JPH08173187A - Monoclonal antibody against human killer cell surface molecule - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain a monoclonal antibody against human killer cell surface molecule, specifically reactive with NKG7 and useful for transplantation, phylaxis, analysis, etc., of diseases such as autoimmune diseases. CONSTITUTION: This monoclonal antibody against an NKG7 gene (having about 16000 molecular weight), comprising 149 amino acids having an amino acid sequence of the formula, expressed in a part of a natural killer(NK) cell and a cytotoxic T lymphocyte(CTL) cell and capable of coding an mRNA of 0.8kb. The monoclonal antibody is obtained by immunizing and sensitizing an animal of rodents with a synthetic peptide containing Cys added to the N-terminal of an amino acid sequence at the 121st to the 131st positions of the amino acid sequence of the formula, extirpating the spleen, preparing a suspension, fusing the resultant cell of the spleen to a cell of a myeloma of the rodents, culturing the fused cell, screening the resultant fused cell capable of producing a desired antibody with the synthetic peptide which is an immunogen (e.g. a hybridoma of an accession No. FERM P-14712), monocloning the screened fused cell according to a limiting dilution method and recovering the desired antibody from the culture supernatant.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体、さ
らに詳しくはヒトキラー細胞表面に存在するＮＫＧ７分
子と特異的に反応するモノクローナル抗体、該モノクロ
ーナル抗体の調製方法、および該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a monoclonal antibody, more specifically to a monoclonal antibody which specifically reacts with NKG7 molecule existing on the surface of human killer cells, a method for preparing the monoclonal antibody, and a hybridoma producing the monoclonal antibody.

【０００２】[0002]

【従来技術】ＮＫ(ナチュラルキラー)細胞はヒト末梢単
核細胞の５〜１５％を占めるリンパ球(表面分子：ＣＤ
３−、ＴcＲ−、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋)であり、その
標的細胞の前感作なしにかつＮＨＣ(主要組織適合抗原
系)非拘束的に腫瘍およびウイルス感染細胞を殺し、そ
れらの細胞の生体内での除去に重要な働きをしていると
考えられている。また末梢リンパ球をＩＬ−２の存在下
で培養すると、末梢リンパ球は広範囲の腫瘍に対する障
害活性を獲得するが、この活性の多くはＮＫ細胞による
ものである。これはＬＡＫ(リンホカイン活性化キラー)
現象として知られる。他のリンパ球のＴ細胞、Ｂ細胞は
それぞれの抗原認識分子(ＴcＲおよびＩg)によって厳密
な抗原特異性を保持している。それに比べ、ＮＫ細胞は
正常細胞は殺さないものの、かなり幅広く異なる腫瘍や
ウイルス感染細胞を障害するので、Ｔ細胞やＢ細胞とは
異なるタイプの抗原認識機構を持つと考えられる。BACKGROUND OF THE INVENTION NK (natural killer) cells are lymphocytes (surface molecule: CD) that occupy 5 to 15% of human peripheral mononuclear cells.
3-, TcR-, CD16 +, CD56 +), killing tumor and virus-infected cells without presensitization of their target cells and NHC (major histocompatibility complex) non-restricted It is believed to play an important role in the removal of Further, when peripheral lymphocytes are cultured in the presence of IL-2, the peripheral lymphocytes acquire a damaging activity against a wide range of tumors, but most of this activity is due to NK cells. This is LAK (lymphokine activation killer)
Known as a phenomenon. T cells and B cells of other lymphocytes maintain strict antigen specificity by their respective antigen recognition molecules (TcR and Ig). In comparison, NK cells do not kill normal cells, but damage tumors and virus-infected cells that are quite different, and therefore are thought to have a different type of antigen recognition mechanism than T cells and B cells.

【０００３】そこで、ＮＫ感受性標的細胞を認識しその
シグナルを伝達することでＮＫ細胞の活性化や障害性反
応を導くことのできるＮＫ細胞に特異なレセプター分子
(いわゆるＮＫレセプター)の同定の試みが精力的に行わ
れてきた。ＮＫ細胞に発現するレセプタータイプの分子
としてはＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＬＦＡ１(ＣＤ
１１a)、ＣＤ４５などが報告されている。これらのうち
ＣＤ２、ＬＦＡ１、ＣＤ４５はＴ細胞でも発現している
し、ＣＤ１６は好中球、ＣＤ５６は神経細胞での発現も
みられる。ＣＤ２とＣＤ１６はＮＫ細胞においてシグナ
ル伝達分子として働き、また障害反応を増強することが
示されている。しかし、それらに対する抗体はＮＫ感受
性標的細胞に対するＮＫ細胞の認識能、障害性を阻害せ
ず、またＣＤ２、ＣＤ１６陰性のＮＫ細胞も存在するの
で、これらのレセプタータイプはＮＫ活性にとって不可
欠ではない。一方、ＣＤ５６、ＬＦＡ１レセプタータイ
プは接着分子としてＮＫ細胞と他の細胞(標的細胞を含
む)との結合に働いているが、ＮＫ細胞感受性の標的細
胞に特異的な反応に対する直接的な関与は報告されてい
ない。このように既知のレセプタータイプの分子群はＮ
Ｋ活性に補助的な機能を有する分子であっても、ＮＫ細
胞に特異なレセプター分子ではないと考えられる。Therefore, NK cell-specific receptor molecules capable of activating NK cells and inducing a damaging reaction by recognizing NK-sensitive target cells and transmitting their signals.
Attempts to identify (a so-called NK receptor) have been vigorously made. Receptor type molecules expressed in NK cells include CD2, CD16, CD56, LFA1 (CD
11a), CD45, etc. have been reported. Of these, CD2, LFA1, and CD45 are also expressed in T cells, CD16 is also expressed in neutrophils, and CD56 is also expressed in nerve cells. CD2 and CD16 have been shown to act as signaling molecules in NK cells and also enhance the impaired response. However, these antibody types are not indispensable for NK activity, because antibodies against them do not inhibit the NK cell's ability to recognize and damage the NK-sensitive target cells, and there are also CD2, CD16-negative NK cells. On the other hand, although CD56 and LFA1 receptor type act as an adhesion molecule in binding NK cells to other cells (including target cells), direct involvement in NK cell-sensitive target cell-specific reaction is reported. It has not been. Thus, the known receptor-type molecules are N
It is considered that even a molecule having an auxiliary function for K activity is not a receptor molecule specific to NK cells.

【０００４】ヒトＮＫ細胞クローンから遺伝子ライブラ
リーを作製することにより、ＮＫ細胞では発現している
が、Ｂ細胞では発現していない遺伝子群の分離に成功し
たという報告が最近、屋部らにより出された。これに関
しては、J.Exp.Med.172巻,1159頁〜(1990年)、J.Exp-Me
d.173巻,1017頁〜(1991年)、J.Mol.Cell.Immunol.，4
巻.295頁(1990年)等の文献、あるいはImmunology Front
ier 1巻,27頁〜(1991年)の総説、Medical Immunology 2
1巻,713頁〜(1991年)に詳しく記載されている。これに
よると、新たな遺伝子分子としてＮＫＧ１〜ＮＫＧ１２
遺伝子が得られたものの、従来から知られている遺伝子
と相同性のないものはＮＫＧ２、ＮＫＧ４、ＮＫＧ７遺
伝子の３種のみであることが判明した。Recently, Yabe et al. Reported that a gene library which was expressed in NK cells but not in B cells was successfully isolated by preparing a gene library from human NK cell clones. Was done. Regarding this, J.Exp.Med.172, 1159- (1990), J.Exp-Me
Volume 173, pp. 1017- (1991), J. Mol. Cell. Immunol., 4
Vol. 295 (1990), etc., or Immunology Front
ier Vol. 1, p. 27- (1991), Medical Immunology 2
Volume 1, pp. 713- (1991). According to this, as new gene molecules, NKG1 to NKG12
Although the genes were obtained, it was revealed that only three kinds of genes, NKG2, NKG4 and NKG7, have no homology with the conventionally known genes.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】従来からＴ細胞上にあ
る抗原レセプターであるＴ細胞レセプター(ＴcＲ)やＢ
細胞上の抗原レセプターであるＢ細胞レセプター(＝Ｉg
Ｍ)といったものについては、分離、解析されていた。
しかし、ＮＫ細胞が、標的となるガン細胞やウイルス感
染細胞を破壊する際、ＮＫ細胞上のどの分子によってど
の抗原を認識しているのかについては、今まで解析され
ていない。ＬＦＡ−１は標的細胞上のＩＣＡＭ−１と、
またＣＤ２は標的細胞上のＬＦＡ−３と結合することに
より、認識している。これらの分子はインテグリンファ
ミリーと表される接着分子で、すでに詳しく解析されて
いる。しかし、ＮＫＧ７はインテグリンファミリーにも
属さない新規のＮＫ細胞表面分子であり、その機能は全
く解析されていない。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention T cell receptor (TcR) and B, which are antigen receptors on T cells, are conventionally used.
B cell receptor (= Ig
For items such as M), they were separated and analyzed.
However, which molecule on the NK cell recognizes which antigen when the NK cell destroys the target cancer cell or virus-infected cell has not been analyzed so far. LFA-1 is ICAM-1 on target cells,
CD2 is recognized by binding to LFA-3 on target cells. These molecules are adhesion molecules represented by the integrin family and have already been analyzed in detail. However, NKG7 is a novel NK cell surface molecule that does not belong to the integrin family, and its function has not been analyzed at all.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは、上記課題に対し、種々検討した結果、ＮＫ細
胞、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）に共通に発現して
いるＮＫＧ７分子は、キラー細胞のメカニズムを解明す
るのに重要な分子であるという考えのもとで、このＮＫ
Ｇ７に対するモノクローナル抗体を開発すれば、キラー
細胞のメカニズムの解明、ＮＫ細胞の抗原認識機構の解
明に役立つとともに、移植、感染防御、自己免疫疾患等
の種々の疾病の治療への糸口がみつかるのではないかと
考え、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
はキラー細胞表面分子の１つであるＮＫＧ７に特異的に
反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ及び該ハイブリドーマの製造方
法に関するものである。なお、本明細書では「キラー細
胞」なる用語は、ナチュラルキラー細胞と細胞傷害性Ｔ
リンパ球、例えばキラーＴ細胞との両者を包含する意味
で使用している。Under the circumstances, as a result of various studies on the above-mentioned problems, the present inventors have found that they are commonly expressed in NK cells and CTLs (cytotoxic T lymphocytes). Under the idea that the NKG7 molecule is an important molecule for elucidating the mechanism of killer cells, this NK
The development of a monoclonal antibody against G7 will help elucidate the mechanism of killer cells and the mechanism of NK cell antigen recognition, and may provide a clue to the treatment of various diseases such as transplantation, infection prevention, and autoimmune diseases. I thought that it might exist, and came to complete the present invention. That is, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically reacts with NKG7, which is one of killer cell surface molecules, a hybridoma that produces the monoclonal antibody, and a method for producing the hybridoma. In addition, in the present specification, the term "killer cell" means a natural killer cell and a cytotoxic T cell.
It is used to include both lymphocytes such as killer T cells.

【０００７】ＮＫＧ７の遺伝子は、ＮＫ細胞とＣＴＬ
(細胞毒性Ｔリンパ球)細胞の一部で発現している新しい
遺伝子であり、０.８kbのmＲＮＡをコードしている。こ
れから推定されるタンパク質は１４９個のアミノ酸配列
からなり、分子量は約１６,０００である［Ｈum. Ｉmmu
nol. Ｖol. ３６, pp.３４−４０, １９９３］。 ヒト
キラー細胞表面分子ＮＫＧ７の遺伝子（ＤＮＡ）配列、
及びその遺伝子によってコードされているアミノ酸配列
を添付の図１に示す。なお、ＣＴＬ細胞は、細菌、ウイ
ルスに感染した細胞、ガン細胞等の異常をきたした細胞
や移植組織を認識し、それらを破壊、除去することが主
要な役割の細胞である。The gene for NKG7 is found in NK cells and CTLs.
(Cytotoxic T lymphocyte) It is a new gene expressed in a part of cells and encodes 0.8 kb mRNA. The protein deduced from this has a 149 amino acid sequence and a molecular weight of approximately 16,000 [Hum. Immu.
nol. Vol. 36, pp. 34-40, 1993]. Gene (DNA) sequence of human killer cell surface molecule NKG7,
And the amino acid sequence encoded by the gene are shown in the attached FIG. The CTL cell is a cell whose main role is to recognize abnormal cells such as bacteria, virus-infected cells, cancer cells and transplanted tissue, and to destroy and remove them.

【０００８】本発明のモノクローナル抗体および該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマは以下のよう
にして作製することができる： (１) ＮＫＧ７をコードする遺伝子配列から推定される
アミノ酸配列中、親水性に富む部分に対するペプチドを
合成し、(２) (１)で得たペプチドを抗原として、齧歯
類動物に免疫感作し、(３) 該齧歯類動物の脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞とを融合させて、ＮＫＧ７部分ペプ
チドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択し、(４) (３)で得たハイブリドーマを適
当な条件下で培養し、該ハイブリドーマから産生される
モノクローナル抗体を回収し、このモノクローナル抗体
を用いて、ＮＫＧ７遺伝子を発現している細胞との免疫
組織染色を行うことにより最終的にＮＫＧ７と反応する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、(５) (４)で得たハイブリドーマを培養することに
より、該モノクローナル抗体を回収する。The monoclonal antibody of the present invention and the hybridoma producing the monoclonal antibody can be produced as follows: (1) A highly hydrophilic portion in the amino acid sequence deduced from the gene sequence encoding NKG7 (2) by immunizing a rodent with the peptide obtained in (1) as an antigen, and (3) fusing the spleen cells of the rodent with mouse myeloma cells , A hybridoma producing a monoclonal antibody that reacts with the NKG7 partial peptide is selected, and the hybridoma obtained in (4) and (3) is cultured under appropriate conditions to recover the monoclonal antibody produced from the hybridoma. Finally, react with NKG7 by immunohistostaining with cells expressing NKG7 gene using the antibody Producing hybridomas are selected that monoclonal antibody by culturing the hybridoma obtained in (5) (4), recovering the monoclonal antibodies.

【０００９】[0009]

【効果】本発明のＮＫＧ７に対するモノクローナル抗体
は、ＮＫＧ７分子と特異的に反応することから、種々の
用途がある。すなわち、ＮＫＧ７はＮＫ細胞やＣＴＬに
特異的に発現しているタンパク質であるため、キラー細
胞の同定等種々の用途がある。すなわち、 １．キラー細胞の同定 ２．キラー細胞のシグナル伝達機構の解明 ３．キラー細胞の標的細胞認識機序の解明 ４．キラー細胞の細胞障害機序の解明 ５．移植、自己免疫疾患等、キラー細胞の関与する疾患
の解析 以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明する。[Effect] The monoclonal antibody against NKG7 of the present invention has various uses because it specifically reacts with NKG7 molecule. That is, since NKG7 is a protein specifically expressed in NK cells and CTLs, it has various uses such as identification of killer cells. That is, 1. Identification of killer cells 1. Elucidation of killer cell signal transduction mechanism 3. Elucidation of target cell recognition mechanism of killer cells 4. Elucidation of cytotoxic mechanism of killer cells 5. Analysis of diseases involving killer cells such as transplantation and autoimmune diseases The present invention will be described in more detail below with reference to Examples.

【００１０】[0010]

【実施例】Ａ．ＮＫＧ７部分ペプチドの調製 (i) 部分ペプチドの合成 ＮＫＧ７のアミノ酸配列はＨum. Ｉmmunol. Ｖol. ３
６, pp.３４−４０, １９９３に記載されている。ＮＫ
Ｇ７の遺伝子によってコードされているアミノ酸配列の
中で、親水性に富んでいる１１２番目のアミノ酸から１
３１番目のアミノ酸に至る１１アミノ酸のＮ末端に、化
学修飾用のシステインをつけた計１２個のアミノ酸(図
２)を、アプライド、バイオシステム社(ＡＢＩ社)製の
ペプチド合成機４３１Ａにて合成した。EXAMPLES A. Preparation of NKG7 Partial Peptide (i) Synthesis of Partial Peptide The amino acid sequence of NKG7 is Hum. Immunol. Vol. 3
6, pp.34-40, 1993. NK
In the amino acid sequence encoded by the G7 gene, from the highly hydrophilic 112th amino acid to 1
A total of 12 amino acids (Fig. 2) with cysteine for chemical modification added to the N-terminal of 11 amino acids up to the 31st amino acid were synthesized by Applied Biosystems (ABI) peptide synthesizer 431A. did.

【００１１】(ii) 部分ペプチドの精製 合成した部分ペプチドを、まず樹脂から切断する。切断
液としては、結晶フェノール０.７５g、１,２−エタン
ジオール０.２５ml、チオアニソール０.５ml、蒸留水
０.５ml、及びトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)１０mlを用い
た。乾燥したペプチド付樹脂と攪拌子をフラスコに入
れ、栓をし、氷浴中で３０分間冷却する。上記切断液を
別の容器に入れ、氷浴中で冷やしておく(３０分)。その
切断液を先のペプチド付樹脂の入ったフラスコに入れ
る。その後、室温になるまで放置し、次いで攪拌子によ
り１.５時間攪拌する。得られた反応液を６μmのメンブ
レンフィルターで濾過し、別のフラスコに濾液をため
る。切断に使用したフラスコに１〜２mlのＴＦＡを入
れ、壁についた溶液をあらい、これも、先と同じフィル
ターで濾過し、濾液をためる。濾液をまとめ、氷冷した
ジエチルエーテル５０mlを加える。約３０分間放置する
(ペプチドの沈澱を十分に確認する)。３μmのメンブレ
ンフィルターにて濾過し、沈殿物(ペプチド)を回収す
る。真空乾燥により粗ペプチドを乾燥させる。得られた
粗ペプチド２０mgを蒸留水２mlに溶かし、０.８μmのフ
ィルターにて濾過した。得られた濾液をＦＰＬＣで精製
した。カラムはＰepＲＰＣ１０／１０(ファルマシア)を
使い、０.１％ＴＦＡに対して７０％アセトニトリルを
用いたグラジエントで溶出した。溶出後、ペプチドの溶
出画分を回収し、凍結乾燥により精製ペプチド７mgを得
た。 (Ii) Purification of Partial Peptide First, the synthesized partial peptide is cleaved from the resin. As the cleavage liquid, 0.75 g of crystalline phenol, 0.25 ml of 1,2-ethanediol, 0.5 ml of thioanisole, 0.5 ml of distilled water, and 10 ml of trifluoroacetic acid (TFA) were used. The dried resin with peptide and a stir bar are placed in a flask, stoppered, and cooled in an ice bath for 30 minutes. The above cutting solution is put in another container and cooled in an ice bath (30 minutes). The cleavage solution is placed in the flask containing the resin with peptide. After that, the mixture is left to stand until it reaches room temperature and then stirred for 1.5 hours with a stirring bar. The obtained reaction solution is filtered through a 6 μm membrane filter, and the filtrate is collected in another flask. The flask used for the cutting is charged with 1-2 ml of TFA, and the solution attached to the wall is flushed, and this is also filtered with the same filter as above, and the filtrate is pooled. The filtrates are combined and 50 ml of ice-cold diethyl ether are added. Leave for about 30 minutes
(Fully confirm peptide precipitation). The precipitate (peptide) is collected by filtration with a 3 μm membrane filter. The crude peptide is dried by vacuum drying. 20 mg of the obtained crude peptide was dissolved in 2 ml of distilled water and filtered through a 0.8 μm filter. The obtained filtrate was purified by FPLC. The column used was PepRPC 10/10 (Pharmacia) and was eluted with a gradient of 70% acetonitrile to 0.1% TFA. After elution, the elution fraction of the peptide was collected and freeze-dried to obtain 7 mg of the purified peptide.

【００１２】(iii) キャリヤータンパク質(ＢＳＡ)と
の結合 ピアス社製のスーパーキャリヤーシステム^TMのプロトコ
ールに従った。上記(ii)により得られたペプチド２mgを
スーパーキャリヤーに付属の結合緩衝液５０μlに溶か
した。スーパーキャリヤー^TM(２mg)を５００μlの蒸留
水に溶かした。ペプチド及びスーパーキャリヤーを混合
し、室温にて２時間反応させた。反応は、ローテーター
を用いる撹拌により行った。 (Iii) a carrier protein (BSA)
The following was the protocol for the Super Carrier System ^™ manufactured by Pierce. 2 mg of the peptide obtained in (ii) above was dissolved in 50 μl of the binding buffer attached to the supercarrier. SuperCarrier ^™ (2 mg) was dissolved in 500 μl of distilled water. The peptide and supercarrier were mixed and reacted at room temperature for 2 hours. The reaction was carried out by stirring using a rotator.

【００１３】Ｂ．免疫感作 Ａの方法によって調製したＮＫＧ７−ＢＳＡ１０μgを
フロイント完全アジュバントと共にマウスの腹腔内に注
射した。次いで２週間後から週１回合計６回、同一マウ
スにＮＫＧ７−ＢＳＡ＋フロイント不完全アジュバント
を注射することにより、免疫感作した。 B. Mice were injected intraperitoneally with 10 μg of NKG7-BSA prepared by the method of immunization A together with Freund's complete adjuvant. Then, after 2 weeks, the same mouse was immunized by injecting NKG7-BSA + Freund's incomplete adjuvant once a week for a total of 6 times.

【００１４】Ｃ．融合 最終免疫の後、３日後に上記マウスから脾臓を取り出し
た。取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ニッスイ製）に浮遊させ、脾細胞を
１×１０⁸個得た。この脾細胞とマウス由来のα−アザ
グアニン耐性株（ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損株）Ｐ３Ｕ１（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１５９７）（２×１０⁷個）とを約５:１の割合で混
合し、遠心した（１５００rpm、５分）。得られた細胞
ペレットに、５０％ポリエチレングリコール４０００
（メルク製）／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の
温水中で攪拌しながら１分を要して加えた。これにＲＰ
ＭＩ１６４０液１５mlを撹拌しながら６分を要して加
え、細胞融合を行った。融合後、大量（約４０ml）のＲ
ＰＭＩ１６４０液を加え、遠心分離（１５００rpm、５
分）して上清を除去した。次いで、ヒポキサンチン（１
００μＭ）、アミノプテリン（０.４μＭ）、チミジン
（１０μＭ）を含む市販のＲＰＭＩ１６４０（ニッス
イ）に１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ製）を加えた培地（Ｈ
ＡＴ培地）にて、脾細胞が１×１０⁶mlになるように調
製した。 C. Three days after the final fusion immunization, the spleen was removed from the mouse. The spleen taken out is shredded, filtered through a mesh, and RP
The suspension was suspended in MI1640 medium (manufactured by Nissui) to obtain 1 × 10 ⁸ splenocytes. This spleen cell and mouse-derived α-azaguanine resistant strain (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase deficient strain) P3U1 (ATCC C
RL1597) (2 × 10 ⁷ pieces) was mixed at a ratio of about 5: 1 and centrifuged (1500 rpm, 5 minutes). 50% polyethylene glycol 4000 was added to the obtained cell pellet.
(Merck) / RPMI1640 solution (2 ml) was added over 1 minute while stirring in warm water at 37 ° C. RP to this
Cell fusion was performed by adding 15 ml of MI1640 solution with stirring for 6 minutes. After fusion, a large amount (about 40 ml) of R
Add PMI1640 solution and centrifuge (1500 rpm, 5
And the supernatant was removed. Then, hypoxanthine (1
(00 μM), aminopterin (0.4 μM), and thymidine (10 μM) commercially available RPMI1640 (Nissui) containing 10% FCS (GIBCO) added medium (H
The spleen cells were prepared to 1 × 10 ⁶ ml in an AT medium).

【００１５】Ｄ．ハイブリドーマの選択 上記Ｂで調製した細胞浮遊液を９６ウエルマイクロプレ
ート５枚に２００μlずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ₂下
にあるＣＯ₂インキュベータで細胞を培養した。１週間
後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成して、増
殖していることが確認できた。 D. Selection of hybridoma The cell suspension prepared in the above B was dispensed into 5 96-well microplates in an amount of 200 μl each, and the cells were cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. and 5% CO ₂ . After 1 week, it was confirmed that only the hybridoma formed colonies and proliferated.

【００１６】Ｅ．抗体の検出 ハイブリドーマが十分に増殖していることが確認された
ので、その培養上清を用い、以下に示す酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）にて抗体の検出を行なった。上記ＮＫＧ
７部分ペプチドを１０μg/mlの濃度で５０μlずつアッ
セイプレート（ダイナテック イムロン２）に分注する
ことで抗原固定した（４℃／一晩）。次いで、抗原液を
除去し、ブロッキング液（ブロックエース：大日本製薬
製）を加えてプレートのウェルの底面をブロッキングし
た（室温、１時間）。その後、ブロッキング液を除去
し、ハイブリドーマの培養上清を５０μlずつ分注し、
室温にて１時間反応した。ＰＢＳにてプレートを洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩg抗体（カッペ
ル社製）を１０００倍希釈した液５０μlを加え、結合
させた（室温、１時間）。その後、もう一度ＰＢＳで洗
浄した後、オルト−フェニレンジアミン（０.４mg/m
l）、過酸化水素水０.０１２％を含むリン酸−クエン酸
緩衝液（ｐＨ５.０）１００μlをこれらのプレートに加
え、発色反応によって抗体を検出した。その結果、ＮＫ
Ｇ７部分ペプチドと反応するウエルを１１ウエル選択し
た。 E. Detection of antibody Since it was confirmed that the hybridoma was proliferating sufficiently, the culture supernatant was used to detect the antibody by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) described below. Above NKG
The 7-part peptide was dispensed at a concentration of 10 μg / ml in 50 μl aliquots onto an assay plate (Dynatech Immunol 2) to immobilize the antigen (4 ° C./overnight). Then, the antigen solution was removed, and a blocking solution (Block Ace: Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to block the bottom of the wells of the plate (room temperature, 1 hour). After that, the blocking solution was removed, and 50 μl of the culture supernatant of the hybridoma was dispensed,
The reaction was carried out at room temperature for 1 hour. After washing the plate with PBS, 50 μl of a 1000-fold diluted peroxidase-labeled anti-mouse Ig antibody (manufactured by Kappel) was added and allowed to bind (room temperature, 1 hour). Then, after washing with PBS again, ortho-phenylenediamine (0.4 mg / m 2
l), 100 μl of a phosphate-citrate buffer (pH 5.0) containing 0.012% hydrogen peroxide was added to these plates, and the antibody was detected by a color reaction. As a result, NK
Eleven wells that react with the G7 partial peptide were selected.

【００１７】Ｆ．クローニング 上記Ｅで選択したウエルで増殖しているハイブリドーマ
を限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が
０.５２／ウエルとなるように１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ
１６４０培地で希釈し、９６ウエルマイクロプレートに
２００μl分注した。３７℃、５％ＣＯ_２存在下での培
養を行ない、コロニーがある程度の大きさになってから
上記ＮＫＧ７部分ペプチドに対する抗体が産生されてい
るかどうかをもう一度上記Ｅの酵素免疫測定法で調べ
た。こうして、ＮＫＧ７部分ペプチドと反応するクロー
ンの細胞を７種得ることができた。このようにして得ら
れたクローン細胞のうちの１つであるＳＥ−Ｎ７は、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４７１２の下で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている（寄託日：平成
６年１２月１５日） F. Cloning The hybridoma growing in the well selected in E above was cloned by the limiting dilution method. 10% FCS / RPMI so that the cell concentration after dilution is 0.52 / well
It was diluted with 1640 medium and 200 μl was dispensed to a 96-well microplate. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO _2, whether or not the antibody against the NKG7 partial peptide was produced was examined once again after the colonies had grown to a certain size by the enzyme immunoassay method of E above. In this way, 7 types of clonal cells that react with the NKG7 partial peptide could be obtained. One of the cloned cells thus obtained, SE-N7,
Deposited under the ERM P-14712 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry (Deposit date: December 15, 1994)

【００１８】Ｇ．サブクラスの決定 抗マウス抗体［抗ＩgＧ₁、抗ＩgＧ₂a、抗ＩgＧ₂b、抗Ｉ
gＧ₃、抗ＩgＭ、抗ＩgＡ］及び抗マウス鎖抗体［抗κ,
λ］（ＭＡＢ−アイソタイピング キット ＰharＭinq
en］とハイブリドーマの培養上清中の抗ＮＫＧ７抗体と
を反応させるＥＬＩＳＡにより、得られた７種のハイブ
リドーマが産生する抗体のサブクラスを決定した。その
結果、ＩgＭ５種、ＩgＧ₂a２種あることがわかり、いず
れもＬ鎖はκだった。 G. Subclass determination anti-mouse antibody [anti-IgG _1, anti-IgG ₂ a, anti-IgG ₂ b, anti-I
gG ₃ , anti-IgM, anti-IgA] and anti-mouse chain antibody [anti-κ,
λ] (MAB-isotyping kit PharMinq
en] and the anti-NKG7 antibody in the culture supernatant of the hybridoma were reacted to determine the subclass of the antibody produced by the 7 hybridomas obtained. As a result, it was found that there were 5 types of IgG and ₂ types of IgG2a, and the L chain was κ in both cases.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ヒトキラー細胞表面分子ＮＫＧ７の遺伝子配
列、及びその遺伝子によってコードされているアミノ酸
配列である。FIG. 1 shows the gene sequence of human killer cell surface molecule NKG7 and the amino acid sequence encoded by the gene.

【図２】 ＮＫＧ７遺伝子によってコードされているア
ミノ酸配列中、１１２−１３１アミノ酸のＮ末端にシス
テインを付加した１２アミノ酸の配列である。FIG. 2 is a 12 amino acid sequence in which cysteine is added to the N-terminal of 112-131 amino acids in the amino acid sequence encoded by the NKG7 gene.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ Ｃ０７Ｋ 14/705 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Office reference number FI Technical display location C12N 15/02 G01N 33/53 D 33/577 B // A61K 39/395 U C07K 14/705 8318 -4H (C12P 21/08 C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 5/00 B C12R 1:91)

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 分子量約１６，０００であり、１４９個
のアミノ酸からなるヒトキラー細胞表面分子の１つであ
るＮＫＧ７に対するモノクローナル抗体。1. A monoclonal antibody against NKG7, which is one of human killer cell surface molecules consisting of 149 amino acids and having a molecular weight of about 16,000. 【請求項２】 ヒトキラー細胞表面分子ＮＫＧ７が図１
に示すアミノ酸配列を有している請求項１に記載のモノ
クローナル抗体。2. The human killer cell surface molecule NKG7 is shown in FIG.
The monoclonal antibody according to claim 1, which has the amino acid sequence shown in. 【請求項３】 図１に示すアミノ酸配列における１２１
番目から１３１番目のアミノ酸配列であるＨis−Ｔhr−
Ｐro−Ａrg−Ｓer−Ａrg−Ｐro−Ｓer−Ｓer−Ｐro−Ｇ
lyのＮ末端にＣysを付加したペプチドに特異的である請
求項２に記載のモノクローナル抗体。3. 121 in the amino acid sequence shown in FIG.
The 131st to 131st amino acid sequence, His-Thr-
Pro-Arg-Ser-Arg-Pro-Ser-Ser-Pro-G
The monoclonal antibody according to claim 2, which is specific to a peptide in which Cys is added to the N-terminal of ly. 【請求項４】 図１に示すアミノ酸配列における１２１
番目から１３１番目のアミノ酸配列が図１に示すＮＫＧ
７の遺伝子の５４２番目の塩基から５７４番目の塩基ま
でのＤＮＡ配列によってコードされている請求項３に記
載のモノクローナル抗体。4. 121 in the amino acid sequence shown in FIG.
The 131st to 131st amino acid sequence is shown in FIG.
The monoclonal antibody according to claim 3, which is encoded by a DNA sequence from the 542nd base to the 574th base of the 7th gene. 【請求項５】 サブクラスがＩgＭ κ、ＩgＧ₂a κであ
る請求項２から請求項４のいずれかに記載のモノクロー
ナル抗体。5. The monoclonal antibody according to any one of claims 2 to 4, wherein the subclass is IgM κ or IgG ₂ a κ. 【請求項６】 (i) 齧歯類動物を、図１に示す１２１
から１３１番目のアミノ酸配列のＮ末端にＣysを付加し
た合成ペプチドで免疫感作し、 (ii) 該齧歯類動物から脾臓を摘出して該脾細胞の懸濁
液を調製し、 (iii) 該脾細胞懸濁液を齧歯類のミエローマ細胞と融
合促進剤の存在下で混合して両細胞を融合し、 (iv) 得られた融合細胞を未融合のミエローマ細胞を支
持しない媒質中で希釈して培養し、 (v) 融合細胞を含有する各ウェル中の上清液につい
て、免疫源となる合成ペプチドとの反応性を指標にして
抗体の存在を確認し、 (vi) 所望の抗体を生成する融合細胞を選択した後、限
界希釈法により単一クローンにし、 (vii) その単一クローンの融合細胞の培養上清液から
所望の抗体を回収することを特徴とする、ヒトキラー細
胞表面分子ＮＫＧ７と特異的に反応するモノクローナル
抗体の調製方法。6. (i) A rodent is shown in FIG.
To immunize with a synthetic peptide in which Cys is added to the N-terminal of the 131st amino acid sequence, (ii) a spleen is isolated from the rodent to prepare a suspension of the splenocytes, (iii) The spleen cell suspension is mixed with rodent myeloma cells in the presence of a fusion promoter to fuse both cells, and (iv) the obtained fused cells are mixed in a medium that does not support unfused myeloma cells. After diluting and culturing, (v) confirm the presence of the antibody in the supernatant in each well containing the fused cells by using the reactivity with the synthetic peptide as the immunogen as an index, and (vi) select the desired antibody. After selecting the fused cells that produce, the single clonal cells are produced by the limiting dilution method, and (vii) the desired antibody is recovered from the culture supernatant of the fused cells of the single clones. A method for preparing a monoclonal antibody which specifically reacts with the molecule NKG7. 【請求項７】 該齧歯類動物がＢalb／cマウスに属し、
該ミエローマ細胞がマウスミエローマＰ３Ｕ１である請
求項６に記載の方法。7. The rodent belongs to Balb / c mouse,
The method according to claim 6, wherein the myeloma cell is mouse myeloma P3U1. 【請求項８】 ヒトキラー細胞表面に存在するＮＫＧ７
分子に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。8. NKG7 present on the surface of human killer cells
A hybridoma that produces a monoclonal antibody specific for a molecule. 【請求項９】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４７１２であ
る請求項８に記載のハイブリドーマ。9. The hybridoma according to claim 8, which has the accession number FERM P-14712.