JPH08182495A - Method for screening compound having ability to induce transcription from promotor in plant - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To provide both a method for screening a compound having the ability to induce the transcription from a promoter and a method for screening a compound capable of imparting the resistance to disease and insect damage in plants. CONSTITUTION: This method for screening a compound hating the ability to induce the transcription from a promoter comprises a step for treating a plant body, derived from a plant cell and containing an expression cassette having (1) a promoter of a peroxidase gene derived from the plant, (2) a reporter gene, transcribed and translated with the promoter and (3) a terminator capable of functioning in the plant cell in the form of the genes capable of functioning or its part with the compound which is a specimen and a step for detecting the presence or absence of the expression of the reporter gene in the plant body or its part after the above step.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、プロモーターからの転
写を誘導する能力を有する化合物をスクリーニングする
方法及び植物における病害虫抵抗性付与化合物をスクリ
ーニングする方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for screening a compound capable of inducing transcription from a promoter and a method for screening a compound imparting pest resistance in a plant.

【０００２】[0002]

【従来の技術】植物が本来持っている病害虫に対する防
御機構を活性化することにより植物に病害抵抗性を付与
する化合物（以下、病害虫抵抗性付与化合物と記す。）
の利用が望まれるようになってきた。このような化合物
としては、たとえば、サリチル酸、ニコチン酸等が代表
的なものとして現在までに知られている。そしてこのよ
うな病害虫抵抗性付与化合物化合物をスクリーニングす
る方法として、特開平 2-9377 号公報には、タバコＰＲ
タンパク質遺伝子、キュウリキチナーゼ遺伝子、タバコ
β−１，３−グルカナーゼ遺伝子のプロモーターを利用
する方法、公開平5-504046 号公報及び公開平 3-504921
号公報にはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝
子（PAL ）、カルコンシンターゼ遺伝子（CHS ）、4-ク
マレート-CoAリガーゼ遺伝子（4CL ）、ヒドロキシプロ
リンリッチタンパク質遺伝子（HRGP）のプロモーターを
利用する方法についての記載がある。2. Description of the Related Art A compound that imparts disease resistance to a plant by activating the defense mechanism inherent in the plant against the pest (hereinafter referred to as a pest resistance imparting compound).
The use of is becoming popular. As such compounds, for example, salicylic acid, nicotinic acid, etc. have been known as typical ones up to now. As a method for screening such a compound for imparting pest resistance, JP-A No. 2-9377 discloses tobacco PR.
Method using promoter of protein gene, cucumber chitinase gene, tobacco β-1,3-glucanase gene, JP-A-5-504046 and JP-A-3-504921
The publication describes a method of using a promoter of phenylalanine ammonia-lyase gene (PAL), chalcone synthase gene (CHS), 4-coumarate-CoA ligase gene (4CL), and hydroxyproline-rich protein gene (HRGP).

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
方法に利用されるプロモーターはタバコＰＲタンパク質
（PR1a）遺伝子のプロモーターを除いていずれのプロモ
ーターも化合物処理によるレポーター遺伝子の発現に関
する誘導度が低いので、該プロモーターを利用してレポ
ーター遺伝子の発現の有無を検出するとしばしば正確性
に問題を生じた。さらに該検出には煩雑な活性測定が必
要となり、多くの検体化合物をスクリーニングするには
多大な労力が必要であった。またタバコＰＲタンパク質
遺伝子のプロモーターでは、化合物処理によるレポータ
ー遺伝子の発現に関する誘導度は非常に高いものである
が、バックグランド（化合物未処理であるが、水のみと
か化合物の水溶解促進用の助剤のみの処理）でもレポー
ター遺伝子の発現に関する誘導度が高いので、上記と同
様に検体化合物が有するプロモーターからの転写を誘導
する能力を評価するにはいまだ充分なものであるとは必
ずしも言えなかった。However, since all the promoters used in the above method except the promoter of the tobacco PR protein (PR1a) gene have a low degree of induction with respect to the expression of the reporter gene by compound treatment, When the presence or absence of the expression of the reporter gene was detected by using the promoter, there was often a problem in accuracy. Further, the detection requires complicated activity measurement, and a great deal of labor is required to screen many sample compounds. In addition, in the promoter of the tobacco PR protein gene, the degree of induction of the expression of the reporter gene by the compound treatment is very high, but the background (untreated compound but only water or an auxiliary agent for promoting water dissolution of the compound) However, it was not always sufficient to evaluate the ability of the sample compound to induce transcription from the promoter possessed by the sample compound, as described above.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、植物の防御遺伝子の発
現を誘導する化合物の一つであるエチレンによってパー
オキシダーゼ遺伝子が植物体内において強く発現される
ことを見い出し、そして該パーオキシダーゼ遺伝子のプ
ロモーターを利用すれば、レポーター遺伝子の発現に関
するすぐれた誘導度が得られると考え、植物由来のパー
オキシダーゼ遺伝子の単離を試みこれに成功した。そし
て該パーオキシダーゼ遺伝子のプロモーターを利用する
ことによってレポーター遺伝子の発現に関する高い誘導
度が得られること、及び、遺伝子工学的技術を利用しや
すい植物であるタバコ内においても化合物により高い誘
導性を示すこと、及び、バックグランドにおけるレポー
ター遺伝子の発現に関する誘導度が極めて低いことを見
い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、検
体である化合物を、（１）植物由来のパーオキシダーゼ
遺伝子のプロモーター、（２）該プロモーターによって
転写翻訳されるレポーター遺伝子、および（３）植物細
胞内で機能可能なターミネーターを有し、これらの遺伝
子を機能可能な形で有する発現カセットを含有する植物
細胞由来の植物体またはその一部に処理する工程、及
び、前記工程後、該植物体またはその一部におけるレポ
ーター遺伝子の発現の有無を検出する工程、からなるこ
と特徴とするプロモーターからの転写を誘導する能力を
有する化合物をスクリーニングする方法（以下、本発明
方法と記す。）、及び、検体である化合物を、（１）植
物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、
（２）該プロモーターによって転写翻訳されるレポータ
ー遺伝子、および（３）植物細胞内で機能可能なターミ
ネーターを有し、これらの遺伝子を機能可能な形で有す
る発現カセットを含有する植物細胞由来の植物体または
その一部に処理する工程、前記工程後、該植物体または
その一部におけるレポーター遺伝子の発現の有無を検出
する工程、及び、レポーター遺伝子の発現が検出された
化合物の植物における病害虫抵抗性を評価する工程から
なること特徴とする植物における病害虫抵抗性付与化合
物をスクリーニングする方法を提供するものである。Under such circumstances, as a result of intensive investigations by the present inventors, as a result of ethylene, which is one of the compounds inducing the expression of plant defense genes, the peroxidase gene is It was found that a strong induction of expression of the reporter gene was obtained by using the promoter of the peroxidase gene, and we succeeded in isolating the plant-derived peroxidase gene. did. And that a high degree of induction of reporter gene expression can be obtained by using the promoter of the peroxidase gene, and that the compound is highly inducible even in tobacco, which is a plant in which genetic engineering techniques are easily utilized. , And found that the degree of induction of reporter gene expression in the background was extremely low, and completed the present invention. That is, the present invention provides a compound which is a sample with (1) a promoter of a plant-derived peroxidase gene, (2) a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and (3) a terminator capable of functioning in plant cells. Having a step of treating a plant cell-derived plant or a part thereof containing an expression cassette having these genes in a functional form, and, after the step, a reporter gene of the plant or a part thereof A method of screening a compound having the ability to induce transcription from a promoter characterized by comprising the step of detecting the presence or absence of expression (hereinafter referred to as the method of the present invention), and ) A promoter of a plant-derived peroxidase gene,
A plant cell-derived plant body having (2) a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and (3) a terminator capable of functioning in a plant cell, and containing an expression cassette having these genes in a functional form. Or a step of treating it, a step of detecting the presence or absence of expression of a reporter gene in the plant body or a part thereof after the step, and pest resistance in a plant of the compound in which expression of the reporter gene is detected. The present invention provides a method for screening a compound for imparting pest resistance in a plant characterized by comprising an evaluation step.

【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、J.,S
ambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラー
クローニング 第２版（Molecular Cloning 2nd edit
ion ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー 発行（Cold Spring Harbor Laboratory press ）、
1989年； D.,M.,Glover 著、DNA クローニング（DNA Cl
oning ）、IRL,発行、1985年等に記載されている通常の
方法に準じて方法である。The present invention will be described in more detail below. Genetic engineering techniques used in the present invention include, for example, J., S
Ambrook, E., F., Frisch, T., Maniatis, Molecular Cloning 2nd edit
ion), Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory press),
1989; D., M., Glover, DNA cloning (DNA Cl
oning), IRL, issuance, 1985, etc.

【０００６】本発明で用いられる植物由来のパーオキシ
ダーゼ遺伝子のプロモーターとは、各種の植物が有する
パーオキシダーゼ遺伝子に関するプロモーター（発現制
御領域）のことで、天然由来あるいは合成由来であって
もかまわない。上記の植物由来のパーオキシダーゼ遺伝
子のプロモーターは、例えば、PAL,CHS,4CL,PR,HGRP,塩
基性及び酸性キチナーゼ遺伝子、塩基性及び酸性グルカ
ナーゼ遺伝子等の植物における病害抵抗性に関与してい
る遺伝子の発現を誘導する化合物、例えば、サリチル
酸、ニコチン酸等の刺激によって後述するレポーター遺
伝子の転写翻訳を開始させる機能を有する。具体的に
は、たとえば、アズキ由来の塩基性パーオキシダーゼ遺
伝子のプロモーターをあげることができる。該プロモー
ターは、配列番号１で示される塩基配列を有する。好ま
しくは、その転写開始点を含む全長約 2,000塩基対程度
からなる領域からなる遺伝子がよい。また、これより更
に短い領域を含む遺伝子であっても病害抵抗性に関与し
ている遺伝子の発現を誘導する化合物の刺激によってレ
ポーター遺伝子の転写翻訳を開始させる機能を有すれば
よい。The plant-derived peroxidase gene promoter used in the present invention is a promoter (expression control region) relating to the peroxidase gene of various plants, and may be of natural or synthetic origin. The promoter of the plant-derived peroxidase gene, for example, PAL, CHS, 4CL, PR, HGRP, basic and acid chitinase gene, a gene involved in disease resistance in plants such as basic and acid glucanase gene. It has a function of initiating transcription / translation of a reporter gene, which will be described later, by stimulation with a compound that induces expression of, for example, salicylic acid, nicotinic acid and the like. Specifically, for example, a promoter of the basic peroxidase gene derived from azuki bean can be used. The promoter has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A gene comprising a region having a total length of about 2,000 base pairs including the transcription initiation point is preferable. Further, even a gene containing a region shorter than this may have a function of initiating transcription / translation of a reporter gene by stimulation of a compound that induces expression of a gene involved in disease resistance.

【０００７】本発明で用いられる植物由来のパーオキシ
ダーゼ遺伝子のプロモーターは、たとえば、cDNA、オリ
ゴヌクレオチドまたはパーオキシダーゼに対する特異的
抗体等を用いて単離されるパーオキシダーゼ遺伝子から
制限酵素によって切り出す、あるいはゲノムＤＮＡを鋳
型にし、かつ植物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロ
モーター領域を増幅するような塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ・
チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によって調製するこ
とができる。たとえば、アズキ由来の塩基性パーオキシ
ダーゼ遺伝子のプロモーターの場合には、アズキのゲノ
ムＤＮＡを鋳型にし、かつ塩基性パーオキシダーゼ遺伝
子のプロモーター領域を増幅するような塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメ
ラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によって調
製することができる。また、これより更に短い領域を含
む遺伝子、すなわち欠失プロモーターの場合には、ゲノ
ムＤＮＡを鋳型にし、かつ、欠失プロモーター領域を増
幅するような塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いるポリメラーゼ・チェーン・リアク
ション（PCR ）によって得る方法、エキソヌクレアーゼ
により上記のプロモーターの５' 末端よりプロモーター
領域を欠失させる方法、DNA 合成法によって全合成する
方法等を用いることができる。The promoter of the plant-derived peroxidase gene used in the present invention is excised with a restriction enzyme from the peroxidase gene isolated by using, for example, cDNA, oligonucleotide or a specific antibody against peroxidase, or genomic DNA. And a polymerase using an oligonucleotide having a nucleotide sequence that amplifies the promoter region of the plant-derived peroxidase gene as a primer
It can be prepared by chain reaction (PCR). For example, in the case of a promoter of the basic peroxidase gene derived from azuki bean, a polymerase that uses the genomic DNA of azuki bean as a template and uses an oligonucleotide having a base sequence that amplifies the promoter region of the basic peroxidase gene as a primer -Can be prepared by chain reaction (PCR). In the case of a gene containing a region shorter than this, that is, in the case of a deletion promoter, a polymerase chain using genomic DNA as a template and an oligonucleotide having a nucleotide sequence that amplifies the deletion promoter region as a primer -A method obtained by reaction (PCR), a method of deleting the promoter region from the 5'end of the above-mentioned promoter by exonuclease, a method of total synthesis by a DNA synthesis method and the like can be used.

【０００８】本発明に用いられるレポーター遺伝子とし
ては、該レポーター遺伝子の発現の有無が容易に検出で
きるものが適している。特に、植物体またはその一部を
そのまま用いてレポーター遺伝子がコードするタンパク
質の酵素活性を測定することによって該レポーター遺伝
子の発現の有無を検出することができるものがよい。た
とえば、β-1,3- グルクロニダーゼ遺伝子（以下、GUS
遺伝子と記す。）あるいはルシフェラーゼ遺伝子（以
下、LUC 遺伝子と記す。）等をあげることができる。GU
S 遺伝子を用いる場合には、5-ブロモ-4- クロロ-3- イ
ンドリール- β-D-グルクロニド・シクロヘキシルアン
モニウム塩を基質とし、生成するインジゴチン量（青色
呈色度）を吸光度として吸光光度計を用いて測定する活
性染色法、LUC 遺伝子を用いる場合には、4-メチルウン
ベリフェリール- β-D- グルクロニドを基質とし、生成
する 4- メチルウンベリフェロン量を蛍光強度として蛍
光検出器を用いて測定する蛍光測定法を利用することが
でき、容易にレポーター遺伝子の発現の有無（定性的）
及びその発現量（定量的）を知ることができる。As the reporter gene used in the present invention, those which can easily detect the presence or absence of expression of the reporter gene are suitable. In particular, it is preferable that the presence or absence of expression of the reporter gene can be detected by measuring the enzyme activity of the protein encoded by the reporter gene using the plant or a part thereof as it is. For example, the β-1,3-glucuronidase gene (hereinafter GUS
It is referred to as a gene. ) Or a luciferase gene (hereinafter referred to as LUC gene). GU
When S gene is used, 5-bromo-4-chloro-3-indoleyl-β-D-glucuronide cyclohexylammonium salt is used as a substrate, and the amount of indigotin produced (blue chromaticity) is used as the absorbance and the absorptiometer is used. When using the LUC gene for the active staining method, the 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide is used as the substrate, and the amount of 4-methylumbelliferone produced is used as the fluorescence intensity. It is possible to use a fluorescence measurement method that can be used to measure the presence or absence of reporter gene expression (qualitatively).
And its expression level (quantitative) can be known.

【０００９】本発明で用いられる植物細胞内で機能可能
なターミネーターとしては、たとえば、Ｔ-DNA由来のノ
パリンシンターゼ遺伝子のターミナーター（NOS ）等の
植物遺伝子由来のターミネーターやニンニクウイルスGV
1,GV2 遺伝子のターミネーター等のウイルス由来のター
ミネーター等をあげることができるが、これらに限定さ
れるものではない。Examples of the terminator which can be used in the plant cell used in the present invention include terminators derived from plant genes such as T-DNA derived nopaline synthase gene terminator (NOS) and garlic virus GV.
Examples include, but are not limited to, virus-derived terminators such as the terminator of 1, GV2 gene.

【００１０】このような植物由来のパーオキシダーゼ遺
伝子のプロモーター、該プロモーターによって転写翻訳
されるレポーター遺伝子、および植物細胞内で機能可能
なターミネーターを通常の遺伝子工学的技術を用いて機
能可能な形で一つのプラスミド内に保持させることによ
って作成させた発現カセットは、たとえば、アグロバク
テリウム法（土壌菌であるアグロバクテリウム菌を植物
組織に感染させる方法）、電気的導入法（プロトプラス
トへの電気的導入方法：エレクトロポレーション）、あ
るいはパーティクルガンによる直接導入法（植物組織及
び培養細胞への直接導入方法：パーティクルガン法）等
の公知な方法によって植物細胞内に導入する。得られ
た、該発現カセットを含有する植物細胞を、例えば、S.
B.Gelvin,R.A.Schilperoot and D.P.S.Verma 著：プラ
ント・モレクラー・バイオロジー／マニュアル（Plant
Molecular Biology/Manual,Kluwer Academic Publisher
s press ）(1988 年) に記載される通常の植物組織培養
技術において用いられる方法に準じて再生することによ
って該植物細胞由来の植物体またはその一部を得ること
ができる。発現カセットの具体的な構築方法としては、
植物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロモーターを市
販のベクター、例えば、 pBI101,pBI101.2,pBI101.3 の
GUS遺伝子の上流に挿入する方法、あるいは、植物由来
のパーオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、該プロモー
ターによって転写翻訳されるレポーター遺伝子、および
植物細胞内で機能可能なターミネーターを必要に応じて
リンカーを用いて順に連結する通常の方法等をあげるこ
とができる。ここでいうリンカーとは、連結する二つの
遺伝子の末端と相補的な塩基配列をもつ約１０〜２０塩
基対程度の短い合成 DNA断片のことを意味する。Such a promoter of a plant-derived peroxidase gene, a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and a terminator capable of functioning in a plant cell are combined in a form capable of functioning using a conventional genetic engineering technique. Expression cassettes created by holding them in one plasmid are, for example, Agrobacterium method (method of infecting plant tissue with Agrobacterium which is a soil fungus), electric transfer method (electric transfer to protoplasts). Method: electroporation) or a direct introduction method using a particle gun (direct introduction method into plant tissues and cultured cells: particle gun method) is introduced into the plant cells. The resulting plant cells containing the expression cassette were transformed into, for example, S.
B.Gelvin, RA Schilperoot and DPSVerma: Plant Molecule Biology / Manual (Plant
Molecular Biology / Manual, Kluwer Academic Publisher
s press) (1988), a plant derived from the plant cell or a part thereof can be obtained by regeneration according to the method used in the ordinary plant tissue culture technique. As a concrete construction method of the expression cassette,
Commercially available vectors for promoters of plant-derived peroxidase genes, such as pBI101, pBI101.2, pBI101.3
A method of inserting upstream of the GUS gene, or a promoter of a plant-derived peroxidase gene, a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and a terminator capable of functioning in plant cells are ligated in order using a linker if necessary. The usual method of doing so can be mentioned. The term "linker" as used herein means a short synthetic DNA fragment of about 10 to 20 base pairs having a base sequence complementary to the ends of two genes to be linked.

【００１１】なお、構築された発現カセットを含有する
植物細胞の植物種としては、たとえば、イネ、トウモロ
コシ、オオムギ、コムギ、オオムギ、タマネギ等の単子
葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ
等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモなどのナ
ス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナなどのアブラナ
科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、
ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植
物等の双子葉植物等をあげることができる。The plant species of the plant cell containing the constructed expression cassette include, for example, monocots such as rice, corn, barley, wheat, barley and onion, and beans such as soybean, pea, green beans and alfalfa. Plants, solanaceous plants such as tobacco, tomato and potato, cruciferous plants such as cabbage, rape and mustard, melons such as melon, pumpkin and cucumber,
Examples thereof include carrots, celery and other plants belonging to the Umbelliferae family, lettuce and other plants in the Asteraceae family, and the like.

【００１２】プロモーターからの転写を誘導する能力を
有する化合物をスクリーニングするために、本発明方法
では、上記のようにして構築された発現カセット、すな
わち、（１）植物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロ
モーター、（２）該プロモーターによって転写翻訳され
るレポーター遺伝子、および（３）植物細胞内で機能可
能なターミネーターを有し、これらの遺伝子を機能可能
な形で有する発現カセットを含有する植物細胞由来の植
物体またはその一部に検体である化合物を処理する工
程、及び、前記工程後、該植物体またはその一部におけ
るレポーター遺伝子の発現の有無を検出する工程、の二
種の工程が必須である。スクリーニングに用いられる、
発現カセットを含有する植物細胞由来の植物体またはそ
の一部としては、植物体、幼植物体、実生、葉片等の植
物組織、カルス、プロトプラスト等をあげることができ
る。In order to screen a compound capable of inducing transcription from a promoter, in the method of the present invention, an expression cassette constructed as described above, that is, (1) a promoter of a plant-derived peroxidase gene, A plant cell-derived plant body having (2) a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and (3) a terminator capable of functioning in a plant cell, and containing an expression cassette having these genes in a functional form. Alternatively, two kinds of steps, that is, a step of treating a part thereof with a compound as a sample and a step of detecting the presence or absence of expression of a reporter gene in the plant body or a part thereof after the step are essential. Used for screening,
Examples of the plant cell-derived plant body containing the expression cassette or a part thereof include plant bodies, seedlings, seedlings, plant tissues such as leaf pieces, callus, protoplasts, and the like.

【００１３】まず、検体化合物から、たとえば、該化合
物を有効成分とする薬液を調製する。なお薬液中におけ
る有効成分の濃度は、各種の条件によって変化するが、
たとえば、約１ppm から約１００ppm 程度をあげられ
る。必要に応じて、通常の農薬の製剤方法に準じて製剤
した後、薬液を調製してもよい。つぎに調製した薬液を
発現カセットを含有する植物細胞由来の植物体またはそ
の一部に、散布、浸漬、塗布等の方法によって処理す
る。薬剤を処理した植物体またはその一部を一定期間栽
培することによって検体化合物によるレポーター遺伝子
の発現を誘導する。この際、ポジティブコントロールと
して、たとえば、サリチル酸、ニコチン酸等の病害虫抵
抗性付与化合物を用いると適切な栽培期間が明確にな
る。栽培終了後、植物体またはその一部におけるレポー
ター遺伝子の発現の有無を前記のように検出する。検出
結果から、レポーター遺伝子の発現が有る場合には、検
体化合物がプロモーターからの転写を誘導する能力を有
する化合物であること、レポーター遺伝子の発現が無い
場合には、検体化合物がプロモーターからの転写を誘導
する能力を有しない化合物であること、が判断できる。
このようにして本発明方法によって、プロモーターから
の転写を誘導する能力を有する化合物（ポジティブ化合
物）をスクリーニングすることができる。さらに、本発
明方法によってスクリーニングされた上記のポジティブ
化合物、すなわち、レポーター遺伝子の発現が検出され
た化合物を通常の農薬の生物活性評価方法に準じた方法
によって植物における病害虫抵抗性を評価すれば、植物
における病害虫抵抗性付与化合物をスクリーニングする
ことができる。このようにしてスクリーニングされた病
害虫抵抗性付与化合物は、植物細胞内に存在するパーオ
キシダーゼ遺伝子のみでなく、さらに各種の病害虫抵抗
性に関与する種々の遺伝子、たとえば、病原菌の溶菌作
用を有す酵素をコードするもの、細胞壁成分の合成に関
与し、細胞壁の強化を担う酵素をコードするもの、ある
いは抗菌物質合成に関与している酵素をコードしている
もの、を活性化する作用を有す可能性がある。したがっ
て、該化合物を植物に前処理することによって各種の病
害虫に抵抗性を付与できる。このような作用を有する化
合物は、病害虫に対する作用スペクトルが広いだけでは
なく、耐性病害虫が出現しにくく、人体に対しても安全
性が高いなど優れた性質をもつ。First, for example, a drug solution containing the compound as an active ingredient is prepared from the analyte compound. The concentration of the active ingredient in the drug solution changes depending on various conditions,
For example, it can be about 1 ppm to about 100 ppm. If necessary, the drug solution may be prepared after formulation according to a usual pesticide formulation method. Next, the prepared drug solution is treated on a plant cell-derived plant containing the expression cassette or a part thereof by a method such as spraying, dipping, or coating. The expression of the reporter gene by the test compound is induced by cultivating the plant treated with the drug or a part thereof for a certain period. At this time, when a pest resistance imparting compound such as salicylic acid or nicotinic acid is used as a positive control, an appropriate cultivation period becomes clear. After the cultivation, the presence or absence of the expression of the reporter gene in the plant body or a part thereof is detected as described above. From the detection results, if there is expression of the reporter gene, it means that the sample compound has the ability to induce transcription from the promoter, and if there is no expression of the reporter gene, the sample compound does not have transcription from the promoter. It can be determined that the compound has no ability to induce.
In this manner, the method of the present invention makes it possible to screen a compound (positive compound) having the ability to induce transcription from a promoter. Furthermore, if the above-mentioned positive compound screened by the method of the present invention, that is, the compound in which the expression of the reporter gene is detected, is evaluated for pest resistance in a plant by a method according to a method for evaluating the biological activity of an ordinary pesticide, the plant is The pest resistance imparting compound can be screened. The pest resistance-imparting compound thus screened is not only a peroxidase gene present in plant cells, but also various genes involved in resistance to various pests, for example, an enzyme having a lytic action on a pathogen. It may have the effect of activating the enzyme that encodes, the enzyme that is involved in the synthesis of cell wall components and that encodes the enzyme that strengthens the cell wall, or that that encodes the enzyme that is involved in the synthesis of antibacterial substances. There is a nature. Therefore, it is possible to impart resistance to various pests by pretreating the compound with a plant. The compound having such an action not only has a broad action spectrum against pests, but also has the excellent properties that resistant pests are less likely to appear and that it is highly safe for the human body.

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、これらに限定されるものではない。The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the invention is not limited thereto.

【００１４】実施例１ （植物由来のパーオキシダーゼ
遺伝子のプロモーターの取得） （１）核 DNAの単離 アズキの葉からの核 DNAの単離は、Nucleic Acid Res.
8:4321(1980) に記載される Murra Thompson の CTAB
法に準じた方法によって行った。市販のアズキ（品種：
大納言）（Vignaangularis, Ohwi et Ohashi cv Tamba-
Dainagon）の成熟葉約 10gを液体窒素中で凍結し、微細
な粉末になるまで乳棒と乳鉢で摩砕した。その粉末を 7
0 ℃に保温した 2xCTAB 溶液（2% cetyltrimethyl ammo
nium bromide, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA, 1.
4M NaCl, 1% 可溶性 polyvinylpyrolidone）10 ml に入
れ、スパーテルでよく混合した後、65℃で 10 分間保温
した。10 ml のクロロホルム/ イソアミルアルコールを
入れて 10 分間室温でゆっくり振盪した後、2,800 rpm
で 15 分間遠心分離にかけた。その上清に等容のクロロ
ホルム／イソアミルアルコールを加え、室温で 10 分間
ゆっくり振盪し、遠心分離（2,800 rpm 10分間）により
上清を分離した。得られた上清に 1/10 容の 10% CTAB
溶液(10% cetyltrimethyl ammonium bromide, 0.7M NaC
l)を加え、転倒混和し、等容のクロロホルム／イソアミ
ルアルコールを加え、室温で１０分間ゆっくり振盪し、
遠心分離（2,800 rpm,10分）により上清を分離した。得
られた上清に等容の沈澱バッファー(1% cetyltrimethy
ammonium bromide, 50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EDT
A) を加え転倒混和したのち３分間６５℃で静置した。
2,800 rpm,15分間の遠心分離により得られる沈澱を 70%
エタノールで洗浄し、エタノールをよく除いた後、TE(1
0 mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA) 6 ml に溶解した。RN
aseAを 1μg/mlとなるように加え、55℃,30 分間処理す
ることによって核 DNAを得た。得られた核 DNAの一部を
アガロースゲル電気泳動で調べた。 （２）ゲノムライブラリーの作製とスクリーニング 上記のようにして得られた核 DNA 10 μg を制限酵素 S
au3Aで部分分解し、20〜 10 kbの断片とし、ファージ E
MBL4（Stratagene社製）の BamHI部位に連結し、ゲノム
ライブラリーを作製した。約 500,000個のプラークを A
Z42 の cDNA （F.Ishige et al. Plant Physiol.101:19
3(1993) ）をプローブにスクリーニングし、5 個の陽性
クローンを得た。ハイブリダイゼーションは、プラーク
DNAを固定したナイロンフィルター（HybondN アマシャ
ム）をハイブリダイデーション液（5xSSC, 50% Formami
de, 5xDenhardt's, 0.1% SDS, 200 μg/ml変性 DNA1x10
⁵〜10⁷ cpm/ml 標識プローブ）中で、37℃で一晩保温
することにより行った。フィルターの洗浄は、1xSSC,
0,1% SDS で、室温、30分間行った。陽性クローンより
DNAを精製し、制限酵素地図を作製したところ、いずれ
も同じ遺伝子由来のクローンであることが明かとなっ
た。そこで最も長いクローンを EcoRIで消化して得られ
る、4.6 kbと 3.5 kb の断片をBLUESCRIPT II KS+ （St
ratagene社製）のEcoRI部位に挿入した。それぞれ pgAZ
42-4.4 及び pgAZ42-3.6 と命名した。 （３）pgAZ42-4.4と pgAZ42-3.6 の塩基配列の決定 cDNAをプローブに用いたハイブリダイゼーションによ
り、pgAZ42-4.4に cDNAの 5' 末端及びプロモーター領
域が含まれていることがわかり、pgAZ42-4.4の全領域と
pgAZ42-3.5 の一部についてダイデオキシ法（Sanger e
t al. Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74:5463(1977) ）によ
り塩基配列を決定した（配列番号 1参照）。プライマー
は塩基配列を決定した領域の一部を随時合成してシーク
エンス反応に用いた。図２に AZ42 遺伝子の制限酵素地
図を示す。タンパク質をコードしている領域は３個のイ
ントロンに分断され、4 個のエクソンから成っていた。
プロモーター領域には、いくつか特徴的な繰り返し配列
が存在していた（図 1、矢印、ボックス、二重波線）。Example 1 (Acquisition of promoter of plant-derived peroxidase gene) (1) Isolation of nuclear DNA Isolation of nuclear DNA from adzuki bean leaves was carried out by Nucleic Acid Res.
8: 4321 (1980) Murra Thompson CTAB
It was carried out by a method according to the law. Commercially available Azuki (variety:
(Vignaangularis, Ohwi et Ohashi cv Tamba-
About 10 g of mature leaves of Dainagon) were frozen in liquid nitrogen and ground with a pestle and mortar until a fine powder was obtained. 7 of that powder
2xCTAB solution (2% cetyltrimethyl ammo
nium bromide, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA, 1.
It was put in 10 ml of 4M NaCl, 1% soluble polyvinylpyrolidone, mixed well with a spatula, and then incubated at 65 ° C for 10 minutes. Add 10 ml of chloroform / isoamyl alcohol, shake gently for 10 minutes at room temperature, then 2,800 rpm.
Centrifuge for 15 minutes at. An equal volume of chloroform / isoamyl alcohol was added to the supernatant, the mixture was slowly shaken at room temperature for 10 minutes, and the supernatant was separated by centrifugation (2,800 rpm for 10 minutes). Add 1/10 volume of 10% CTAB to the resulting supernatant.
Solution (10% cetyltrimethyl ammonium bromide, 0.7M NaC
l) was added, mixed by inversion, added with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol, and gently shaken at room temperature for 10 minutes,
The supernatant was separated by centrifugation (2,800 rpm, 10 minutes). Add an equal volume of precipitation buffer (1% cetyltrimethy
ammonium bromide, 50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EDT
After A) was added and mixed by inversion, the mixture was allowed to stand at 65 ° C for 3 minutes.
70% of the precipitate obtained by centrifugation at 2,800 rpm for 15 minutes
After washing with ethanol and removing the ethanol thoroughly, TE (1
It was dissolved in 6 ml of 0 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA). RN
Nuclear DNA was obtained by adding aseA to 1 μg / ml and treating at 55 ° C for 30 minutes. A part of the obtained nuclear DNA was examined by agarose gel electrophoresis. (2) Preparation and screening of genomic library 10 μg of the nuclear DNA obtained as described above was treated with restriction enzyme S
Partially digested with au3A to obtain a fragment of 20-10 kb, and phage E
A genomic library was prepared by ligating to the BamHI site of MBL4 (Stratagene). Approximately 500,000 plaques A
Z42 cDNA (F. Ishige et al. Plant Physiol. 101: 19
3 (1993)) was used as a probe to obtain 5 positive clones. Hybridization with plaque
Nylon filter (HybondN Amersham) with immobilized DNA is used for hybridization solution (5xSSC, 50% Formami
de, 5xDenhardt's, 0.1% SDS, 200 μg / ml denatured DNA1x10
⁵ to 10 ⁷ cpm / ml labeled probe), and incubated at 37 ° C overnight. Filter cleaning is 1xSSC,
It was carried out at room temperature for 30 minutes in 0.1% SDS. From positive clones
When the DNA was purified and a restriction map was created, it was revealed that they were clones derived from the same gene. There, the 4.6 kb and 3.5 kb fragments obtained by digesting the longest clone with EcoRI were used for BLUESCRIPT II KS + (St
ratagene) was inserted into the EcoRI site. PgAZ for each
It was named 42-4.4 and pgAZ42-3.6. (3) Determination of the nucleotide sequences of pgAZ42-4.4 and pgAZ42-3.6 It was found by hybridization using cDNA as a probe that pgAZ42-4.4 contains the 5'end of the cDNA and the promoter region, and Whole area and
Part of pgAZ42-3.5 dideoxy method (Sanger e
Tal. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463 (1977)), the nucleotide sequence was determined (see SEQ ID NO: 1). The primer was used for the sequencing reaction by synthesizing a part of the region whose base sequence was determined as needed. Figure 2 shows the restriction map of the AZ42 gene. The protein-coding region was divided into 3 introns and consisted of 4 exons.
There were some characteristic repeats in the promoter region (Fig. 1, arrow, box, double wavy line).

【００１５】実施例２ （発現カセットの構築：pPOX9
） pPOX9 は、AZ42遺伝子のプロモーター（POX ）の下流に
レポーター遺伝子として大腸菌のβ-1,3- グルクロニダ
ーゼ遺伝子（GUS ）とノパリンシンターゼのターミネー
ター（NOS ）を連結したカセット（POX/GUS/NOS ）を有
する。また、選抜マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝
子（NPTII ）を有する。実施例１によって得られた AZ4
2 遺伝子よりプロモーター領域を切り出す際、FbaIを用
いるが、この制限酵素はメチル化されている DNAを消化
できない。そこで、pAZ42-4.4 により大腸菌 JM110（da
m,dcm ）を形質転換し、脱メチル化されたプラスミド p
AZ42-4.4の DNAを調製した。制限酵素 FbaI と SalI で
切り出される 2.2 kb のプロモーターを含む DNA断片
を、バイナリーベクター pBI101(CLONTECH社製）の Bam
HIと SalI 間に挿入した。pPOX9 の構造は制限酵素地図
の作製や塩基配列の決定により確認した。このプラスミ
ドの構造を図３に示す。Example 2 (Construction of Expression Cassette: pPOX9
) PPOX9 is a cassette (POX / GUS / NOS) in which the β-1,3-glucuronidase gene of Escherichia coli (GUS) and the nopaline synthase terminator (NOS) are linked downstream of the promoter (POX) of the AZ42 gene as a reporter gene. Have. It also has a kanamycin resistance gene (NPTII) as a selection marker. AZ4 obtained according to Example 1
FbaI is used to excise the promoter region from the two genes, but this restriction enzyme cannot digest methylated DNA. Therefore, E. coli JM110 (da
m, dcm) and demethylated plasmid p
DNA of AZ42-4.4 was prepared. A DNA fragment containing the 2.2 kb promoter excised with the restriction enzymes FbaI and SalI was inserted into the Bam of the binary vector pBI101 (CLONTECH).
Inserted between HI and SalI. The structure of pPOX9 was confirmed by constructing a restriction map and determining the nucleotide sequence. The structure of this plasmid is shown in FIG.

【００１６】実施例３ （発現カセットの植物細胞内へ
の導入） 実施例２によって得られたプラスミド pPOX9は塩化セシ
ウム密度勾配遠心法により精製し、塩化カルシウム処理
によりコンピテント状態にしたアグロバクテリウム菌
（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ）（ストレプト
マイシン耐性、リファンピシン耐性を示す。）（CLONTE
CH社製）に導入した。形質転換体は、導入されたプラス
ミドの NPTII遺伝子により付与されるカナマイシン耐性
の性質を利用してストレプトマイシン 300 ug/ml、リフ
ァンピシン 100ug/ml 、カナマイシン 100ug/ml を含む
L寒天培地で選抜することによって得られた。得られた
アグロバクテリウム菌の形質転換体をストレプトマイシ
ン 300ug/ml、リファンピシン 100 ug/ml、カナマイシ
ン 100 ug/mlを含む L培地で 20 ℃一昼夜培養し、得ら
れた菌液を S.B.Gelvin, R.A.Schilperoort and D.P.S.
Verma著；Plant Molecular Biology/Manual（1988）（K
luwer Academic Publishers発行）に記載されている通
常の方法でタバコ葉部のディスク片への感染に用いた。
感染した葉部ディスク片を MS-NB寒天培地で４日間培養
した後、セフォタキシム500 ug/mlを含む MS-NB寒天培
地に移し、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。11日
目にセフォタキシム 500 ug/mlとカナマイシン 100 ug/
mlを含むMS-NB 寒天培地に移し、形質転換体の選抜を開
始した。約４週間後、緑色の茎葉分化した幼植物体をデ
ィスク片から切り分け、セフォタキシム 500 ug/mlとカ
ナマイシン50 ug/ml を含む MS 寒天培地に植え継ぎ、
発根した幼植物体を選抜した。なお、形質転換体におけ
る導入遺伝子の挿入の確認は、以下の方法によって行っ
た。上記の形質転換タバコの葉片約 0.5g をエッペンド
ルフチューブ中でホモジェナイザーを用いて十分摩砕し
た後、あらかじめ 65 ℃に保温した 2xCTAB 液（2% cet
yltrimethyl amonium bromide, 1% polyvinylpyroridon
e(PVP)）0.5 mlを加え、65℃で５分間保温した。これに
0.5 ml のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:
1）混合液を加え、緩やかに５分間混合した。12,000 rp
m（10,000xg）で１０分間遠心分離して上層を分取し、
0.5 mlのイソプロピルアルコールを加え混合した。12,0
00 rpm(10,000xg)で 15 分間遠心分離して得られた沈澱
を 200 ul TE（10mM Tris-HCL pH8.0, 1 mM EDTA）に溶
解した。RNaseAを１０ ug/mlとなるように加え、37℃で
30 分間保温し、RNA を分解した。反応後等容のフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:1
）混液を加えて良く混合し、上層を分取した。1/10 容
の 3M 酢酸ナトリウム液（pH5.2 ）と 2.5容のエタノー
ルを加えて良く混合し、12,000 rpm（10,000xg）で５分
間遠心分離して約５ｇのゲノム DNAを得た。得られた形
質転換タバコのゲノム DNAの 50 ngを鋳型として配列番
号２及び３で示される塩基配列を有する２つの合成プラ
イマーを用いて PCRで AZ42 遺伝子のプロモーター領域
の増幅を行い、PCR 反応液の一部をアガロース電気泳動
で解析した。選抜した形質転換体で AZ42 遺伝子のプロ
モーター領域に相当するサイズの DNA断片の増幅が見ら
れた。Example 3 (Introduction of Expression Cassette into Plant Cell) The plasmid pPOX9 obtained in Example 2 was purified by a cesium chloride density gradient centrifugation method, and was made competent by treatment with calcium chloride. (Agrobacterium tumefaciens LBA4404) (Streptomycin resistance, rifampicin resistance.) (CLONTE
CH company). The transformant contained streptomycin 300 ug / ml, rifampicin 100 ug / ml, kanamycin 100 ug / ml by utilizing the kanamycin resistance property conferred by the NPTII gene of the introduced plasmid.
Obtained by selection on L agar. The resulting transformants of Agrobacterium were cultured overnight at 20 ° C in L medium containing streptomycin 300 ug / ml, rifampicin 100 ug / ml, kanamycin 100 ug / ml, and the resulting bacterial solution was added to SBGelvin, RASchilperoort and DPS.
By Verma; Plant Molecular Biology / Manual (1988) (K
Luwer Academic Publishers), and used to infect a leaf disc of a tobacco leaf by the usual method.
The infected leaf disc pieces were cultured on MS-NB agar medium for 4 days, and then transferred to MS-NB agar medium containing 500 ug / ml cefotaxime to eradicate Agrobacterium. Day 11 cefotaxime 500 ug / ml and kanamycin 100 ug / ml
The cells were transferred to MS-NB agar medium containing ml to start the selection of transformants. After about 4 weeks, the green foliage-differentiated seedlings were cut from the disc pieces and transferred to MS agar medium containing 500 ug / ml cefotaxime and 50 ug / ml kanamycin.
Rooted seedlings were selected. The insertion of the transgene in the transformant was confirmed by the following method. Approximately 0.5 g of the above-mentioned transformed tobacco leaf pieces were thoroughly ground in an Eppendorf tube using a homogenizer, and then 2xCTAB solution (2% cet) preheated to 65 ° C was used.
yltrimethyl amonium bromide, 1% polyvinylpyroridon
0.5 ml of e (PVP)) was added, and the mixture was kept at 65 ° C. for 5 minutes. to this
0.5 ml of chloroform / isoamyl alcohol (24:
1) The mixed solution was added and gently mixed for 5 minutes. 12,000 rp
Centrifuge for 10 minutes at m (10,000xg) to collect the upper layer,
0.5 ml of isopropyl alcohol was added and mixed. 12,0
The precipitate obtained by centrifugation at 00 rpm (10,000xg) for 15 minutes was dissolved in 200 ul TE (10 mM Tris-HCL pH8.0, 1 mM EDTA). Add RNase A to 10 ug / ml, and at 37 ℃
It was kept warm for 30 minutes to decompose RNA. After reaction, equal volumes of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1
) The mixed solution was added and mixed well, and the upper layer was separated. 1/10 volume of 3M sodium acetate solution (pH5.2) and 2.5 volumes of ethanol were added and mixed well, followed by centrifugation at 12,000 rpm (10,000xg) for 5 minutes to obtain about 5 g of genomic DNA. Amplification of the promoter region of the AZ42 gene was carried out by PCR using 50 ng of the obtained transgenic tobacco genomic DNA as a template and two synthetic primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, and A part was analyzed by agarose electrophoresis. Amplification of a DNA fragment of a size corresponding to the promoter region of the AZ42 gene was observed in the selected transformants.

【００１７】実施例４ （形質転換体植物の自家受粉と
純系ラインの育成） 実施例３で導入遺伝子が確認された形質転換タバコ幼植
物体を土壌に移し、温室で育成した。開花期に花を自家
受粉させ成熟した花から種子を得た。得られた種子を 1
% 次亜塩素酸ナトリウム中で５分間殺菌した後、カナマ
イシン 100 ug/mlを含む MS 寒天培地に播種した。播種
した種子の全てが発芽し生育するクローンを選抜したす
ることによって純系ラインを得た。Example 4 (Self-pollination of transformed plants and growth of pure line) The transformed tobacco seedlings whose transgene was confirmed in Example 3 were transferred to soil and grown in a greenhouse. Seeds were obtained from mature flowers by self-pollinating the flowers at the flowering stage. 1 seeds obtained
After sterilizing in 5% sodium hypochlorite for 5 minutes, it was seeded on MS agar medium containing 100 ug / ml of kanamycin. A pure line was obtained by selecting a clone in which all of the sown seeds germinated and grew.

【００１８】実施例５ （植物体を用いたポジティブ化
合物の評価） 実施例４によって得られた形質転換タバコ種子を 1% 次
亜塩素酸ナトリウム中で殺菌し、播種・生育させたタバ
コの成熟葉片（15 x 15 mm）を以下に示す各種濃度の化
合物溶液に浮かべた。また、対照としては葉片を蒸留水
に浮かべたものを同様に処理した。 １）サリチル酸（0.01〜 5 mM ）:100 mM 溶液（pH6 〜
7）を蒸留水で希釈して用いた。 ２）ニコチン酸（0.1 〜 1 mM ）：1 M 溶液（DMSO中）
を蒸留水で希釈して pH6 〜 7に調製した。明所 25 ℃
で２日間処理した後、葉片を蒸留水で洗浄し、以下に示
すようにβ-1,3- グルクロニダーゼの活性測定あるいは
活性染色を行った。 １）活性測定 形質転換体タバコの成熟葉片約 100 mg をエッペンドル
フチューブに入れ、100 ulの抽出緩衝液（50 mM リン酸
緩衝液 pH7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1 %
Sarkosyl, 10 mMメルカプトエタノール）中でホモジェ
ナイザーにより十分摩砕した。12,000 rpm(10,000xg) 1
5 分間の遠心分離によって得られる上清を GUS活性測定
に用いた。反応液の組成は、50 mM リン酸緩衝液 pH7.
0, 10 mMEDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% Sarkosyl, 10
mM メルカプトエタノール, 1mM4-methylumbelliferyl-
β-D-glucuronideで、全反応液 500 ul 中に抽出液 10
〜 50 ulを用いて 37 ℃で反応を行った。一定反応時間
毎に（例えば、0 分、10分、20分、30分）100 ulずつ４
回サンプリングし、直ちに 900 ul 反応停止液（0.2 M
炭酸ナトリウム溶液）と混合して反応を停止した。分光
蛍光光度計（日立製作所 F-2000 ）を用いてサンプルの
蛍光光度を測定し、その増加速度から GUS活性を算出し
た。 ２）染色 GUS染色液（1 mM X-Gluc, 0.5 mM K₃Fe(CN)₆ , 0.5 mM
Fe₄Fe(CN)₆ , 0.3% Triton X-100 ）に植物組織を浸漬
し、37℃で一晩保温した。植物組織をエタノールに移
し、数回エタノールを交換することにより脱色した。青
色色素の沈着量を調査した。表１に葉片の化合物処理に
よる GUS活性の変化を、表２に GUS染色の結果を示す。Example 5 (Evaluation of Positive Compounds Using Plants) Transformed tobacco seed obtained in Example 4 was sterilized in 1% sodium hypochlorite, and mature leaf pieces of tobacco were sown and grown. (15 x 15 mm) was floated on the compound solutions having various concentrations shown below. As a control, leaf pieces floated on distilled water were similarly treated. 1) Salicylic acid (0.01-5 mM): 100 mM solution (pH 6-
7) was diluted with distilled water before use. 2) Nicotinic acid (0.1-1 mM): 1 M solution (in DMSO)
Was diluted with distilled water to adjust the pH to 6-7. Light 25 ° C
After the treatment for 2 days, the leaf pieces were washed with distilled water, and β-1,3-glucuronidase activity was measured or stained as described below. 1) Activity measurement Approximately 100 mg of mature leaf pieces of transformant tobacco were placed in an Eppendorf tube and 100 ul of extraction buffer (50 mM phosphate buffer pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1%) was added.
It was thoroughly ground with a homogenizer in Sarkosyl, 10 mM mercaptoethanol. 12,000 rpm (10,000xg) 1
The supernatant obtained by centrifugation for 5 minutes was used for GUS activity measurement. The composition of the reaction solution is 50 mM phosphate buffer pH 7.
0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% Sarkosyl, 10
mM Mercaptoethanol, 1 mM 4-methylumbelliferyl-
β-D-glucuronide was used to extract 10 parts of the total reaction solution in 500 ul.
The reaction was carried out at 37 ° C using ~ 50 ul. 100 ul at every fixed reaction time (eg 0 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes) 4
Sampled twice, immediately 900 ul stop solution (0.2 M
The reaction was stopped by mixing with a sodium carbonate solution). The fluorescence intensity of the sample was measured using a spectrofluorometer (F-2000, Hitachi Ltd.), and the GUS activity was calculated from the rate of increase. 2) Staining GUS staining solution (1 mM X-Gluc, 0.5 mM K ₃ Fe (CN) ₆ , 0.5 mM
Fe ₄ Fe (CN) _6, was immersed 0.3% Triton X-100) to the plant tissue, and incubated overnight at 37 ° C.. The plant tissue was transferred to ethanol and decolorized by exchanging the ethanol several times. The amount of blue pigment deposited was investigated. Table 1 shows changes in GUS activity of leaf pieces treated with compounds, and Table 2 shows the results of GUS staining.

【００１９】[0019]

【表１】 ──────────────────────────────── 植物材料 化合物処理 GUS活性（nmolMU/min/mg ） ──────────────────────────────── 葉片 水 138 (1) 0.5 mM サリチル酸 2627 (19) 0.5 mM ニコチン酸 2404 (17) ──────────────────────────────── （）の数は、水処理に対する相対誘導度を示す。[Table 1] ──────────────────────────────── Plant material Compound-treated GUS activity (nmolMU / min / mg) ─ ─────────────────────────────── Leaf leaf water 138 (1) 0.5 mM salicylic acid 2627 (19) 0.5 mM nicotinic acid 2404 ( 17) ──────────────────────────────── The number in () indicates the relative degree of induction for water treatment.

【００２０】[0020]

【表２】 ──────────────────────────────── 植物材料 化合物処理 染色度 ──────────────────────────────── 葉片 水 ＋／− 0.5 mM サリチル酸 ＋＋＋ 0.5 mM ニコチン酸 ＋＋ ──────────────────────────────── 青色色素の強度を＋の数で示す。[Table 2] ──────────────────────────────── Plant material Compound treatment Staining degree ──────── ──────────────────────── Leaf leaf water +/- 0.5 mM salicylic acid ++ + 0.5 mM nicotinic acid ++ + ──────────── ──────────────────── Indicates the intensity of the blue dye by the number of +.

【００２１】特開平 2-9377 号公報には、タバコＰＲタ
ンパク質遺伝子（PR1a,R,Q）、塩基性及び酸性グルカナ
ーゼ遺伝子、塩基性及び酸性キチナーゼ遺伝子等のプロ
モーターを利用した例、特表平 3-504921 号公報及び特
表平 5-504046 号公報には、フェニルアラニンアンモニ
アリアーゼ遺伝子（PAL ）、カルコンシンターゼ遺伝子
（CHS ）、4-クマレート-CoAリガーゼ遺伝子（4CL ）、
ヒドロキシプロリンリッチグリコプロテイン遺伝子（HR
GP）等のプロモーターを利用した例について記載があ
る。これらのプローモーターが有する、化合物処理によ
るレポーター遺伝子の発現に関する誘導度について比較
する。PAL （our data）及び 4CL（EMBO.J.,(1991)10:1
767-1775 ）では、エリシター（植物における病害虫抵
抗性付与に関与する遺伝子のプロモーターからの転写を
誘導する能力を有する化合物）処理によるレポーター遺
伝子の発現誘導は認められず、CHS では、グルタチオン
処理により最大 5.2倍（特表平 5-504046 号公報、特表
平3-504921号公報）、オキザロ酸処理により最大２倍
（Mol.Plant-Microbe Interact.(1990)3:381-388）のレ
ポーター遺伝子の発現誘導が認められている。また塩基
性及び酸性グルカナーゼ遺伝子では、サリチル酸処理に
より２〜７倍（Plant Cell(1990)2:1131-1143, Plant M
ol.Biol.(1993)21:451-461）のレポーター遺伝子の発現
誘導が認められ、HRGP（特表平 5-504046,3-504921号公
報）では、グルタチオンやエリシター処理によるレポー
ター遺伝子の発現誘導は小さく（最大３倍）、化合物未
処理でもバックグランドが認められ、また塩基性キチナ
ーゼ遺伝子（Plant Mol.Biol.(1994)24:485-493 ）及び
酸性キチナーゼ遺伝子（our data）では、エリシター処
理により最大９ 〜１０倍のレポーター遺伝子の発現誘
導が認められるが活性は低い。以上より、いずれのプロ
モーターもレポーター遺伝子の発現誘導度が低い、ある
いは活性が低いなどの理由で植物における病害虫抵抗性
付与化合物のスクリーニングを行うには不十分である。
またタバコＰＲタンパク質遺伝子のなかにはサリチル酸
処理によるレポーター遺伝子の発現誘導度が比較的に高
いもの(PR1a)が存在するが、このようなものは化合物未
処理におけるバックグランドも非常に高いので病害虫抵
抗性付与化合物のスクリーニングには適切ではない（特
開平2-257884号公報）。PR1a以外のタバコＰＲタンパク
質遺伝子のプロモーターでは、レポーター遺伝子の発現
誘導度は低く、そのうえに化合物未処理におけるバック
グランドも高い（Plant Cell(1991)3:1085-1094 ）ので
好ましいとはいえない。これに対して、本発明で用いら
れる植物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロモーター
では、サリチル酸処理により最大１９倍のレポーター遺
伝子の発現誘導度を示し、化合物未処理におけるバック
グラウンドも低いために病害虫抵抗性付与化合物のスク
リーニングに適していることが判明した（表１参照）。[0021] Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-9377 discloses an example using promoters of tobacco PR protein gene (PR1a, R, Q), basic and acid glucanase genes, basic and acid chitinase genes, etc. -504921 and Japanese Patent Publication No. 5-504046, phenylalanine ammonia lyase gene (PAL), chalcone synthase gene (CHS), 4-coumarate-CoA ligase gene (4CL),
Hydroxyproline-rich glycoprotein gene (HR
There is a description about an example using a promoter such as GP). These promoters are compared with each other for the degree of induction of reporter gene expression by compound treatment. PAL (our data) and 4CL (EMBO.J., (1991) 10: 1
767-1775), expression induction of the reporter gene by treatment with elicitor (a compound capable of inducing transcription from a promoter of a gene involved in imparting pest resistance in plants) was not observed. The reporter gene was 5.2 times (Mole.Plant-Microbe Interact. (1990) 3: 381-388) up to 2 times (Mol.Plant-Microbe Interact. (1990) 3: 381-388) by oxaloic acid treatment. Expression induction is recognized. In addition, the basic and acid glucanase genes were treated with salicylic acid 2 to 7 times (Plant Cell (1990) 2: 1131-1143, Plant M).
ol.Biol. (1993) 21: 451-461), the expression induction of the reporter gene was observed. In HRGP (Table 5-504046,3-504921), expression induction of the reporter gene by glutathione or elicitor treatment was observed. Is small (up to 3 times), background is observed even without compound treatment, and basic chitinase gene (Plant Mol. Biol. (1994) 24: 485-493) and acid chitinase gene (our data) are treated with elicitor. The expression induction of the reporter gene was observed up to 9 to 10 times, but the activity was low. As described above, any of the promoters is insufficient for screening pest resistance-imparting compounds in plants due to low expression induction of the reporter gene or low activity.
In addition, among the tobacco PR protein genes, there is a gene (PR1a) that has a relatively high expression inducibility of the reporter gene by salicylic acid treatment. However, such a gene also has a very high background in the untreated compound, and thus imparts pest resistance. It is not suitable for screening compounds (JP-A-2-257884). Promoters of tobacco PR protein genes other than PR1a are not preferable because the degree of expression induction of the reporter gene is low and the background in the untreated compound is high (Plant Cell (1991) 3: 1085-1094). On the other hand, in the promoter of the plant-derived peroxidase gene used in the present invention, the salicylic acid treatment showed a maximum 19-fold increase in the expression level of the reporter gene, and the background in the untreated compound was low, and thus the pest resistance was imparted. It was found to be suitable for compound screening (see Table 1).

【００２２】実施例６ （植物体を用いた検体化合物の
スクリーニング） 種子滅菌（0.1% 次亜塩素酸ナトリウム液中で５分）し
た形質転換体種子を 100 ug/mlカナマイシンを含む MS
寒天培地上で発芽させ、２日後の実生をスクリーニング
に用いた。1 g/ml(1,000 ppm)(DMSO中) に調製した化合
物を蒸留水で5〜 20 ppm の濃度に調製し、実生ととも
に４８穴マルチプレート（住友ベークライト製）に入
れ、明所 25 ℃で２日間保温した。各実生を蒸留水で洗
浄し、GUS染色液（実施例５参照）に浸漬して、２日間
保温した後、エタノールで数回脱色した。処理により実
生が青色に染まっている化合物を選抜することにより化
合物のスクリーニングを行った。また、対照としてサリ
チル酸を５〜２０ppm に調製し、同様に処理した。Example 6 (Screening of Specimen Compounds Using Plants) Seed-sterilized (5 minutes in 0.1% sodium hypochlorite) transformant seeds were MS containing 100 ug / ml kanamycin.
Germinated on agar medium and seedlings 2 days later were used for screening. The compound prepared to 1 g / ml (1,000 ppm) (in DMSO) was prepared with distilled water to a concentration of 5 to 20 ppm, and placed in a 48-well multiplate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) along with the seedlings at 25 ° C in the light at 2 ° C. It was kept warm for a day. Each seedling was washed with distilled water, immersed in a GUS stain (see Example 5), kept warm for 2 days, and then decolorized several times with ethanol. Compounds were screened by selecting compounds whose seedlings were stained blue by the treatment. As a control, salicylic acid was adjusted to 5 to 20 ppm and treated in the same manner.

【００２３】実施例において用いられた培地の組成を以
下に示す。 1. MS 寒天培地 MURASHIGE AND SKOOG(Flow Laboratories)34.7 gを蒸留
水 1 Lに溶かし、1M KOHで pH 5.8 に調製し、寒天を８
g添加した後オートクレーブ滅菌した。 2. MS-NB寒天培地 MS寒天培地に、1-ナフタリン酢酸（NAA ）0.1 mg/mL 6-
ベンジルアミノプリン（BA）1.0 mg/mL を添加した培
地。 3. L 培地 バクトトリプトン（Difco ）10 g、バクトイーストエキ
ストラクト（Difco ）5 g 、NaCl 10 g を蒸留水 1 Lに
溶かし、5 M NaOHで pH 7.0 に調製し、オートクレーブ
滅菌する。The composition of the medium used in the examples is shown below. 1. Dissolve 34.7 g of MS agar medium MURASHIGE AND SKOOG (Flow Laboratories) in 1 L of distilled water and adjust to pH 5.8 with 1 M KOH.
After adding g, it was sterilized by autoclave. 2. MS-NB agar medium Add 1-naphthalene acetic acid (NAA) 0.1 mg / mL 6- to MS agar medium.
Medium containing benzylaminopurine (BA) 1.0 mg / mL. 3. L medium Dissolve 10 g of bactotryptone (Difco), 5 g of bacto yeast extract (Difco) and 10 g of NaCl in 1 L of distilled water, adjust to pH 7.0 with 5 M NaOH, and sterilize by autoclaving.

【００２４】[0024]

【発明の効果】本発明により、レポーター遺伝子の発現
に関する高い誘導度が得られ、かつ、バックグランドに
おけるレポーター遺伝子の発現に関する誘導度が極めて
低くなった。このために、レポーター遺伝子の発現を検
出するための煩雑な活性測定が不必要となり、また多く
の検体化合物をスクリーニングすることが可能になっ
た。本発明方法を用いることによって、プロモーターか
らの転写を誘導する能力を有する化合物、さらには植物
における病害虫抵抗性付与化合物を実用的にスクリーニ
ングすることができるようになった。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a high degree of induction of reporter gene expression was obtained, and the degree of induction of reporter gene expression in the background was extremely low. Therefore, complicated activity measurement for detecting the expression of the reporter gene is unnecessary, and it has become possible to screen many sample compounds. By using the method of the present invention, it has become possible to practically screen a compound capable of inducing transcription from a promoter, and further a compound imparting pest resistance in plants.

【００２５】[0025]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：５０１２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：アズキ（Vignaangularis, Ohwi et Ohashi cv
Tamba-Dainagon） 品種：大納言 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：１．．２２２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTCCAAA AGTTATCATT TAAACGTTCA ATCCCGCCAC GCCGACATTT AAAGTCTTAT 60 TTAGACATCA GTCCCTCCTA ACCCGGACGC CAAATGTGTC CACTAAAATT ATATTTTAAA 120 CCCTTTAGAT GTCAGCTAGG AGGAGGTCCG ACTTCTAAAG TCATTTAGAC GTCAGCTAGG 180 ATGGGGGGCC GACTTCTAAA ATGTCTGCTA TTACACGAGA CAACAGTTAC GCACACTCAG 240 TGTTCAAGCT TTTGAAGTTC GTTTTCTCTA TTTTGCATCG TTTAAAATTA GTTTTACTCC 300 GATTACATTA CTCTTTGATG AATTATCTTC CATTTGAACT GATTATAATG CGTTTTCGTT 360 GCGTTTTGGT GTAGTTTTGC GCGTGTCTTT GGCCGACGAT TTTGAGCGTT TTTGGCCGGT 420 GATTCTTGCG TTTTTGAACG GTGCACTCCT CCATTTCCCT CCAATGTGTT TTTGAACGGT 480 GCACATGCAG ACGTCTAATG GATTACAAAA CCAAGATTCG TCGAGGACAT TAAACGTCAG 540 CTGCCCCACA ATCCGACGTC TATATAGACG TCTGACCTGT ACTATCTGAC GTCTACATTG 600 ACATATGTCG AGGACATTAA ACGTGAGCTG CCCCACAATT CGACGTCTAT ATAGACGTCT 660 GACCTGTACT ATCTGACGTC TACATTGACG TCTCCCAACA AAACGTCAGT GTACAGATCA 720 AACATTAAAA GCTCTAAATA ACAGACTTTA AAAGCCTTTT TTTCACTAGT GTTTTTTTAT 780 TGTGATATTT TATTAAAGGA ATATTAAAAC AAGAATGAAA ATTATAACAA AACACCTAAA 840 CTATAATAAA AACAATGACT TAAATATTGT CATCTTTAAT ATTTAGTTTA TTAATAAAGG 900 TATTTAAGAG TTGTCATCGT ATAAAAAACA TTTATGTAAT ACTTTGAGCA AATATATTTT 960 TTTCTACCTA ACTTCAATTT TAGGTTTCAA ATAAAGTTGA CCCATGGGCC TTACAGTCTT 1020 ATCCTTTTGT GTATATTTCT TGGATAAAGG TTAACACAAA TGACATAATT ATGCTTTAAC 1080 GGTACAAACA AATATAAAAC GGTAAAATCA CATAGTTAAT TTAAAAAAAA AACAGTTTAA 1140 TGGTAAACTA ATTTATTTGA TTAATACAAT AACATGAATA AAATAAATTA AAATATTAAT 1200 TATCAATGCT GAAAAGACCA TCTTGATTTA TATTGTTGTT TAATTTTACA TAATTTTTAT 1260 CAAAAAAACA TTAAAAAATA GTAAAGTAAT AAATAAAGCA ATTTTGAAAC ATGTTTCAAG 1320 AAGGCGTATG GGACTACATA GAAAATATAC CAAAAGGGCA AAATATAGAT ATAAAAGAAA 1380 TAACAATAAT TATAAAAAGC AGCACAAGTT ATATATTGAT GAGATTGAAA TGGATATAAA 1440 ACTACTAAGC TTTGCGTAAG GTTTGAAAAC TCCTATAGGT ATTTTTTTTA TATAAAAGCT 1500 TTATCTTTTC CAAAATTATT AGCTATTGAA AATAAACTGA ATAAAATGGT TAATTTTCAG 1560 CTTAATTTTT TACTTTCAAG GAGAAAAAAT AAATAAATGG AGGTAAAGAT GATATTACTG 1620 GATTCGTGTA TTTTAATCAA TTTGGAACAA AACTGACTGA AAAAGAATAA TTTGAAACAT 1680 ATTGATGGCC GTCAAAGTTG AATTGTACAC GTGCCCTGTT GAGTAGTAGG AACAGTCGAG 1740 GGAGCCTTCA AGTTTAGAGC TAAGAAAAAC TAATATTAAA AGTAGATAAA TTTTAGAAAA 1800 AATATATATT TTAATATCCA TAAATTTTTT ATATTTATTT GATATATATA TATATTTTAC 1860 TCTAATTTTT TTGAAAAATT ATAAATTTTT TCATACCATT TTATTGTCAA ATAAATGTAA 1920 ATATATTACT TAAATTTTTA AAAATCAATT TATTATGTGA AAGAAAATTG AACGGAGGAG 1980 ATCGTCAATA TAGCTTCTAT TCATTGTAAT ATAATCTCAT CCACTTGCCT TCATTGTCTA 2040 ACTTTGTTTC CTCTGGAGAC GTCCTTGAAC CAACCACACG GCTGCTGAGA ATCCTCATAA 2100 TCTGCAAAAC TCCATTTATT ATTCACATTC ACGCAGGGTT CCATTCTTCA GACTCACTAA 2160 TTCTCTATAA ATACTATACA TCCCTTGCTA CATCTGAACC CATTACCTTT CTACTTTTGA 2220 TCATGGCTTC TATTTCTTCT AATAAGAATG CTATTTTCAG CTTTCTTCTC CTCTCTATCA 2280 TTCTTTCTGT TTCAGTTATT AAAGTGTGTG AGGCACAAGC CAGGCCTCCT ACTGTCAGAG 2340 GTCTATCATA TACCTTCTAT TCCAAAACTT GCCCTACGCT TAAATCCATA GTTAGAACTG 2400 AGCTCAAAAA GGTCTTCCAG AGCGACATTG CTCAAGCTGC TGGCTTGCTT CGCCTTCACT 2560 TCCATGACTG CTTTGTTCAG GTAATTAATC AAACACTAGT TTACAGAATG AATAACGGTG 2520 AAAAAGCACA CTCCACAAAC ATAAACACAA ACACTTGGTA CTCGTGGGCA CTAAACATTT 2680 TTGGAAGAAA GAATTTGATA ACAATTAATC CACATTTAGC TGTTATGAAA CATTCATCGA 2740 TTTGGGTGTA CAAAAATCAT GGTGAGAAAT GCGTTTGATG TAGGGATGTG ATGGGTCAGT 2700 TTTATTGGAT GGATCTGCAA GTGGGCCGAG TGAGAAAGAT GCGCCACCAA ACTTGACTTT 2760 GAGAGCTGAA GCTTTTAGGA TCATCGAAAG GATTCGTGGT CTGTTAGAGA AGAGCTGTGG 2820 AAGAGTCGTC TCATGTTCAG ACATCACTGC CCTCGCTGCA CGTGATGCTG TTTTCCTTGT 2880 AAGTACCATT ATTTTGGATA GACTTCATGT TTTCACACTC TTTTTATTCT CTTACTTTTT 2940 CTTAACAATT CTATATAATC ATTTTTTATT CAATAATTTC ATTTAAATTT AAATTTTATT 3000 ATACTAATTT AATAATAACA CAGTTGTCAA ATGGAAGAAA AAACAGTCTC AAACTAACTT 3060 TTTTTCTTTT CAATATTATT CAGAGATTGT GTATTAGTTA TTATCGAAAA ATATGCTAAA 3120 CATAACTTTT AAAATCATTA TTATAAAATT AGAAAAATAT GTCTTGGTCA TTGTCGTATG 3180 TGACTTTATC TTTATCAAAG AAAATTGAGG GAGTGATGAA GGTTACGTAT TTTCCAAATA 3240 TGAAACTAAA CACTTTTTGT TCTTCCCAAA ATTAATCATT TTATCATTAG ATTTAAATGA 3300 AATAAACATA AGATAAAAAA AACACATAAG AAAATATTTC AAAATAACTT TTGTTTGATA 3360 CGAGAAAAAC ACGTTTAATA CGAGAAAAGG ACATGACAAA CAACATCAGA AAAAATACGC 3420 ACATATAAAA GAATAAATCC CTCATTTAAT ACATGAGGTT TAAGAGAAAA AAAAATCAAG 3480 GTCCCTTACT ATATAATCCT TTCCTTCCAA TTTGAAAAAA AAAGGTACTT AAAAAGGAGC 3540 AGATATAAAA TACCATTATC TTTTATCGTT AAAACGTACA CAAACAAAAA TAATATACAT 3600 ATTTTTATTT TAAAATAATT GTCATTCTTT AAATATACTA CTTTAAACAA TTAAGGGAGT 3660 GTCATTTGAA TACTGGAAAT AAACGCATGT TTTATTCAAT ACTTGCTTCT TCTTTTTGTA 3720 CATCATAATA CATAGAAGAA AGTCAGCAAA TTGGTTACAA CTAGTTATAC TAATACATGT 3780 TGAAGAAAAT GGAACCATTC ATATTCATGG AAAACATAAT ACATAAAAGG ATGTTCAGTG 3840 AGTCAATCCA ACCATACCCT TAAACAATGG TCAATATTTT GTTTTTACCT TTTCTTCATT 3900 TGACACTTTC TTTTATAAAG CAAAAGCCTT CTTTCTGGTT TTTGTGGGAT TGATAATGTA 3960 TAAAAATTGT ATCTTTATTA TGAATGACAG TCAGGGGGAC CAGACTATGA GATTCCCTTG 4020 GGAAGGAGAG ATGGGTTAAC CTTTGCCTCT AGACAGGTGA CATTAGACAA CCTTCCACCA 4080 CCCTCAAGCA ACACCACCAC CATCCTAAAC TCCCTCGCCA CCAAAAACCT CGACCCCACC 4140 GATGTGGTAT CCCTCTCTGG TGGCCACACC ATAGGCATAA GTCACTGCAG CTCTTTCAAC 4200 AACAGACTCT ACCCTACACA GGACCCTGTC ATGGACAAAA CCTTTGGCAA AAACCTCAGA 4260 CTCACTTGCC CCACCAACAC CACCGACAAC ACCACAGTCT TGGACATTCG ATCCCCCAAT 4320 ACCTTCGACA ACAAATACTA CGTTGACCTC ATGAACCGAC AGGGCCTCTT CACCTCCGAC 4380 CAAGACCTCT ACACCGATAA GAGGACCAGA GGCATTGTCA CCAGCTTTGC CGTGAACCAG 4440 AGTCTCTTCT TTGAGAAGTT TGTGTTCGCC ATGCTCAAGA TGGGTCAGCT CAGTGTGCTC 4500 ACGGGAAATC AAGGGGAGAT TCGTGCCAAC TGCTCCGTGA GGAATGCCAA CAGCAAGGCC 4560 TTCTTGAGTT CCGTCGTGGA AAATGTGGCC CAAGAATTCA TAGAAATGTA ACCGGGTCTT 4620 CTTTGTTGTA TATGTTATGA CCATGAATAA TGCGTAACCC TTGTTTCTGG ATGATCTAAC 4680 GTGGTAGGGA ACCGTTCTCT AATGTTCCTA GTTATATATA CATACGTACT TGAGTTGTAA 4740 TAAATTTTAA AATCTGAACA AGAGCTTCTC ATTGGCATGT ATACAATACA CTTCATCTTA 4800 ATCATCATAC GCACAATATA TCTTCTACAT AACTTCCTTA GAGCAGACCT GAACCCATCC 4860 GTGATAGTAA AATCCTGAAC ATAAGGCTTC GTTGAAGAAG TTAAACATTT AAGGAAGAGG 4920 ATTTCAACAT GAATAAAATA AAAAAAGCTT GTCATATTTA CAATTTTGAC CTAGAGGAGT 4980 ATAATACAAC TATATAAAAT TGAAACCAAA TT 5012SEQ ID NO: 1 Sequence length: 5012 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Sequence characteristics Origin Biological name: Vignaangularis, Ohwi et Ohashi cv
Tamba-Dainagon) Variety: Dainagon Character of sequence Sequence symbol: promoter Location: 1. ． 2222 method to determine the characteristics: E SEQ GAATTCCAAA AGTTATCATT TAAACGTTCA ATCCCGCCAC GCCGACATTT AAAGTCTTAT 60 TTAGACATCA GTCCCTCCTA ACCCGGACGC CAAATGTGTC CACTAAAATT ATATTTTAAA 120 CCCTTTAGAT GTCAGCTAGG AGGAGGTCCG ACTTCTAAAG TCATTTAGAC GTCAGCTAGG 180 ATGGGGGGCC GACTTCTAAA ATGTCTGCTA TTACACGAGA CAACAGTTAC GCACACTCAG 240 TGTTCAAGCT TTTGAAGTTC GTTTTCTCTA TTTTGCATCG TTTAAAATTA GTTTTACTCC 300 GATTACATTA CTCTTTGATG AATTATCTTC CATTTGAACT GATTATAATG CGTTTTCGTT 360 GCGTTTTGGT GTAGTTTTGC GCGTGTCTTT GGCCGACGAT TTTGAGCGTT TTTGGCCGGT 420 GATTCTTGCG TTTTTGAACG GTGCACTCCT CCATTTCCCT CCAATGTGTT TTTGAACGGT 480 GCACATGCAG ACGTCTAATG GATTACAAAA CCAAGATTCG TCGAGGACAT TAAACGTCAG 540 CTGCCCCACA ATCCGACGTC TATATAGACG TCTGACCTGT ACTATCTGAC GTCTACATTG 600 ACATATGTCG AGGACATTAA ACGTGAGCTG CCCCACAATT CGACGTCTAT ATAGACGTCT 660 GACCTGTACT ATCTGACGTC TACATTGACG TCTCCCAACA AAACGTCAGT GTACAGATCA 720 AACATTAAAA GCTCTAAATA ACAGACTTTA AAAGCCTTTT TTTCACTAGT GTTTTTTTAT 780 TGTGATATTT TATTAAAGGA ATATTAAAAC AAGA ATGAAA ATTATAACAA AACACCTAAA 840 CTATAATAAA AACAATGACT TAAATATTGT CATCTTTAAT ATTTAGTTTA TTAATAAAGG 900 TATTTAAGAG TTGTCATCGT ATAAAAAACA TTTATGTAAT ACTTTGAGCA AATATATTTT 960 TTTCTACCTA ACTTCAATTT TAGGTTTCAA ATAAAGTTGA CCCATGGGCC TTACAGTCTT 1020 ATCCTTTTGT GTATATTTCT TGGATAAAGG TTAACACAAA TGACATAATT ATGCTTTAAC 1080 GGTACAAACA AATATAAAAC GGTAAAATCA CATAGTTAAT TTAAAAAAAA AACAGTTTAA 1140 TGGTAAACTA ATTTATTTGA TTAATACAAT AACATGAATA AAATAAATTA AAATATTAAT 1200 TATCAATGCT GAAAAGACCA TCTTGATTTA TATTGTTGTT TAATTTTACA TAATTTTTAT 1260 CAAAAAAACA TTAAAAAATA GTAAAGTAAT AAATAAAGCA ATTTTGAAAC ATGTTTCAAG 1320 AAGGCGTATG GGACTACATA GAAAATATAC CAAAAGGGCA AAATATAGAT ATAAAAGAAA 1380 TAACAATAAT TATAAAAAGC AGCACAAGTT ATATATTGAT GAGATTGAAA TGGATATAAA 1440 ACTACTAAGC TTTGCGTAAG GTTTGAAAAC TCCTATAGGT ATTTTTTTTA TATAAAAGCT 1500 TTATCTTTTC CAAAATTATT AGCTATTGAA AATAAACTGA ATAAAATGGT TAATTTTCAG 1560 CTTAATTTTT TACTTTCAAG GAGAAAAAAT AAATAAATGG AGGTAAAGAT GATATTACTG 1620 GATTCGTGTA TTTTAATCAA TTTGGAACAA AACTGACTGA AA AAGAATAA TTTGAAACAT 1680 ATTGATGGCC GTCAAAGTTG AATTGTACAC GTGCCCTGTT GAGTAGTAGG AACAGTCGAG 1740 GGAGCCTTCA AGTTTAGAGC TAAGAAAAAC TAATATTAAA AGTAGATAAA TTTTAGAAAA 1800 AATATATATT TTAATATCCA TAAATTTTTT ATATTTATTT GATATATATA TATATTTTAC 1860 TCTAATTTTT TTGAAAAATT ATAAATTTTT TCATACCATT TTATTGTCAA ATAAATGTAA 1920 ATATATTACT TAAATTTTTA AAAATCAATT TATTATGTGA AAGAAAATTG AACGGAGGAG 1980 ATCGTCAATA TAGCTTCTAT TCATTGTAAT ATAATCTCAT CCACTTGCCT TCATTGTCTA 2040 ACTTTGTTTC CTCTGGAGAC GTCCTTGAAC CAACCACACG GCTGCTGAGA ATCCTCATAA 2100 TCTGCAAAAC TCCATTTATT ATTCACATTC ACGCAGGGTT CCATTCTTCA GACTCACTAA 2160 TTCTCTATAA ATACTATACA TCCCTTGCTA CATCTGAACC CATTACCTTT CTACTTTTGA 2220 TCATGGCTTC TATTTCTTCT AATAAGAATG CTATTTTCAG CTTTCTTCTC CTCTCTATCA 2280 TTCTTTCTGT TTCAGTTATT AAAGTGTGTG AGGCACAAGC CAGGCCTCCT ACTGTCAGAG 2340 GTCTATCATA TACCTTCTAT TCCAAAACTT GCCCTACGCT TAAATCCATA GTTAGAACTG 2400 AGCTCAAAAA GGTCTTCCAG AGCGACATTG CTCAAGCTGC TGGCTTGCTT CGCCTTCACT 2560 TCCATGACTG CTTTGTTCAG GTAATTAATC AAACACTAGT TTACAGAA TG AATAACGGTG 2520 AAAAAGCACA CTCCACAAAC ATAAACACAA ACACTTGGTA CTCGTGGGCA CTAAACATTT 2680 TTGGAAGAAA GAATTTGATA ACAATTAATC CACATTTAGC TGTTATGAAA CATTCATCGA 2740 TTTGGGTGTA CAAAAATCAT GGTGAGAAAT GCGTTTGATG TAGGGATGTG ATGGGTCAGT 2700 TTTATTGGAT GGATCTGCAA GTGGGCCGAG TGAGAAAGAT GCGCCACCAA ACTTGACTTT 2760 GAGAGCTGAA GCTTTTAGGA TCATCGAAAG GATTCGTGGT CTGTTAGAGA AGAGCTGTGG 2820 AAGAGTCGTC TCATGTTCAG ACATCACTGC CCTCGCTGCA CGTGATGCTG TTTTCCTTGT 2880 AAGTACCATT ATTTTGGATA GACTTCATGT TTTCACACTC TTTTTATTCT CTTACTTTTT 2940 CTTAACAATT CTATATAATC ATTTTTTATT CAATAATTTC ATTTAAATTT AAATTTTATT 3000 ATACTAATTT AATAATAACA CAGTTGTCAA ATGGAAGAAA AAACAGTCTC AAACTAACTT 3060 TTTTTCTTTT CAATATTATT CAGAGATTGT GTATTAGTTA TTATCGAAAA ATATGCTAAA 3120 CATAACTTTT AAAATCATTA TTATAAAATT AGAAAAATAT GTCTTGGTCA TTGTCGTATG 3180 TGACTTTATC TTTATCAAAG AAAATTGAGG GAGTGATGAA GGTTACGTAT TTTCCAAATA 3240 TGAAACTAAA CACTTTTTGT TCTTCCCAAA ATTAATCATT TTATCATTAG ATTTAAATGA 3300 AATAAACATA AGATAAAAAA AACACATAAG AAAATATTTC AAAATAACTT TTG TTTGATA 3360 CGAGAAAAAC ACGTTTAATA CGAGAAAAGG ACATGACAAA CAACATCAGA AAAAATACGC 3420 ACATATAAAA GAATAAATCC CTCATTTAAT ACATGAGGTT TAAGAGAAAA AAAAATCAAG 3480 GTCCCTTACT ATATAATCCT TTCCTTCCAA TTTGAAAAAA AAAGGTACTT AAAAAGGAGC 3540 AGATATAAAA TACCATTATC TTTTATCGTT AAAACGTACA CAAACAAAAA TAATATACAT 3600 ATTTTTATTT TAAAATAATT GTCATTCTTT AAATATACTA CTTTAAACAA TTAAGGGAGT 3660 GTCATTTGAA TACTGGAAAT AAACGCATGT TTTATTCAAT ACTTGCTTCT TCTTTTTGTA 3720 CATCATAATA CATAGAAGAA AGTCAGCAAA TTGGTTACAA CTAGTTATAC TAATACATGT 3780 TGAAGAAAAT GGAACCATTC ATATTCATGG AAAACATAAT ACATAAAAGG ATGTTCAGTG 3840 AGTCAATCCA ACCATACCCT TAAACAATGG TCAATATTTT GTTTTTACCT TTTCTTCATT 3900 TGACACTTTC TTTTATAAAG CAAAAGCCTT CTTTCTGGTT TTTGTGGGAT TGATAATGTA 3960 TAAAAATTGT ATCTTTATTA TGAATGACAG TCAGGGGGAC CAGACTATGA GATTCCCTTG 4020 GGAAGGAGAG ATGGGTTAAC CTTTGCCTCT AGACAGGTGA CATTAGACAA CCTTCCACCA 4080 CCCTCAAGCA ACACCACCAC CATCCTAAAC TCCCTCGCCA CCAAAAACCT CGACCCCACC 4140 GATGTGGTAT CCCTCTCTGG TGGCCACACC ATAGGCATAA GTCACTGCAG CTCTTTCAA C 4200 AACAGACTCT ACCCTACACA GGACCCTGTC ATGGACAAAA CCTTTGGCAA AAACCTCAGA 4260 CTCACTTGCC CCACCAACAC CACCGACAAC ACCACAGTCT TGGACATTCG ATCCCCCAAT 4320 ACCTTCGACA ACAAATACTA CGTTGACCTC ATGAACCGAC AGGGCCTCTT CACCTCCGAC 4380 CAAGACCTCT ACACCGATAA GAGGACCAGA GGCATTGTCA CCAGCTTTGC CGTGAACCAG 4440 AGTCTCTTCT TTGAGAAGTT TGTGTTCGCC ATGCTCAAGA TGGGTCAGCT CAGTGTGCTC 4500 ACGGGAAATC AAGGGGAGAT TCGTGCCAAC TGCTCCGTGA GGAATGCCAA CAGCAAGGCC 4560 TTCTTGAGTT CCGTCGTGGA AAATGTGGCC CAAGAATTCA TAGAAATGTA ACCGGGTCTT 4620 CTTTGTTGTA TATGTTATGA CCATGAATAA TGCGTAACCC TTGTTTCTGG ATGATCTAAC 4680 GTGGTAGGGA ACCGTTCTCT AATGTTCCTA GTTATATATA CATACGTACT TGAGTTGTAA 4740 TAAATTTTAA AATCTGAACA AGAGCTTCTC ATTGGCATGT ATACAATACA CTTCATCTTA 4800 ATCATCATAC GCACAATATA TCTTCTACAT AACTTCCTTA GAGCAGACCT GAACCCATCC 4860 GTGATAGTAA AATCCTGAAC ATAAGGCTTC GTTGAAGAAG TTAAACATTT AAGGAAGAGG 4920 ATTTCAACAT GAATAAAATA AAAAAAGCTT GTCATATTTA CAATTTTGAC CTAGAGGAGT 4980 ATAATACAAC TATATAAAAT TGAAACCAAA TT 5012

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：1 本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 CAGCTATGACCATGATTACGCC 22SEQ ID NO: 2 Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Sequence CAGCTATGACCATGATTACGCC 22

【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：1 本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 CGCGCTTTCCCACCAACGCTGATC 24SEQ ID NO: 3 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Sequence CGCGCTTTCCCACCAACGCTGATC 24

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は、アズキの塩基性パーオキシダーゼ遺伝
子のプロモーター領域の塩基配列上の特徴を示す図であ
る（配列番号１で示される塩基配列における塩基番号１
から２３００までの塩基配列に相当する）。矢印、ボッ
クス、二重線、二重波線は繰り返し配列、二重線は TAT
A ボックス、+1は転写開始点を示す。FIG. 1 is a diagram showing the characteristics of the promoter region of the azuki bean basic peroxidase gene on the base sequence (base number 1 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
To 2300). Arrows, boxes, double lines, double wavy lines are repeating sequences, double lines are TAT
Box A, +1 indicates the transcription start point.

【図２】図２は、アズキの塩基性パーオキシダーゼ遺伝
子のタンパク質コード領域の制限酵素地図を示す図であ
る（配列番号１で示される塩基配列における塩基番号２
２２３から４６０８までの塩基配列に相当する）。白領
域はエキソン、黒領域はイントロンを示す。FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of the protein coding region of the azuki bean basic peroxidase gene (base number 2 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
Corresponding to the nucleotide sequence from 223 to 4608). White areas indicate exons and black areas indicate introns.

【図３】図３は、発現カセットであるpPOX9 の構築方法
を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a method for constructing an expression cassette, pPOX9.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI technical display location // C12Q 1/68 A 9453-4B

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】検体である化合物を、（１）植物由来のパ
ーオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、（２）該プロモ
ーターによって転写翻訳されるレポーター遺伝子、およ
び（３）植物細胞内で機能可能なターミネーターを有
し、これらの遺伝子を機能可能な形で有する発現カセッ
トを含有する植物細胞由来の植物体またはその一部に処
理する工程、及び、前記工程後、該植物体またはその一
部におけるレポーター遺伝子の発現の有無を検出する工
程、からなること特徴とするプロモーターからの転写を
誘導する能力を有する化合物をスクリーニングする方
法。1. A compound as a sample, comprising (1) a promoter of a plant-derived peroxidase gene, (2) a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and (3) a terminator capable of functioning in plant cells. And treating the plant cell-derived plant or a part thereof containing an expression cassette having these genes in a functional form, and expressing the reporter gene in the plant or a part thereof after the step A method of screening a compound having the ability to induce transcription from a promoter characterized by comprising the step of detecting the presence or absence of. 【請求項２】検体である化合物を、（１）植物由来のパ
ーオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、（２）該プロモ
ーターによって転写翻訳されるレポーター遺伝子、およ
び（３）植物細胞内で機能可能なターミネーターを有
し、これらの遺伝子を機能可能な形で有する発現カセッ
トを含有する植物細胞由来の植物体またはその一部に処
理する工程、前記工程後、該植物体またはその一部にお
けるレポーター遺伝子の発現の有無を検出する工程、及
び、レポーター遺伝子の発現が検出された化合物の植物
における病害虫抵抗性を評価する工程からなること特徴
とする植物における病害虫抵抗性付与化合物をスクリー
ニングする方法。2. A sample compound comprising (1) a promoter of a plant-derived peroxidase gene, (2) a reporter gene transcribed and translated by the promoter, and (3) a terminator capable of functioning in a plant cell. And a step of treating a plant cell-derived plant or a part thereof containing an expression cassette having these genes in a functional form, and the presence or absence of expression of a reporter gene in the plant or a part thereof after the step And a step of evaluating the pest resistance of the compound in which the expression of the reporter gene is detected in the plant, the method for screening a pest resistance imparting compound in a plant. 【請求項３】植物由来のパーオキシダーゼ遺伝子のプロ
モーターがアズキ由来の塩基性パーオキシダーゼ遺伝子
のプローモーターであること特徴とする請求項１及び２
記載の方法。3. The plant-derived peroxidase gene promoter is the promoter of the azuki bean-derived basic peroxidase gene.
The described method. 【請求項４】レポーター遺伝子がβ-1,3- グルクロニダ
ーゼ（GUS ）構造遺伝子であること特徴とする請求項
１、２及び３記載の方法。4. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the reporter gene is a β-1,3-glucuronidase (GUS) structural gene. 【請求項５】レポーター遺伝子がルシフェラーゼ（LUC
）構造遺伝子であること特徴とする請求項１、２及び
３記載の方法。5. The reporter gene is luciferase (LUC).
4. The method according to claim 1, 2 or 3, which is a structural gene.