JPH08226919A - Immunological measurement method for n-peptide sandwich - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To quickly and easily measure N-peptide in blood or its precursor with high accuracy by adding monoclonal antibodies recognizing N-peptide and labeled monoclonal antibodies recognizing N-peptide to a sample and incubating. CONSTITUTION: An animal such as a mouse or rat is immunized by antibodies using peptide fragments of an arbitrary part of N-peptide, hybridoma for yielding monoclonal antibodies recognizing N-peptide is obtained by blending a spleen cell originated preferably from an immunized mouse and a myeloma cell originated from a mammal and cultivated preferably in vivo to obtain monoclonal antibodies. After the antibody is fixed to a solid phase and incubated together with a sample containing an antigen, an antibody labeled by an enzyme or a fluorescent material is added. The obtained mixture is incubated for detecting a produced composite comprising the labeled antigen and antibody.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、心不全および慢性
腎不全の診断に、臨床上有用なＮ−ペプチドを迅速かつ
簡便に測定する方法、該方法に用いるモノクローナル抗
体、および該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for rapidly and conveniently measuring a clinically useful N-peptide for the diagnosis of heart failure and chronic renal failure, a monoclonal antibody used in the method, and a monoclonal antibody produced by the method. Regarding hybridoma.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド(ｈ
ＡＮＰ)は、126個のアミノ酸からなるペプチドであるｈ
ＡＮＰ(126)(γ-ｈＡＮＰ)として生合成され、主として
心房内顆粒に蓄積され、心房圧刺激に応じて分泌され
る。その際、γ−ｈＡＮＰはｈＡＮＰ(1-98)(Ｎ−ペプ
チド)とｈＡＮＰ(99-126)(α-ｈＡＮＰ)とに分解されて
同時に血液中に放出される。2. Description of the Related Art Human atrial natriuretic peptide (h
ANP) is a peptide consisting of 126 amino acids h
It is biosynthesized as ANP (126) (γ-hANP), is mainly accumulated in atrial granules, and is secreted in response to atrial pressure stimulation. At that time, γ-hANP is decomposed into hANP (1-98) (N-peptide) and hANP (99-126) (α-hANP) and simultaneously released into the blood.

【０００３】血中のα-ｈＡＮＰ濃度は心不全や慢性腎
不全のマーカーになり、その免疫学的測定法はすでに診
断に応用されている。しかし、非常に長い反応時間(３
日間)を要すること、および、α-ｈＡＮＰが血中で不安
定であるため試料の採取または保存の方法によっては免
疫学的活性が著しく低下することが欠点であった(Tsuj
i,T.ら、Clin. Chim. Acta, 225, 171-177(1994))。こ
れに対して、α-ｈＡＮＰよりも安定でクリアランスが
低いＮ−ペプチドは、循環血液中での濃度が高いため、
このＮ−ペプチドを用いる測定法が開発されている。The blood α-hANP concentration serves as a marker for heart failure and chronic renal failure, and its immunological assay method has already been applied to diagnosis. However, very long reaction time (3
However, the immunological activity of α-hANP is unstable in the blood and the immunological activity is significantly reduced depending on the method of sample collection or storage (Tsuj
i, T. et al., Clin. Chim. Acta, 225 , 171-177 (1994)). On the other hand, N-peptide, which is more stable and has lower clearance than α-hANP, has a high concentration in circulating blood,
Assays using this N-peptide have been developed.

【０００４】上記γ−ｈＡＮＰのＮ末端側のペプチドで
あるＮ−ペプチドの測定が心不全および慢性腎不全の診
断に有用であることは、以前より報告されてきた(Sunds
fjoed,J.A.ら、J. Clin. Endocrionol. Metab.,66, 605
-610(1988)；Ito,H.ら、J. Clin. Endocrinol.,67(3),
429-437(1988)；Burckleyら、Clin. Sci., 77, 573-579
(1989)；および、Burckleyら、Clin. Chim. Acta, 191,
1-14(1990))。現在までに報告されたＮ−ペプチドの免
疫学的測定法はすべて、１種類の抗体を用いる競合放射
免疫学的測定法(競合ＲＩＡ法)であるため、測定に長時
間(３〜４日間)および限られた温度条件(約４℃)、また
は血漿の前処理という煩雑な操作(Sep-pak C-18抽出)を
必要とする(Sundsfjoed,J.A.ら、J. Clin. Endocriono
l. Metab., 66, 605-610(1988)、およびBurckleyら、Cl
in. Chim. Acta, 191, 1-14(1990))。さらに、いずれの
方法も精度が低く、再現性が悪いという問題点がある。
従って、Ｎ−ペプチドを用いる迅速かつ簡便な測定法の
開発が期待されていた。It has been previously reported that the measurement of N-peptide, which is a peptide on the N-terminal side of γ-hANP, is useful for diagnosis of heart failure and chronic renal failure (Sunds.
fjoed, JA et al., J. Clin. Endocrionol. Metab., 66 , 605
-610 (1988); Ito, H. et al., J. Clin. Endocrinol., 67 (3),
429-437 (1988); Burckley et al., Clin. Sci., 77 , 573-579.
(1989); and Burckley et al., Clin. Chim. Acta, 191 ,.
1-14 (1990)). All N-peptide immunoassays reported to date are competitive radioimmunoassays (competitive RIA method) that use one type of antibody, so the measurement takes a long time (3 to 4 days). And limited temperature conditions (about 4 ° C.) or complicated procedures of plasma pretreatment (Sep-pak C-18 extraction) are required (Sundsfjoed, JA et al., J. Clin. Endocriono
l. Metab., 66 , 605-610 (1988), and Burckley et al., Cl.
in. Chim. Acta, 191 , 1-14 (1990)). Furthermore, both methods have problems of low accuracy and poor reproducibility.
Therefore, development of a rapid and simple assay method using N-peptide has been expected.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血中
のＮ−ペプチドおよびその前駆体の濃度の測定を迅速か
つ簡便に、そして精度良く行う方法を提供することであ
る。本発明の他の目的は、該方法に用いるモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ、および該モノクローナル抗体を含むＮ−ペプチドま
たはその前駆体の免疫学的測定用キットを提供すること
である。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for measuring the concentration of N-peptide and its precursor in blood rapidly, simply and accurately. Another object of the present invention is to provide a kit for immunological measurement of a monoclonal antibody used in the method, a hybridoma producing the monoclonal antibody, and an N-peptide containing the monoclonal antibody or a precursor thereof.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｎ−ペプ
チドおよびその前駆体を迅速かつ簡便に、そして精度良
く測定するために種々の検討を行った。その結果、Ｎ−
ペプチドを認識するモノクローナル抗体を作製し、この
モノクローナル抗体と、Ｎ−ペプチドの異なるエピトー
プを認識する他のモノクローナル抗体とを組み合わせて
用いるサンドイッチ免疫学的測定法を構築し、本発明を
完成するに至った。[Means for Solving the Problems] The present inventors have conducted various studies in order to measure N-peptides and their precursors rapidly, conveniently, and accurately. As a result, N-
The present invention was completed by preparing a monoclonal antibody that recognizes a peptide, constructing a sandwich immunoassay using this monoclonal antibody in combination with another monoclonal antibody that recognizes a different epitope of N-peptide. It was

【０００７】本発明のＮ−ペプチドまたはその前駆体を
測定する方法は、試料と、Ｎ−ペプチドを認識する第１
のモノクローナル抗体とをインキュベートする工程、さ
らにＮ−ペプチドを認識する標識した第２のモノクロー
ナル抗体を加えてインキュベートする工程、および生成
した抗原抗体複合体を検出する工程を包含する。The method for measuring N-peptide or its precursor of the present invention comprises a sample and a first method for recognizing N-peptide.
The step of incubating with the monoclonal antibody of 1), the step of adding a labeled second monoclonal antibody that recognizes the N-peptide and incubating, and the step of detecting the formed antigen-antibody complex.

【０００８】本発明のＮ−ペプチドまたはその前駆体を
測定する他の方法は、試料と、Ｎ−ペプチドを認識する
第１のモノクローナル抗体およびＮ−ペプチドを認識す
る標識した第２のモノクローナル抗体とをインキュベー
トする工程、および生成した抗原抗体複合体を検出する
工程を包含する。Another method for measuring the N-peptide of the present invention or its precursor is a sample, a first monoclonal antibody that recognizes the N-peptide and a labeled second monoclonal antibody that recognizes the N-peptide. And the step of detecting the produced antigen-antibody complex.

【０００９】好ましい実施態様によれば、上記第１また
は第２のモノクローナル抗体は、Ｎ−ペプチドの４３位
から６６位のアミノ酸配列に含まれる部分を認識する。According to a preferred embodiment, the first or second monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence at positions 43 to 66 of N-peptide.

【００１０】好ましい実施態様によれば、上記第１また
は第２のモノクローナル抗体は７Ｂ６である。According to a preferred embodiment, the first or second monoclonal antibody is 7B6.

【００１１】好ましい実施態様によれば、上記第１また
は第２のモノクローナル抗体のいずれか一方は、上記７
Ｂ６であり、他方のモノクローナル抗体は、該７Ｂ６の
認識部位とは異なるＮ−ペプチドのアミノ酸配列に含ま
れる部分を認識するモノクローナル抗体である。According to a preferred embodiment, either one of the first or second monoclonal antibodies described above is
B6, and the other monoclonal antibody is a monoclonal antibody that recognizes a portion contained in the amino acid sequence of the N-peptide that is different from the recognition site of 7B6.

【００１２】好ましい実施態様によれば、上記第１また
は第２のモノクローナル抗体のいずれか一方は、Ｎ−ペ
プチドの４３位から６６位のアミノ酸配列に含まれる部
分を認識し、他方のモノクローナル抗体は、Ｎ−ペプチ
ドの１位から２５位のアミノ酸配列に含まれる部分を認
識するモノクローナル抗体である。According to a preferred embodiment, one of the first or second monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence from position 43 to position 66 of the N-peptide, and the other monoclonal antibody is , A monoclonal antibody that recognizes a portion contained in the amino acid sequence from the 1st position to the 25th position of N-peptide.

【００１３】好ましい実施態様によれば、上記他方のモ
ノクローナル抗体はＫＹ−ＡＮＰ−IIIである。According to a preferred embodiment, the other monoclonal antibody is KY-ANP-III.

【００１４】好ましい実施態様によれば、上記第１のモ
ノクローナル抗体はＮ−ペプチドの１位から２５位のア
ミノ酸配列に含まれる部分を認識し、上記第２のモノク
ローナル抗体はＮ−ペプチドの４３位から６６位のアミ
ノ酸配列に含まれる部分を認識する。According to a preferred embodiment, the first monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence from positions 1 to 25 of the N-peptide, and the second monoclonal antibody has position 43 of the N-peptide. To recognize the portion contained in the amino acid sequence at position 66.

【００１５】好ましい実施態様によれば、上記第１のモ
ノクローナル抗体はＫＹ−ＡＮＰ−IIIであり、上記第
２のモノクローナル抗体は７Ｂ６である。According to a preferred embodiment, the first monoclonal antibody is KY-ANP-III and the second monoclonal antibody is 7B6.

【００１６】好ましい実施態様によれば、上記第２のモ
ノクローナル抗体は、放射性同位元素、酵素、金コロイ
ド、蛍光物質、または発光物質で標識されている。さら
に好ましくは、上記第２のモノクローナル抗体は放射性
同位元素または酵素で標識されている。According to a preferred embodiment, the second monoclonal antibody is labeled with a radioisotope, an enzyme, a gold colloid, a fluorescent substance, or a luminescent substance. More preferably, the second monoclonal antibody is labeled with a radioisotope or an enzyme.

【００１７】本発明のモノクローナル抗体は、Ｎ−ペプ
チドの４３位から６６位のアミノ酸配列に含まれる部分
を認識する。The monoclonal antibody of the present invention recognizes a portion contained in the amino acid sequence at positions 43 to 66 of N-peptide.

【００１８】好ましい実施態様によれば、上記モノクロ
ーナル抗体は７Ｂ６である。According to a preferred embodiment, the monoclonal antibody is 7B6.

【００１９】本発明のハイブリドーマは上記いずれかの
モノクローナル抗体を産生する。The hybridoma of the present invention produces any of the above monoclonal antibodies.

【００２０】好ましい実施態様によれば、上記ハイブリ
ドーマはMouse hybridoma 7B6（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８
７８）である。According to a preferred embodiment, the hybridoma is Mouse hybridoma 7B6 (FERM BP-48
78).

【００２１】本発明のＮ−ペプチドまたはその前駆体の
免疫学的測定用キットは、上記いずれかのモノクローナ
ル抗体を含む。The immunological assay kit for N-peptide or its precursor of the present invention contains any of the above monoclonal antibodies.

【００２２】[0022]

【発明の実施の形態】本明細書中の「Ｎ−ペプチド」と
は、γ−ｈＡＮＰのＮ末端側の１位から98位のアミノ酸
配列からなるペプチドをいう。γ−ｈＡＮＰは、生体内
で分泌される際にＮ−ペプチドとα−ｈＡＮＰとに分解
され、このα−ｈＡＮＰは、γ−ｈＡＮＰの99位から12
6位のアミノ酸配列からなる。本明細書中の「Ｎ−ペプ
チド前駆体」には、γ−ｈＡＮＰも包含される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The "N-peptide" in the present specification refers to a peptide consisting of the amino acid sequence from the 1st position to the 98th position on the N-terminal side of γ-hANP. [gamma] -hANP is decomposed into N-peptide and [alpha] -hANP when secreted in vivo, and this [alpha] -hANP is located at the 99th position of [gamma] -hANP.
It consists of the amino acid sequence at position 6. The term “N-peptide precursor” used herein also includes γ-hANP.

【００２３】本明細書中の「Ｎ−ペプチド(X-Y)」と
は、Ｎ−ペプチドのX位からY位のアミノ酸配列をいう。
例えば、「Ｎ−ペプチド(1-25)」とは、Ｎ−ペプチドの
１位から25位のアミノ酸配列をいう。「Ｎ−ペプチド(4
3-66)」とは、Ｎ−ペプチドの43位から66位のアミノ酸
配列を、「Ｎ−ペプチド(43-67)」とは、Ｎ−ペプチド
の43位から67位のアミノ酸配列をいう。また、「Ｎ−ペ
プチド(43-66)Cys」とは、Ｎ−ペプチド(43-66)のカル
ボキシル末端にシステイン残基が付加しているものをい
う。The term "N-peptide (XY)" as used herein refers to the amino acid sequence from the X position to the Y position of the N-peptide.
For example, "N-peptide (1-25)" refers to the amino acid sequence from the 1st position to the 25th position of the N-peptide. "N-peptide (4
"3-66)" refers to the amino acid sequence from positions 43 to 66 of the N-peptide, and "N-peptide (43-67)" refers to the amino acid sequence from positions 43 to 67 of the N-peptide. In addition, "N-peptide (43-66) Cys" refers to one in which a cysteine residue is added to the carboxyl terminus of N-peptide (43-66).

【００２４】本明細書中の、試料中のまたは免疫学的測
定法に用いる「Ｎ−ペプチド」および「Ｎ−ペプチド前
駆体」は、天然に存在するまたは合成により生成された
Ｎ−ペプチドおよびＮ−ペプチド前駆体をいう。As used herein, "N-peptide" and "N-peptide precursor" in a sample or used in an immunoassay refer to naturally occurring or synthetically produced N-peptide and N. -Refers to a peptide precursor.

【００２５】本明細書中の、標識および免疫学的測定に
用いる「抗体」は、抗体およびそのフラグメントをい
い、抗体のFab、Fab'、F(ab)₂などのフラグメントを含
む。As used herein, the term “antibody” used for labeling and immunoassay refers to an antibody and a fragment thereof, and includes Fab, Fab ′, F (ab) ₂ fragments of the antibody.

【００２６】本明細書中の「ＫＹ−ＡＮＰ−III抗体」
とは、中尾らが作製したγ−ｈＡＮＰの１位から25位の
アミノ酸配列(Ｎ−ペプチド(1-25))を認識するモノクロ
ーナル抗体である(特開平2-16997号)。なお、このモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマは、茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研
究所に、昭和63年5月18日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１８８７として、ブダペスト条約に基づいて寄託さ
れている。"KY-ANP-III antibody" in the present specification
Is a monoclonal antibody produced by Nakao et al. That recognizes the amino acid sequence (N-peptide (1-25)) at positions 1 to 25 of γ-hANP (Japanese Patent Laid-Open No. 2-16997). The hybridoma producing this monoclonal antibody is available from the Institute of Microbial Science and Technology, Institute of Industrial Technology, 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, on May 18, 1988, under the contract number FERM B.
It has been deposited under the Budapest Treaty as P-1887.

【００２７】次に、本発明の方法を工程の順に説明す
る。Ｎ−ペプチドを認識するモノクローナル抗体の作
製、および、Ｎ−ペプチドを認識するモノクローナル抗
体を用いるサンドイッチ免疫学的測定法は、特に指示が
ない限り、当業者に公知の一般的手法を用いて行い得
る。Next, the method of the present invention will be described in the order of steps. Unless otherwise specified, preparation of a monoclonal antibody that recognizes an N-peptide and a sandwich immunoassay using a monoclonal antibody that recognizes an N-peptide can be performed using general techniques known to those skilled in the art. .

【００２８】(1)免疫 Ｎ−ペプチドを認識するモノクローナル抗体を作製する
ために、まず適切な抗原で動物を免疫する。動物にはマ
ウス、ラットなどを用い得る。抗原には、Ｎ−ペプチド
の任意の部分のペプチドフラグメントを用い得る。この
抗原を免疫用の免疫原とする。この抗原を免疫原として
用いるには、例えば、Ｎ−ペプチド(43-66)Cysをキャリ
アタンパク質にコンジュゲートし得る。キャリアタンパ
ク質は、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヘモシアニン、お
よびウシチオグロブリン(BTG)などの高分子物質を用い
得る。コンジュゲートするには、マレイミド試薬などを
用い得る。これは、２官能性架橋剤であり、スクシンイ
ミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−
カルボキシレート(SMCC)、m−マレイミドベンゾイル−N
−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スクシン
イミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMP
B)、ならびに、スルホ−MBS、スルホ−SMCCなどを含
む。これらの架橋剤のスクシンイミジル基が第一アミン
と反応し、さらにチオール反応性マレイミドと反応し
て、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
得られた免疫原をフロイントの完全アジュバントなどの
適切なアジュバントに乳濁し、得られた乳濁液を動物の
腹腔内に投与して免疫する。好ましくは数週間おきに、
動物の腹腔内、皮下、または静脈内に数回の追加免疫を
行う。(1) Immunization In order to produce a monoclonal antibody that recognizes an N-peptide, first, an animal is immunized with an appropriate antigen. Animals such as mice and rats can be used. The antigen may be a peptide fragment of any part of the N-peptide. This antigen is used as an immunogen for immunization. To use this antigen as an immunogen, for example, N-peptide (43-66) Cys can be conjugated to a carrier protein. As the carrier protein, polymeric substances such as bovine serum albumin (BSA), hemocyanin, and bovine thioglobulin (BTG) can be used. A maleimide reagent or the like can be used for conjugation. It is a bifunctional cross-linking agent and is succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-
Carboxylate (SMCC), m-maleimidobenzoyl-N
-Hydroxysuccinimide ester (MBS), succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (SMP
B), as well as sulfo-MBS, sulfo-SMCC and the like. The succinimidyl group of these crosslinkers reacts with primary amines and further with thiol-reactive maleimides to form covalent bonds with thiols of cysteine residues.
The obtained immunogen is emulsified in a suitable adjuvant such as Freund's complete adjuvant, and the obtained emulsion is intraperitoneally administered to an animal for immunization. Preferably every few weeks,
Animals are given several boosts intraperitoneally, subcutaneously or intravenously.

【００２９】(2)モノクローナル抗体の作製 Ｎ−ペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合
して作製し得る。脾臓細胞は、上記(1)項で免疫した動
物、好ましくはマウス由来である。ミエローマ細胞は、
哺乳類由来であり、好ましくはマウスミエローマ細胞で
ある。細胞の融合にはポリエチレングリコールなどを用
い得る。融合により得られたハイブリドーマをスクリー
ニングおよびクローニングすることにより、望ましいハ
イブリドーマを選択し得る。(2) Preparation of Monoclonal Antibody A hybridoma producing a monoclonal antibody that recognizes N-peptide can be prepared by fusing spleen cells and myeloma cells. The spleen cells are derived from the animal immunized in (1) above, preferably mouse. Myeloma cells
It is of mammalian origin and is preferably mouse myeloma cells. Polyethylene glycol or the like can be used for cell fusion. The desired hybridomas can be selected by screening and cloning the hybridomas obtained by the fusion.

【００３０】モノクローナル抗体を作製するには、上記
得られたハイブリドーマをインビトロまたはインビボで
培養する。好ましくはインビボで培養する。例えば、モ
ノクローナル抗体を含む腹水を産生させるためにマウス
の腹腔内に上記のハイブリドーマを投与する。モノクロ
ーナル抗体は、産生された腹水から、当業者に公知の方
法により容易に精製され得る。To prepare the monoclonal antibody, the hybridoma obtained above is cultured in vitro or in vivo. Preferably it is cultured in vivo. For example, the above hybridoma is administered intraperitoneally to a mouse to produce ascites fluid containing a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be easily purified from the produced ascites fluid by methods known to those skilled in the art.

【００３１】本発明のモノクローナル抗体は、本発明の
サンドイッチ免疫学的測定法のほかに、競合法、二抗体
法など他の免疫学的測定法にも適用され得る。The monoclonal antibody of the present invention can be applied not only to the sandwich immunological assay method of the present invention but also to other immunological assay methods such as the competitive method and the two antibody method.

【００３２】(3)免疫学的測定法 本発明の免疫学的測定法は、抗体(第１のモノクローナ
ル抗体)を固相に固定し、抗原を含む試料と共にインキ
ュベートする工程、さらに標識した第２のモノクローナ
ル抗体を加えて、得られた混合物をインキュベートする
工程、および混合物中の生成した標識された抗原抗体複
合体を検出する工程を包含する、サンドイッチ免疫学的
測定法に基づくものである。本発明の免疫学的測定法で
は、試料と、第１のモノクローナル抗体および標識した
第２のモノクローナル抗体とを同時にインキュベートし
てもよい。(3) Immunological Assay Method The immunological assay method of the present invention comprises a step of immobilizing an antibody (first monoclonal antibody) on a solid phase and incubating it with a sample containing an antigen, and a labeled second antibody. Of the sandwich immunoassay, which comprises the steps of adding the monoclonal antibody of 1) and incubating the resulting mixture, and detecting the labeled antigen-antibody complex formed in the mixture. In the immunoassay method of the present invention, the sample and the first monoclonal antibody and the labeled second monoclonal antibody may be simultaneously incubated.

【００３３】本発明のサンドイッチ免疫学的測定法に
は、その検出方法により、サンドイッチ放射免疫測定法
(ＲＩＡ法)、サンドイッチ酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)、
サンドイッチ蛍光免疫測定法(ＦＩＡ法)、サンドイッチ
発光免疫測定法(ＣＬＩＡ法)、サンドイッチ発光酵素免
疫測定法(ＣＬＥＩＡ法)、サンドイッチ法に基づく免疫
クロマトグラフ法などがある。好ましくは、ＲＩＡ法、
ＥＩＡ法が、用いられ得る。The sandwich immunological assay method of the present invention includes a sandwich radioimmunoassay method depending on the detection method.
(RIA method), sandwich enzyme immunoassay method (EIA method),
There are sandwich fluorescence immunoassay (FIA method), sandwich luminescence immunoassay (CLIA method), sandwich luminescence enzyme immunoassay (CLEIA method), sandwich-based immunochromatographic method and the like. Preferably, the RIA method,
The EIA method can be used.

【００３４】本発明の第１のモノクローナル抗体は、マ
イクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、メンブレ
ン、濾紙、プラスチック性カップなどの固相に固定され
得る。特に、ポリスチレンビーズが好適に用いられ得
る。The first monoclonal antibody of the present invention can be immobilized on a solid phase such as microtiter plate, beads, tube, membrane, filter paper, plastic cup and the like. Particularly, polystyrene beads can be preferably used.

【００３５】測定する試料は、血漿、血清、血液、尿な
どＮ−ペプチドおよびその前駆体を含む試料であり得
る。The sample to be measured may be a sample containing N-peptide and its precursor such as plasma, serum, blood and urine.

【００３６】本発明の第２のモノクローナル抗体は、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などにより標
識化され得る。これらの標識は、いずれも当該分野で公
知の方法で実施され得る。The second monoclonal antibody of the present invention can be labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like. Any of these labeling can be performed by a method known in the art.

【００３７】標識に用いられる放射性同位元素として
は、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどであり、特に
¹²⁵Ｉが好適に用いられ得る。これらは、クロラミンＴ
法、ペルオキシダーゼ法、Iodogen法、ボルトンハンタ
ー法などにより、モノクローナル抗体に結合され得る。Radioisotopes used for labeling include ¹⁴ C, ³ H, ³² P, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, etc.
¹²⁵ I may preferably be used. These are chloramine T
Method, peroxidase method, Iodogen method, Bolton-Hunter method, etc.

【００３８】標識に用い得る酵素としては、例えば、β
ガラクトシダーゼ(βGAL)、アルカリホスファターゼ(AL
P)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)などを含む。
これらは、仲根法、石川らの方法(酵素免疫測定法、第
３版、75-127 (1987) 医学書院)などによりモノクロー
ナル抗体に結合され得る。Examples of the enzyme that can be used for labeling include β
Galactosidase (βGAL), alkaline phosphatase (AL
P), horseradish peroxidase (HRP) and the like.
These can be bound to a monoclonal antibody by the Nakane method, Ishikawa et al. Method (enzyme immunoassay method, 3rd edition, 75-127 (1987) Medical Shoin).

【００３９】標識に用い得る蛍光物質としては、フルオ
レセイン、フルオレサミン、フロレセインイソチオシア
ネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートな
どがある。Fluorescent substances that can be used for labeling include fluorescein, fluoresamine, fluorescein isothiocyanate, and tetramethylrhodamine isothiocyanate.

【００４０】標識に用い得る発光物質としては、ルシフ
ェリン、ルミノール誘導体、アクリジニウムエステルな
どがある。The luminescent substance that can be used for labeling includes luciferin, luminol derivative, acridinium ester and the like.

【００４１】標識には、金コロイドを用いてもよい。Colloidal gold may be used for labeling.

【００４２】好ましい実施態様によれば、Ｎ−ペプチド
サンドイッチＲＩＡ法が行われ得る。Ｎ−ペプチドサン
ドイッチＲＩＡ法は、具体的には、標準Ｎ−ペプチド溶
液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定した
ビーズを加えて混和し、４℃から45℃、好ましくは25℃
から37℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュ
ベートする(第一反応)。洗浄後、例えば¹²⁵Iで標識した
第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃から
45℃、好ましくは25℃から37℃で、１から４時間、好ま
しくは２時間インキュベートする(第二反応)。洗浄後、
ビーズに結合した抗原抗体複合体の放射能量をγ線カウ
ンターなどで検出することによりＮ−ペプチドの量測定
する。According to a preferred embodiment, the N-peptide sandwich RIA method can be performed. Specifically, the N-peptide sandwich RIA method is carried out by adding beads to which a first monoclonal antibody is immobilized to a standard N-peptide solution or sample and mixing the mixture, and then 4 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C.
To 37 ° C for 1 to 4 hours, preferably 2 hours (first reaction). After washing, add a solution containing the second monoclonal antibody labeled with ¹²⁵ I, for example, and
Incubate at 45 ° C, preferably 25 ° C to 37 ° C for 1 to 4 hours, preferably 2 hours (second reaction). After washing
The amount of N-peptide is measured by detecting the amount of radioactivity of the antigen-antibody complex bound to the beads with a γ-ray counter or the like.

【００４３】他の好ましい実施態様によれば、Ｎ−ペプ
チドサンドイッチＥＩＡ法が行われ得る。Ｎ−ペプチド
サンドイッチＥＩＡ法は、具体的には、標準Ｎ−ペプチ
ド溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定
したビーズを加えて混和し、４℃から45℃、好ましくは
25℃から37℃で２時間インキュベートする(第一反応)。
洗浄後、例えばＨＲＰで標識した第２のモノクローナル
抗体を含む溶液を加え、４℃から45℃、好ましくは25℃
から37℃で２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体／
Ｎ−ペプチド／抗体複合体を形成する(第二反応)。次
に、ビーズ上の酵素活性を、特異的基質を介して比色法
により測定し、それによりビーズ上に捕獲されたＮ−ペ
プチドの量を測定し得る。比色定量は、通常の分光光度
計などで行われ得る。According to another preferred embodiment, the N-peptide sandwich EIA method can be performed. Specifically, the N-peptide sandwich EIA method is performed by adding beads to which a first monoclonal antibody is immobilized to a standard N-peptide solution or sample and mixing them, and then at 4 ° C to 45 ° C, preferably
Incubate at 25 ° C to 37 ° C for 2 hours (first reaction).
After washing, for example, a solution containing a second monoclonal antibody labeled with HRP is added, and the temperature is 4 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C.
Incubate for 2 hours at 37 ° C to
Form an N-peptide / antibody complex (second reaction). The enzyme activity on the beads can then be measured colorimetrically via a specific substrate, thereby determining the amount of N-peptide captured on the beads. The colorimetric quantification can be performed with a usual spectrophotometer or the like.

【００４４】[0044]

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。The present invention will be further described by the following examples.

【００４５】(実施例１) Ｎ−ペプチド(43-66)Cysに含
まれる部分を認識するモノクローナル抗体および該抗体
を産生するハイブリドーマの作製 Ａ．免疫原の調製および免疫 サンドイッチ免疫学的測定法によるＮ−ペプチドの測定
を行うために、既知のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ
−IIIの認識部位とは異なるＮ−ペプチド部分を認識す
るモノクローナル抗体を次のようにして作製した。抗原
としてＮ−ペプチド(43-66)Cysを用いた。Example 1 Preparation of Monoclonal Antibody Recognizing Portion Contained in N-Peptide (43-66) Cys and Hybridoma Producing the Antibody A. Preparation of Immunogen and Immunization In order to measure N-peptide by sandwich immunoassay, known monoclonal antibody KY-ANP is used.
A monoclonal antibody that recognizes an N-peptide portion different from the recognition site of -III was prepared as follows. N-peptide (43-66) Cys was used as an antigen.

【００４６】まず、キャリアタンパク質として、33.5mg
のウシチオグロブリン(BTG、Sigma社製)を5mlの0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH7.0)(緩衝液Ａ)に溶解した。これに10.5m
gのスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シ
クロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC、Pierc
e社製)を含む緩衝液Ａを1.2ml加え、30℃で１時間反応
し、BTGをマレイミド化した。反応混合物を、0.1Mリン
酸緩衝液(pH6.0)(緩衝液Ｂ)で平衡化したセファデック
スG-25(Pharmacia社製)カラムにかけ、マレイミド化BTG
を含むボイド画分を分取した。６mgのマレイミド化BTG
を含む緩衝液Ｂの2.6mlに、3.3mgのＮ−ペプチド(43-6
6)Cys(ペプチド研究所製)および2.5mM EDTAを含む緩衝
液Ｂを0.4ml加えて４℃で20時間反応させた後、40μlの
50mM N-エチルマレイミド溶液を加えて反応を停止し
た。反応混合物を、緩衝液Ｂで平衡化したセファデック
スG-50(Pharmacia社製)のカラムにかけボイド画分を分
取し、未反応のペプチドを除いた。集めた画分を水に対
して4℃で一晩透析し、次いで凍結乾燥した。10.9mg(乾
燥重量)のＮ−ペプチド(43-66)Cys-BTGコンジュゲート
を得、これを免疫原とした。First, as a carrier protein, 33.5 mg
Bovine thioglobulin (BTG, Sigma) was dissolved in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) (buffer A). 10.5m to this
g sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC, Pierc
1.2 ml of buffer solution A containing e.g.) was added and reacted at 30 ° C. for 1 hour to maleimidate BTG. The reaction mixture was applied to a Sephadex G-25 (Pharmacia) column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) (buffer B) to give maleimidated BTG.
The void fraction containing was collected. 6 mg maleimidated BTG
In 2.6 ml of buffer solution B containing 3.3 mg of N-peptide (43-6
6) Add 0.4 ml of buffer B containing Cys (manufactured by Peptide Institute) and 2.5 mM EDTA, react at 4 ° C. for 20 hours, and then add 40 μl
The reaction was stopped by adding 50 mM N-ethylmaleimide solution. The reaction mixture was applied to a column of Sephadex G-50 (manufactured by Pharmacia) equilibrated with buffer solution B, and a void fraction was collected to remove unreacted peptides. The collected fractions were dialyzed against water at 4 ° C overnight and then lyophilized. 10.9 mg (dry weight) of N-peptide (43-66) Cys-BTG conjugate was obtained and used as an immunogen.

【００４７】BALB/cマウスに、免疫原として１匹あたり
100μgのコンジュゲートを腹腔内投与して免疫した。追
加免疫を３〜４週間隔で３回行った。初回および２回目
の免疫では、フロイントの完全アジュバントとともに投
与した。In BALB / c mice, per mouse as an immunogen
100 μg of the conjugate was intraperitoneally administered to immunize. Boosts were given three times at 3-4 week intervals. The first and second immunizations were given with Freund's complete adjuvant.

【００４８】Ｂ．７Ｂ６抗体を産生するハイブリドーマ
および該ハイブリドーマを用いた７Ｂ６抗体の作製 上記Ａ項で免疫したマウスから最終免疫後３日目に摘出
した脾臓細胞(1.1×10⁸個)と、マウスミエローマ細胞(P
3-U1-X63-Ag8(東京腫瘤研究所)、2.1×10⁷個)とを、50
％のポリエチレングリコール4000(Merck社製)を用いて
融合した。融合により得られたハイブリドーマを、ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培
地で選択した。細胞融合後10日目に特異抗体産生ハイブ
リドーマのスクリーニングを行った。スクリーニングに
用いたＥＩＡ法は次の通りである：96穴マイクロタイタ
ープレート(Nunc社製)の各ウェルに、１μgのＮ−ペプ
チド(43-67)(ペプチド研究所製)またはＮ−ペプチド(1-
25)(ペプチド研究所製)を含むPBS(0.15MのNaClを含むリ
ン酸緩衝液(pH7.4))を50μl加えて、４℃で１晩固定し
た。次に、このウェルを25％のブロックエース(大日本
製薬社製)を含む溶液で１回洗浄した後、この溶液を300
μl添加してブロッキングを行った。次いでウェルを0.0
5%のTween 20を含むPBSで３回洗浄した後、ハイブリド
ーマの培養上清を50μl加えて室温で２時間反応させ
た。次いでウェルを３回洗浄した後、５μgのＨＲＰ標
識抗マウスIgGを含む25％のブロックエース溶液を50μl
加え、室温で１時間反応させた。ウェルを３回洗浄後、
４mMの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-
スルホン酸)(ABTS、ベーリンガー・マンハイム社製)お
よび2mM H₂O₂を含む溶液を50μl加えて室温で15分間の
酵素反応を行い、0.002% NaN₃を含む溶液を50μl加えて
反応を停止した。各ウェルについて、プレートリーダー
(MTP-32、コロナ社製)で415nmの吸光度を測定した。B. Preparation of 7B6 Antibody-Producing Hybridoma and 7B6 Antibody Using the Hybridoma The spleen cells (1.1 × 10 ⁸ cells) extracted from the mouse immunized in the above section A on the third day after the final immunization and the mouse myeloma cell (P
3-U1-X63-Ag8 (Tokyo Mass Research Institute, 2.1 x 10 ⁷ ) and 50
% Polyethylene glycol 4000 (Merck) was used for fusion. Hybridomas obtained by fusion were selected on medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. On the 10th day after cell fusion, screening of specific antibody-producing hybridomas was performed. The EIA method used for screening was as follows: 1 μg of N-peptide (43-67) (Peptide Institute) or N-peptide (1) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Nunc). -
25) (Peptide Laboratories) -containing PBS (phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl) (50 μl) was added, and fixed at 4 ° C. overnight. Next, this well was washed once with a solution containing 25% Block Ace (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.),
μl was added for blocking. Well then 0.0
After washing 3 times with PBS containing 5% Tween 20, 50 μl of the culture supernatant of the hybridoma was added and reacted at room temperature for 2 hours. Then, the wells were washed 3 times, and 50 μl of 25% Block Ace solution containing 5 μg of HRP-labeled anti-mouse IgG was added.
In addition, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing the well 3 times,
4 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-
Sulfonic acid) (ABTS, Boehringer Mannheim) and 50 mM of a solution containing ₂ mM H ₂ O ₂ was added to carry out an enzyme reaction for 15 minutes at room temperature, and the reaction was stopped by adding 50 μl of a solution containing 0.002% NaN ₃ . . Plate reader for each well
(MTP-32, manufactured by Corona) was used to measure the absorbance at 415 nm.

【００４９】特異抗体の産生が陽性を示したウェル中の
ハイブリドーマを、限界希釈法により３回クローニング
して、Ｎ−ペプチド(43-66)を認識するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを得た。The hybridoma in the well showing positive production of specific antibody was cloned three times by the limiting dilution method to obtain a hybridoma producing a monoclonal antibody that recognizes N-peptide (43-66).

【００５０】得られたハイブリドーマの培養上清につい
て、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット
(Mouse monoclonal antibody isotyping kit、アマシャ
ム社製)を用いて、ハイブリドーマが産生する抗体のサ
ブクラスを決定した。新たに得られたモノクローナル抗
体は、７Ｂ６と命名し、そのアイソタイプはIgG₁(κ)で
あった。A mouse monoclonal antibody isotyping kit was used for the obtained culture supernatant of the hybridoma.
(Mouse monoclonal antibody isotyping kit, manufactured by Amersham) was used to determine the subclass of the antibody produced by the hybridoma. The newly obtained monoclonal antibody was named 7B6 and its isotype was IgG ₁ (κ).

【００５１】既存のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−
III(IgG₁κ)および新規のモノクローナル抗体７Ｂ６
の、各種Ｎ−ペプチドフラグメントとの反応性を上記Ｅ
ＩＡ法を用いて確認した。ＫＹ−ＡＮＰ−IIIは、ハイ
ブリドーマＦＥＲＭ ＢＰ−１８８７が産生するモノク
ローナル抗体を用いた。結果を図１に示す。図中の白丸
はＮ−ペプチド(1-25)に対する反応性を、黒丸はＮ−ペ
プチド(43-67)に対する反応性を示す。ＫＹ−ＡＮＰ−I
II抗体はＮ−ペプチド(1-25)と反応するが、Ｎ−ペプチ
ド(43-67)とは反応しなかった(図１(Ａ))。逆に、７Ｂ
６抗体はＮ−ペプチド(43-67)と反応するが、Ｎ−ペプ
チド(1-25)とは反応しなかった(図１(Ｂ))。このよう
に、ＫＹ−ＡＮＰ−III抗体はＮ−ペプチド(1-25)を認
識し、７Ｂ６抗体はＮ−ペプチド(43-66)に含まれる部
分を認識することより、２つの抗体がＮ−ペプチドの異
なる部分を認識していることを確認した。Existing monoclonal antibody KY-ANP-
III (IgG ₁ κ) and novel monoclonal antibody 7B6
Of the N-peptide fragments of E.
It confirmed using the IA method. As KY-ANP-III, a monoclonal antibody produced by hybridoma FERM BP-1887 was used. The results are shown in Fig. 1. In the figure, open circles show reactivity with N-peptide (1-25), and black circles show reactivity with N-peptide (43-67). KY-ANP-I
The II antibody reacted with N-peptide (1-25), but did not react with N-peptide (43-67) (FIG. 1 (A)). Conversely, 7B
The 6 antibody reacted with N-peptide (43-67), but did not react with N-peptide (1-25) (FIG. 1 (B)). Thus, the KY-ANP-III antibody recognizes the N-peptide (1-25), and the 7B6 antibody recognizes the portion contained in the N-peptide (43-66). It was confirmed that different parts of the peptide were recognized.

【００５２】本発明のモノクローナル抗体７Ｂ６を産生
するハイブリドーマは、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成6年11
月9日付で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８７８として、
ブダペスト条約に基づいて寄託されている。The hybridoma producing the monoclonal antibody 7B6 of the present invention is 1-3, Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki Prefecture.
No. 1994, Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology,
As of the contract number FERM BP-4878 on the 9th of the month
It has been deposited under the Budapest Treaty.

【００５３】(実施例２) マウス腹水からのモノクロー
ナル抗体７Ｂ６の精製 マウス(BALB/c)の腹腔内にプリスタンを0.5ml投与した
２週間後、一匹あたり約１×10⁷個の実施例で得られた
ハイブリドーマを腹腔内投与した。投与後７〜10日目に
腹水を回収し、10,000×gで20分間遠心分離してその上
清をPBSで２倍に希釈した後、プロテインＧセファロー
スカラム(Pharmacia社製)に通した。PBSでカラムを洗浄
後、0.2Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)で抗体を溶出し、
直ちに１Mトリス緩衝液を加えて中和した。得られた溶
出液を０℃で、50％の飽和硫酸アンモニウムで塩析し
た。塩析物を10,000×gで20分間遠心分離して回収し
た。得られた沈澱をPBSに溶解し、さらにPBSに対して４
℃で一晩透析して精製７Ｂ６モノクローナル抗体とし
た。Example 2 Purification of Monoclonal Antibody 7B6 from Mouse Ascites Two weeks after 0.5 ml of pristane was intraperitoneally administered to mice (BALB / c), about 1 × 10 ⁷ mice were used. The obtained hybridoma was intraperitoneally administered. Ascitic fluid was collected 7 to 10 days after administration, centrifuged at 10,000 × g for 20 minutes, the supernatant was diluted 2-fold with PBS, and then passed through a protein G sepharose column (Pharmacia). After washing the column with PBS, elute the antibody with 0.2 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.7),
Immediately, 1 M Tris buffer was added to neutralize. The obtained eluate was salted out at 0 ° C. with 50% saturated ammonium sulfate. The salted out product was recovered by centrifugation at 10,000 × g for 20 minutes. Dissolve the obtained precipitate in PBS and further add 4 to PBS.
It was dialyzed at 0 ° C. overnight to give a purified 7B6 monoclonal antibody.

【００５４】(実施例３) ＫＹ−ＡＮＰ−III抗体を固
定したビーズの作製 予め１％のグルタルアルデヒド水溶液で処理したポリス
チレンビーズ(イムノケミカル社製)を、0.05Mリン酸緩
衝液(pH7.1)中の25μg/mlのＫＹ−ＡＮＰ−III抗体溶液
に浸潤した(１個/200μl)。Ｎ−ペプチド(1-25)を認識
するモノクローナル抗体のＫＹ−ＡＮＰ−III抗体は、
この抗体を産生するハイブリドーマである受託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１８８７を培養することにより得た。これ
を25℃で３時間振盪した後、さらに４℃で19時間以上振
盪した。水溶液部分を吸引除去した後、0.05Mリン酸緩
衝液(pH7.1)で洗浄し、25％のブロックエースを含む0.0
5Mリン酸緩衝液(pH7.1)を加えてブロッキングを４℃で4
0時間以上行うことにより、ＫＹ−ＡＮＰ−III抗体を固
定したビーズを得た。得られたビーズを、0.15M塩化ナ
トリウム、0.1％ BSA、1mM EDTA、および0.1％ アジ化
ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)中で保存し
た。(Example 3) Preparation of beads to which KY-ANP-III antibody was immobilized Polystyrene beads (manufactured by Immunochemical Co., Ltd.) previously treated with a 1% glutaraldehyde aqueous solution were mixed with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.1). 25 μg / ml of KY-ANP-III antibody solution in (1) / 200 μl). The KY-ANP-III antibody, which is a monoclonal antibody that recognizes N-peptide (1-25), is
Accession number FE, which is a hybridoma that produces this antibody
Obtained by culturing RM BP-1887. This was shaken at 25 ° C. for 3 hours and then at 4 ° C. for 19 hours or more. After removing the aqueous solution by suction, it was washed with 0.05M phosphate buffer (pH 7.1), containing 0.0% 25% Block Ace.
Add 5M phosphate buffer (pH 7.1) to block at 4 ℃.
By carrying out for 0 hours or more, beads on which the KY-ANP-III antibody was immobilized were obtained. The obtained beads were stored in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.15 M sodium chloride, 0.1% BSA, 1 mM EDTA, and 0.1% sodium azide.

【００５５】(実施例４) ７Ｂ６抗体の放射性ヨウ素(
¹²⁵I)標識 精製７Ｂ６抗体の¹²⁵I標識をクロラミンＴ法で以下のよ
うに行った。Example 4 7B6 antibody radioactive iodine (
¹²⁵ I) Labeling The purified 7B6 antibody was labeled with ¹²⁵ I by the chloramine T method as follows.

【００５６】ガラスチューブに、100μlの0.5Mリン酸緩
衝液(pH7.5)および2mCi/20μlのNa^{1 25}I(アマシャム社
製)を分取した後、PBS中の3.3mg/mlの７Ｂ６抗体溶液を
60μl加え、次いで0.5Mリン酸緩衝液(pH7.5)中の１mg/m
lのクロラミンＴ溶液を20μl加えて攪拌した。この混合
液を室温で30秒間反応させた後、0.1Mリン酸緩衝液(pH
7.5)中の2.5mg/mlのピロ亜硫酸ナトリウム溶液を20μl
加えて反応を停止した。この反応溶液に50mg/mlのヨウ
化カリウム水溶液を20μl加えた後、スーパーロース12
(1×30cm)(Pharmacia社製)を用いて0.1Mリン酸緩衝液(p
H7.0)で溶出し、¹²⁵I標識７Ｂ６抗体を含む画分を分取
した。[0056] the glass tube, after a sample was collected 0.5M phosphate buffer 100 [mu] l (pH 7.5) and 2 mCi / 20 [mu] l of Na ^{1 25} I (Amersham), 3.3 mg / ml 7B6 antibody for in PBS Solution
Add 60 μl, then 1 mg / m in 0.5 M phosphate buffer (pH 7.5)
20 μl of 1 chloramine T solution was added and stirred. After reacting this mixed solution at room temperature for 30 seconds, 0.1M phosphate buffer (pH
20 μl of 2.5 mg / ml sodium pyrosulfite solution in 7.5)
In addition, the reaction was stopped. After adding 20 μl of 50 mg / ml potassium iodide aqueous solution to this reaction solution,
(1 × 30 cm) (manufactured by Pharmacia) using 0.1 M phosphate buffer (p
Elution was performed with H7.0), and a fraction containing ¹²⁵ I-labeled 7B6 antibody was collected.

【００５７】(実施例５) サンドイッチＲＩＡ法 一連の濃度のＮ−ペプチド(1-67)(ペプチド研究所製)を
含む標準溶液を調製した。試験管に、この標準溶液また
は試料を50μlずつ加えた。次に緩衝液Ｃ(0.15M塩化ナ
トリウム、0.1% BSA、1mM EDTA、および0.1% ケーソン
ＣＧ(Rohm and Haas社製)を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.
5))を250μlずつ添加し、さらに上記実施例３で作製し
たＫＹ−ＡＮＰ−III抗体を固定したビーズを１個ずつ
加えて混和した。水平振盪(200ストローク/分)を25℃で
２時間行い(第一反応)、試験管内の溶液を吸引除去した
後、試験管を２mlの緩衝液Ｄ(1mM EDTA、0.0075% Tween
20、および0.1% ケーソンＣＧを含む0.05Mリン酸緩衝
液(pH6.5))で３回洗浄した。次に0.1% BSAを含む緩衝液
Ｄで希釈した¹²⁵I標識７Ｂ６抗体溶液を300μl(約200,0
00cpm)加え、水平振盪(200ストローク/分)を25℃で２時
間行った(第二反応)。次いで試験管内の溶液を吸引除去
し、２mlの緩衝液Ｄで３回洗浄し、ビーズに残存する放
射能量をγ線カウンター(ARC-600、アロカ社製)で測定
した。Example 5 Sandwich RIA Method A standard solution containing a series of concentrations of N-peptide (1-67) (manufactured by Peptide Laboratories) was prepared. 50 μl of this standard solution or sample was added to each test tube. Next, a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.M) containing buffer C (0.15 M sodium chloride, 0.1% BSA, 1 mM EDTA, and 0.1% caisson CG (Rohm and Haas)).
5)) was added in an amount of 250 μl each, and the beads prepared by immobilizing the KY-ANP-III antibody prepared in Example 3 were added one by one and mixed. Horizontal shaking (200 strokes / min) was performed at 25 ° C for 2 hours (first reaction), the solution in the test tube was removed by suction, and then the test tube was mixed with 2 ml of buffer solution D (1 mM EDTA, 0.0075% Tween).
20 times, and it wash | cleaned 3 times by the 0.05M phosphate buffer solution (pH6.5) containing 0.1% caisson CG. Next, 300 μl of a ¹²⁵ I-labeled 7B6 antibody solution diluted with buffer D containing 0.1% BSA (about 200,0
00cpm) and horizontal shaking (200 strokes / minute) was performed at 25 ° C for 2 hours (second reaction). Then, the solution in the test tube was removed by suction, washed 3 times with 2 ml of buffer solution D, and the amount of radioactivity remaining in the beads was measured with a γ-ray counter (ARC-600, manufactured by Aloka).

【００５８】サンドイッチＲＩＡ法における標準曲線を
図２に示す。0〜5000 fmol/mlの範囲で、Ｎ−ペプチド
(1-67)に対して濃度依存的な反応性が認められた。最低
検出感度は40 fmol/mlであった。ヒト血漿４例を用いて
再現性試験を行った。再現性試験は測定法の精度を確認
する試験であり、２種類の試験方法がある：測定内再現
性試験は１回の測定内における複数の同一試料の測定値
の間のばらつきを、測定間再現性試験は、複数の測定に
おける同一試料の測定値の間のばらつきを測定する試験
である。２種類の再現性試験の結果を表１および表２に
示す。測定内再現性では変動係数(CV)は1.5〜2.2％(表
１)であり、そして測定間再現性ではCVは4.1〜5.6％(表
２)であった。A standard curve in the sandwich RIA method is shown in FIG. N-peptide in the range of 0 to 5000 fmol / ml
A concentration-dependent reactivity with (1-67) was observed. The minimum detection sensitivity was 40 fmol / ml. A reproducibility test was performed using 4 cases of human plasma. The reproducibility test is a test for confirming the accuracy of the measurement method, and there are two types of test methods: the intra-measurement reproducibility test shows the variation between the measurement values of the same sample in one measurement, The reproducibility test is a test for measuring a variation between measurement values of the same sample in a plurality of measurements. The results of two types of reproducibility tests are shown in Tables 1 and 2. The coefficient of variation (CV) was 1.5 to 2.2% (Table 1) for intra-measurement reproducibility, and the CV was 4.1 to 5.6% (Table 2) for inter-measurement reproducibility.

【００５９】[0059]

【表１】 [Table 1]

【００６０】[0060]

【表２】 [Table 2]

【００６１】次いでヒト血漿を用いて希釈試験を行っ
た。４種類のヒト血漿を、緩衝液Ｃを用いて２倍系列希
釈して測定用試料とした。得られた試料を上記と同様に
サンドイッチＲＩＡ法で測定した。結果を図３に示す。
いずれの濃度においてもほぼ原点を通る直線上にあっ
た。Then, a dilution test was carried out using human plasma. Four types of human plasma were serially diluted 2-fold with buffer C to obtain measurement samples. The obtained sample was measured by the sandwich RIA method as described above. The results are shown in Fig. 3.
All the concentrations were on a straight line passing through the origin.

【００６２】次に、血漿中に存在すると考えられる成分
の影響について検討した結果、結合型ビリルビン(0.15m
g/ml)、遊離型ビリルビン(0.17mg/ml)、ヘモグロビン
(4.25mg/ml)、および乳び(ホルマジン濁度、24度)の影
響は認められなかった。Next, as a result of examining the influence of the components that are considered to be present in plasma, it was found that bound bilirubin (0.15 m
g / ml), free bilirubin (0.17 mg / ml), hemoglobin
(4.25 mg / ml) and chyle (formazine turbidity, 24 degrees) had no effect.

【００６３】従って、本発明のサンドイッチＲＩＡ法
は、血漿中の他の成分の影響を受けることなく、精度良
くＮ−ペプチドを測定し得ることを確認した。Therefore, it was confirmed that the sandwich RIA method of the present invention can accurately measure N-peptide without being affected by other components in plasma.

【００６４】さらに、ヒト血漿を用いて添加回収試験を
行った。４種類のヒト血漿を、各濃度の標準Ｎ−ペプチ
ド(1-67)溶液を用いて２倍に希釈したものを測定試料と
した。得られた試料を上記と同様にサンドイッチＲＩＡ
法で測定した。結果を表３に示す。回収率は88〜134％
であった。このように、本発明のサンドイッチＲＩＡ法
は、ヒト血漿中の種々のＮ−ペプチドと標準Ｎ−ペプチ
ドとが同様の反応性を示すことを確認した。Further, an addition recovery test was conducted using human plasma. Four types of human plasma were diluted two-fold with standard N-peptide (1-67) solutions of each concentration, and used as measurement samples. The obtained sample was subjected to sandwich RIA in the same manner as above.
It was measured by the method. The results are shown in Table 3. Recovery rate is 88-134%
Met. Thus, the sandwich RIA method of the present invention confirmed that various N-peptides in human plasma and the standard N-peptide show similar reactivity.

【００６５】[0065]

【表３】 [Table 3]

【００６６】次に、本発明のサンドイッチＲＩＡ法で健
常人36例(男性23例、女性13例)の血漿中のＮ−ペプチド
濃度を測定した結果、平均値は213 fmol/mlであり標準
偏差は90 fmol/mlであった。Next, the sandwich RIA method of the present invention was used to measure the N-peptide concentration in plasma of 36 healthy subjects (23 males and 13 females), and the average value was 213 fmol / ml, which was the standard deviation. Was 90 fmol / ml.

【００６７】(実施例６) ７Ｂ６抗体の西洋ワサビペル
オキシダーゼ(ＨＲＰ)標識 精製７Ｂ６抗体のＨＲＰ標識を石川らの方法(前出)に従
って以下のように行った。Example 6 Horseradish Peroxidase (HRP) Labeling of 7B6 Antibody Purified 7B6 antibody was labeled with HRP according to the method of Ishikawa et al. (Supra).

【００６８】まず、PBS中の4.4mg/mlの精製７Ｂ６抗体
溶液の4.5mlに、0.2Mクエン酸緩衝液(pH4.0)の4.5ml
と、0.2Mクエン酸緩衝液(pH4.0)中の2.2mg/mlのペプシ
ン(ベーリンガーマンハイム社製)溶液の0.9mlとを加え
て37℃で18時間消化した。消化物を0.1Mリン酸緩衝液(p
H7.0)で平衡化したウルトロゲルACA 44(2.6×84cm)(IBF
biotechnics社製)で分離した。F(ab)₂を含む画分を集
め、セントリコン30(アミコン社製)で濃縮した。First, 4.5 ml of a purified 7B6 antibody solution of 4.4 mg / ml in PBS was added to 4.5 ml of 0.2 M citrate buffer (pH 4.0).
And 0.9 ml of a 2.2 mg / ml pepsin (Boehringer Mannheim) solution in 0.2 M citrate buffer (pH 4.0) were added and digested at 37 ° C. for 18 hours. Digest the digest with 0.1 M phosphate buffer (p
Ultrogel ACA 44 (2.6 × 84 cm) (IBF) equilibrated with H7.0)
biotechnics). Fractions containing F (ab) ₂ were collected and concentrated with Centricon 30 (Amicon).

【００６９】次に、得られたF(ab)₂の一部を次のように
還元した。3.3mgのF(ab)₂を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.
0)の1.2mlに、0.1M 2-メルカプトエチルアミンと5mMエ
チレンジアミン４酢酸(EDTA)とを含む0.1Mリン酸緩衝液
(pH6.0)を1/10容量加え、37℃で30分間還元した。還元
物を、5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡
化したスーパーロース12(1.5×50cm)(Pharmacia社製)で
分離し、Fabを含む画分を集め、セントリコン10(アミコ
ン社製)で濃縮した。Next, a part of the obtained F (ab) ₂ was reduced as follows. 0.1M phosphate buffer containing 3.3 mg of F (ab) ₂ (pH 7.
0) 0.1M phosphate buffer containing 0.1M 2-mercaptoethylamine and 5mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) in 1.2ml
1/10 volume of (pH 6.0) was added, and the mixture was reduced at 37 ° C. for 30 minutes. The reduced product was separated with Superose 12 (1.5 × 50 cm) (Pharmacia) equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA, and Fab-containing fractions were collected, and Centricon 10 was used. (Amicon).

【００７０】一方、２mlの0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に
溶解したＨＲＰ(シグマ社製)17.2mgに、250μlのN,N-ジ
メチルホルムアミドに溶解したε−マレイミドカプロイ
ルオキシスクシンイミド(EMCS、同仁化学社製)23.6mgを
加え、30℃で15分間反応させた。生成した沈澱を遠心分
離して除去し、上清を0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡
化したPD-10(Pharmacia社製)に通して低分子物質を除去
し、マレイミド化ＨＲＰを得た。On the other hand, ε-maleimidocaproyloxysuccinimide (250 μl) dissolved in 250 μl of N, N-dimethylformamide was added to 17.2 mg of HRP (manufactured by Sigma) dissolved in 2 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). 23.6 mg was added and reacted at 30 ° C. for 15 minutes. The formed precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was passed through PD-10 (Pharmacia) equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) to remove low molecular weight substances and maleimidated HRP. Got

【００７１】得られたマレイミド化ＨＲＰを含む画分と
濃縮したFabとを、モル比が1:1になるように混合し、30
℃で１時間反応させた。ＨＲＰ標識されたFabを、0.1M
リン酸緩衝液(pH6.5)で平衡化したスーパーロース12(1.
5×50cm)により未反応物と分離し、ＨＲＰ標識モノクロ
ーナル抗体(0.62mg)を得た。The obtained fraction containing maleimidated HRP and the concentrated Fab were mixed at a molar ratio of 1: 1 and
The reaction was carried out at 0 ° C for 1 hour. HRP-labeled Fab is 0.1M
Superose 12 (1.
The HRP-labeled monoclonal antibody (0.62 mg) was obtained by separating from the unreacted product by (5 × 50 cm).

【００７２】(実施例７) サンドイッチＥＩＡ法 試験管に、標準Ｎ−ペプチド(1-67)溶液または試料を50
μlずつ加えた。次に緩衝液Ｃを250μlずつ添加し、さ
らに上記実施例３で作製したＫＹ−ＡＮＰ−III抗体を
固定したビーズを１個ずつ加えて混和した。水平振盪(2
00ストローク/分)を25℃で２時間行い(第一反応)、試験
管内の溶液を吸引除去した後、２mlの緩衝液Ｄで３回洗
浄した。次いで、0.1% BSAを含む緩衝液Ｄで希釈したＨ
ＲＰ標識７Ｂ６抗体溶液を300μl加え(200ng/試験管)、
水平振盪(200ストローク/分)を25℃で２時間行った(第
二反応)。試験管内の溶液を吸引除去した後、２mlの緩
衝液Ｄで５回洗浄した。次に、発色液として8.5mg/mlの
2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホ
ン酸)(ABTS、ベーリンガー・マンハイム社製)および2mM
の過酸化水素を含む0.01Mクエン酸緩衝液(pH5.0)を300
μlずつ加えて混和し、25℃で正確に30分間静置した
後、反応停止液を2mlずつ加えて混和した。得られた溶
液の415nmの吸光度を分光光度計(UV-264、島津製作所社
製)を用いて測定した。蒸留水をブランクとして用い
た。Example 7 Sandwich EIA Method A standard N-peptide (1-67) solution or sample was placed in a test tube in an amount of 50.
μl was added to each. Next, 250 μl of buffer solution C was added, and the beads prepared by immobilizing the KY-ANP-III antibody prepared in Example 3 were added one by one and mixed. Horizontal shaking (2
(00 strokes / minute) was performed at 25 ° C. for 2 hours (first reaction), the solution in the test tube was removed by suction, and then the solution was washed 3 times with 2 ml of buffer solution D. Then H diluted with buffer D containing 0.1% BSA
Add 300 μl of RP-labeled 7B6 antibody solution (200 ng / test tube),
Horizontal shaking (200 strokes / minute) was performed at 25 ° C for 2 hours (second reaction). After the solution in the test tube was removed by suction, it was washed 5 times with 2 ml of buffer solution D. Next, 8.5 mg / ml of color developing solution
2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Boehringer Mannheim) and 2 mM
0.01M citrate buffer (pH 5.0) containing hydrogen peroxide of 300
μl was added to each well and mixed, and the mixture was allowed to stand exactly at 25 ° C. for 30 minutes, and then 2 ml of the reaction stop solution was added and mixed. The absorbance at 415 nm of the obtained solution was measured using a spectrophotometer (UV-264, manufactured by Shimadzu Corporation). Distilled water was used as a blank.

【００７３】サンドイッチＥＩＡ法における標準曲線を
図４に示す。ビーズに残存する酵素活性は、0〜5000 fm
ol/mlの範囲で、Ｎ−ペプチド(1-67)濃度に比例してい
た。最低検出感度は25 fmol/mlであった。ヒト血漿３例
を用いて再現性試験を行った結果を表４および表５に示
す。測定内再現性ではCVは1.2〜4.6％であり、そして測
定間再現性ではCVは5.9〜15.0％であった。The standard curve in the sandwich EIA method is shown in FIG. The enzyme activity remaining on the beads is 0-5000 fm
It was proportional to the N-peptide (1-67) concentration in the range of ol / ml. The minimum detection sensitivity was 25 fmol / ml. The results of the reproducibility test using three examples of human plasma are shown in Tables 4 and 5. The intra-measurement reproducibility showed a CV of 1.2-4.6%, and the inter-measurement reproducibility showed a CV of 5.9-15.0%.

【００７４】[0074]

【表４】 [Table 4]

【００７５】[0075]

【表５】 [Table 5]

【００７６】次いでヒト血漿を用いて希釈試験を行っ
た。３種類のヒト血漿を、緩衝液Ｃを用いて２倍系列希
釈して測定用試料とした。得られた試料を上記と同様に
サンドイッチＥＩＡ法で測定した。結果を図５に示す。
いずれの濃度においてもほぼ原点を通る直線上にあっ
た。Then, a dilution test was carried out using human plasma. Three types of human plasma were serially diluted 2-fold with buffer C to prepare samples for measurement. The obtained sample was measured by the sandwich EIA method as described above. Results are shown in FIG.
All the concentrations were on a straight line passing through the origin.

【００７７】また、本発明のサンドイッチＥＩＡ法は、
上記実施例５と同様に血漿中の他の成分の影響を受ける
ことなく、精度良くＮ−ペプチドを測定し得ることを確
認した。The sandwich EIA method of the present invention is
As in Example 5 above, it was confirmed that N-peptide could be measured accurately without being affected by other components in plasma.

【００７８】さらに、ヒト血漿を用いて添加回収試験を
行った。３種類のヒト血漿を、各濃度の標準Ｎ−ペプチ
ド(1-67)溶液を用いて２倍に希釈したものを測定試料と
した。得られた試料を上記と同様にサンドイッチＥＩＡ
法で測定した。結果を表６に示す。回収率は82〜103％
であった。従って、本発明のサンドイッチＥＩＡ法にお
いて、標準Ｎ−ペプチドは、ヒト血漿中の種々のＮ−ペ
プチドと同等の反応性を示すことを確認した。Further, an addition recovery test was conducted using human plasma. Three types of human plasma were diluted 2-fold with standard N-peptide (1-67) solutions of each concentration, and used as measurement samples. The obtained sample was subjected to sandwich EIA in the same manner as above.
It was measured by the method. The results are shown in Table 6. Recovery rate is 82-103%
Met. Therefore, in the sandwich EIA method of the present invention, it was confirmed that the standard N-peptide shows the same reactivity as various N-peptides in human plasma.

【００７９】[0079]

【表６】 [Table 6]

【００８０】また、サンドイッチＲＩＡ法(Ｘ)とサンド
イッチＥＩＡ法(Ｙ)との相関をヒト血漿(14例)を用いて
検討した結果、相関式Ｙ＝0.79Ｘ−132(fmol/ml)、相関
係数Ｒ＝0.99であった。The correlation between the sandwich RIA method (X) and the sandwich EIA method (Y) was examined using human plasma (14 cases). As a result, the correlation equation Y = 0.79X-132 (fmol / ml), The relation number R = 0.99.

【００８１】[0081]

【発明の効果】本発明によれば、Ｎ−ペプチドおよびそ
の前駆体を測定するためのサンドイッチ免疫学的測定
法；該方法に用いるモノクローナル抗体；該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ；および該モノクロ
ーナル抗体を含むＮ−ペプチドまたはその前駆体の免疫
学的測定用キットが提供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a sandwich immunoassay for measuring N-peptide and its precursor; a monoclonal antibody used in the method; a hybridoma producing the monoclonal antibody; and the monoclonal antibody A kit for immunological measurement of an N-peptide or a precursor thereof containing the same is provided.

【００８２】本発明の免疫学的測定法は、従来の競合法
に比べ、精度、簡便性、および迅速性に優れ、さらに高
感度である。また、Ｎ−ペプチドはα-ｈＡＮＰに比べ
て安定であり、試料の採取操作による免疫学的活性の低
下も少ないと考えられ、さらに非ＲＩＡ法にも適用可能
である。従って、本発明の免疫学的測定法は、心疾患お
よび腎疾患、その他の循環器系疾患の診断に非常に有用
である。The immunological assay method of the present invention is superior to the conventional competitive method in accuracy, convenience, and rapidity, and has high sensitivity. In addition, N-peptide is more stable than α-hANP, and it is considered that the immunological activity is less likely to decrease due to the operation of collecting a sample, and it is also applicable to the non-RIA method. Therefore, the immunological assay method of the present invention is very useful for diagnosis of heart disease, renal disease and other cardiovascular diseases.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】Ａは、既存のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ
−IIIのＮ−ペプチド(1-25)およびＮ−ペプチド(43-67)
への反応性を示すグラフであり、そしてＢは、本発明の
モノクローナル抗体７Ｂ６のＮ−ペプチド(1-25)および
Ｎ−ペプチド(43-67)への反応性を示すグラフである。FIG. 1A shows the existing monoclonal antibody KY-ANP.
-III N-peptide (1-25) and N-peptide (43-67)
And B is a graph showing the reactivity of the monoclonal antibody 7B6 of the present invention with N-peptide (1-25) and N-peptide (43-67).

【図２】本発明のサンドイッチＲＩＡ法におけるＮ−ペ
プチドの標準曲線を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing a standard curve of N-peptide in the sandwich RIA method of the present invention.

【図３】本発明のサンドイッチＲＩＡ法による臨床試料
の希釈試験の結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of a dilution test of clinical samples by the sandwich RIA method of the present invention.

【図４】本発明のサンドイッチＥＩＡ法におけるＮ−ペ
プチドの標準曲線を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing a standard curve of N-peptide in the sandwich EIA method of the present invention.

【図５】本発明のサンドイッチＥＩＡ法による臨床試料
の希釈試験の結果を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the results of a dilution test of clinical samples by the sandwich EIA method of the present invention.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 福永 隆博 大阪府大阪市東淀川区豊里２−１−７− 1308 (72)発明者 谷口 靖 大阪府高槻市上田辺町６−24−510Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number in the agency FI technical display location // (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Takahiro Fukunaga 2-Toyosato, Higashiyodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka 1-7-1308 (72) Inventor Yasushi Taniguchi 6-24-510 Uetanabecho, Takatsuki City, Osaka Prefecture

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 Ｎ−ペプチドまたはその前駆体を測定す
る方法であって、 試料と、Ｎ−ペプチドを認識する第１のモノクローナル
抗体とをインキュベートする工程、 さらにＮ−ペプチドを認識する標識した第２のモノクロ
ーナル抗体を加えてインキュベートする工程、および生
成した抗原抗体複合体を検出する工程、を包含する方
法。1. A method for measuring an N-peptide or a precursor thereof, comprising the step of incubating a sample with a first monoclonal antibody that recognizes the N-peptide, further comprising a labeled first antibody that recognizes the N-peptide. A method comprising the steps of adding 2 monoclonal antibodies and incubating, and detecting the formed antigen-antibody complex. 【請求項２】 Ｎ−ペプチドまたはその前駆体を測定す
る方法であって、 試料と、Ｎ−ペプチドを認識する第１のモノクローナル
抗体およびＮ−ペプチドを認識する標識した第２のモノ
クローナル抗体とをインキュベートする工程、および生
成した抗原抗体複合体を検出する工程、を包含する方
法。2. A method for measuring N-peptide or a precursor thereof, comprising: a sample; a first monoclonal antibody that recognizes the N-peptide and a labeled second monoclonal antibody that recognizes the N-peptide. Incubating, and detecting the produced antigen-antibody complex. 【請求項３】 前記第１または第２のモノクローナル抗
体が、Ｎ−ペプチドの４３位から６６位のアミノ酸配列
に含まれる部分を認識する、請求項１または２に記載の
方法。3. The method according to claim 1 or 2, wherein the first or second monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence at positions 43 to 66 of N-peptide. 【請求項４】 前記第１または第２のモノクローナル抗
体が７Ｂ６である、請求項３に記載の方法。4. The method of claim 3, wherein the first or second monoclonal antibody is 7B6. 【請求項５】 前記第１または第２のモノクローナル抗
体のいずれか一方が、前記７Ｂ６であり、他方のモノク
ローナル抗体が該７Ｂ６の認識部位とは異なるＮ−ペプ
チドのアミノ酸配列に含まれる部分を認識するモノクロ
ーナル抗体である、請求項４に記載の方法。5. One of the first and second monoclonal antibodies is the 7B6, and the other monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence of an N-peptide different from the recognition site of the 7B6. The method according to claim 4, wherein the method is a monoclonal antibody. 【請求項６】 前記第１または第２のモノクローナル抗
体のいずれか一方が、Ｎ−ペプチドの４３位から６６位
のアミノ酸配列に含まれる部分を認識し、他方のモノク
ローナル抗体が、Ｎ−ペプチドの１位から２５位のアミ
ノ酸配列に含まれる部分を認識する、請求項３に記載の
方法。6. One of the first and second monoclonal antibodies recognizes a portion contained in the amino acid sequence from the 43rd position to the 66th position of the N-peptide, and the other monoclonal antibody binds to the N-peptide. The method according to claim 3, wherein a portion contained in the amino acid sequence from positions 1 to 25 is recognized. 【請求項７】 前記他方のモノクローナル抗体がＫＹ−
ＡＮＰ−IIIである、請求項６に記載の方法。7. The other monoclonal antibody is KY-
The method according to claim 6, which is ANP-III. 【請求項８】 前記第１のモノクローナル抗体がＮ−ペ
プチドの１位から２５位のアミノ酸配列に含まれる部分
を認識し、前記第２のモノクローナル抗体がＮ−ペプチ
ドの４３位から６６位のアミノ酸配列に含まれる部分を
認識する、請求項６に記載の方法。8. The first monoclonal antibody recognizes a portion contained in the amino acid sequence of positions 1 to 25 of the N-peptide, and the second monoclonal antibody binds to amino acids of positions 43 to 66 of the N-peptide. The method according to claim 6, wherein the portion included in the sequence is recognized. 【請求項９】 前記第１のモノクローナル抗体がＫＹ−
ＡＮＰ−IIIであり、前記第２のモノクローナル抗体が
７Ｂ６である、請求項８に記載の方法。9. The first monoclonal antibody is KY-
9. The method of claim 8, which is ANP-III and wherein the second monoclonal antibody is 7B6. 【請求項１０】 前記第２のモノクローナル抗体が、放
射性同位元素、酵素、金コロイド、蛍光物質、または発
光物質で標識されている、請求項１または２に記載の方
法。10. The method according to claim 1, wherein the second monoclonal antibody is labeled with a radioisotope, an enzyme, a colloidal gold, a fluorescent substance, or a luminescent substance. 【請求項１１】 前記第２のモノクローナル抗体が、放
射性同位元素または酵素で標識されている、請求項１０
に記載の方法。11. The second monoclonal antibody is labeled with a radioisotope or an enzyme.
The method described in. 【請求項１２】 Ｎ−ペプチドの４３位から６６位のア
ミノ酸配列に含まれる部分を認識するモノクローナル抗
体。12. A monoclonal antibody which recognizes a portion contained in the amino acid sequence of positions 43 to 66 of N-peptide. 【請求項１３】 前記モノクローナル抗体が７Ｂ６であ
る、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。13. The monoclonal antibody according to claim 12, wherein the monoclonal antibody is 7B6. 【請求項１４】 請求項１２または１３に記載のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。14. A hybridoma which produces the monoclonal antibody according to claim 12 or 13. 【請求項１５】 前記ハイブリドーマがMouse hybridom
a 7B6（ＦＥＲＭＢＰ−４８７８）である、請求項１４
に記載のハイブリドーマ。15. The hybridoma is a Mouse hybridom
a 7B6 (FERM BP-4878),
The hybridoma according to the above. 【請求項１６】 請求項１２または１３に記載のモノク
ローナル抗体を含む、Ｎ−ペプチドまたはその前駆体の
免疫学的測定用キット。16. A kit for immunologically measuring an N-peptide or a precursor thereof, which comprises the monoclonal antibody according to claim 12 or 13.