JPH08228782A - Protein-binding magnetic fine particle and its production - Google Patents
Protein-binding magnetic fine particle and its productionInfo
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- JPH08228782A JPH08228782A JP7263487A JP26348795A JPH08228782A JP H08228782 A JPH08228782 A JP H08228782A JP 7263487 A JP7263487 A JP 7263487A JP 26348795 A JP26348795 A JP 26348795A JP H08228782 A JPH08228782 A JP H08228782A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の技術分野】本発明は、タンパク質結合磁気微粒
子及びその製造方法、並びにそれらに関連した新規遺伝
子、遺伝子断片、融合ＤＮＡ配列、組み換えプラスミ
ド、形質転換された磁性細菌に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to protein-bound magnetic fine particles, a method for producing the same, and novel genes, gene fragments, fused DNA sequences, recombinant plasmids, and transformed magnetic bacteria associated therewith.
【０００２】[0002]
【従来の技術】磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等
の生理活性を有するタンパク質は、磁気的手段で誘導す
ることができるため、従来困難であった局所的な位置へ
の誘導が可能であり、磁気により集めたり、分離したり
することができるため、医療や発酵の分野を初めとする
各種産業において利用が期待されている。2. Description of the Related Art Proteins having physiological activity such as enzymes and antibodies immobilized on magnetic particles can be induced by magnetic means, so that they can be introduced to a local position, which has been difficult in the past. Since it can be collected and separated by magnetism, it is expected to be used in various industries including the fields of medicine and fermentation.
【０００３】従来、磁気微粒子への生理活性物質の固定
化は特公平６−１２９９４に示されるように磁性細菌よ
り磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで
処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化す
ることが行われていた。また、酵素処理により、磁性菌
から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒
子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固
定化を行う方法も知られている。また、ＳＰＤＰを用い
る化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定
化する方法も知られている（特開平５−２０９８８
４）。Conventionally, as shown in Japanese Patent Publication No. 6-12994, the immobilization of the physiologically active substance on the magnetic fine particles is carried out by separating the magnetic fine particles from the magnetic bacteria by an alkali treatment, and γ-aminopropyltriethoxysilane or glutaraldehyde. It has been practiced to chemically immobilize a physiologically active substance thereon after treating with. There is also known a method in which magnetic particles are separated from magnetic bacteria in a state of being covered with an organic thin film composed of lipids by an enzyme treatment, and proteins are immobilized after glutaraldehyde treatment. A method of immobilizing a physiologically active substance on magnetic fine particles by a chemical bonding method using SPDP is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 20988/1993).
4).
【０００４】さらに、これらの方法で化学的に生理活性
物質を固定化した磁気微粒子を用いて抗原抗体反応を行
なわせる、抗原又は抗体の測定方法が提案されている
（特開平４−２８５８５７、同５−２０９８８４、特開
平５−９９９２６）。Further, there has been proposed a method for measuring an antigen or antibody in which an antigen-antibody reaction is carried out using magnetic fine particles chemically immobilized with a physiologically active substance by these methods (Japanese Patent Laid-Open No. 4-285857, the same publication). 5-209884, JP-A-5-99926).
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらはいず
れも酵素、抗体等のタンパク質を化学的に磁気微粒子に
結合させる必要があるため、固定化処理に長時間を要す
る、固定化処理によりタンパク質の生理活性が低下す
る、得られる固定化タンパク質の固定化量にロット間バ
ラツキが大きくかつ活性のバラツキも大きい、固定化に
用いられるタンパク質は一般に高価であるので固定化タ
ンパク質は高コストにならざるを得ない、等の問題があ
った。However, in all of these, it is necessary to chemically bond a protein such as an enzyme or an antibody to the magnetic fine particles, so that the immobilization treatment requires a long time. Physiological activity decreases, lot-to-lot variation in the amount of immobilized protein obtained and variation in activity are large, and the protein used for immobilization is generally expensive, so the immobilized protein must be expensive. There was a problem such as not getting.
【０００６】そこで、本発明の課題は、これらの問題を
解決したタンパク質結合磁気微粒子等を提供することに
ある。Therefore, an object of the present invention is to provide protein-bonded magnetic fine particles and the like which solve these problems.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、第一に、磁性
細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆す
る有機膜に結合したタンパク質をコードし、配列表に記
載の配列番号１で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、
精製されたｍａｇＡ遺伝子を提供する。Means for Solving the Problems The first aspect of the present invention is to encode a protein bound to an organic membrane that coats magnetic fine particles produced in the cells of a magnetic bacterium AMB-1, and has the sequence number shown in the sequence listing. An isolation consisting of the DNA sequence shown in 1,
Provide a purified magA gene.
【０００８】また、本発明は、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌
体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した
タンパク質であって、後述の配列表に記載の配列番号２
で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍ
ａｇＡタンパク質を提供する。The present invention also relates to a protein bound to an organic film that coats the magnetic fine particles produced in the bacterial cells of the magnetic bacterium AMB-1, which is SEQ ID NO: 2 described in the sequence listing below.
Isolated and purified m consisting of the amino acid sequence shown by
Provides the agA protein.
【０００９】本発明は、ｍａｇＡタンパク質の磁性細菌
内に生成される磁気微粒子を被覆する有機膜との結合性
に着目し、融合タンパク質の状態で別の有用タンパク質
を磁気微粒子に固定する方法、磁気微粒子上に有用タン
パク質を生成せしめる方法等を提供する。ｍａｇＡ遺伝子 本発明者は、後述の配列表に記載の配列番号１で示され
る塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなり、磁性細菌の
菌体内に生成する磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成
分とする有機膜に結合したタンパク質をコードするｍａ
ｇＡ遺伝子を見いだした。The present invention focuses on the binding property of the magA protein to the organic membrane coating the magnetic fine particles produced in the magnetic bacteria, and a method of immobilizing another useful protein on the magnetic fine particles in the form of a fusion protein, A method for producing a useful protein on fine particles is provided. The magA gene consists of a DNA sequence represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described below, and is mainly composed of phospholipids that coat the magnetic fine particles produced in the cells of magnetic bacteria. Coding for a protein bound to an organic membrane
I found the gA gene.
【００１０】上記のｍａｇＡ遺伝子は、磁性細菌ＡＭＢ
−１（微工研菌寄第13282 号) から次のようにして見い
だされ、単離、精製された。The above-mentioned magA gene is associated with the magnetic bacterium AMB.
-1 (Microtechnology Research Institute, No. 13282), and was isolated and purified as follows.
【００１１】磁性細菌ＡＭＢ−１に、薬剤耐性因子（Ｋ
ｍ）を持った転移性の遺伝子であるトランスポゾンＴｎ
５を導入することでゲノムに部位非特異的にミューテー
ションを生じさせ、磁気微粒子精製機能を欠損したミュ
ータントを作製した。次に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を指
標に磁気応答しない菌体を分離し、このミュータントか
らゲノムをCureent Protocols in Molecular Biologyの
方法で抽出した。EcoRI で切断後、サザンハイブリダイ
ゼーションでトランスポゾンＴｎ５とのハイブリッドの
形成を指標にｍａｇＡ遺伝子を含む遺伝子断片を単離
し、ｐＵＣ１９にクローニンすることで精製を行った。
遺伝子解析の結果、ｍａｇＡ遺伝子１．３ｋｂを見出し
た。ｍａｇＡタンパク質 該ｍａｇＡ遺伝子の配列の上流にはプロモーター配列が
隣接している。該タンパク質のアミノ酸配列は、後記の
配列表の配列番号２に示す（前記塩基配列とともに表
示）通りであり、Ｎ末端から第１〜第６アミノ酸残基の
範囲が親水性領域であり、それに続く第７〜第３８０ア
ミノ酸残基の範囲が疎水性領域であり、続く第３８１〜
４３４アミノ酸残基の範囲が第二の親水性領域である。
中央の長い疎水性領域が膜結合部位であり、両端の親水
性領域は膜から露出した状態にある。詳細には、疎水性
領域は短い親水性部分を約４箇所含んでおり、これらの
部分は膜から一部露出しているものと推定される。The magnetic bacterium AMB-1 is associated with a drug resistance factor (K
transposon Tn, which is a metastatic gene having m)
By introducing 5, a mutation was generated in a non-site-specific manner in the genome, and a mutant deficient in the magnetic particle purification function was prepared. Next, bacterial cells that did not respond magnetically using the drug resistance factor (Km) as an index were separated, and the genome was extracted from this mutant by the method of Cure Protocols in Molecular Biology. After cleavage with EcoRI, a gene fragment containing the magA gene was isolated by Southern hybridization with the formation of a hybrid with transposon Tn5 as an index, and purified by pcloning it into pUC19.
As a result of gene analysis, 1.3 kb of the magA gene was found. MagA protein A promoter sequence is adjacent to the upstream of the sequence of the magA gene. The amino acid sequence of the protein is as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (shown together with the base sequence), and the range from the N-terminal to the 1st to 6th amino acid residues is a hydrophilic region, followed by The range of the 7th to 380th amino acid residues is the hydrophobic region, followed by the 381st to 381st.
The range of 434 amino acid residues is the second hydrophilic region.
The long hydrophobic region in the center is the membrane binding site, and the hydrophilic regions at both ends are exposed from the membrane. Specifically, the hydrophobic region contains about 4 short hydrophilic portions, and these portions are presumed to be partially exposed from the membrane.
【００１２】このタンパク質は次のようにして単離、精
製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠
心集菌後フレンチプレスより細胞を破砕した。この破砕
物からサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子を抽出し、
精製した。次に１％Tryton 10mM トリス緩衝液中で２時
間攪拌し、磁気微粒子と膜を分離した。このように処理
した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行ったところ、前記ｍａｇＡ遺伝子からコードさ
れるタンパク質の分子量として既知である、46.8kDa の
ところにバンドが確認された。This protein was isolated and purified as follows. The magnetic bacterium AMB-1 was cultivated to the stationary phase, and the cells were disrupted by French press after centrifugation. Magnetic particles are extracted from this crushed material with a samarium cobalt magnet,
Purified. Then, the mixture was stirred in 1% Tryton 10 mM Tris buffer for 2 hours to separate the magnetic fine particles from the membrane. The extract thus treated was subjected to protein electrophoresis (SDS-PAG
When E) was performed, a band was confirmed at 46.8 kDa, which is known as the molecular weight of the protein encoded by the magA gene.
【００１３】ｍａｇＡタンパク質のホモロジー検索を行
った結果、大腸菌のカリウムイオン流出機構を司るタン
パク質と高いホモロジーを示した。これよりｍａｇＡタ
ンパク質はカチオンイオンの流出に関与すると考えられ
る。そこでｍａｇＡ遺伝子を大腸菌内で発現させ、細胞
外膜を除去した後に逆転膜リポソームを作製し、このリ
ポソームの鉄イオン流出現象をラジオアイソトープ標識
した鉄を用いて確認した。この結果、ｍａｇＡタンパク
質は鉄イオンの排出を行っていることが分かった。As a result of a homology search of the magA protein, it showed a high homology with the protein that controls the potassium ion efflux mechanism of Escherichia coli. From this, it is considered that the magA protein is involved in the outflow of cation ions. Therefore, the magA gene was expressed in Escherichia coli, the extracellular membrane was removed, an inverted membrane liposome was prepared, and the iron ion efflux phenomenon of this liposome was confirmed using radioisotope-labeled iron. As a result, it was found that the magA protein excretes iron ions.
【００１４】該ｍａｇＡタンパク質は前記のｍａｇＡ遺
伝子によりコードされるものであるが、より一般的に
は、配列表に記載の配列番号３で示される塩基配列を融
合するＤＮＡ配列によりコードされる。The magA protein is encoded by the above-mentioned magA gene, but more generally, it is encoded by a DNA sequence that fuses the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
【００１５】本発明者は、ｍａｇＡタンパク質の疎水性
領域が該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合する機
能を有し、両端の親水性領域は有機膜から露出すること
に着目し、親水性領域に別の有用タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を融合すると、得られる融合ＤＮＡ配列は
磁性細菌内で該有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に
結合した状態で生成することを見いだした。ｍａｇＡ遺伝子断片 そこで、本発明は、第二に、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体
内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍ
ａｇＡタンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列
表に記載の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の
領域）をコードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含
むｍａｇＡ遺伝子断片を提供する。The present inventors have noticed that the hydrophobic region of the magA protein has a function of binding the protein to the organic film of the magnetic fine particles, and the hydrophilic regions at both ends are exposed from the organic film. It has been found that when a DNA sequence encoding another useful protein is fused to, the resulting fused DNA sequence is produced in a magnetic bacterium in a state in which the useful protein is bound to the organic membrane of magnetic particles. MagA gene fragment Then, the present invention secondly, m bound to an organic film covering the magnetic fine particles generated in the intracellular body of the magnetic bacterium AMB-1.
Provided is a magA gene fragment containing a DNA sequence represented by a nucleotide sequence encoding a hydrophobic region (region of amino acid residues 7 to 380 of SEQ ID NO: 2 shown in the sequence listing) in the amino acid sequence of agA protein. .
【００１６】該ｍａｇＡ遺伝子断片は融合タンパク質を
有機膜に結合した状態で生成させるための、固定手段と
して有用である。The magA gene fragment is useful as an immobilizing means for producing a fusion protein bound to an organic membrane.
【００１７】該ｍａｇＡ遺伝子断片は上記の疎水性領域
を含むことを必須とするが、３’末端側又は５’末端側
にｍａｇＡ遺伝子に存在する塩基配列の全部又は一部が
存在してもよい。融合ＤＮＡ配列 また、本発明は、第三に、(a) 該ｍａｇＡ遺伝子断片
と、(b) 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は両方の末端に
融合された、一又は二の有用タンパク質をコードする一
又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を提供
する。It is essential that the magA gene fragment contains the above-mentioned hydrophobic region, but the whole or part of the nucleotide sequence present in the magA gene may be present at the 3'end side or the 5'end side. . Fusion DNA Sequence The present invention also thirdly provides one or two useful proteins encoding (a) the magA gene fragment and (b) fused to one or both ends of the magA gene fragment. Alternatively, a fusion DNA sequence consisting of two DNA sequences is provided.
【００１８】有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列は
ｍａｇＡ遺伝子断片の３’末端側及び５’末端側のいず
れか一方に融合されてもよいし、両方に融合されてもよ
い。両方に融合される場合には、３’末端に導入される
ＤＮＡ配列と５’末端に導入されるＤＮＡ配列とは同一
のタンパク質をコードするものでもよいし、異なるタン
パク質をコードするものでもよい。両方に融合する利点
は、次のような場合に得られる。 １）両末端に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を導入することで、磁気微粒子への該タンパク質の固定
化量を向上させることができる。 ２）５’末端と３’末端に２つの連続する複合酵素系又
は酵素と補酵素再生酵素などのタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を導入することで、酵素系の反応を迅速に進
めることができる。 ３）５’末端と３’末端にサブユニットを形成するタン
パク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、この
サブユニットを迅速にかつ完全に形成させることができ
る。The DNA sequence encoding the useful protein may be fused to either the 3'end side or the 5'end side of the magA gene fragment, or may be fused to both. When fused to both, the DNA sequence introduced at the 3 ′ end and the DNA sequence introduced at the 5 ′ end may encode the same protein or different proteins. The advantage of merging both is obtained in the following cases. 1) By introducing a DNA sequence encoding the same protein at both ends, the amount of the protein immobilized on the magnetic fine particles can be improved. 2) By introducing two continuous complex enzyme systems or a DNA sequence encoding a protein such as an enzyme and a coenzyme regenerating enzyme at the 5'and 3'ends, the reaction of the enzyme system can be rapidly advanced. 3) By introducing a DNA sequence encoding a protein forming a subunit at the 5'end and the 3'end, the subunit can be rapidly and completely formed.
【００１９】該ｍａｇＡ遺伝子断片に前記有用タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を融合させる位置は、融合部
に生成する塩基配列がアミノ酸合成に適したものとなる
限り制限されない。前記疎水性領域をコードするＤＮＡ
配列に近接する形で有用タンパク質をコードするＤＮＡ
配列が導入されてもよいし、疎水性領域をコードするＤ
ＮＡ配列と有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との
間に前記親水性領域をコードするＤＮＡ配列が部分的に
存在してもよい。また、ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は
両方の端に、都合のよい制限酵素切断部位が生じるよう
に人工的に延長されたＤＮＡ配列が存在してもよい。特
に５’末端側の親水性領域は短いので、これらは全て存
在していてもよいし、必要に応じこの部分が延長されて
いてもよい。目的とする有用タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を挿入する部位として有用な５’末端側の制限
酵素切断部位としては、ｍａｇＡ遺伝子内に導入したＳ
ｃａＩ切断部位があり、３’末端側の制限酵素切断部位
としてはＳｐｈＩ切断部位、ＤｒａΙΙΙ切断部位があ
る。ＳｐｈＩ切断部位とＤｒａΙΙΙ切断部位はｍａｇ
Ａ遺伝子の疎水性領域から僅かに下流側に寄った親水性
領域内に存在するので、好都合な部位の一つである。組み換えプラスミド 本発明は、第四に、上記の融合ＤＮＡ配列を発現させる
のに用いる組み換えプラスミドを提供する。The position at which the DNA sequence encoding the useful protein is fused to the magA gene fragment is not limited as long as the base sequence generated at the fusion site is suitable for amino acid synthesis. DNA encoding the hydrophobic region
DNA encoding a useful protein in the vicinity of the sequence
A sequence may be introduced or D encoding a hydrophobic region
A DNA sequence encoding the hydrophilic region may be partially present between the NA sequence and the DNA sequence encoding the useful protein. In addition, an artificially extended DNA sequence may be present at one or both ends of the magA gene fragment so as to generate a convenient restriction enzyme cleavage site. Especially, since the hydrophilic region on the 5'-terminal side is short, these may all be present or, if necessary, this portion may be extended. D encoding a desired useful protein
As the 5'-terminal side restriction enzyme cleavage site useful as a site for inserting the NA sequence, S introduced into the magA gene is used.
There is a caI cleavage site, and as a restriction enzyme cleavage site on the 3'-terminal side, there are a SphI cleavage site and a DraΙΙΙ cleavage site. SphI and DraΙΙΙ cleavage sites are mag
Since it exists in the hydrophilic region slightly downstream from the hydrophobic region of the A gene, it is one of the convenient sites. Recombinant plasmid The present invention fourthly provides a recombinant plasmid used for expressing the above-mentioned fusion DNA sequence.
【００２０】即ち、本発明は、前記の融合ＤＮＡ配列を
含有する組み換えプラスミドを提供する。That is, the present invention provides a recombinant plasmid containing the above fusion DNA sequence.
【００２１】該組み換えプラスミドは、前記のｍａｇＡ
遺伝子断片及び目的とするタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列からなる融合ＤＮＡ配列を公知の方法により適当
なべクタープラスミドに導入することにより得られる。The recombinant plasmid is the above-mentioned magA.
DN encoding gene fragment and target protein
It can be obtained by introducing the fused DNA sequence consisting of the A sequence into an appropriate vector plasmid by a known method.
【００２２】組み換えプラスミドの調製に用いるベクタ
ーとしては、例えば、ｐＲＫ４１５の系統、ｐＫＴ２３
０の系統のものを用いることができる。選択したベクタ
ーに遺伝子を組み込む。ベクターに最も効率よく、また
遺伝子が目的の向きに並ぶように、遺伝子を組み込む
順、用いる制限酵素を決定する。遺伝子を導入する手順
が決定したなら、制限酵素によってＤＮＡを切断し、電
気泳動を行うことにより導入する目的遺伝子断片を分離
する。その後、リガーゼを用いてライゲーションを行い
ＤＮＡを連結する。遺伝子断片の連結部分が合わない場
合は末端部分を平滑化処理し、ライゲーションを行う。
制限酵素、リガーゼ、末端平滑化用の酵素などは全て市
販のものを用いて行うことができる。最後に目的のプラ
スミドができているかどうか制限酵素の切断パターンを
確認する。The vector used for the preparation of the recombinant plasmid is, for example, pRK415 strain, pKT23.
0 system can be used. Incorporate the gene into the vector of choice. Decide the restriction enzymes to be used in the order in which the genes are incorporated so that the genes are most efficiently arranged in the vector and the genes are arranged in the desired orientation. When the procedure for introducing the gene is determined, the DNA is cleaved with a restriction enzyme, and the target gene fragment to be introduced is separated by performing electrophoresis. Then, ligation is performed using ligase to ligate the DNA. If the connecting parts of the gene fragments do not match, the end parts are blunted and ligated.
As the restriction enzyme, ligase, enzyme for blunting ends, etc., all commercially available products can be used. Finally, check the restriction enzyme cleavage pattern to see if the desired plasmid has been constructed.
【００２３】この際、ｍａｇＡ遺伝子と融合させる、別
のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定され
るものではない。形質転換された磁性細菌 本発明は、第五に、上記の組み換えプラスミドで形質転
換された磁性細菌を提供する。At this time, the kind of the gene encoding another protein to be fused with the magA gene is not particularly limited. Transformed magnetic bacterium Fifth, the present invention provides a magnetic bacterium transformed with the above recombinant plasmid.
【００２４】磁性細菌の上記プラスミドによる形質転換
は公知の方法により行うことができる。宿主として用い
る磁性細菌としては、例えば、Magnetospirillum種の微
生物（例：菌株AMB-1(微工研菌寄13282), MS-1(IFO 152
72, ATCC 31632, DSM 3856),MSR-1(IFO 15272, DSM 636
1)、及びDesulfovibrio 種の微生物（例：菌株RS-1(微
工研菌寄13283)) が挙げられる。Transformation of the magnetic bacterium with the above-mentioned plasmid can be performed by a known method. Examples of magnetic bacteria to be used as a host include microorganisms of Magnetospirillum species (eg, strain AMB-1 (Microtechnical Lab. 13282), MS-1 (IFO 152
72, ATCC 31632, DSM 3856), MSR-1 (IFO 15272, DSM 636
1), and microorganisms of Desulfovibrio species (eg, strain RS-1 (Microtechnology Research Institute, Inc. 13283)).
【００２５】こうして得られた磁性細菌を適切な条件下
で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク
質を有する磁気微粒子が生成する。具体的には、目的と
するタンパク質は、ｍａｇＡ遺伝子断片によりコードさ
れる膜結合性タンパク質と融合した状態で、その磁気微
粒子を被覆している有機膜に結合した状態で得られる。By culturing the magnetic bacterium thus obtained under appropriate conditions, magnetic fine particles having a useful protein of interest are produced in the microbial cells. Specifically, the target protein is obtained in a state of being fused with a membrane-bound protein encoded by a magA gene fragment and bound to an organic membrane coating the magnetic fine particles.
【００２６】このタンパク質結合磁気微粒子は、該タン
パク質が機能性タンパク質である場合に特に有用であ
る。磁気により該磁気微粒子を所望の箇所へ移動し、そ
の箇所でそのタンパク質が有する機能を発揮させること
ができるからである。機能性タンパク質結合磁気微粒子 そこで、本発明は、第六に、磁気微粒子と、該磁気微粒
子の表面を被覆している有機膜に結合している、前記の
融合ＤＮＡ配列（但し前記有用タンパク質が機能性タン
パク質である）でコードされた一又は二の機能性タンパ
ク質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タン
パク質結合磁気微粒子を提供する。タンパク質結合磁気微粒子の製造方法 また、本発明は、第七に、上記の融合ＤＮＡ配列を含む
プラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養するこ
とにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タンパ
ク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有
機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからな
る、上記有用タンパク質結合磁気微粒子を製造する方法
を提供する。The protein-bonded magnetic fine particles are particularly useful when the protein is a functional protein. This is because the magnetic fine particles can be moved to a desired location by magnetism and the function of the protein can be exerted at that location. Functional protein coupled magnetic particles The present invention is, in the sixth, magnetic particles and are bonded to the organic film covering the surface of the magnetic particles, wherein the fusion DNA sequence (provided that the useful protein function A functional protein-bonded magnetic fine particle having a fusion protein containing one or two functional proteins encoded by a functional protein). Method for producing protein-bonded magnetic fine particles Seventhly , the present invention expresses the fusion DNA sequence by culturing the magnetic bacterium transformed with the plasmid containing the fusion DNA sequence described above, and contains a useful protein. Provided is a method for producing the above-mentioned useful protein-bonded magnetic fine particles, which comprises producing a fusion protein in the microbial cells in a state of being bound to an organic film covering the magnetic fine particles.
【００２７】該有用タンパク質結合磁気微粒子は、培養
により増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破
砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることが
できる。The useful protein-bonded magnetic fine particles can be easily collected by utilizing magnetism after crushing or lysing the bacterial cells of magnetic bacteria grown by culture by a usual method.
【００２８】本発明によりｍａｇＡ遺伝子断片と融合さ
れる有用なタンパク質をコードする遺伝子も、それによ
り発現されるタンパク質も特に限定されない。医療、発
酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らか
の機能、例えば、生理活性を有するタンパク質が用いら
れよう。しかし、これに限定されるものではなく、通常
の方法では分離、取得が困難であるタンパク質の製造に
本発明を利用することができる。即ち、このようなタン
パク質を融合タンパク質の形で磁気微粒子上に生成さ
せ、磁気的に容易に分離し集めることができる。The gene encoding a useful protein fused with the magA gene fragment according to the present invention and the protein expressed thereby are not particularly limited. When used for the purpose of medical treatment, industries utilizing fermentation, etc., a protein having some function, for example, a physiologically active protein may be used. However, the present invention is not limited to this, and the present invention can be applied to the production of proteins that are difficult to separate and obtain by ordinary methods. That is, such a protein can be produced in the form of a fusion protein on magnetic fine particles, and can be magnetically easily separated and collected.
【００２９】有用タンパク質の内、機能性タンパク質と
しては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関
連タンパク質、レクチン、アビジン等の結合能を有する
タンパク質、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異
性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素類が
挙げられる。Among useful proteins, functional proteins include, for example, antigens, antibodies, immune-related proteins such as protein A, proteins having binding ability such as lectins and avidins, coenzymes, hydrolases, oxidoreductases, Enzymes such as an isomerase, a transferase, a releasing enzyme, and a restriction enzyme can be mentioned.
【００３０】また、上記の有用タンパク質の製造方法
は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質
である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方
法によっては純粋な形で得ることが困難であるときに
は、該タンパク質の製造方法として有用である。この場
合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られ
るが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に
他の細胞成分から分離、精製することができる。利用可能性 本発明は、例えば、次のような利用可能性を有する。 1)酵素結合担体 一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる
酵素はすべて磁気微粒子表面で発現させる価値がある。
例えば、生化学反応において反応系の中で局所的にある
酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気
微粒子は有用である。また、ある酵素系の疾患において
は器官に特異的にその酵素を投与したい場合磁気微粒子
表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによっ
て、治療することが可能である。 2)DNA キャリア DNA やRNA との結合能を持つタンパク質、例えばリプレ
ッサーなどのタンパク質の遺伝子をｍａｇＡ遺伝子断片
と融合し、本発明により磁気微粒子に固定すると、この
磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いる
ことが可能である。リプレッサーなどのタンパク質はあ
る特定の物質の存在下で結合力を失う特性がある。これ
を利用して、遺伝子の輸送を行うことができる。リプレ
ッサータンパク質の例としてはＬａｃＩが挙げられる。
ＬａｃＩとはラクトース分解酵素の遺伝子発現を制御す
るタンパク質で、プロモーターの下流域に結合すること
によって、遺伝子の転写を抑制するリプレッサーであ
る。このＬａｃＩはラクトースや、ＩＰＴＧなどの化学
物質と結合することによって、ＤＮＡとの結合能を失
う。つまり、分解する基質が存在するときに発現する仕
組みになっているのである。また、ＬａｃＩが結合する
特定のＤＮＡドメインがある。ＤＮＡドメインを組み込
んだ遺伝子はＬａｃＩが結合することができる。Further, in the above method for producing a useful protein, even if the protein is a useful protein having no function, it is difficult to obtain the protein in a pure form by conventional production methods. In some cases, it is useful as a method for producing the protein. In this case, the useful protein is obtained in a state of being bound to the magnetic fine particles, but it can be easily separated and purified from other cell components by a magnetic method using a magnet or the like as described above. Usability The present invention has the following usability, for example. 1) Enzyme binding carrier Generally, all enzymes that are thought to ideally work site-specifically are worth expressing on the surface of magnetic particles.
For example, when it is desired to locally perform an enzyme reaction in a reaction system in a biochemical reaction, magnetic fine particles expressing this enzyme are useful. In addition, a certain enzyme-based disease can be treated by magnetically inducing an enzyme expressed on the surface of the magnetic fine particles when it is desired to specifically administer the enzyme to an organ. 2) DNA carrier A carrier carrying a gene capable of binding to DNA or RNA, for example, a gene of a protein such as a repressor, is fused with a magA gene fragment and immobilized on magnetic microparticles according to the present invention to transport the magnetic microparticles. Can be used as Proteins such as repressors have the property of losing binding power in the presence of certain substances. Utilizing this, gene transfer can be performed. An example of a repressor protein is LacI.
LacI is a protein that controls the gene expression of lactose-degrading enzyme, and is a repressor that suppresses gene transcription by binding to the downstream region of the promoter. This LacI loses its ability to bind to DNA by binding to chemical substances such as lactose and IPTG. In other words, it is a mechanism that is expressed when there is a substrate that decomposes. There are also specific DNA domains to which LacI binds. LacI can bind to a gene incorporating a DNA domain.
【００３１】例えば、このＬａｃＩを磁気微粒子表面で
発現させることによって、ＬａｃＩがＤＮＡドメインを
組み込んだ遺伝子と結合する。一方、ＬａｃＩは、ＩＰ
ＴＧという物質によってＤＮＡとの結合能を失う。これ
を用いてある特定の場所からＤＮＡを磁気輸送し、ＩＰ
ＴＧの添加によってＤＮＡを遊離させることができる。
こうして、遺伝子を所要の場所へ輸送することができ
る。For example, by expressing this LacI on the surface of the magnetic fine particles, LacI binds to the gene incorporating the DNA domain. On the other hand, LacI is an IP
The substance called TG loses its ability to bind to DNA. This is used to magnetically transport DNA from a specific place,
DNA can be released by the addition of TG.
In this way, the gene can be transported to the required location.
【００３２】したがって、本発明の磁気微粒子は、遺伝
子治療における遺伝子移送担体などに応用することが考
えられる。例えば、目的遺伝子の相補鎖からできるアン
チセンスＲＮＡを発現させることによって、その目的の
遺伝子の発現をＲＮＡハイブリッドの形成によって抑え
るという治療法が現在盛んに研究されているが、そのア
ンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを運ぶ手段として
用いることができる。Therefore, the magnetic microparticles of the present invention can be applied to a gene transfer carrier in gene therapy. For example, a therapeutic method of suppressing the expression of the target gene by forming an RNA hybrid by expressing an antisense RNA formed from a complementary strand of the target gene is currently under active research. It can be used as a means to carry the expressed DNA.
【００３３】また、さらに、金属結合性のタンパク質を
磁気微粒子表面に発現させ、これを金属の回収、また
は、検出に用いることができる。回収、検出は磁気回収
によって行うことができる。 3)タンパク質生産システム 一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、
磁気微粒子上にMagAタンパク質との融合タンパク質とし
て発現させることで、分離精製が容易になる。即ち、磁
気微粒子表面で発現させたタンパク質は、最後に磁気に
より容易に回収できるからである。磁性細菌から得られ
る磁気微粒子の分散性の高さを考えると、タンパク質に
よっては、磁気微粒子に固定化された状態で使用可能な
ものも多く存在すると考えられる。例えばアルコール発
酵用の酵素などは磁気微粒子と結合したままの状態でも
酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられ
る。Furthermore, a metal-binding protein can be expressed on the surface of the magnetic fine particles, and this can be used for metal recovery or detection. Recovery and detection can be performed by magnetic recovery. 3) Protein production system Proteins that are generally said to be difficult to separate and purify
By expressing it as a fusion protein with MagA protein on magnetic particles, separation and purification will be facilitated. That is, the protein expressed on the surface of the magnetic fine particles can be easily recovered by magnetism at the end. Considering the high dispersibility of magnetic fine particles obtained from magnetic bacteria, it is considered that there are many proteins that can be used in a state of being immobilized on the magnetic fine particles depending on the protein. For example, it is considered that an enzyme for alcoholic fermentation or the like can be sufficiently used even if it remains bound to the magnetic fine particles as long as the enzyme has activity.
【００３４】[0034]
例１Ｉ．組み換えプラスミドの調製 蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ
製）を磁性細菌内で発現させ、該遺伝子でコードされる
発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上に生成
させるため、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したプ
ラスミドｐＫＭＬ、及びｍａｇＡ遺伝子を含まずｌｕｃ
遺伝子のみを結合したプラスミドｐＫＰＬを図１に示す
方法で作製した。 (1) ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による
遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子
を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，
Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ
Ｄ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７
０：１９１−１９７）を用いた。ｐＲＫ４１５にｌｕｃ
遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。プ
ラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流部に存在するＢ
ａｍＨＩで切断し、ブランティングキット（Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ Ｋｉｔ）（宝酒造製）で平滑末端化した。 (2) ＡＭＢ−１のクロモゾームをＥｃｏＲＩで切断し、
λＤＮＡであるλＺＡＰＩＩにランダムに組み込んでλ
ＺＡＰＩＩジーンバンクを作製した。これはファージ粒
子中にパッケージし、大腸菌に感染させることによっ
て、プラークの形でジーンバンクを作製している。ｐＵ
Ｍ５ＡはλＺＡＰＩＩジーンバンクより分離したｍａｇ
Ａ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ遺伝子断片を
ｐＵＣ１９にクローニングして得た（図２）。分離の際
にはプラークサザンハイブリダイゼーションを行った。Example 1 I. Preparation of Recombinant Plasmid MagA-luc fusion gene for expressing firefly luciferase gene (luc gene, manufactured by Toyo Ink Co., Ltd.) in a magnetic bacterium and producing a luminescent protein encoded by the gene on an organic film covering magnetic particles. Lucid that does not contain the plasmid pKML and the magA gene
A plasmid pKPL in which only the gene was bound was prepared by the method shown in FIG. (1) A plasmid pRK415 (NTTeen, which has a tetracycline resistance gene, can be introduced into the vector by conjugative transfer into the magnetic bacterium AMB-1.
S. Tamaki, D.M. Kobayashi and
D. Trallinger, 1988, Gene 7
0: 191-197). luc to pRK415
The gene was incorporated to create the plasmid pKLC. The plasmid pKLC is present in the upstream part of the luc gene, B
Cut with amHI and use the blunting kit (Blunt
ing Kit) (manufactured by Takara Shuzo) was used to make the ends blunt. (2) AMB-1 chromosomes were cut with EcoRI,
Randomly integrated into λZAPII, which is λDNA,
The ZAPII Genebank was created. It is packaged in phage particles and infected with E. coli to create a gene bank in the form of plaques. pU
M5A is a mag isolated from λZAPII Genebank
A 2.6 kbp EcoRI gene fragment containing the A gene was obtained by cloning into pUC19 (Fig. 2). Plaque Southern hybridization was performed during the separation.
【００３５】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子断片を分離
し、同様に平滑末端化し、プラスミドｐＫＬＣと接続
し、プラスミドｐＫＭＬを作製した。こうしてｍａｇＡ
の読み訳とずれることなくｌｕｃ遺伝子は翻訳され融合
タンパク質を生産することが出来る。 (3) プラスミドｐＵＭ５ＡからＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩで
切断し、プロモーターの配列のみを分離したものを、同
様に平滑末端化したプラスミドｐＫＬＣに接続しプラス
ミドｐＫＰＬを作製した。Next, the magA gene was added to the plasmid pUM.
It was digested with 5A of SphI, the magA gene fragment was separated, blunt-ended in the same manner, and ligated with the plasmid pKLC to prepare the plasmid pKML. Thus magA
The luc gene can be translated to produce a fusion protein without deviating from the translation. (3) The plasmid pUM5A was cleaved with EcoRI and NcoI, and only the promoter sequence was separated, which was ligated to the similarly blunt-ended plasmid pKLC to prepare a plasmid pKPL.
【００３６】以上の操作によりプロモーター領域のみを
ｌｕｃ遺伝子と結合したプラスミドｐＫＰＬとｍａｇＡ
−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したｐＫＭＬの２種を作製し
た。ｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図を図３に示す。II. 接合伝達体の作製 次に、Ｉで得られた二種の組み換えプラスミドを接合伝
達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製
を行った。接合伝達における供与菌体として用いたE. c
oli S17-1 はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達
を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能で
ある。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期
から後期の磁性細菌約８×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用
い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロ
ニーをかき取って１０9 から１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに
なるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸
菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイ
ティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り
５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この
懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加した
ＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細
胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地
では増殖しない。By the above operation, plasmids pKPL and magA in which only the promoter region was bound to the luc gene
Two types of pKML to which the -luc fusion gene was linked were prepared. A map of restriction enzyme cleavage sites of pKML is shown in FIG. II. Preparation of conjugation transfer medium Next, the two recombinant plasmids obtained in I were introduced into the wild strain AMB-1 by conjugation transfer to prepare the conjugation transfer medium. E. c used as a donor in conjugative transfer
Since oli S17-1 has the tra gene, it is possible to carry out conjugation transfer without a helper plasmid when carrying out conjugation transfer. For conjugative transfer, about 8 × 10 7 cells / ml of magnetic bacteria in the mid to late logarithmic phase cultured in MSGM medium were used, and the donor cells were transformed with the plasmid on the previous day and the colonies generated were scraped to 10 9 to 10 10 cells. The cells were used by suspending them to cells / ml. The bacteria were mixed with 1:50 (magnetic bacteria: Escherichia coli), spotted on an agar plate, and mating was performed. After 6 hours, the spot was cut with a scalpel to collect the bacterial cells using about 5 ml of MSGM medium. This suspension was inoculated into MSGM medium supplemented with 2.5 μg / ml of tetracycline. The cells grown by culturing at 25 ° C. were used as conjugative transfer media. At this time, Escherichia coli does not grow in MSGM medium.
【００３７】次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁
性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心
分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄
後、菌体濃度０．１ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌ／ｍｌを超え
ない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音
波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しなが
らＮｄ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、
磁気微粒子を懸濁液中から分離した。さらに懸濁液を
５，０００Ｇ、１５分遠心分離することで細胞膜成分を
分離し、１００，０００Ｇ、１．５時間超遠心する事で
細胞質を分離した。Next, magnetic particles were separated from the magnetic bacteria cultured in MSGM medium after conjugation transfer. The magnetic bacteria were collected by centrifugation, washed twice with 10 mM Tris buffer, suspended at a concentration not exceeding 0.1 g wet cell / ml, and ultrasonically disrupted 5 times for 30 seconds at an output of 120 W. . While ice-cooling the disrupted cell suspension in the container, an Nd-Co magnet was applied to the outer wall of the container for 30 minutes for treatment.
The magnetic particles were separated from the suspension. Further, the suspension was centrifuged at 5,000 G for 15 minutes to separate the cell membrane components, and ultracentrifuged at 100,000 G for 1.5 hours to separate the cytoplasm.
【００３８】磁気微粒子、細胞膜及び細胞質の各分画の
ルシフェーラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋
インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定するこ
とで行い、導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現及び発
現量を測定した。結果を表１に示す。The luciferase activity of each fraction of the magnetic fine particles, the cell membrane and the cytoplasm was measured by measuring the amount of luminescence with a luminometer using a Piccagene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink Co., Ltd.) to measure the expression and the amount of expression of the introduced luciferase gene. did. The results are shown in Table 1.
【００３９】[0039]
【表１】 （単位：キロカウント／ｍｇタンパク質） 表１に示すように、プロモーター領域の配列のみをｌｕ
ｃ遺伝子と結合したｐＫＰＬ遺伝子を導入した磁性細菌
は細胞質分画の発光量が高く、磁気微粒子表面でのタン
パク質の発現効率が低いのに対し、ｍａｇＡ−ｌｕｃ融
合遺伝子を結合したｐＫＭＬを導入した磁性細菌では磁
気微粒子分画と細胞膜分画で高い発光量が得られた。即
ち、膜結合性タンパク質であるｍａｇＡ融合タンパク質
が磁気微粒子分画でも発現しており、磁気微粒子を被覆
する有機膜上でのｌｕｃタンパク質の生産及び分離が示
された。例２ 抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原認識部位をコードした遺伝子
（ｉｇｇ遺伝子、ファルマシア社）を該遺伝子でコード
される抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質
を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−
ｉｇｇ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＧを図４
に示す方法で作成した。[Table 1] (Unit: kilocount / mg protein) As shown in Table 1, only the sequence of the promoter region was lu.
A magnetic bacterium introduced with the pKPL gene linked to the c gene has a high luminescence amount in the cytoplasmic fraction and a low protein expression efficiency on the surface of the magnetic particles, whereas a magnetic bacterium introduced with the pKML linked with the magA-luc fusion gene. In bacteria, high luminescence was obtained by magnetic particle fractionation and cell membrane fractionation. That is, the magA fusion protein, which is a membrane-bound protein, was also expressed in the magnetic fine particle fraction, indicating production and separation of luc protein on the organic membrane that coats the magnetic fine particles. Example 2 In order to generate a gene encoding the antigen recognition site of an anti-rabbit IgG antibody (igg gene, Pharmacia) on the organic film containing phospholipids as a main component, the antibody protein encoded by the gene is coated with magnetic fine particles. , MagA-
FIG. 4 shows the plasmid pKMG ligated with the igg fusion gene.
It was created by the method shown in.
【００４０】即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に
接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイク
リン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用い
た。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断し平滑末端化しｉ
ｇｇ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＧＣを作製し
た。That is, as the vector, a plasmid pRK415 which can be introduced into the magnetic bacterium AMB-1 by conjugative transfer and has a tetracycline resistance gene was used. pRK415 was cut with EcoRI to make it blunt-ended i
The gg gene was incorporated to create the plasmid pKGC.
【００４１】次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾーム
をＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰII（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡ
ＰIIジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中に
パッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形
でジーンバンクを作製した。λＺＡＰIIジーンバンクよ
り分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５
Ａを作製した。Next, the chromosomes of the magnetic bacterium AMB-1 were cleaved with EcoRI to obtain λDNA λZAPII (S
ΛZA randomly incorporated into TRATAGENE)
A PII gene bank was created. This was packaged in phage particles and infected with E. coli to create a gene bank in the form of plaques. A 2.6 kbp Eco containing the magA gene isolated from λZAPII gene bank
The RI gene fragment was cloned into pUC19 and cloned into pUM5.
A was produced.
【００４２】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平
滑末端化し、プラスミドｐＫＧＣと接続しプラスミドｐ
ＫＭＧを作製した。ｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図を
図５に示す。Next, the magA gene was added to the plasmid pUM.
It was digested with SphI of 5A to isolate the magA gene, blunt-ended and ligated with plasmid pKGC to construct plasmid p
KMG was made. A map of restriction enzyme cleavage sites of pKMG is shown in FIG.
【００４３】このプラスミドを接合伝達によって野生株
AMB-1 に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を
培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収し
た。この磁気微粒子を用いて、ウサギIgG を抗原とした
イムノアッセイを行った。イムノアッセイはアルカリフ
ォスファターゼ標識した抗ウサギIgG 抗体を２次抗体と
して用いたサンドイッチ法を用い、検出はアルカリフォ
スファターゼと、AMPPD(Boehringer Mannheim Biochemi
ca) との反応による発光をルミノメーターで測定した。
この結果、抗原を検出することが可能であった。この実
験により、接合伝達体の磁気微粒子に抗体がMagA融合タ
ンパク質として結合することによって、抗体固定化操作
なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒
子を生産することができた。例３ プロテインＡ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｇｅｎｅ、フ
ァルマシア社製ｐＥＺＺ１８より分離）を該遺伝子でコ
ードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質
を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍａｇＡ−
プロテインＡ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＭＡ
を図６に示す方法で作製した。This plasmid was used as a wild strain by conjugal transfer.
It was introduced into AMB-1 to prepare a conjugative transfer medium. The conjugative transfer medium was cultured, cells were collected and disrupted, and magnetic fine particles were collected. An immunoassay using rabbit IgG as an antigen was performed using the magnetic fine particles. The immunoassay uses a sandwich method in which an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG antibody is used as a secondary antibody, and detection is performed using alkaline phosphatase and AMPPD (Boehringer Mannheim Biochemi).
Luminescence due to reaction with (ca) was measured by a luminometer.
As a result, it was possible to detect the antigen. By this experiment, it was possible to produce magnetic microparticles that can be used in an antigen detection system without an antibody immobilization operation by binding an antibody as a MagA fusion protein to the magnetic microparticles of the conjugation transmitter. Example 3 The protein A gene (Protein A gene, isolated from Pharmacia pEZZ18) was generated in order to generate a protein encoded by the gene on an organic membrane containing phospholipids as a main component for coating magnetic fine particles.
Plasmid pKMA ligated with protein A fusion gene
Was manufactured by the method shown in FIG.
【００４４】即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に
接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイク
リン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用い
た。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断しプロテインＡ遺
伝子を組み込み、プラスミドｐＫＡＣを作製した。That is, as a vector, a plasmid pRK415 which can be introduced into a magnetic bacterium AMB-1 by conjugative transfer and has a tetracycline resistance gene was used. pRK415 was cleaved with EcoRI to incorporate the protein A gene to prepare a plasmid pKAC.
【００４５】次に、磁性細菌ＡＭＢ−１のクロモゾーム
をＥｃｏＲＩで切断し、λＤＮＡであるλＺＡＰII（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にランダムに組み込みλＺＡ
ＰIIジーンバンクを作製した。これはファージ粒子中に
パッケージし、大腸菌に感染させることでプラークの形
でジーンバンクを作製した。λＺＡＰIIジーンバンクよ
り分離したｍａｇＡ遺伝子を含む２．６ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ遺伝子断片をｐＵＣ１９にクローニングしｐＵＭ５
Ａを作製した。Next, the chromosomes of the magnetic bacterium AMB-1 were cleaved with EcoRI to obtain λDNA λZAPII (S
ΛZA randomly incorporated into TRATAGENE)
A PII gene bank was created. This was packaged in phage particles and infected with E. coli to create a gene bank in the form of plaques. A 2.6 kbp Eco containing the magA gene isolated from λZAPII gene bank
The RI gene fragment was cloned into pUC19 and cloned into pUM5.
A was produced.
【００４６】次に、ｍａｇＡ遺伝子をプラスミドｐＵＭ
５ＡのＳｐｈＩで切断し、ｍａｇＡ遺伝子を分離し、平
滑末端化したプラスミドｐＫＡＣと接続しプラスミドｐ
ＫＭＡを作製した。ｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図を
図７に示す。Next, the magA gene was cloned into the plasmid pUM.
5A was cleaved with SphI to isolate the magA gene, which was ligated to the blunt-ended plasmid pKAC to obtain plasmid p
KMA was prepared. A map of restriction enzyme cleavage sites of pKMA is shown in FIG.
【００４７】このプラスミドを接合伝達によって野生株
AMB-1 に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を
培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収し
た。この磁気微粒子に対し、プロテインＡのIgG との結
合能に注目し、抗杉花粉、抗小麦、抗卵IgG と混合し
た。混合した粒子は洗浄し、抗体固定化量を測定したと
ころ、従来用いられてきたSPDPを用いる化学結合法（特
開平５−２０９８８４）と同程度の固定化が可能である
ことが示された。また、実施例１と同様に、抗原検出実
験を行った結果、３種の抗原はどれも検出可能であっ
た。このようにプロテインＡのmagA融合タンパク質を用
いて様々なIgG を磁気微粒子表面に簡便に結合させるこ
とが可能であり、従来の化学結合に劣らない抗原検出が
可能であることが示された。例４ 蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）をｍａｇＡ遺
伝子の５’末端側に導入し、ｌｕｃ−ｍａｇＡ融合ＤＮ
Ａ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＭを図８に示す方法で
作製した。 (1) ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による
遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子
をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。このｐＲＫ４
１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮΙ切断部位を平滑末
端化処理により欠損させ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥ
を作製した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍ
ａｇＡプロモータ−ｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラ
スミドｐＮＥＰＬを生成した。 (2) 次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＵＭ
５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用
い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳｃａＩで
切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミド
ｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを作製し
た。ｐＮＥＰＬの制限酵素切断部位地図を図９に示す。 (3) このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−
１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養
して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を
磁石を用いて回収した。この磁気微粒子のルシフェラー
ゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を
用いルミノメーターで発光量を測定した。結果を表２に
示す。This plasmid was used as a wild strain by conjugal transfer.
It was introduced into AMB-1 to prepare a conjugative transfer medium. The conjugative transfer medium was cultured, cells were collected and disrupted, and magnetic fine particles were collected. Focusing on the ability of protein A to bind to IgG, the magnetic fine particles were mixed with anti-cedar pollen, anti-wheat and anti-egg IgG. When the mixed particles were washed and the amount of antibody immobilized was measured, it was shown that immobilization was possible to the same extent as in the conventionally used chemical binding method using SPDP (JP-A-5-209884). In addition, as a result of performing an antigen detection experiment as in Example 1, all three types of antigens were detectable. As described above, it was shown that various IgGs can be easily bound to the surface of the magnetic fine particles by using the magA fusion protein of protein A, and the antigen can be detected as in the conventional chemical binding. Example 4 A firefly luciferase gene (luc gene) was introduced into the 5'end of the magA gene, and a luc-magA fusion DN was formed.
A plasmid pNELM containing the A sequence was prepared by the method shown in FIG. (1) As a vector, a plasmid pRK415 capable of transducing a gene into the magnetic bacterium AMB-1 by conjugative transfer and having a tetracycline resistance gene was used. This pRK4
The NcoI cleavage site and EcoNII cleavage site of 15 were deleted by blunting treatment to obtain plasmid pRK415NE.
Was produced. pRK415NE was cut with SacI and
A plasmid pNEPL incorporating the agA promoter-luc fusion gene was generated. (2) Next, a plasmid pUM carrying the magA gene
A magA gene was amplified by PCR with 5A using a primer designed with a ScaI cleavage site, cut with ScaI, and ligated with a plasmid pNEPL that had been blunt-ended after cutting with EcoNI to prepare a plasmid pNELM. A map of restriction enzyme cleavage sites of pNEPL is shown in FIG. (3) This plasmid was transferred by conjugal transfer to the wild strain AMB-
Introduced into No. 1 to produce a junction transmitter. The conjugative transfer medium was cultured and proliferated, cells were collected and disrupted, and magnetic fine particles were collected using a magnet. The luciferase activity of the magnetic fine particles was measured for luminescence with a luminometer using a Piccagene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink). Table 2 shows the results.
【００４８】[0048]
【表２】 （単位：キロカウント／μｇタンパク質） 次に、磁気微粒子上におけるｍａｇＡタンパク質のＣ末
端及びＮ末端の露出方向を確認するために、ｍａｇＡ遺
伝子の３’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐ
ＫＭＬを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子と、ｍａ
ｇＡ遺伝子の５’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラス
ミドｐＮＥＬＭを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子
において、抗ルシフェラーゼＩｇＧ及びアルカリホスフ
ァターゼ標識抗ウサギＩｇＧを用いてイムノアッセイを
行った。検出はアルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａ）との反応による発光をルミノメーターで
測定した。結果を表３に示す。[Table 2] (Unit: kilocount / μg protein) Next, in order to confirm the exposure direction of the C-terminal and N-terminal of the magA protein on the magnetic fine particles, the plasmid p in which the luc gene was linked to the 3'end of the magA gene was confirmed.
Magnetic particles derived from a conjugation transmitter that holds KML;
An immunoassay was carried out using anti-luciferase IgG and alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG on magnetic microparticles derived from a conjugation carrier carrying a plasmid pNELM having a luc gene bound to the 5'end of the gA gene. Detection is alkaline phosphatase and AMPPD
(Boehringer Mannheim Bioc
The luminescence from the reaction with hemica) was measured with a luminometer. The results are shown in Table 3.
【００４９】[0049]
【表３】 （単位：キロカウント／ｍｇタンパク質） この実験により、ｍａｇＡタンパク質のＮ末端及びＣ末
端は磁気微粒子を被覆する有機膜の外側に露出している
ことが明らかとなった。従って機能性タンパク質の性質
に応じてｍａｇＡタンパク質のＮ末端に融合した融合タ
ンパク質として生成させるかＣ末端に融合した融合タン
パク質として生成させるかを選択することができる。例５ 蛍ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を磁気微粒子
上に同時発現させるため、ｌｕｃ−ｍａｇＡ−ｃａｔ融
合ＤＮＡ配列を含む遺伝子であるプラスミドｐＮＥＬＭ
Ｃを図１０に示す方法で作製した。[Table 3] (Unit: kilocount / mg protein) This experiment revealed that the N-terminal and C-terminal of the magA protein are exposed outside the organic film that coats the magnetic fine particles. Therefore, depending on the properties of the functional protein, it is possible to select whether to generate the fusion protein fused to the N-terminus or the C-terminus of the magA protein. Example 5 Plasmid pNELM, which is a gene containing a luc-magA-cat fusion DNA sequence for co-expressing the firefly luciferase gene and the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene on magnetic microparticles.
C was produced by the method shown in FIG.
【００５０】すなわち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−
１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサ
イクリン耐性遺伝子をもつプラスミドｐＲＫ４１５を用
いた。このｐＲＫ４１５のＮｃｏΙ切断部位とＥｃｏＮ
Ι切断部位を平滑末端化処理により欠損させ、プラスミ
ドｐＲＫ４１５ＮＥを生成した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳ
ａｃＩで切断し、ｍａｇＡプロモーター−ｌｕｃ融合遺
伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを作製した。That is, the vector contains the magnetic bacterium AMB-.
The plasmid pRK415 having a tetracycline resistance gene, which enables gene transfer by conjugal transfer to the plasmid No. 1, was used. The NcoI cleavage site of this pRK415 and EcoN
The Ι cleavage site was deleted by blunting treatment to generate plasmid pRK415NE. pRK415NE is S
It was cleaved with acI to prepare a plasmid pNEPL incorporating the magA promoter-luc fusion gene.
【００５１】次に、ｍａｇＡ遺伝子を保持するプラスミ
ドｐＵＭ５ＡにＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライ
マーを用い、ＰＣＲによりｍａｇＡ遺伝子を増幅させＳ
ｃａＩで切断し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプ
ラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭを
作製した。Next, the plasmid pUM5A carrying the magA gene was amplified by PCR using the primers designed with the ScaI cleavage site to amplify the magA gene by PCR.
It was cut with caI, ligated with plasmid pNEPL which had been cut with EcoNI and then blunt-ended to prepare plasmid pNELM.
【００５２】次に、ｃａｔ遺伝子に該遺伝子のＳＤ配列
を削除しＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを
用い、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子を増幅させた。これを
ＤｒａＩＩＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥ
ＬＭと接続し、プラスミドｐＮＥＬＭＣを作製した。ｐ
ＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位地図を図１１に示す。こ
のプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導
入し、接合伝達体を生成した。接合伝達体を培養して増
殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁石で磁気微粒子を
回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピ
ッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメ
ーターで発光量を測定したところｐＮＥＬＭと同等のル
シフェラーゼ活性を示した。Next, the cat gene was amplified by PCR using a primer in which the SD sequence of the gene was deleted and the ScaI cleavage site was designed. This was cleaved with DraIII and blunt-ended, resulting in plasmid pNE
It was connected to LM to prepare plasmid pNELMC. p
A map of NELMC restriction enzyme cleavage sites is shown in FIG. This plasmid was introduced into the wild-type strain AMB-1 by conjugation transfer to generate a conjugation transfer agent. The conjugative transfer medium was cultured and proliferated, cells were collected and disrupted, and magnetic fine particles were collected with a magnet. The luciferase activity of the magnetic fine particles was measured by a luminometer using a Piccagene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink Co., Ltd.), and the luciferase activity equivalent to that of pNELM was shown.
【００５３】次に、この磁気微粒子のＣＡＴアッセイを
行った結果、ＣＡＴ活性が検出された。ＣＡＴアッセイ
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
とクロラムフェニコールとの反応によるクロラムフェニ
コールアセチル化体を薄層クロマトグラフィーにより検
出することで行った。この結果、ｍａｇＡ遺伝子タンパ
ク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、該タ
ンパク質を単独で接続したときと同等の活性を示した。
この実験より、ｍａｇＡ遺伝子タンパク質の両末端に機
能の異なるタンパク質をコードする遺伝子を接続した融
合遺伝子を構築することで、磁気微粒子上に同時発現す
ることが可能になり、これより多数の機能を有する磁気
微粒子を生産することができた。Next, as a result of performing a CAT assay on the magnetic fine particles, CAT activity was detected. The CAT assay was performed by detecting chloramphenicol acetylated product by the reaction of chloramphenicol acetyltransferase and chloramphenicol by thin layer chromatography. As a result, each of the proteins connected to both ends of the magA gene protein exhibited the same activity as when the proteins were connected alone.
From this experiment, by constructing a fusion gene in which genes encoding proteins having different functions are connected to both ends of the magA gene protein, it becomes possible to co-express on a magnetic fine particle, which has more functions than this. It was possible to produce magnetic particles.
【００５４】[0054]
【発明の効果】本発明によれば、固定化等の処理を行う
必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内
に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その
他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状
態で安定して得ることができる。有用タンパク質が機能
性タンパク質である場合には、磁気微粒子に固定化され
た機能性タンパク質を磁気的に制御することができるの
で、所要の局所へ効率的にその機能を発揮させることが
できる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, it is not necessary to carry out a treatment such as immobilization and the like, and the transformed magnetic bacteria are cultured, and the magnetic fine particles produced in the cells are separated. The protein can be stably obtained in a state of being bound to the organic film of the magnetic fine particles. When the useful protein is a functional protein, the functional protein immobilized on the magnetic fine particles can be magnetically controlled, so that the function can be efficiently exerted in a required local area.
【００５５】また、所要のタンパク質をコードする遺伝
子を本発明のプラスミドに導入し、磁性細菌を形質転換
することでどのようなタンパク質も磁気微粒子上に生成
させることができる。Any protein can be produced on magnetic particles by introducing a gene encoding a required protein into the plasmid of the present invention and transforming a magnetic bacterium.
【００５６】高価な酵素、抗体等のタンパク質を用意す
る必要はなく、同じ菌株を維持し培養するだけで所要の
タンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することが
でき、製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツ
キがなく、しかも低コスト化のメリットも大きい。しか
も、こうして得られる磁気微粒子は、常に同一活性を有
するタンパク質を同一の量で含有するものである。It is not necessary to prepare proteins such as expensive enzymes and antibodies, and the required protein-bonded magnetic fine particles can be semipermanently produced only by maintaining and culturing the same strain. There is no variation in activity, and there are great advantages in cost reduction. Moreover, the magnetic fine particles thus obtained always contain the proteins having the same activity in the same amount.
【００５７】さらに、タンパク質を磁気微粒子上に生産
するため目的とするタンパク質を磁気的に短時間で分離
回収でき、効率的な分離精製が出来る。Furthermore, since the protein is produced on the magnetic fine particles, the target protein can be magnetically separated and recovered in a short time, and efficient separation and purification can be performed.
【００５８】[0058]
配列番号：１ 配列の長さ：1302 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス起源 生物名：マグネトスピルラム属（ Magnetospirullum ) 株名：AMB-1 （微工研菌寄第13282 号） 配列： ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 GGA ATT 1302 配列番号：２ 配列の長さ：434 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 Met Glu Leu His His Pro Glu Leu Thr Tyr Ala Ala Ile Val Ala Leu 5 10 15 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 Ala Ala Val Leu Cys Gly Gly Met Met Thr Arg Leu Lys Gln Pro Ala 20 25 30 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 Val Val Gly Tyr Ile Leu Ala Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Gly Phe 35 40 45 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 Gly Leu Val Ser Asn Arg Asp Ala Val Ala Thr Leu Ala Glu Phe Gly 50 55 60 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240 Val Leu Met Leu Leu Phe Val Ile Gly Met Lys Leu Asp Ile Ile Arg 65 70 75 80 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 Phe Leu Glu Val Trp Lys Thr Ala Ile Phe Thr Thr Val Leu Gln Ile 85 90 95 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 Ala Gly Ser Val Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Arg His Gly Leu Gly 100 105 110 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384 Trp Ser Leu Gly Leu Ala Val Val Leu Gly Cys Ala Val Ala Ser Ser 115 120 125 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 Thr Ala Val Val Ile Lys Val Leu Glu Ser Ser Asp Glu Leu Asp Thr 130 135 140 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480 Pro Val Gly Arg Thr Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ala Gln Asp Met Ala 145 150 155 160 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 Val Val Pro Met Met Leu Val Leu Glu Ser Phe Glu Thr Lys Ala Leu 165 170 175 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 Leu Pro Ala Asp Met Ala Arg Val Val Leu Ser Val Leu Phe Leu Val 180 185 190 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624 Leu Leu Phe Trp Trp Leu Ser Lys Arg Arg Ile Asp Leu Pro Ile Thr 195 200 205 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 Ala Arg Leu Ser Arg Asp Ser Asp Leu Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala 210 215 220 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 Trp Cys Phe Gly Thr Ala Ala Ile Ser Gly Val Leu Asp Leu Ser Pro 225 230 235 240 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768 Ala Tyr Gly Ala Phe Leu Gly Gly Val Val Leu Gly Asn Ser Ala Gln 245 250 255 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 Arg Asp Met Leu Leu Lys Arg Ala Gln Pro Ile Gly Ser Val Leu Leu 260 265 270 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 Met Val Phe Phe Leu Ser Ile Gly Leu Leu Leu Asp Phe Lys Phe Ile 275 280 285 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912 Trp Lys Asn Leu Gly Thr Val Leu Thr Leu Leu Ala Met Val Thr Leu 290 295 300 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 Phe Lys Thr Ala Leu Asn Val Thr Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gln Asp 305 310 315 320 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 Trp Pro Ser Ala Phe Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Gln Ile Gly Glu 325 330 335 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 Phe Ser Phe Leu Leu Ala Glu Thr Gly Lys Ala Val Lys Leu Ile Ser 340 345 350 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 Ala Gln Glu Thr Lys Leu Val Val Ala Val Thr Val Leu Ser Leu Val 355 360 365 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 Leu Ser Pro Phe Trp Leu Phe Thr Met Arg Arg Met His Arg Val Ala 370 375 380 GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 Ala Val His Val His Ser Phe Arg Asp Leu Val Thr Arg Leu Tyr Gly 385 390 395 400 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 Asp Glu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Thr Ala Arg Arg Ala Arg Val Leu 405 410 415 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 Val Arg Arg Gly Ser Trp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Gly Pro Gly Ser 420 425 430 GGA ATT Gly Ile 配列番号：３ 配列の長さ：1302 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATG GAR YTN CAY CAY CCN GAR YTN ACN TAY GCN GCN ATH GTN GCN YTN 48 GCN GCN GTN YTN TGY GGN GGN ATG ATG ACN MGN YTN AAR CAR CCN GCN 96 GTN GTN GGN TAY ATH YTN GCN GGN GTN GTN YTN GGN CCN WSN GGN TTY 144 GGN YTN GTN WSN AAY MGN GAY GCN GTN GCN ACN YTN GCN GAR TTY GGN 192 GTN YTN ATG YTN YTN TTY GTN ATH GGN ATG AAR YTN GAY ATH ATH MGN 240 TTY YTN GAR GTN TGG AAR ACN GCN ATH TTY ACN ACN GTN YTN CAR ATH 288 GCN GGN WSN GTN GGN ACN GCN YTN YTN YTN MGN CAY GGN YTN GGN TGG 336 WSN YTN GGN YTN GCN GTN GTN YTN GGN TGY GCN GTN GCN GTN WSN WSN 384 ACN GCN GTN GTN ATH AAR GTN YTN GAR WSN WSN GAY GAR YTN GAY ACN 432 CCN GTN GGN MGN ACN ACN YTN GGN ATH YTN ATH GCN CAR GAY ATG GCN 480 GTN GTN CCN ATG ATG YTN GTN YTN GAR WSN TTY GAR ACN AAR GCN YTN 528 YTN CCN GCN GAY ATG GCN MGN GTN GTN YTN WSN GTN YTN TTY YTN GTN 576 YTN YTN TTY TGG TGG YTN WSN AAR MGN MGN ATH GAY YTN CCN ATH ACN 624 GCN MGN YTN WSN MGN GAY WSN GAY YTN GCN ACN YTN WSN ACN YTN GCN 672 TGG TGY TTY GGN ACN GCN GCN ATH WSN GGN GTN YTN GAY YTN WSN CCN 720 GCN TAY GGN GCN TTY YTN GGN GGN GTN GTN YTN GGN AAY WSN GCN CAR 768 MGN GAY ATG YTN YTN AAR MGN GCN CAR CCN ATH GGN WSN GTN YTN YTN 816 ATG GTN TTY TTY YTN WSN ATH GGN YTN YTN YTN GAY TTY AAR TTY ATH 864 TGG AAR AAY YTN GGN ACN GTN YTN ACN YTN YTN GCN ATG GTN ACN YTN 912 TTY AAR ACN GCN YTN AAY GTN ACN GCN YTN MGN YTN GCN MGN CAR GAY 960 TGG CCN WSN GCN TTY YTN GCN GGN GTN GCN YTN GCN CAR ATH GGN GAR 1008 TTY WSN TTY YTN YTN GCN GAR ACN GGN AAR GCN GTN AAR YTN ATH WSN 1056 GCN CAR GAR ACN AAR YTN GTN GTN GCN GTN ACN GTN YTN WSN YTN GTN 1104 YTN WSN CCN TTY TGG YTN TTY ACN ATG MGN MGN ATG CAY MGN GTN GCN 1152 GCN GTN CAY GTN CAY WSN TTY MGN GAY YTN GTN ACN MGN YTN TAY GGN 1200 GAY GAR GCN MGN GCN TTY GCN MGN ACN GCN MGN MGN GCN MGN GTN YTN 1248 GTN MGN MGN GGN WSN TGG MGN GAY GAY CCN AAY GCN GGN CCN GGN WSN 1296 GGN ATHSEQ ID NO: 1 Sequence length: 1302 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Hypothetical sequence: No Antisense origin Organism name: Magnetospirrum ( Magnetospirullum ) Strain name: AMB-1 (Microtechnology Research Institute, No. 13282) Sequence: ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG ATG CTG GAC ATC ATC CGC 240 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGC GTG GCG GTG TCG TCC 384 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG G CG 480 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG ATC ACC 624 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG ATG CTG GTG TCC GCC CAG 768 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC GACC CTG CTG CCC ACC CTG CTG ATG GTG ACC CTG 912 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG GACC GGC AAG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 GCG GTG CAT GTC CAT TCG CTC CGC GAT TG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 GGA ATT 1302 SEQ ID NO: 2 sequence Length: 434 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: ATG GAA CTG CAT CAT CCC GAA CTG ACC TAT GCC GCC ATC GTC GCC CTG 48 Met Glu Leu His His Pro Glu Leu Thr Tyr Ala Ala Ile Val Ala Leu 5 10 15 GCC GCC GTG CTG TGC GGC GGG ATG ATG ACG CGC CTG AAG CAG CCG GCC 96 Ala Ala Val Leu Cys Gly Gly Met Met Thr Arg Leu Lys Gln Pro Ala 20 25 30 GTC GTC GGC TAC ATC CTG GCG GGG GTG GTG CTG GGA CCC AGC GGC TTC 144 Val Val Gly Tyr Ile Leu Ala Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Gly Phe 35 40 45 GGG CTG GTG AGC AAC CGC GAC GCC GTG GCC ACC CTG GCC GAG TTC GGC 192 Gly Leu Val Ser Asn Arg Asp Ala Val Ala Thr Leu Ala Glu Phe Gly 50 55 60 GTG CTG ATG CTG CTG TTC GTC ATC GGC ATG AAG CTG GAC ATC ATC CGC 240 Val Leu Met Leu Leu Phe Val Ile Gly Met Lys Leu As p Ile Ile Arg 65 70 75 80 TTT CTC GAA GTG TGG AAG ACG GCC ATC TTC ACC ACG GTT CTG CAG ATC 288 Phe Leu Glu Val Trp Lys Thr Ala Ile Phe Thr Thr Val Val Leu Gln Ile 85 90 95 GCC GGC AGC GTG GGC ACG GCC CTG CTG CTG CGT CAC GGC CTG GGC TGG 336 Ala Gly Ser Val Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Arg His Gly Leu Gly 100 105 110 AGC CTG GGG CTG GCG GTG GTG CTG GGC TGT GCC GTG GCG GTG TCG TCC 384 Trp Ser Leu Gly Leu Ala Val Val Leu Gly Cys Ala Val Ala Ser Ser 115 120 125 ACC GCC GTA GTG ATC AAG GTG CTG GAA TCC TCG GAC GAG CTG GAC ACG 432 Thr Ala Val Val Ile Lys Val Leu Glu Ser Ser Asp Glu Leu Asp Thr 130 135 140 CCG GTC GGC CGC ACC ACC CTT GGC ATC CTG ATC GCC CAG GAC ATG GCG 480 Pro Val Gly Arg Thr Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ala Gln Asp Met Ala 145 150 155 160 GTG GTG CCC ATG ATG CTG GTG CTG GAA TCC TTC GAG ACC AAG GCG CTG 528 Val Val Pro Met Met Leu Val Leu Glu Ser Phe Glu Thr Lys Ala Leu 165 170 175 CTG CCC GCC GAC ATG GCC CGG GTG GTG CTG TCG GTG CTG TTC CTG GTG 576 Leu Pro Ala Asp Met Ala Arg Val Val Leu S er Val Leu Phe Leu Val 180 185 190 CTG CTG TTC TGG TGG CTG TCC AAG CGC CGC ATC GAC CTG CCG ATC ACC 624 Leu Leu Phe Trp Trp Leu Ser Lys Arg Arg Ile Asp Leu Pro Ile Thr 195 200 205 GCC CGG CTT TCC CGC GAT TCT GAC CTT GCC ACC CTG TCG ACC CTG GCC 672 Ala Arg Leu Ser Arg Asp Ser Asp Leu Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala 210 215 220 TGG TGT TTC GGC ACC GCC GCC ATC TCC GGC GTG CTG GAC TTG TCG CCG 720 Trp Cys Phe Gly Thr Ala Ala Ile Ser Gly Val Leu Asp Leu Ser Pro 225 230 235 240 GCC TAT GGC GCC TTC CTG GGC GGC GTG GTG CTG GGC AAT TCC GCC CAG 768 Ala Tyr Gly Ala Phe Leu Gly Gly Val Val Leu Gly Asn Ser Ala Gln 245 250 255 CGC GAC ATG CTG TTG AAG CGT GCC CAG CCC ATC GGC AGC GTG CTG CTG 816 Arg Asp Met Leu Leu Lys Arg Ala Gln Pro Ile Gly Ser Val Leu Leu 260 265 270 ATG GTG TTC TTC CTG TCC ATC GGG CTG CTG CTC GAC TTC AAG TTC ATC 864 Met Val Phe Phe Leu Ser Ile Gly Leu Leu Leu Asp Phe Lys Phe Ile 275 280 285 TGG AAG AAT CTG GGC ACC GTT CTC ACC CTG CTG GCC ATG GTG ACC CTG 912 Trp Lys Asn Leu Gly Thr Val L eu Thr Leu Leu Ala Met Val Thr Leu 290 295 300 TTC AAG ACG GCG CTG AAC GTC ACG GCG CTG CGC CTG GCG CGG CAG GAC 960 Phe Lys Thr Ala Leu Asn Val Thr Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gln Asp 305 310 315 320 TGG CCC AGC GCC TTC CTG GCC GGC GTG GCC CTG GCC CAG ATC GGC GAG 1008 Trp Pro Ser Ala Phe Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Gln Ile Gly Glu 325 330 335 TTC TCG TTC CTG CTG GCC GAG ACC GGC AAG GCG GTC AAG CTG ATC AGC 1056 Phe Ser Phe Leu Leu Ala Glu Thr Gly Lys Ala Val Lys Leu Ile Ser 340 345 350 GCC CAG GAG ACC AAG CTG GTG GTG GCG GTC ACC GTG CTG TCC CTG GTG 1104 Ala Gln Glu Thr Lys Leu Val Val Ala Val Thr Val Leu Ser Leu Val 355 360 365 CTG TCG CCG TTC TGG CTG TTC ACC ATG CGG CGC ATG CAC CGG GTG GCG 1152 Leu Ser Pro Phe Trp Leu Phe Thr Met Arg Arg Met His Arg Val Ala 370 375 380 GCG GTG CAT GTC CAT TCG TTC CGC GAT CTG GTC ACG CGG CTG TAT GGC 1200 Ala Val His Val His Ser Phe Arg Asp Leu Val Thr Arg Leu Tyr Gly 385 390 395 395 400 GAC GAG GCC CGC GCT TTC GCC CGC ACC GCG CGG CGG GCC CGT GTG CTG 1248 Asp Glu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Thr Ala Arg Arg Ala Arg Val Leu 405 410 415 GTG CGG CGT GGT TCC TGG AGG GAT GAC CCC AAT GCC GGA CCT GGC TCT 1296 Val Arg Arg Gly Ser Trp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Gly Pro Gly Ser 420 425 430 GGA ATT Gly Ile SEQ ID NO: 3 Sequence length: 1302 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Sequence: ATG GAR YTN CAY CAY CCN GAR YTN ACN TAY GCN GCN ATH GTN GCN YTN 48 GCN GCN GTN YTN TGY GGN GGN ATG ATG ACN MGN YTN AAR CAR CCN GCN 96 GTN GTN GGN TAY ATH YTN GCN GGN GTN GTN YTN GGN CCN WSN GGN TTY 144 GGN YTN GTN WSN AAY MGN GA GCN GTN GCN ACN YTN GCN GAR TTY GGN 192 GTN YTN ATG YTN YTN TTY GTN ATH GGN ATG AAR YTN GAY ATH ATH MGN 240 TTY YTN GAR GTN TGG AAR ACN GCN ATH TTY ACN ACN GTN YTN CAR ATH 288 GCN GGN WSN GTN GGN AC GCN YTN YTN YTN MGN CAY GGN YTN GGN TGG 336 WSN YTN GGN YTN GCN GTN GTN YTN GGN TGY GCN GTN GCN GTN WSN WSN 384 ACN GCN GTN GTN ATH AAR GTN YTN GAR WSN WSN GAY GAR YTN GAY ACN 432 CCN GT N GGN MGN ACN ACN YTN GGN ATH YTN ATH GCN CAR GAY ATG GCN 480 GTN GTN CCN ATG ATG YTN GTN YTN GAR WSN TTY GAR ACN AAR GCN YTN 528 YTN CCN GCN GAY ATG GCN MGN GTN GTN YTN WSN GTN YTN TTY YTN GTN YTN YTN TTY TGG TGG YTN WSN AAR MGN MGN ATH GAY YTN CCN ATH ACN 624 GCN MGN YTN WSN MGN GAY WSN GAY YTN GCN ACN YTN WSN ACN YTN GCN 672 TGG TGY TTY GGN ACN GCN GCN ATH WSN GGN GTN WTN GAY YTN GAY YTN GAY 720 GCN TAY GGN GCN TTY YTN GGN GGN GTN GTN YTN GGN AAY WSN GCN CAR 768 MGN GAY ATG YTN YTN AAR MGN GCN CAR CCN ATH GGN WSN GTN YTN YTN 816 ATG GTN TTY TTY YTN WSN ATH GGN YTN YTN YTN GATY TTY ATY ATH 864 TGG AAR AAY YTN GGN ACN GTN YTN ACN YTN YTN GCN ATG GTN ACN YTN 912 TTY AAR ACN GCN YTN AAY GTN ACN GCN YTN MGN YTN GCN MGN CAR GAY 960 TGG CCN WSN GCN TTY YTN GCN GGN GTN GCN YTN GCN CAR GGN GAR 1008 TTY WSN TTY YTN YTN GCN GAR ACN GGN AAR GCN GTN AAR YTN ATH WSN 1056 GCN CAR GAR ACN AAR YTN GTN GTN GCN GTN ACN GTN YTN WSN YTN GTN 1104 YTN WSN CCN TTY TGG YTN TTY ACN ATG MGN MGN AGN CAGN MGN GTN GCN 1152 GCN GTN CAY GTN CAY WSN TTY MGN GAY YTN GTN ACN MGN YTN TAY GGN 1200 GAY GAR GCN MGN GCN TTY GCN MGN ACN GCN MGN MGN GCN MGN GTN YTN 1248 GTN MGN MGN GGN WSN TGG MGN GAY GACN CCN AA GGN CCN GGN WSN 1296 GGN ATH
【図１】例１で調製したプラスミドｐＫＰＬ及びｐＫＭ
Ｌの調製方法の説明図である。FIG. 1 Plasmids pKPL and pKM prepared in Example 1
It is explanatory drawing of the preparation method of L.
【図２】例１で調製したプラスミドｐＵＭ５Ａの調製方
法の説明図である。FIG. 2 is an explanatory view of a method for preparing the plasmid pUM5A prepared in Example 1.
【図３】プラスミドｐＫＭＬの制限酵素切断部位地図で
ある。FIG. 3 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKML.
【図４】例２で調製したプラスミドｐＫＭＧの調製方法
の説明図である。FIG. 4 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pKMG prepared in Example 2.
【図５】プラスミドｐＫＭＧの制限酵素切断部位地図で
ある。FIG. 5 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKMG.
【図６】例３で調製したプラスミドｐＫＭＡの調製方法
の説明図である。FIG. 6 is an explanatory diagram of a method for preparing the plasmid pKMA prepared in Example 3.
【図７】プラスミドｐＫＭＡの制限酵素切断部位地図で
ある。FIG. 7 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pKMA.
【図８】例４で調製したｐＮＥＬＭの調製方法の説明図
である。FIG. 8 is an explanatory diagram of a method for preparing pNELM prepared in Example 4.
【図９】プラスミドｐＮＥＬＭの制限酵素切断部位地図
である。FIG. 9 is a restriction enzyme cleavage site map of plasmid pNELM.
【図１０】例５で調製したｐＮＥＬＭＣの調製方法の説
明図である。10 is an explanatory diagram of a method for preparing pNELMC prepared in Example 5. FIG.
【図１１】プラスミドｐＮＥＬＭＣの制限酵素切断部位
地図である。FIG. 11 is a map of restriction enzyme cleavage sites of plasmid pNELMC.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 // Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12P 21/02 C12P 21/02 C G01N 33/553 G01N 33/553 // G01N 33/533 G01N 33 / 533 (C12N 1/21 C12R 1:01) (C12P 21/02 C12R 1:01)
Claims (13)
磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質をコ
ードし、配列表に記載の配列番号１で示されるＤＮＡ配
列からなる、単離、精製されたｍａｇＡ遺伝子。1. An isolation, comprising a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, which encodes a protein bound to an organic membrane that coats magnetic fine particles produced in the cells of the magnetic bacterium AMB-1. Purified magA gene.
磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したタンパク質であ
って、配列表に記載の配列番号２で示されるアミノ酸配
列からなる、単離、精製されたｍａｇＡタンパク質。2. A protein which is a protein bound to an organic film which coats magnetic fine particles produced in the bacterial cells of the magnetic bacterium AMB-1 and which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. Purified magA protein.
磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタンパ
ク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載の配
列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）をコー
ドする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇＡ遺
伝子断片。3. A hydrophobic region in the amino acid sequence of the magA protein bound to an organic film that coats the magnetic fine particles produced in the bacterial cells of the magnetic bacterium AMB-1 (7th to 7th SEQ ID No. 2 in the Sequence Listing). A magA gene fragment containing a DNA sequence represented by a nucleotide sequence encoding a (380 amino acid residue region).
する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したｍａｇＡタ
ンパク質のアミノ酸配列中の疎水性領域（配列表に記載
の配列番号２の第７〜第３８０アミノ酸残基の領域）を
コードする塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含むｍａｇ
Ａ遺伝子断片と、(b) 該ｍａｇＡ遺伝子断片の一方又は
両方の末端に融合された、一又は二の有用タンパク質を
コードする一又は二のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮ
Ａ配列。4. (a) A hydrophobic region in the amino acid sequence of the magA protein bound to the organic membrane that coats the magnetic fine particles produced in the intracellular body of the magnetic bacterium AMB-1 (the sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing). Mag containing the DNA sequence represented by the nucleotide sequence encoding the 7th to 380th amino acid residue region)
A fused DN comprising an A gene fragment and (b) one or two DNA sequences encoding one or two useful proteins fused to one or both ends of the magA gene fragment.
A array.
性タンパク質である、請求項4 に記載の融合ＤＮＡ配
列。5. The fusion DNA sequence according to claim 4, wherein the one or two useful proteins is a functional protein.
する組み換えプラスミド。6. A recombinant plasmid containing the fusion DNA sequence of claim 4.
えプラスミドが導入されてなる、形質転換磁性細菌。7. A transformed magnetic bacterium, which is obtained by introducing the recombinant plasmid according to claim 6 into a host magnetic bacterium.
etospirillum種又はDesulfovibrio 種の微生物である、
形質転換磁性細菌。8. The host magnetic bacterium according to claim 7 is Magn
a microorganism of the species etospirillum or Desulfovibrio,
Transformed magnetic bacteria.
覆している有機膜に結合している、請求項4 に記載の融
合ＤＮＡ配列でコードされた一又は二の機能性タンパク
質を含有する融合タンパク質とを有する、機能性タンパ
ク質結合磁気微粒子。9. A magnetic fine particle, and one or two functional proteins encoded by the fusion DNA sequence according to claim 4 bound to an organic film coating the surface of the magnetic fine particle. A functional protein-bonded magnetic fine particle having a fusion protein.
微粒子であって、前記の一又は二の機能性タンパク質が
生理活性を有するものである磁気微粒子。10. The functional protein-bound magnetic fine particles according to claim 9, wherein the one or two functional proteins have physiological activity.
の生理活性を有するタンパク質が、免疫関連タンパク
質、結合能を有するタンパク質、又は酵素である磁気微
粒子。11. The magnetic fine particle according to claim 10, wherein the protein having physiological activity is an immune-related protein, a protein having binding ability, or an enzyme.
むプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養する
ことにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、有用タン
パク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する
有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることから
なる、有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法。12. A magnetic bacterium transformed with the plasmid containing the fusion DNA sequence according to claim 4 is cultured to express the fusion DNA sequence, and the fusion protein containing the useful protein is coated with magnetic fine particles. A method for producing useful protein-bonded magnetic fine particles, which is produced in the cells in a state of being bound to the organic film.
質である、請求項12に記載の製造方法。13. The production method according to claim 12, wherein the useful protein is a functional protein.
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|---|---|---|---|---|
| EP0834560A1 (en) * | 1996-03-27 | 1998-04-08 | TDK Corporation | Fine magnetic particles containing useful proteins bound thereto, process for producing the same, and use thereof |
-
1995
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| EP0834560A1 (en) * | 1996-03-27 | 1998-04-08 | TDK Corporation | Fine magnetic particles containing useful proteins bound thereto, process for producing the same, and use thereof |
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