JPH08245397A - Autocrine-motility-factor active inhibitor comprising glucose-6-phosphate isomerase inhibitor - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain the subject inhibitor useful for treating and preventing humectation and metastasis of a cancer cell causing worsening of one's condition by sthenia of motor ability of cell or diseases such as chronic rheumatism and arteriosclerosis. CONSTITUTION: This inhibitor comprises a glucose-6-phosphate isomerase (preferable example: 6-phosphogluconic acid or erythrose-4-phosphoric acid) which is one of glycolytic ferments which widely exists ranging from microorganisms to higher animals and plants. The dose of the inhibitor is normally daily 0.5mg/kg to 20g/kg and the inhibitor can be administered also by any of oral and parenteral administration and prepared in formulation of tablet, powdery preparation, injection, etc. Furthermore, glucose-6-phosphate isomerase and autocrine-motility-factor are common in not only both amino acid sequences, but also positions manifesting the both activities and there is quantitatively and qualitatively strong correlation between the both.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の運動能の亢
進により病態が悪化する癌細胞の浸潤、転移、あるいは
慢性関節リウマチ、動脈硬化症等の疾患の治療、処置、
予防に有用な自己分泌型運動因子（Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ
−ｍｏｔｉｌｉｔｙ−ｆａｃｔｏｒ．以下、ＡＭＦとい
うこともある。）阻害剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the treatment, treatment, and treatment of cancer cell infiltration, metastasis, or rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, or the like, the condition of which deteriorates due to the enhancement of cell motility.
Autocrine motility factor (Autocrine) useful for prevention
-Motility-factor. Hereinafter, it may be referred to as AMF. ) Regarding inhibitors.

【０００２】[0002]

【従来の技術】悪性腫瘍の治療において、移転の克服は
最も期待される課題のひとつである。複雑な移転成立過
程の中で、癌細胞の固有運動能の亢進は、きわめて重要
な段階である（Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．６４；３２７−３３
６，１９９１）。これまでに、高転移性癌細胞は、それ
自身がＡＭＦを産生し、固有運動を亢進させること（ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏ
ｌ．８３；３３０２−３３０６，（１９８６）、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅ．Ｖｏｌ．５１；３５０７−３５１１，１
９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６６；１
３４４２−３４４８，１９９１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ，１９９３など）、また、マウスの強制転移実験系
において、ＡＭＦ処理により癌細胞の転移能が増強され
ることが報告されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，
１９９３）。ＡＭＦの細胞運動能亢進のメカニズムに関
しては、ＡＭＦが細胞膜上のＡＭＦ受容体ｇｐ７８に作
用し、（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．４０；３
９６−４０２，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖ
ｏｌ．２６６；１３４４２−１３４４８，１９９１な
ど）、百日咳毒素感受性Ｇ蛋白質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１４
６；３３９−３４５，１９８７）、リン脂質（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏ
ｌ．１６６；７５７−７６４，１９９０）、蛋白質のリ
ン酸化（Ｂｉｏｃｈｉ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｖ
ｏｌ．１２２２；３９５−３９９，１９９４）などのシ
グナル伝達系を動員すると考えられている。さらに、臨
床の癌患者においては、膀胱癌（Ｊ．ＮＣＩ．Ｖｏｌ．
８０；１２０３−１２１１，１９８８、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．５４；３１２０−３１２３，１９９
４）や大腸癌（Ｃａｎｃｅｒ，ｉｎｐｒｅｓｓ）で癌の
進行度と、ＡＭＦや受容体ｇｐ７８の発現の相関が報告
されている。2. Description of the Related Art Overcoming transfer is one of the most promising challenges in the treatment of malignant tumors. In the process of establishment of complicated transfer, enhancement of intrinsic motility of cancer cells is a very important step (Cell Vol. 64; 327-33).
6, 1991). To date, highly metastatic cancer cells themselves produce AMF and promote proper movement (p
rc. Natl. Acad. Sci. USA Vo
l. 83; 3302-3306, (1986), Can.
cer Re. Vol. 51; 3507-3511, 1
991, J.I. Biol. Chem. Vol. 266; 1
3442-3448, 1991, Int. J. Canc
er, 1993, etc.), and that AMF treatment enhances the metastatic potential of cancer cells in a mouse forced metastasis experimental system (Int. J. Cancer,
1993). Regarding the mechanism of AMF's enhancement of cell motility, AMF acts on the AMF receptor gp78 on the cell membrane (Int. J. Cancer, Vol. 40; 3;
96-402, 1987, J. Am. Biol. Chem. V
ol. 266; 13442-13448, 1991), and pertussis toxin-sensitive G protein (Biochem. B).
iophys. Res. Commun. Vol. 14
6; 339-345, 1987), phospholipids (Bioc).
hem. Biophys Res. Commun. Vo
l. 166; 757-764, 1990), phosphorylation of proteins (Biochi. Biophys. Acta V.
ol. 1222; 395-399, 1994). Furthermore, in clinical cancer patients, bladder cancer (J. NCI. Vol.
80; 1203-1121, 1988, Cancer.
Res. Vol. 54; 3120-3123, 199.
4) and colorectal cancer (Cancer, inpress), the correlation between the degree of cancer progression and the expression of AMF and the receptor gp78 has been reported.

【０００３】このようなことから、ＡＭＦは、癌転移を
引き起こす癌悪性化因子のひとつとして捉えられてお
り、その阻害物質は転移抑制剤として期待ができる。Ａ
ＭＦは種々の癌細胞により産生されていることが報告さ
れているが、これまでその一次構造に関しては不明であ
ったために、現在までその特異的阻害剤は見いだされて
はいない。また、ＡＭＦ阻害剤は癌転移のみならず、細
胞の運動能の亢進が病態を悪化させる慢性関節リウマチ
（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｖｏｌ．２１；３７−４
０，１９９４）、動脈硬化症等の疾患にも治療、子防効
果が期待される。From the above, AMF is regarded as one of the cancer malignant factors causing cancer metastasis, and its inhibitor can be expected as a metastasis inhibitor. A
It has been reported that MF is produced by various cancer cells, but since its primary structure has not been known so far, its specific inhibitor has not been found until now. Further, an AMF inhibitor is not only a cancer metastasis but also rheumatoid arthritis (J. Rheumatol. Vol. 21; 37-4) in which the motility enhancement of cells worsens the pathological condition.
0, 1994), and is expected to be effective in treating and preventing diseases such as arteriosclerosis.

【０００４】一方、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ（ＥＣ．５．３．１．９）（以下、Ｇ６ＰＩというこ
ともある。）は、解糖糸酵素のひとつであり、微生物か
ら高等動・植物までに広く存在しており、細胞の可溶画
分に局在している。また、がん、肝炎、心筋梗塞、筋肉
疾患などで血中のこの酵素活性は増加するが、疾患に関
する特異性は低いと考えられていた。１９８６年にＧｕ
ｒｎｅｙらが報告した骨髄ニューロン又は知覚ニューロ
ン等の神経栄養因子ニューロロイキン（Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｖｏｌ．２３４；５６６−５７４，１９８６や特表平
１−５０２７４７号）と同一の物質と判明している（Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３２３；４５４−４５５，１９８
８，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３２３；４５５−５６，１
９８８）。しかし、Ｇ６ＰＩの解糖系の酵素活性とニュ
ーロロイキン活性の間の相関関係については未だ明確に
されていない。[0006] On the other hand, glucose-6-phosphate isomerase (EC 5.3.1.9) (hereinafter sometimes referred to as G6PI) is one of the glycolytic enzymes, and it is recognized as a microorganism from higher animals and plants. Exist widely and are localized in the soluble fraction of cells. Moreover, although this enzyme activity in blood increases due to cancer, hepatitis, myocardial infarction, muscle disease, etc., it was considered to have low specificity for the disease. Gu in 1986
Neuroleukin neuroleukins such as bone marrow neurons and sensory neurons reported by Rney et al. (Science)
Vol. 234; 566-574, 1986 and Tokukaihei 1-502747) (N).
ature Vol. 323; 454-455, 198.
8, Nature Vol. 323; 455-56, 1
988). However, the correlation between the glycolytic enzyme activity of G6PI and the neuroleukin activity has not yet been clarified.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】このような状況におい
て、ＡＭＦの構造や特性を解析することにより、その阻
害剤を開発し癌転移抑制剤として開発することが求めら
れている。Under such circumstances, it is required to analyze the structure and characteristics of AMF to develop an inhibitor thereof and a cancer metastasis inhibitor.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＡＭＦの
アノミ酸配列の解明やＡＭＦの特性について鋭意研究を
重ねたきた結果、Ｃ３Ｈマウス繊維肉腫細胞株（Ｇｃ４
−ＰＦ）培養上清より、ＡＭＦを単離精製することに成
功した。そして、そのアミノ酸配列を解析するために、
それをリシルエンドペプチダーゼで切断し、表１に示す
４個のアミノ酸断片、ペプチドＩ〜ＩＶを得た。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have conducted extensive studies on the clarification of the anomic acid sequence of AMF and the characteristics of AMF, and as a result, the C3H mouse fibrosarcoma cell line (Gc4
-PF) AMF was successfully isolated and purified from the culture supernatant. Then, in order to analyze the amino acid sequence,
It was cleaved with lysyl endopeptidase to obtain the four amino acid fragments shown in Table 1, peptides I to IV.

【０００７】[0007]

【表１】 [Table 1]

【０００８】これらのアミノ酸配列に基づいてＡＭＦの
新規性についてデータベースにより検索した結果、驚く
べきことにこの４個のアミノ酸断片、ペプチドＩ〜ＩＶ
のアミノ酸配列と完全に一致する配列をすべて有する唯
一の既知の蛋白質として、マウスＧ６ＰＩが存在してい
ることが判明した。解糖系酵素であるＧ６ＰＩ（ＥＣ．
５．３．１．９）は神経栄養因子ニューロロイキンと同
一の物質であることが報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ
Ｖｏｌ．３２３；４５４−４５５，１９８８，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｖｏｌ．３２３；４５５−４５６，１９８
８）、前記のデータベースでの検索結果はＧ６ＰＩとＡ
ＭＦとが同一の物質であることを示唆するものであっ
た。As a result of searching a database for novelty of AMF based on these amino acid sequences, surprisingly, these four amino acid fragments, peptides I to IV, were surprisingly obtained.
It was found that mouse G6PI exists as the only known protein having all the sequences that completely match the amino acid sequence of. G6PI (EC.
(5.3.1.9) is reported to be the same substance as the neurotrophic factor neuroleukin (Nature).
Vol. 323; 454-455, 1988, Nat.
ure Vol. 323; 455-456, 198.
8), the search results in the above database are G6PI and A
It was suggested that MF is the same substance.

【０００９】次いで、本発明者らはＧ６ＰＩとＡＭＦの
活性の相関関係について研究を行った。これらの活性に
相関関係が見出されるならば、両者のアミノ酸配列のみ
ならず、両者の活性を発現させる位置も共通していると
考えられるからである。まず、精製ＡＭＦがＧ６ＰＩ活
性を有することについて、ウサギ筋肉由来Ｇ６ＰＩ（シ
グマ社）の比活性と精製ＡＭＦのＧ６ＰＩ活性の関係を
測定した。その結果を図１に示す。０．１Ｕ（白四角
印）と０．０１Ｕ（白三角印）のＧ６ＰＩ及び１／１０
０精製ＡＭＦ（黒丸印）の三者共同じ挙動を示してお
り、精製ＡＭＦが定性的にも定量的にもＧ６ＰＩ活性を
有していることが判明した。また、図１に示される三者
について、その吸光度をＹとし、時間をＸとしてその関
係を式で示すと、０．１ＵのＧ６ＰＩ（白四角印）で
は、Ｙ＝０．２３７７７＋０．５２２０８Ｘ （相関率
０．９８８）であり、０．０１ＵのＧ６ＰＩ（白三角
印）では、Ｙ＝１．４１４６ｅｘｐ（−２）＋７．３１
２１ｅｘｐ（−２）Ｘ （相関率１．０００）であり、
１／１００精製ＡＭＦ（黒丸印）では、Ｙ＝５．９４３
６ｅｘｐ（−２）＋０．３７７５０Ｘ （相関率０．９
９８）であった。このような関係から、精製ＡＭＦのＧ
６ＰＩ活性におけるユニット（Ｕ）を算出してみると、
１／１００精製ＡＭＦがＧ６ＰＩの０．７１Ｕ／ｍｌ
（１８４．６ｎｇ／ｍｌ）に相当していると考えられ
る。Next, the present inventors investigated the correlation between the activities of G6PI and AMF. If a correlation is found between these activities, it is considered that not only the amino acid sequences of both activities but also the positions at which both activities are expressed are common. First, regarding the fact that purified AMF has G6PI activity, the relationship between the specific activity of rabbit muscle-derived G6PI (Sigma) and the G6PI activity of purified AMF was measured. The result is shown in FIG. 0.1U (white square mark) and 0.01U (white triangle mark) G6PI and 1/10
0 purified AMF (black circles) showed the same behavior, and it was found that purified AMF has qualitatively and quantitatively G6PI activity. Further, regarding the three parties shown in FIG. 1, assuming that the absorbance is Y, the time is X, and the relationship is expressed by an equation, in the case of 0.1 U G6PI (white square mark), Y = 0.23777 + 0.52208X (correlation) The ratio is 0.988), and Y = 1.4146exp (−2) +7.31 at 0.01 U of G6PI (white triangle mark).
21exp (−2) X (correlation rate 1.000),
With 1/100 purified AMF (black circle), Y = 5.943
6exp (-2) + 0.37750X (correlation rate 0.9
98). From this relationship, purified AMF G
When the unit (U) in 6PI activity is calculated,
1/100 purified AMF is 0.71 U / ml of G6PI
(184.6 ng / ml).

【００１０】次いで、Ｇ６ＰＩがＡＭＦ活性を有するこ
とについて、ウサギ筋肉由来Ｇ６ＰＩのＡＭＦ活性をＧ
ｃ４−ＰＦ細胞を用いて金コロイド法（Ｃｅｌｌ Ｖｏ
ｌ．１１；３９５−４０４，１９７７）により測定し
た。その結果を図２に示す。コントロールは０．１％牛
胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものを使用している（図
２中の左端）。１５０ｎｇ／ｍｌのＧ６ＰＩを添加した
場合には有意にＡＭＦ活性が上昇しており（図２中の左
端から３番目）、Ｇ６ＰＩがＡＭＦ活性を有しているこ
とが判明した。また、その活性は同量の精製ＡＭＦを添
加した場合（図２中の左端から２番目）とほぼ同程度で
あり、定性的のみならず定量的にも両者に強い相関関係
があることが分かる。なお、図２の右側の３個はこれら
のものにＧ６ＰＩ阻害剤である６−ホスホグルコン酸
（６ＰＧＡ）を添加した場合のＡＭＦ活性を示してい
る。さらに、本発明者らはＧ６ＰＩ阻害剤がインビボに
おいても癌転移抑制作用を有することをマウスを用いて
確認した。Next, regarding the fact that G6PI has an AMF activity, the AMF activity of rabbit muscle-derived G6PI is
Colloidal gold method (Cell Vo using c4-PF cells)
l. 11; 395-404, 1977). The result is shown in FIG. As a control, the one to which 0.1% fetal calf serum (FCS) has been added is used (the left end in FIG. 2). When 150 ng / ml of G6PI was added, the AMF activity was significantly increased (the third from the left end in FIG. 2), and it was revealed that G6PI has the AMF activity. The activity was almost the same as when the same amount of purified AMF was added (second from the left end in FIG. 2), and it can be seen that both have a strong correlation not only qualitatively but also quantitatively. . Note that the three on the right side of FIG. 2 show the AMF activity when 6-phosphogluconic acid (6PGA), which is a G6PI inhibitor, is added to these. Furthermore, the present inventors confirmed using a mouse that the G6PI inhibitor has a cancer metastasis inhibitory action also in vivo.

【００１１】以上のように、本発明者らは癌転移、慢性
関節リウマチ、動脈硬化症などに深く関係していると考
えられているＡＭＦと公知のＧ６ＰＩとのアミノ酸配列
の相同性に着目し、ＡＭＦ活性とＧ６ＰＩ活性とに強い
相関関係があることを解明し、Ｇ６ＰＩ阻害剤が同時に
ＡＭＦ活性を阻害することを見い出し、本発明を完成し
た。ＡＭＦは癌転移を引き起こす癌悪性化因子であるば
かりでなく、慢性関節リウマチや動脈硬化症などとも深
く関係していることから、ＡＭＦ阻害剤はこれらの疾患
の治療・処理・予防剤として重要である。As described above, the present inventors have focused on the homology of the amino acid sequence between AMF and the known G6PI, which are considered to be deeply related to cancer metastasis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis and the like. , Elucidated that there is a strong correlation between AMF activity and G6PI activity, and found that a G6PI inhibitor simultaneously inhibits AMF activity, and completed the present invention. Since AMF is not only a cancer malignant factor that causes cancer metastasis but also deeply related to rheumatoid arthritis and arteriosclerosis, AMF inhibitors are important as therapeutic / treatment / preventive agents for these diseases. is there.

【００１２】Ｇ６ＰＩ阻害剤としては現在までに多くの
物質が知られている（例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉ
ｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９０などを参照）。本発
明のＧ６ＰＩ阻害剤としては、現在までに知られている
Ｇ６ＰＩ阻害剤をはじめ、Ｇ６ＰＩの酵素活性を阻害す
るものであればどのようなものでも使用できる。本発明
のＧ６ＰＩ阻害剤の具体例としては、例えば、６−ホス
ホグルコン酸、エリスロース−４−リン酸、セドヘプツ
ロース−７−リン酸、ソルビトール、１，５−アンヒド
ログルシトール−６−リン酸、マンノース−６−リン
酸、マンニトール−６−リン酸、２−デオキシグルコー
ス−６−リン酸、ガラクトース−６−リン酸、Ｌ−ソル
ボース−６−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、リボ
ース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、Ｌ−キシ
ルロース−５−リン酸、エリスリトール−４−リン酸、
ホスホエノールピルビン酸などや、これらの塩、エステ
ルなどを挙げることができ、好ましくは６−ホスホグル
コン酸、エリスロース−４−リン酸などが挙げられる。Many substances are known to date as G6PI inhibitors (for example, Enzyme Hand.
book, Springer-Verlag Berli
nHeidelberg, 1990, etc.). As the G6PI inhibitor of the present invention, any known G6PI inhibitor can be used as long as it inhibits the enzyme activity of G6PI. Specific examples of the G6PI inhibitor of the present invention include, for example, 6-phosphogluconic acid, erythrose-4-phosphate, sedoheptulose-7-phosphate, sorbitol, 1,5-anhydroglucitol-6-phosphate. Acid, mannose-6-phosphate, mannitol-6-phosphate, 2-deoxyglucose-6-phosphate, galactose-6-phosphate, L-sorbose-6-phosphate, glucosamine-6-phosphate, ribose -5-phosphate, ribulose-5-phosphate, L-xylulose-5-phosphate, erythritol-4-phosphate,
Examples thereof include phosphoenolpyruvate and the like, salts and esters thereof, preferably 6-phosphogluconic acid and erythrose-4-phosphate.

【００１３】本発明のＡＭＦ阻害剤の投与量は、患者や
疾患の程度に応じて適量を投与すればよいが、一般的に
は１日０．５ｍｇ／Ｋｇから２０ｇ／Ｋｇ程度である。
また、本発明のＡＭＦ阻害剤は経口、非経口のいずれで
も投与することができ、錠剤、散剤、注射剤など通常使
用されている剤型に製剤化することができる。The dose of the AMF inhibitor of the present invention may be an appropriate amount depending on the patient and the degree of disease, but it is generally about 0.5 mg / Kg to 20 g / Kg per day.
The AMF inhibitor of the present invention can be administered orally or parenterally, and can be formulated into a commonly used dosage form such as tablets, powders and injections.

【００１４】[0014]

【実施例】【Example】

実施例１ 「精製ＡＭＦのリシルエンドペプチダーゼ分
解断片のアミノ酸配列の決定」 Ｃ３Ｈマウス繊維肉腫細胞株（Ｇｃ４−ＰＦ）培養上清
から精製したＡＭＦ約５μｇをＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル（１４％）電気泳動により分画し、電気抽出装
置（ＩＳＣＯ社）により溶出した。この溶出蛋白を、８
Ｍ尿素−０．４Ｍ重炭酸アンモニウム溶液下で、カルボ
キシアミドメチル化により還元し、リシルエンドペプチ
ダーゼ（和光純薬工業）０．００４μｇ／ｍｌ、３０
℃、１５時間処理にて酵素消化し、ペプチド断片化を行
った。これを、逆相ＨＰＬで単離し、そのアミノ酸配列
をペプチドシークエンサー（アプライドバイオシステム
ズ）を用いて決定した。その結果、以下に示す４つのペ
プチド配列を得た（表１）。Example 1 "Determination of Amino Acid Sequence of Lysyl Endopeptidase Degradation Fragment of Purified AMF" About 5 μg of AMF purified from C3H mouse fibrosarcoma cell line (Gc4-PF) culture supernatant was subjected to SDS-polyacrylamide gel (14%) electrophoresis. Was fractionated by and eluted with an electric extractor (ISCO). This eluted protein is
M urea-0.4 M ammonium bicarbonate solution for reduction by carboxyamidomethylation, lysyl endopeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.004 μg / ml, 30
Peptide fragmentation was carried out by enzymatic digestion at 15 ° C. for 15 hours. This was isolated by reverse-phase HPL, and its amino acid sequence was determined using a peptide sequencer (Applied Biosystems). As a result, the following four peptide sequences were obtained (Table 1).

【００１５】[0015]

【表１】[Table 1]

【００１６】これらの配列に関してデーターベース検索
（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ，ＳＤＣソフトウェア開発）
を行ったところ、マウスグルコース−６−リン酸イソメ
ラーゼ（即ち、ニューロロイキン、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ａ２４４３９）と完全に一致
した（表２）。Database search for these sequences (GENETYX-MAC, SDC software development)
Was performed, and mouse glucose-6-phosphate isomerase (ie, neuroleukin, Genbank A
accession No. A24439) and was completely in agreement (Table 2).

【００１７】[0017]

【表２】 [Table 2]

【００１８】実施例２ 「精製ＡＭＦのＧ６ＰＩ活性」 Ｃ３Ｈマウス繊維肉腫細胞株（Ｇｃ４−ＰＨ）培養上清
から精製したＡＭＦ分画のＧ６ＰＩ酵素活性を測定した
ところ、図１に示すように強い活性を認めた。ウサギＧ
６ＰＩ（シグマ社）の比活性から、アッセイに供したＡ
ＭＦ分画中のＧ６ＰＩ濃度を算出すると、ＡＭＦ分画の
全蛋白質量とほぼ同程度であった。Ｇ６ＰＩ活性の測定
はフルクトース−６−リン酸を基質としてグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４
９）との共役反応によりＮＡＤＰＨの精製を測定した。
詳細には、０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０、０．２ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰ、１ｍＭ フルクト
ース−６−リン酸、１ｕｎｉｔのグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ存在下に、サンプルを加え３４０ｎ
ｍの吸光度の継時変化をプロットし、その勾配をＧ６Ｐ
Ｉ活性とした。Example 2 "G6PI activity of purified AMF" When the G6PI enzyme activity of the AMF fraction purified from the culture supernatant of the C3H mouse fibrosarcoma cell line (Gc4-PH) was measured, it showed a strong activity as shown in FIG. Admitted. Rabbit G
From the specific activity of 6PI (Sigma), A used for the assay
When the G6PI concentration in the MF fraction was calculated, it was almost the same as the total protein amount in the AMF fraction. G6PI activity was measured using fructose-6-phosphate as a substrate for glucose-
6-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.4
Purification of NADPH was measured by conjugation reaction with 9).
Specifically, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.2 m
The sample was added in the presence of MEDTA, 0.5 mM NADP, 1 mM fructose-6-phosphate, and 1 unit of glucose-6-phosphate dehydrogenase at 340 n.
Plot the change in absorbance of m over time, and plot the slope with G6P
I activity.

【００１９】実施例３ 「ウサギ筋肉由来Ｇ６ＰＩの細
胞運動能刺激活性」 精製ＡＭＦ分画及びウサギ筋肉由来Ｇ６ＰＩの細胞運動
能刺激活性を金コロイド法（Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．１１；
３９５−４０４，１９７７）により測定したところ、図
２に示すようにＧ６ＰＩはＡＭＦとほぼ同等の活性を認
めた。詳細には、金コロイドを均一にコートしたカバー
グラスを３．５ｍｍ組織培養皿に置き、２．５％牛胎児
血清を含むＧＭ４０培養液（１０ｍＭグルタミン、１０
０ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭヘペスバ
ッファー、２．０ｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウムを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地）２ｍｌに対して２，０００個の
Ｇｃ４−ＰＦ細胞を加え、さらに精製ＡＭＦまたはウサ
ギ筋肉由来Ｇ６ＰＩ（シグマ社）あるいはコントロール
として０．１％牛胎児血清を添加して、２４時間培養を
行った。その後、倒立顕微鏡で金コロイドカーペットの
欠損部を細胞運動の軌跡として観察し、その面積を測定
した。少なくとも５０個の細胞運動の軌跡を測定し、９
５％以上の信頼度で測定値を算出した。統計処理はスチ
ューデントのＴテストにより、Ｐ値を算出した。結果を
表３に示す。この結果を図にしたものを図２に示す。Example 3 "Cell motility stimulating activity of rabbit muscle-derived G6PI" Purified AMF fraction and cell motility stimulating activity of rabbit muscle-derived G6PI were analyzed by the colloidal gold method (Cell Vol. 11;
395-404, 1977), G6PI showed almost the same activity as AMF as shown in FIG. Specifically, a cover glass uniformly coated with colloidal gold was placed on a 3.5 mm tissue culture dish, and GM40 culture solution (10 mM glutamine, 10 mM) containing 2.5% fetal calf serum was placed.
R containing 0 mg / ml sodium pyruvate, 10 mM Hepes buffer, 2.0 g / ml sodium bicarbonate
PMI-1640 medium) 2,000 Gc4-PF cells were added to 2 ml, and purified AMF or rabbit muscle-derived G6PI (Sigma) or 0.1% fetal calf serum as a control was added for 24 hours. Culture was performed. Then, the inverted part of the gold colloid carpet was observed with an inverted microscope as a locus of cell movement, and its area was measured. Measure the loci of at least 50 cell movements, and
The measured value was calculated with a reliability of 5% or more. Statistical processing calculated P value by Student's T test. The results are shown in Table 3. The result is shown in FIG.

【００２０】[0020]

【表３】 [Table 3]

【００２１】表３及び図２中、「ＡＭＦ」はＡＭＦを添
加した場合を、「Ｇ６ＰＩ」はＧ６ＰＩを添加した場合
を、「ＡＭＦ／６ＰＧＡ」はＡＭＦ及び６−ホスホグル
コン酸を添加した場合を、「Ｇ６ＰＩ／６ＰＧＡ」はＧ
６ＰＩ及び６−ホスホグルコン酸を添加した場合を、
「６ＰＧＡ」は６−ホスホグルコン酸を添加した場合
を、それぞれ示している。表３から分かるように、Ｇ６
ＰＩにも精製ＡＭＦと同程度の細胞運動能刺激活性があ
る。そして、いずれも６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ
Ａ）のようなＧ６ＰＩ活性阻害剤により、その活性が阻
害されていることがわかる。In Table 3 and FIG. 2, "AMF" is the case where AMF is added, "G6PI" is the case where G6PI is added, and "AMF / 6PGA" is the case where AMF and 6-phosphogluconic acid are added. , "G6PI / 6PGA" is G
When 6PI and 6-phosphogluconic acid were added,
"6PGA" shows the case where 6-phosphogluconic acid was added. As you can see from Table 3, G6
PI has the same level of cell motility stimulating activity as purified AMF. And both are 6-phosphogluconic acid (6PG
It can be seen that the activity is inhibited by G6PI activity inhibitors such as A).

【００２２】実施例４ 「Ｇ６ＰＩ阻害剤の細胞運動能
刺激活性」 ＡＭＦ及びＧ６ＰＩによる細胞運動能の亢進に対する、
Ｇ６ＰＩ阻害剤のＡＭＦ活性の阻害作用を調べた。Ｃ３
Ｈマウス繊維肉腫細胞株（Ｇｃ４−ＰＨ）を、７０μＭ
の濃度の６−ホスホグルコン酸（６ＰＧＡ）又はエリス
ロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の２種のＧ６ＰＩ活性阻
害剤で１時間前に前処理した後、ＡＭＦ（またはＧ６Ｐ
Ｉ）で刺激を加えて２４時間後の運動能を上記の金コロ
イド法にて同様に調べた。統計処理はスチューデントの
Ｔテストにより、Ｐ値を算出した。結果を表４に示す。
この結果を図にしたものを図３に示す。Example 4 "Cell motility stimulating activity of G6PI inhibitor" For the enhancement of cell motility by AMF and G6PI,
The inhibitory effect of G6PI inhibitor on AMF activity was examined. C3
H mouse fibrosarcoma cell line (Gc4-PH) at 70 μM
At a concentration of 6-phosphogluconic acid (6PGA) or erythrose-4-phosphate (E4P) prior to 1 hour pretreatment with two G6PI activity inhibitors, followed by AMF (or G6P)
The motility was examined 24 hours after the stimulation was applied in I) by the gold colloid method described above. Statistical processing calculated P value by Student's T test. The results are shown in Table 4.
A graphical representation of this result is shown in FIG.

【００２３】[0023]

【表４】 [Table 4]

【００２４】表４及び図３中、「ＡＭＦ」はＡＭＦを添
加した場合を、「６ＰＧＡ」は６−ホスホグルコン酸を
添加した場合を、「６ＰＧＡ／ＡＭＦ」は６−ホスホグ
ルコン酸及びＡＭＦを添加した場合を、「Ｅ４Ｐ」はエ
リスロース−４−リン酸を添加した場合を、「Ｅ４Ｐ／
ＡＭＦ」はエリスロース−４−リン酸及びＡＭＦを添加
した場合を、それぞれ示している。その結果、６−ホス
ホグルコン酸、エリスロース−４−リン酸のいずれにも
顕著な運動抑制活性が示された。In Table 4 and FIG. 3, "AMF" means the case where AMF is added, "6PGA" means the case where 6-phosphogluconic acid is added, and "6PGA / AMF" means the 6-phosphogluconic acid and AMF. When added, "E4P" means that when erythrose-4-phosphoric acid is added, "E4P /
"AMF" shows the case where erythrose-4-phosphate and AMF were added, respectively. As a result, a remarkable locomotor activity was shown for both 6-phosphogluconic acid and erythrose-4-phosphate.

【００２５】実施例５ 「Ｇ６ＰＩ阻害剤エリスロース
−４−リン酸によるマウスの肺転移抑制」 本発明のＧ６ＰＩ阻害剤のなかで、インビトロで強い細
胞運動能抑制作用を示したエリスロース−４−リン酸
（Ｅ４Ｐ）のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における癌転
移抑制効果を次のようにして調べた。Ｃ３Ｈ／ｈｅ系雌
マウス（４週齢）をコントロール群１１匹８群、エリス
ロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）０．５ｍｇ投与群１０匹
８群、Ｅ４Ｐ５ｍｇ投与群１０匹７群に分け、癌細胞Ｇ
ｃ４−ＰＦ細胞（２００００細胞／マウス）を尾静脈に
注射した。各Ｅ４Ｐ投与群のマウスには癌細胞を注射す
る直前に、エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）を各々
０．５ｍｇ、５ｍｇを腹腔内に投与し、その後３日間同
量のＥ４Ｐを連日投与した。１４日後に肺のコロニー数
を数えた。実験は独立して２回行い、それぞれを実験
１、実験２とした。２回の独立した実験１及び２におい
て、同様の結果を得た。図４及び図５にその結果を示
す。グラフ縦軸は各群マウスの平均肺転移コロニー数を
示している。これらの結果から判るように、Ｅ４Ｐの投
与によりインビボにおいても有意に肺への強制転移の抑
制効果（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法による有意差検定
による）が認められた。Example 5 "Inhibition of pulmonary metastasis of mouse by G6PI inhibitor erythrose-4-phosphate" Erythrose-4-, which showed a strong cell motility inhibitory action in vitro among the G6PI inhibitors of the present invention. The cancer metastasis inhibitory effect of phosphoric acid (E4P) in vivo was examined as follows. C3H / he strain female mice (4 weeks old) were divided into a control group of 11 8 groups, an erythrose-4-phosphate (E4P) 0.5 mg administration group of 8 groups, an E4P 5 mg administration group of 10 groups of 7 mice, and cancer. Cell G
c4-PF cells (20,000 cells / mouse) were injected into the tail vein. Immediately before injecting the cancer cells into each E4P-administered group, 0.5 mg and 5 mg of erythrose-4-phosphate (E4P) were intraperitoneally administered, and thereafter, the same amount of E4P was continuously administered for 3 days. did. After 14 days, the number of lung colonies was counted. The experiment was independently performed twice, and each was designated as Experiment 1 and Experiment 2. Similar results were obtained in two independent experiments 1 and 2. The results are shown in FIGS. 4 and 5. The vertical axis of the graph shows the average number of lung metastases colonies of each group of mice. As can be seen from these results, the suppression effect of forced metastasis to the lung (by the significant difference test by the Mann-Whitney method) was observed in vivo by the administration of E4P.

【００２６】[0026]

【発明の効果】本発明の、６−ホスホグルコン酸やエリ
スロース−４−リン酸をはじめとする種々のＧ６ＰＩ阻
害剤は、ＡＭＦで刺激した細胞の運動能を抑制すること
から、ＡＭＦの関与する細胞運動能の亢進により病態が
悪化する癌細胞の浸潤、移転及び慢性関節リウマチ、動
脈硬化症等の疾患の治療並びに予防に有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY Various G6PI inhibitors such as 6-phosphogluconic acid and erythrose-4-phosphate of the present invention suppress the motility of cells stimulated by AMF, and thus involve AMF. It is useful for the treatment and prevention of invasion and transfer of cancer cells whose pathological condition is deteriorated by the enhancement of cell motility, and diseases such as rheumatoid arthritis and arteriosclerosis.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】精製ＡＭＦのＧ６ＰＩ活性との相関関係を示す
図である。FIG. 1 shows the correlation between purified AMF and G6PI activity.

【図２】Ｇ６ＰＩのＡＭＦ活性、及び、ＡＭＦ活性に対
するＧ６ＰＩ阻害剤の阻害作用を示す図である。FIG. 2 is a graph showing the AMF activity of G6PI and the inhibitory effect of a G6PI inhibitor on the AMF activity.

【図３】６−ホスホグルコン酸（６ＰＧＡ）及びエリス
ロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）のＡＭＦ活性の阻害作用
を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the inhibitory effect of 6-phosphogluconic acid (6PGA) and erythrose-4-phosphate (E4P) on the AMF activity.

【図４】エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）によるマ
ウスの癌転移抑制についての実験１の結果を示す図であ
る。FIG. 4 is a diagram showing the results of Experiment 1 on suppression of cancer metastasis in mice by erythrose-4-phosphate (E4P).

【図５】エリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）によるマ
ウスの癌転移抑制についての実験２の結果を示す図であ
る。FIG. 5 is a diagram showing the results of Experiment 2 on suppression of cancer metastasis in mice by erythrose-4-phosphate (E4P).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 11/04 Ｃ０７Ｈ 11/04 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (72)発明者 小林 幹 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味 の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 アブラハム ラッツ アメリカ合衆国、ミシガン48201、デトロ イト、イースト ワレン アベニュー110 テューモー プログレッション アンド メタスタシス ミシガン キャンサー ファウンデェーション内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location C07H 11/04 C07H 11/04 C12N 9/99 C12N 9/99 (72) Inventor Miki Kobayashi Kanagawa Central Research Institute, Ajinomoto Co., Inc. 1-1, Suzuki-cho, Kawasaki-ku, Kawasaki-shi (72) Inventor Abraham Rats 48201, Michigan, USA Detroit, East Warren Avenue 110 Thumpro Progression and Metastasis Michigan Cancer Foundation

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 グルコース−６−リン酸イソメラーゼ阻
害剤からなる自己分泌型運動因子阻害剤。1. An autocrine motility factor inhibitor comprising a glucose-6-phosphate isomerase inhibitor. 【請求項２】 グルコース−６−リン酸イソメラーゼ阻
害剤からなる癌転移抑制剤。2. A cancer metastasis inhibitor comprising a glucose-6-phosphate isomerase inhibitor. 【請求項３】 グルコース−６−リン酸イソメラーゼ阻
害剤が、６−ホスホグルコン酸又はエリスロース−４−
リン酸である請求項１又は２に記載の阻害剤又は抑制
剤。3. A glucose-6-phosphate isomerase inhibitor is 6-phosphogluconic acid or erythrose-4-.
The inhibitor or suppressor according to claim 1, which is phosphoric acid.