JPH0822231B2

JPH0822231B2 - Ｄ−アラニンの製造方法

Info

Publication number: JPH0822231B2
Application number: JP11355288A
Authority: JP
Inventors: 健次左右田; 貞夫蔭山
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1988-05-12
Filing date: 1988-05-12
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPH01285192A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、抗生物質の修飾剤や合成甘味料の原料等と
して極めて有用な、Ｄ−アラニンの製造方法に関する。

（従来技術）従来、酵素法によりＤ−アラニンを製造する方法とし
ては、５−置換ヒダントインにＤ−ヒダントイナーゼを
作用させる方法（特公昭56−1909号）やＮ−アセチル−
Ｄ−アラニンにＤ−アミノアシラーゼを作用させる方法
（特公昭53−36035号）、ピルビン酸とＤ−アミノ酸に
Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｄ−アラニンアミノ
トランスフェラーゼ;EC2.6.1.21;以下、Ｄ−ATAと示
す）を作用させる方法などが知られている。

（発明が解決しようとする課題）しかしこれらの方法は使用される基質が高価なもので
あり、経済的に優れた方法であるとはいえない。

例えば、Ｄ−ATAを利用してＤ−アラニンを製造する
場合、基質としてピルビン酸とアミノ基供与体Ｄ−アミ
ノ酸が反応に供されるが、そのアミノ基供与体Ｄ−アミ
ノ酸はピルビン酸に対し過剰量必要である。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、Ｄ−ATAを利用し、安価な原料からＤ
−アラニンを製造する方法を確立するべく鋭意研究した
結果、DL−アスパラギン酸がアミノ基供与体とピルビン
酸供給源の二つの役割を果たすものとして利用できるこ
とに着目し、本発明を完成させた。

即ち本発明は、微量のピルビン酸の存在下、Ｄ−ATA
の作用により、DL−アスパラギン酸からＤ−アラニンを
製造する方法である。

本発明は次の第１式に示すことができる。

つまり、基質のDL−アスパラギン酸のＤ−アスパラギ
ン酸がＤ−ATAの作用により微量のピルビン酸と反応
し、Ｄ−アラニンとオキサロ酢酸を生成する。生成した
オキサロ酢酸は化学的に不安定なため、自然に脱炭酸さ
れピルビン酸を生じる。従って、Ｄ−ATAの平衡定数が
約１であるにもかかわらず、生成物のオキサロ酢酸が蓄
積しないため、反応はＤ−アラニンの生成する方向に進
む。さらにオキサロ酢酸の脱炭酸によって生じたピルビ
ン酸は、原料ケト酸として再利用される。

本発明に使用されるＤ−ATAは、Ｄ−ATA生産能を有す
る微生物、植物などより調製することができ、その起源
は特に限定されないが、具体的にはバチルス・エスピー
（Bacillus sp.）YM−１株（微工研菌寄第8057号）より
得られるＤ−ATA（特開昭61−187786号）等を挙げるこ
とができる。

これらの起源よりＤ−ATAを調製して本発明の反応に
使用し、光学純度の高いＤ−アラニンを得るためには、
その微生物、植物がＤ−ATA以外に生産している酵素の
うち、Ｄ−アラニンの光学純度を低下させる原因となる
もの、例えば、Ｌ−アスパラギン酸を脱炭酸しＬ−アラ
ニンを生成するアスパラギン酸β−脱炭酸酵素や、Ｄ−
アラニンをラセミ化するアラニンラセマーゼを精製によ
って除去するか、或いは、阻害剤，熱,pH等に対する感
受性の差を利用して失活させる必要がある。例えば、バ
チルス・エスピーYM−１株由来のＤ−ATAをコードする
遺伝子を含有するプラスミドpICT113（特願昭62−39173
号）で形質転換したエシェリヒア・コリ（Esherichia c
oli）を用いると、このＤ−ATAは熱安定性が高いのでエ
シェリヒア・コリが生産するＤ−アラニンの光学純度を
低下させる原因となるアラニンラセマーゼ等を熱処理の
みで失活させることができ好適である。

本発明の反応において基質となるDL−アスパラギン酸
は50〜1000mM、好ましくは200mM程度、ピルビン酸は0.1
〜10mM、好ましくは1mM程度、Ｄ−ATAは0.1〜10U/ml、
好ましくは1U/ml程度の濃度で添加される。また、補酵
素であるピリドキサール５′−リン酸（以下、PLPと示
す）は、必要に応じて50μＭ程度添加される。

反応温度および反応液のpHは、用いるＤ−ATAの至適
温度および至適pHに合わせて調整されるが、25〜60℃、
pH5〜９の範囲が好ましい。

反応は通常４〜48時間行われるが、他の条件に応じて
適当に変えることもできる。

反応液からのＤ−アラニンの採取は、例えば反応液を
トリクロロ酢酸などにより除タンパクした後、カチオン
交換クロマトグラフィーによりＤ−アラニンを溶出さ
せ、等電点沈澱により結晶化させる方法により行なうこ
とができる。

以下、実施例を以て本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

（実施例）実施例（１）Ｄ−ATAをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドpICT111の構築バチルス・エスピーYM−１を表−１に示す培地で55
℃、６時間培養した後集菌し、菌体6.0gを得た。

次に得られた菌体より斎藤−三浦法に従って染色体DN
Aを抽出し、これをHind III（寳酒造製）によって３時
間消化して１〜10KbのDNA断片を得た。

続いて、プラスミドpBR322 ３μｇをHind IIIによっ
て完全消化し、これを先に得られた染色体からのDNA断
片とT4DNAリガーゼ（寳酒造製）によって連結し、この
反応液をエタノール沈澱により濃縮した。

この濃縮液を用いて、マンデル−ヒガ（Mandel−Hig
a）の方法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（J.Mol、Biol.），53,159（1970））によりエシ
ェリヒア・コリC600を形質転換した。

形質転換株の中からＤ−ATAをコードする遺伝子を含
有するプラスミドを有する株を選択するために、形質転
換株を表−２に示す組成の最少培地の寒天上で培養し
た。目的の株は窒素源としてＤ−グルタミン酸資化性を
獲得するため、目的の株のみがこの培地上で生育可能で
あり、生育した株は約100コロニーであった。

次にin situにおけるＤ−ATA活性を確認するため、
ラエツ（Raetz）らの方法（プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），72,2274（1975））
を一部改変した以下に示す方法に従って活性染色を行な
った。即ち、プレート上に生育させた約100コロニーか
らフィルター上にレプリカを作成し、リゾチーム処理
（リゾチーム溶液（10mg/ml）2ml中で室温にて30分間）
し、余分な水分を除去した後、1mlの呼吸鎖阻害液（20m
M NaN₃、1mM KF、1mM Na₂HAsO₄、4mMトリス−塩酸緩
衝液（pH7.4））を添加し、２度凍結、融解し、溶菌し
た。

続いてこれを70℃で20分間処理した後、表−３に示す
反応液を1.5ml添加し、50℃で10分間反応させた。これ
によってＤ−ATA活性を有する株は青色を呈するため、
強い青色を呈したコロニーを１株選択した。この株が含
有しているプラスミドをpICT111とした。

次に、pICT111をオカの方法（ジャーナルオブバ
クテリオロジー（J.Bacteriol.），133,916（1978））
に従い単離し、Pst I、EcoR I、Ban III、Hind III、Sa
l I（寳酒造製）によりマッピングを行なった。pICT111
の制限酵素切断地図を第１図に示す。

（２）pICT111のサブクローニング pICT111をエイチ．シー．バーンボイン・アンド・ジ
ェイ・ドーリー（H.C.Birnboin and J.Doly）の方法
（ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucreic Acids
Research），７,1513（1979））に従い単離し、EcoR
I（寳酒造製）で完全消化し、アガロースゲル電気泳動
後、約1.7KbのEcoR I−EcoR I断片を含むゲルを切り出
し、DNA断片を溶出した。

プラスミドpUC18をEcoR Iで完全消化し、これを精製
したpICT111EcoR I−EcoR I断片とT4DNAリガーゼにより
連結し、この連結されたプラスミドでエシェリヒア・コ
リJM103を形質転換し、形質転換株をイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド、５−クロロ−４−ブ
ロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトース及びアン
ピシリンを含むＬ培地上で培養した。ここでＤ−ATA活
性を有する株は青色を呈さないので青色でない株を選択
した。この株が含有しているプラスミドをpICT113とし
た。

次にpICT113をオカの方法に従い単離し、Pst I、EcoR
I、BanI II、Hind III、Sa lIによりマッピングを行な
った。pICT113の制限酵素切断地図を第２図に示す。

pICT113をエイチ．シー．バーンボイン・アンド・ジ
ェイ・ドーリーの方法に従い単離した。

（３）pICT113を含むエシェリヒア・コリ；エシェリヒ
ア・コリHB101（pICT113）の創製および該菌体からのＤ
−ATA酵素液の採取ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.），53,159−162（1970）に記載の方法に従っ
て、０℃付近で塩化カルシウム処理したエシェリヒア・
コリHB101をプラスミドpICT113と接触させることによっ
て形質転換した。

次に菌株をアンピシリン含有YT培地（ペプトン1g,酵
母エキス0.5g,NaCl0.5g,アンピシリン5g/100ml、pH7.
2）750mlで37℃、一晩培養し、遠心分離により菌体を回
収した。

回収した菌体2.2gを、10mMリン酸カリウム緩衝液pH7.
2,0.01％２−メルカプトエタノール,50μＭ PLP5mlに
懸濁した。

超音波により菌体を破砕した後、15,000rpmで20分間
遠心分離して上清を回収し、無細胞抽出液を調製した。

得られた無細胞抽出液を65℃で30分間熱処理し、遠心
分離により上清を得、酵素液とした。

この酵素液のＤ−ATA活性は、以下の方法により測定
した。

トリス−塩酸緩衝液（pH8.1）50μmol,PLP50nmol,α
−ケトグルタル酸10μmol,D−アラニン25μmol,乳酸脱
水素酵素（ベーリンガーマンハイム山ノ内製）5U,NADH
0.2μmol,および酵素を含む1mlの反応液を50℃でキュベ
ット中で反応させ、NADHの減少に由来する340nmにおけ
る吸光度の減少を測定した。尚、ここで1Uは、この条件
下１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とし
た。

その結果、酵素液のＤ−ATAの比活性は23.4U/mg−タ
ンパク質であった。

（４）得られたＤ−ATA酵素液を用いたＤ−アラニンの
製造Ｄ−ATA10U,HEPEP−KOH緩衝液（pH7.0）50μmol,DL−
アスパラギン酸200μmol,ピルビン酸１μmol,PLP50nmol
を含む反応液1mlを50℃で48時間反応させた。

反応液に12％トリクロル酢酸を100μ添加すること
により反応を停止させ、反応液の一部についてアミノ酸
自動分析計にて生成アラニン量を測定した。その結果、
生成したアラニンは、79.4μmolであり、基質Ｄ−アス
パラギン酸からのアラニンへの転化率は79.4％であっ
た。

得られたアラニンの光学純度を、アラニン中に混在す
るＬ−アラニンをＬ−アラニン脱水素酵素により選択的
に分解し、生成するNADH量を測定することによって求め
た。その結果、生成したアラニンの99％以上がＤ体であ
った。

表−１ポリペプトン 0.5 ％酵母エキス 0.25％肉エキス 0.2 ％グリセロール 0.5 ％ KH₂PO₄ 0.2 ％ K₂HPO₄ 0.2 ％ NaCl 0.05％ MgSO₄・7H₂O 0.01％ DL−アラニン 0.3 ％Ｌ−グルタミン酸 0.2 ％ビオチン４×10^-7％ 700ml pH 7.2 表−２チアミン 1 mg Ｌ−ロイシン 10 mg Ｌ−スレオニン 20 mg MgSO₄・7H₂O 50 mg MnCl2・4H2O 5 mg FeSO4・7H2O 0.25ng CaCl2 0.5 mg 酵母エキス 0.5 mg リン酸カリウム緩衝液（pH7.2） 20 mmol アンピシリン 25 mg Ｄ−グルタミン酸 4 g ピルビン酸 1 g 1 表−３トリス−塩酸緩衝液（pH8.3） 150 μmol Ｄ−システインスルフィン酸 1.5μmol α−ケトグルタル酸 15 μmol PLP 75 nmol フェナジンメトサルフェイト 150 nmol ニトロブル−テトラゾリウム 900 nmol （発明の効果）本発明により、経済的に優れた方法でＤ−アラニンを
製造することが可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpICT111の制限酵素切断地図であ
る。第２図は、プラスミドpICT113の制限酵素切断地図であ
る。図中部分は挿入された部分を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微量のピルビン酸の存在下、Ｄ−アミノ酸
トランスアミナーゼの作用により、DL−アスパラギン酸
からＤ−アラニンを製造する方法