JPH08208694A - シクロヘキサペプチドおよびそれらの混合物、それらの製造方法およびそれらの使用 - Google Patents
シクロヘキサペプチドおよびそれらの混合物、それらの製造方法およびそれらの使用Info
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- JPH08208694A JPH08208694A JP7322652A JP32265295A JPH08208694A JP H08208694 A JPH08208694 A JP H08208694A JP 7322652 A JP7322652 A JP 7322652A JP 32265295 A JP32265295 A JP 32265295A JP H08208694 A JPH08208694 A JP H08208694A
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 診断剤、アレルギーおよび感染症の治療また
は予防のための医薬、またはインターロイキン−４（Ｉ
Ｌ−４）のＩＬ−４受容体への結合を阻害するための科
学的ツールとして有用なシクロヘキサペプチドの提供。 【解決手段】 本シクロヘキサペプチドは次の式Ｉ シクロ（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−（Ｄ）−Ａｌａ） （Ｉ） （式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、相互に独立的に同
一であっても相異なっていてもよく、そしてシステイン
（Ｃｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）以外の天然
アミノ酸の残基である）で示される。
は予防のための医薬、またはインターロイキン−４（Ｉ
Ｌ−４）のＩＬ−４受容体への結合を阻害するための科
学的ツールとして有用なシクロヘキサペプチドの提供。 【解決手段】 本シクロヘキサペプチドは次の式Ｉ シクロ（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−（Ｄ）−Ａｌａ） （Ｉ） （式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、相互に独立的に同
一であっても相異なっていてもよく、そしてシステイン
（Ｃｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）以外の天然
アミノ酸の残基である）で示される。
Description
【０００１】本発明は、式Ｉ シクロ（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−(Ｄ)−Ａｌａ） (Ｉ) （式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、相互に独立的に同
一であっても相異なっていてもよく、そしてシステイン
（Ｃｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）以外の天然
アミノ酸の残基であり、従ってアラニン（Ａｌａ）、ア
ルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパ
ラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン
（Ｓｅｒ）、トレオニン(Ｔｈｒ）、チロシン(Ｔｙｒ）
またはバリン(Ｖａｌ）であってよい)で示される化合物
およびそれらの生理学的に許容し得る塩に関する。
一であっても相異なっていてもよく、そしてシステイン
（Ｃｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）以外の天然
アミノ酸の残基であり、従ってアラニン（Ａｌａ）、ア
ルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパ
ラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン
（Ｓｅｒ）、トレオニン(Ｔｈｒ）、チロシン(Ｔｙｒ）
またはバリン(Ｖａｌ）であってよい)で示される化合物
およびそれらの生理学的に許容し得る塩に関する。
【０００２】式Ｉ（式中、ＡおよびＢは、相互に独立的
に同一であっても相異なってもよく、そしてＩｌｅ、Ｌ
ｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、またＣ、Ｄ
およびＥは、相互に独立的に、同一であっても相異なっ
てもよく、そしてシステインおよびトリプトファン以外
の天然アミノ酸の残基に相当する）の化合物が好まし
い。
に同一であっても相異なってもよく、そしてＩｌｅ、Ｌ
ｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、またＣ、Ｄ
およびＥは、相互に独立的に、同一であっても相異なっ
てもよく、そしてシステインおよびトリプトファン以外
の天然アミノ酸の残基に相当する）の化合物が好まし
い。
【０００３】次のペプチド配列： シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala）、 シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）、または シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala） （式中、ＸａａはＣｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ
酸の残基である）を示す式Ｉの化合物が更に好ましい。
酸の残基である）を示す式Ｉの化合物が更に好ましい。
【０００４】天然アミノ酸とは、遊離状態でまたはタン
パク質の構造単位として天然に存在する、例えばBell
（FEBS Letters 64 (1976) 29-35）などに記載されてい
るような、すべてのα−アミノ酸を意味する。タンパク
質中に天然に存在するアミノ酸の場合には、天然アミノ
酸とはＬ−アミノ酸（グリシンは例外である）を意味す
る。（Ｄ）−ＡｌａはＤ配置のアミノ酸アラニンの残基
に相当する。ペプチドとは、ペプチド結合により相互に
連結されたアミノ酸の配列を意味しそしてＮ−末端とＣ
−末端を有する。括弧でくくられたアミノ酸配列は、最
初のアミノ酸のＮ−末端（アミノ基）が最後のアミノ酸
のＣ−末端（ＣＯＯＨ基）に連結されたシクロペプチド
の記述である。
パク質の構造単位として天然に存在する、例えばBell
（FEBS Letters 64 (1976) 29-35）などに記載されてい
るような、すべてのα−アミノ酸を意味する。タンパク
質中に天然に存在するアミノ酸の場合には、天然アミノ
酸とはＬ−アミノ酸（グリシンは例外である）を意味す
る。（Ｄ）−ＡｌａはＤ配置のアミノ酸アラニンの残基
に相当する。ペプチドとは、ペプチド結合により相互に
連結されたアミノ酸の配列を意味しそしてＮ−末端とＣ
−末端を有する。括弧でくくられたアミノ酸配列は、最
初のアミノ酸のＮ−末端（アミノ基）が最後のアミノ酸
のＣ−末端（ＣＯＯＨ基）に連結されたシクロペプチド
の記述である。
【０００５】式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される
塩とは、Remington's Pharmaceutical Sciences (17
版，1418ページ（1985））に記載されているような無機
塩および有機塩の両方を意味する。適切な塩は特に、ア
ルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、生理学的に許容
し得るアミンとの塩および、無機または有機酸、例えば
ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸またはフマール
酸、との塩である。
塩とは、Remington's Pharmaceutical Sciences (17
版，1418ページ（1985））に記載されているような無機
塩および有機塩の両方を意味する。適切な塩は特に、ア
ルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、生理学的に許容
し得るアミンとの塩および、無機または有機酸、例えば
ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸またはフマール
酸、との塩である。
【０００６】式（Ｉ）で示される前記化合物はペプチド
化学において慣用される一般的に知られている方法によ
り合成され得るシクロヘキサペプチドである。それらシ
クロヘキサペプチドは、例えば ａ） 適当に保護されたアミノ酸誘導体を固体支持体に
カップリングさせ、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断
し、 ｃ） そのペプチドを溶液中で環化し、 ｄ） 側鎖保護基を除去することにより合成される。
化学において慣用される一般的に知られている方法によ
り合成され得るシクロヘキサペプチドである。それらシ
クロヘキサペプチドは、例えば ａ） 適当に保護されたアミノ酸誘導体を固体支持体に
カップリングさせ、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断
し、 ｃ） そのペプチドを溶液中で環化し、 ｄ） 側鎖保護基を除去することにより合成される。
【０００７】適当なアミノ酸保護基は、ペプチド合成に
慣用的に用いられそして例えばKontakte Merck 3/79, p
p. 14-22および1/80, pp. 23-35に記載されているよう
な保護基である。アミノ官能基保護のためのウレタン基
の例は、Ｐｙｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｆｃｂｏｃ、Ｚ、Ｂｏ
ｃ、Ｄｄｚ、Ｂｐｏｃ、Ｚ−(ＮＯ2)、Ｄｏｂｚ、Ｍｏ
ｃ、Ｍｂｏｃ、Ｉｂｏｃ、Ａｄｏｃ、Ａｄｐｏｃ、Ｍｓ
ｃまたはＰｉｏｃである。これらのアミノ酸保護基は、
酸、塩基を用いてまたは還元的に除去される。グアニジ
ノ基保護のための基の例はＮＯ2、トシル、Ｂｏｃ、
Ｚ、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）などであ
る。それらは、加水分解的にまたは水素添加分解的に除
去することができる。
慣用的に用いられそして例えばKontakte Merck 3/79, p
p. 14-22および1/80, pp. 23-35に記載されているよう
な保護基である。アミノ官能基保護のためのウレタン基
の例は、Ｐｙｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｆｃｂｏｃ、Ｚ、Ｂｏ
ｃ、Ｄｄｚ、Ｂｐｏｃ、Ｚ−(ＮＯ2)、Ｄｏｂｚ、Ｍｏ
ｃ、Ｍｂｏｃ、Ｉｂｏｃ、Ａｄｏｃ、Ａｄｐｏｃ、Ｍｓ
ｃまたはＰｉｏｃである。これらのアミノ酸保護基は、
酸、塩基を用いてまたは還元的に除去される。グアニジ
ノ基保護のための基の例はＮＯ2、トシル、Ｂｏｃ、
Ｚ、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）などであ
る。それらは、加水分解的にまたは水素添加分解的に除
去することができる。
【０００８】ＣＯＯＨ側鎖官能基は、アルキルエステ
ル、好ましくはメチル、エチルまたはｔｅｒｔ−ブチル
エステルとして、またはベンジルエステルまたは修飾さ
れたベンジルエステル（特にｐ−ＮＯ2、ｐ−Ｃｌ、ｐ
−Ｂｒ）としてブロックされる。それらはアルカリまた
は酸加水分解によりまたは水素添加により脱ブロックさ
れる。ヒドロキシル保護基の例はｔｅｒｔ−ブチルまた
はベンジルである。
ル、好ましくはメチル、エチルまたはｔｅｒｔ−ブチル
エステルとして、またはベンジルエステルまたは修飾さ
れたベンジルエステル（特にｐ−ＮＯ2、ｐ−Ｃｌ、ｐ
−Ｂｒ）としてブロックされる。それらはアルカリまた
は酸加水分解によりまたは水素添加により脱ブロックさ
れる。ヒドロキシル保護基の例はｔｅｒｔ−ブチルまた
はベンジルである。
【０００９】本発明は更に、式（Ｉ）のシクロヘキサペ
プチドの混合物に関する。前述のシクロヘキサペプチド
は、いわゆる「組合せ合成法（combinatorial synthesi
s techniques）」を用いて混合物の形で合成できる。Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ ９２／００００９１は容易に「ペプチド
ライブラリー」の合成に使用できる組合せ合成法を開示
している。
プチドの混合物に関する。前述のシクロヘキサペプチド
は、いわゆる「組合せ合成法（combinatorial synthesi
s techniques）」を用いて混合物の形で合成できる。Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ ９２／００００９１は容易に「ペプチド
ライブラリー」の合成に使用できる組合せ合成法を開示
している。
【００１０】式Ｉの化合物の混合物は、前掲ステップ
ａ）〜ｄ）に従って調製され得る。しかしながら、組合
せ合成法を用いれば式Ｉのすべての可能なシクロヘキサ
ペプチドを特異的に合成する必要がない（ここに記載の
シクロヘキサペプチドの場合、それは結局、ほぼ１９０
万（１８5）種類の異なる化合物または合成数である)。
そうする代りに、各合成サイクルにつき１８種類の異な
るアミノ酸全てを同時に添加することにより、式Ｉのシ
クロヘキサペプチドの混合物を調製することができる。
従来合成法と比べた場合のこの方法の長所は明白であ
る。すなわち、例えば、実際に式Ｉで示される１９０万
種類の可能なシクロヘキサペプチド全てを含むペプチド
混合物が、各場合に所望のアミノ酸全てを同時使用して
わずか５回だけ合成サイクルを経由させた後わずか１回
の合成で環化した後に得られる。
ａ）〜ｄ）に従って調製され得る。しかしながら、組合
せ合成法を用いれば式Ｉのすべての可能なシクロヘキサ
ペプチドを特異的に合成する必要がない（ここに記載の
シクロヘキサペプチドの場合、それは結局、ほぼ１９０
万（１８5）種類の異なる化合物または合成数である)。
そうする代りに、各合成サイクルにつき１８種類の異な
るアミノ酸全てを同時に添加することにより、式Ｉのシ
クロヘキサペプチドの混合物を調製することができる。
従来合成法と比べた場合のこの方法の長所は明白であ
る。すなわち、例えば、実際に式Ｉで示される１９０万
種類の可能なシクロヘキサペプチド全てを含むペプチド
混合物が、各場合に所望のアミノ酸全てを同時使用して
わずか５回だけ合成サイクルを経由させた後わずか１回
の合成で環化した後に得られる。
【００１１】しかしながら、今記載した方法とは別の選
択肢として、アミノ酸混合物を全ての合成サイクルにお
いて添加する必要はない。例えば１回の合成サイクル後
に、その上でペプチド混合物が合成された支持体物質を
分画しそして以後の別個の合成反応において特定位置に
所望のアミノ酸を挿入することができる。
択肢として、アミノ酸混合物を全ての合成サイクルにお
いて添加する必要はない。例えば１回の合成サイクル後
に、その上でペプチド混合物が合成された支持体物質を
分画しそして以後の別個の合成反応において特定位置に
所望のアミノ酸を挿入することができる。
【００１２】前記方法を用いてペプチド混合物を調製し
た後、生物活性を有するペプチドを検出する必要があ
り、またそれらの配列を同定する必要がある。これは、
一例として、式Ａ シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ） （Ａ） で示されるシクロペプチド類含有混合物を用いた後記の
反復再合成法を用いて行うことができる。この混合物
は、（ＣｙｓまたはＴｒｐ以外の）全ての天然アミノ酸
によって占められた三つの可変位置（Ｘ）を有するシク
ロヘキサペプチドを含有する。残りの位置は規定された
アミノ酸（Ｏ）によって占められる（これらも同じくＣ
ｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ酸である）。一つの
位置は常にＤ−Ａｌａである。
た後、生物活性を有するペプチドを検出する必要があ
り、またそれらの配列を同定する必要がある。これは、
一例として、式Ａ シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ） （Ａ） で示されるシクロペプチド類含有混合物を用いた後記の
反復再合成法を用いて行うことができる。この混合物
は、（ＣｙｓまたはＴｒｐ以外の）全ての天然アミノ酸
によって占められた三つの可変位置（Ｘ）を有するシク
ロヘキサペプチドを含有する。残りの位置は規定された
アミノ酸（Ｏ）によって占められる（これらも同じくＣ
ｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ酸である）。一つの
位置は常にＤ−Ａｌａである。
【００１３】シクロペプチドＡの混合物は、前述の如
く、１８種全部のアミノ酸の混合物を用いて合成サイク
ルを３回行い、次いでペプチド混合物を結合させたまま
支持体物質を分画し、次いで式Ａのシクロペプチド混合
物を３２４（１８×１８）回の別個の合成として調製す
ることにより調製され得る。これら３２４種類の混合物
は各々約５８００（１８3）種類の異なるペプチドを含
有する。バイオアッセイ（後記参照）で活性があること
がわかった３２４種類の混合物の各々を選び出し、そし
て更なる規定された位置の新たな挿入を伴う反復再合成
によりその複雑さを制限する。反復再合成の各相には１
８の新しい合成工程が必要である。最後に得られた規定
構造のシクロヘキサペプチドの作用をバイオアッセイで
テストすることにより確認する。以下のスキームは今記
述したばかりの手順を明確にするものである。
く、１８種全部のアミノ酸の混合物を用いて合成サイク
ルを３回行い、次いでペプチド混合物を結合させたまま
支持体物質を分画し、次いで式Ａのシクロペプチド混合
物を３２４（１８×１８）回の別個の合成として調製す
ることにより調製され得る。これら３２４種類の混合物
は各々約５８００（１８3）種類の異なるペプチドを含
有する。バイオアッセイ（後記参照）で活性があること
がわかった３２４種類の混合物の各々を選び出し、そし
て更なる規定された位置の新たな挿入を伴う反復再合成
によりその複雑さを制限する。反復再合成の各相には１
８の新しい合成工程が必要である。最後に得られた規定
構造のシクロヘキサペプチドの作用をバイオアッセイで
テストすることにより確認する。以下のスキームは今記
述したばかりの手順を明確にするものである。
【００１４】三つの規定位置を有するペプチド： シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ） １． 特異的バイオアッセイ（３２４回のテスト） ２． 活性混合物の同定 ３． 四つの規定位置を有するペプチドの合成（１８
回）
回）
【００１５】四つの規定位置を有するペプチド： シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ） １． 特異的バイオアッセイ（１８回のテスト） ２． 活性混合物の同定 ３． 五つの規定位置を有するペプチドの合成（１８
回）
回）
【００１６】五つの規定位置を有するペプチド： シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｏ4−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ) １． 特異的バイオアッセイ（１８回のテスト） ２． 活性混合物の同定 ３． 六つの規定位置を有するペプチドの合成（１８
回）
回）
【００１７】六つの規定位置を有するペプチド： シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｏ4−Ｏ5−（Ｄ）−Ａｌａ) １． 特異的バイオアッセイ（１８回のテスト） ２． 活性ペプチドの同定 原則として、シクロペプチドの混合物はまた、慣用の分
析方法例えば分取ＨＰＬＣまたはその他のクロマトグラ
フィー法などにより分画しまたは精製することもでき
る。
析方法例えば分取ＨＰＬＣまたはその他のクロマトグラ
フィー法などにより分画しまたは精製することもでき
る。
【００１８】今般、式Ｉのシクロヘキサペプチドまたは
それらの混合物がインターロイキン−４（ＩＬ）のＩＬ
−４受容体への結合を特異的に阻害し、そしてＩＬ−４
活性を抑制することがわかった。従って、これら新規物
質はＩＬ−４活性の有効な阻害剤である。これら新規化
合物またはそれらの混合物のＩＬ−４阻害作用は細胞不
含結合アッセイまたは細胞バイオアッセイで測定するこ
とができる。ドイツ特許出願ＤＥ ４３ ２２ ３３０ Ａ
１はＩＬ−４活性の抑制は、ＴＨ２型のＴヘルパー細胞
の出現増加に伴う疾病診断、治療提供および／または治
療に用いることができることを開示している。
それらの混合物がインターロイキン−４（ＩＬ）のＩＬ
−４受容体への結合を特異的に阻害し、そしてＩＬ−４
活性を抑制することがわかった。従って、これら新規物
質はＩＬ−４活性の有効な阻害剤である。これら新規化
合物またはそれらの混合物のＩＬ−４阻害作用は細胞不
含結合アッセイまたは細胞バイオアッセイで測定するこ
とができる。ドイツ特許出願ＤＥ ４３ ２２ ３３０ Ａ
１はＩＬ−４活性の抑制は、ＴＨ２型のＴヘルパー細胞
の出現増加に伴う疾病診断、治療提供および／または治
療に用いることができることを開示している。
【００１９】多くのアレルギー性、ウイルス性、寄生虫
性および細菌性疾病の治療および予防は依然として大き
な課題である。一部の寄生虫性、ウイルス性および細菌
性疾病の過程でリンパ球および単球細胞の亜集団に変化
が生じることが知られている。これは例えばいわゆる２
型Ｔヘルパー細胞（以下においてＴＨ２細胞と記す）が
出現増加する場合である。一般的に、Ｔ細胞は表面マー
カーに基づき、そしてそれらの機能に基づいて亜集団に
細分することができる。すなわち、Ｔヘルパーリンパ球
は例えばＣＤ４表面分子を有し、そして活性化された後
にサイトカインを分泌する。
性および細菌性疾病の治療および予防は依然として大き
な課題である。一部の寄生虫性、ウイルス性および細菌
性疾病の過程でリンパ球および単球細胞の亜集団に変化
が生じることが知られている。これは例えばいわゆる２
型Ｔヘルパー細胞（以下においてＴＨ２細胞と記す）が
出現増加する場合である。一般的に、Ｔ細胞は表面マー
カーに基づき、そしてそれらの機能に基づいて亜集団に
細分することができる。すなわち、Ｔヘルパーリンパ球
は例えばＣＤ４表面分子を有し、そして活性化された後
にサイトカインを分泌する。
【００２０】健常マウスからの、または同種細胞（allo
genic cell）で刺激したマウスからのクローン化Ｔヘル
パー細胞のサイトカインパターンを分析したところ、こ
れらのヘルパー細胞はインターロイキン−２、インター
ロイキン−４、ガンマインターフェロン、インターロイ
キン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−
１０およびリンホトキシンを産生することが示された
（いわゆるＴＨＯ型のＴヘルパー細胞）。
genic cell）で刺激したマウスからのクローン化Ｔヘル
パー細胞のサイトカインパターンを分析したところ、こ
れらのヘルパー細胞はインターロイキン−２、インター
ロイキン−４、ガンマインターフェロン、インターロイ
キン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−
１０およびリンホトキシンを産生することが示された
（いわゆるＴＨＯ型のＴヘルパー細胞）。
【００２１】例えば細菌抗原ブルセラ・アボルツス（Br
ucella abortus）またはマイコバクテリウム・ツベルク
ローシス（Mycobacterium tuberculosis）に感染したマ
ウスからのＴヘルパー細胞をクローン化したところ、大
部分のクローンはリンホトキシン、ガンマインターフェ
ロンおよびインターロイキン−２を分泌するがインター
ロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキ
ン−６またはインターロイキン−１０はほとんどまたは
全く分泌しないことが判った（いわゆるＴＨ１型のＴヘ
ルパー細胞）。
ucella abortus）またはマイコバクテリウム・ツベルク
ローシス（Mycobacterium tuberculosis）に感染したマ
ウスからのＴヘルパー細胞をクローン化したところ、大
部分のクローンはリンホトキシン、ガンマインターフェ
ロンおよびインターロイキン−２を分泌するがインター
ロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキ
ン−６またはインターロイキン−１０はほとんどまたは
全く分泌しないことが判った（いわゆるＴＨ１型のＴヘ
ルパー細胞）。
【００２２】例えば、リーシュマニア・メジャー（Leis
hmania major）などの寄生虫病原体に感染した高感受性
マウスに由来するＴヘルパー細胞をクローン化したとこ
ろ、出現したクローンの大部分の、インターロイキン−
４、インターロイキン−５およびインターロイキン−１
０の生産量は増加したがインターロイキン−２およびガ
ンマインターフェロンの生産量は減少するか検出し得な
かった（ＴＨ２型のＴヘルパー細胞）（Mosmann et al.
Immunological Review 1991, No. 123, 209-229; S. R
omagnani, Immunology Today, 256-257; Vol. 12, No.
8 1991）。
hmania major）などの寄生虫病原体に感染した高感受性
マウスに由来するＴヘルパー細胞をクローン化したとこ
ろ、出現したクローンの大部分の、インターロイキン−
４、インターロイキン−５およびインターロイキン−１
０の生産量は増加したがインターロイキン−２およびガ
ンマインターフェロンの生産量は減少するか検出し得な
かった（ＴＨ２型のＴヘルパー細胞）（Mosmann et al.
Immunological Review 1991, No. 123, 209-229; S. R
omagnani, Immunology Today, 256-257; Vol. 12, No.
8 1991）。
【００２３】このＴＨ２リンパ球出現の増加は、動物お
よび人間の一部の感染症において既に検出されており
（ElseおよびGrenic, Parasitology Today, Vol. 7, N
o. 11,1991, pp. 313-316; Parasitology Today, Vol.
7, No. 10, 1991, p. 261）、また二次的パラメータに
も反映されている。例えば、リーシュマニア・メジャー
に感染したマウスでは一般に、ガンマインターフェロン
生産は減少し血清ＩｇＥは激増しそして好酸球増加症を
示した。
よび人間の一部の感染症において既に検出されており
（ElseおよびGrenic, Parasitology Today, Vol. 7, N
o. 11,1991, pp. 313-316; Parasitology Today, Vol.
7, No. 10, 1991, p. 261）、また二次的パラメータに
も反映されている。例えば、リーシュマニア・メジャー
に感染したマウスでは一般に、ガンマインターフェロン
生産は減少し血清ＩｇＥは激増しそして好酸球増加症を
示した。
【００２４】一般に、例えば癩腫癩、リーシュマニア症
または住血吸虫症の患者、またはマイコバクテリウム・
ツベルクローシスに感染した患者の血清においては、健
常者の血清に認められる濃度に比べＩｇＥ濃度が激増し
た。寄生虫感染症の場合には、病気の過程で好酸球増加
症がしばしば認められる。このタイプの調節異常は、ア
トピー性皮膚炎および喘息などの即時型のＩｇＥ介在ア
レルギー反応の一特徴でもある。例えばアレルギー性皮
膚炎患者の生検標本由来の抗原特異的Ｔ細胞クローンは
概してＴＨ２型である（Kapsenbelg et al. Immunology
Today, Vol. 12, No. 11, 1991, 392-395）。
または住血吸虫症の患者、またはマイコバクテリウム・
ツベルクローシスに感染した患者の血清においては、健
常者の血清に認められる濃度に比べＩｇＥ濃度が激増し
た。寄生虫感染症の場合には、病気の過程で好酸球増加
症がしばしば認められる。このタイプの調節異常は、ア
トピー性皮膚炎および喘息などの即時型のＩｇＥ介在ア
レルギー反応の一特徴でもある。例えばアレルギー性皮
膚炎患者の生検標本由来の抗原特異的Ｔ細胞クローンは
概してＴＨ２型である（Kapsenbelg et al. Immunology
Today, Vol. 12, No. 11, 1991, 392-395）。
【００２５】本発明の新規化合物および混合物は、アレ
ルギー症および感染症、特にウイルス性、細菌性および
寄生虫性感染症のほか真菌性感染症；とくにヒト免疫不
全症ウイルス（ＨＩＶ）、マイコバクテリア、特にマイ
コバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）によ
る、リステリア類による、原虫、特にリーシュマニアお
よびプラスモジウム（Plasmodium）属による、蠕虫、特
に住血吸虫（Schistosoma）、ニッポストロンギルス（N
ippostrongylus）およびヘリグモソモイデス（Heligmos
omoides）属による、トリクリダ（Trichurida）、トリ
キネラ（Trichinella）、条虫（Taenia)（嚢尾虫（Cyst
icercus））、カンジダ（Candida）およびコウジカビ
（Aspergillus）による感染症の治療、予防と診断の両
方に適している。しかしながら、即時型のアレルギー反
応、特にＩｇＥ・介在反応も診断でき、治療できまたは
予防的処置ができる。これらには特にアトピー性皮膚炎
および喘息が含まれる。
ルギー症および感染症、特にウイルス性、細菌性および
寄生虫性感染症のほか真菌性感染症；とくにヒト免疫不
全症ウイルス（ＨＩＶ）、マイコバクテリア、特にマイ
コバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）によ
る、リステリア類による、原虫、特にリーシュマニアお
よびプラスモジウム（Plasmodium）属による、蠕虫、特
に住血吸虫（Schistosoma）、ニッポストロンギルス（N
ippostrongylus）およびヘリグモソモイデス（Heligmos
omoides）属による、トリクリダ（Trichurida）、トリ
キネラ（Trichinella）、条虫（Taenia)（嚢尾虫（Cyst
icercus））、カンジダ（Candida）およびコウジカビ
（Aspergillus）による感染症の治療、予防と診断の両
方に適している。しかしながら、即時型のアレルギー反
応、特にＩｇＥ・介在反応も診断でき、治療できまたは
予防的処置ができる。これらには特にアトピー性皮膚炎
および喘息が含まれる。
【００２６】一般に、投与剤形は病気が異なれば異な
る。例えば、一部の病気には局所投与が有益であり得
る。例えば、喘息の場合には吸入による投与が有益であ
る一方、結膜炎の場合には点眼剤の形での投与が有益で
あり、またアトピー性皮膚炎の場合には、特に病理学的
ＴＨ２細胞を局所的に検出できるので経皮または皮内投
与が有益である。本発明の新規ペプチド、またはそれら
の混合物は、一般に、インターロイキン−４（ＩＬ−
４）のＩＬ−４受容体への結合を阻害するための科学的
ツールとして用いることもできる。
る。例えば、一部の病気には局所投与が有益であり得
る。例えば、喘息の場合には吸入による投与が有益であ
る一方、結膜炎の場合には点眼剤の形での投与が有益で
あり、またアトピー性皮膚炎の場合には、特に病理学的
ＴＨ２細胞を局所的に検出できるので経皮または皮内投
与が有益である。本発明の新規ペプチド、またはそれら
の混合物は、一般に、インターロイキン−４（ＩＬ−
４）のＩＬ−４受容体への結合を阻害するための科学的
ツールとして用いることもできる。
【００２７】本発明は更に、式Ｉの化合物またはそれら
の混合物を含む薬学的調製物にも関する。それらの医薬
は、例えば、経口投与できる薬学的調製物の形で、例え
ば錠剤、被覆錠剤、硬または軟ゼラチンカプセル、溶
液、乳濁液または懸濁液の形で使用してもよい。適切な
場合にはタンパク質など更なる成分を含んでいてもよい
リポソーム中への医薬封入も同じく適切な投与剤形の一
つである。それらはまた直腸経由で、例えば坐薬の形
で、あるいは非経腸的に、例えば注射液の形で投与して
もよい。薬学的調製物の製造には、これらの化合物を治
療的に不活性な有機および無機賦形剤中に配合すること
ができる。錠剤、被覆錠剤および硬ゼラチンカプセルの
ためのこのような賦形剤の例は、ラクトース、コーンス
ターチまたはそれらの誘導体、獣脂およびステアリン酸
またはそれらの塩である。溶液の調製に適した賦形剤は
水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコース
である。注射液に適した賦形剤は水、アルコール、ポリ
オール、グリセロールおよび植物油である。坐薬に適し
た賦形剤は植物および硬化油、ろう、脂肪、および半液
体ポリオールである。それら薬学的調製物は防腐剤、溶
剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、甘味剤、色素、香味
剤、浸透圧調節用塩、緩衝剤、被覆剤、抗酸化剤および
他の治療活性化合物を適切な場合に含むこともできる。
の混合物を含む薬学的調製物にも関する。それらの医薬
は、例えば、経口投与できる薬学的調製物の形で、例え
ば錠剤、被覆錠剤、硬または軟ゼラチンカプセル、溶
液、乳濁液または懸濁液の形で使用してもよい。適切な
場合にはタンパク質など更なる成分を含んでいてもよい
リポソーム中への医薬封入も同じく適切な投与剤形の一
つである。それらはまた直腸経由で、例えば坐薬の形
で、あるいは非経腸的に、例えば注射液の形で投与して
もよい。薬学的調製物の製造には、これらの化合物を治
療的に不活性な有機および無機賦形剤中に配合すること
ができる。錠剤、被覆錠剤および硬ゼラチンカプセルの
ためのこのような賦形剤の例は、ラクトース、コーンス
ターチまたはそれらの誘導体、獣脂およびステアリン酸
またはそれらの塩である。溶液の調製に適した賦形剤は
水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコース
である。注射液に適した賦形剤は水、アルコール、ポリ
オール、グリセロールおよび植物油である。坐薬に適し
た賦形剤は植物および硬化油、ろう、脂肪、および半液
体ポリオールである。それら薬学的調製物は防腐剤、溶
剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、甘味剤、色素、香味
剤、浸透圧調節用塩、緩衝剤、被覆剤、抗酸化剤および
他の治療活性化合物を適切な場合に含むこともできる。
【００２８】本発明はまた、少なくとも一種類の式
（Ｉ）の化合物を、薬学的に適切で生理学的に許容され
る賦形剤および適切な場合には更なる適切な活性化合
物、添加剤および補助物質と共に、投与に適した剤形に
することより成る新規医薬の調製方法にも関する。好ま
しい投与形態は、経口および局所投与、例えばカテーテ
ルを用いた局所投与、あるいは注射である。
（Ｉ）の化合物を、薬学的に適切で生理学的に許容され
る賦形剤および適切な場合には更なる適切な活性化合
物、添加剤および補助物質と共に、投与に適した剤形に
することより成る新規医薬の調製方法にも関する。好ま
しい投与形態は、経口および局所投与、例えばカテーテ
ルを用いた局所投与、あるいは注射である。
【００２９】以下の（調製）例は、本発明をより詳しく
説明するためのものであって本発明の範囲をいささかも
限定しようとするものではない。以下の省略形を用い
た： 省略形： ＡＡ アミノ酸 ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー ＤＣＭ ジクロロメタン ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド ＤＩＰＥＡ シイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着剤アッセイ Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＰＬＣ 高圧（性能）液体クロマトグラフィー ｈｕＩＬ ヒトインターロイキン ＩＬ インターロイキン ｍｕＩＬ マウスインターロイキン ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水 ＰＢＳＡ ＰＢＳ中牛血清アルブミン ＴＢＴＵ ベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウ
ムテトラフルオロボレート ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
説明するためのものであって本発明の範囲をいささかも
限定しようとするものではない。以下の省略形を用い
た： 省略形： ＡＡ アミノ酸 ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー ＤＣＭ ジクロロメタン ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド ＤＩＰＥＡ シイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着剤アッセイ Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＰＬＣ 高圧（性能）液体クロマトグラフィー ｈｕＩＬ ヒトインターロイキン ＩＬ インターロイキン ｍｕＩＬ マウスインターロイキン ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水 ＰＢＳＡ ＰＢＳ中牛血清アルブミン ＴＢＴＵ ベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウ
ムテトラフルオロボレート ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
【００３０】シクロヘキサペプチドの合成 前述のシクロペプチドは個々のペプチドとしてあるいは
混合物として調製される。この合成は、 ａ） 適当に保護されたアミノ酸誘導体を固定支持体に
カップリングさせ、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断
し、 ｃ） そのペプチドを溶液中で環化し、 ｄ） 側鎖保護基を除去することにより行われる。
混合物として調製される。この合成は、 ａ） 適当に保護されたアミノ酸誘導体を固定支持体に
カップリングさせ、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断
し、 ｃ） そのペプチドを溶液中で環化し、 ｄ） 側鎖保護基を除去することにより行われる。
【００３１】ａ） 線状ペプチドまたはペプチド混合物
の合成 １３.１ｇのＥｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−トリチル樹脂を１
３１mlのジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣ
Ｍ／ＤＭＦ）（２：１）に懸濁し、そして０.４ml（４
０mg，０.０３２mmol）の樹脂懸濁液を用意された反応
容器にそれぞれピペットで添加する。反応容器はガラス
ウールで栓がされ、そして自動化多重ペプチド合成用装
置の合成ブロックに挿入されたエッポンドルフチップで
ある。必要なＦｍｏｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加
し、そしてカップリングは、ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：２）
中１.５Ｍ溶液として５倍過剰で添加されるジイソプロ
ピルカルボジイミド（ＤＩＣ）による系内活性化の後、
５倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸を用いて行われる。カップ
リング時間は５０分間である。規定されたペプチド混合
物は個々のペプチドで被覆された支持体（ポリマービー
ズ）を混合することにより得られる。
の合成 １３.１ｇのＥｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−トリチル樹脂を１
３１mlのジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣ
Ｍ／ＤＭＦ）（２：１）に懸濁し、そして０.４ml（４
０mg，０.０３２mmol）の樹脂懸濁液を用意された反応
容器にそれぞれピペットで添加する。反応容器はガラス
ウールで栓がされ、そして自動化多重ペプチド合成用装
置の合成ブロックに挿入されたエッポンドルフチップで
ある。必要なＦｍｏｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加
し、そしてカップリングは、ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：２）
中１.５Ｍ溶液として５倍過剰で添加されるジイソプロ
ピルカルボジイミド（ＤＩＣ）による系内活性化の後、
５倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸を用いて行われる。カップ
リング時間は５０分間である。規定されたペプチド混合
物は個々のペプチドで被覆された支持体（ポリマービー
ズ）を混合することにより得られる。
【００３２】
【表１】
【００３３】ｂ） 線状ペプチドまたはペプチド混合物
の樹脂からの切断 ペプチドまたはペプチド混合物はいわゆるFalconsR 中
で樹脂（各々１ｇ）から、３０mlの酢酸／メタノール／
ＤＣＭ（２：２：６）を用いて室温で３時間振盪しなが
ら切断する。それら樹脂を切断溶液から濾別し、そして
溶媒を３００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノール）また
は１mbar／４０℃（酢酸）で真空濃縮装置内で除去す
る。残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：
１）に溶解し、そして（アミノ基に基づいて）２当量の
０.２Ｎ ＨＣｌをこの溶液に添加し、そしてその溶液を
真空濃縮装置内で再び濃縮する。
の樹脂からの切断 ペプチドまたはペプチド混合物はいわゆるFalconsR 中
で樹脂（各々１ｇ）から、３０mlの酢酸／メタノール／
ＤＣＭ（２：２：６）を用いて室温で３時間振盪しなが
ら切断する。それら樹脂を切断溶液から濾別し、そして
溶媒を３００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノール）また
は１mbar／４０℃（酢酸）で真空濃縮装置内で除去す
る。残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：
１）に溶解し、そして（アミノ基に基づいて）２当量の
０.２Ｎ ＨＣｌをこの溶液に添加し、そしてその溶液を
真空濃縮装置内で再び濃縮する。
【００３４】ｃ） 線状ペプチドまたはペプチド混合物
の環化 ０.４mmol量のペプチドまたはペプチド混合物をポリプ
ロピレンフラスコ中で２５０mlのＤＭＦ（０.００１６
Ｍ）に溶解し、そして４当量のジイソプロピルエチルア
ミン（ＤＩＰＥＡ）を添加する。ＤＭＦ中の０.４Ｍ Ｈ
ＯＢｔ／ＴＢＴＵ溶液３ml（３当量、１.２mmol）を振
盪しながら各々の場合にゆっくり滴加する。反応の進行
はＴＬＣで監視し、そして反応は５時間後に止める。溶
媒を真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で一夜（１５時
間）かけて除去し、乾燥残留物をＤＣＭにとり、これら
溶液を５％ＫＨＳＯ4、５％ＮａＨＣＯ3溶液および水と
共に振盪する（各々３×）ことにより抽出する。有機相
をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過しそして真空濃縮する。残
留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶
解し、そしてこれら溶液を凍結乾燥する。
の環化 ０.４mmol量のペプチドまたはペプチド混合物をポリプ
ロピレンフラスコ中で２５０mlのＤＭＦ（０.００１６
Ｍ）に溶解し、そして４当量のジイソプロピルエチルア
ミン（ＤＩＰＥＡ）を添加する。ＤＭＦ中の０.４Ｍ Ｈ
ＯＢｔ／ＴＢＴＵ溶液３ml（３当量、１.２mmol）を振
盪しながら各々の場合にゆっくり滴加する。反応の進行
はＴＬＣで監視し、そして反応は５時間後に止める。溶
媒を真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で一夜（１５時
間）かけて除去し、乾燥残留物をＤＣＭにとり、これら
溶液を５％ＫＨＳＯ4、５％ＮａＨＣＯ3溶液および水と
共に振盪する（各々３×）ことにより抽出する。有機相
をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過しそして真空濃縮する。残
留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶
解し、そしてこれら溶液を凍結乾燥する。
【００３５】ｄ） 側鎖保護基の除去 各々の場合に、１００〜２００mgのシクロペプチドまた
はシクロペプチド混合物をそれぞれ５mlまたは１０mlの
除去溶液（ＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール、
０.９５：０.２５：０.２５）を用い室温で４時間処理
して側鎖保護基を除去する。次にシクロペプチドをジエ
チルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）中で沈殿させ、
遠心分離し、ジエチルエーテル／ｎ−ヘプタンで更に２
回洗浄し、そしてｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水
（４：１）に溶解し、そしてそれら溶液を凍結乾燥す
る。
はシクロペプチド混合物をそれぞれ５mlまたは１０mlの
除去溶液（ＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール、
０.９５：０.２５：０.２５）を用い室温で４時間処理
して側鎖保護基を除去する。次にシクロペプチドをジエ
チルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）中で沈殿させ、
遠心分離し、ジエチルエーテル／ｎ−ヘプタンで更に２
回洗浄し、そしてｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水
（４：１）に溶解し、そしてそれら溶液を凍結乾燥す
る。
【００３６】実施例１ シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)(K 0021）の合
成 ａ） 線状ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-
Ala）の合成 １８成分（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Arg
-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asn-Val-Tyr-(D)-Ala；Val
-Tyr-Asp-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gln-Val-Tyr-(D)-
Ala；Val-Tyr-Glu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gly-Val-
Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-His-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-
Ile-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Leu-Val-Tyr-(D)-Ala；
Val-Tyr-Lys-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Met-Val-Tyr-
(D)-Ala；Val-Tyr-Phe-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Pro-
Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ser-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-
Tyr-Thr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Tyr-Val-Tyr-(D)-A
la；Val-Tyr-Val-Val-Tyr-(D)-Ala）より成る線状ペプ
チド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）を合成す
るために、これら個々のペプチドを多重ペプチド合成用
に設計されたロボットを用いて、ポリマー支持体上で合
成する。反応容器として、ポリプロピレン濾過カラム
に、各々の場合に、４０mg（＝０.０３２mmol）のＦｍ
ｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−２−クロロトリチル樹脂を充填す
る。樹脂量は、乾燥樹脂を秤量添加するかまたはジクロ
ロメタン／ジメチルホルムアミド（２：１）中の樹脂懸
濁液をピペットで添加することにより配分する。ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中の等モル量のＮ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む必要なＦｍｏ
ｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加し、そしてカップリン
グを、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（２：
１）中の１.５Ｍ溶液として、５倍過剰で添加されるＤ
ＩＣによる系内活性化によって５倍過剰のＦｍｏｃアミ
ノ酸を用いて行う。カップリング時間は５０分間であ
る。
成 ａ） 線状ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-
Ala）の合成 １８成分（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Arg
-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asn-Val-Tyr-(D)-Ala；Val
-Tyr-Asp-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gln-Val-Tyr-(D)-
Ala；Val-Tyr-Glu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gly-Val-
Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-His-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-
Ile-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Leu-Val-Tyr-(D)-Ala；
Val-Tyr-Lys-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Met-Val-Tyr-
(D)-Ala；Val-Tyr-Phe-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Pro-
Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ser-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-
Tyr-Thr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Tyr-Val-Tyr-(D)-A
la；Val-Tyr-Val-Val-Tyr-(D)-Ala）より成る線状ペプ
チド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）を合成す
るために、これら個々のペプチドを多重ペプチド合成用
に設計されたロボットを用いて、ポリマー支持体上で合
成する。反応容器として、ポリプロピレン濾過カラム
に、各々の場合に、４０mg（＝０.０３２mmol）のＦｍ
ｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−２−クロロトリチル樹脂を充填す
る。樹脂量は、乾燥樹脂を秤量添加するかまたはジクロ
ロメタン／ジメチルホルムアミド（２：１）中の樹脂懸
濁液をピペットで添加することにより配分する。ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中の等モル量のＮ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む必要なＦｍｏ
ｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加し、そしてカップリン
グを、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（２：
１）中の１.５Ｍ溶液として、５倍過剰で添加されるＤ
ＩＣによる系内活性化によって５倍過剰のＦｍｏｃアミ
ノ酸を用いて行う。カップリング時間は５０分間であ
る。
【００３７】ｂ） 線状ペプチド混合物の樹脂からの切
断 ペプチドを樹脂から切断する前に、１８種類の個々のヘ
キサペプチド樹脂をプール（１８×４０mg＝０.７２ｇ
のペプチド樹脂）してペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Va
l-Tyr-(D)-Ala）を得る。総量で０.７２ｇのペプチド樹
脂より成るペプチド混合物を、２０mlの酢酸／メタノー
ル／ジクロロメタン（２：２：６）を用いて室温で３時
間振盪しながら切断する。樹脂を切断溶液から濾去し、
そして溶媒を回転真空濃縮装置（Beta-RVC，Christ，Os
terode）を用い、２００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノ
ール）または１mbar／４０℃（酢酸）で除去する。残留
物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解
し、（アミノ基に基づき）２当量の０.２Ｎ ＨＣｌを添
加しそして全体を回転真空濃縮装置で濃縮乾固する。
断 ペプチドを樹脂から切断する前に、１８種類の個々のヘ
キサペプチド樹脂をプール（１８×４０mg＝０.７２ｇ
のペプチド樹脂）してペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Va
l-Tyr-(D)-Ala）を得る。総量で０.７２ｇのペプチド樹
脂より成るペプチド混合物を、２０mlの酢酸／メタノー
ル／ジクロロメタン（２：２：６）を用いて室温で３時
間振盪しながら切断する。樹脂を切断溶液から濾去し、
そして溶媒を回転真空濃縮装置（Beta-RVC，Christ，Os
terode）を用い、２００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノ
ール）または１mbar／４０℃（酢酸）で除去する。残留
物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解
し、（アミノ基に基づき）２当量の０.２Ｎ ＨＣｌを添
加しそして全体を回転真空濃縮装置で濃縮乾固する。
【００３８】ｃ） 環化 ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）（０.
４mmol）をポリプロピレンフラスコ中、２５０mlのＤＭ
Ｆに溶解し（０.００１６Ｍ）、４当量のジイソプロピ
ルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、次にその混合
物をフリーザー内で１時間冷却する。３mlの０.４Ｍ Ｈ
ＯＢｔ／ＴＢＴＵ／ＤＭＦ溶液（＝３当量、１.２mmo
l）を振盪しながらゆっくり滴加する。反応の進行は薄
層クロマトグラフィー（移動相：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸 ８５：１５：２、ＲF生成物＝０.５９）
により監視する。反応は３時間後に完了する。溶媒を回
転真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で除去し、乾燥残留
物をジクロロメタンに溶解し、この溶液を５％ＫＨＳＯ
4溶液および水と共に振盪することにより抽出する。有
機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を真空蒸発させ、そ
して残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水(４：
１）に溶解し、そしてこの溶液を凍結乾燥する。
４mmol）をポリプロピレンフラスコ中、２５０mlのＤＭ
Ｆに溶解し（０.００１６Ｍ）、４当量のジイソプロピ
ルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、次にその混合
物をフリーザー内で１時間冷却する。３mlの０.４Ｍ Ｈ
ＯＢｔ／ＴＢＴＵ／ＤＭＦ溶液（＝３当量、１.２mmo
l）を振盪しながらゆっくり滴加する。反応の進行は薄
層クロマトグラフィー（移動相：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸 ８５：１５：２、ＲF生成物＝０.５９）
により監視する。反応は３時間後に完了する。溶媒を回
転真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で除去し、乾燥残留
物をジクロロメタンに溶解し、この溶液を５％ＫＨＳＯ
4溶液および水と共に振盪することにより抽出する。有
機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を真空蒸発させ、そ
して残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水(４：
１）に溶解し、そしてこの溶液を凍結乾燥する。
【００３９】ｄ） 側鎖保護基の除去 シクロペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Al
a）（１００〜２００mg）を１０mlの除去溶液（ＴＦＡ
／チオアニソール／チオクレゾール、０.９５：０.０２
５：０.０２５）を用いて室温で４時間処理して側鎖保
護基を除去する。その除去溶液をゆっくり撹拌しながら
ジエチルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）に添加し、
沈殿を遠心分離しそして沈殿を超音波処理によってジエ
チルエーテル／ｎ−ヘプタンで２回洗浄しそしてｔｅｒ
ｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、次のこ
の溶液を凍結乾燥する。
a）（１００〜２００mg）を１０mlの除去溶液（ＴＦＡ
／チオアニソール／チオクレゾール、０.９５：０.０２
５：０.０２５）を用いて室温で４時間処理して側鎖保
護基を除去する。その除去溶液をゆっくり撹拌しながら
ジエチルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）に添加し、
沈殿を遠心分離しそして沈殿を超音波処理によってジエ
チルエーテル／ｎ−ヘプタンで２回洗浄しそしてｔｅｒ
ｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、次のこ
の溶液を凍結乾燥する。
【００４０】ｅ） シクロペプチド混合物の分析 シクロペプチド混合物をＨＰＬＣおよびイオンスプレー
質量分析により分析する。MS（FAB）：シクロ（Val-Tyr
-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa
＝Ala：667.8（M＋H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝
Pro：693.9 (M＋H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Th
r：697.9 (M＋H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Il
e：709.9 (M＋H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝As
p：711.8 (M＋H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gl
n：724.9 (M＋H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Me
t：728 (M＋H)；Xaa＝His：733.9 (M＋H)；Xaa＝Phe：7
43.9 (M＋H)；Xaa＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：75
9.9 (M＋H)。
質量分析により分析する。MS（FAB）：シクロ（Val-Tyr
-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa
＝Ala：667.8（M＋H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝
Pro：693.9 (M＋H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Th
r：697.9 (M＋H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Il
e：709.9 (M＋H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝As
p：711.8 (M＋H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gl
n：724.9 (M＋H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Me
t：728 (M＋H)；Xaa＝His：733.9 (M＋H)；Xaa＝Phe：7
43.9 (M＋H)；Xaa＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：75
9.9 (M＋H)。
【００４１】実施例２ シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)(K 5993）の合
成 シクロペプチド混合物シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-
(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に
合成する。MS(FAB):シクロ(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-A
la)；Xaa＝Gly:525.7 (M＋H)；Xaa＝Ala：539.7 (M＋
H)；Xaa＝Ser：555.7 (M＋H)；Xaa＝Pro：565.8 (M＋
H)；Xaa＝Val：567.8 (M＋H)；Xaa＝Thr：569.8 (M＋
H)；Xaa＝Leu：581.8 (M＋H)；Xaa＝Ile：581.8 (M＋
H)；Xaa＝Asn：582.8 (M＋H)；Xaa＝Asp：583.7 (M＋
H)；Xaa＝Lys：596.8 (M＋H)；Xaa＝Gln：596.8 (M＋
H)；Xaa＝Glu：597.8 (M＋H)；Xaa＝Met：599.9 (M＋
H)；Xaa＝His：605.8 (M＋H)；Xaa＝Phe：615.8 (M＋
H)；Xaa＝Arg：624.8 (M＋H)；Xaa＝Tyr：631.8 (M＋
H)。
成 シクロペプチド混合物シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-
(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に
合成する。MS(FAB):シクロ(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-A
la)；Xaa＝Gly:525.7 (M＋H)；Xaa＝Ala：539.7 (M＋
H)；Xaa＝Ser：555.7 (M＋H)；Xaa＝Pro：565.8 (M＋
H)；Xaa＝Val：567.8 (M＋H)；Xaa＝Thr：569.8 (M＋
H)；Xaa＝Leu：581.8 (M＋H)；Xaa＝Ile：581.8 (M＋
H)；Xaa＝Asn：582.8 (M＋H)；Xaa＝Asp：583.7 (M＋
H)；Xaa＝Lys：596.8 (M＋H)；Xaa＝Gln：596.8 (M＋
H)；Xaa＝Glu：597.8 (M＋H)；Xaa＝Met：599.9 (M＋
H)；Xaa＝His：605.8 (M＋H)；Xaa＝Phe：615.8 (M＋
H)；Xaa＝Arg：624.8 (M＋H)；Xaa＝Tyr：631.8 (M＋
H)。
【００４２】実施例３ シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)(K 0022）の合
成 シクロペプチド混合物シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-
(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に
合成する。MS(FAB):シクロ(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-A
la)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa＝Ala：667.8 (M＋
H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝Pro：693.9 (M＋
H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Thr：697.9 (M＋
H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Ile：709.9 (M＋
H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝Asp：711.8 (M＋
H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gln：724.9 (M＋
H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Met：728 (M＋H)；
Xaa＝His：733.9(M＋H)；Xaa＝Phe：743.9 (M＋H)；Xaa
＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：759.9(M＋H)。
成 シクロペプチド混合物シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-
(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に
合成する。MS(FAB):シクロ(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-A
la)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa＝Ala：667.8 (M＋
H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝Pro：693.9 (M＋
H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Thr：697.9 (M＋
H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Ile：709.9 (M＋
H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝Asp：711.8 (M＋
H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gln：724.9 (M＋
H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Met：728 (M＋H)；
Xaa＝His：733.9(M＋H)；Xaa＝Phe：743.9 (M＋H)；Xaa
＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：759.9(M＋H)。
【００４３】
【００４４】実施例４ 以下のシクロペプチドまたはシクロペプチド混合物を同
様に調製した。 シクロ（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Gly-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Gln-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Lys-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Asn-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Ile-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Leu-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Pro-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Phe-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-His-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Ala-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Gln-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Lys-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Asp-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Phe-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Gly-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-His-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Asn-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Pro-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ser-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Val-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Tyr-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Met-Tyr-Val-(D)-Ala） Hypはヒドロキシプロリンである。
様に調製した。 シクロ（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Gly-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Gln-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Lys-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Asn-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Ile-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Leu-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Pro-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Phe-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-His-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Ala-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Xaa-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Gln-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Lys-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Asp-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Phe-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Gly-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-His-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Asn-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Pro-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Ser-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Val-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Tyr-Tyr-Val-(D)-Ala） シクロ（Tyr-Val-Met-Tyr-Val-(D)-Ala） Hypはヒドロキシプロリンである。
【００４５】バイオアッセイによる生物活性の測定 実施例５ 細胞不含結合アッセイにおけるＩＬ−４結合の特異的阻
害 EP 488 170 A1は細胞不含結合テストを開示している。
それらを行うために、そのカルボキシル末端にヒンジ、
ＣＨ2およびＣＨ3領域より成る免疫グロブリン重鎖のＦ
ｃ領域が融合した通常膜に局在する受容体の細胞外領域
より成る組換えキメラタンパク質を用いる。これらのい
わゆる受容体／Ｆｃ融合タンパク質は、特異的受容体結
合活性を維持しながら、例えばＦｃ部分に対するモノク
ローナル抗体で予め被覆しておいた固相に結合させるこ
とができる。この例として、RNunc Ｂ型 ＥＬＩＳＡプ
レートを固相として用いた。１０mg／ml ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ（ＰＢＳＡ）に溶解した受容体／Ｆｃ融合タンパク
質をこれら前処理プレートに結合させた（ｈｕＩＬ−４
Ｒ／Ｆｃ：５００ng／ml；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：２５
０ng／ml；ｈｕＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：１２５ng／ml；室温
で１時間）。洗浄後に、それらペプチドまたはそれぞれ
の特異的未標識リガンド（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｈｕ
ＩＬ−４；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｍｕＩＬ−４；ｈｕ
ＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：ｈｕＩＬ−１ｒａ）を様々な濃度で
添加した後、ビオチニル化された形の特異的リガンドを
固定濃度（１００ng／ml）で添加した。それらプレート
を５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳＡ中、室温で１時間インキュ
ベートした。洗浄後、それらプレートを室温で２０分間
ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ（Amersham、Ｐ
ＢＳＡ中、１：２０００）と共にインキュベートした。
それらプレートをテトラメチルベンジジン基質（Behrin
gwerke）の溶液中で繰り返し洗浄した後、結合したペル
オキシダーゼを検出した。プレートを３０分間インキュ
ベートした後、受容体に結合したビオチニル化リガンド
の量を直接反映する４５０nmでの吸光度を測定した。図
１〜３では、測定された吸光信号を競合剤濃度に対して
プロットした（１００％値は競合剤の非存在下に測定さ
れた吸光度である）。
害 EP 488 170 A1は細胞不含結合テストを開示している。
それらを行うために、そのカルボキシル末端にヒンジ、
ＣＨ2およびＣＨ3領域より成る免疫グロブリン重鎖のＦ
ｃ領域が融合した通常膜に局在する受容体の細胞外領域
より成る組換えキメラタンパク質を用いる。これらのい
わゆる受容体／Ｆｃ融合タンパク質は、特異的受容体結
合活性を維持しながら、例えばＦｃ部分に対するモノク
ローナル抗体で予め被覆しておいた固相に結合させるこ
とができる。この例として、RNunc Ｂ型 ＥＬＩＳＡプ
レートを固相として用いた。１０mg／ml ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ（ＰＢＳＡ）に溶解した受容体／Ｆｃ融合タンパク
質をこれら前処理プレートに結合させた（ｈｕＩＬ−４
Ｒ／Ｆｃ：５００ng／ml；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：２５
０ng／ml；ｈｕＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：１２５ng／ml；室温
で１時間）。洗浄後に、それらペプチドまたはそれぞれ
の特異的未標識リガンド（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｈｕ
ＩＬ−４；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｍｕＩＬ−４；ｈｕ
ＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：ｈｕＩＬ−１ｒａ）を様々な濃度で
添加した後、ビオチニル化された形の特異的リガンドを
固定濃度（１００ng／ml）で添加した。それらプレート
を５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳＡ中、室温で１時間インキュ
ベートした。洗浄後、それらプレートを室温で２０分間
ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ（Amersham、Ｐ
ＢＳＡ中、１：２０００）と共にインキュベートした。
それらプレートをテトラメチルベンジジン基質（Behrin
gwerke）の溶液中で繰り返し洗浄した後、結合したペル
オキシダーゼを検出した。プレートを３０分間インキュ
ベートした後、受容体に結合したビオチニル化リガンド
の量を直接反映する４５０nmでの吸光度を測定した。図
１〜３では、測定された吸光信号を競合剤濃度に対して
プロットした（１００％値は競合剤の非存在下に測定さ
れた吸光度である）。
【００４６】図１は、ｈｕＩＬ−４結合テストにおい
て、ヒトＩＬ−４受容体への結合を求めて未標識ｈｕＩ
Ｌ−４がビオチニル化ｈｕＩＬ−４と競合することを示
している。同じことが、対応した形でいうと、ｍｕＩＬ
−４とマウスＩＬ−４受容体（図２）、およびｈｕＩＬ
−１ｒａとヒトＩＬ−１受容体（図３）についてもいえ
る。しかしながら、ペプチド混合物Ｋ ５９９３、Ｋ
００２１およびＫ ００２２は、ビオチニル化ｈｕＩＬ
−４およびｍｕＩＬ−４のそれぞれの受容体への結合を
阻害する（図１および２）が、ＩＬ−１ｒａ結合アッセ
イでは有意な作用を全く生じない（図３）。
て、ヒトＩＬ−４受容体への結合を求めて未標識ｈｕＩ
Ｌ−４がビオチニル化ｈｕＩＬ−４と競合することを示
している。同じことが、対応した形でいうと、ｍｕＩＬ
−４とマウスＩＬ−４受容体（図２）、およびｈｕＩＬ
−１ｒａとヒトＩＬ−１受容体（図３）についてもいえ
る。しかしながら、ペプチド混合物Ｋ ５９９３、Ｋ
００２１およびＫ ００２２は、ビオチニル化ｈｕＩＬ
−４およびｍｕＩＬ−４のそれぞれの受容体への結合を
阻害する（図１および２）が、ＩＬ−１ｒａ結合アッセ
イでは有意な作用を全く生じない（図３）。
【００４７】以下のＩＣ50値が測定された： ＩＣ50〔μｇ／ml〕 シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala) (K 5993) 37 シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala) (K 0021) 68 シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala) (K 0022) 220 シクロ（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala) 16.7 シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala) 8.3 シクロ（Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala) 17.4 シクロ（Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala) 62.5 シクロ（Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala) 41.3 シクロ（Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala) 96.6 シクロ（Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala) 92.0 Xaa＝CysまたはTrp以下の天然アミノ酸の残基
【００４８】実施例６ ＩＬ−４誘導増殖に対する作用 式Ｉで示されるシクロヘキサペプチドの、またはそれら
の混合物の生物活性をバイオアッセイで測定した。ＩＬ
−４は種特異的にＩＬ−４受容体に結合する。それ故
に、マウスを起源としそして細胞膜にマウスＩＬ−４受
容体を有する細胞系統を用いた。この細胞系統にヒトイ
ンターロイキン−４受容体の完全な遺伝子を移入した。
この細胞系統は機能的にマウスおよびヒト膜局存受容体
を同時に発現し、そしてこの細胞系統はマウスおよびヒ
トＩＬ−４の両方に依存して増殖する（Mosley et al.,
Cell, Vol. 59, 335-348, October 20, 1989）。ペプ
チドの溶解度を向上させるために１％ＤＭＳＯをすべて
の培地に添加した。
の混合物の生物活性をバイオアッセイで測定した。ＩＬ
−４は種特異的にＩＬ−４受容体に結合する。それ故
に、マウスを起源としそして細胞膜にマウスＩＬ−４受
容体を有する細胞系統を用いた。この細胞系統にヒトイ
ンターロイキン−４受容体の完全な遺伝子を移入した。
この細胞系統は機能的にマウスおよびヒト膜局存受容体
を同時に発現し、そしてこの細胞系統はマウスおよびヒ
トＩＬ−４の両方に依存して増殖する（Mosley et al.,
Cell, Vol. 59, 335-348, October 20, 1989）。ペプ
チドの溶解度を向上させるために１％ＤＭＳＯをすべて
の培地に添加した。
【００４９】ａ） ヒトＩＬ−４−誘導増殖に対する作
用 図４（標準曲線）に示されるように、細胞系統はヒトＩ
Ｌ−４（ｈｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃度
のｈｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載のペ
プチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する（図
４）。
用 図４（標準曲線）に示されるように、細胞系統はヒトＩ
Ｌ−４（ｈｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃度
のｈｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載のペ
プチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する（図
４）。
【００５０】ｂ） マウスＩＬ−４−誘導増殖に対する
作用 図５（標準曲線）に示されるように、細胞系統はマウス
ＩＬ−４（ｍｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃
度のｍｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載の
ペプチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する
（図５）。
作用 図５（標準曲線）に示されるように、細胞系統はマウス
ＩＬ−４（ｍｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃
度のｍｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載の
ペプチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する
（図５）。
【００５１】実施例７ ＩＬ−１−誘導増殖に対する作用 ＩＬ−１−依存性Ｔ細胞クローン（D10(N4)M、Hopkins
et al., J. of Imm. Methods, 120, 271-276, 1989）を
用いた。ペプチドの溶解度を向上させるために１％ＤＭ
ＳＯを培地に添加した。細胞はヒトＩＬ−１ベータ（ｈ
ｕＩＬ−１ベータ）に依存して増殖する（図６、標準曲
線）。一定濃度のｈｕＩＬ−１ベータを用いると、個々
に滴定される記載のペプチド混合物の各々は所与の濃度
範囲において細胞系統の増殖を阻害しない（図６）。
et al., J. of Imm. Methods, 120, 271-276, 1989）を
用いた。ペプチドの溶解度を向上させるために１％ＤＭ
ＳＯを培地に添加した。細胞はヒトＩＬ−１ベータ（ｈ
ｕＩＬ−１ベータ）に依存して増殖する（図６、標準曲
線）。一定濃度のｈｕＩＬ−１ベータを用いると、個々
に滴定される記載のペプチド混合物の各々は所与の濃度
範囲において細胞系統の増殖を阻害しない（図６）。
【図１】競合的ｈｕＩＬ−４結合テストの結果を示す。
【図２】競合的ｍｕＩＬ−４結合テストの結果を示す。
【図３】競合的ｈｕＩＬ−１ｒａ結合テストの結果を示
す。
す。
【図４】ｈｕＩＬ−４−依存バイオアッセイによるペプ
チドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−４（滴
定）であり、そしてｂは１ng／ml ｈｕＩＬ−４（一
定）へペプチド（滴定）を添加したものを示す。
チドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−４（滴
定）であり、そしてｂは１ng／ml ｈｕＩＬ−４（一
定）へペプチド（滴定）を添加したものを示す。
【図５】ｍｕＩＬ−４依存バイオアッセイによるペプチ
ドのテストの結果で、ａは標準曲線ｍｕＩＬ−４（滴
定）を、そしてｂは１ng／ml ｍｕＩＬ−４（一定）へ
ペプチド（滴定）を添加したものを示す。
ドのテストの結果で、ａは標準曲線ｍｕＩＬ−４（滴
定）を、そしてｂは１ng／ml ｍｕＩＬ−４（一定）へ
ペプチド（滴定）を添加したものを示す。
【図６】ｈｕＩＬ−１ベータ−依存バイオアッセイによ
るペプチドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−
１ベータ（滴定）を、そしてｂは０.５Ｕ／ml ｈｕＩＬ
−１ベータ（一定）へペプチド（滴定）を添加したもの
を示す。
るペプチドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−
１ベータ（滴定）を、そしてｂは０.５Ｕ／ml ｈｕＩＬ
−１ベータ（一定）へペプチド（滴定）を添加したもの
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/04 8517−4Ｈ 1/06 8517−4Ｈ (72)発明者 ヨーヒエン・クノレ ドイツ連邦共和国デー−65830クリフテル. ヘーヒスターシユトラーセ21 (72)発明者 レアンダー・ラウフアー ドイツ連邦共和国デー−35075グラーデン バハ．シユロスアレー25 (72)発明者 ズザネ・フアイアーターク ドイツ連邦共和国デー−72070テユービン ゲン．アム・シユタトグラーベン３ (72)発明者 カール−ハインツ・ヴイースミユラー ドイツ連邦共和国デー−72070テユービン ゲン．ラペンベルクハルデ33 (72)発明者 ギユンター・ユング ドイツ連邦共和国デー−72076テユービン ゲン．オプデアグラーフエンハルデ５
Claims (16)
- 【請求項１】 式Ｉ シクロ（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−（Ｄ）−Ａｌａ） （Ｉ） （Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、相互に独立的に同一であ
っても相異なっていてもよく、そしてシステインおよび
トリプトファン以外の天然アミノ酸の残基であり、従っ
てＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＶａｌで
あってよい）で示される化合物およびその生理学的に許
容される塩。 - 【請求項２】 式中、ＡおよびＢが、相互に独立的に同
一であっても相異なっていてもよく、そしてＩｌｅ、Ｌ
ｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、そしてＣ、
ＤおよびＥが、相互に独立的に同一であっても相異なっ
ていてもよくそしてシステインおよびトリプトファン以
外の天然アミノ酸の残基である、請求項１記載の式Ｉの
化合物。 - 【請求項３】 式 シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala）、 シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）または シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala） （式中、ＸａａはＣｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ
酸の残基である）で示される化合物およびその生理学的
に許容される塩。 - 【請求項４】 ａ） 適当な保護されたアミノ酸誘導体
を同体支持体にカップリングさせ、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら、形成された線状ペプ
チドを支持体から切断し、 ｃ） その線状ペプチドを溶液中で環化し、 ｄ） その側鎖保護基を除去し、そして適切な場合に
は、 ｅ） それを生理学的に許容される塩に変えることより
成る請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉの化合物の製
造方法。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の化合物
を含む混合物。 - 【請求項６】 ａ） 適当に保護されたアミノ酸誘導体
を同体支持体にカップリングさせ、そして可変位置を導
入するために、すべての所望のアミノ酸の混合物を添加
するかまたは前記支持体をそこにカップリングされたオ
リゴペプチドと共に画分に分けまたは各画分を個別的に
特定のアミノ酸にカップリングさせ、そして次にそれら
画分を再びプールし、 ｂ） 側鎖保護基を保持しながら形成された線状ペプチ
ドの混合物を支持体から切断し、 ｃ） それら線状ペプチドの混合物を溶液中で環化し、
そして ｄ） その側鎖保護基を除去し、そして適切な場合に
は、 ｅ） それを生理学的に許容される塩に変えることより
成る請求項５記載の混合物の製造方法。 - 【請求項７】 請求項１〜３の一以上に記載の式Ｉの化
合物の、アレルギー症および感染症の治療および予防の
ための医薬を調製するための使用。 - 【請求項８】 請求項１〜３の一以上に記載の式Ｉの化
合物の、診断剤を調製するための使用。 - 【請求項９】 請求項１〜３の一以上に記載の式Ｉの化
合物の、インターロイキン−４（ＩＬ−４）のＩＬ−４
受容体への結合を阻害するための科学的ツールを調製す
るための使用。 - 【請求項１０】 有効量の請求項１〜３の一以上に記載
の式Ｉの化合物を含有する薬学的剤または診断剤。 - 【請求項１１】 請求項１〜３の一以上に記載の少なく
とも一種類の化合物を、生理学的に許容される賦形剤お
よび適当な添加剤および／または補助物質と混合するこ
とより成る薬学的剤または診断剤の調製方法。 - 【請求項１２】 請求項５に記載の混合物の、アレルギ
ー症および感染症の治療および予防のための医薬を調製
するための使用。 - 【請求項１３】 請求項５に記載の混合物の、診断剤を
調製するための使用。 - 【請求項１４】 請求項５に記載の混合物の、インター
ロイキン−４（ＩＬ−４）のＩＬ−４受容体への結合を
阻害するための科学的ツールを調製するための使用。 - 【請求項１５】 有効量の請求項５記載の混合物を含有
する薬学的剤または診断剤。 - 【請求項１６】 請求項５記載の一種類以上の混合物を
生理学的に許容される賦形剤および適切な場合には適当
な添加剤および／または補助物質と混合することより成
る薬学的剤または診断剤の調製方法。
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