成装置を
用いてホスホアミダイド法にて合成した。５′末端の塩
基にはアミノリンクII（商品名：アプライドバイオシス
テム社）を用いてアミノ基を導入し、その後セファデッ
クスＧ−５０を用いたゲル濾過で精製した。得られたア
ミノ化オリゴヌクレオチドは以下のように標識化した。
すなわち、１０μg／μl ＤＭＦと１００mM ＮａＨＣ
Ｏ3を含む溶液中でアミノ化オリゴヌクレオチドをビオ
チニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルと反応さ
せ、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを得た。又は、３
３％エタノールと６７mM ＮａＨＣＯ3を含む溶液中で
アミノ化オリゴヌクレオチドをジニトロフルオロベンゼ
ンと反応させてジニトロフェニル標識オリゴヌクレオチ
ドを得た。(2) Synthesis and labeling of primer The oligonucleotide used as a primer is a mecA gene amplification primer (M1 to M) designed from the gene sequence.
12) and a spa gene amplification primer (S1 to S)
4) was synthesized by the phosphoramidide method using a DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems. An amino group was introduced into the base at the 5'end using Aminolink II (trade name: Applied Biosystems), and then purified by gel filtration using Sephadex G-50. The resulting aminated oligonucleotide was labeled as follows.
That is, 10 μg / μl DMF and 100 mM NaHC
The aminated oligonucleotide was reacted with biotinyl-N-hydroxysuccinimide ester in a solution containing O 3 to obtain a biotin-labeled oligonucleotide. Or 3
The aminated oligonucleotide was reacted with dinitrofluorobenzene in a solution containing 3% ethanol and 67 mM NaHCO 3 to obtain a dinitrophenyl labeled oligonucleotide.
【００２３】（３）ＰＣＲ ＰＣＲは、検体ＤＮＡ（２０ng）と、各プライマー（ｍ
ｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー２種類及びｓｐａ遺伝子
増幅用プライマー２種類：それぞれ５０ng／５０μ
l）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／５０
μl）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰそれぞれ２００
μM、ｄＵＴＰ ４００μM、５０mM ＫＣｌ、５０mM
トリス緩衝液（pH８．３）という反応液組成で、パーキ
ンエルマー・シータス社のサーマルサイクラー９６００
を用い、９２℃で１５秒の変性工程、６０℃で１５秒の
アニーリング工程、７２℃で１５秒の伸長工程という温
度サイクルを４０回繰り返して実施した。(3) PCR In PCR, the sample DNA (20 ng) and each primer (m
Two types of ecA gene amplification primers and two types of spa gene amplification primers: 50 ng / 50 μ each
l), Taq DNA polymerase (2.5 units / 50
μl), dATP, dGTP, dCTP each 200
μM, dUTP 400 μM, 50 mM KCl, 50 mM
Thermal cycler 9600 from Perkin-Elmer Cetus with a reaction solution composition of Tris buffer (pH 8.3)
The temperature cycle of denaturing step at 92 ° C. for 15 seconds, annealing step at 60 ° C. for 15 seconds, and extension step at 72 ° C. for 15 seconds was repeated 40 times using the above.
【００２４】プライマーは、表１に示すｍｅｃＡ遺伝子
増幅プライマー（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ
６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２）及び
ｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ
４）を表２の組み合わせで加えた。それぞれ奇数番号は
遺伝子のセンス側に対応する配列、偶数番号はアンチセ
ンス側に対応する配列である。なお、増幅効率を見る側
の奇数番号にビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマ
ーを、偶数番号にジニトロフェニル標識オリゴヌクレオ
チドプライマーを用い、他方はアミノ化オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。The primers are the mecA gene amplification primers (M1, M2, M3, M4, M5, M shown in Table 1).
6, M7, M8, M9, M10, M11, M12) and spa gene amplification primers (S1, S2, S3, S)
4) was added in the combination of Table 2. The odd number is the sequence corresponding to the sense side of the gene, and the even number is the sequence corresponding to the antisense side. In addition, a biotin-labeled oligonucleotide primer was used for the odd number on the side where the amplification efficiency was observed, a dinitrophenyl-labeled oligonucleotide primer was used for the even number, and an aminated oligonucleotide primer was used for the other.
【００２５】[0025]
【表１】 [Table 1]
【００２６】（４）増幅結果の判定 ＰＣＲによる遺伝子増幅の判定は、ストレプトアビジン
固定マイクロタイターウエルに、それぞれの増幅反応液
１０μlを１００μlのアルカリホスファターゼ標識抗ジ
ニトロフェニル抗体溶液とともに加えて２５℃で３０分
間インキュベートし、洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン
酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、２５℃で３０
分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロプ
レートリーダーで測定することで行った。(4) Determination of Amplification Results For determination of gene amplification by PCR, 10 μl of each amplification reaction solution was added together with 100 μl of alkaline phosphatase-labeled anti-dinitrophenyl antibody solution to streptavidin-fixed microtiter wells, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 30 minutes. After incubating for minutes and washing, 100 μl of p-nitrophenyl phosphate solution (40 μg / ml) was added, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 30 minutes.
After incubation for a minute, the absorbance at 405 nm was measured by a microplate reader.
【００２７】（５）結果 表２に示す如く、ＭＲＳＡ ＤＮＡ添加時に１．０以上
の強い発色を認め、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ添加時の非特
異的発色が０．１を超えない組み合わせとしてＭ９（配
列番号１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号
３）、Ｓ４（配列番号４）の組み合わせが得られた。(5) Results As shown in Table 2, when MRSA DNA was added, strong color development of 1.0 or more was observed, and E. A combination of M9 (SEQ ID NO: 1), M6 (SEQ ID NO: 2), S3 (SEQ ID NO: 3), S4 (SEQ ID NO: 4) was obtained as a combination in which non-specific color development upon addition of E. coli DNA did not exceed 0.1. It was
【００２８】[0028]
【表２】 [Table 2]
【００２９】実施例２（ｓｐａ遺伝子の特異性の認識） （１）検体 臨床分離されたブドウ球菌（黄色ブドウ球菌１８７株、
その他のブドウ球菌（ＣＮＳ）２５株）のコロニーを検
体とした。Example 2 (Recognition of specificity of spa gene) (1) Sample Clinically isolated Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus 187 strain,
Other colonies of Staphylococcus (CNS) strain 25 were used as samples.
【００３０】（２）ＰＣＲ 被検コロニーの一部（１０5〜１０7の菌数に相当）を溶
菌液１（７μg／３０μl リゾスタフィン、５０mM ト
リス緩衝液（pH７．５））３０μlに懸濁し、５０℃で
５分間インキュベート後、溶菌液２（プロテイナーゼＫ
２μg／１０μl、１１０mM トリス緩衝液（pH８．
９）、１．５mM ＭｇＣｌ2、８０mM ＫＣｌ、５０μg
／１０μl 牛血清アルブミン）１０μlを加えて６０℃
で１０分間、９４℃で５分間インキュベートした。これ
に増幅用試薬（ｓｐａ遺伝子増幅用プライマーＳ３とＳ
４（それぞれ５０ng／１０μl）、Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ ２．５単位／１０μl、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ１０nmole／１０μl、
２５０mM ＫＣｌ、２５０mM トリス緩衝液（pH８．3
））を加えて実施例１と同様にＰＣＲを行った。(2) PCR A part of the test colony (corresponding to the number of bacteria of 10 5 to 10 7 ) was suspended in 30 μl of Lysis solution 1 (7 μg / 30 μl lysostaphin, 50 mM Tris buffer (pH 7.5)), After incubating at 50 ° C for 5 minutes, lysate 2 (proteinase K
2 μg / 10 μl, 110 mM Tris buffer (pH 8.
9), 1.5 mM MgCl 2 , 80 mM KCl, 50 μg
/ 10 μl bovine serum albumin) 10 μl
Incubated for 10 minutes at 94 ° C. for 5 minutes. Amplification reagents (spa gene amplification primers S3 and S
4 (50 ng / 10 μl each), Taq DNA Polymerase 2.5 units / 10 μl, dATP, dGT
P, dCTP, dTTP 10 nmole / 10 μl each,
250 mM KCl, 250 mM Tris buffer (pH 8.3
)) Was added and PCR was performed in the same manner as in Example 1.
【００３１】（３）増幅結果の判定 実施例１と同様にして、ストレプトアビジン固定ウエル
とアルカリホスファターゼ標識抗ジニトロフェニル抗体
溶液を用いて実施した。(3) Judgment of Amplification Result The same procedure as in Example 1 was carried out using streptavidin-immobilized wells and an alkaline phosphatase-labeled anti-dinitrophenyl antibody solution.
【００３２】（４）結果 ＰＣＲの結果、黄色ブドウ球菌１８７株全株でｓｐａ遺
伝子陽性であり、その他のブドウ球菌全株ともｓｐａ遺
伝子の増幅を認めなかった。(4) Results As a result of PCR, all 187 Staphylococcus aureus strains were positive for the spa gene, and no amplification of the spa gene was observed with any of the other Staphylococcus strains.
【００３３】実施例３（プローブを用いた増幅検出） （１）ファージプローブ固定マイクロタイターウエルの
調製 プローブオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列から設計し
た表３に示すｍｅｃＡ遺伝子用プローブ配列及びｓｐａ
遺伝子用プローブ配列に結合用の配列を加えたオリゴヌ
クレオチド（Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１
９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１
７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２
３、Ｓ２４（結合用に付加した配列を小文字のアルファ
ベットで示す。））を、実施例１と同様にアプライドバ
イオシステム社のＤＮＡ合成機で合成した。合成したそ
れぞれのオリゴヌクレオチドは相補的な組み合わせ（Ｍ
１３とＭ１４、Ｍ１７とＭ１８、Ｍ１９とＭ２０、Ｍ２
１とＭ２２、Ｓ１３とＳ１４、Ｓ１７とＳ１８、Ｓ１９
とＳ２０、Ｓ２１とＳ２２、Ｓ２３とＳ２４）ごとにＤ
ＮＡリガーゼを用いて１０個を直列に結合させ、これら
を更にプラスミドｐＵＣＳｆｉに挿入した。それぞれの
プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転
換した大腸菌を培養後、ヘルパーファージを加えて、目
的のプローブ配列を持つファージの一本鎖ＤＮＡ、ＭＰ
１４（Ｍ１４の配列を含む）、ＭＰ１７（Ｍ１７の配列
を含む）、ＭＰ１９（Ｍ１９の配列を含む）、ＭＰ２１
（Ｍ２１の配列を含む）、ＳＰ１３（Ｓ１３の配列を含
む）、ＳＰ２１（Ｓ２１の配列を含む）、ＳＰ２３（Ｓ
２３の配列を含む）を得た。得られたそれぞれの一本鎖
ＤＮＡ（以下、ファージプローブ）を１０mM トリス緩
衝液（pH７．６、１mM ＥＤＴＡを含む）で１００ng／
μlの濃度とし、これに４倍容の水と５倍容の固定化緩
衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ pH８．０、０．３ＭＭｇＣｌ2）を加えて混和し、
マイクロタイターウエル（グライナー社製）に１ウエル
あたり１００μlずつ加えた。これに蓋をして３７℃で
１６時間放置し、液を除いた後風乾した。Example 3 (Amplification detection using probe) (1) Preparation of phage probe-immobilized microtiter well The probe oligonucleotide was designed from the gene sequence, and the mecA gene probe sequence and spa shown in Table 3 were used.
Oligonucleotides (M13, M14, M17, M18, M1) in which a binding sequence is added to the gene probe sequence
9, M20, M21, M22, S13, S14, S1
7, S18, S19, S20, S21, S22, S2
3, S24 (the sequence added for binding is shown in lower case alphabet) was synthesized by a DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems in the same manner as in Example 1. Each of the synthesized oligonucleotides has a complementary combination (M
13 and M14, M17 and M18, M19 and M20, M2
1 and M22, S13 and S14, S17 and S18, S19
And S20, S21 and S22, S23 and S24)
Ten were tandemly ligated with NA ligase and these were further inserted into plasmid pUCSfi. Escherichia coli JM109 strain was transformed with each plasmid, the transformed Escherichia coli was cultured, and then a helper phage was added to the single-stranded DNA containing the desired probe sequence, MP.
14 (including the sequence of M14), MP17 (including the sequence of M17), MP19 (including the sequence of M19), MP21
(Including the sequence of M21), SP13 (including the sequence of S13), SP21 (including the sequence of S21), SP23 (S
(Including 23 sequences). Each of the obtained single-stranded DNAs (hereinafter, phage probe) was treated with 10 mM Tris buffer (pH 7.6, containing 1 mM EDTA) at 100 ng /
Concentration of μl, 4 volumes of water and 5 volumes of immobilization buffer (1.5M NaCl, 0.3M Tris HC)
pH 8.0, 0.3M MgCl 2 ) and mixed,
100 μl per well was added to a microtiter well (manufactured by Greiner). This was covered and left at 37 ° C. for 16 hours to remove the liquid, and then air-dried.
【００３４】[0034]
【表３】 [Table 3]
【００３５】（２）ファージプローブ固定マイクロタイ
ターウエルを用いた検出 ＰＣＲ 実施例１と同様にしてＭＲＳＡのＤＮＡを検体とし、プ
ライマーはビオチンで標識したＭ９、Ｍ６、Ｓ３及びＳ
４を用いて実施した。遺伝子増幅反応を終えた反応液５
０μlに５０μlの０．４Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えＤＮＡ
を変性させた後、５０μlの０．４Ｎ ＨＣｌを加えて
中和した。その３０μlをあらかじめハイブリダイゼー
ション緩衝液（５００mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．
５、１００mM ＮａＣｌ、１３％ グアニジンチオシア
ン酸）１００μlを加えたファージプローブ固定マイク
ロタイターウエルに加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。液を除いた後、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ pH７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２mM ＭｇＣ
ｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で２回洗
浄、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン溶
液１００μl を加えて３７℃で１５分間インキュベート
した。洗浄液で２回洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、３７℃で３
０分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロ
プレートリーダーで測定した。(2) Detection Using Phage Probe-Immobilized Microtiter Wells PCR As in Example 1, using MRSA DNA as a sample, and primers M9, M6, S3 and S labeled with biotin.
4 was used. Reaction solution 5 after gene amplification reaction
50 μl of 0.4N NaOH solution was added to 0 μl of DNA
Was denatured and then neutralized by adding 50 μl of 0.4N HCl. 30 μl thereof was previously mixed with a hybridization buffer (500 mM Tris.HCl pH7.
5, 100 mM NaCl, 13% guanidine thiocyanate (100 μl) was added to the phage probe-immobilized microtiter well, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. After removing the solution, wash solution (0.1M Tris.
HCl pH 7.5, 0.3M NaCl, 2mM MgC
l 2, washed twice with 0.05% Triton-X100), and incubated with alkaline phosphatase-labeled streptavidin solution 100 [mu] l 37 ° C. for 15 minutes. After washing twice with the washing solution, 100 μl of p-nitrophenyl phosphate solution (40 μg / ml) was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 3
After incubating for 0 minutes, the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader.
【００３６】（３）結果 表４に示す如く、いずれのファージプローブ固定ウエル
も増幅遺伝子の捕獲に使用可能であった。(3) Results As shown in Table 4, any of the phage probe-immobilized wells could be used for capturing an amplified gene.
【００３７】[0037]
【表４】 [Table 4]
【００３８】実施例４（特異性の確認） （１）検体の調製 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＴＫ７
８４（ＭＲＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１９６３６（ＭＳＳＡ）、Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｎ
ｏ．８６（メチシリン耐性株：ＭＲＳＥ）、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＴＫ３
３４４Ｎ（メチシリン感性：ＭＳＳＥ）、Ｅｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕ
ｎｄｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏ
ｒｇａｎｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒ
ｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓの各菌について実施例１と同様にして培養し、ＤＮ
Ａを調製した。Example 4 (Confirmation of specificity) (1) Preparation of sample Staphylococcus aureus TK7
84 (MRSA), Staphylococcus a
ureus ATCC19636 (MSSA), Sta
phylococcus epidermidis N
o. 86 (methicillin resistant strain: MRSE), Staph
ylococcus epidermidis TK3
344N (methicillin sensitivity: MSSE), Echeri
chiacoli, Citrobacter freu
ndi, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium, En
terobacter cloacae, Proteu
s mirabilis, Morganella mo
rgani, Providencia rettger
i, Pseudomonas aeruginosa,
Acinetobacter calcoacetic
Each bacterium of us was cultured in the same manner as in Example 1 to obtain DN.
A was prepared.
【００３９】（２）検出 ＰＣＲは、プライマーとして実施例１のＭ９（配列番号
１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４
（配列番号４）の組み合わせをそれぞれビオチン標識し
て用い、後は実施例１と同様に操作した。検出は実施例
３に示した１本鎖ＤＮＡ ＭＰ２１と１本鎖ＤＮＡ Ｓ
Ｐ２３をそれぞれ固定したマイクロタイターウエルを用
い、実施例３と同様にハイブリダイゼーション、発色検
出を行った。(2) Detection PCR was performed by using M9 (SEQ ID NO: 1), M6 (SEQ ID NO: 2), S3 (SEQ ID NO: 3) and S4 of Example 1 as primers.
The combination of (SEQ ID NO: 4) was used after being labeled with biotin, and thereafter the same operation as in Example 1 was performed. For detection, single-stranded DNA MP21 and single-stranded DNA S shown in Example 3 were used.
Hybridization and color detection were carried out in the same manner as in Example 3 using the microtiter wells to which P23 was immobilized.
【００４０】（３）結果 表５に示す如く、ｍｅｃＡ遺伝子とｓｐａ遺伝子のそれ
ぞれを保存する株に特異的に発色が認められ、非保有株
では認められず、本発明の検査法でＭＲＳＡを特異的に
検出できることが確認された。(3) Results As shown in Table 5, color development was observed specifically in the strains storing the mecA gene and spa gene respectively, but not in the non-carrying strains, and MRSA specific in the test method of the present invention. It was confirmed that it could be detected.
【００４１】[0041]
【表５】 [Table 5]
【００４２】[0042]
【発明の効果】本発明の検出法によればＭＲＳＡをＭＲ
−ＣＮＳと区別して正確かつ迅速に検出でき、ＭＲＳＡ
感染症に対する適切な治療及び予防が可能となる。According to the detection method of the present invention, MRSA
-It is possible to detect MRSA accurately and quickly by distinguishing it from CNS.
Appropriate treatment and prevention of infectious diseases are possible.
【００４３】[0043]
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖上 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列：5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′ SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 19 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence Features: Other Features: Complementary to Staphylococcal Sequence Have a specific sequence. Sequence: 5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3 ′
【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖上 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列：5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′SEQ ID NO: 2 Sequence Length: 19 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence Features: Other Features: Staphylococcal It has a sequence complementary to the sequence. Sequence: 5'GCGATCAATGTTACCGTAG 3 '
【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖上 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列：5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 21 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence Features: Other Features: Staphylococcal It has a sequence complementary to the sequence. Sequence: 5'TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3 '
【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖上 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列：5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′SEQ ID NO: 4 Sequence Length: 21 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence Features: Other Features: Staphylococcal It has a sequence complementary to the sequence. Sequence: 5'TACAGTTGTACCGATGAATGG 3 '
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 山根 明男 広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬 株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07H 21/04 9162-4B C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Akio Yamane Koda-cho, Takada-gun, Hiroshima Prefecture 1624 Yukunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
Claims (2)
及び（４）； （１）5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′ （２）5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′ （３）5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′ （４）5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′ 〔式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、
Ｔはチミンを示し、任意のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れていてもよい〕で表わされる４種のオリゴヌクレオチ
ドを遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴
とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法。1. The following nucleotide sequences (1), (2), (3)
And (4); (1) 5'AGAAATGACTGAACGTCCG 3 '(2) 5'GCGATCAATGTTACCGTAG 3' (3) 5'TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3 '(4) 5'TACAGTTGTACCGATGAATGG 3' [wherein A is adenine, G is guanine and C] Is cytosine,
T represents thymine, and any T may be substituted with uracil (U)] as a gene amplification reaction primer, and a method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus. .
ドを含有することを特徴とするメチシリン耐性黄色ブド
ウ球菌検出用キット。2. A kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus, which comprises the four kinds of oligonucleotides according to claim 1.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999001572A3 (en) * | 1997-07-03 | 1999-03-25 | Id Biomedical Corp | Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci |
| KR100439532B1 (en) * | 2001-07-03 | 2004-07-09 | 주식회사 코메드 | Multiplex polymerase chain reaction for rapidly detecting antibiotic resistance of Staphyllococcus strains |
| US7241597B2 (en) | 1998-10-08 | 2007-07-10 | Hitachi, Ltd. | Method for assaying DNA fragments in mixture |
-
1996
- 1996-01-17 JP JP00569296A patent/JP3735400B2/en not_active Expired - Fee Related
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| WO1999001572A3 (en) * | 1997-07-03 | 1999-03-25 | Id Biomedical Corp | Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci |
| US6503709B1 (en) | 1997-07-03 | 2003-01-07 | Id Biomedical Corporation | Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci |
| US7241597B2 (en) | 1998-10-08 | 2007-07-10 | Hitachi, Ltd. | Method for assaying DNA fragments in mixture |
| KR100439532B1 (en) * | 2001-07-03 | 2004-07-09 | 주식회사 코메드 | Multiplex polymerase chain reaction for rapidly detecting antibiotic resistance of Staphyllococcus strains |
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