JPH08173172A - Method of synthesizing inhibin alpha chain and/or beta chain - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject substance administrable to mammals including a human for controlling fertility by cloning a nucleic acid encoding the matured inhibin α- and β-chains of a human and a swine into a vector and culturing a recombinant cell.

SOLUTION: This method for synthesizing inhibin α- and β-chains at first ligates a nucleic acid encoding α, βA and βB chains as prodomain regions of the matured inhibin of a human and a swine to a replicable vector under control of a promoter. A host cell (preferably Escherichia coli 294 strain, or the like) is transformed with the vector to be cultured. An αβA or an αβB inhibin, or a β-chain heterodimer or homodimer is recovered from the cultured cell. The inhibin α chain contains an amino acid sequence of formula I and the inhibin βA chain contains an amino acid sequence of formula II in human cases. The inhibin induces infertility when administrated to mammals including human, and is also useful for diagnosis of infertility or treatment for fertility induction.

COPYRIGHT: (C)1996,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の背景】本発明は、組換え細胞培養法による、イ
ンヒビンα鎖またはインヒビンβ鎖を含有するタンパク
質の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、イ
ンヒビンをコードしているＤＮＡを得る方法、並びに、
それを用いる方法、さらには動物またはヒトの天然のイ
ンヒビンあるいは自然界に存在するそれらのアレルのア
ミノ酸配列を出発物質としてインヒビン変異体を製造す
る方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing a protein containing an inhibin α chain or an inhibin β chain by a recombinant cell culture method. More specifically, the present invention provides a method for obtaining DNA encoding inhibin, and
The present invention also relates to a method for using the same, and further to a method for producing an inhibin mutant using, as a starting material, a natural amino acid sequence of animal or human inhibin or a naturally occurring allele thereof.

【０００２】インヒビンは性腺(生殖腺)で産生され、下
垂体レベルにおいて、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)の分泌
を特異的に阻害するよう作用するタンパク質である。イ
ンヒビンの存在については、最初、マックラーフ(ＭcＣ
ullagh)により仮説が出された[１９３２、「サイエンス
(Ｓcience)」７６: １９−２０]。その様なゴナドトロピ
ン(性腺刺激ホルモン)分泌に対する優先的な制御作用に
大きな関心が寄せられ、過去５０年間に、多数の研究者
達が、精巣抽出液、***、精巣網液、***血漿および卵
胞液からこの物質を単離し、様々なバイオアッセイを用
いて特性化することを試みた。多くの文献において、
５,０００〜１００,０００ダルトンの分子量を有するイ
ンヒビン様物質を精製したと報告されているが、継続研
究において、これらの物質はホモジーニアス(均質)でな
かったり、真のインヒビンに予測される高度の特異活性
を持たず、そして／または本明細書に記載したインヒビ
ンの分子特性を示さない物質であることが分かった[ド
ウ・ジョン(de Ｊong)、インヒビン・ファクター・ア
ーティファクト(Ｉnhibin−Ｆactor Ａrtifact)「モレ
キュラー・アンド・セルラー・エンドクリン(Ｍolecula
r ＆ Ｃellular Ｅndocrin)」１３: １−１０(１９７
９); シエスら(Ｓheth)１９８４「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１
６５(１): １１−１５; セイダーら(Ｓeidah)、１９８
４「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１７５(２): ３４９−３５５; リ
ルジャら(Ｌilja)、１９８５年３月、「Ｆ．Ｅ．Ｂ．
Ｓ．」１９８２(１): １８１−１８４; リら(Ｌi)１９８
５年６月「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎat．Ａ
cd．Ｓci．)ＵＳＡ」８２: ４０４１−４０４４: セイダ
ーら(Ｓeidah)「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１６７(１): ９８−
１０２; およびベクサックら(Ｂeksac)１９８４、「イン
ター・ジェイ・アンドロロジィ(Ｉntern．Ｊ．Ａndrolo
gy)」７: ３８９−３９７]。[0002] Inhibin is a protein produced in the gonad (gonad), which acts at the pituitary level to specifically inhibit the secretion of follicle-stimulating hormone (FSH). Regarding the existence of inhibin, first, McCraf (McC
ullagh) proposed a hypothesis [1932, "Science
(Science) "76 : 19-20]. There has been great interest in such preferential regulatory actions on gonadotropin (gonadotropin) secretion, and over the last 50 years, numerous researchers have found that testis extract, sperm, testicular reticulum, semen plasma and follicular fluid. Attempts were made to isolate this material from E. coli and characterize it using various bioassays. In many documents,
Although it has been reported that inhibin-like substances having a molecular weight of 5,000 to 100,000 daltons have been purified, in ongoing studies, these substances were not homogeneous or had a high degree of prediction to that of true inhibin. It has been found that the substance has no specific activity of and / or does not exhibit the molecular characteristics of inhibin described herein [de Jong, Inhibin-Factor Artifact]. "Molecula and Cellular Endocrine
r & Cellular Endocrin) "13: 1-10 (197)
9); Sheath et al. 1984 "FEBS " 1
65 (1): 11-15; Seider et al., 198.
4 "FEBS " 175 (2): 349-355; Lilja et al., March 1985, "FEBS."
S. 1982 (1): 181-184; Li et al. (Li) 198
June 5th “Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Nat. A
cd. Sci. ) USA "82 : 4041-4044: Seidah" FEBS "167 (1): 98-.
102; and Beksac et al., 1984, Intern. J. Androlo.
gy) ”7: 389-397].

【０００３】インヒビン活性を有するポリペプチドが、
ウシまたはヒツジの卵胞液から精製された(ＰＣＴ８６
／０００７８、１９８６年１月３日公開)。このタンパ
ク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく分子量５６,０００±
１,０００を有しており、見掛け上の分子量４４,０００
±３,０００および１４,０００±２,０００を有する２
つのサブユニットに解離し得ることが報告されている。
各サブユニットのアミノ末端配列が記載されている。A polypeptide having inhibin activity is
Purified from bovine or ovine follicular fluid (PCT86
/ 00078, published January 3, 1986). This protein has a molecular weight of 56,000 ± based on SDS-PAGE.
It has an apparent molecular weight of 44,000.
2 with ± 3,000 and 14,000 ± 2,000
It has been reported that it can be dissociated into two subunits.
The amino terminal sequence of each subunit is listed.

【０００４】いずれも約３２,０００ダルトンの分子量
の、インヒビン活性を有する２種のタンパク質をブタの
卵胞液から単離することに成功した。ヘパリン−セファ
ロース・アフィニティ・クロマトグラフィー、ゲル濾過
および逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ)等のタンパク質分離法を組み合わせて、実質上均質
(総タンパク質重量の９０％)に、ブタインヒビンを精製
した。Two proteins having inhibin activity, each having a molecular weight of about 32,000 daltons, were successfully isolated from porcine follicular fluid. Heparin-Sepharose affinity chromatography, gel filtration and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPL
Substantially homogeneous by combining protein separation methods such as C)
Porcine inhibin (90% of total protein weight) was purified.

【０００５】これらのタンパク質はブタから得た物質か
ら実質上、均質な状態で単離され、プロテインＡ(Ｐrot
ein Ａ)およびプロテインＢ(Ｐrotein Ｂ)と命名され
た。各タンパク質は分子量３２,０００ダルトン(３２
Ｋ)であり、これらは分子量が１８,０００ダルトンおよ
び１４,０００ダルトンであって、タンパク質内でジス
ルフィド結合を介して結合し、ホルモン活性を示す２本
のポリペプチド鎖からなっている。両タンパク質の１
８,０００ダルトン(１８Ｋ)鎖またはアルファ(α)鎖の
アミノ末端アミノ酸残基配列は、式:[0005] These proteins were isolated from the material obtained from pigs in a substantially homogeneous state, and protein A (Prot
It was designated as ein A) and protein B (Protein B). Each protein has a molecular weight of 32,000 daltons (32
K), which have molecular weights of 18,000 daltons and 14,000 daltons and are composed of two polypeptide chains linked within the protein via disulfide bonds and exhibiting hormonal activity. 1 of both proteins
The amino terminal amino acid residue sequence of the 8,000 dalton (18K) or alpha (α) chain has the formula:

【化５７】Ｓer−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｌeu−Ｐro−Ｔrp
−Ｐro−Ｔrp−Ｓer−Ｐro−Ａla−Ａla−Ｌeu−Ａrg−
Ｌeu−Ｌeu−Ｇln−Ａrg−Ｐro−Ｐro−Ｇlu−Ｇlu−Ｐ
ro−Ａla−Ｖal で示される。また、プロテインＡの１４,０００ダルト
ン(１４Ｋ)鎖またはベーター(β)鎖のアミノ末端アミノ
酸残基配列は、式:Embedded image Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp
-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-Ala-Leu-Arg-
Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-P
It is represented by ro-Ala-Val. Also, the amino terminal amino acid residue sequence of the 14,000 dalton (14K) or beta (β) chain of protein A has the formula:

【化５８】Ｇly−Ｌeu−Ｇlu−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｌys−
Ｖal−Ａsn−Ｉle−Ｘ−Ｘ−Ｌys−Ｌys−Ｇln−Ｐhe−
Ｐhe−Ｖal−Ｓer−Ｐhe−Ｌys−Ａsp−Ｉle−Ｇly−Ｔ
rp−Ａsn−Ａsp−Ｔrp−Ｉle−Ｉle−Ａla で示され、プロテインＢのそれは、式:Embedded image Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Lys-
Val-Asn-Ile-XX-Lys-Lys-Gln-Phe-
Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-T
rp-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala, that of protein B has the formula:

【化５９】Ｇly−Ｌeu−Ｇlu−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ａrg−
Ｔhr−Ａsn−Ｌeu−Ｘ−Ｘ−Ａrg−Ｇln−Ｇln−Ｐhe−
Ｐhe−Ｉle−Ａsp−Ｐhe−Ａrg−Ｌeu で示される。プロテインＡおよびプロテインＢは完全に
特性化されている。各３２Ｋタンパク質はいずれもイン
ヒビン活性を示し、ＦＳＨの基礎的な分泌を特異的に阻
害するが、黄体形成ホルモン(ＬＨ)の分泌を阻害するこ
とはない。各ポリペプチド鎖はホルモン活性を示さなか
った。これに関する元の(親)出願を行った後、インヒビ
ンβ鎖二量体(ダイマー)が、卵胞液中に天然の存在物
(アクティビンと称される)として存在しており、それ
が、ラット脳下垂体前葉細胞によるＦＳＨ分泌を刺激す
る作用を有することが示された[バレら(Ｖale)、１９８
６ネイチャー「Ｎature」３２１: ７７６−７７９および
リングら(Ｌing)１９８６「ネイチャー」３２１: ７７９
−７８２]。Embedded image Gly-Leu-Glu-X-Asp-Gly-Arg-
Thr-Asn-Leu-XX-Arg-Gln-Gln-Phe-
It is represented by Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu. Protein A and protein B have been fully characterized. Each of the 32K proteins exhibits inhibin activity and specifically inhibits the basic secretion of FSH, but does not inhibit the secretion of luteinizing hormone (LH). Each polypeptide chain showed no hormonal activity. After filing the original (parent) application for this, the inhibin β chain dimer (dimer) was found to be a naturally occurring entity in follicular fluid.
(Called activin), which has been shown to have the effect of stimulating FSH secretion by rat anterior pituitary cells [Vale et al., 198].
6 Nature "Nature " 321 : 776-779 and Ling 1986 "Nature " 321 : 779
-782].

【０００６】ヒト由来のインヒビンのα鎖およびβ鎖の
アミノ酸配列は、本発明より以前には知られていなかっ
た。動物のインヒビンに関して行なわれた研究に匹敵す
る研究を行うために必要な大量のヒト卵胞液の入手が容
易でないばかりか、ヒトのインヒビンと動物のインヒビ
ンとが、同様の精製方法が有効な程度に、充分類似して
いるという保証もない。従って、ヒトインヒビンのアミ
ノ酸配列の特徴を決定する方法が必要とされている。The amino acid sequences of the α and β chains of human-derived inhibin were not known prior to the present invention. Not only is it difficult to obtain the large amounts of human follicular fluid necessary to carry out studies comparable to those carried out on animal inhibin, but human inhibin and animal inhibin are to the extent that similar purification methods are effective. There is no guarantee that they are sufficiently similar. Therefore, there is a need for methods to characterize the amino acid sequence of human inhibin.

【０００７】また、インヒビンのα鎖またはβ鎖を、好
ましくは、懸案の(questioned)インヒビンにとってホモ
ローガス(homologous)な種のタンパク質を殆んど、ある
いは全く含有しない状態で、好ましくは生物学的に活性
なインヒビンのα鎖またはβ鎖を製造するための経済的
な方法が必要とされている。これらの、並びに他の目的
は本発明の全貌から明らかとなるであろう。Also, the α or β chain of inhibin is preferably biologically contained, with little or no protein of a species homologous to the questioned inhibin. There is a need for economical methods for producing active inhibin α or β chains. These and other objects will be apparent from the overall scope of the present invention.

【０００８】要約 ブタおよびヒトの成熟インヒビンのα鎖およびβ鎖、お
よびそれらのプレプロ形並びにプロ形の前駆体をコード
している核酸を単離し、複製可能なベクターにクローン
した。インヒビンをコードしているcＤＮＡの配列決定
により、成熟インヒビン鎖のＮ末端に位置し、一緒にな
って生物活性なポリペプチドを発現するプロドメイン(p
rodomain)領域が同定された。このプロドメイン領域、
あるいはプロドメイン・イムノゲン(免疫原)は、形質転
換細胞におけるプレプロインヒビンのプロセッシングの
監視(モニター)、または動物における臨床条件の変化あ
るいは生殖生理学上の変調に関する実験に有用である。
本発明においてはα鎖の核酸またはβ鎖の核酸を用いて
宿主を形質転換し、成熟インヒビンα鎖および／または
β鎖を組換え発現させ、診断学的検定に用いるために、
前駆体インヒビン鎖のプロドメイン配列を調製した。さ
らに詳しくは、該領域をコードしている核酸をプロモー
ターのコントロール下において、複製可能なベクターに
ライゲートし、このベクターで宿主細胞を形質転換し、
宿主細胞を培養し、培養された細胞からプロドメイン、
アクティビンまたはインヒビンを回収することからなる
方法により、インヒビンα鎖および／またはβ鎖を組換
え細胞培養内で発現させた。本発明方法によれば、イン
ヒビン、アクティビンおよびプロドメインを、ホモロー
ガスな供給源のタンパク質を全く含まず、生物学的に活
性な形で製造することができる。[0008] α-chain and β-chain of the mature inhibin Summary pigs and humans, and to a nucleic acid isolated encoding those prepro form as well as professional type precursor were cloned into a replicable vector. By sequencing the cDNA encoding inhibin, a prodomain (p
rodomain) region was identified. This pro domain area,
Alternatively, prodomain immunogens are useful for monitoring preproinhibin processing in transformed cells, or for experiments on altered clinical conditions or reproductive physiologic modulation in animals.
In the present invention, a host is transformed with an α-chain nucleic acid or a β-chain nucleic acid to recombinantly express mature inhibin α-chain and / or β-chain, and used for diagnostic assay,
The prodomain sequence of the precursor inhibin chain was prepared. More specifically, a nucleic acid encoding the region is ligated to a replicable vector under the control of a promoter, and a host cell is transformed with this vector,
Culturing a host cell, the prodomain from the cultured cell,
The inhibin α and / or β chains were expressed in recombinant cell culture by a method consisting of recovering activin or inhibin. According to the method of the present invention, inhibin, activin and prodomain can be produced in a biologically active form without containing any protein of a homologous source.

【０００９】本発明において同定された核酸はブタまた
はヒトのインヒビンのα, β_Aおよびβ_B鎖をコードして
いる。組換え細胞は、αβ_Aまたはαβ_Bインヒビンを発
現するか、あるいは、β−鎖ヘテロ二量体またはホモ二
量体(これらは文献中にアクティビンとして総括されて
いる)を発現するよう形質転換された。組換え細胞の発
現産物であるβ鎖二量体は、天然状態で普通に伴ってい
るホモローガスなタンパク質を含んでいない。The nucleic acids identified in the present invention encode the α, β _A and β _B chains of porcine or human inhibin. Recombinant cells are transformed to express αβ _A or αβ _B inhibin, or to express β-chain heterodimers or homodimers, which are summarized in the literature as activin. Was done. The β chain dimer, the expression product of recombinant cells, does not contain the homologous proteins normally associated with it in its native state.

【００１０】インヒビンまたはアクティビン並びにそれ
らの無毒な塩と薬学上許容し得る担体とを混合して製剤
化し、稔性(妊性)をコントロールするためにヒトを含む
哺乳類に投与することができる。インヒビン投与によっ
て雌性哺乳類では稔性の減少、雄性哺乳類では***形成
の減少を来し、充分量を投与することにより不稔を引き
起こす。インヒビンは不妊の診断にも有用である。文献
によるとアクティビンは脳下垂体細胞からのＦＳＨ分泌
を刺激することができることが示されており、従って、
稔性誘導治療に有用である。Inhibin or activin and their non-toxic salts may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier to prepare a formulation, which can be administered to mammals including humans to control fertility (fertility). Inhibin administration reduces fertility in female mammals and spermatogenesis in male mammals, and administration of sufficient dose causes sterility. Inhibin is also useful in diagnosing infertility. The literature has shown that activin can stimulate FSH secretion from pituitary cells, thus:
It is useful for fertility induction therapy.

【００１１】また、本発明方法により、インヒビン、ア
クティビンおよびプロドメインの、天然の類似体から
の、一次アミノ酸配列および／またはグリコシル化にお
ける変化を伴った変異体の簡便な製造方法、とりわけ、
インヒビン、アクティビンまたはプロドメイン領域と免
疫原ペプチドとの融合物を簡便かつ容易に製造すること
ができる。The method of the present invention also provides a convenient method for the production of variants of inhibin, activin and prodomain from natural analogues with alterations in primary amino acid sequence and / or glycosylation, among others:
A fusion of the inhibin, activin or prodomain region and the immunogenic peptide can be simply and easily produced.

【００１２】図面に関する説明 図１はブタα鎖のmＲＮＡの模式図である。配列決定に
用いたオーバーラップしたcＤＮＡクローンをmＲＮＡ構
造を示す図の上方に記した。λクローンの３'末端の黒
い四角はこれらのクローンが特異的なプライミング(pri
ming)により得られたことを表している。非翻訳配列を
直線で示し、暗号配列を四角で囲んで示した。空白部分
はシグナル配列およびプロ配列の暗号領域を指し、交差
した斜線で示した領域は１３４アミノ酸α−鎖を指す。
スケールはヌクレオチドを最長のcＤＮＡクローンの５'
末端から表したものである。DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG . 1 is a schematic diagram of porcine α chain mRNA. The overlapping cDNA clones used for sequencing are marked above the figure showing the mRNA structure. The black squares at the 3'end of the lambda clones indicate that these clones have specific priming (prior
ming). Untranslated sequences are shown as straight lines and coding sequences are shown as boxes. The blank area refers to the coding region of the signal sequence and the pro sequence, and the cross-hatched area refers to the 134 amino acid α-chain.
The scale is 5'of the longest cDNA clone with the longest nucleotides.
It is shown from the end.

【００１３】図２および図３はブタインヒビンα鎖前駆
体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を示
す。ヌクレオチド番号は左側に、アミノ酸番号は全般を
通して記載されている。下線を付したアミノ酸配列は長
い合成ＤＮＡプローブを設計するのに用いられた配列で
ある。この３６４アミノ酸前駆体には、疎水性のシグナ
ル配列、プロ領域、並びに成熟の鎖(アミノ酸２３１−
３６４)が含まれている。成熟α鎖のＮＨ₂末端の直ぐ上
流にタンパク分解的なプロセッシング部位であるＡrg−
Ａrg(黒色バーで表示)がある。その他、プロ領域内に存
在する、幾つかの推定の二塩基性プロセッシング部位は
白色バー(空白の棒)で示されている。単一の、潜在的な
Ｎ−結合グリコシル化部位は、交差斜線を引いたバーで
示されている。mＲＮＡの３'末端と近接したＡＡＴＡＡ
Ａボックスに下線を施して示した。2 and 3 show the nucleotide and deduced amino acid sequences of the porcine inhibin α chain precursor. Nucleotide numbers are listed on the left and amino acid numbers throughout. The underlined amino acid sequence is the sequence used to design the long synthetic DNA probe. This 364 amino acid precursor contains a hydrophobic signal sequence, a pro region, and a mature chain (amino acids 231-
364) is included. Arg- which is a proteolytic processing site immediately upstream of the NH ₂ terminus of the mature α chain
There is Arg (displayed with a black bar). In addition, some putative dibasic processing sites within the pro region are indicated by white bars (blank bars). A single potential N-linked glycosylation site is indicated by the crosshatched bar. AATAA close to the 3'end of mRNA
The A box is underlined.

【００１４】図４はブタのβ_AサブユニットmＲＮＡおよ
びβ_BサブユニットmＲＮＡを表し、その暗号配列を四角
で囲んで示した模式図である。β_Aサブユニットおよび
β_Bサブユニット(ダッシュで表示)は、暗号配列の３'末
端に向かってコードされている。３'および５'非翻訳領
域は線で示されている。β_BサブユニットmＲＮＡの５'
および３'非翻訳領域の長さはmＲＮＡのサイズ(図９)、
並びに、それとβ_A mＲＮＡとの明白な類似性に基づい
て帰納的に決められた。図中、破線はcＤＮＡの仮定の
領域を示している。オーバーラップするオリゴdＴにプ
ライムされたcＤＮＡクローンおよびランダムにプライ
ムされたクローン(λＰＩＮβ_A５s、λＰＩＮβ_B１s、
およびλＰＩＮβ_B２s)の相対的な位置を示した。スケ
ールは４.５kbmＲＮＡの５'末端から、ヌクレオチド番
号で示されている。FIG. 4 is a schematic diagram showing porcine β _A subunit mRNA and β _B subunit mRNA, the coding sequences of which are enclosed by a square. The β _A and β _B subunits (indicated by dashes) are encoded towards the 3 ′ end of the coding sequence. The 3'and 5'untranslated regions are indicated by lines. 5'of β _B subunit mRNA
And the length of the 3'untranslated region is the size of the mRNA (Fig. 9),
As well as on the basis of the apparent similarity between it and β _A mRNA. In the figure, the broken line indicates a hypothetical region of cDNA. Overlapping oligo dT primed cDNA clones and randomly primed clones (λPINβ _A 5s, λPINβ _B 1s,
And the relative position of λPINβ _B 2s). The scale is indicated by the nucleotide number from the 5'end of the 4.5 kb mRNA.

【００１５】図５、図６、図７および図８は、ブタ・イ
ンヒビンのβサブユニット前駆体のヌクレオチド配列お
よび推定のアミノ酸配列を示す。β_B配列はβ_A配列と、
最大限ホモロジィに並んでいる。βサブユニット前駆体
のＮＨ₂末端は角型括弧と矢印で示されている。システ
イン残基には陰影を施し、可能なプロセッシング部位を
白色バーで示すと共に、可能なグリコシル化部位を交差
した斜線を付した箱で囲んだ。両配列の、終止コドンの
３'側に存在する極めてＧＣに富む領域、イントロン配
列に、上線(オーバーライン)または下線を付した。オリ
ゴヌクレオチドの設計に用いたアミノ酸配列に、ＡＡＴ
ＡＡＡポリアデニル化シグナルのごとく下線を付した。
λＰＩＮ−β_A８とこの領域をカバーする他のクローン
類との間には１個のヌクレオチドの相違があった。Ｇ→
Ａ変化によりアミノ酸２７８のグリシンからセリンへの
変化が起きた。成熟β_AサブユニットのＮＨ₂末端の直ぐ
上流には、プロ配列を伴って、Ａrg Ａrg Ａrg Ａrg
Ａrg (黒色バー)タンパク分解的プロセッシング部位
が存在する。β_Aサブユニットのアミノ酸配列にのみ番
号が付されている。FIGS. 5, 6, 7 and 8 show the nucleotide and deduced amino acid sequences of the porcine inhibin β subunit precursor. The β _B sequence is the β _A sequence,
It is lined up to the maximum homology. The NH ₂ terminus of the β subunit precursor is indicated by square brackets and arrows. The cysteine residues are shaded, the possible processing sites are indicated by white bars and the possible glycosylation sites are boxed with crossed lines. The extremely GC-rich region, the intron sequence, located 3'to the stop codon of both sequences is overlined or underlined. The amino acid sequence used to design the oligonucleotide was AAT
The AAA polyadenylation signal is underlined.
Between the λPIN-β _A 8 and other clones covering this region was a difference of 1 nucleotide. G →
A change caused the change of amino acid 278 from glycine to serine. Immediately upstream of the NH ₂ terminus of the mature β _A subunit, with the prosequence, Arg Arg Arg Arg
There is an Arg (black bar) proteolytic processing site. Only the amino acid sequence of the β _A subunit is numbered.

【００１６】図９はα,β_Aおよびβ_Bサブユニット・ハ
イブリダイゼーションプローブを用いて行ったブタの卵
胞mＲＮＡについてのノーザン・ブロット・分析の結果
を示す図である。a、b、c、dおよびfレーンはポリＡ⁺m
ＲＮＡを、eおよびgレーンは全ＲＮＡを示している。２
８Ｓおよび１８Ｓリボソーム性ＲＮＡの位置を表示し
た。a、dおよびeレーンはαサブユニットcＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズさせ; d、eおよびgレーンはβ_Aサブ
ユニット特異的プローブとハイブリダイズさせ;cレーン
はβ_Bサブユニット特定的プローブとハイブリダイズさ
せた結果を示す。αサブユニットmＲＮＡは約１.５kbで
あり、β_AサブユニットmＲＮＡは約４.５kbである。a、
bおよびcレーンに示したハイブリダイゼーションは、m
ＲＮＡの相対レベルを判定するために略等しい長さと特
異活性を有するプローブを用いて行われた。FIG. 9 shows the results of Northern blot analysis of porcine follicular mRNA using α, β _A and β _B subunit hybridization probes. Lanes a, b, c, d and f are poly A ⁺ m
RNA, e and g lanes show total RNA. Two
The positions of 8S and 18S ribosomal RNA are indicated. Lanes a, d and e were hybridized with an α subunit cDNA probe; d, e and g lanes were hybridized with a β _A subunit specific probe; c lanes were hybridized with a β _B subunit specific probe. The results are shown below. The α subunit mRNA is about 1.5 kb and the β _A subunit mRNA is about 4.5 kb. a,
The hybridizations shown in lanes b and c are
It was performed using probes of approximately equal length and specific activity to determine relative levels of RNA.

【００１７】図１０はヒトβ−ＴＧＦアミノ酸配列と、
ブタインヒビンのβ_Aおよびβ_Bアミノ酸配列とを比較し
て示した図である。システイン残基周辺の配列が示され
ている。同一残基は箱で囲まれているが保存的な変化は
星印により示されている。図中、Ｉnhはインヒビンを表
す。FIG. 10 shows the human β-TGF amino acid sequence,
It is the figure which compared with the (beta) _A and (beta) _B amino acid sequence of porcine inhibin. The sequence around the cysteine residue is shown. Identical residues are boxed but conservative changes are indicated by asterisks. In the figure, Inh represents inhibin.

【００１８】図１１はαサブユニット配列とβ_Aインヒ
ビン配列との比較図である。図中、Ｉnhはインヒビンを
表す。FIG. 11 is a comparison diagram of the α subunit sequence and the β _A inhibin sequence. In the figure, Inh represents inhibin.

【００１９】図１２、図１３および図１４は代表的な、
ブタインヒビンの組換え発現プラスミドの組立て模式図
である。図中、Ｉnhはインヒビンを表す。12, 13 and 14 are representative,
FIG. 3 is a schematic diagram of assembly of a recombinant expression plasmid of porcine inhibin. In the figure, Inh represents inhibin.

【００２０】図１５および図１６はヒトαインヒビンc
ＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
示す図である。アミノ酸数３３５のプロまたはインヒビ
ン配列に、仮定のシグナル開裂部位から番号を付した。
アミノ酸数１６のシグナル配列は−１から−１６までの
番号が付されている。ブタの配列と相同(ホモロジィ)の
場合は、シグナル配列中の１２アミノ酸残基がさらに予
測される。この図および他の図において、推定の二塩基
性プロセッシング部位を白色バー、グリコシル化部位を
斜線を付したバーで、そしてアミノ末端成熟鎖プロセッ
シング部位を黒色バーで示した。ポリ(Ａ)付加シグナル
配列には下線を施した。システイン残基には陰影を施し
た。FIGS. 15 and 16 show human α inhibin c.
It is a figure which shows the nucleotide sequence of DNA and the deduced amino acid sequence. The 335 amino acid pro or inhibin sequence is numbered from the putative signal cleavage site.
Signal sequences having 16 amino acids are numbered from -1 to -16. In the case of homology with the porcine sequence, 12 amino acid residues in the signal sequence are further predicted. In this and other figures, putative dibasic processing sites are indicated by white bars, glycosylation sites by shaded bars, and amino-terminal mature chain processing sites by black bars. The poly (A) addition signal sequence is underlined. The cysteine residues are shaded.

【００２１】図１７および図１８はヒトとブタのαイン
ヒビンタンパク質配列の比較図である。ホモロジィを最
大にするために間隙を配し、同定していない位置には星
印を付した。番号はブタ配列に関して付されており、こ
れは、ヒトの配列よりもアミノ酸１個分短い。17 and 18 are comparison diagrams of human and porcine α-inhibin protein sequences. Gaps are placed to maximize homology, and unidentified positions are marked with stars. Numbering is given for the porcine sequence, which is one amino acid shorter than the human sequence.

【００２２】図１９、図２０および図２１はアミノ酸数
２８のヒトβ_Aインヒビンシグナル配列(残基−２８〜−
１)と、長さ３７８アミノ酸の前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す図である。前駆体中
の基本的なプロセッシング部位は黒色バーを、潜在的な
グリコシル化部位は斜線を付したバーを、それぞれ配列
の上方に配して示した。システイン残基には陰影を付し
た。FIGS. 19, 20 and 21 show the human β _A inhibin signal sequence (residues −28 to −28) having 28 amino acids.
FIG. 1) shows the nucleotide sequence of a precursor having a length of 378 amino acids and the deduced amino acid sequence. The basic processing sites in the precursors are shown as black bars and the potential glycosylation sites are shown as shaded bars above the sequence. The cysteine residues are shaded.

【００２３】図２２、図２３および図２４はヒトβ_Bイ
ンヒビンcＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミ
ノ酸配列を示す図である。この配列はシステイン残基
(７位)から始まり、β_A配列(図１９、図２０および図２
１)中の残基７に存在するシステインから並んでいる。
成熟インヒビンのプロセッシング部位は黒色バーで、潜
在的なグリコシル化部位は交差斜線を付したバーで示さ
れている。システイン残基には陰影を施した。FIG. 22, FIG. 23 and FIG. 24 show the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of human β _B inhibin cDNA. This sequence is a cysteine residue
Starting from (7th position), the β _A sequence (FIG. 19, FIG. 20 and FIG. 2)
Aligned from the cysteine present at residue 7 in 1).
The processing sites of mature inhibin are shown as black bars and potential glycosylation sites are shown as cross-hatched bars. The cysteine residues are shaded.

【００２４】詳しい記述 本発明のポリペプチドはインヒビンのα鎖およびβ鎖、
並びにそれらの多量体形(アクティビンおよびインヒビ
ン)、それらのプレプロ形、それらのプロドメイン、そ
れら各鎖および各形のグリコシル化および／またはアミ
ノ酸配列における変異体を含む。ヒトまたは動物供給源
由来のインヒビン(アレルを含む)は、脳下垂体前葉細胞
からのＦＳＨの基礎分泌を阻害するがＬＨの基礎分泌を
阻害せず、アクティビンはその逆の作用を表す[以後、
“ホルモン活性(hormonally active)"アクティビン、ま
たは“ホルモン活性"インヒビンと呼称]。 Detailed Description The polypeptide of the present invention comprises the α and β chains of inhibin,
And their multimeric forms (activin and inhibin), their prepro forms, their prodomains, their respective chains and their forms of glycosylation and / or variants in the amino acid sequence. Inhibins from human or animal sources (including alleles) inhibit basal secretion of FSH from anterior pituitary cells but not LH, and activin exhibits the opposite effect [hereafter ,
Called "hormonally active" activin, or "hormone active" inhibin.

【００２５】一般に、アミノ酸配列変異体は図２、図
３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１６、図１
９、図２０、図２１、図２２、図２３および図２４に示
したブタまたはヒトのαあるいはβ鎖配列と、適切な割
合で、実質上ホモローガスである。実質上ホモローガス
とは、２種のタンパク質を、そのアミノ酸残基の番号が
最大限一致する様に並べたとき、候補ポリペプチドの一
次アミノ酸配列の約７０％以上がブタまたはヒトの鎖と
対応していることを意味する。残基の一致を最大にする
ためには、アミノ酸および／またはカルボキシ末端のシ
フトや、必要なギャップの導入および／または候補ポリ
ペプチド中に挿入体として存在する残基の欠失が行われ
る。例として、β_Aおよびβ_Bサブユニット、あるいはヒ
トおよびブタのα−インヒビン配列が最大限ホモロジィ
に並んでいる図５、図６、図７、図８、図１７および図
１８を参照されたい。一般に、アミノ酸配列上の変異体
は図２、図３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１
６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３および図
２４に示した対応する天然の配列と約９０％ホモローガ
スである。In general, amino acid sequence variants are shown in FIGS. 2, 3, 5, 6, 6, 7, 8, 15, 16 and 1.
It is substantially homologous to the porcine or human α or β chain sequences shown in FIG. 9, FIG. 20, FIG. 21, FIG. 22, FIG. 23 and FIG. Substantially homologous means that when two proteins are aligned such that the amino acid residue numbers are maximally matched, about 70% or more of the primary amino acid sequence of the candidate polypeptide corresponds to the pig or human chain. It means that To maximize residue matching, amino acid and / or carboxy terminal shifts, introduction of necessary gaps and / or deletion of residues present as inserts in the candidate polypeptide are made. See, for example, Figure 5, Figure 6, Figure 7, Figure 8, Figure 17, and Figure 18, in which the β _A and β _B subunits or human and porcine α-inhibin sequences are maximally homologous. Generally, the variants on the amino acid sequence are shown in FIG. 2, FIG. 3, FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7, FIG.
6, about 90% homologous to the corresponding native sequence shown in Figures 19, 20, 20, 21, 23 and 24.

【００２６】ホルモン的に活性でないが(１)天然の対応
物(カウンターパーツ)に対して惹起された抗体と免疫学
的に交差反応し得るが、あるいは(２)その様な対応ポリ
ペプチドと、細胞表面の受容体への結合において拮抗し
得る変異体であって、成熟インヒビン鎖またはプロドメ
イン配列と実質上ホモローガスであるか、あるいはホモ
ローガスでないポリペプチドを包含する変異体も本発明
の範囲に含まれる。ホルモン的に不活性な変異体は、フ
ラグメントなかんずく単離されたインヒビンのαまたは
β鎖の組換え合成法あるいは有機合成法によって製造さ
れるか、またはアミノ酸配列に変化を導入することによ
り、分子が前記定義のホルモン活性をもはや示さなくな
り、生産される。(1) not hormonally active but capable of immunologically cross-reacting with an antibody raised against its natural counterpart (counterpart), or (2) with such a corresponding polypeptide, Also included within the scope of the invention are variants that can antagonize binding to cell surface receptors, including polypeptides that are substantially homologous or not homologous to the mature inhibin chain or prodomain sequences. Be done. Hormonally inactive mutants are produced by recombinant or organic synthesis of the α or β chain of isolated inhibin, in particular fragments, or by introducing changes in the amino acid sequence. It no longer exhibits the hormonal activity defined above and is produced.

【００２７】免疫学的な交差反応性または受容体との交
差反応性という語句は、候補ポリペプチドがホルモン活
性類似体とホルモン活性類似体に対して惹起されたポリ
クローナル抗血清との結合を競合的に阻害し得ることを
意味する。その様な抗血清は、ヒツジまたはウサギの
Ｓ．Ｃとホルモン活性類似体を注射するか、あるいは、
完全フロインドのアジュバント中に入れた誘導体を与
え、不完全フロインド中のＳ．Ｃを腹腔内にブースター
注入することにより常法通り調製される。The phrase immunological cross-reactivity or receptor cross-reactivity refers to the fact that a candidate polypeptide competitively binds hormone-active analogs and polyclonal antisera raised against the hormone-active analog. It means that it can inhibit. Such antisera have been described in sheep or rabbit S. cerevisiae. By injecting C and a hormone active analogue, or
Given the derivative in complete Freund's adjuvant, S. It is prepared in a conventional manner by injecting C intraperitoneally with a booster.

【００２８】ホルモン活性を有さないが、ホルモン活性
なインヒビン、アクティビンまたはプロドメインに対す
る抗血清と反応し得る変異体は、(a)天然の類似体また
はその抗体の診断アッセイにおける試薬(b)既知の方法
で不溶化した場合には、抗血清から抗一天然同族体抗体
を精製するための物質として、(c)ホルモン活性同族体
に対する抗体を惹起するための免疫原として、有用であ
る。Variants that have no hormonal activity but are capable of reacting with antisera directed against hormonally active inhibin, activin or prodomain are: (a) natural analogues or reagents in diagnostic assays for their antibodies (b) When it is insolubilized by a known method, it is useful as a substance for purifying anti-naturally occurring homolog antibody from antiserum, and as an immunogen for inducing an antibody against (c) hormone active homolog.

【００２９】本発明は、インヒビンαまたはβ鎖前駆体
のプロ配列および／またはプレプロ配列、あるいはそれ
らの免疫学的または生物学的に活性なフラグメントであ
って、実質上、対応する成熟インヒビン鎖を含んでいな
いものを含む。ブタまたはヒトのインヒビンに関するこ
れらの配列は、図２、図３、図５、図６、図７、図８、
図１５、図１６、図１９、図２０、図２１、図２２、図
２３および図２４に示されている。ブタαサブユニット
前駆体のプレプロ配列は残基１から約２３０までのポリ
ペプチドであり、β_Aサブユニットのプロ配列は残基１
から約３０８によって構成されている。本明細書中で
は、これらの配列をプロドメイン配列に包含させること
とする。The present invention relates to pro- and / or pre-pro sequences of inhibin α or β chain precursors, or immunologically or biologically active fragments thereof, substantially corresponding to the mature inhibin chain. Including those that do not include. These sequences for porcine or human inhibin are shown in Figure 2, Figure 3, Figure 5, Figure 6, Figure 7, Figure 8,
It is shown in FIGS. 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23 and 24. The porcine α subunit precursor prepro sequence is a polypeptide from residue 1 to about 230, and the β _A subunit pro sequence is residue 1
To about 308. As used herein, these sequences will be included in the prodomain sequence.

【００３０】αおよびβサブユニットプロドメイン配列
は、タンパク分解的部位によって境を接しているいくつ
かのドメイン(領域)から成っており、本発明において
は、それらドメインを、個別に、あるいは他のドメイン
と結合した形で合成する。基本的なブタのβ_Aドメイン
は、残基１〜約７０(ドメインＩ)、約７０〜約１１０
(ドメインＩＩ)、約１１０〜約１８０(ドメインＩＩ
Ｉ)、約１８０〜約２６０(ドメインＩＶ)および約２７
０〜約３０９(ドメインＶ)にある。さらに詳しくは、ブ
タβ_Aドメインは、式:The α and β subunit prodomain sequences are composed of several domains bounded by proteolytic sites, and in the present invention, these domains can be used individually or in combination with other domains. Synthesized in a form linked to the domain. The basic porcine β _A domain is residues 1 to about 70 (domain I), about 70 to about 110.
(Domain II), about 110 to about 180 (domain II
I), about 180 to about 260 (domain IV) and about 27
0 to about 309 (domain V). More specifically, the porcine β _A domain has the formula:

【化６０】ＧＨＳＡＡＰＤＣＰＳＣＡＬＡＴＬＰＫＤＶ
ＰＮＳＱＰＥＭＶＥＡＶ、ＨＩＬＮＭＬＨＬＫＫＲＰＤ
ＶＴＱＰＶＰＫＡＡＬＬＮＡＩ、ＬＨＶＧＫＶＧＥＮＧ
ＹＶＥＬＥＤＤＩＧ、ＡＥＭＮＥＬＭＥＱＴＳＥＩＩＴ
ＦＡＥＡＧＲＡＲＫＴＬＲＦＥＩＳＫＥＧＳＤＬＳＶＶ
ＥＲＡＥＩＷＬＦＫＶＰＫＡＮＲＴＲＴＫＶＳＩＲＬＦ
ＱＱＱ、ＰＱＧＳＡＤＡＧＥＥＡＥＤＶＧＦＰＥＥＫＳ
ＥＶＬＩＳＥＫＶＶＤＡ、ＳＴＷＨＩＦＰＶＳＳＳＩＱ
ＲＬＬＤＱＧＫＳＡＬＤＩＲＴＡＣＥＱＣＨＥＴＧＡＳ
ＬＶＬＬＧ、およびＧＨＳＡＡＰＤＣＰＳＣＡＬＡＴＬ
ＰＫＤＶＰＮＳＱＰＥＭＶＥＡＶＫＫＨＩＬＮＭＬＨＬ
ＫＫＲＰＤＶＴＱＰＶＰＫＡＡＬＬＮＡＩ のドメインを含む。また、ブタβ_Bドメインはホモロー
ガスなβドメインと同じ配列のドメインおよび、式:[Chemical Formula 60] GHSAAPDCPSCALATLPKDV
PNSQPEMVEAV, HILNMLHLKKRPD
VTQPVPKAALLNAI, LHVGKVGENG
YVELEDDIG, AEMNELMEQTSEIIT
FAEAGRARKLTLRFEISKEGSDLSVV
ERAIWLFKVPKANRTRTKVSIRLF
QQQ, PQGSADAGEEAEDVGFPEEKS
EVLISEKVVDA, STWHIFPVSSSIQ
RLLDQGKSALDIRTACEQCHETGAS
LVLLLG, and GHSAAPDCPSCALATL
PKDVPNSQPEMAVEAVKKHILNLMLHL
It contains the domain of KKRPDVTQPVPKAALLNAI. In addition, the porcine β _B domain is a domain having the same sequence as the homologous β domain and the formula:

【化６１】ＲＡＡＨＩＬＬＨＡＶＲＶＳＧＷＬＮＬ で示されるドメインを含む。さらにブタαドメインは、
式:Includes the domain designated RAAHILLHAVRVSGWLNL. Furthermore, the porcine α domain is
formula:

【化６２】ＧＰＥＬＤＲＥＬＶＬＡＫＶＲＡＬＦＬＤＡ
ＬＧＰＰＡＶＴＧＥＧＧＤＰＧＶおよびＧＳＥＰＥＥＥ
ＤＶＳＱＡＩＬＦＰＡＴＧＡＲＣＧＡＥＰＡＡＧＥＬＡ
ＲＥＡＥＥＧＬＦＴＹＶＧＲＰＳＱＨＴＨＳＲＱＶＴＳ
ＡＱＬＷＦＨＴＧＬＤＲＱＧＭＡＡＡＮＳＳＧＰＬＬＤ
ＬＬＡＬＳＳＲＧＰＶＡＶＰＭＳＬＧＱＡＰＰＲＷＡＶ
ＬＡＡＳＡＬＰＬＬＴＨＰＶＬＶＬＬＬＲＣＰＬＣＳＣ
ＳＡＲＰＥＡＴＰＦＬＶＡＨＴＲＡＲＰＰＳＧＧＥＲＡ で示されるドメインを含む。代表的な結合(コンビネー
ション)ドメインポリペプチドは、β_AドメインＩＩのＣ
末端とβ_AドメインＩＩＩのＮＨ₂末端とが結合してなる
ポリペプチドである。さらに、これらのドメインは、図
２、図３または図５、図６、図７および図８に示される
様にタンパク分解部位で融合しているか、加水分解に抵
抗性の１〜４残基ポリペプチド(例えばグルタミニル残
基またはヒスチジル残基)により融合しているか、ある
いは直接、融合しており、結合ドメインポリペプチドの
産生にはこれら３種の場合の全てがあてはまる。[Chemical Formula 62] GPELDRELVLAKVRALFLDA
LGPPAVTGEGGDPGV and GSEPEEE
DVSQAILFPATGARCGAEPAAGELA
REAEEGLFTYVGRPSQHTHSRQVTS
AQLWFHTGLDRQGMAAANSSGPLLD
LLALSSRGPVAVPMSLGQAPPRWAV
LAASALLPLLTHPLVLLLLRCPLCSC
Includes the domain designated SARPEATPFLVAHTRARPPSGGERA. An exemplary binding domain polypeptide is the C of β _A domain II.
It is a polypeptide in which the end is bound to the NH ₂ terminus of β _A domain III. In addition, these domains may be fused at the proteolytic site as shown in Figure 2, Figure 3 or Figure 5, Figure 6, Figure 7 and Figure 8, or may be a 1-4 residue polypolynucleotide that is resistant to hydrolysis. Fusions with peptides (eg glutaminyl or histidyl residues) or direct fusions, all three of these cases apply to the production of binding domain polypeptides.

【００３１】基本的なヒトα鎖プロドメインは、大概残
基３０−１９９および１−２９、ヒトβ_Aプロドメイン
は大概、残基１−３０、３２−４０、４３−５９、６２
−８０、８３−１８５および１８６−２３０、ヒトβ_B
プロドメインは大概、残基１−１３、１５−３０、３２
−５９、６２−１４５、１４８−１９５および１９８−
２４１それぞれ、図１５、図１６、図１９、図２０、図
２１、図２２、図２３および図２４の番号付けによる)
である。結合プロドメインポリペプチドも本発明の範囲
内に含まれ、それらは、例えば、残基約４３−８０のβ
_Aプロドメイン、残基約１−３０および約３２−１４５
のβ_Bプロドメインである。好ましいヒトα、β_Aおよび
β_B鎖プロドメインは、残基約１−２９、約４３−８０
および約１−３０である。The basic human α chain prodomain is mostly residues 30-199 and 1-29, the human β _A prodomain is mostly residues 1-30, 32-40, 43-59, 62.
-80, 83-185 and 186-230, human β _B
Prodomains are usually residues 1-13, 15-30, 32.
-59, 62-145, 148-195 and 198-
241, respectively, by the numbering in FIGS. 15, 16, 19, 20, 20, 21, 23, and 24).
Is. Binding prodomain polypeptides are also included within the scope of the invention and are, for example, β-residues at about 43-80.
_A prodomain, residues about 1-30 and about 32-145
Is the β _B prodomain of. Preferred human α, β _A and β _B chain prodomains have residues 1-29, 43-80.
And about 1-30.

【００３２】無傷の、単離されたプレプロまたはプロド
メインβ_A、β_Bまたはα配列は、組換え細胞培養により
最もよく製造できる。個々の準構成(サブコンポーネン
ト)ドメインは、有機化学における常套手段、あるいは
組換え細胞培養により合成される。次いで、それらを既
知の方法を用い、放射性同位元素、あるいは、酵素また
は蛍光等の検出可能な基で標識し、プレプロまたはプロ
形のインヒビン(個々のドメインをも含む)あるいはその
前駆体をコードしているＤＮＡを有する形質転換体にお
けるプレプロまたはプロ形のインヒビン(ドメインを含
む)のレベルを検出するためのイムノアッセイに用い
る。このアッセイは、プロインヒビンのタンパク分解的
加水分解が宿主形質転換体内で起きているか、あるいは
その培地中で起きているかを決定するのに有用である。
このアッセイはまた、組換え合成における律速段階が、
mＲＮＡのプレプロ形への翻訳か、プレプロ形から成熟
インヒビンへのプロセッシングのいずれにあるかを調べ
るにも有用である。例えば、プレプロまたはプロインヒ
ビンが細胞リゼイト中に高レベルに存在しており、分泌
された成熟インヒビンのレベルが比較的低いということ
は、宿主細胞がインヒビンＤＮＡを適当に転写し、翻訳
しているが、充分な速度で前駆体をプロセッシングして
いないことを示唆している。従って、この場合には、専
ら、形質転換用プラスミドの転写効率や翻訳効率の向上
を目的とする宿主細胞以外の宿主細胞を選ぶ方が良く、
それは、例えば、他のプロモーターを選択することで行
われる。プロドメイン配列は、動物の生殖サイクルおよ
び稔性における生理学上の共同調節に関与していると思
われる。The intact, isolated prepro or prodomain β _A , β _B or α sequences can best be produced by recombinant cell culture. The individual subcomponent domains are synthesized by conventional means in organic chemistry or by recombinant cell culture. They are then labeled using known methods with radioactive isotopes or detectable groups such as enzymes or fluorescence to encode prepro or pro forms of inhibin (including individual domains) or precursors thereof. It is used in an immunoassay for detecting the level of prepro or pro form of inhibin (including domain) in a transformant carrying the DNA. This assay is useful in determining whether proteolytic hydrolysis of proinhibin is occurring within the host transformant or in its medium.
This assay also demonstrates that the rate-limiting step in recombinant synthesis is
It is also useful for investigating whether the mRNA is in the translation into the prepro form or the processing of the prepro form into mature inhibin. For example, high levels of prepro or proinhibin present in cell lysates and relatively low levels of secreted mature inhibin indicate that the host cell has properly transcribed and translated inhibin DNA. , Suggesting that it is not processing the precursor at a sufficient rate. Therefore, in this case, it is better to select a host cell other than the host cell whose purpose is to improve the transcription efficiency or translation efficiency of the transformation plasmid.
This is done, for example, by selecting another promoter. Prodomain sequences appear to be involved in physiological co-regulation in animal reproductive cycle and fertility.

【００３３】アミノ酸配列の変異体は、(１)ホルモン活
性であるか、(２)成熟インヒビンあるいはプロドメイン
αまたはβ鎖配列に対して惹起された抗体と交差反応し
得るか、あるいは(３)インヒビン／アクティビンの細胞
表面受容体と交差反応し得るものであって、天然のイン
ヒビンまたはプロドメイン配列の配列を出発物質とする
一次アミノ酸配列を有することを特徴とする配列であ
る。これらの誘導体は、通常、標的ＤＮＡをコードして
いるＤＮＡが変異体をコードする様に修飾するために、
ヌクレオチドの挿入、欠失または置換を行った後、組換
え細胞培養内でＤＮＡを発現させることにより調製され
る。約１００−１５０までの残基を有するポリペプチド
はまた、インビトロ合成法により、好都合に調製でき
る。その様な変異体は、天然に存在するアレル変異また
は種間変異とは異なる特徴である、予め定められた性質
上の変化を有することを特徴とする。変異体は天然に存
在する類似体と質的に同じ生物学的活性を示すか、ある
いはその様な類似体に対して拮抗的に作用することがで
きる。Amino acid sequence variants may be (1) hormonally active, (2) cross-reactive with antibodies raised against mature inhibin or prodomain α or β chain sequences, or (3) A sequence capable of cross-reacting with an inhibin / activin cell surface receptor and characterized by having a primary amino acid sequence starting from the sequence of a natural inhibin or prodomain sequence. These derivatives are usually modified so that the DNA encoding the target DNA is modified to encode the mutant,
It is prepared by inserting, deleting or substituting nucleotides and then expressing the DNA in recombinant cell culture. Polypeptides having up to about 100-150 residues can also be conveniently prepared by in vitro synthetic methods. Such variants are characterized by having a predetermined change in property, a characteristic that is different from naturally occurring allelic or interspecies variations. Variants may exhibit qualitatively the same biological activity as a naturally occurring analog, or may act antagonistically on such an analog.

【００３４】配列の変化を導入する部位は予め定めてお
くが、突然変異そのものを予め定めておく必要はない。
例えば、特定の位置の残基での突然変異を適切に行うた
めには、標的コドンまたは領域に無作為な変異誘発を行
い、発現されたインヒビン突然変異体を、所望の活性の
適切な組み合わせについてスクリーニングする。既知の
配列を有するＤＮＡの予定の部位で置換突然変異を誘発
する方法はよく知られている(例、Ｍ１３プライマー突
然変異誘発)。The site for introducing a sequence change is predetermined, but the mutation itself need not be predetermined.
For example, in order to properly mutate a residue at a particular position, random mutagenesis of the target codon or region is carried out, and the expressed inhibin mutant is cloned for the appropriate combination of desired activities. To screen. Methods for inducing substitution mutations at predetermined sites in DNA having a known sequence are well known (eg, M13 primer mutagenesis).

【００３５】突然変異誘発は、通常、アミノ酸残基約１
〜１０程度の挿入、または約１〜３０残基の欠失により
行われる。欠失または挿入は隣接する１対、即ち、２残
基の欠失または２残基の挿入により行うことが好まし
い。置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、等を組み
合わせて最終的な組立てを行う。挿入には、アミノ末端
またはカルボキシ末端の融合、例えばカルボキシ末端に
おける付加的疎水性の延長も含まれる。しかしながら、
置換突然変異のみを行うことが好ましい。暗号ＤＮＡ内
における突然変異は、暗号配列をリーディングフレーム
外に位置せしめるようなものであってはならず、また、
ハイブリダイズして、ループやヘアピンのごとき、mＲ
ＮＡの二次構造を形成させる可能性のある相補領域を作
らないことが好ましいことは明らかである。Mutagenesis is usually performed at about 1 amino acid residue.
It is performed by insertion of about 10 or deletion of about 1 to 30 residues. Deletions or insertions are preferably made by a pair of adjacent, deletion of two residues or insertion of two residues. Final assembly is performed by combining substitutions, deletions, insertions, or combinations thereof. Insertions also include amino or carboxy terminal fusions, eg, additional hydrophobic extensions at the carboxy terminus. However,
It is preferable to make only substitution mutations. Mutations in the coding DNA must not place the coding sequence out of reading frame, and
Hybridize and use mR such as loops and hairpins
Clearly, it is preferable not to create complementary regions that could form the secondary structure of NA.

【００３６】本発明のポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡにおける突然変異の全てが最終分泌産物に発現され
るわけではない。例えば、置換型のＤＮＡ突然変異体の
主なものは、固有のブタまたはヒトのαまたはβ鎖分泌
リーダーが、そのリーダー配列内での欠失、または置換
のいずれかにより、異なる分泌リーダーまたはシグナル
で置き換えられ、固有のリーダー配列の大部分または全
部が所望の宿主によって一層認識され易いリーダーに変
化されたものである。例えば、原核性発現ベクターを組
立てるには、細菌のアルカリホスファターゼリーダーま
たは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのためにブ
タまたはヒトのαまたはβ鎖分泌リーダーを欠失させ、
酵母発現ベクターの組立てには、酵母インバーターゼリ
ーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダ
ーで、該リーダーを置換する。しかしながら、ブタおよ
びヒトの分泌リーダーは多くの、異質(ヘテロローガス)
のより高等な真核細胞によって認識される。宿主によっ
て分泌リーダーが「認識」されると、成熟インヒビンまた
はプロドメインと、Ｃ末端において融合しているリーダ
ーポリペプチドの融合が、宿主のシグナルペプチダーゼ
で開裂され、成熟インヒビンまたはプロドメインポリペ
プチドが分泌され得る。D encoding the polypeptide of the present invention
Not all mutations in NA are expressed in the final secreted product. For example, predominantly substitutional DNA mutants are those in which a unique porcine or human α or β chain secretory leader has different secretory leaders or signals, either due to deletions or substitutions within the leader sequence. , And most or all of the unique leader sequence has been changed to a leader that is more recognizable by the desired host. For example, to construct a prokaryotic expression vector, delete the porcine or human α or β chain secretion leader for the bacterial alkaline phosphatase leader or the thermostable enterotoxin II leader,
For the construction of yeast expression vectors, the yeast invertase leader, alpha factor leader or acid phosphatase leader is substituted for the leader. However, many secretory leaders in pigs and humans are heterologous.
Is recognized by higher eukaryotic cells of. Once the secretory leader is "recognized" by the host, the fusion of the mature inhibin or prodomain and the leader polypeptide fused at the C-terminus is cleaved by the host signal peptidase to secrete the mature inhibin or prodomain polypeptide. Can be done.

【００３７】最終的なアミノ酸配列誘導体として発現さ
れないもう一つの主なＤＮＡ突然変異体は、発現を促進
するためのヌクオチド置換に関するものであり、それ
は、第一義的に、転写されたmＲＮＡに５'ステムアンド
ループ構造が形成されることを回避する[ドウ・ボアら
(de Ｂoer)ＥＰ７５, ４４４Ａを参照]ためであり、あ
るいは、選択された宿主によってより転写され易いコド
ンを与える(例えば、大腸菌または酵母による発現に好
都合な、周知のコドンを与える)ためのものである。こ
れらの置換物は、置換されたアミノ酸をコードしていて
も、いなくともよいが、コードしていない方が好まし
い。Another major DNA mutant that is not expressed as the final derivative of the amino acid sequence involves a nucleotide substitution to enhance expression, which is primarily associated with the transcribed mRNA. 'Avoid forming a stem-and-loop structure [Dou Bohr et al.
(de Boer) EP 75, 444A] or to provide codons that are more transcribed by the host of choice (eg, to provide known codons that are convenient for expression by E. coli or yeast). is there. These substitutions may or may not code for the substituted amino acids, but preferably do not.

【００３８】挿入および置換によるアミノ酸配列変異体
は、標的インヒビン、アクティビン、プロドメインある
いはプロ形のインヒビンまたはアクティビンの予め定め
られた位置に１またはそれ以上のアミノ酸残基が導入さ
れているか、その位置から除去されているタンパク質で
ある。最も一般的には、挿入変異体は、αまたはβ鎖、
プロドメイン、あるいは他のインヒビン誘導体のアミノ
末端またはカルボキシ末端にヘテロローガスなタンパク
質またはポリペプチドが融合している融合物である。免
疫原性誘導体は、例えばプロドメインポリペプチド等の
標的配列に、インビトロ合成、あるいは、融合物をコー
ドしているＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養によ
り、免疫原性ポリペプチドを融合させることにより調製
される。その様な免疫原性ポリペプチドは、trpＬＥや
ベーターガラクトシダーゼ等とそれらの免疫原性フラグ
メントとが一緒になった細菌ポリペプチドであることが
好ましい。その他、分泌されるべきタンパク質のＮＨ₂
末端上流に、ヘテロローガスな真核性の分泌シグナル
(例えば、ヘルペスウイルスgＤシグナル)、または微生
物の分泌シグナルを挿入したり、プロテアーゼプロセッ
シング配列を挿入することも含まれる。システイン等の
不安定な残基の欠失は、例えば、α鎖またはβ鎖の酸化
安定性が増強されるので、好ましい。欠失誘導体は、α
鎖フラグメントまたはβ鎖フラグメントを産生するであ
ろう。その様なフラグメントも、それが生物学的または
免疫学的に活性であれば、本発明の範囲内に含まれる。
例えば、約１１〜４５(成熟Ｇly１からの番号による)の
β_Bまたはβ_A残基を含むフラグメントは本発明範囲に含
まれる。The amino acid sequence variant by insertion and substitution has one or more amino acid residues introduced at a predetermined position of the target inhibin, activin, prodomain or pro-form inhibin or activin, or A protein that has been removed from that location. Most commonly, insertional variants are α or β chains,
Fusions in which a heterologous protein or polypeptide is fused to the amino or carboxy terminus of the prodomain or other inhibin derivative. An immunogenic derivative is prepared by fusing an immunogenic polypeptide to a target sequence such as a prodomain polypeptide by in vitro synthesis or recombinant cell culture transformed with a DNA encoding the fusion. Is prepared. Such an immunogenic polypeptide is preferably a bacterial polypeptide in which trpLE, beta-galactosidase and the like are combined with an immunogenic fragment thereof. NH ₂ which is another protein to be secreted
Heterologous eukaryotic secretion signal upstream of the terminal
(Eg, the herpesvirus gD signal), or the insertion of a microbial secretion signal, or the insertion of a protease processing sequence is also included. Deletion of unstable residues such as cysteine is preferable because it enhances the oxidative stability of the α chain or β chain, for example. The deletion derivative is α
Will produce a chain fragment or a β chain fragment. Such fragments are also included within the scope of the invention provided they are biologically or immunologically active.
For example, fragments containing about 11-45 (by number from mature Gly1) β _B or β _A residues are within the scope of the invention.

【００３９】プロドメインポリペプチド、インヒビンお
よびアクティビンの免疫原性コンジュゲート(抱含体)
は、βラクタマーゼまたはヘルペスgＤタンパク質のご
ときウイルス性抗原の様な免疫原性ポリペプチドとの融
合物として、組換え細胞培養により合成するか、あるい
は、融合していない形でポリペプチドを合成(組換え法
またはインビトロ合成法により)した後、二価の交差結
合剤を用いてキーホール・リンペット・ヘモシアニンま
たはＳＴＩのごとき免疫原性ポリペプチドと共有結合性
の交差反応を生ぜしめることにより、容易に合成するこ
とができる。この免疫原性ポリペプチドは、ミョウバン
またはフロインドのごときワクチンアジュバントと一緒
に処方される。アジュバント中のタンパク質の調整法
や、交差結合の方法は、動物に対するワクチン接種法と
して当業者によく知られており、用いられている方法で
ある。免疫原性コンジュゲートは、インヒビン製造にお
ける監視に用いるための、プロドメイン領域に対する抗
体を製造する上で有用であり、あるいは、動物の生殖系
または稔性における生理学的調節を行い得る抗体を惹起
するためのワクチン接種において、インビボで有用であ
る。通常、様々な用量でプロドメインまたはその免疫原
を実験動物またはブタを稔性にするために投与し、動物
の生殖系および稔性を監視すると共に、通常の競合的ま
たはサンドイッチイムノアッセイによって抗イムノゲン
またはプロドメインの血清レベルを検定する。Immunogenic Conjugates of Prodomain Polypeptides, Inhibins and Activins
Is synthesized by recombinant cell culture, either as a fusion with an immunogenic polypeptide such as a viral antigen such as β-lactamase or herpes gD protein, or in a non-fused form. By a divalent cross-linking agent, followed by a covalent cross-reaction with an immunogenic polypeptide such as keyhole limpet hemocyanin or STI. Can be synthesized. This immunogenic polypeptide is co-formulated with a vaccine adjuvant such as alum or Freund. The method of preparing a protein in an adjuvant and the method of cross-linking are methods well known and used by those skilled in the art as vaccination methods for animals. Immunogenic conjugates are useful in producing antibodies to the prodomain region for use in surveillance in inhibin production, or elicit antibodies that may provide physiological regulation in the reproductive system or fertility of an animal. In vaccination for in vivo. Usually, various doses of prodomain or its immunogens are administered to fertilize experimental animals or pigs to monitor the reproductive system and fertility of the animals, as well as anti-immunogen or by conventional competitive or sandwich immunoassays. Assay prodomain serum levels.

【００４０】置換誘導体は、標的コドンのＤＮＡに突然
変異が誘発されており、以後はそのコドンにより異なる
アミノ酸がコードされているが、この突然変異したＤＮ
Ａから発現される分子の残基の番号が混乱していること
はない。置換または欠失は、例えば、タンパク分解部位
の内部で、またはその近辺で残基を置換する。あるいは
その部位の残基を欠失させる、または、システインを他
の残基で置き換えてジスルフィド結合を追加することに
よりタンパク分解部位を消失させ、本発明のタンパク質
の安定性を増加させるのに有用である。置換は成熟、ま
たはプロドメインαまたはβ鎖の合成あるいは回収を容
易にするのに有用である。例えば、成熟インヒビン配列
中のメチオニン残基を置換または欠失させ、プレプロ配
列を欠失させ、成熟ＮＨ₂末端残基のＮＨ₂末端の直ぐ隣
りの−１部位にメチオニンを挿入し、他の配列を外来性
メチオニンのＮ末端側に挿入する。この場合、インヒビ
ン誘導体は中間にメチニル残基を有する融合物として発
現し、次いで、この残基の位置において、臭化シアンを
用いる既知の手段はより開裂される。次いで、融合物か
ら遊離した成熟インヒビン誘導体を回収する。The substituted derivative has a mutation in the DNA of the target codon, and after that, a different amino acid is encoded by the codon.
The numbering of the residues of the molecule expressed from A is not confusing. Substitutions or deletions, for example, replace residues within or near the proteolytic site. Alternatively, it is useful for deleting the proteolytic site by deleting the residue at that site, or replacing cysteine with another residue to add a disulfide bond, and increasing the stability of the protein of the present invention. is there. Substitutions are useful to facilitate maturation or synthesis or recovery of the prodomain α or β chain. For example, by replacing or deleting a methionine residue in the mature inhibin sequence, deleting the prepro sequence, inserting a methionine at the -1 site immediately adjacent to the NH ₂ terminal of the mature NH ₂ terminal residue, and Is inserted at the N-terminal side of exogenous methionine. In this case, the inhibin derivative is expressed as a fusion with a methynyl residue in the middle, and then at this residue the known procedure with cyanogen bromide is more cleaved. The mature inhibin derivative released from the fusion is then recovered.

【００４１】ブタインヒビン誘導体の例として、[Ａsn
₂₆₆→Ｇln]Ｉnhα(仮定のグリコシル化部位を除去する
ため)、[Ｃys₃₂₅またはＣys₃₂₄→Δ]Ｉnhα, [Ｃys₃₆₁
またはＣys₃₆₃→Δ]Ｉnhα, [Ｌys₃₂₁またはＬys₃₂₂→
Δ]Ｉnhβ_Aまたは[Ｌys₃₂₂→ＨisまたはＳer]Ｉnhβ
_A(潜在的なタンパク分解部位を不活化するため), [Ｌys
₃₁₅→Ａrg; Ｖal₃₁₆→Ｔhr]Ｉnhβ_A(β_A／β_Bハイブリ
ッドを生成するため), [Ｃys₃₈₈またはＣys₃₉₀→Δ]Ｉn
hβ_A, [Ｌys₄₁₁→Ｇln]Ｉnhβ_A, [Ａrg₃₁₅→Ｌys, Ｖal
₃₁₆→Ｔhr]Ｉnhβ_B(β_B／β_Aハイブリッドを生成するた
め), [Ｃys₃₁₉またはＣys₃₂₀→Δ]Ｉnhβ_B[Ｐro₃₈₁Ｇly
₃₈₂→Ｐro Ｐhe Ｇly]Ｉnhβ_B, および[Ａrg₃₉₅→Ｇl
n]Ｉnhβ_B[ここに、Ｉnhはインヒビンの省略形であり、
Ｉnhβ_Bの残基番号は、Ｉnhβ_Aに用いられている番号に
対応している(図５、図６、図７および図８参照)]を挙
げることができる。As an example of the porcine inhibin derivative, [Asn
₂₆₆ → Gln] Inhα (to remove putative glycosylation sites), [Cys ₃₂₅ or Cys ₃₂₄ → Δ] Inhα, [Cys ₃₆₁
Or Cys ₃₆₃ → Δ] Inhα, [Lys ₃₂₁ or Lys ₃₂₂ →
Δ] Inhβ _A or [Lys ₃₂₂ → His or Ser] Inhβ
_A (to inactivate potential proteolytic sites), [Lys
₃₁₅ → Arg; Val ₃₁₆ → Thr] Inhβ _A (to generate β _A / β _B hybrid), [Cys ₃₈₈ or Cys ₃₉₀ → Δ] In
hβ _A , [Lys ₄₁₁ → Gln] Inhβ _A , [Arg ₃₁₅ → Lys, Val
₃₁₆ → Thr] Inhβ _B (for producing β _B / β _A hybrid), [Cys ₃₁₉ or Cys ₃₂₀ → Δ] Inhβ _B [Pro ₃₈₁ Gly
₃₈₂ → Pro Phe Gly] Inhβ _B , and [Arg ₃₉₅ → Gl
n] Inhβ _B [where Inh is an abbreviation for inhibin,
The residue number of Inhβ _B corresponds to the number used for Inhβ _A (see FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7 and FIG. 8)].

【００４２】突然変異性の置換または欠失を行う上で主
な候補であるhβ_Aアミノ酸(あるいは、残基挿入部位の
隣接アミノ酸)の位置は、残基２９３−２９７、３６４
−３７６、および３８７−３９８(図１９、図２０およ
び図２１)である。これらの配列中のプロリン、システ
インおよびグリシン残基は修飾しない方が好ましい。イ
ンヒビンまたはアクティビンよりも大きい効力を有する
候補、あるいは、インヒビンまたはアクティビン拮抗物
として作用する候補を、該候補を一定量のインヒビンま
たはアクティビンを含有している溶液で希釈し、得られ
た組成物をラット脳下垂体細胞アッセイにより分析する
ことからなるスクリーニングアッセイにかけて同定す
る。インヒビンまたはアクティビンの作用を示さず、ま
たそれらに拮抗することもない候補を、天然のホルモン
に対するポリクローナル抗体に対する、天然ホルモン由
来のラベルしたインヒビンまたはアクティビンとの競合
的な免疫置換を測定することにより、インヒビンまたは
アクティビンを測定するためのイムノアッセイに用いる
目的でスクリーンする。想定されるhβ_A変異体配列の例
には、Ｐhe₃₀₂→ＩleまたはＬeu;Ｇln₂₉₇→Ａspまたは
Ｌys;Ｔrp₃₀₇→ＴyrまたはＰhe;Ｔrp₃₁₀→ＴyrまたはＰ
he;Ｉle₃₁₁→ＰheまたはＶal;Ｔyr₃₁₇→ＴrpまたはＴh
r;Ｈis₃₁₈→Ｌys;Ａla₃₁₉→Ｓer;Ａsn₃₂₀→Ｇln, Ｔyr
またはＨis;Ｔyr₃₂₁→ＴhrまたはＡsp, Ｐhe₃₄₀→Ｔyr
(ＴＧＦ−β／β_A鎖間ハイブリッド); Ｈis₃₅₃→Ａsp;
Ｈis₃₅₃→Ｌys(β_A／β_Bハイブリッド); Ｐhe₃₅₆→Ｔy
r;Ｖal₃₆₄→Ｐhe;Ｖal₃₆₄→Ｌeu;Ｔyr₃₇₅→Ｔhr;Ｔyr
₃₇₆→Ｔrp;Ａsn₃₈₉→Ｇln, ＨisまたはＬys;Ｉle₃₉₁→
ＬeuまたはＴhr;Ｍet₃₉₀→ＬeuまたはＳer;Ｖal₃₉₂→Ｐ
he, Ｇlu, ＴhrまたはＩleが含まれる。ヒトβ_B鎖にも
これと匹敵する修飾が施される。例えば、hβ_Aは残基３
０２にフェニルアラニル残基を含有しており、hβ_Bを、
図１０のブタβ_Bに見られる様なやり方と同様に並べる
と、これもまたホモローガスな位置(２６４位、図２
２、図２３および図２４)にフェニルアラニル残基を含
有している。上記の如くβ_AのＰhe₃₀₂はイソロイシニル
またはロイシニル基で置換されるので、β_BのＰhe₂₆₄も
同じ残基で置換される。The position of the hβ _A amino acid (or the amino acid adjacent to the residue insertion site), which is the main candidate for making a mutational substitution or deletion, is at residues 293-297,364.
-376, and 387-398 (FIGS. 19, 20 and 21). It is preferred not to modify the proline, cysteine and glycine residues in these sequences. Candidates having a greater potency than inhibin or activin, or acting as inhibin or activin antagonists, were diluted with a solution containing a certain amount of inhibin or activin to obtain the resulting composition. Are subjected to a screening assay which consists of analyzing them by the rat pituitary cell assay. To determine a competitive immune displacement of a natural hormone-derived labeled inhibin or activin against a polyclonal antibody against a natural hormone, which is a candidate showing neither inhibin or activin action nor antagonizing them. Screen for use in immunoassays to measure inhibin or activin. Examples of putative hβ _A variant sequences include Phe ₃₀₂ → Ile or Leu; Gln ₂₉₇ → Asp or Lys; Trp ₃₀₇ → Tyr or Phe; Trp ₃₁₀ → Tyr or P
he; Ile ₃₁₁ → Phe or Val; Tyr ₃₁₇ → Trp or Th
r; His ₃₁₈ → Lys; Ala ₃₁₉ → Ser; Asn ₃₂₀ → Gln, Tyr
Or His; Tyr ₃₂₁ → Thr or Asp, Phe ₃₄₀ → Tyr
(TGF-β / β _A interchain hybrid); His ₃₅₃ → Asp;
His ₃₅₃ → Lys (β _A / β _B hybrid); Phe ₃₅₆ → Ty
r; Val ₃₆₄ → Phe; Val ₃₆₄ → Leu; Tyr ₃₇₅ → Thr; Tyr
₃₇₆ → Trp; Asn ₃₈₉ → Gln, His or Lys; Ile ₃₉₁ →
Leu or Thr; Met ₃₉₀ → Leu or Ser; Val ₃₉₂ → P
Includes he, Glu, Thr or Ile. The human β _B chain also has a comparable modification. For example, hβ _A is residue 3
02 containing a phenylalanyl residue, hβ _B ,
When arranged in a manner similar to that seen for pig β _B in FIG. 10, this is also a homologous position (264, FIG. 2).
2, FIG. 23 and FIG. 24) contain a phenylalanyl residue. As mentioned above, since Phe ₃₀₂ of β _A is replaced with an isoleucinyl or leucinyl group, Phe _{264 of} β _B is also replaced with the same residue.

【００４３】ポリペプチドをインヒビン、アクティビン
またはインヒビン変異体であると同定するための因子の
１つは、成熟インヒビンまたはアクティビンのホルモン
活性を実質上中和し得る抗血清が懸案のポリペプチドの
ホルモン活性をも実質上、中和し得るということであ
る。しかしながら、免疫学的同一性とホルモン活性とは
必ずしも同一範囲内でなくてよい。例えば、インヒビン
のための中和抗体は、該中和抗体がたまたまインヒビン
の活性にとって臨界的な部位に特異的に結合するもので
ないために候補タンパク質と結合しないかもしれない。
むしろ、この抗体は、無害な領域に結合し、その中和効
果を立体障害によって表しているのかもしれない。従っ
て、その無害な領域で突然変異を生じた候補タンパク質
はもはや中和抗体と結合しないが、それにも拘わらず、
実質上ホモロジィという意味、および生物学的活性にお
いて、インヒビンである。One of the factors for identifying a polypeptide as an inhibin, activin or inhibin variant is that of an antiserum-suspended polypeptide that can substantially neutralize the hormonal activity of mature inhibin or activin. It means that hormonal activity can be substantially neutralized. However, immunological identity and hormonal activity need not necessarily be in the same range. For example, a neutralizing antibody for inhibin may not bind to a candidate protein because the neutralizing antibody does not happen to specifically bind to a site critical to inhibin activity.
Rather, the antibody may bind to innocuous regions and display its neutralizing effect by steric hindrance. Therefore, the candidate protein mutated in its innocuous region no longer binds the neutralizing antibody, but nevertheless
Inhibin in the sense of substantially homology and biological activity.

【００４４】卵胞液等の組織供給源から得た天然または
野生型の成熟インヒビンまたはアクティビンに関する分
子量や等電点の様な特性が天然形のもののみについて記
載されているということを観察することが重要である。
前記の定義に包含される変異体は天然の同族体の特性を
全て表すわけではない。例えば、上記の、挿入突然変異
体、欠失突然変異体または融合タンパク質のごときイン
ヒビン誘導体において、例えば、成熟インヒビンとの融
合物またはプロインヒビンそれ自体、並びに挿入突然変
異体は、天然の成熟インヒビンよりも大きい分子量を有
しているので、対応する天然インヒビンに対して確立さ
れた分子量から離脱した分子量を示すことになる。他
方、天然の成熟インヒビンの欠失突然変異体は、より低
い分子量を有することになる。最後に、ヘテロローガス
なセルラインにおけるプレプロインヒビン鎖の翻訳後プ
ロセッシングは、ホモローガス宿主細胞による程忠実に
行われないかもしれないので、αおよび／またはβ鎖の
アミノ末端に幾らかの変異が生じ得る。この変異は、成
熟タンパク質にプロ配列が残留しているか、あるいは、
プロ配列と一緒に成熟タンパク質の残基数個が開裂さ
れ、失われていることによる場合もある。同じことがヘ
テロローガス組換え細胞内でのプレタンパク質のプロセ
ッシングについても言える。Observing that properties such as molecular weight and isoelectric point for natural or wild type mature inhibin or activin obtained from tissue sources such as follicular fluid are described only for the natural form. is important.
Variants embraced by the above definition do not exhibit all the properties of natural congeners. For example, in the above-described insertion mutants, deletion mutants or inhibin derivatives such as fusion proteins, for example fusions with mature inhibin or proinhibin itself, as well as insertion mutants are Also has a large molecular weight, indicating a molecular weight deviating from that established for the corresponding natural inhibin. On the other hand, deletion mutants of native mature inhibin will have a lower molecular weight. Finally, post-translational processing of the preproinhibin chain in heterologous cell lines may not be as faithful as performed by homologous host cells, which may result in some mutations at the amino terminus of the α and / or β chains. . This mutation may be due to residual prosequence in the mature protein, or
It may be due to the cleavage and loss of several residues of the mature protein along with the prosequence. The same applies to the processing of preproteins in heterologous recombinant cells.

【００４５】インヒビン、アクティビンまたはプロドメ
インの共有結合的修飾物も本発明の範囲内に含まれ、そ
れらには他の化学部分との共有結合的または凝集による
コンジュゲートが含まれる。共有結合誘導体は、当業者
既知の方法でインヒビンアミノ酸側鎖あるいはＮまたは
Ｃ末端に見い出される基の機能的部分と結合させること
により調製される。例えば、これらの誘導体にはカルボ
キシ末端、あるいはアスパルチル残基のごときカルボキ
シ残基を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、セリ
ルまたはアラニル等のヒドロキシル基含有残基のＯ−ア
シル誘導体、並びにアミノ末端アミノ酸またはリジンや
アルギニン等のアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体が
含まれる。アシル基を形成するにはアルキル部分(Ｃ₃〜
Ｃ₁₀の直鎖アルキルを含む)のグループから選んでアル
カノイル種を形成することにより、また、炭素環または
異項環化合物を選んでアロイル種を形成することができ
る。反応性の基は、例えば、m−マレイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルのごとく、反
応性の側鎖基を通してタンパク質を交差結合させて不溶
性のマトリックスにするのに用い得ることが自体既知で
ある二機能性化合物であることが好ましい。好ましい誘
導体化部位はヒスチジン残基である。Covalent modifications of the inhibin, activin or prodomain are also included within the scope of this invention and include conjugates covalently or aggregated with other chemical moieties. Covalent derivatives are prepared by attaching them to functional moieties of inhibin amino acid side chains or groups found at the N or C termini by methods known to those of skill in the art. For example, these derivatives include carboxy-terminal or aliphatic ester or amide of a residue containing a carboxy residue such as aspartyl residue, O-acyl derivative of hydroxyl group-containing residue such as ceryl or alanyl, and amino-terminal amino acid. Also included are N-acyl derivatives of amino group-containing residues such as lysine and arginine. To form an acyl group, an alkyl moiety (C _3-
Carbocyclic or heterocyclic compounds can also be selected to form aroyl species by selecting from the group (including C ₁₀ straight chain alkyl) to form alkanoyl species. It is known per se that reactive groups can be used to cross-link proteins through reactive side groups to give an insoluble matrix, eg m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester. It is preferably a bifunctional compound. A preferred derivatization site is a histidine residue.

【００４６】成熟インヒビン、アクティビンまたはプロ
ドメイン配列の共有結合誘導体または凝集反応誘導体は
イムノアッセイにおける試薬、あるいはアフィニティ精
製法のための試薬として有用である。例えば、インヒビ
ンまたはプロドメインを臭化シアン−活性化セファロー
スと自体既知の方法で共有結合的に結合させて不溶化す
るか、あるいはポリオレフィン表面(グルタルアルデヒ
ド交差結合を持つものまたは持たないもの)に吸着させ
ることにより不溶化し、抗−インヒビン抗体または抗プ
ロドメイン抗体、あるいは細胞表面受容体の分析または
精製に用いる。またインヒビンまたはプロドメイン配列
を、例えば、クロラミンＴ法によって放射性ヨウ素化す
る。希土類キレート化合物と共有結合させる、あるいは
別の蛍光成分と結合させる、等の方法で標識し、診断学
的アッセイ、特に、生物標本中のインヒビンまたはプロ
ドメインレベルを競合型イムノアッセイによって診断学
的アッセイするのに用いる。Covalent or agglutination derivatives of mature inhibin, activin or prodomain sequences are useful as reagents in immunoassays or for affinity purification methods. For example, the inhibin or prodomain is covalently bound to the cyanogen bromide-activated sepharose in a manner known per se to insolubilize it, or it is adsorbed to a polyolefin surface (with or without glutaraldehyde crosslinks). It is then insolubilized and used for analysis or purification of anti-inhibin antibody or anti-prodomain antibody, or cell surface receptor. The inhibin or prodomain sequences are also radioiodinated, for example by the chloramine T method. Labeled by methods such as covalently binding to rare earth chelate compounds, or to another fluorescent moiety, and diagnostic assays, particularly inhibin or prodomain levels in biological specimens by competitive immunoassays Used for.

【００４７】インヒビン／アクティビンの完全なα鎖お
よびβ鎖をコードしているＤＮＡは化学合成するか、あ
るいは卵巣から得たmＲＮＡ逆転写物をスクリーニング
する、または何らかの細胞からのゲノムライブラリィを
スクリーニングすることにより得られる。スクリーニン
グには、αおよびβ鎖をコードしているcＤＮＡまたは
ゲノムライブラリィからＤＮＡを同定しなければならな
いので、所望のＤＮＡ部分を単純に合成する方が効率が
良い。また、合成法によれば、ＤＮＡの調製時に特異
(ユニーク)な制限部位を導入し、さもなければ、天然の
配列中に存在しない制限部位を含有するベクター内で遺
伝子を用いることができると共に、突然変異等によるＤ
ＮＡをさらに修飾する必要なしに上記のごとき翻訳効率
の向上を図る工程をとることができるので、これもまた
有利な方法である。αまたはβ鎖をコードしているcＤ
ＮＡは非翻訳介在配列(イントロン)並びに、それらの供
給源にとってホモローガスな他のタンパク質をコードし
ている、側方の(フランキング)ＤＮＡを含んでいない。DNA encoding complete α and β chains of inhibin / activin is chemically synthesized, or mRNA reverse transcript obtained from ovary is screened, or a genomic library from any cell is screened. It is obtained by doing. For screening, it is more efficient to simply synthesize the desired DNA portion, since the DNA must be identified from the cDNA or genomic library encoding the α and β chains. In addition, according to the synthetic method, it is unique when DNA is prepared.
Introducing a (unique) restriction site, otherwise the gene can be used in a vector containing a restriction site that is not present in the native sequence, and D
This is also an advantageous method since it is possible to take the steps for improving the translation efficiency as described above without the need to further modify the NA. cd encoding α or β chain
NA contains no untranslated intervening sequences (introns) as well as flanking DNA (flanking) that encodes other proteins homologous to their source.

【００４８】αおよびβ鎖をコードしているＤＮＡは、
(a)標的動物の卵巣からcＤＮＡライブラリィを得、(b)c
ＤＮＡライブラリィ中の、ホモローガスな配列を含んで
いるクローンを検出するためにブタまたはヒトのαおよ
びβ鎖あるいはそのフラグメントをコードしている標識
ＤＮＡを用いてサザーン分析を行い、(c)得られたクロ
ーンを制限酵素分析および核酸配列決定に付してクロー
ンの全長を同定し、もしも、ライブラリィ中に全長に及
ぶクローンが存在していないときには、種々のクローン
から適当なフラグメントを回収し、これらをクローンに
とって共通の制限部位でライゲートして全長に及ぶ分子
をコードしているクローンを組立てることにより、ブタ
またはヒト以外の供給源からも得ることができる。以下
に示すごとく、ライブラリィ中に不足している配列は、
ライブラリィのスクリーニングによって同定されたcＤ
ＮＡと相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドを卵巣
mＲＮＡの３'側に延長させて得るか、あるいは、既知の
動物cＤＮＡからホモローガスな配列を得てもよい。こ
の方法は、所望の種からのプレプロインヒビンから成熟
インヒビンへのプロセッシングが容易なプレまたはプレ
プロインヒビン配列を組立てる上で特に有用である。The DNA encoding the α and β chains is
(a) A cDNA library was obtained from the ovary of the target animal, and (b) c
Southern analysis was performed using labeled DNA encoding porcine or human α and β chains or fragments thereof to detect clones containing homologous sequences in a DNA library. The clones were subjected to restriction enzyme analysis and nucleic acid sequencing to identify the full length of the clones.If no full-length clones were present in the library, suitable fragments were recovered from various clones. Can also be obtained from sources other than porcine or human by ligating at a restriction site common to the clones to assemble clones encoding full-length molecules. As shown below, the missing sequences in the library are
Cd identified by library screening
Ovary synthetic oligodeoxynucleotides complementary to NA
It may be obtained by extending it to the 3 ′ side of mRNA, or a homologous sequence may be obtained from a known animal cDNA. This method is particularly useful in assembling pre- or pre-proinhibin sequences that are easy to process from preproinhibin to mature inhibin from the desired species.

【００４９】ブタおよびヒトの卵巣cＤＮＡライブラリ
ィを、まず、精製ブタインヒビンを分析して決定した部
分的アミノ酸配列に基づく配列を有するオリゴヌクレオ
チドであって標識されているもの(ヒトcＤＮＡの場合は
ブタcＤＮＡプローブ)を用い、インヒビンをコードして
いるＤＮＡに関してプローブする。しかしながら、一度
ヒトおよびブタのインヒビン、並びにプロドメインをコ
ードしているcＤＮＡが記録されれば、当業者はこの記
述された配列を基に、残余のヒトまたはブタの遺伝子を
得るために、確実にハイブリダイズするプローブを容易
に調製し得る。A porcine and human ovary cDNA library was first labeled with an oligonucleotide having a sequence based on the partial amino acid sequence determined by analysis of purified porcine inhibin (in the case of human cDNA, porcine cDNA probe) to probe for DNA encoding inhibin. However, once the human and porcine inhibin and the cDNA encoding the prodomain have been recorded, one of ordinary skill in the art would be confident that one could use the described sequences to obtain the remaining human or porcine genes. Hybridizing probes can be readily prepared.

【００５０】同定されたブタおよびヒトのcＤＮＡクロ
ーンのヌクレオチド配列決定によりインヒビンの両型の
生合成による前駆体の構造が明らかになった。興味深い
ことに、２本のインヒビン鎖は単一の、プロセッシング
された前駆体から得られたものでなかった。そうでな
く、これら２本の鎖は別々のmＲＮＡから翻訳され、そ
の後にジスルフィド交差結合による２本鎖分子に組立て
られている。Nucleotide sequencing of the identified porcine and human cDNA clones revealed the structure of the biosynthetic precursors of both forms of inhibin. Interestingly, the two inhibin chains were not derived from a single, processed precursor. Instead, the two strands are translated from separate mRNAs and subsequently assembled into a double-stranded molecule by disulfide cross-linking.

【００５１】図２、図３、図５、図６、図７、図８、図
１５、図１６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２
３および図２４は、ブタおよびヒトのプレプロインヒビ
ンおよびプレプロアクティビンを構成するポリペプチド
鎖をコードしているＤＮＡを示す図である。明らかに、
これらの図中に開示されたコドンには縮重があってよ
く、それによっても同じアミノ酸がコードされている。
図２、図３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１
６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３および図
２４のＤＮＡを突然変異させ、上記のαおよびβ鎖のア
ミノ酸変異体をコードさせる。特に、懸案の成熟鎖を組
換え培養中で直接発現させるために、プレプロ配列を欠
失させ、該配列の５'側に隣接して開始コドンを挿入す
る。このＤＮＡを例えば放射活性なリンで標識し、卵巣
cＤＮＡライブラリィのスクリーンに用い、上で一総括
的に述べた様に、他の種のものをコードしているＤＮＡ
から、αまたはβ鎖を同定することができる。2, FIG. 3, FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7, FIG. 8, FIG. 15, FIG. 16, FIG.
3 and FIG. 24 are diagrams showing the DNAs encoding the polypeptide chains constituting porcine and human preproinhibin and preproactivin. clearly,
The codons disclosed in these figures may have degeneracy, which also encodes the same amino acid.
2, FIG. 3, FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7, FIG. 8, FIG.
6, Figure 19, Figure 20, Figure 21, Figure 22, Figure 23 and Figure 24 are mutated to encode the above α and β chain amino acid variants. In particular, in order to directly express the mature chain of interest in recombinant culture, the prepro sequence is deleted and a start codon is inserted adjacent to the 5'side of the sequence. This DNA is labeled with radioactive phosphorus, for example,
DNA used for screens in a cDNA library and encoding other species, as described generally above.
From, the α or β chains can be identified.

【００５２】このＤＮＡの共有結合的な標識は、蛍光性
の基、放射活性な原子、あるいは化学発光性の基等の検
出可能な基により自体既知の方法で行われる。次いで、
標識ＤＮＡを、通常のハイブリダイゼーション分析(ア
ッセイ)に用いる。その様な分析法は、以下の実施例に
述べるごとく、ベクターや形質転換体を同定するため
に、または、組織試料中のmＲＮＡの検出のごとく、イ
ンビトロでの診断に利用される。The covalent labeling of the DNA is carried out by a method known per se with a detectable group such as a fluorescent group, a radioactive atom or a chemiluminescent group. Then
Labeled DNA is used for routine hybridization analysis (assay). Such assays are utilized for in vitro diagnostics, as described in the Examples below, to identify vectors and transformants, or to detect mRNA in tissue samples.

【００５３】長い配列はそれら、例えばインヒビンまた
はプロドメイン配列をコードしているＤＮＡを含むベク
ターで形質転換された宿主細胞中で合成されることが望
ましい。ベクターは、以後のプロセッシングのために多
量のＤＮＡを調製する(クローニングベクター)か、ある
いは、これらの鎖を発現させる(発現ベクター)目的で、
該鎖をコードしているＤＮＡを増幅させるために用いら
れる。発現ベクターは、αまたはβ鎖をコードしている
ＤＮＡと、それらの適当な宿主内での発現に影響を及ぼ
し得る適当なコントロール配列とが機能的に結合した複
製可能なＤＮＡ組立て物である。クローニングベクター
は発現コントロール配列を含有している必要がない。一
般に、コントロール配列には、転写プロモーター、転写
をコントロールするための任意のオペレーター配列、適
切なmＲＮＡリボゾーム結合部位をコードしている配列
(原核性発現のために)、および転写および翻訳の終止を
コントロールするための配列が含まれる。ベクターは、
所望のポリペプチドを安定な発現、および／または形質
転換体の選択を容易にするために選択遺伝子を含有して
いる必要がある。しかしながら、αおよび／またはβ鎖
の発現を維持するための選択遺伝子は真核性宿主細胞を
用い同時(共)形質転換法により、別のベクターから供給
することもできる。The long sequences are preferably synthesized in a host cell transformed with a vector containing DNA encoding them, eg inhibin or prodomain sequences. The vector may be used to prepare a large amount of DNA for subsequent processing (cloning vector) or to express these chains (expression vector).
Used to amplify the DNA encoding the strand. An expression vector is a replicable DNA construct in which the DNA encoding the α or β chain is operably linked with appropriate control sequences capable of affecting their expression in an appropriate host. Cloning vectors need not contain expression control sequences. Generally, a control sequence includes a transcription promoter, an arbitrary operator sequence for controlling transcription, and a sequence encoding an appropriate mRNA ribosome binding site.
Sequences are included (for prokaryotic expression), and for controlling termination of transcription and translation. The vector is
It should contain a selection gene to facilitate stable expression of the desired polypeptide and / or selection of transformants. However, the selection gene for maintaining the expression of α and / or β chains can also be supplied from another vector by co-transformation method using eukaryotic host cells.

【００５４】ベクターにはプラスミド、ウイルス(ファ
ージを含む)、および組込み可能なＤＮＡフラグメント
(即ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得る
もの)が含まれる。本明細書に記載されている、αおよ
び／またはβ鎖の真核性細胞内発現に用いるためのベク
ターは、微生物内でクローニングするためのプラスミド
配列を含有しており、該微生物内でプラスミドは、宿主
のゲノムと別に自律して複製するが、形質転換に際して
ＤＮＡは真核性宿主細胞のゲノムに組込まれると考えら
れている。同様に、細菌内でホモローガス組換えによっ
てゲノム内に組込むことのできるバチルス(bacillus)ベ
クターも有用である。しかしながら、その他の同等な機
能を有する他の形のベクターであって、現在知られてい
る、あるいは将来知られるであろうベクターも本発明に
用いることができる。Vectors include plasmids, viruses (including phages), and integrable DNA fragments
(Ie, those that can be integrated into the genome of the host by recombination). The vectors described herein for use in the eukaryotic intracellular expression of α and / or β chains contain a plasmid sequence for cloning in a microorganism, in which the plasmid is , Which autonomously replicates independently of the host genome, but is considered to have DNA integrated into the genome of eukaryotic host cells during transformation. Also useful are bacillus vectors that can integrate into the genome by homologous recombination in bacteria. However, other forms of vectors having other equivalent functions, which are now known or will be known in the future, can also be used in the present invention.

【００５５】適当なベクターは一般に、意図する発現用
宿主にとって適合し得る種から導かれたレプリコン(複
製起源、非組込み性ベクターの場合)およびコントロー
ル配列を含有している。形質転換された宿主細胞とは、
インヒビンαおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮ
Ａを含有しているベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた細胞である。形質転換された宿主細胞はク
ローンしたＤＮＡを含有しており、発現ベクターで形質
転換された場合にはαおよび／またはβ鎖を発現する。
発現されたポリペプチドは、選択した宿主細胞、並びに
発現したタンパク質中の適当なプロセッシングシグナル
(ホモローガスまたはヘテロローガスなシグナル配列)の
存在に応じて、細胞内に沈着するか、あるいはペリプラ
スミック間隙に分泌される。Suitable vectors generally contain replicon (origin of replication, in the case of non-integrative vectors) and control sequences which are derived from species compatible with the intended expression host. A transformed host cell is
DN encoding inhibin α and / or β chain
A cell transformed or transfected with a vector containing A. The transformed host cell contains the cloned DNA and expresses the α and / or β chains when transformed with the expression vector.
The expressed polypeptide will be expressed in the host cell of choice as well as the appropriate processing signals in the expressed protein.
Depending on the presence of (homologous or heterologous signal sequence), it is either deposited intracellularly or secreted into the periplasmic space.

【００５６】ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に
関連している場合は、機能的(操作可能)に結合(operabl
y linked)している。例えば、プレ配列または分泌リー
ダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に与
えるプレタンパク質として発現されるならば、該ポリペ
プチドに関するＤＮＡと機能的に結合している; プロモ
ーターは、それが結合している暗号配列の転写をコント
ロールするものであるならば、該配列と機能的に結合し
ている; リボゾーム結合部位は、それが結合している暗
号配列の翻訳を可能にする様な位置に存在しているなら
ば、該暗号配列と機能的に結合している。一般に、機能
的に結合している、ということは結合しているＤＮＡが
近接(コンティギュアス)していることを意味し、分泌リ
ーダー配列の場合には、近接し、かつ解読相内にあるこ
とを意味する。DNA regions are functionally (operably) linked when they are functionally related to each other.
y linked). For example, a DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to the DNA for that polypeptide if it is expressed as a preprotein that directs secretion of the polypeptide; a promoter is bound by it. Operably linked to the coding sequence to which it binds, the ribosome binding site is located at a position that allows translation of the coding sequence to which it is attached. If present, it is operatively associated with the code sequence. Generally, functionally linked means that the DNAs to which they are linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in reading phase. Means that.

【００５７】適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞ま
たは高等な真核細胞である。原核生物にはグラム陰性ま
たはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌(Ｅ．coli)や
バチルス(桿菌、Ｂacilli)が含まれる。高等な真核細胞
には、以下に述べるごとく哺乳類動物起源の樹立(確立
された)セルラインが含まれる。好適な宿主細胞は大腸
菌２９４(ＡＴＣＣ ３１,４４６)株であるが、他の原核
生物、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３
１,５３７)、大腸菌２９４(ＡＴＣＣ ３１,４４６)、大
腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７,３２５)、シュードモー
ナス(Ｐsendomonas)種、あるいはセラシア・マーセサン
ス(Ｓerratia Ｍarcesans、霊菌)等も適する。Suitable host cells are prokaryotic cells, yeast cells or higher eukaryotic cells. Prokaryotes include Gram-negative or Gram-positive microorganisms such as E. coli and Bacillus (bacilli). Higher eukaryotic cells include established (established) cell lines of mammalian origin, as described below. A preferred host cell is the E. coli 294 (ATCC 31,446) strain, but other prokaryotes such as E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 3).
1,537), Escherichia coli 294 (ATCC 31,446), Escherichia coli W3110 (ATCC 27,325), Pseudomonas species, or Serratia Marcesans, etc. are also suitable.

【００５８】一般に、宿主細胞のための発現ベクターに
は、複製起源(クローニングの場合の様に染色体外での
増幅が望まれる場合の複製起源は、細菌起源である)、
インヒビン暗号領域の上流に位置するプロモーターであ
って、リボゾーム結合部位を伴うもの(リボゾーム結合
配列またはシャイン−ダルガノ配列は、原核性発現の場
合にのみ必要とされる)、ＲＮＡスプライス部位(インヒ
ビンＤＮＡが１またはそれ以上のイントロンを含むゲノ
ムＤＮＡを含有している場合)、ポリアデニル化部位、
並びに転写終止配列を含有している。当業者なら認める
ことであるが、ある種の宿主内における発現には、上記
の配列の内、ある種のものは必要でない。微生物に用い
る発現ベクターの場合には、所望の宿主が認識し得る複
製起源、宿主内で機能し得るプロモーター、並びに表現
型の選択性遺伝子(例えば、抗生物質耐性を付与するタ
ンパク質をコードしている遺伝子、または独立栄養生物
の要求を満たす様なタンパク質をコードしている遺伝子
のみが必要とされる。インヒビンＤＮＡは通常、大腸菌
種から得られるプラスミドpＢＲ３２２[ボリバー(Ｂoli
var)ら、１９７７、“ジーン(Ｇene)" ２: ９５]を用い
て大腸菌内でクローニングされる。pＢＲ３２２はアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を
含有しており、これらは形質転換細胞を容易に同定し得
る手段となる。In general, expression vectors for host cells include origins of replication (the origin of replication where extrachromosomal amplification is desired, such as in cloning is of bacterial origin),
A promoter located upstream of the inhibin coding region with a ribosome binding site (ribosome binding sequences or Shine-Dalgarno sequences are required only for prokaryotic expression), RNA splice sites (inhibin DNA A genomic DNA containing one or more introns), a polyadenylation site,
And a transcription termination sequence. As will be appreciated by those in the art, expression of certain host types does not require some of the above sequences. In the case of an expression vector used in a microorganism, it encodes an origin of replication that can be recognized by a desired host, a promoter that can function in the host, and a phenotypic selectivity gene (for example, a protein that confers antibiotic resistance). Only genes, or genes encoding proteins that meet the requirements of autotrophs, are required.Inhibin DNA is usually obtained from the plasmid pBR322 [Bolivar (Boli) (Boli).
var) et al., 1977, "Gene (Gene)" 2: is cloned in E. coli using 95. pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, which provide a means by which transformed cells can be readily identified.

【００５９】発現ベクターはクローニングベクターと異
なり、宿主生物によって認識され得るプロモーターを含
有していなければならない。このことは、一般に、プロ
モーターは所望の宿主にとってホモローガスであること
を意味する。組換えＤＮＡ組立て物に最も普通に用いら
れるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシリナ
ーゼ)およびラクトースプロモーター系([チャン(Ｃhan
g)ら、１９７８ “ネイチャー"、２７５: ６１５; およ
びゲッテル(Ｇoeddel)ら、１９７９ “ネイチャー" ２
８１: ５４４]、トリプトファン(trp)プロモーター系
[ゲッテル(Ｇoeddel)ら、１９８０ “ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)" ８: ４
０５７およびＥＰＯ出願公開番号３６,７７６]並びにta
cプロモーター[Ｈ．ドウ ボエル)Ｈ．Ｄe Ｂoer)ら、
“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．
Ｓci)Ｕ.Ｓ.Ａ.“８０: ２１−２５(１９８３)]が含ま
れる。これらが最も普通に用いられているが、その他の
既知の微生物プロモーターも使用し得る。それらの詳し
いヌクレオチド配列は公開されているので、当業者は、
それらをプラスミドベクター内の、インヒビンをコード
しているＤＮＡと機能的にライゲートさせることができ
る[シーベンリスト(Ｓiebenlist)ら、１９８０、“セル
(Ｃell)" ２０:２６９]。原核性発現系に用いられるプ
ロモーターは、インヒビンと機能的に結合したシャイン
ダルガノ(Ｓ．Ｄ．)配列をも含有していることを要する
(Ｓ．Ｄ．は翻訳を容易にする様に位置している)。この
ことは、一般に、細菌の構造遺伝子の第２コドンの上流
に位置してプロモーターおよびＳ．Ｄ．配列があり、こ
れらが成熟αおよび／またはβ鎖の５'側における、プ
レプロインヒビンの配列と置換されていることを意味す
る。Unlike cloning vectors, expression vectors must contain a promoter that can be recognized by the host organism. This generally means that the promoter is homologous to the desired host. The most commonly used promoters for recombinant DNA constructions include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems ([Chan (Chan
g) et al., 1978 “Nature”, 275 : 615; and Goeddel et al., 1979 “Nature” 2
81 : 544], tryptophan (trp) promoter system
[Goeddel et al., 1980 "Nucleic Acids Res." 8 : 4
057 and EPO Application Publication No. 36,776] and ta
c promoter [H. Douboel) H. De Boer) et al.
"Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Nat'l. Acad.
Sci) USA " 80 : 21-25 (1983)], although these are the most commonly used, other known microbial promoters may also be used. Since it is published, those skilled in the art
They can be functionally ligated with DNA encoding inhibin in a plasmid vector [Siebenlist et al., 1980, "Cells.
(Cell) " 20 : 269]. It is necessary that the promoter used in the prokaryotic expression system also contains a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to inhibin.
(SD is located to facilitate translation). This is generally because it is located upstream of the second codon of the bacterial structural gene and contains a promoter and S. D. It means that there are sequences, which are replaced by the sequences of preproinhibin 5 ′ of the mature α and / or β chains.

【００６０】原核生物に加えて、酵母培養のごとき真核
生微生物もインヒビン暗号化ベクターにより、形質転換
され得る。下等な真核生宿主微生物の内、サッカロミケ
ス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cereviciae)または通
常のパン酵母が最も一般的に用いられる。しかし、その
他多数の株も普通に手に入れ、本発明に用い得る。酵母
ベクターは、通常、２ミクロン酵母プラスミドからの複
製起源または自律的複製配列(ＡＲＳ)、プロモーター、
αおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮＡ並びにポ
リアデニル化および転写の終止のための配列、および選
択遺伝子配列を含有している。酵母内での発現に適した
プラスミドはＹＲ_p7である[ステインチコム(Ｓtinchcom
b)ら、１９７９、“ネイチャー" ２８２: ３９: キング
スマン(Ｋingsman)ら、１９７９、“ジーン" ７: １４
１: チェンパー(Ｔschemper)ら、１９８０、“ジーン"
１０: １５７]。このプラスミドは既にtrp１遺伝子を含
有しており、この遺伝子は、酵母の突然変異株、例えば
ＡＴＣＣ Ｎo．４４０７６またはＰＥＰ４−１[ジョー
ンズ(Ｊones)、１９７７、“ジェネテックス" ８５:１
２]に、トリプトファン中で増殖する能力を持たないと
いう選択マーカーを与える。この酵母宿主細胞ゲノムは
trp１障害を有するので、形質転換体をトリプトファン
の非存在下で増殖させることで、形質転換体の検出に効
果的な環境を得ることができる。In addition to prokaryotes, eukaryotes such as yeast cultures
Transformation of live microorganisms with inhibin coding vector
Can be done. Among lower eukaryotic host microorganisms, Saccharomyces
Saccharomyces cereviciae or
Common baker's yeast is most commonly used. But that
Many other strains are commonly available and can be used in the present invention. yeast
Vectors are usually duplicated from a 2 micron yeast plasmid.
Origin or autonomously replicating sequence (ARS), promoter,
DNAs encoding α and / or β chains and
Sequences and terminations for termination of rearadenylation and transcription
It contains an alternative gene sequence. Suitable for expression in yeast
The plasmid is YR_p7It is [Stinchcom
b) et al., 1979, "Nature".282: 39: King
Kingsman et al., 1979, "Gene".7: 14
1: Tschemper et al., 1980, "Gene".
10: 157]. This plasmid already contains the trp1 gene
The gene has a mutant strain of yeast, for example
ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jaw
Jones, 1977, "Genetex" 85: 1
2] has the ability to grow in tryptophan
Gives a selectable marker. This yeast host cell genome
Since it has a trp1 disorder, tryptophan transformants
Growth in the absence of is effective for detecting transformants.
You can get a fruitful environment.

【００６１】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る: メタロチオナイン(metallothionein)、３−ホスホ
グリセレート・キナーゼ[ヒッツマン(Ｈitzeman)ら、１
９８０ “ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリィ" ２５５: ２０７３]またはエノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、
ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメ
ラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナ
ーゼ等の他の解糖酵素類[ヘス(Ｈess)ら、１９６８、"
ジャーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム
・レグ(Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒeg．)"７: １４９: およ
びホランド(Ｈolland)ら、１９７８、"バイオケミスト
リィ"１７: ４９００]。更に、酵母内で発現させる上で
好適なベクターおよびプロモーターはＲ．ヒッツマン
(Ｒ．Ｈitzeman)らにより、ＥＰ７３,６５７Ａ中に記述
されている。Suitable promoting sequences for yeast vectors include promoters for: metallothionein, 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., 1
980 "Journal of Biological Chemistry" 255 : 2073] or enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
Hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase,
Other glycolytic enzymes such as pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase [Hess et al., 1968, "
Journal of Advances in Enzyme Reg (J. Adv. Enzyme Reg.) " 7 : 149: and Holland et al., 1978," Biochemistry " 17 : 4900]. Suitable vectors and promoters for expression are R. hitzman
(R. Hitzeman) et al. In EP 73,657A.

【００６２】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をも有する酵母プロモーターとし
て、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵
素、前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースお
よびラクトースの利用に与える酵素類等に関するプロモ
ーター領域が含まれる。適当な発現プラスミドを組立て
るには、これらの遺伝子に関連する終止配列を、発現ベ
クター内のインヒビンまたは誘導体暗号配列の３'側に
ライゲートし、mＲＮＡの終止およびポリアデニル化を
与える。In addition, as a yeast promoter which also has the advantage that transcription is controlled by growth conditions, alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzyme related to nitrogen metabolism, metallothionain, glycerine Aldehyde-3-
Included are the promoter regions for phosphate dehydrogenase and enzymes that contribute to maltose and lactose utilization. To construct suitable expression plasmids, the termination sequences associated with these genes are ligated 3'to the inhibin or derivative coding sequences in the expression vector, providing termination and polyadenylation of the mRNA.

【００６３】多細胞生物からの細胞培養も、ホルモン活
性なインヒビンまたはアクティビンの発現はその様な細
胞内でのみ起こり、微生物発現では、免疫学的交差反応
活性の発現が殆んどであると考えられるので、本発明に
おける好ましい宿主である。原則として、脊椎動物の培
養物であるか無脊椎動物の培養物であるかに拘わらず、
あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。最近では、
その様な細胞を細胞培養中で増殖させることは日常的な
操作となっている[ティッシュ・カルチャー(Ｔissue
Ｃulture)アカデミック・プレス、クルスおよびパター
ソン(Ｋrus andpatterson)編、(１９７３)]。In cell cultures from multicellular organisms, the expression of hormone-active inhibin or activin occurs only in such cells, and in microbial expression, immunological cross-reactive activity is almost expressed. As such, it is the preferred host in the present invention. As a general rule, regardless of whether it is a vertebrate culture or an invertebrate culture,
Any higher eukaryotic cell culture can be used. recently,
Propagating such cells in cell culture is a routine procedure [tissue culture (Tissue
Culture Academic Press, edited by Krus and Patterson, (1973)].

【００６４】高等な真核生物内でαまたはβ鎖を発現さ
せる上で適切な宿主細胞には以下のものが含まれる: Ｓ
Ｖ４０で形質転換されたサルの腎臓ＣＶＩ系(ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１); ベビーハムスター
の腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＲＬ１０); チャイニー
ズハムスターの卵巣細胞−ＤＨＦＲ[ウーラウブ(Ｕrlau
b)およびチャッシン(Ｃhasin)著、ＰＮＡＳ(ＵＳＡ)７
７ ４２１６(１９８０)]; マウス・セルトリー細胞[Ｔ
Ｍ４、マザー(Ｍather)、Ｊ．Ｐ．、バイオロ・レプロ
ド(Ｂiol．Ｒeprod．)２３: ２４３−２５１(１９８
０)]; サル腎細胞(ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); ア
フリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８７); ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ、Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４); バッファロー・ラット腎細胞(ＢＲＬ ３
Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞(Ｗ１３
８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞(ＨepＧ２ Ｈ
Ｂ８０６５); マウス乳腺腫(ＭＭＴ０６０６５２、ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ５１); ラット肝腫瘍細胞[ＨＴＣ、Ｍ１、
５４、バウマンら(Ｂauman)、ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオロジィ(Ｊ．Ｃell．Ｂiol．)８５: １−８
(１９８０)]; およびＴＲＩ細胞[マザーＪ．Ｐ．ら、ア
ナルス・Ｎ．Ｙ．アカド・サイ(Ａnnals Ｎ．Ｙ．Ａca
d．Ｓci．)３８３:４４−６８(１９８２)]。Suitable host cells for expressing the α or β chain in higher eukaryotes include: S
V40-transformed monkey kidney CVI system (COS-
7, ATCC CRL 1651); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CRL10); Chinese hamster ovary cells-DHFR [Urlau.
b) and Chasin, PNAS (USA) 7.
7 4216 (1980)]; mouse Sertoli cells [T
M4, Mather, J.M. P. Biol. Reprod. 23 : 243-251 (198).
0)]; monkey kidney cells (CVI ATCC CCL70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC
CRL-1587); human cervical cancer cells (HELA, A
TCC CCL2); canine kidney cells (MDCK, ATCC
CCL34); Buffalo rat kidney cells (BRL 3
A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W13
8, ATCC CCL75); human hepatocytes (HepG2H
B8065); mouse mammary tumor (MMT060652, AT
CC CCL51); rat liver tumor cells [HTC, M1,
54, Bauman et al., Journal of Cellular Biology (J. Cell. Biol.) 85 : 1-8
(1980)]; and TRI cells [Mother J. P. Anals N. et al. Y. Acad Sai (Annals NY Aca)
d. Sci. 383 : 44-68 (1982)].

【００６５】脊椎動物細胞に使用される発現ベクターの
ための転写および翻訳コントロール配列は、ウイルス起
源から供給されることが好ましい。例えば、普通用いら
れているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス
２、および最も好ましくはシミアンウイルス４０(ＳＶ
４０)から導かれる。初期(早期)および後期プロモータ
ーは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製起源をも含有し
ているフラグメントとして該ウイルスから容易に得られ
るので特に有用である[ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１９
７８、“ネイチャー" ２７３: １１３]、ＳＶ４０のよ
り小さい、またはより大きいフラグメントも、それらが
ウイルス性複製起源内に存在するＨindＩＩＩ部位から
ＢglＩ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限り
用いることができる。更に、αまたはβ鎖に自然に伴わ
れているゲノムプロモーター、コントロールおよび／ま
たはシグナル配列も、その様なコントロール配列が宿主
細胞に適合し得ることを条件として用いることができ、
またしばしば好ましいことである。Transcriptional and translational control sequences for expression vectors used in vertebrate cells are preferably provided by viral sources. For example, commonly used promoters are polyoma, adenovirus 2, and most preferably Simian virus 40 (SV
40). The early (early) and late promoters are particularly useful because both are easily obtained from the virus as a fragment which also contains the SV40 viral origin of replication [Fiers et al., 19
78, "Nature" 273 : 113], smaller or larger fragments of SV40, as long as they contain an approximately 250 bp sequence from the HindIII site to the BglI site present within the viral origin of replication. You can Furthermore, genomic promoters, control and / or signal sequences naturally associated with the α or β chain can also be used, provided such control sequences are compatible with the host cell,
It is also often desirable.

【００６６】複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウイ
ルス性起源(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、Ｖ
ＳＶ、ＢＰＶ等)から導かれる複製起源等の外来性起源
を含む様にベクターを組立てることにより、あるいは宿
主細胞の染色体複製機構により与えられる。もしも、ベ
クターが宿主細胞染色体に組込まれるなら、しばしば、
後者の機構で十分である。Origins of replication include, for example, SV40 and other viral origins (eg, polyoma, adenovirus, V
It is provided by assembling the vector so as to include an exogenous origin such as a replication origin derived from SV, BPV, etc.) or by the chromosome replication mechanism of the host cell. If the vector integrates into the host cell chromosome, often
The latter mechanism is sufficient.

【００６７】ウイルス性の複製起源を含有しているベク
ターを用いずに、選択マーカーをコードしているＤＮＡ
とαおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮＡとを用
い、同時形質転換法によって哺乳類細胞を形質転換する
こともできる。適当な選択マーカーの例として、ジヒド
ロ葉酸還元酵素(ＤＨＥＦＲ)またはチミジン(thymizin
e)キナーゼを挙げることができる。その様なマーカー類
はタンパク質であり、一般には形質転換細胞(即ち、外
因性ＤＮＡの取り込みに適合した(コンピテント)細胞)
の同定を可能にする酵素である。通常、同定は細胞がそ
のマーカータンパク質を取り込んでいなければ、該細胞
にとって有毒な培地、あるいは、該細胞が必須栄養素を
得ることができない培地で、形質転換体は生存し得る、
ということに基づいて行う。DNA encoding a selectable marker without the use of a vector containing a viral origin of replication
It is also possible to transform mammalian cells by co-transformation method with and DNA encoding α and / or β chain. Examples of suitable selectable markers include dihydrofolate reductase (DHEFR) or thymizin.
e) Kinases can be mentioned. Such markers are proteins and are generally transformed cells (ie, cells that are competent for uptake of exogenous DNA (competent)).
Is an enzyme that enables the identification of Usually, the identification is that a transformant can survive in a medium that is toxic to the cell, or one in which the cell cannot obtain essential nutrients, unless the cell has taken up its marker protein.
Based on that.

【００６８】インヒビンとＤＨＦＲの両者をコードして
いるＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトする
のに好適な哺乳類宿主細胞を選択するのに際しては、用
いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに従って宿主を選択す
るのが適当である。野生型ＤＨＦＲタンパク質を用いる
場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが好まし
く、そうすることにより、ＤＨＦＲの非存在下では利用
し得ない必須栄養素である。ピポキサンチン、グリシン
およびチミジンを欠く選択培地(hgt^-)内で成功したトラ
ンスフェクションを選択するためのマーカーとしてＤＨ
ＦＲ暗号配列を用いることができる。この場合、好まし
い宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスタ
ーの卵巣(ＣＨＯ)セルラインであり、これは、ウーラウ
ブおよびチャッシン(Ｕrlaub and Ｃhasin)[１９８
０、“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミィ・オブ・サイエンスイズ"(ＵＳＡ)７７: ４２
１６]の方法で調製し、増殖させることができる。In selecting suitable mammalian host cells for transfection with a vector containing a DNA sequence encoding both inhibin and DHFR, it is appropriate to select the host according to the type of DHFR protein used. is there. When using the wild-type DHFR protein, it is preferable to select a DHFR-deficient host cell, which is an essential nutrient that cannot be utilized in the absence of DHFR. DH as a marker for selecting successful transfection in ^- Pipo xanthine, selective medium lacking glycine, and thymidine (hgt)
FR code sequences can be used. In this case, the preferred host cell is the Chinese hamster ovary (CHO) cell line lacking DHFR activity, which is described in Urlaub and Chasin [198].
0, "Proceedings of the National Akademyi of Science Is" (USA) 77: 42
16] and can be propagated.

【００６９】メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する結合親
和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤＮＡ
をコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ耐性細
胞を用いる必要はない。突然変異ＤＨＦＲはＭＴＸ耐性
であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であるなら
ば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることがで
きる。ＭＴＸを吸収することのできる真核細胞の大多数
は、メトトレキセート感受性であると思われる。その様
な、有用なセルラインはＣＨＯ系、ＣＨＯＫＩ(ＡＴＣ
Ｃ Ｎo．ＣＣＬ６１)である。まず、形質転換体をネオ
マイシン耐性に関して選択し(ネオマイシン耐性付与遺
伝子をコードしているＤＮＡを共に用いてトランスフェ
クションを行う)、次いで、場合に応じてαおよび／ま
たはβ鎖発現のＭＴＸ増幅を選択することが好ましい
[キムら(Ｋim)、“セル(Ｃell)" ４２:１２９−１３８
(１９８５)およびＥＰ１６０,４５７Ａ参照]。DNA encoding a DHFR protein with low binding affinity for methotrexate (MTX)
When is used as a control sequence, it is not necessary to use DHFR resistant cells. Since the mutant DHFR is MTX resistant, MTX containing medium can be used as a means of selection if the host cells themselves are MTX sensitive. The majority of eukaryotic cells capable of absorbing MTX appear to be methotrexate sensitive. Such useful cell lines are CHO type, CHOKI (ATC
C No. CCL61). First, transformants are selected for neomycin resistance (cotransfection with the DNA encoding the neomycin resistance-conferring gene is performed together), and then MTX amplification for α and / or β chain expression is optionally selected. It is preferable to
[Kim, "Cell" 42 : 129-138.
(1985) and EP 160,457A].

【００７０】その他、組換え脊椎細胞培養内でのαおよ
び／またはβ鎖の合成に適用するのに好ましい方法とし
て、Ｍ−Ｊ．ゲシング(Ｇething)ら、“ネイチャー" ２
９３:６２０−６２５(１９８１); Ｎ．マンティ(Ｍante
i)ら、“ネイチャー" ２８１: ４０−４６; Ａ．レビン
ソン(Ｌevinson)ら、ＥＰ１１７,０６０Ａおよび１１
７,０５８Ａ等が述べている方法がある。Other preferred methods applied to the synthesis of α and / or β chains in recombinant vertebrate cell culture include MJ. Geting et al., “Nature” 2
93 : 620-625 (1981); Manti
i) et al., "Nature" 281 : 40-46; Levinson et al., EP 117,060A and 11
There is a method described by 7,058A.

【００７１】組換え細胞培養中で、インヒビンα鎖は、
β鎖分子のいずれかと一緒に、または別個に発現され
る。同様に、成熟β鎖のいずれかまたは両方をコードし
ているＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。ＴＧＦ−βと
の類似性に基づいて、組換え培養中での発現に際し、成
熟β鎖はホモ二量体またはβ_A／β_Bヘテロ二量体を形成
し得る。これらの構造物はインヒビンでなく、従って、
本明細書中ではβ−鎖二量体またはアクティビンと称す
る。これらは、活性インヒビンの製造におけるβ鎖の供
給源として有用であり、あるいは、αおよびβ鎖同時形
成転換によって合成されたβ鎖のβ鎖二量体への転換を
検出する上で、ゲル電気泳動法における標準として用い
ることができる。実施例４に見られる様に、このことは
仮定の問題ではない。勿論、上記のごとく、生殖の調節
においても二量体は有用である。In the recombinant cell culture, the inhibin α chain was
It is expressed with or separately from any of the β chain molecules. Similarly, host cells are transformed with DNA encoding either or both of the mature β chains. Based on its similarity to TGF-β, upon expression in recombinant culture, the mature β chain can form homodimers or β _A / β _B heterodimers. These structures are not inhibin, so
Referred to herein as β-chain dimers or activin. These are useful as a source of β chain in the production of active inhibin, or gel electrochemistry for detecting the conversion of β chain synthesized by α and β chain co-transformation into β chain dimer. It can be used as a standard in electrophoresis. As seen in Example 4, this is not a hypothetical issue. Of course, as described above, the dimer is also useful in the regulation of reproduction.

【００７２】β鎖のヘテロ二量体あるいはホモ二量体
は、インビトロで個々の鎖を変性(アンホールディング)
した後、一般に既知の方法に従ってα−鎖と酸化的ジス
ルフィド結合させて分離する。しかしながら、成熟イン
ヒビンの調製には、α鎖と、β鎖のいずれか一方との両
者をコードしているＤＮＡで組換え宿主を形成転換する
のが好ましい。その結果、宿主細胞の生体内でホルモン
活性な分子がそのまま結合するので、インビトロでの処
理により２本の鎖を結合させる必要がない。αおよびβ
鎖は同じベクター内に、同じプロモーターのコントロー
ル下に配置されていることが好ましいが、それが必須と
いうわけではない。Heterodimers or homodimers of β chains denature (unfold) individual chains in vitro.
Then, the α-chain is separated by oxidative disulfide bond formation according to a generally known method. However, for the preparation of mature inhibin, it is preferable to transform the recombinant host with DNA encoding both α chain and β chain. As a result, the hormone-active molecule is bound as it is in the host cell body, and it is not necessary to bind the two chains by in vitro treatment. α and β
The strands are preferably placed in the same vector, under the control of the same promoter, but this is not essential.

【００７３】スクリーニングにおいて同定されたある種
のβ鎖アミノ酸配列変異体は下垂体の細胞表面受容体を
結合しないか、あるいは、結果的にホルモン活性を表さ
ない。その様な変異体が組換え細胞培養中でホモ二量体
として発現された場合、それらが天然のβ鎖と交差反応
性の免疫学的エピトープを有するならば、アクティビン
のイムノアッセイに有用である。さらに、その様な変異
体は、ホルモン活性なβ鎖をコードしているＤＮＡと一
緒に同時発現され、固有のβ鎖と変異体β鎖とを含むハ
イブリッドが得られる。この場合、変異体は固有のβ鎖
の構造を安定化する様、作用する。この形のβ鎖ヘテロ
二量体はホモ二量体と同様に、アクティビンのイムノア
ッセイに有用である。これはまたアクティビンの拮抗体
としても機能し得る。Certain β chain amino acid sequence variants identified in the screen either do not bind to the pituitary cell surface receptor or, as a result, do not display hormonal activity. When such variants are expressed as homodimers in recombinant cell culture, they are useful in immunoassays for activin if they have immunological epitopes that are cross-reactive with the native β chain. . In addition, such mutants are co-expressed with DNA encoding the hormonally active β chain, resulting in hybrids containing the native β and mutant β chains. In this case, the mutant acts to stabilize the structure of the native β chain. This form of the β-chain heterodimer, like the homodimer, is useful in activin immunoassays. It may also function as an activin antagonist.

【００７４】また、β鎖／ＴＧＦ−βハイブリッドを生
産するためにアクティビン／インヒビンβ鎖をＴＧＦ−
βと同時発現させる。ＴＧＦ−βを発現するベクター並
びに発現させる方法は既知である[例えば、デリンクら
(Ｄerynck)、ヒト形質転換成長因子−β相補ＤＮＡ配
列、並びに正常および形質転換細胞内での発現(Ｈuman
Ｔransforming Ｇrowth Ｆactor−β Ｃomplementar
y ＤＮＡ Ｓequenceand Ｅxpression in Ｎormal
and Ｔransformed Ｃells) “ネイチャー" ３１６:
７０１−７０５(１９８５)参照]。デリンク(Ｄerynck)
らの記載のごとくに、ＴＧＦ−β遺伝子を担ったベクタ
ーによる哺乳類細胞の同時形質転換をアクティビン／イ
ンヒビンのβ_Aまたはβ_B鎖と一緒に行うことにより、β
鎖／ＴＧＦ−βハイブリッド二量体がある割合で分泌さ
れるであろう。このハイブリッドはＴＧＦ−β／β鎖イ
ムノゲンの調製またはイムノアッセイに有用である。In order to produce β chain / TGF-β hybrid, activin / inhibin β chain was added to TGF-.
Co-express with β. Vectors expressing TGF-β as well as methods for expressing are known [eg Delink et al.
(Derynck), human transforming growth factor-β complementary DNA sequences, and expression in normal and transformed cells (Human).
Transforming Growth Factor-β Complementar
y DNA Sequence and Expression in Normal
and Transformed Cells) “Nature” 316 :
701-705 (1985)]. Delink
And co-transformation of mammalian cells with a vector carrying the TGF-β gene together with the activin / inhibin β _A or β _B chain,
The chain / TGF-β hybrid dimer will be secreted in some proportion. This hybrid is useful in the preparation or immunoassay of TGF-β / β chain immunogens.

【００７５】形質転換細胞から自体既知の方法によって
インヒビン、アクティビンまたはプロドメイン配列を回
収する。ポリペプチドが組換え細菌内で屈折体として発
現される場合には、所望のポリペプチドを回収し、常法
通り、所望のポリペプチドを再生する。別法として、ア
クティビンまたはインヒビンを分泌する形質転換細胞、
好ましくは哺乳類細胞の細胞培養を単に遠心することに
より、細胞から上清を分離する。次いで、一般に、ヘパ
リン−セファロースアフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過、および少なくとも１回の(好ましくは数回の)
固定相および／または移動相内での種々の条件下におけ
るＲＰ−ＨＰＬＣ(逆相高速液体クロマトグラフィー)工
程を含む連続精製法により、インヒビンを精製する。イ
ンビトロ合成法で生産されたプロドメイン配列は常法通
り精製される。Inhibin, activin or prodomain sequences are recovered from the transformed cells by a method known per se. When the polypeptide is expressed as a refractile body in a recombinant bacterium, the desired polypeptide is recovered, and the desired polypeptide is regenerated as usual. Alternatively, a transformed cell that secretes activin or inhibin,
The supernatant is separated from the cells, preferably by simply centrifuging the cell culture of the mammalian cells. Then, generally, heparin-sepharose affinity chromatography,
Gel filtration, and at least once (preferably several times)
Inhibin is purified by a continuous purification method involving a RP-HPLC (reverse phase high performance liquid chromatography) step under various conditions in a stationary phase and / or a mobile phase. The prodomain sequence produced by the in vitro synthesis method is purified by a conventional method.

【００７６】本発明に用いるのに好ましいプロドメイン
ポリペプチドは、所望のプロドメインに適したαおよび
／またはβ鎖を合成する様、形質転換された組換え細胞
の培地から回収される。特にそれらの回収は、まず固有
の電気泳動ゲル上で培養培地ポリペプチドを分離し、予
測される分子量のバンドを切り取った後、溶離したポリ
ペプチドを例えばＦＰＬＣまたはＨＰＬＣによってさら
に精製し、次いで、実質上ホモジーニアスな分離された
ポリペプチドをアミノ酸配列決定に付すことにより回収
される。次に、この精製(純化)プロドメインポリペプチ
ドを用いて、例えば、ウサギ等に抗体を産生させ、それ
をイムノアフィニティ精製に用いれば、プロドメインの
回収が単純になると思われる。Preferred prodomain polypeptides for use in the present invention are recovered from the culture medium of transformed recombinant cells so as to synthesize the appropriate α and / or β chains for the desired prodomain. In particular, their recovery involves first separating the culture medium polypeptides on a native electrophoretic gel, excising bands of the expected molecular weight, and then further purifying the eluted polypeptides by, for example, FPLC or HPLC, then Recovered by subjecting the upper homogenous isolated polypeptide to amino acid sequencing. Next, using this purified (purified) prodomain polypeptide, for example, if an antibody is produced in, for example, a rabbit and used for immunoaffinity purification, recovery of the prodomain would be simplified.

【００７７】単離されたブタのホルモン活性なインヒビ
ンを精製するには、まず、清澄な形質転換培養の上清ま
たは細胞リゼイトをヘパリン−セファロースアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製し、次に、セファクリ
ルＳ−２００ゲルにかけてゲル濾過した後、種々の移動
相グラディエントおよび／または誘導体化シリカゲル支
持体を用い、４回の連続的なＲＰ−ＨＰＬＣに付す方法
が好ましい。好ましくは、比較的疎水性の低い固定相を
用い、Ｃ₃−Ｃ₈カラムで行うことが好ましく、Ｃ₃−Ｃ₅
であってフェニルカラムを用いることが特に好ましい。
移動相の溶質特異性は、有機成分特にアセトニトリルの
濃度を変えることにより適宜調節できる。１回のＲＰ−
ＨＰＬＣ分画によってもゲル濾過物質に比べてかなり純
度が高くなるが、ヘパリン−セファロースクロマトグラ
フィーおよびゲル濾過による連続処理の後、通常、２ま
たはそれ以上、好ましくは４回のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を
行う。この方法は、組換え細胞培養からのヒトインヒビ
ンの精製にも同様に適用し得ることが分かった。To purify the isolated porcine hormonally active inhibin, the supernatant of the clear transformant culture or cell lysate was first purified by heparin-Sepharose affinity chromatography and then Sephacryl S-200. Preferred is a method involving gel filtration and subsequent gel filtration followed by four consecutive RP-HPLC using various mobile phase gradients and / or derivatized silica gel supports. Preferably, a relatively less hydrophobic stationary phase is preferably carried out in the C ₃ -C ₈ column, C ₃ -C ₅
Therefore, it is particularly preferable to use a phenyl column.
The solute specificity of the mobile phase can be appropriately adjusted by changing the concentration of the organic component, especially acetonitrile. One RP-
Although the HPLC fractionation also results in considerably higher purity than the gel filtration material, continuous treatment by heparin-sepharose chromatography and gel filtration is usually followed by 2 or more, preferably 4 times RP-HPLC purifications. . It was found that this method can be applied to the purification of human inhibin from recombinant cell culture as well.

【００７８】精製の第１段階はヘパリン−セファロース
アフィニティクロマトグラフィーであり、ここでは、タ
ンパク質を適用した条件下においてセファロース−結合
ヘパリン部分に吸着され、この吸着されたインヒビンを
１Ｍ ＮaＣlで溶離して回収する。この段階において、
かなり大量の粗抽出物を相当迅速に処理し、総インヒビ
ン活性が粗抽出物の少なくとも９０％に匹敵する多量の
タンパク質を回収することができるのでこの段階で、粗
抽出物の精製工程が極めて促進される。The first step of purification is heparin-sepharose affinity chromatography, in which the protein is adsorbed on the sepharose-bound heparin moiety under the conditions applied and the adsorbed inhibin is eluted with 1M NaCl. To do. At this stage,
At this stage, the purification process of the crude extract is greatly facilitated, as it is possible to process a fairly large amount of crude extract fairly quickly and to recover a large amount of protein with a total inhibin activity comparable to at least 90% of the crude extract. To be done.

【００７９】様々なカラム画分中のインヒビン活性を検
出するために、容量比で約０.０１％〜０.１％を分取
し、水１００μl中に入れたヒト血清アルブミン１００
μgを加えた後、スピード−バク(Ｓpeed−Ｖac)コンセ
ントレーター(濃縮器)[サバント(Ｓavant)、ヒックスビ
レ、ＮＹ]中で溶媒を留去した。残留物を３mlのＨＤＭ
ＥＭ中１％ウシ胎児血清に再溶解し、ミレックス(Ｍill
ex)−ＧＳ ０.２２μmフィルター[ミリポア(Ｍillipor
e)コーポレーション、ベットフォード、ＭＡ]で濾過
し、複製して分析した。精製工程におけるバイオアッセ
イのスピードを上げるために、インヒビン活性によるＦ
ＳＨ分泌の基礎的な阻害のみを測定し、クロマトグラム
中の、インヒビンタンパク質が泳動していると予測され
る領域をプロットした。In order to detect inhibin activity in various column fractions, approximately 0.01% to 0.1% by volume was taken and 100 ml of human serum albumin was added to 100 μl of water.
After the addition of μg, the solvent was distilled off in a Speed-Vac concentrator (concentrator) [Savant, Hicksville, NY]. 3 ml of HDM residue
Redissolved in 1% fetal bovine serum in EM, Millex (Mill
ex) -GS 0.22 μm filter [Millipor (Millipor
e) Corporation, Betford, MA], filtered and analyzed in duplicate. In order to speed up the bioassay in the purification process, F due to inhibin activity
Only the basal inhibition of SH secretion was measured and the region of the chromatogram where the inhibin protein was predicted to migrate was plotted.

【００８０】ヘパリン−セファロースアフィニティクロ
マトグラフィーを行うために、細胞分屑を、ベックマン
Ｊ２−２１遠心機(ベックマンインスツルメンツインコ
ーポレーテッド、パロ・アルト、ＣＡ)中において、Ｊ
Ａ２０ローターを用い、１０,０００rpmで３０分間遠心
することにより沈降させた。エーレンマイヤーフラスコ
中で、上清１／２に０.１Ｍ ＮaＣl含有０.０１Ｍトリ
スＨＣl(pＨ７)を加えて元の容量の１０倍に希釈し、２
個のラビット(Ｒabbit)４チャンネル蠕動ポンプ[ライニ
ン・インスツルメント(Ｒainin Ｉnstrument)Ｃo．Ｉn
c．エメリービレ、ＣＡ]により、ヘパリン−セファロー
ス[ファルマシア・ファイン・ケミカルス(Ｆarmacia
Ｆine Ｃhemicals)、ピスカッタウエイ、Ｎ．Ｊ．]カ
ラム(３.５×９cm)に、カラム当たり、４０ml／時間の
速度で、シラスティック(Ｓilastic)チューブ(０.７６m
mＩＤ)を通して同時にポンプ注入した。液体全てがヘパ
リン−セファロースカラム内にポンプ注入された後、８
本のカラム全てを同時に、０.１Ｍ ＮaＣlを含有する
０.０１ＭトリスＨＣl、pＨ７により、同様にして洗浄
した。吸着された、インヒビン活性を有するタンパク質
を、８本のカラムを、上記のごとく１Ｍ ＮaＣl含有
０.０１ＭトリスＨＣl(pＨ７)によって同時に洗浄する
ことにより除き、洗浄液を画分に分けて集めた。上記の
ごときインビトロでのバイオアッセイによってインヒビ
ン活性を監視した。残る抽出物の精製のために、カラム
を０.０１ＭトリスＨＣl(pＨ７)中２Ｍ ＮaＣlで洗浄
して再生させ、０.１Ｍ ＮaＣl含有０.０１ＭトリスＨ
Ｃlで再度平衡化した。To perform heparin-sepharose affinity chromatography, the cell debris was placed in a Beckman J2-21 centrifuge (Beckman Instruments Incorporated, Palo Alto, CA) in a J.
It was made to sediment by centrifuging at 10,000 rpm for 30 minutes using an A20 rotor. In an Erlenmeyer flask, 0.01M Tris HCl containing 0.1M NaCl (pH 7) was added to 1/2 of the supernatant to dilute it to 10 times the original volume, and
Rabbit 4-channel peristaltic pump [Rainin Instrument Co. In
c. Heparin-Sepharose [Pharmacia Fine Chemicals (Farmacia
Fine Chemicals), Piscataway, N.W. J. ] Columns (3.5 x 9 cm) at a rate of 40 ml / hr per column, with Silastic tubes (0.76 m)
pumped simultaneously through mID). After all the liquid was pumped into the heparin-sepharose column, 8
All columns of the book were simultaneously washed in the same manner with 0.01 M Tris HCl containing 0.1 M NaCl, pH 7. The adsorbed protein having inhibin activity was removed by washing the eight columns simultaneously with 0.01 M Tris HCl containing 1 M NaCl (pH 7) as described above, and the washings were collected in fractions. Inhibin activity was monitored by an in vitro bioassay as described above. For purification of the remaining extract, the column was regenerated by washing with 2M NaCl in 0.01M Tris HCl (pH 7) and 0.01M Tris H containing 0.1M NaCl.
Equilibrated again with Cl.

【００８１】次に、得られた物質をゲル濾過して分画
し、通常、分子量に従ってタンパク質を分ける。ヘパリ
ン−セファロースカラムによって抽出したインヒビン活
性を有する画分をプールし、分子量(Ｍr)カットオフ３,
５００である、シリンダー(直径２８.６mm)のスペクト
ラポール(Ｓpectrapor)Ｎo．３ メンブラン・チュービ
ング[スペクトラム・メジカル・インダストリィズ(Ｓpe
ctrum Ｍedical Ｉndustries)インコーポレーテッ
ド、ロスアンゼルス、ＣＡ]中、３０％酢酸に対して一
夜透析し、ＮaＣlを除去する。上記のごとくにして保持
液を遠心して白色の沈澱を除き、上清を５×１００cmの
セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ−２００微細(スーパーフ
ァイン)カラム[ファルマシア・ファイン・ケミカルス
(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals)ピスカッタウェイ、
Ｎ．Ｊ．]にかけるために等分量づつ分ける。各カラム
を３０％酢酸２０mlで、２２分間溶離し、２８０nmにお
けるＵＶ吸収とバイオアッセイによりカラムからの画分
を監視する。Next, the obtained substance is gel-filtered and fractionated, and the protein is usually separated according to the molecular weight. Fractions having inhibin activity extracted by heparin-sepharose column were pooled, and molecular weight (Mr) cutoff 3,
500, cylinder (diameter 28.6 mm) Spectrapole No. 3 Membrane Tubing [Spectrum Medical Industries (Spe
ctrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, Calif.) against 30% acetic acid overnight to remove NaCl. Centrifuge the retentate as above to remove the white precipitate and remove the supernatant from the 5 × 100 cm Sephacryl S-200 column (Pharmacia Fine Chemicals).
(Pharmacia Fine Chemicals) Piscataway,
N. J. ] Divide into equal aliquots to apply. Elute each column with 20 ml of 30% acetic acid for 22 minutes and monitor the fractions from the column by UV absorption at 280 nm and bioassay.

【００８２】Ｓ−２００カラムから得たバイオアッセイ
陽性タンパク質をプールし、凍結乾燥する。この凍結乾
燥品を０.２Ｎ酢酸に溶解し(１ml／ml)、ミレックス−
ＨＡ(Ｍillex−ＨＡ)０.４５μmフィルター[ミリポア
(Ｍillipore)Ｃorp．、ベッドフォード、ＭＡ]で濾過す
る。濾液を１×２５cmヴィダック(Ｖydac)５μm粒子サ
イズのＣ４カラム[ザ・セパレーションズ・グループ・
ヘスペリア(Ｔhe Ｓeparations Ｇroup Ｈesperi
a)、ＣＡ]に直接適用し、ＴＥＡＰバッファーのグラデ
ィエントで展開する。ＴＥＡＰ系において、バッファー
Ａは０.２５Ｎリン酸トリエチルアンモニウム(pＨ３)か
らなり、バッファーＢはバッファーＡ中の８０％アセト
ニトリルで構成されている。全濾液を適用した後、ＵＶ
吸収が基線に至るまで、水性バッファーＡによりカラム
を洗浄する。インヒビン活性を示す画分をスペクトロフ
ロー(Ｓpectroflow)７５７ＵＶ検出器[クラトス・アナ
リティカル・インスツルメンツ(Ｋratos Ａnalytical
Ｉnstruments)、ラムセイ、Ｎ．Ｊ．]、ソルテック
(Ｓoltec)２２０記録計[ソルテック(Ｓoltec)Ｃorp．サ
ンバレー、ＣＡ]およびレディラック(Ｒedirac)２１１
２ フラクション・コレクター[ＬＫＢインスツルメン
ツＩnc．、ギャザースバーグ、ＭＤ]を備えたベックマ
ン２３２グラディエント液体クロマトグラフィー系[ベ
ックマン・インスツルメンツ(Ｂeckman Ｉnstruments)
Ｉnc．バークレー、ＣＡ]内で分離する。インヒビン活
性を示すゾーンをバイオアッセイによって検出する。Bioassay positive proteins from the S-200 column are pooled and lyophilized. This lyophilized product was dissolved in 0.2N acetic acid (1 ml / ml), and the
HA (Millex-HA) 0.45 μm filter [Millipore
(Millipore) Corp. , Bedford, MA]. The filtrate was a 1 x 25 cm Vydac 5 μm particle size C4 column [The Separations Group.
Hesperia (The Separations Group Hesperi
a), CA] and developed with a gradient of TEAP buffer. In the TEAP system, buffer A consisted of 0.25N triethylammonium phosphate (pH 3) and buffer B consisted of 80% acetonitrile in buffer A. After applying the whole filtrate, UV
The column is washed with aqueous buffer A until the absorption reaches the baseline. Fractions showing inhibin activity were analyzed using a Spectroflow 757 UV detector [Kratos Analytical Instruments (Kratos Analytical Instruments)
Instruments), Ramsey, N.M. J. ], Soltec
(Soltec) 220 recorder [Soltec Corp. Sun Valley, CA] and Redirac 211
2 Fraction collector [LKB Instruments Inc. , Gathersburg, MD] Beckman 232 Gradient Liquid Chromatography System [Beckman Instruments]
Inc. Berkeley, CA]. Zones showing inhibin activity are detected by bioassay.

【００８３】所望によりさらに２段階のＲＰ−ＨＰＬＣ
を行うことにより、β_B鎖を含むインヒビンタンパク質
を精製し、β_A種を含まないインヒビンを得る。第１段
階では１×２５cmのＶydac ５μm−粒子サイズのＣ４カ
ラムとトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)バッファーとを用い、
第２段階では１×２５cm Ｖydac ５μm粒子サイズのフ
ェニルカラムとＴＥＡＰバッファー系とを用いる。ＴＦ
Ａ系において、バッファーＡは水９９９ml中にトリフル
オロ酢酸１mlを含有し、バッファーＢは水１９９mlおよ
びアセトニトリル８００ml中にトリフルオロ酢酸１mlを
含有している。２種のインヒビン種は別々に溶離され
る。いくつかのバッチから蓄積したインヒビンを０.４
６×２５cmのアクアポア(Ａquapore)ＲＦ−３００ １
０μm粒子サイズカラム[ブラウン・リー(Ｂrownlee)ラ
ボス(Ｌabs)、サンタクララ、ＣＡ]とＴＦＡバッファー
系とを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより濃縮した。しかしな
がら、通常、β_Aまたはβ_B鎖のみをコードしているＤＮ
Ａによる形質転換体から得た細胞培養上清については、
この精製段階は使用されない。Optionally two additional steps of RP-HPLC
The inhibin protein containing β _B chain is purified by carrying out to obtain inhibin containing no β _A species. In the first step, a 1 × 25 cm Vydac 5 μm-particle size C4 column and trifluoroacetic acid (TFA) buffer were used.
The second stage uses a 1 × 25 cm Vydac 5 μm particle size phenyl column and a TEAP buffer system. TF
In system A, buffer A contains 1 ml trifluoroacetic acid in 999 ml water and buffer B contains 1 ml trifluoroacetic acid in 199 ml water and 800 ml acetonitrile. The two inhibin species are eluted separately. 0.4 accumulated inhibin from several batches
6 x 25 cm Aquapore RF-300 1
Concentrated by RP-HPLC using a 0 μm particle size column [Brownlee Labs, Santa Clara, CA] and a TFA buffer system. However, DNs that normally encode only β _A or β _B chains
Regarding the cell culture supernatant obtained from the transformant of A,
This purification step is not used.

【００８４】インヒビン、アクティビン、プロドメイン
配列またはそれらの変異体は薬学的に許容し得る無毒な
塩類、例えば酸付加塩や、金属錯体(コンプレックス)、
例えば、亜鉛および鉄等(これらもまた、本発明の目的
においては、塩と見なされる)の形で投与される。その
様な酸付加塩の例には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、
リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香
酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、お
よび酒石酸塩等がある。等張性生理食塩水やリン酸緩衝
液等の溶液として静脈内投与するのが適当である。The inhibin, activin, prodomain sequence or variants thereof are pharmaceutically acceptable non-toxic salts such as acid addition salts, metal complexes,
For example, it is administered in the form of zinc, iron and the like, which are also considered salts for the purposes of this invention. Examples of such acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, sulphate,
There are phosphates, maleates, acetates, citrates, benzoates, succinates, malates, ascorbates, and tartrates. It is suitable to be administered intravenously as a solution of isotonic saline or phosphate buffer.

【００８５】本発明のポリペプチドは医師の指導の下で
投与されるべきであり、普通、医薬組成物中には、有効
量のペプチドと通常の、薬学的に許容し得る担体とが含
まれている。投与量は、該タンパク質の投与における特
定の目的により変化し、雄性の不稔のために規則的にイ
ンヒビンを投与する場合の用量レベルは約０.１〜約１m
g／kg(体重)の範囲とすることができる。The polypeptides of the present invention should be administered under the supervision of a physician and will typically include an effective amount of the peptide in a pharmaceutical composition and a conventional, pharmaceutically acceptable carrier. ing. Dosage will vary with the particular purpose of administration of the protein, with dose levels of about 0.1 to about 1 m for inhibin being regularly administered due to male sterility.
It can be in the range of g / kg (body weight).

【００８６】インヒビン、アクティビン、プロドメイン
配列およびそれらの誘導体は、埋め込み(移植)可能な、
あるいは皮膚に接着可能な、持続的放出製品から投与す
ることが望ましい。適当な系には、例えば、Ｌ−グルタ
ミン酸とガンマーエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合
体[シドマン(Ｕ．Ｓidman)ら、１９８３、“バイオポリ
マーズ(Ｂiopolymers)" ２２(１): ５４７−５５６]、
ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)[ランガ
ー(Ｒ．Ｌanger)ら、１９８１、“ジェイ・バイオメド
・マター・レス(Ｊ．Ｂiomed．Ｍater．Ｒes．)" １５:
１６７−２７７およびＲ．ランガーら、１９８２、
“ケミ・テク(Ｃhem．Ｔech．)" １２: ９８−１０
５]、エチレンビニルアセテート(Ｒ．ランガーら、同
上)、あるいはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸(Ｅ
Ｐ１３３,９８８Ａ)等が含まれる。その様な製品は、皮
下に埋め込んだり、皮膚または粘膜と接触させる様に付
して用いられる。Inhibin, activin, prodomain sequences and their derivatives are implantable,
Alternatively, it may be desirable to administer from a sustained release product that can adhere to the skin. Suitable systems include, for example, copolymers of L-glutamic acid and gamma-ethyl-L-glutamate [U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22 (1): 547-556]. ,
Poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) [R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15 :
167-277 and R.I. Langer et al., 1982,
"Chem. Tech." 12 : 98-10
5], ethylene vinyl acetate (R. Langer et al., Ibid.), Or poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (E
P133,988A) and the like. Such products are used by being implanted subcutaneously or in contact with skin or mucous membranes.

【００８７】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。プラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表される。本発明の出発
物質であるプラスミドは市販されているか、または非制
限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの様
にして入手し得るプラスミドまたはＤＮＡから、公知の
方法に従って組立てることができる。更に、その他の同
等なプラスミドも当業者には知られており、通常の技術
者にとって自明であろう。To simplify the description of the examples, frequently used methods are abbreviated in short idioms. Plasmids are designated by a lowercase p and / or followed by uppercase and / or numbers. The plasmids that are the starting materials of the present invention are either commercially available or are generally available from non-restrictive facilities, or can be constructed from plasmids or DNA thus obtained according to known methods. Moreover, other equivalent plasmids are known to those of skill in the art and will be apparent to those of ordinary skill in the art.

【００８８】ＤＮＡの“消化"とは、ＤＮＡを、該ＤＮ
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
“部分"消化とは、制限酵素による不完全な消化であ
り、特定のエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質中の
部分の全てでなく、そのうちのいくつかを開裂する様な
条件を選んで行う。本発明において用いる様々な制限酵
素は市販されており、その反応条件、コファクター、お
よびその他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従っ
て使用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られ
た微生物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通
常、数字からなる略号で表される。一般に、特別の場合
を除き、約１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメン
トを、約２０μlの緩衝液中の約１単位の酵素と共に使
用する。特定の酵素について適当な緩衝液および基質の
量は、製造業者によって明示されている。通常、インキ
ュベーション時間は３７℃で１時間とするが、供給者の
指示に従って変えてもよい。インキュベーションした
後、フェノールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出
して除き、水性フラクションからエタノール沈澱によっ
て消化された核酸を回収する。時たま、制限酵素による
消化の後、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末端
が“閉環(サーキュライディング)"したり、閉じたルー
プを形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡフラ
グメントが挿入されにくくなるのを防止するために、
５'末端のホスフェートを細菌性アルカリホスファター
ゼで加水分解することがある。明示しない限り、プラス
ミドの消化には、５'末端の脱リン酸反応は伴わないも
のとする。脱リン酸の方法および試薬は常法に従う
[Ｔ．マニアティス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、１９８２、モレ
キュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)pp．１
３３−１３４]。"Digestion" of DNA means that DNA is
Refers to catalytic cleavage by an enzyme that acts only on a certain position of A. Such an enzyme is called a restriction enzyme, and a site specific to the enzyme is called a restriction site.
A "partial" digestion is an incomplete digestion with a restriction enzyme and is performed under conditions such that it cleaves some, but not all, of the part in the DNA substrate for a particular endonuclease. Various restriction enzymes used in the present invention are commercially available, and their reaction conditions, cofactors, and other requirements were used according to the instructions of the enzyme supplier. Restriction enzymes are represented by a capital letter that indicates the microorganism from which each restriction enzyme was first obtained, then other letters, and usually an abbreviation consisting of numbers. Generally, unless otherwise specified, about 1 μg of plasmid or DNA fragment is used with about 1 unit of enzyme in about 20 μl of buffer. Appropriate buffer and substrate amounts for a particular enzyme are specified by the manufacturer. In general, the incubation time is 37 ° C. for 1 hour, but it may be changed according to the supplier's instruction. After incubation, the proteins are extracted and extracted with phenol and chloroform and the digested nucleic acids are recovered from the aqueous fraction by ethanol precipitation. Occasionally, after restriction enzyme digestion, the two restriction cleavage ends of the DNA fragment "circulate" or form a closed loop, which makes it difficult for other DNA fragments to be inserted into the restriction site. In order to prevent
The phosphate at the 5'end may be hydrolyzed by bacterial alkaline phosphatase. Unless otherwise indicated, digestion of plasmids shall not be accompanied by dephosphorylation of the 5'end. Dephosphorylation methods and reagents follow conventional methods
[T. T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning pp. 1
33-134].

【００８９】制限酵素による消化によって得られたＤＮ
Ａフラグメントの“回収"または“単離"とは、この消化
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、
フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフ
ラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを同定
し、該フラグメントを含む部分を取り除き、該ゲルから
ＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一般的に
知られている。例、Ｒ．ローン(Ｒ．Ｌawn)ら、１９８
１、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"９:６１０３
−６１１４およびＤ．ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)ら、１９
８０“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ" ８: ４０５
７参照。DN obtained by digestion with restriction enzymes
"Recovery" or "isolation" of the A fragment means that the digest is separated by polyacrylamide gel electrophoresis,
By comparing the mobility of the fragment with that of a marker DNA fragment of known molecular weight, the desired fragment is identified, the portion containing the fragment is removed, and the DNA is separated from the gel. This method is generally known. For example, R.I. R. Lawn et al., 198
1. "Nucleic Acids Research" 9 : 6103
-6114 and D.I. D. Goeddel et al., 19
80 "Nucleic Acids Research" 8 : 405
See FIG.

【００９０】“サザーン分析"とは、消化物中のＤＮＡ
配列またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、
既知の、標識したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラ
グメントとのハイブリダイゼーションによって確認する
方法である。本明細書中では、特に断らない限り、サザ
ーン分析という時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)の
方法[１９７５ “ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジィ(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)" ９８: ５０３−５１
７]に従って、消化物を１％アガロース上で分離し、変
性し、そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテ
ィスらの方法[１９７８、“セル" １５: ６８７−７０
１]に従ってハイブリダイゼーションを行うことを意味
する。"Southern analysis" means DNA in digests.
The presence of the DNA sequence in the sequence or DNA-containing composition,
It is a method of confirmation by hybridization with a known labeled oligonucleotide or DNA fragment. In this specification, unless otherwise specified, the Southern analysis refers to E. The method of E. Southern [1975 "J. Mol. Biol." 98 : 503-51.
7], the digests were separated on 1% agarose, denatured and transferred onto nitrocellulose, T. Maniatis et al. [1978, "Cell" 15 : 687-70.
1] means that the hybridization is carried out according to [1].

【００９１】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果、ＤＮＡが染色体外成分と
して、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを
意味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌
の形質転換法はマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl₂法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ィ" ５３: １５４)を採用する。"Transformation" means introducing DNA into an organism, and as a result, DNA is replicated as an extrachromosomal component or integrated into a chromosome to be replicated. Unless otherwise specified, the transformation method of E. coli according to the present invention is the ManCl et al. CaCl ₂ method (19).
70, "Journal of Molecular Biology" 53 : 154).

【００９２】“ライゲーション(結合)"とは、２個の二
本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ．マニアティスら、前掲p１４
６)。特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩
衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤ
ＮＡフラグメント０.５μg当たりＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
(“リガーゼ")１０単位を用いて行う。"Ligation" refers to the process of forming phosphodiester bonds between two double stranded nucleic acid fragments (T. Maniatis et al., Supra, p14).
6). Unless otherwise stated, ligation uses known buffers and conditions and approximately equimolar amounts of D to be ligated.
T ₄ DNA ligase per 0.5 μg of NA fragment
(“Ligase”) performed with 10 units.

【００９３】形質転換体からＤＮＡを“調製する"と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアティスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p．９０)を採用する。“Preparing” DNA from transformants means isolating plasmid DNA from microbial culture. Unless otherwise specified, the alkaline / SDS method of Maniatis et al. (Id. P. 90) is used.

【００９４】“オリゴヌクレオチド"とは、短い一本鎖
または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既知
の方法によって化学的に合成され、次いで、ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである。"Oligonucleotides" are short, single- or double-stranded polydeoxynucleotides that have been chemically synthesized by known methods and then purified on polyacrylamide gels.

【００９５】引用した文献は、参考までに全て末尾の文
献目録に示した。All the cited documents are shown in the bibliography at the end for reference.

【００９６】以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明
する。The present invention will be described in detail below with reference to examples.

【００９７】実施例１ クローン化したインヒビン・α−サブユニットcＤＮＡ
の単離 ブタインヒビンのサブユニットをコードしている配列を
含有するクローンの同定法は、いくつかの先行例[アン
ダーソン等(Ａnderson et al.)、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、８０: ６８３６
−６８４２(１９８３)およびユルリッチ(Ｕllrich et a
l.)、ネイチャー(Ｎature)、３０９: ４１８−４２５
(１９８４)]において成功した、“長いプローブ"を用い
る方法に基づいている。簡単に説明すると、λgt１０に
おいて作成し、そしてオリゴ−dＴをプライマーとするc
ＤＮＡ合成によってブタ卵巣mＲＮＡから得た、高度に
錯綜したcＤＮＡライブラリーを、ブタインヒビンのα
−鎖のＮ−末端アミノ酸配列に向けられた６４塩基の長
さの一本鎖合成オリゴデオキシヌクレオチドでスクリー
ニングした。インヒビン鎖のmＲＮＡは明らかに不安定
であるが故に、ライブラリーを新鮮な卵巣組織から調製
すべきであるということがわかった。２０００個のプラ
ーク中約１個がこのプローブと交雑し、雑種化している
クローン化cＤＮＡ数個を配列分析してプローブ同定が
正しいことを確認した。この分析により、特徴づけられ
たcＤＮＡのすべてが、α−鎖の前駆体タンパク質の完
全な構造を予想するための十分な配列情報を含んでいな
いことがわかった。同一のcＤＮＡライブラリー由来の
さらに多くのクローンを分析する代わりに、α−前駆体
残基６０−６４(図１)をコードする配列化領域に相補的
な合成オリゴヌクレオチドの卵巣mＲＮＡ上の３'側延長
によって第２のライブラリーを作成した。このライブラ
リーを、予め分析しておいたcＤＮＡからの適当な制限
フラグメントでスクリーニングし、α−前駆体のＮ−末
端領域をコードするＤＮＡ配列の残りを指定する数個の
単離体を得た。このコード化配列の完全性を、ブタα−
鎖ペプチド配列を指定し、そしてメチオニンコドン(前
にフレーム内停止コドンを有し、後ろにシグナルペプチ
ドの特質を備えた疎水配列が続く)で開始する長いリー
ディング・フレームの存在によって判定した。この前駆
体タンパク質およびそのcＤＮＡの完全配列を図２およ
び図３に示す。シグナルペプチドを含有する完全なタン
パク質は、３６４個のアミノ酸からなり、〜４０ＫのＭ
r値を有し、このうちＣ末端側の１３４個(Ｍr〜１４.５
Ｋ)はブタインヒビンα−鎖を構成する。前駆体のプロ
領域にはＡrg−Ａrg配列が数個存在し、そのうちの１個
はα−サブユニットの前に直接して存在する。この塩基
残基の後者の対がタンパク質加水分解によるα−ペプチ
ド放出のプロセシング部位であると我々は考えている。
この推定の前駆体配列により、２つのＮ−連鎖グリコシ
レート化部位が予想され、その１つはα鎖プロパー内に
あると予想される。 Example 1 Cloned inhibin α-subunit cDNA
The method for identifying clones containing sequences encoding the subunits of isolated porcine inhibin is described in several previous examples [Anderson et al., Proceedings.
Of National Academy of Sciences
(Proc. Nat. Acad. Sci. USA), 80 : 6836.
-6842 (1983) and Ullrich et a
l.), Nature, 309 : 418-425.
(1984)], which is based on the successful method of using "long probes". Briefly, we created in λgt10 and used oligo-dT as a primer c
A highly complex cDNA library obtained from porcine ovary mRNA by DNA synthesis was used to transform the α of porcine inhibin.
-Screened with a single-stranded synthetic oligodeoxynucleotide 64 bases in length directed to the N-terminal amino acid sequence of the chain. It was found that the library should be prepared from fresh ovarian tissue because the inhibin chain mRNA is clearly unstable. About 1 out of 2000 plaques hybridized with this probe and several hybridized cloned cDNAs were sequenced to confirm correct probe identification. This analysis revealed that none of the characterized cDNAs contained sufficient sequence information to predict the complete structure of the α-chain precursor protein. Instead of analyzing more clones from the same cDNA library, 3'on the ovarian mRNA of a synthetic oligonucleotide complementary to the sequenced region encoding the α-precursor residues 60-64 (FIG. 1). A second library was created by side extension. This library was screened with appropriate restriction fragments from the pre-analyzed cDNA, yielding several isolates that specify the rest of the DNA sequence encoding the N-terminal region of the α-precursor. . The integrity of this coding sequence was confirmed by porcine α-
The chain peptide sequence was designated and judged by the presence of a long reading frame starting with a methionine codon, preceded by an in-frame stop codon, followed by a hydrophobic sequence with the characteristics of the signal peptide. The complete sequences of this precursor protein and its cDNA are shown in Figures 2 and 3. The complete protein containing the signal peptide consists of 364 amino acids and has an M of ~ 40K.
r-value, of which 134 at the C-terminal side (Mr-14.5)
K) constitutes the porcine inhibin α-chain. There are several Arg-Arg sequences in the pro region of the precursor, one of which is directly in front of the α-subunit. We believe that this latter pair of base residues is the processing site for proteolytic α-peptide release.
This putative precursor sequence predicts two N-linked glycosylation sites, one within the α-chain proper.

【００９８】コード領域に加え、このcＤＮＡ配列は１
６７個のヌクレオチドからなる３'−非翻訳配列(正規の
ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを含有する)、お
よび５'−非翻訳領域(この領域の正確な長さは現在わか
っていない)。In addition to the coding region, this cDNA sequence is 1
A 3'-untranslated sequence of 67 nucleotides (containing the canonical AATAAA polyadenylation signal), and a 5'-untranslated region (the exact length of this region is currently unknown).

【００９９】この方法の詳細は以下のようである。ポリ
アデニル化したmＲＮＡを、新鮮なうちに凍結させたブ
タ卵巣から調製した[カプラン等(Ｋaplan et al.)、ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｊ．Ｂioche
m．)、１８３: １８１−１８４]。用いたＥcoＲＩアダ
プターが配列:The details of this method are as follows. Polyadenylated mRNA was prepared from freshly frozen porcine ovaries [Kaplan et al., Journal of Biochemistry (J. Bioche).
m. ), 183 : 181-184]. The sequence of the Eco RI adapter used is:

【化６３】 ５'−ＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＣ−３' ３'−ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧ−５'Ｐ を有するものであること以外は、ウッド等[Ｗood et a
l.、ネイチャー(Ｎature)、３１２: ３３０−３３７(１
９８４)]の開示のようにして、ポリＡ＋mＲＮＡ５μgか
らλgt１０において〜６×１０⁶クローンのオリゴ−dＴ
プライマー処理したcＤＮＡライブラリー[ヒューイン等
(Ｈuynh et al.)、ＤＮＡ・クローニング・テクニック
ス(ＤＮＡ clonig Ｔechniques)、クローバー(Ｄ．Ｃ
lover)編、１９８４]を調製した。Embedded image Wood et al. [Wood et a, except that it has 5′-AATTCACTCGAGACGC-3 ′ 3′-GTGAGCTCTGCG-5′P.
l., Nature, 312 : 330-337 (1)
984)] and ~ 6x10 ⁶ clones of oligo-dT in λgt10 from 5 μg of poly A + mRNA.
Primer-treated cDNA library [Huin et al.
(Huynh et al.), DNA cloning techniques, Clover (DC)
lover), 1984] was prepared.

【０１００】約１×１０⁶の未増幅 cＤＮＡ クローン
を、図２および図３で下線を引いたアミノ酸配列に基づ
く、５α−サブユニット・オリゴヌクレオチド:About 1 × 10 ⁶ unamplified cDNA clones were isolated from the 5α-subunit oligonucleotide based on the amino acid sequences underlined in FIGS. 2 and 3:

【化６４】５'−ＡＣＣＧＣＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧ
ＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡ
ＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧ−３' でスクリーニングした。交雑は、５×ＳＳＣ、４０％ホ
ルムアミド中、３７℃で、ホスホリル化した³²Ｐラベル
化プローブを用いて行った。交雑が陽性であるクローン
約５００個が得られ、そのうち１２個を精製し、挿入の
大きさについて試験した。これらのうち５個のＥcoＲＩ
総入隊(λＰＩＮ−α２、−α５Ａ、−α５、−α９、
−α１０)をＭ１３誘導体[メシング等(Ｍessing et a
l.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcid
s．Ｒes．)、９: ３０９−３２１(１９８１)]にサブク
ローンし、サンガー等[Ｓanger et al.、Ｐroc．Ｎat．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７４: ５４６３−５４６７(１９
７７)]のジデオキシ鎖停止法によって配列決定した。特
異的にプライマー処理されたライブラリーを、ポリＡ＋
mＲＮＡ ５μgをオリゴヌクレオチド:Embedded image 5′-ACCGCCCCTTTGCCCTG
GCCTTGGTCCCCCTGCTGCTCTGAGA
Screened with CTGCTGCAGAGACCTCCTGAGG-3 '. Crosses were performed with phosphorylated ³² P-labeled probe at 37 ° C. in 5 × SSC, 40% formamide. About 500 clones with positive crosses were obtained, 12 of which were purified and tested for insert size. 5 of these Eco RIs
Total enlistment (λPIN-α2, -α5A, -α5, -α9,
-Α10) is an M13 derivative [Messing et a
l.), Nucleic Acids Research (Nucl. Acid
s. Res. ), 9 : 309-321 (1981)] and sub-cloned into Sanger et al. [Sanger et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (19).
77)] dideoxy chain termination method. The specifically primed library was labeled with poly A +
Oligonucleotide 5 μg mRNA:

【化６５】 ５'−ＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３' (ヌクレオチド２４８−２６３に相補性)でプライマー処
理し、次いで、λgt１０にクローニングすることによっ
て調製した。得られた１×１０⁶クローンのうち約２×
１０⁵クローンを、λＰＩＮ−α２から調製した５' １
００bp ＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントでスクリーニ
ングした。得られた交雑が陽性であるクローン１７０個
のうち１２個について精製を行い、２個(λＰＩＮ−Ｓ
１２s、−Ｓ４s)についてジデオキシ法で配列決定し
た。α−サブユニットcＤＮＡの完全なヌクレオチド配
列は、異なるλ単離体からの種々の制限フラグメントを
Ｍ１３ファージ誘導体にサブクローンすることによって
得られた。Ｅ．コリの一本鎖結合タンパク質(ファーマ
シア)と組み合わせてデオキシイノシン混合物を用いる
ことによって圧縮体を溶解した。Embedded image Prepared by priming with 5′-CCCCACAGCATGCTCTT-3 ′ (complementary to nucleotides 248-263), then cloning into λgt10. About 2 × out of 1 × 10 ⁶ clones obtained
10 ⁵ clones were prepared from λPIN-α2 5 ′ 1
Screened with a 00 bp Eco RI- Bam HI fragment. Twelve out of 170 clones with positive crosses obtained were purified to obtain two clones (λPIN-S
12s, -S4s) was sequenced by the dideoxy method. The complete nucleotide sequence of the α-subunit cDNA was obtained by subcloning various restriction fragments from different λ isolates into M13 phage derivatives. E. FIG. The compacts were lysed by using the deoxyinosine mixture in combination with E. coli single chain binding protein (Pharmacia).

【０１０１】クローン化したインヒビン・β−サブユニ
ットcＤＮＡの単離 インヒビン・β−サブユニットの前駆体をコードしてい
るcＤＮＡ配列は、α−サブユニットの際に用いたもの
と同一のcＤＮＡライブラリーから得られた。重なり合
うcＤＮＡクローンは、始めに２つのＮ−末端・β−サ
ブユニット配列に基づく単独の長い合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドのプローブでスクリーニングし、次いで、
５'および３'の両方向に“歩く"プローブとして働く、
特徴づけがなされたcＤＮＡクローン由来の適当な制限
フラグメントでスクリーニングすることによって単離し
た(図４)。 Cloned inhibin β-subuni
The cDNA sequence encoding the precursor for the inhibin β-subunit was obtained from the same cDNA library used for the α-subunit. Overlapping cDNA clones were first screened with a single long synthetic oligodeoxynucleotide probe based on two N-terminal β-subunit sequences, then
Acts as a "walking" probe in both 5'and 3'directions,
Isolated by screening with the appropriate restriction fragments from the characterized cDNA clones (FIG. 4).

【０１０２】より詳細に説明すると、約２×１０⁵のオ
リゴ−dＴプライマー処理した卵巣cＤＮＡクローンを、
残基３２１〜３３９のアミノ酸配列に基づく５'末端標
識化β_Aオリゴヌクレオチド:More specifically, about 2 × 10 ⁵ oligo-dT primer-treated ovarian cDNA clones were cloned into
5'end-labeled β _A oligonucleotide based on the amino acid sequence of residues 321 to 339:

【化６６】５'−ＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴ
ＧＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴ
ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣ−３' でスクリーニングした。交雑が陽性であるものが５つ得
られ、そのうちの３つが、β_Aコード化配列(λＰＩＮ−
β_A２、−β_A４、−β_A８)を含有することを証明した。
λＰＩＮβ_A２由来の３'末端２１３bp ＥcoＲＩ−Ｐst
フラグメント(ヌクレオチド１６７９−１８９２)および
５'末端１５４bp ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ(ヌクレオチド
１５８−２９７)を用いて、α−鎖の特異的プライマー
処理ライブラリーからの２×１０⁵クローンおよび２×
１０⁶オリゴ−dＴプライマー処理化cＤＮＡクローンを
スクリーニングした。詳細に分析した１６のクローンの
他に、２つがより大きい５'末端を有することがわかり
(λＰＩＮ−β_A５Ｓ、−β_A２２)、そして１つのクロー
ン、λＰＩＮ−β_A２１は完全な３'−非翻訳領域を含有
していた。ブタインヒビンβ_BサブユニットcＤＮＡクロ
ーンは、特異的にプライマー処理したライブラリーから
の２×１０⁵クローンを、図１に記載されているＮＨ₂−
末端配列に基づくβ_Bオリゴヌクレオチド:Embedded image 5′-AAGAAGCAGTTCTTTTGT
GTCCTTCAAGGACATTTGCTGGAAT
Screened with GACTGGATCATTGC-3 '. Five positive crosses were obtained, three of which were β _A coding sequences (λ PIN-
It was proved to contain β _A 2, -β _A 4, and -β _A 8).
3'end 213 bp Eco RI-Pst derived from λPINβ _A 2
The fragment (nucleotides 1679-1892) and the 5'end 154 bp Eco RI- Hind III (nucleotides 158-297) were used to generate 2x10 ⁵ clones and 2x10 ⁵ clones from the α-chain specific priming library.
10 ⁶ oligo-dT primer treated cDNA clones were screened. In addition to the 16 clones analyzed in detail, two were found to have larger 5'ends
_{(λPIN-β A 5S, -β} A 22), and one clone, λPIN-β _A 21 contained the entire 3'-untranslated region. The porcine inhibin β _B subunit cDNA clone was a 2 × 10 ⁵ clone from the specifically primed library, NH ₂ − described in FIG.
Β _B oligonucleotides based on terminal sequence:

【化６７】５'−ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧ
ＧＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧ
ＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴ−
３' でスクリーニングすることによって単離した。陽性を示
したクローンについては、さらにオリゴヌクレオチド・
イノシン・プローブ:Embedded image 5′-GGCCTGGAGTGTGATGGG
GAGAACCAACCTGTCCTGCCGCCAG
GAATTTTTTCATCGATTTCAGGCT-
Isolated by screening 3 '. For positive clones,
Inosine probe:

【化６８】 [配列中、Ｉはイノシンを表す]でスクリーニングした
(これは、アミノ酸配列: ＱＱＦＦＩＤＦのための非コ
ード化鎖におけるすべての可能性をカバーしている)。[Chemical 68] [In the sequence, I represents inosine]
(This covers all possibilities in the non-coding strand for the amino acid sequence: QQFFIDF).

【０１０３】２種のクローン(λＰＩＮβ_B−１Ｓ、−２
Ｓ)を単離し、配列決定し、β_Bサブユニットをコードし
ていることを確認した。２３０bpのＥcoＲＩ−Ｓma(ヌ
クレオチド２１−２５１)フラグメントをλＰＩＮβ_B−
Ｉから単離し、これを交雑プローブとして用いて２×１
０⁶オリゴ−dＴプライム処理したcＤＮＡクローンをス
クリーニングした。陽性を示したものが２種類得られた
(λＰＩＮβ_B−３,４)。これらの重なり有ったクローン
のヌクレオチド配列を用いて、示されている配列を作成
した。すべての配列は、特異的なフラグメントをＭ１３
ファージベクター[メシング等、前記]にサブクローニン
グすることによって得た。上記に記載したＥcoＲＩ制限
部位はすべてcＤＮＡアダプターフラグメント中に含ま
れており、cＤＮＡ中に存在する配列を意味するもので
はない。Two clones (λPINβ _B -1S, -2
S) was isolated, sequenced and confirmed to encode the β _B subunit. A 230 bp Eco RI- Sma (nucleotide 21-251) fragment was inserted into λPINβ _B −.
2x1 isolated from I and used as a hybridization probe
0 ⁶ oligo -dT primed cDNA clones were screened. Two kinds of positive ones were obtained
(λPINβ _B -3,4). The nucleotide sequences of these overlapping clones were used to generate the sequences shown. All sequences contain a specific fragment M13
It was obtained by subcloning into a phage vector [Messing et al., Supra]. All of the Eco RI restriction sites described above are included in the cDNA adapter fragment and do not imply sequences present in the cDNA.

【０１０４】オリゴ−dＴプライマー処理したライブラ
リー由来の極めてわずかのクローン(２×１０⁵のうち４
つ)だけがインヒビンＡのβ−サブユニット用の合成プ
ローブと交雑することに我々は気付いた。これらのほと
んどはＤＮＡ配列分析によって正しいことが証明された
が、その３'末端においてポリＡホモポリマーがないこ
とから判断する限り、完全な３'−非翻訳化領域を含有
するものは全くない。ポリＡの尾部がないことは、ライ
ブラリー作成用に用いるポリメラーゼによって複製する
ことが困難であることを示す構造領域および／またはこ
のmＲＮＡ片における極めて長い３'−未翻訳化配列の存
在を示唆した。より多量(〜１０倍)のインヒビンβ_Aサ
ブユニットコード化配列が、予想外に、α−サブユニッ
トmＲＮＡ上を特異的にプライマー処理して作成したcＤ
ＮＡライブラリー中に見い出された。このライブラリー
を、α前駆体mＲＮＡがβサブユニットをもコードして
いるであろうという間違っていることが後に証明された
理論に基づいて、インヒビンＡのβ−鎖用の合成プロー
ブでスクリーニングした。このライブラリーにおける極
めて多量のインヒビンβ_A cＤＮＡを、後に、対応するm
ＲＮＡの３'−非翻訳化部分中の領域に対する、この特
異的なα鎖プライマーの偶然の相補性までトレースし
た。Very few clones (4 out of 2 × 10 ⁵ from the oligo-dT primed library)
We have found that only 3) hybridize with the synthetic probe for the β-subunit of inhibin A. Most of these proved to be correct by DNA sequence analysis, but none, as judged by the lack of poly A homopolymer at their 3'ends, contained the complete 3'-untranslated region. The lack of poly A tails suggested the presence of structural regions and / or extremely long 3'-untranslated sequences in this piece of mRNA that would be difficult to replicate by the polymerase used to generate the library. . A larger (~ 10-fold) inhibin β _A subunit coding sequence was unexpectedly created by specifically priming on the α-subunit mRNA.
Found in NA library. This library was screened with a synthetic probe for the β-strand of inhibin A, based on the subsequently proven theory that the α-precursor mRNA might also encode the β-subunit. . The extremely high amount of inhibin β _A cDNA in this library was later converted to the corresponding m
The accidental complementarity of this specific a-chain primer to a region in the 3'-untranslated portion of RNA was traced.

【０１０５】我々のライブラリーにおいては、インヒビ
ンＢのβサブユニットをコードしているクローン化cＤ
ＮＡが４つだけ見い出された。これらのクローンから得
られた配列情報によっては、対応する前駆体タンパク質
およびそのcＤＮＡの完全な構造を明らかにすることが
できなかった。βサブユニットの前駆体の推定タンパク
質構造およびcＤＮＡ配列を図５、図６、図７および図
８において比較する。インヒビンβ_AサブユニットcＤＮ
Ａのヌクレオチド配列は、その長さが３.６kbであり、
４２５アミノ酸からなるタンパク質(Ｍr〜４６Ｋ)のた
めのオープン・リーディング・フレーム[このうちＣ−
末端側１１６残基はβサブユニットプロパー(Ｍr〜１３
Ｋ)を表している]を含有している。このリーディング・
フレームはメチオニンで始まり、特徴的なシグナルペプ
チドをコードする配列がこれに続き、その真の長さは２
９残基であると考えられている。このコードされたβサ
ブユニットの前には一連の５個のアルギニンが存在し、
この位置でタンパク質加水分解的に前駆体から切断され
るものと推定される。αサブユニット前駆体と同様に、
このβ前駆体は数個の付加的な塩基残基対を含有し、こ
こで今まで未知であった生物学的に活性なペプチド物質
が放出されるものと考えられる。また、プロ領域(Ａs
n、残基１６５)にはＮ−結合グリコシル化が可能な部位
が１個含まれている。In our library, a cloned cD encoding the β subunit of inhibin B
Only four NAs were found. The sequence information obtained from these clones failed to reveal the complete structure of the corresponding precursor protein and its cDNA. The putative protein structures and cDNA sequences of precursors of β subunits are compared in FIGS. 5, 6, 7 and 8. Inhibin β _A subunit cDNA
The nucleotide sequence of A has a length of 3.6 kb,
Open reading frame for a protein consisting of 425 amino acids (Mr ~ 46K) [of which C-
The terminal 116 residues are β subunit proper (Mr ~ 13
K)] is included. This reading
The frame begins with methionine, followed by sequences encoding a characteristic signal peptide, the true length of which is 2
It is believed to be 9 residues. In front of this encoded β subunit is a series of 5 arginines,
It is presumed to be proteolytically cleaved from the precursor at this position. Similar to the α subunit precursor,
This β-precursor contains several additional base residue pairs, which are believed to release heretofore unknown biologically active peptide substances. In addition, professional area (As
n, residue 165) contains one site capable of N-linked glycosylation.

【０１０６】インヒビンＢのβサブユニットのこの推定
タンパク質配列は、β_Aサブユニット配列との高度な相
同性を示す。７１個のアミノ酸残基が同一であり、ほと
んどの変化はコンサーバティブ(保存的)なものである。
比較的程度は少ないが、配列相同性は両方のβサブユニ
ット前駆体のプロ領域にも見い出される。興味あること
に、極端にプリンに富む配列はコード化領域にはめった
に見られないが、このインヒビンβ_A前駆体をコードし
ているcＤＮＡ中には存在し、相同のβ_B前駆体をコード
しているcＤＮＡ中には見い出されることのない珍しい
アミノ酸配列になる。このことは、タンパク質配列を相
同性が最大になるように並べたときに、インヒビンのβ
_B前駆体由来の２２アミノ酸残基の欠陥となる。また、
このように並べると、両前駆体のシステイン位置に完全
な好一対をも生じさせる(図５、図６、図７および図８
を参照)。This putative protein sequence of the β subunit of inhibin B shows a high degree of homology with the β _A subunit sequence. The 71 amino acid residues are identical and most changes are conservative.
To a lesser extent, sequence homology is also found in the pro region of both β subunit precursors. Interestingly, extremely purine-rich sequences are rarely found in the coding region but are present in the cDNA encoding this inhibin β _A precursor and encode a homologous β _B precursor. It is a rare amino acid sequence that is not found in the present cDNA. This means that when the protein sequences are aligned for maximum homology, the β of inhibin
_{It is} a defect of 22 amino acid residues derived from the _B precursor. Also,
This alignment also gives rise to a perfect pair at the cysteine position of both precursors (Figure 5, Figure 6, Figure 7 and Figure 8).
See).

【０１０７】αおよびβ鎖前駆体mＲＮＡのノーザン分
析 卵巣の全ての、そしてポリアデニル化したＲＮＡを、配
列決定されたcＤＮＡをプローブとして用いるノーザン
法で分析して、ヘテロダイマー性インヒビン分子のβ_B
およびペプチドサブユニットαおよびβをコードしてい
るmＲＮＡのサイズおよび相対的豊富さについて評価し
た。ポリアデニル化したmＲＮＡ(２μg:レーンa、b、c
およびf; ８μg: レーンd)および全ＲＮＡ(１０μg: レ
ーンeおよびg)をホルムアルデヒド１.２％アガロースゲ
ルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターにプロッ
トした。以下に挙げる³²Ｐ−標識化したcＤＮＡフラグ
メントを、厳格な条件下、交雑プローブとして用いた。
レーンa: αサブユニットcＤＮＡからの２４０bp Ｅco
ＲＩ−ＳmaＩ(ヌクレオチド１３４−３７１); b: β_Aサ
ブユニットcＤＮＡからの１５４bp ＥcoＲＩ−ＨindＩ
ＩＩ(ヌクレオチド１５８−２９７); Ｃ: β_Bサブユニ
ットcＤＮＡからの２３０bp ＥcoＲＩ−Ｓma(ヌクレオ
チド２１−２５１); dおよびe: λＰＩＮ−α２のＥco
ＲＩ挿入体; fおよびg: λＰＩＮ−β_A５のＥcoＲＩ挿
入体。０.１Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを３回交換し
て、６０℃で２時間フィルターを洗浄した。 Northern components of α and β chain precursor mRNAs
All the analysis ovaries, and the polyadenylated RNA, the cDNA was sequenced and analyzed by Northern blotting using as a probe, the heterodimeric inhibin molecule beta _B
And the size and relative abundance of mRNAs encoding the peptide subunits α and β were evaluated. Polyadenylated mRNA (2 μg: lanes a, b, c
And f; 8 μg: lane d) and total RNA (10 μg: lanes e and g) were electrophoresed on a formaldehyde 1.2% agarose gel and plotted on a nitrocellulose filter. The ³² P-labeled cDNA fragments listed below were used as hybridization probes under stringent conditions.
Lane a: 240 bp Eco from α subunit cDNA
RI- Sma I (nucleotides 134-371); b: 154 bp Eco RI- Hind I from β _A subunit cDNA.
II (nucleotides 158-297); C: 230 bp EcoRI- Sma (nucleotides 21-251) from the β _B subunit cDNA; d and e: Eco of λPIN-α2.
RI inserts; f and _{g: λPIN-β A 5 Eco} RI insert of. The filter was washed at 60 ° C. for 2 hours by exchanging 0.1 × SSC and 0.1% SDS three times.

【０１０８】cＤＮＡクローニングから得られる結果で
示されるように、αおよびβmＲＮＡが異なる大きさお
よび量を有するものであることが分析によってわかった
(図９)。それぞれのバンドの強さからα前駆体mＲＮＡ
は、β_A前駆体のmＲＮＡに比べ少なくとも１０倍以上の
量であり、かつβ_B前駆体のmＲＮＡに比べ約２０倍以上
大きい量であると概算される。Analysis showed that the α and β mRNAs were of different size and quantity, as shown by the results obtained from cDNA cloning.
(Figure 9). From the intensity of each band, α precursor mRNA
Is estimated to be at least 10 times greater than the mRNA of β _A precursor and about 20 times greater than the mRNA of β _B precursor.

【０１０９】リボソームＲＮＡを大きさの標準として用
いると、単一の種であるこのα前駆体mＲＮＡはその長
さが〜１５００ヌクレオチドであり、これはクローン化
したcＤＮＡ配列とよく一致する大きさである(図２およ
び図３)。β_A前駆体mＲＮＡ配列は、長さが〜４.５およ
び〜７.２kbである２つの主な種で表される。全ＲＮＡ
に比べポリアデニル化したＲＮＡにおいての方が両方の
種の強度が高いことは、この４.５kbの種が、cＤＮＡプ
ローブと交雑する２８Ｓ ＲＮＡを表すものではないこ
とを示唆する。従って、図５、図６、図７および図８で
示されるβ前駆体cＤＮＡ配列が４.５kbのmＲＮＡを表
すと考えられ、β_AmＲＮＡの５'非翻訳化領域が約９０
０ヌクレオチドの長さであることを示唆する。このβ_B
前駆体は、大きさが約４.５kbである１つのmＲＮＡ以上
にコードされており、２つのβ_A mＲＮＡの約半分のレ
ベルで存在する。この２つのβmＲＮＡは密接に関係し
ているので、両mＲＮＡが同じ構造を有し、従って、こ
のβ_B mＲＮＡが恐らく長い５'および３'非翻訳化領域
(β_A mＲＮＡについて示されるものと同じ領域)を有す
るであろうということを予想することができる。異なる
ポリアデニル化シグナルを選択すれば７.２kbの種の存
在を説明しうるであろう。Using ribosomal RNA as a size standard, the single species, the α-precursor mRNA, is ~ 1500 nucleotides in length, which is a size well matched to the cloned cDNA sequence. Yes (FIGS. 2 and 3). The β _A precursor mRNA sequence is represented in two major species that are ˜4.5 and ˜7.2 kb in length. Total RNA
The higher intensity of both species in the polyadenylated RNA compared to that suggests that this 4.5 kb species does not represent 28S RNA that hybridizes with the cDNA probe. Therefore, the β-precursor cDNA sequence shown in FIGS. 5, 6, 7 and 8 is considered to represent a 4.5 kb mRNA, and the 5 ′ untranslated region of β _A mRNA is about 90.
Suggested to be 0 nucleotides in length. This β _B
The precursor is encoded by more than one mRNA, which is about 4.5 kb in size, and is present at about half the level of the two β _A mRNAs. Since the two β mRNAs are closely related, both mRNAs have the same structure, and therefore this β _B mRNA is likely to have long 5'and 3'untranslated regions.
It can be expected that it will have (the same region as shown for β _A mRNA). The choice of different polyadenylation signals could explain the presence of the 7.2 kb species.

【０１１０】形質転換成長因子−βとの相同性 完全なαおよびβインヒビンサブユニットはそれぞれ７
および９個のシステイン残基を含有している。システイ
ン残基を並べると、この２つのサブユニットが同様のシ
ステイン分布を分け合っており、そして、ある配列相同
性がこの残基のまわりに存在していること(図１０およ
び図１１)が明らかであり、両種類のサブユニットが１
つの前駆遺伝子に由来することを示唆している。驚くべ
きことに、このβ鎖と最近決定されたヒトＴＧＦ−βの
一次構造との間にかなりの相同性が見い出された。図１
０および図１１中に下線を引いたように、両ペプチドは
ほぼ等しい長さであり(インヒビンβ_Aサブユニット:１
１６;β_Bサブユニット:１１５;ＴＧＦＳ:１１６残基)、
それらのシステイン残基９個の著しく類似した分布を示
す。並べかえにこのシステイン“骨格"を用いると、こ
のβ_AおよびＴＧＦ−β配列は同一位置に３１個の付加
的な残基を有し、９つの相同場所にわずかな差異を示
す。同様の相同性の高さはβ_Bとβ−ＴＧＦの比較にお
いても見られる。よりうまく並べるためにある空白を導
入した(図１０および図１１)。全体の相同性は３５％で
あるが、ある部分(ブタインヒビンβ_A鎖残基１１〜４５
とＴＧＦ残基１５〜４９を比較して)では６０％に達
し、種の違いを考慮するとその相同性は極めて高い。興
味あることに、この相同性はそれぞれのcＤＮＡ中のタ
ンパク質合成のための停止コドンを越えて延びている。
従って、このＴＧＦ−βのcＤＮＡおよび両方のインヒ
ビンβサブユニットは極めてＧとＣに富む配列をこの領
域に含有し、またこれらは異常に長い５'および３'非翻
訳化領域を有している。 Homology with Transforming Growth Factor-β The complete α and β inhibin subunits are each 7
And contains 9 cysteine residues. Aligning the cysteine residues reveals that the two subunits share a similar cysteine distribution, and that some sequence homology exists around this residue (FIGS. 10 and 11). Yes, both types of subunits are 1
It is suggested that it is derived from one precursor gene. Surprisingly, considerable homology was found between this β chain and the recently determined primary structure of human TGF-β. FIG.
0 and underlined in FIG. 11, both peptides are of approximately equal length (inhibin β _A subunit: 1
16; β _B subunit: 115; TGFS: residue 116),
It shows a remarkably similar distribution of those 9 cysteine residues. Using this cysteine "backbone" for rearrangement, the β _A and TGF-β sequences have 31 additional residues at the same position and show slight differences at 9 homologous positions. Similar high homology is also seen in the comparison of β _B and β-TGF. Some white space was introduced for better alignment (Figs. 10 and 11). The overall homology is 35%, but some part (porcine inhibin β _A chain residues 11-45
And TGF residues 15-49), reaching 60%, and the homology is extremely high considering the difference in species. Interestingly, this homology extends beyond the stop codon for protein synthesis in the respective cDNA.
Thus, the TGF-β cDNA and both inhibin β subunits contain highly G and C rich sequences in this region, and they have unusually long 5 ′ and 3 ′ untranslated regions. .

【０１１１】ヒトおよびネズミのβ−ＴＧＦの間にはほ
とんど絶対的な相同性が存在するので、インヒビンのβ
サブユニットがヒトＴＧＦ−βのブタ等価物であるとい
うこの示唆を割り引いて考えることができる。これらの
知見は、インヒビンサブユニットとＴＧＦ−βの両者が
共通の祖先を有し、１種類の遺伝子の族に属するという
ことを強く示している。３種のペプチドすべては、同様
の大きさの前駆体(Ｍr〜４０Ｋ)から生じる(それらはＣ
−末端の１１０残基程度を占め、アルギニン対の所でタ
ンパク質加水分解切断によって放出される)。それらは
ホモまたはヘテロダイマーを形成し、生物学的に活性な
複合体中のサブユニットはジスルヒド架橋で結合する。
しかし、βサブユニットおよびＴＧＦペプチドの前にあ
る普通ではない残基を含有する領域は、制限されている
とはいえかなりの配列関連性を示すが、ＴＧＦ−βとβ
サブユニット間には、それらの前駆体のプロ部分におい
ては配列相同性が少ししか存在しない。Due to the almost absolute homology between human and murine β-TGF, β of inhibin
This suggestion that the subunit is the porcine equivalent of human TGF-β can be discounted. These findings strongly indicate that both the inhibin subunit and TGF-β have a common ancestor and belong to one gene family. All three peptides arise from similarly sized precursors (Mr-40K) (they are C
-Occupies about the terminal 110 residues and is released by proteolytic cleavage at the arginine pair). They form homo or heterodimers and the subunits in the biologically active complex are linked by disulfide bridges.
However, the region containing the β subunit and the unusual residues preceding the TGF peptide shows considerable sequence related, albeit limited, TGF-β and β.
There is little sequence homology between the subunits in the pro portion of their precursors.

【０１１２】実施例２ ブタインヒビンの組換え合成 ブタインヒビンの組換え合成に用いたプラスミドはpＳ
ＶＥ−Ｐ_αＢ_AＩnh−ＤＨＦＲである。このプラスミド
の構築法を図１２、図１３および図１４に示すが、これ
を以下のようにして行った。pＨＢＳ３４８−Ｅ(ＥＰ０
０７３６５６Ａ)をＥcoＲＩで部分消化し、Ｅ．コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩ(クレノウフラグメント)および４種
のdＮＴＰで平滑にし、ライゲートし、そしてライゲー
ション混合物をＥ．コリ２９４(ＡＴＴＣ３１４４６)に
導入して形質転換した。この形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別
した。ＳＶ４０初期プロモーターの前にあるＥcoＲＩ部
位の欠失に対してプラスミドをスクリーニングした。こ
の欠失部位を有するプラスミドをpＨＢＳ３４８−ＥＩ
Ｉと称する。 Example 2 Recombinant Synthesis of Porcine Inhibin The plasmid used for the recombinant synthesis of porcine inhibin was pS.
A _{VE-P α B A Inh-} DHFR. The construction method of this plasmid is shown in FIGS. 12, 13 and 14, which was carried out as follows. pHBS348-E (EP0
073656A) was partially digested with Eco RI to give E. Kori D
NA polymerase I (Klenow fragment) and 4 dNTPs were blunted, ligated, and the ligation mixture was transformed into E. coli. Escherichia coli 294 (ATTC31446) was introduced and transformed. This transformed culture was plated on ampicillin medium plates to select resistant colonies. Plasmids were screened for deletion of the Eco RI site in front of the SV40 early promoter. The plasmid having this deletion site was designated as pHBS348-EI.
Called I.

【０１１３】pＨＢＳ３４８−ＥＩＩをＥcoＲＩおよび
ＥcoＲＩで消化して２種のフラグメント、すなわちＳＶ
４０初期プロモーター、pmＬ−Ａmp^r配列およびＨＢsＡ
g３'非翻訳化領域を含有するフラグメントＩ、並びにＨ
ＢsＡg(肝炎Ｂ抗原)コード化配列を含有するフラグメン
ト２を得た。PHBS348-EII was transformed with Eco RI and
Digested with Eco RI to produce two fragments, SV
40 early promoter, pmL-Amp ^r sequence and HBsA
Fragment I containing the g3 'untranslated region, and H
Fragment 2 was obtained containing the BsAg (hepatitis B antigen) coding sequence.

【０１１４】ブタインヒビンβ_Aサブユニットのコード
化領域を含有するλＰＩＮβ_A５sをＥcoＲＩおよびＳma
Ｉで消化し、β_Aコード化領域を含有する１３３５bpの
フラグメント(フラグメント３)をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で回収した。アガロースゲル電気泳動で回収
したフラグメントＩをフラグメント３にライゲートし、
このライゲーション混合物をＥ．コリ株２９４(ＡＴＣ
Ｃ ３１４４６)に導入して形質転換した。この形質転
換培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養し、
耐性コロニーを選別した。プラスミドＤＮＡを形質転換
体から調製し、制限分析によって正しいＤＮＡフラグメ
ントの存在を確認した。このプラスミドをpＳＶＥ−pβ
_AＩnhと称する。ΛPINβ _A 5s containing the coding region of the porcine inhibin β _A subunit was transformed with Eco RI and Sma.
Digested with I and the 1335 bp fragment containing the β _A coding region (fragment 3) was recovered by polyacrylamide gel electrophoresis. The fragment I recovered by agarose gel electrophoresis was ligated to fragment 3,
This ligation mixture was transformed into E. Coli strain 294 (ATC
C 31446) and transformed. This transformant culture was plated on ampicillin medium plates,
Resistant colonies were selected. Plasmid DNA was prepared from the transformants and restriction analysis confirmed the presence of the correct DNA fragment. This plasmid was designated as pSVE-pβ
_It is called _A Inh.

【０１１５】pＨＢＳ３４８−Ｅ(ＥＰ ００７３６５６
Ａ)をＥcoＲＩで部分的に消化し、Ｅ．コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ(クレノウフラグメント)および４種のdＮＴ
Ｐで平滑にし、ＳalＩ認識部位を含有する合成オリゴヌ
クレオチド:PHBS348-E (EP 0073656)
A) was partially digested with Eco RI to give E. E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) and 4 dNTs
Synthetic oligonucleotides blunted with P and containing a Sal I recognition site:

【化６９】５'−ＧＧＴＣＧＧＡＣＣ−３' にライゲートした。この形質転換培養物をアンピシリン
培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別し
た。プラスミドを余分のＳalＩ制限部位の存在について
スクリーニングした。プラスミドＤＮＡをこの構築物か
ら調製した(pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩ)。Ligated to 5'-GGTCGGACC-3 '. This transformed culture was plated on ampicillin medium plates to select resistant colonies. Plasmids were screened for the presence of extra Sal I restriction sites. Plasmid DNA was prepared from this construct (pHBS348-ESalI).

【０１１６】λＰＩＮα−１２sおよびλＰＩＮα−２
をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化した。５'コード化領
域を含有するλＰＩＮα−１２sからの１０４bp ＥcoＲ
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントおよび中央部分と３'コード
化領域を含有するλＰＩＮα−２からの１２４６bp Ｅc
oＲＩ−ＢamＨＩを回収し、一緒にしてライゲートし
た。このライゲーション混合物をＥcoＲＩで消化し、酵
素を熱変性し、混合物をＥcoＲＩ消化したpＵＣ９(ＢＲ
Ｌ)にライゲートした。組換え体を選別し、制限分析に
よって確認した。ＤＮＡを正しいプラスミドから調製し
た(pＰＩＮα)。ΛPINα-12s and λPINα-2
Was digested with Eco RI and Bam HI. 5 '104 bp Eco from λPINα-12s containing the coding region R
1246 bp Ec from λPINα-2 containing the I- Bam HI fragment and the central part and the 3'coding region.
o RI- Bam HI was recovered and ligated together. This ligation mixture was digested with Eco RI, the enzyme was heat denatured, and the mixture was digested with Eco RI pUC9 (BR
L) was ligated. Recombinants were selected and confirmed by restriction analysis. DNA was prepared from the correct plasmid (pPINα).

【０１１７】ブタα−インヒビンの完全なコード化領域
を含有するpＰＩＮαをＮcoＩおよびＥcoＲＩで消化
し、４dＮＴＰの存在下、Ｐol(Ｉ)Ｋで充填し、１２８
０bpのフラグメント(フラグメント４)をゲル電気泳動で
回収した。pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩをＳstＩＩおよび
ＨindＩＩＩで消化し、４dＮＴＰの存在下、Ｐol(Ｉ)Ｋ
で充填し、ＰＭＬ−Ａmpr領域、ＳＶ４０初期プロモー
ターおよびＨＢsＡg３'非翻訳化領域を含有するフラグ
メント５をゲル電気泳動で回収した。フラグメント４お
よび５を一緒にしてライゲートし、このライゲーション
混合物を用いてＥ．コリ２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)
を形質転換した。組換え体をアンピシリン培地プレート
上での増殖によって選別した。目的の組換え体をpＳＶ
Ｅ−ＰαＩnhと称する。[0117] The pPINα containing the complete coding region of the porcine α- inhibin was digested with Nco I and Eco RI, the presence of four dNTP, filled with Pol (I) K, 128
The 0 bp fragment (fragment 4) was recovered by gel electrophoresis. pHBS348-ESalI and SstII and
Digested with Hind III, Pol (I) K in the presence of 4dNTPs
The fragment 5 containing the PML-Ampr region, SV40 early promoter and HBsAg 3'untranslated region was recovered by gel electrophoresis. Fragments 4 and 5 were ligated together and this ligation mixture was used to transform E. coli. Coli 294 (ATCC 31446)
Was transformed. Recombinants were selected by growth on ampicillin medium plates. The target recombinant is pSV
It is called E-PαInh.

【０１１８】pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩをＳalＩおよび
ＨindＩＩＩで消化し、pＭＬ−ＡmprおよびＳＶ４０初
期プロモーターを含有するフラグメント６をゲル電気泳
動で回収した。pＦＤＩＩ(ＥＰ １１７,０６０Ａ)をＳa
lＩおよびＨindＩＩＩで消化し、ＨＢsＡg３'非翻訳化
領域と融合した正常なマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する
フラグメント７を回収した。フラグメント６および７を
ライゲートし、このライゲーション混合物でＥ．コリ株
２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換した。この形質
転換培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養
し、耐性コロニーを選別した。プラスミドＤＮＡを形質
転換体から調製し、制限分析によって正しいＤＮＡフラ
グメントの存在を確認した。この構築物をpＦＤＩＩ−
ＳalＩと称する。PHBS348-ESalI was replaced with SalI and
Digested with Hind III and fragment 6 containing pML-Ampr and SV40 early promoter was recovered by gel electrophoresis. pFDII (EP 117,060A) to Sa
was digested with l I and Hind III, it was recovered fragment 7 containing the normal mouse DHFR gene fused to HBsAg 'untranslated region. Fragments 6 and 7 were ligated and E. coli was added to this ligation mixture. E. coli strain 294 (ATCC31446) was transformed. This transformed culture was plated on ampicillin medium plates to select resistant colonies. Plasmid DNA was prepared from the transformants and restriction analysis confirmed the presence of the correct DNA fragment. This construct was designated pFDII-
It is called SalI.

【０１１９】pＳＶＥ−ＰαＩnhをＳalＩで消化し、Ｈ
ＢsＡg３'非翻訳化領域と融合したα−インヒビンコー
ド化領域およびＳＶ４０初期プロモーターを含有するフ
ラグメント８を回収した。pＦＤＩＩ−ＳalＩをＳalＩ
で消化し、ＨＢsＡg３'非翻訳化領域と結合したマウス
ＤＨＦＲコード化領域およびＳＶ４０初期プロモーター
を含有するフラグメント９を回収した。pＳＶＥ−β_AＩ
nhをＳalＩ消化して直線化し、フラグメント８および９
と３成分ライゲーションでライゲートした。このライゲ
ーション混合物でＥ．コリ株２９４(ＡＴＣＣ３１４４
６)を形質転換した。この形質転換培養物をアンピシリ
ン培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別し
た。３つのＳＶ４０初期プロモーターからの転写が同一
の方向に進行するように、フラグメント８および９が正
しい方向で存在しているかどうかについて形質転換体を
スクリーニングした。この最終のプラスミドをpＳＶＥ
−Ｐαβ_AＩnh−ＤＨＦＲと称する。PSVE-PαInh was digested with Sal I and H
Fragment 8 was recovered containing the α-inhibin coding region fused to the BsAg 3 ′ untranslated region and the SV40 early promoter. pFDII-SalI a Sal I
The fragment 9 containing the mouse DHFR coding region linked to the HBsAg 3'untranslated region and the SV40 early promoter was recovered. pSVE-β _A I
nh was linearized with Sal I to give fragments 8 and 9
And ligated by three-component ligation. E. coli with this ligation mixture. E. coli strain 294 (ATCC3144
6) was transformed. This transformed culture was plated on ampicillin medium plates to select resistant colonies. Transformants were screened for the presence of fragments 8 and 9 in the correct orientation so that transcription from the three SV40 early promoters proceed in the same orientation. This final plasmid is called pSVE
-Pαβ _A Inh-DHFR.

【０１２０】プラスミドpＳＶＥ−Ｐαβ_AＩnh−ＤＨＦ
ＲをＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞[ウルラウブおよびチャー
ジン(Ｕrlaub and Ｃhasin)、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐ
ＮＡＳ)、７７、４２１６−４２２０(１９８０)]中にト
ランスフェクションした。しかし、すべてのＤＨＦＲ^-
哺乳動物宿主細胞がこのプラスミドの使用に適してい
る。あるいはまた、宿主細胞をネオマイシン耐性をコー
ドしているプラスミドで同時形質転換するときには、す
べての哺乳動物宿主細胞が使用でき、この場合、形質転
換体は、ネオマイシン含有培地において増殖しうるその
能力によって同定される。Plasmid pSVE-Pαβ _A Inh-DHF
R for DHFR deficient CHO cells [Urlaub and Chasin, Proceedings.
Of National Academy of Science (P
NAS), 77 , 4216-4220 (1980)]. However, all of the DHFR ^-
Mammalian host cells are suitable for use with this plasmid. Alternatively, all mammalian host cells can be used when co-transforming the host cells with a plasmid encoding neomycin resistance, in which case the transformants are identified by their ability to grow in neomycin-containing medium. To be done.

【０１２１】このトランスフェクションしたＣＨＯ細胞
を１５ＨＧＴ^-培地で培養して選別した。この細胞を直
径１５cmのプレート中、集密状態になるまで増殖させ
た。次いで、細胞を集める前に、血清を含まない培地で
４８時間培養した。ヒト血清アルブミン１００mgを加え
た後、上清培地５０mlを凍結乾燥した。残留物を１％ウ
シ胎児血清のＨＤＭＥＭ[ギブコ・ラボラトリーズ(ＧＩ
ＢＣＯ Ｌaboratories)、Ｓanta Ｃlara、ＣＡ]溶液
３mlに再溶解し、マイレックス−ＧＳ ０.２２mＭフィ
ルター[Ｍillex−ＧＳ、ミリポアー社(Ｍillipere Ｃo
rp．)、Ｂedford、ＭＡ]で濾過し、正副対で検定した。The transfected CHO cells were selected by culturing in 15HGT ^- medium. The cells were grown in 15 cm diameter plates to confluence. The cells were then cultured in serum-free medium for 48 hours before harvesting. After adding 100 mg of human serum albumin, 50 ml of the supernatant medium was freeze-dried. The residue is 1% fetal bovine serum in HDMEM [Gibco Laboratories (GI
BCO Laboratories), Santa Clara, CA] redissolved in 3 ml of solution, Millex-GS 0.22 mM filter [Millex-GS, Millipore Co.
rp. ), Bedford, MA] and calibrated with ortho pair.

【０１２２】形質転換体上清におけるインヒビンのホル
モン様活性を、ラット下垂体前葉単層培養物を用いる試
験管内バイオアッセイによって測定した[ベール等(Ｖal
e,Ｗ．et al.)、エンドクリノロジー(Ｅndocrinolog
y)、９１、５６２−５７２(１９７２)]。簡単に説明す
ると、生後２１日目の雌ラット下垂体前葉を集め、酵素
的に分散し、１日目は２４−ウエル組織培養プレート
[ファルコン・プラスチック(Ｆalcon Ｐlastic)、Ｏxn
ard、ＣＡ]に入れ、１０％ウシ胎児血清のＨＤＭＥＭ
(前記)溶液中で平板培養した。２日目に培地１％ウシ胎
児血清のＨＤＭＥＭ溶液に交換し、形質転換体培地試料
を加え、さらに４８時間インキュベーションを続けた。
次いで、この単層培地を集め、“ＮＩＡＤＤＫＤの下垂
体ホルモンプログラム"から入手した材料を用い、放射
線免疫検定(ＲＩＡ)によってＬＨおよびＦＳＨ含量を測
定した。この検定において、インヒビンを含有するＣＨ
Ｏ細胞培養物は、インキュベーション培地だけを与えた
対照下垂体細胞と比較すると、基礎的なＦＳＨの放出を
阻害するが、ＬＨは阻害しない。形質転換体上清中で検
知されたブタインヒビンの量は２０ng／mlであり、純粋
なブタ卵巣インヒビンで得られた用量−反応曲線に相応
する曲線を示した。The hormone-like activity of inhibin in transformant supernatants was measured by an in vitro bioassay using rat anterior pituitary monolayer cultures [Vale et al.
e, W. et al.), Endocrinology (Endocrinolog
y), 91 , 562-572 (1972)]. Briefly, 21-day old female rat anterior pituitary glands were collected, enzymatically dispersed, and on day 1 24-well tissue culture plates.
[Falcon Plastic, Oxn
ard, CA] and HDMEM with 10% fetal bovine serum
Plated in solution (as above). On day 2, the medium was replaced with a 1% fetal bovine serum solution in HDMEM, a transformant medium sample was added, and the incubation was continued for a further 48 hours.
The monolayers were then collected and LH and FSH contents were measured by radioimmunoassay (RIA) using materials obtained from the "NIADDKD Pituitary Hormone Program". In this assay, CH containing inhibin
O cell cultures inhibit basal FSH release but not LH when compared to control pituitary cells fed with incubation medium alone. The amount of porcine inhibin detected in the transformant supernatant was 20 ng / ml, showing a curve corresponding to the dose-response curve obtained with pure porcine ovary inhibin.

【０１２３】免疫学的な交叉反応性をサンドイッチ型放
射線免疫検定によって検定する。フロイントの完全アジ
ュバント中、ブタインヒビンをウサギに経皮投与するこ
とによって免疫化し、精製ブタ卵胞インヒビンに対する
ウサギ抗血清を高める。抗血清中の抗インヒビンの存在
は、抗血清を精製ブタインヒビンとともにインキュベー
ションし、常法、例えばゲル濾過によって免疫複合体の
生成を検定して測定する。この抗血清の一部を、ヤギ−
抗−ウサギＩgＧを予め塗布したポリスチレン試験管に
塗布する。組換え培養物上清あるいは抽出物をリン酸緩
衝食塩水で希釈し、上記の塗布試験管に加え、一晩イン
キュベートし、洗浄する。ウサギ抗血清の別の一部をこ
の試験管に加え、インキュベートし、洗浄する。放射線
ヨウ素化したヤギ抗ウサギＩgＧをこの試験管に加え、
インキュベートし、未結合のヤギ抗血清を洗浄して除去
する。試験管での結合数から明白であるように(これ
は、非形質転換宿主細胞からの抽出物または培養培地で
インキュベートした対照群のそれを上回る)、この組換
えによって生成したインヒビンはウサギ抗血清と交叉反
応する。Immunological cross-reactivity is assayed by sandwich radioimmunoassay. Rabbit antiserum against purified porcine follicle inhibin is immunized by transdermal administration of porcine inhibin in complete Freund's adjuvant to rabbits. The presence of anti-inhibin in the antiserum is determined by incubating the antiserum with purified porcine inhibin and assaying for the formation of immune complexes by standard methods such as gel filtration. A part of this antiserum was
Apply anti-rabbit IgG to precoated polystyrene test tubes. Recombinant culture supernatants or extracts are diluted with phosphate buffered saline and added to the above coated test tubes, incubated overnight and washed. Another portion of rabbit antiserum is added to the tube, incubated and washed. Radioiodinated goat anti-rabbit IgG was added to the tube,
Incubate and wash away unbound goat antiserum. As evidenced by the number of bindings in the test tube (which is higher than that of the control group incubated with extracts or culture medium from non-transformed host cells), this recombinantly produced inhibin was rabbit antiserum. Cross-react with.

【０１２４】実施例３ ヒトインヒビンベクターの構築および組換え細胞培養物
−Ｉ中でのヒトインヒビンの発現 完全なブタおよびヒトβ_A鎖が同一であるという発見に
より、ヒトインヒビンαβ_Aの発現は容易である。すな
わち、ヒトインヒビン発現用ベクターの構築は、ブタβ
_AをコードしているcＤＮＡを含有する、実施例１のプラ
スミドpＳＶＥ−β_Aから行うことができる。 Example 3 Construction of human inhibin vector and recombinant cell culture
Expression of human inhibin in -I Expression of human inhibin αβ _A is straightforward due to the finding that the intact porcine and human β _A chains are identical. That is, the construction of a vector for expressing human inhibin was carried out using porcine β
It can be carried out from the plasmid pSVE-β _{A of} Example 1, which contains the cDNA encoding _A.

【０１２５】卵巣mＲＮＡ１０μgから調製したヒト卵巣
cＤＮＡのλgt１０ライブラリーを、α、β_Aおよびβ_B
鎖をコードしている放射線リン酸標識化ブタcＤＮＡを
用いて、サザン分析にかけた。λＨＩＮα−２はヒトα
インヒビン鎖のコード化領域を含有することが確認され
た。ヒトαインヒビンの場合の雑種化クローンの割合
は、ブタαインヒビンについて見い出されるそれよりか
なり低く、αＩnh用のブタcＤＮＡの６８５bp ＳmaＩフ
ラグメントと交雑したヒトクローン１００,０００個
中、１個の位である。β鎖クローンもまれであり、β_B
クローンはβ_Aの約３倍量存在する(クローン１,０００,
０００個中、それぞれ１個および３個である)。β鎖ク
ローンのすべては完全な長さのものではない。これらを
プライマー処理したcＤＮＡライブラリーで補充し、通
常ブタcＤＮＡについて上記したようにして組立てた。
このλ挿入体をＥcoＲＩ消化して回収した。Human ovary prepared from 10 μg of ovarian mRNA
The λgt10 library of cDNA was loaded with α, β _A and β _B
Radiophosphate labeled porcine cDNA encoding the strand was used for Southern analysis. λHINα-2 is human α
It was confirmed to contain the coding region of the inhibin chain. The proportion of hybridized clones in the case of human α-inhibin is significantly lower than that found for porcine α-inhibin, at 1 position in 100,000 human clones crossed with the 685 bp Sma I fragment of the porcine cDNA for αInh. is there. β chain clones are also rare, β _B
Clones are present in approximately three times the amount of β _A (clone 1,000,
There are 1 and 3 of 000). Not all β chain clones are full length. These were supplemented with a primed cDNA library and assembled as described above for normal porcine cDNA.
This λ insert was digested with Eco RI and recovered.

【０１２６】プラスミドpＨＩＮα−２をＮcoＩおよび
ＳmaＩで消化し、ゲル電気泳動によって１０４９bp１５
フラグメント(フラグメント１０)を回収した。pＰinα
(実施例２)をＥcoＲＩおよびＰvuＩＩで消化した。９８
bpフラグメント(フラグメント１１)をゲル電気泳動によ
って回収した。フラグメント１０および１１をアダプタ
ーＩ:[0126] The plasmid pHINα-2 Nco I and
Digested with Sma I and 1049bp15 by gel electrophoresis
The fragment (fragment 10) was recovered. pPinα
Example 2 was digested with Eco RI and Pvu II. 98
The bp fragment (fragment 11) was recovered by gel electrophoresis. Fragments 10 and 11 with adapter I:

【化７０】５'−ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴ
ＧＧＣＣＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ
ＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣ−３' に、アダプターＩの相補体であるアダプターＩＩと組み
合わせてライゲートした。得られた１２０８bpフラグメ
ント(フラグメント１２)を４dＮＴＰおよびＰol(Ｉ)の
クレノウフラグメントで処理し、ＨindＩＩＩおよびＳa
cＩＩで制限消化して実施例１に記載のようにして平滑
末端にしておいたpＨＢＳ３４８−ＥＳalＩにライゲー
トした。別法では、ＨpaＩＩ部位の上流(すなわち、ブ
タ配列の最初の２１残基)をコードしているフラグメン
トを回収しながら、pＰinαをＥcoＲＩおよびＨpaＩＩ
で消化した。この別法において用いたアダプターを以下
に示す：[Chemical Formula 70] 5'-CTGCTCCTCTTGCTGTT
GGCCCCACGGAGTGGGGCATGGCTGC
CAGGGGCCCGGAGCTGGACC-3 ′ was ligated in combination with adapter II, the complement of adapter I. The resulting 1208 bp fragment (fragment 12) was treated with 4dNTPs and Klenow fragment of Pol (I) to give Hind III and Sa
It was ligated to pHBS348-ESalI which had been blunt ended as described in Example 1 by restriction digestion with cII. Alternatively, pPinα was reconstituted with Eco RI and Hpa II while recovering the fragment encoding upstream of the Hpa II site (ie, the first 21 residues of the pig sequence).
Digested with. The adapters used in this alternative are shown below:

【化７１】５’ＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣ３' ３' ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧ５' 正しく配向したフラグメント１２を有するプラスミドp
ＳＶＥ−ＨαＩnhを形質転換体の配列文節によって同定
した。従って、この構築物(pＳＶＥ−ＨαＩnh)は、ブ
タシグナル配列の最初の２４残基を、プレプロヒトイン
ヒビンである残部とともに含有する。プラスミドpＳＶ
Ｅ−Ｈα鎖ＩnhをＳalＩで消化した。ＳＶ４０プロモー
ターおよびヒトインヒビン配列を含有するフラグメント
を、フラグメント９およびＳalＩ消化したpＳＶＥ−β_A
Ｉnh(実施例２)にライゲートした。pＳＶＥ−hαβ_AＩn
h−ＤＨＦＲ１と称するこの最終プラスミドをＤＨＦＲ
欠失のＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし、実施例
２に記載のようにして選別した。この培養物の上清はホ
ルモン的に活性なヒトインヒビンを含有していた。Embedded image 5'CGGAGCTCGACC3 '3'CTCGAGCTGG5' Plasmid p with the correctly oriented fragment 12
SVE-HαInh was identified by the sequence clauses of the transformants. Therefore, this construct (pSVE-HαInh) contains the first 24 residues of the porcine signal sequence, with the remainder being preprohuman inhibin. Plasmid pSV
The E-H α chain Inh was digested with Sal I. The fragment containing the SV40 promoter and human inhibin sequence was digested with fragment 9 and Sal I to pSVE-β _A.
Ligated to Inh (Example 2). pSVE-hαβ _A In
This final plasmid, called h-DHFR1, is called DHFR
Transfected into deficient CHO cells and sorted as described in Example 2. The supernatant of this culture contained hormonally active human inhibin.

【０１２７】実施例４ ヒトインヒビンベクターの構築および組換え細胞培養物
−ＩＩにおけるヒトインヒビンの発現 本実施例は、ブタβ_Bプレプロ領域の代わりにヒトイン
ヒビンβ_Bのプロ配列を用いること以外は実施例３と同
様である。 Example 4 Construction of human inhibin vector and recombinant cell culture
Expression of human inhibin in -II This example is similar to Example 3 except that the human inhibin β _B prosequence was used in place of the porcine β _B prepro region.

【０１２８】実施例３のラムダgt１０ライブラリーは、
実施例３に記載したように、λＨＩＮα２を、λＨＩＮ
β_A−５および−１４とともに生成した。この後者２種
類のファージを用い、λＨＩＮβ_A−５の３１１bp Ｅc
oＲＩ−ＨindＩＩＩフラグメント(フラグメント１３)を
λＨＩＮβ_A−１４の１１０１bp ＨindＩＩＩ−ＨpaＩ
フラグメント(フラグメント１４)にライゲートし、この
混合物をＥcoＲＩ−ＳmaＩ消化したmp１８ベクター(バ
イオラブズ)中でライゲートして、完全長さのβ_Aコード
化cＤＮＡを構築した。クローンを適切な大きさの挿入
体についてスクリーニングし、選別した。二本鎖にする
ため、正しい挿入体を含有するmp１８ベクターをＤＮＡ
ポリメラーゼ(Ｉ)および４種のdＮＴＰで処理し、次い
で、ＸbaＩで消化し(これはmp１８ポリリンカー配列内
を切断する)、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび４種のdＮＴ
Ｐで平滑にし、そしてＥcoＲＩで消化した。１３２０bp
のフラグメント(フラグメント１５)を、実施例２のＥco
ＲＩ−ＥcoＲＶフラグメント１にライゲートした。この
ライゲーション混合物を用いてＥ．コリ２９４細胞を形
質転換した。クローンをサザン・ハイブリダイゼーショ
ンでスクリーニングし、制限分析で確認した。hＩnhβ_A
コード化配列を含有するこのクローンをpＳＶＥ−humβ
_AＩnhと称する。ヒトβ_Aコード化配列およびヒトα−イ
ンヒビン配列をＤＨＦＲ遺伝子とともに含有するプラス
ミドを、上記に略述したようにしてプラスミドpＳＶＥ
−humβ_AＩnh、pＳＶＥ−ＨαＩnhおよびpＦＤＩＩＳal
Ｉから構築する。すなわち、ヒトαインヒビンおよびＤ
ＨＦＲ遺伝子を含有するpＦＤＩＩＳalＩおよびpＳＶＥ
−ＨαＩnh由来のＳalフラグメントをＳalＩ消化したp
ＳＶＥ−humβ_AＩnhとライゲートし、３種の遺伝子全部
を含有するクローンを同定した。pＳＶＥ−humαβ_A Ｉ
nh−ＤＨＦＲ２と称するこのプラスミドをＤＨＦＲ^-Ｃ
ＨＯ細胞中にトランスフェクションし、ght^-培地で培養
して選別した。２４のクローンを取り出し、ＣＨＯ細胞
に対する通常の条件下、ght^-培地で２日間集密状態にな
るまで増殖させ、さらに２日間そのままにしておき、次
いで、この培養培地を、上記のラット下垂体細胞検定を
用いてインヒビンおよびアクチビン活性について検定し
た。４つのクローンがかなりの量のヒトαβ_Aインヒビ
ンを分泌することがわかった(hαβ_A−８、１２、１４
および１８)。クローンそれぞれの培養培地中のレベル
はそれぞれ１２５、１２５、２００および２５０ng／ml
であった。別のクローン(hαβ_A−１１)は、このクロー
ンについて培養培地におけるα鎖免疫反応性の欠如およ
び生物学的活性によって測定する限り、検知しうるイン
ヒビンは全く産生しないが、β_Aβ_Aホモダイマーとして
アクチビンを産生した。クローンhαβ_A−１６はα鎖だ
けを分泌し、アクチビンまたはインヒビン活性を欠いて
いた。The lambda gt10 library of Example 3 is:
As described in Example 3, λHINα2 was replaced with λHINα2.
Produced with β _A -5 and -14. Using these latter two types of phage, 311 bp Ec of λHINβ _A- 5
o The RI- Hind III fragment (fragment 13) was replaced with the 1101 bp Hind III- Hpa I of λHINβ _A- 14.
This fragment was ligated to the fragment (fragment 14) and this mixture was ligated into the Eco RI- Sma I digested mp18 vector (Biolabs) to construct the full length β _A encoding cDNA. Clones were screened and screened for inserts of the appropriate size. The mp18 vector containing the correct insert was made into DNA to make it double-stranded.
Treated with polymerase (I) and 4 dNTPs, then digested with Xba I (which cleaves within the mp18 polylinker sequence), DNA polymerase I and 4 dNTs
Smoothed with P and digested with Eco RI. 1320bp
The fragment (Fragment 15), in Example 2 Eco
Ligated to RI- Eco RV fragment 1. This ligation mixture was used to transform E. E. coli 294 cells were transformed. Clones were screened by Southern hybridization and confirmed by restriction analysis. hInhβ _A
This clone containing the coding sequence was named pSVE-humβ.
_It is called _A Inh. _A plasmid containing the human β _A coding sequence and the human α-inhibin sequence together with the DHFR gene was constructed as described above in plasmid pSVE.
-Humβ _A Inh, pSVE-Hα Inh and pFDIISal
Build from I. That is, human α inhibin and D
PFDIISalI and pSVE containing the HFR gene
-The Sal fragment from HαInh was Sal I digested p
_A clone was ligated with SVE-humβ _A Inh and a clone containing all three genes was identified. pSVE-humαβ _AI
This plasmid, called nh-DHFR2, was designated as DHFR ^- C.
Transfection into HO cells, culturing in ght ^- medium and selection. Twenty-four clones were picked and grown under normal conditions for CHO cells in ght ^- medium for 2 days until confluent and left for another 2 days, then this culture medium was used to transform the rat pituitary cells described above. The assay was used to assay for inhibin and activin activity. It was found that four clones secreted a significant amount of human αβ _A inhibin (hαβ _A- 8, 12, 14
And 18). The levels in the culture medium of each clone were 125, 125, 200 and 250 ng / ml, respectively.
Met. Another clone (hαβ _A -11), as long as the measured for this clone by the absence and biological activity of α-chain immunoreactivity in the culture medium, but do not produce inhibin that may be detected at all, as beta _A beta _A homodimer Produced activin. Clone hαβ _A- 16 secreted only the α chain and lacked activin or inhibin activity.

【０１２９】実施例５ ヒトアクチビンの組換え発現 ベール等(Ｖale et al.、同じ)およびリング等(Ｌing e
t al.、同じ)が報告しているように、β鎖Ａおよび／ま
たはＢのホモダイマーおよびヘテロダイマーは、下垂体
においてインヒビンの逆効果を有し、ＦＳＨを阻害する
よりむしろ誘起する。これらのタンパク質を一括してア
クチビンと称するが、これらを実施例４に記載したよう
にして、αおよびβ鎖共形質転換体において調製する。
しかし、最初のトランスフェクションがα鎖遺伝子を含
有しないベクターあるいはベクター群で行なわれたとき
には、適切な形質転換体を探すためのスクリーニングは
幾分少なくてもよい。適切なベクターは、上記のベクタ
ーからα鎖遺伝子を切除することによって容易に構築さ
れる。実施例４からのプラスミドpＳＶＥ−humβ_AＩnh
をＳalＩで消化し、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するフラグメ
ント９(実施例２)にライゲートする。このライゲーショ
ン混合物を用いてＥ．コリ２９４細胞をトランスフェク
ションし、β鎖ＤＮＡと雑種化しているが、α鎖配列と
は雑種化していないことに基づいてコロニーを選別し
た。α鎖ＤＮＡを削除したクローンpＳＶＥ−humβ_AＩn
h−ＤＨＦＲを同定した。このクローンを上記のように
してＤＨＦＲ^-ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし
た。形質転換体が培養培地中にアクチビンを分泌するこ
とを確認した。同様に、β_Bコード化配列(ヒトβ_Aの最
初の３４アミノ酸をコードしているＤＮＡをヒトβ_B鎖
の残りのコード化配列にライゲートして再構築される)
を含有する発現ベクターは容易に構築され、pＳＶＥ−h
umβ_AＩnh−ＤＨＦＲと共トランスフェクションしてヘ
テロダイマーを得た。また、試験管内バイオアッセイに
おいてインヒビンのαβ_A形と実質的に非都市医生物学
的活性を有するαβ_Bインヒビンを得るために、この再
構築ヒトβ_B遺伝子を前記プラスミドに用いた。 Example 5 Recombinant expression of human activin Vale et al. (Same) and Ring et al.
(Tal., ibid.), β-chain A and / or B homodimers and heterodimers have the opposite effect of inhibin in the pituitary gland and induce rather than inhibit FSH. These proteins, collectively referred to as activin, are prepared in α and β chain cotransformants as described in Example 4.
However, when the initial transfection is done with a vector or vectors that do not contain the α-chain gene, the screen for suitable transformants may be somewhat less. Appropriate vectors are readily constructed by excising the α chain gene from the above vectors. Plasmid pSVE-humβ _A Inh from Example 4
Is digested with Sal I and ligated to fragment 9 (Example 2) containing the DHFR gene. This ligation mixture was used to transform E. Escherichia coli 294 cells were transfected and colonies were selected on the basis of hybridizing with β chain DNA but not with α chain sequence. Clone pSVE-humβ _A In from which α chain DNA has been deleted
h-DHFR was identified. This clone was transfected into DHFR ^- CHO cells as described above. It was confirmed that the transformant secretes activin into the culture medium. Similarly, β _B coding sequence (reconstructed by ligating the DNA coding for the first 34 amino acids of human β _A to the remaining coding sequence of human β _B chain).
An expression vector containing pSVE-h was constructed easily.
Heterodimers were obtained by co-transfection with umβ _A Inh-DHFR. This reconstructed human β _B gene was also used in the plasmid to obtain α β _B inhibin, which has substantially non-urban medical biological activity with the αβ _A form of inhibin in an in vitro bioassay.

【０１３０】本発明をその好ましい態様について記載
し、これが、本発明者が現在知りうる限り最良の態様で
あるが、当分野で通常の知識を有する者にとって明白で
ある種々の変更および修正を、本明細書中の特許請求の
範囲に記載した本発明の範囲を逸脱することなく、これ
を行いうることを理解しておくべきである。The present invention has been described with respect to its preferred embodiments, which are the best modes the present inventors are currently aware of, but which are susceptible to various changes and modifications which are obvious to those of ordinary skill in the art. It should be understood that this may be done without departing from the scope of the invention as set forth in the claims herein.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ブタα鎖mＲＮＡを示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing porcine α chain mRNA.

【図２】 ブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing a nucleotide sequence and a deduced amino acid sequence of a porcine inhibin α chain precursor.

【図３】 ブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing a nucleotide sequence and a deduced amino acid sequence of a porcine inhibin α chain precursor.

【図４】 ブタβ_AサブユニットmＲＮＡおよびブタβ_B
サブユニットmＲＮＡを示す模式図である。FIG. 4. Porcine β _A subunit mRNA and porcine β _B
It is a schematic diagram which shows subunit mRNA.

【図５】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。FIG. 5 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and putative amino acid sequence of the porcine inhibin β subunit precursor.

【図６】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。FIG. 6 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the porcine inhibin β subunit precursor.

【図７】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。FIG. 7 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the porcine inhibin β subunit precursor.

【図８】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。FIG. 8 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and putative amino acid sequence of the porcine inhibin β subunit precursor.

【図９】 ブタ卵巣mＲＮＡのノーザン・ブロット分析
法による分析結果を示す模写図である。FIG. 9 is a copy showing the analysis results of porcine ovary mRNA by Northern blot analysis.

【図１０】 ヒトβ−ＴＧＦのアミノ酸配列とブタイン
ヒビンβ_Aおよびβ_Bのアミノ酸配列を対比させて示した
模式図である。FIG. 10 is a schematic diagram showing the amino acid sequence of human β-TGF and the amino acid sequences of porcine inhibin β _A and β _B in comparison.

【図１１】 αサブユニット配列とβ_Aインヒビン配列
とを対比させて示した模式図である。FIG. 11 is a schematic diagram showing the α subunit sequence and the β _A inhibin sequence in comparison.

【図１２】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。FIG. 12 is a schematic diagram of assembly of a typical recombinant expression plasmid of porcine inhibin.

【図１３】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。FIG. 13 is a schematic diagram of assembly of a typical recombinant expression plasmid of porcine inhibin.

【図１４】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。FIG. 14 is a schematic diagram of assembly of a typical recombinant expression plasmid of porcine inhibin.

【図１５】 ヒトαインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 15 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of human α inhibin cDNA and the deduced amino acid sequence.

【図１６】 ヒトαインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 16 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of human α inhibin cDNA and the deduced amino acid sequence.

【図１７】 ヒトαインヒビンタンパク質配列とブタα
インヒビンタンパク質配列とを比較して示した模式図で
ある。FIG. 17: Human α inhibin protein sequence and porcine α
It is the schematic diagram shown in comparison with the inhibin protein sequence.

【図１８】 ヒトαインヒビンタンパク質配列とブタα
インヒビンタンパク質配列とを比較して示した模式図で
ある。FIG. 18: Human α inhibin protein sequence and porcine α
It is the schematic diagram shown in comparison with the inhibin protein sequence.

【図１９】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。FIG. 19 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of the human β _A inhibin signal sequence and the deduced amino acid sequence.

【図２０】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。FIG. 20 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of the human β _A inhibin signal sequence and the deduced amino acid sequence.

【図２１】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。FIG. 21 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of the human β _A inhibin signal sequence and the deduced amino acid sequence.

【図２２】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 22 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence of human β _B inhibin cDNA and the deduced amino acid sequence.

【図２３】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 23 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of human β _B inhibin cDNA.

【図２４】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。FIG. 24 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of human β _B inhibin cDNA.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Office reference number FI technical display location G01N 33/50 P // C12N 5/10 (C12P 21/02 C12R 1:91)

Claims (20)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 式； 【化１】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンα
鎖、式； 【化２】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンα
鎖、式； 【化３】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化４】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_B鎖、式； 【化５】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化６】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_B鎖、および該ヒトのインヒビンα鎖とβ鎖、該ブタの
インヒビンα鎖とβ鎖、該ヒトのインヒビンα鎖と該ブ
タのインヒビンβ鎖、該ブタのインヒビンα鎖と該ヒト
のインヒビンβ鎖、該ヒトのインヒビンβ鎖とβ鎖、該
ブタのインヒビンβ鎖とβ鎖、及び該ヒトのインヒビン
β鎖と該ブタのインヒビンβ鎖からなる群から選択され
るポリペプチドをコードしている核酸、又は該アミノ酸
配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によるアミノ酸
配列の変異体をコードしている核酸、を含有するベクタ
ーを用いて形質転換された真核性宿主細胞を培養するこ
とを包含するインヒビンα鎖、インヒビンβ鎖、インヒ
ビンαβ鎖の二量体及びインヒビンββ鎖の二量体から
なる群から選択されるポリペプチドの製造方法（ただ
し、上記変異体は、実質上、該アミノ酸配列を有するポ
リペプチドとホモローガスであるが、牛のインヒビンα
鎖及び式； 【化７】 で示されるアミノ酸配列を有する部分的な牛インヒビン
β鎖を含まず、さらに該変異体は、（１）該ヒトのイン
ヒビンα鎖、該ブタのインヒビンα鎖、該ヒトのインヒ
ビンβ鎖、該ブタのインヒビンβ鎖、該ヒトのインヒビ
ンα鎖とβ鎖の二量体、該ブタのインヒビンα鎖とβ鎖
の二量体、該ヒトのインヒビンα鎖と該ブタのインヒビ
ンβ鎖の二量体、該ブタのインヒビンα鎖と該ヒトのイ
ンヒビンβ鎖の二量体、該ヒトのインヒビンβ鎖とβ鎖
の二量体、該ブタのインヒビンβ鎖とβ鎖の二量体、及
び該ヒトのインヒビンβ鎖と該ブタのインヒビンβ鎖の
二量体からなる群から選択されるポリペプチドに対して
生じる抗体と交差反応性があるか又は、（２）該ヒトの
インヒビンα鎖、該ブタのインヒビンα鎖、該ヒトのイ
ンヒビンβ鎖、該ブタのインヒビンβ鎖、該ヒトのイン
ヒビンα鎖とβ鎖、該ブタのインヒビンα鎖とβ鎖の二
量体、該ヒトのインヒビンα鎖と該ブタのインヒビンβ
鎖の二量体、該ブタのインヒビンα鎖と該ヒトのインヒ
ビンβ鎖の二量体、該ヒトのインヒビンβ鎖とβ鎖の二
量体、該ブタのインヒビンβ鎖とβ鎖の二量体、及び該
ヒトのインヒビンβ鎖と該ブタのインヒビンβ鎖の二量
体からなる群から選択されるポリペプチドに対する細胞
表面受容体と交差反応性があるか又は、（３）該ヒトの
インヒビンα鎖、該ブタのインヒビンα鎖、該ヒトのイ
ンヒビンβ鎖、該ブタのインヒビンβ鎖、該ヒトのイン
ヒビンα鎖とβ鎖の二量体、該ブタのインヒビンα鎖と
β鎖の二量体、該ヒトのインヒビンα鎖と該ブタのイン
ヒビンβ鎖の二量体、該ブタのインヒビンα鎖と該ヒト
のインヒビンβ鎖の二量体、該ヒトのインヒビンβ鎖と
β鎖の二量体、該ブタのインヒビンβ鎖とβ鎖の二量
体、及び該ヒトのインヒビンβ鎖と該ブタのインヒビン
β鎖の二量体からなる群から選択されるポリペプチドの
持つホルモン様活性を有していることを特徴とするもの
であり、更に、上記においてインヒビンβ鎖というとき
は、インヒビンβ_A鎖またはインヒビンβ_B鎖のいずれか
を意味する)。1. A formula; Human inhibin α containing the amino acid sequence shown in
Chain, formula; Pig inhibin α containing the amino acid sequence shown by
Chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, and the human inhibin α and β chains, the porcine inhibin α and β chains, the human inhibin α chain and the porcine inhibin β chain, the porcine inhibin α chain and the human inhibin β Chain, the human inhibin β chain and β chain, the porcine inhibin β chain and β chain, and the polypeptide selected from the group consisting of the human inhibin β chain and the porcine inhibin β chain. Culturing a eukaryotic host cell transformed with a vector containing a nucleic acid, or a nucleic acid encoding a variant of an amino acid sequence by insertion, deletion or substitution of an amino acid in the amino acid sequence, A method for producing a polypeptide selected from the group consisting of inhibin α chain, inhibin β chain, dimer of inhibin αβ chain and dimer of inhibin ββ chain (wherein the variant is substantially Is a polypeptide homologous with acid sequence, inhibin bovine α
Chain and formula; Does not include a partial bovine inhibin β chain having the amino acid sequence shown in (1), and the mutant further comprises (1) the human inhibin α chain, the pig inhibin α chain, the human inhibin β chain, the pig Inhibin β chain, dimer of the human inhibin α chain and β chain, dimer of the pig inhibin α chain and β chain, dimer of the human inhibin α chain and the pig inhibin β chain A dimer of the pig inhibin α chain and the human inhibin β chain, the human inhibin β chain and β chain dimer, the pig inhibin β chain and β chain dimer, and the human Cross-reactive with an antibody raised against a polypeptide selected from the group consisting of a dimer of the inhibin β chain of porcine and the porcine inhibin β chain, or (2) the human inhibin α chain, the pig Inhibin α-chain, the human inhibin β-chain, the pig inhibin β chain, inhibin α chain and β chain of the human, dimers of inhibin α chain and β chain of the porcine inhibin inhibin α chain and the pig of the human β
Chain dimer, the porcine inhibin α chain and the human inhibin β chain dimer, the human inhibin β chain and β chain dimer, the porcine inhibin β chain and β chain dimer Body and a cell surface receptor for a polypeptide selected from the group consisting of a dimer of the human inhibin β chain and the porcine inhibin β chain, or (3) the human inhibin α chain, the porcine inhibin α chain, the human inhibin β chain, the porcine inhibin β chain, the human inhibin α chain and β chain dimer, the porcine inhibin α chain and β chain dimer Body, a dimer of the human inhibin α chain and the porcine inhibin β chain, a dimer of the porcine inhibin α chain and the human inhibin β chain, a dimer of the human inhibin β chain and β chain Body, the porcine inhibin β chain and β chain dimer, and the human inhibin β chain and It is characterized in having a hormone-like activity have from the group consisting of a dimer of the other inhibin β chains of polypeptides selected, further, the term inhibin β chain in the above description, inhibin β Means either the _A chain or the inhibin β _B chain). 【請求項２】 該核酸が、式； 【化８】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンα
鎖、式； 【化９】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンα
鎖、式； 【化１０】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化１１】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_B鎖、式； 【化１２】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化１３】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_B鎖、該ヒトのインヒビンα鎖とβ鎖の二量体、該ブタ
のインヒビンα鎖とβ鎖の二量体、該ヒトのインヒビン
α鎖と該ブタのインヒビンβ鎖の二量体、該ブタのイン
ヒビンα鎖と該ヒトのインヒビンβ鎖の二量体、該ヒト
のインヒビンβ鎖とβ鎖の二量体、該ブタのインヒビン
β鎖とβ鎖の二量体、及び該ヒトのインヒビンβ鎖と該
ブタのインヒビンβ鎖の二量体からなる群から選択され
るポリペプチドをコードしている核酸である請求項１に
記載の方法。2. The nucleic acid has the formula: Human inhibin α containing the amino acid sequence shown in
Chain, formula; Pig inhibin α containing the amino acid sequence shown by
Chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, the human inhibin α chain and β chain dimer, the pig inhibin α chain and β chain dimer, the human inhibin α chain and the pig inhibin β chain dimer, the Dimer of porcine inhibin α chain and human inhibin β chain, dimer of human inhibin β chain and β chain, porcine inhibin β chain and β chain dimer, and human inhibin The method according to claim 1, which is a nucleic acid encoding a polypeptide selected from the group consisting of a β chain and a dimer of the porcine inhibin β chain. 【請求項３】 該ベクターが、インヒビンβ鎖又はその
変異体であって、天然のヒト又はブタのインヒビンβ_A
鎖以外又は式； 【化１４】 で示されるアミノ酸配列である部分的な牛のインヒビン
β鎖以外のインヒビンβ鎖の変異体をコードする核酸を
含有する請求項１に記載の方法。3. The vector is an inhibin β chain or a variant thereof, which is a natural human or porcine inhibin β _A.
Other than chain or formula; The method according to claim 1, which comprises a nucleic acid encoding a variant of the inhibin β chain other than the partial bovine inhibin β chain having the amino acid sequence shown by 【請求項４】 該核酸が、式； 【化１５】[Ａsn₂₆₆→Ｇln]Ｉnhα,[Ｃys₃₂₅またはＣys
₃₂₄→Δ]Ｉnhα, [Ｃys₃₆₁またはＣys₃₆₃→Δ]Ｉnhα,
[Ｌys₃₂₁またはＬys₃₂₂→Δ]Ｉnhβ_Aまたは[Ｌys₃₂₂→
ＨisまたはＳer]Ｉnhβ_A, [Ｌys₃₁₅→Ａrg; Ｖal₃₁₆→
Ｔhr]Ｉnhβ_A, [Ｃys₃₈₈またはＣys₃₉₀→Δ]Ｉnhβ_A,
[Ｌys₄₁₁→Ｇln]Ｉnhβ_A, [Ａrg₃₁₅→Ｌys, Ｖal₃₁₆→
Ｔhr]Ｉnhβ_B, [Ｃys₃₁₉またはＣys₃₂₀→Δ]Ｉnhβ_B[Ｐ
ro₃₈₁Ｇly₃₈₂→Ｐro Ｐhe Ｇly]Ｉnhβ_B, および[Ａr
g₃₉₅→Ｇln]Ｉnhβ_Bからなる群から選択される式（上記
式中、Ｉｎｈはインヒビンの略語であり、式； 【化１６】 で示されるブタの成熟インヒビンα鎖の残基番号は２３
１から始まり、式； 【化１７】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_A 鎖及び式； 【化１８】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_B 鎖の残基番号は３
０９から始まる）で示されるブタのインヒビン変異体、
式； 【化１９】 （上記配列の残基番号は２８３から始まる）で示される
アミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビンβ_A 鎖の残
基２９３−２９７、３６４−３７６及び３８７−３９８
からなる群から選択される残基の隣におけるアミノ酸の
置換、削除又は挿入による変異を有するヒトのインヒビ
ンβ_A鎖の変異体、及び式； 【化２０】 で示されるアミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビン
α鎖と９０％以上ホモローガスであるヒトのインヒビン
α鎖の変異体から選択される変異体をコードしている請
求項１に記載の方法（上記変異体は、インヒビンα鎖が
インヒビンβ鎖と結合する場合には卵胞刺激ホルモン遊
離を抑制するインヒビンの生物学的活性を有しており、
インヒビンβ鎖がもう１つのインヒビンβ鎖と結合する
場合には卵胞刺激ホルモン遊離を促進するアクチビンの
生物学的活性を有していることを特徴とする)。4. The nucleic acid has the formula: [Asn ₂₆₆ → Gln] Inhα, [Cys ₃₂₅ or Cys].
₃₂₄ → Δ] Inhα, [Cys ₃₆₁ or Cys ₃₆₃ → Δ] Inhα,
[Lys ₃₂₁ or Lys ₃₂₂ → Δ] Inhβ _A or [Lys ₃₂₂ →
His or Ser] Inhβ _A , [Lys ₃₁₅ → Arg; Val ₃₁₆ →
Thr] Inhβ _A , [Cys ₃₈₈ or Cys ₃₉₀ → Δ] Inhβ _A ,
[Lys ₄₁₁ → Gln] Inhβ _A , [Arg ₃₁₅ → Lys, Val ₃₁₆ →
Thr] Inhβ _B , [Cys ₃₁₉ or Cys ₃₂₀ → Δ] Inhβ _B [P
ro ₃₈₁ Gly ₃₈₂ → Pro Phe Gly] Inhβ _B , and [Ar
A formula selected from the group consisting of g ₃₉₅ → Gln] Inhβ _B (wherein Inh is an abbreviation for inhibin and the formula: The residue number of the mature porcine inhibin α chain represented by
Starting from 1, the formula; Porcine mature inhibin β _A chain and formula: The residue number of the mature porcine inhibin β _B chain shown by is 3
Starting from 09)), the porcine inhibin mutant
Formula; Residues 293-297, 364-376 and 387-398 of human mature inhibin β _A chain having the amino acid sequence set forth in (residue numbering of the above sequence begins at 283).
A variant of the human inhibin β _A chain having a mutation by substitution, deletion or insertion of an amino acid next to a residue selected from the group consisting of: and a formula; The method according to claim 1, which encodes a variant selected from a variant of human mature inhibin α chain having the amino acid sequence shown by and a variant of human inhibin α chain that is homologous to 90% or more. Has the biological activity of inhibin that suppresses follicle-stimulating hormone release when the inhibin α chain binds to the inhibin β chain,
It is characterized by having activin biological activity that promotes follicle-stimulating hormone release when the inhibin β chain binds to another inhibin β chain). 【請求項５】 該核酸が、式； 【化２１】Ｐhe₃₀₂→ＩleまたはＬeu;Ｇln₂₉₇→Ａspま
たはＬys;Ｔrp₃₀₇→ＴyrまたはＰhe;Ｔrp₃₁₀→Ｔyrまた
はＰhe;Ｉle₃₁₁→ＰheまたはＶal;Ｔyr₃₁₇→Ｔrpまたは
Ｔhr;Ｈis₃₁₈→Ｌys;Ａla₃₁₉→Ｓer;Ａsn₃₂₀→Ｇln, Ｔ
yrまたはＨis;Ｔyr₃₂₁→ＴhrまたはＡsp, Ｐhe₃₄₀→Ｔy
r;Ｈis₃₅₃→Ａsp;Ｈis₃₅₃→Ｌys(β_A／β_Bハイブリッ
ド); Ｐhe₃₅₆→Ｔyr;Ｖal₃₆₄→Ｐhe;Ｖal₃₆₄→Ｌeu;Ｔy
r₃₇₅→Ｔhr;Ｔyr₃₇₆→Ｔrp;Ａsn₃₈₉→Ｇln, Ｈisまたは
Ｌys;Ｉle₃₉₁→ＬeuまたはＴhr;Ｍet₃₉₀→ＬeuまたはＳ
er;Ｖal₃₉₂→Ｐhe, Ｇlu, ＴhrまたはＩleからなる群か
ら選択される式（式中、式； 【化２２】 で示されるアミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビン
β_A 鎖の残基番号は２８３から始まる）で示されるヒト
インヒビンβ_A鎖の変異体又は同様に修飾されたヒトイ
ンヒビンβ_B 鎖をコードしている第１項に記載の方法。5. The nucleic acid has the formula: Phe ₃₀₂ → Ile or Leu; Gln ₂₉₇ → Asp or Lys; Trp ₃₀₇ → Tyr or Phe; Trp ₃₁₀ → Tyr or Phe; Ile ₃₁₁ → Phe or Val; Tyr ₃₁₇ → Trp or Thr; His ₃₁₈ → Lys; Ala ₃₁₉ → Ser; Asn ₃₂₀ → Gln, T
yr or His; Tyr ₃₂₁ → Thr or Asp, Phe ₃₄₀ → Ty
r; His ₃₅₃ → Asp; His ₃₅₃ → Lys (β _A / β _B hybrid); Phe ₃₅₆ → Tyr; Val ₃₆₄ → Phe; Val ₃₆₄ → Leu; Ty
r ₃₇₅ → Thr; Tyr ₃₇₆ → Trp; Asn ₃₈₉ → Gln, His or Lys; Ile ₃₉₁ → Leu or Thr; Met ₃₉₀ → Leu or S
er; Val ₃₉₂ → an expression selected from the group consisting of Phe, Glu, Thr or Ile (wherein the expression; In residue number of the mature inhibin beta _A chain of human having an amino acid sequence shown encodes a variant or similarly modified human inhibin beta _B chain of human inhibin beta _A chain represented by starting) from 283 The method according to item 1. 【請求項６】 該核酸が、宿主細胞によって認識される
プロモーターに機能的に連結したインヒビンα鎖及び／
又はβ鎖をコードし、さらに培養培地からインヒビンα
β鎖の二量体及びインヒビンββ鎖の二量体からなる群
から選択される二量体を回収するステップを包含する請
求項１〜請求項５のいずれか１つに記載の方法。6. The inhibin α chain operably linked to a promoter recognized by a host cell, and / or
Alternatively, the β chain is encoded, and inhibin α
The method according to any one of claims 1 to 5, comprising a step of recovering a dimer selected from the group consisting of a β chain dimer and an inhibin ββ chain dimer. 【請求項７】 該ベクターがインヒビンα鎖及び／又は
インヒビンβ鎖のプレプロ型をコードする核酸を含有す
る請求項１〜請求項６のいずれか１つに記載の方法であ
って、該プレプロ型は、式； 【化２３】 で示されるアミノ酸配列であるヒトのインヒビンα鎖の
プレプロ型、式； 【化２４】 で示されるアミノ酸配列であるブタのインヒビンα鎖の
プレプロ型、式； 【化２５】 で示されるアミノ酸配列であるヒトのインヒビンβ_A鎖
のプレプロ型、または式； 【化２６】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_B鎖のプレプロ型、式； 【化２７】 で示されるアミノ酸配列であるブタのインヒビンβ_A鎖
のプレプロ型、式； 【化２８】 で示されるアミノ酸配列であるブタのインヒビンβ_B鎖
のプレプロ型である方法。7. The method according to claim 1, wherein the vector contains a nucleic acid encoding a prepro type of inhibin α chain and / or inhibin β chain. Is a formula; A prepro form of human inhibin α chain having the amino acid sequence shown by the formula: A prepro form of the porcine inhibin α chain, which is the amino acid sequence represented by the formula: _A prepro form of human inhibin β _A chain having the amino acid sequence represented by: or a formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B- chain prepro form, formula; _A prepro form of the porcine inhibin β _A chain having the amino acid sequence shown by: The method which is a prepro type of the pig inhibin β _B chain having the amino acid sequence shown by. 【請求項８】 該ベクターがインヒビンα鎖及びインヒ
ビンβ鎖の両方のプレプロ型をコードする核酸を含有す
る第７項に記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the vector contains nucleic acids encoding the preproforms of both the inhibin α chain and the inhibin β chain. 【請求項９】 該プロモーターがウイルスのプロモータ
ーである請求項６に記載の方法。9. The method according to claim 6, wherein the promoter is a viral promoter. 【請求項１０】 該プロモーターがＳＶ４０プロモータ
ーである請求項９に記載の方法。10. The method of claim 9, wherein the promoter is the SV40 promoter. 【請求項１１】 ブタの成熟インヒビン及びヒトの成熟
インヒビンからなる群から選択されるインヒビンを回収
する請求項１〜請求項１０のいずれか１つに記載の方
法。11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein inhibin selected from the group consisting of mature swine inhibin and human mature inhibin is recovered. 【請求項１２】 該ベクターがプレプロ型のインヒビン
β鎖をコードしている核酸を含有し、α鎖を含むことな
く成熟β鎖二量体を回収する請求項１〜６又は請求項９
〜請求項１０のいずれか１つに記載の方法。12. The method according to claim 1, wherein the vector contains a nucleic acid encoding a prepro-type inhibin β chain, and a mature β chain dimer is recovered without containing an α chain.
~ The method according to claim 10. 【請求項１３】 β鎖がβ_A鎖であって、インヒビンが
培養培地に約２０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で存在している
請求項１１に記載の方法。13. The method according to claim 11, wherein the β chain is β _A chain, and inhibin is present in the culture medium at a concentration of about 20 ng / ml or more. 【請求項１４】 １つのα鎖と１つのβ鎖からなるヒト
のインヒビン及び１つのα鎖と１つのβ鎖からなるブタ
のインヒビンからなる群から選択されるインヒビンであ
って、該α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列は、式； 【化２９】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンα
鎖、式； 【化３０】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンα
鎖、式； 【化３１】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化３２】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_B鎖、式； 【化３３】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_A鎖及び、式； 【化３４】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_B鎖で示されるか、又は該アミノ酸配列中のアミノ酸の
挿入、欠失又は置換によるアミノ酸配列の変異体であ
り、同定されていないヒト又はブタの蛋白質を全く含ん
でいないインヒビン（上記変異体は、実質上、該アミノ
酸配列を有するポリペプチドとホモローガスであるが、
牛のインヒビンα鎖を含んでおらず、さらに該変異体
は、（１）該ヒトのインヒビン及び該ブタのインヒビン
から選択されるポリペプチドに対して生じる抗体と交差
反応性があるか又は、（２）該ヒトのインヒビン及び該
ブタのインヒビンから選択されるポリペプチドに対する
細胞表面受容体と交差反応性があるか又は、（３）卵胞
刺激ホルモン遊離を抑制するインヒビンの生物活性を有
することを特徴とする)。14. An inhibin selected from the group consisting of human inhibin consisting of one α chain and one β chain and porcine inhibin consisting of one α chain and one β chain, wherein the α chain and The amino acid sequence of the β chain is represented by the formula: Human inhibin α containing the amino acid sequence shown in
Chain, formula; Pig inhibin α containing the amino acid sequence shown by
Chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain and formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
Inhibin represented by the _B chain, or a variant of the amino acid sequence by insertion, deletion or substitution of amino acids in the amino acid sequence, which does not contain any unidentified human or porcine protein (the above variant is , Which is substantially homologous to the polypeptide having the amino acid sequence,
It does not contain a bovine inhibin α chain, and the mutant is (1) cross-reactive with an antibody raised against a polypeptide selected from the human inhibin and the porcine inhibin, or ( 2) It has a cross-reactivity with a cell surface receptor for a polypeptide selected from the human inhibin and the porcine inhibin, or (3) has the biological activity of inhibin that suppresses follicle-stimulating hormone release. And). 【請求項１５】 該α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列が式； 【化３５】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンα
鎖、式； 【化３６】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンα
鎖、式； 【化３７】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_A鎖、式； 【化３８】 で示されるアミノ酸配列を含有するヒトのインヒビンβ
_B鎖、式； 【化３９】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_A鎖及び、式； 【化４０】 で示されるアミノ酸配列を含有するブタのインヒビンβ
_B鎖からなる群のアミノ酸配列から選択される請求項１
４に記載のインヒビン。15. The amino acid sequences of the α chain and β chain are represented by the formula; Human inhibin α containing the amino acid sequence shown in
Chain, formula; Pig inhibin α containing the amino acid sequence shown by
Chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain, formula; Human inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_B chain, formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A chain and formula; Porcine inhibin β containing the amino acid sequence shown in
_A selected amino acid sequence from the group consisting of _B chains.
Inhibin according to 4. 【請求項１６】 該変異体は、式； 【化４１】[Ａsn₂₆₆→Ｇln]Ｉnhα,[Ｃys₃₂₅またはＣys
₃₂₄→Δ]Ｉnhα, [Ｃys₃₆₁またはＣys₃₆₃→Δ]Ｉnhα,
[Ｌys₃₂₁またはＬys₃₂₂→Δ]Ｉnhβ_Aまたは[Ｌys₃₂₂→
ＨisまたはＳer]Ｉnhβ_A, [Ｌys₃₁₅→Ａrg; Ｖal₃₁₆→
Ｔhr]Ｉnhβ_A, [Ｃys₃₈₈またはＣys₃₉₀→Δ]Ｉnhβ_A,
[Ｌys₄₁₁→Ｇln]Ｉnhβ_A, [Ａrg₃₁₅→Ｌys, Ｖal₃₁₆→
Ｔhr]Ｉnhβ_B, [Ｃys₃₁₉またはＣys₃₂₀→Δ]Ｉnhβ_B[Ｐ
ro₃₈₁Ｇly₃₈₂→Ｐro Ｐhe Ｇly]Ｉnhβ_B, および[Ａr
g₃₉₅→Ｇln]Ｉnhβ_Bからなる群から選択される式（上記
式中、Ｉｎｈはインヒビンの略語であり、式； 【化４２】 で示されるブタの成熟インヒビンα鎖の残基番号は２３
１から始まり、式； 【化４３】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_A 鎖及び式； 【化４４】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_B 鎖の残基番号は３
０９から始まる）で示されるブタのインヒビン変異体、
式； 【化４５】 （上記配列の残基番号は２８３から始まる）で示される
アミノ酸配列であるヒトの成熟インヒビンβ_A 鎖の残基
２９３−２９７、３６４−３７６及び３８７−３９８か
らなる群から選択される残基の隣におけるアミノ酸の置
換、削除又は挿入による変異を有するヒトのインヒビン
β_A 鎖の変異体、及び式； 【化４６】 で示されるアミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビン
α鎖と９０％以上ホモローガスであるヒトのインヒビン
α鎖の変異体から選択される変異体である請求項１４に
記載のインヒビン。16. The mutant has the formula: [Asn ₂₆₆ → Gln] Inhα, [Cys ₃₂₅ or Cys].
₃₂₄ → Δ] Inhα, [Cys ₃₆₁ or Cys ₃₆₃ → Δ] Inhα,
[Lys ₃₂₁ or Lys ₃₂₂ → Δ] Inhβ _A or [Lys ₃₂₂ →
His or Ser] Inhβ _A , [Lys ₃₁₅ → Arg; Val ₃₁₆ →
Thr] Inhβ _A , [Cys ₃₈₈ or Cys ₃₉₀ → Δ] Inhβ _A ,
[Lys ₄₁₁ → Gln] Inhβ _A , [Arg ₃₁₅ → Lys, Val ₃₁₆ →
Thr] Inhβ _B , [Cys ₃₁₉ or Cys ₃₂₀ → Δ] Inhβ _B [P
ro ₃₈₁ Gly ₃₈₂ → Pro Phe Gly] Inhβ _B , and [Ar
A formula selected from the group consisting of g ₃₉₅ → Gln] Inhβ _B (wherein Inh is an abbreviation for inhibin; The residue number of the mature porcine inhibin α chain represented by
Starting from 1, the formula; Porcine mature inhibin β _A chain and formula: The residue number of the mature porcine inhibin β _B chain shown by is 3
Starting from 09)), the porcine inhibin mutant
Formula; (Residue number of the above sequence starts from 283), which is an amino acid sequence represented by human mature inhibin β _A chain residues 293-297, 364-376 and 387-398 Mutants of the human inhibin β _A chain with mutations due to amino acid substitutions, deletions or insertions in the neighborhood, and the formula; 15. The inhibin according to claim 14, which is a mutant selected from a mutant of the human inhibin α chain having the amino acid sequence shown by and a human inhibin α chain that is homologous to 90% or more. 【請求項１７】 式； 【化４７】Ｐhe₃₀₂→ＩleまたはＬeu;Ｇln₂₉₇→Ａspま
たはＬys;Ｔrp₃₀₇→ＴyrまたはＰhe;Ｔrp₃₁₀→Ｔyrまた
はＰhe;Ｉle₃₁₁→ＰheまたはＶal;Ｔyr₃₁₇→Ｔrpまたは
Ｔhr;Ｈis₃₁₈→Ｌys;Ａla₃₁₉→Ｓer;Ａsn₃₂₀→Ｇln, Ｔ
yrまたはＨis;Ｔyr₃₂₁→ＴhrまたはＡsp, Ｐhe₃₄₀→Ｔy
r;Ｈis₃₅₃→Ａsp;Ｈis₃₅₃→Ｌys(β_A／β_Bハイブリッ
ド); Ｐhe₃₅₆→Ｔyr;Ｖal₃₆₄→Ｐhe;Ｖal₃₆₄→Ｌeu;Ｔy
r₃₇₅→Ｔhr;Ｔyr₃₇₆→Ｔrp;Ａsn₃₈₉→Ｇln, Ｈisまたは
Ｌys;Ｉle₃₉₁→ＬeuまたはＴhr;Ｍet₃₉₀→ＬeuまたはＳ
er;Ｖal₃₉₂→Ｐhe, Ｇlu, ＴhrまたはＩleからなる群か
ら選択される式（式中、式； 【化４８】 で示されるアミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビン
β_A 鎖の残基番号は２８３から始まる）で示されるヒト
のインヒビンβ_A鎖の変異体又は同様に修飾されたヒト
のインヒビンβ_B 鎖を含有する請求項１４に記載のイン
ヒビン。17. A compound having the formula: Phe ₃₀₂ → Ile or Leu; Gln ₂₉₇ → Asp or Lys; Trp ₃₀₇ → Tyr or Phe; Trp ₃₁₀ → Tyr or Phe; Ile ₃₁₁ → Phe or Val; Tyr ₃₁₇ → Trp Or Thr; His ₃₁₈ → Lys; Ala ₃₁₉ → Ser; Asn ₃₂₀ → Gln, T
yr or His; Tyr ₃₂₁ → Thr or Asp, Phe ₃₄₀ → Ty
r; His ₃₅₃ → Asp; His ₃₅₃ → Lys (β _A / β _B hybrid); Phe ₃₅₆ → Tyr; Val ₃₆₄ → Phe; Val ₃₆₄ → Leu; Ty
r ₃₇₅ → Thr; Tyr ₃₇₆ → Trp; Asn ₃₈₉ → Gln, His or Lys; Ile ₃₉₁ → Leu or Thr; Met ₃₉₀ → Leu or S
er; Val ₃₉₂ → an expression selected from the group consisting of Phe, Glu, Thr or Ile (wherein the expression; The human mature inhibin β _A chain having the amino acid sequence shown by is starting with the residue number starting from 283) containing a variant of the human inhibin β _A chain or a similarly modified human inhibin β _B chain The inhibin according to claim 14. 【請求項１８】 インヒビンα鎖不含のポリペプチドで
あって、式； 【化４９】 で示されるヒトの成熟インヒビンβ_A 鎖、式； 【化５０】 で示されるヒトの成熟インヒビンβ_B 鎖、式； 【化５１】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_A 鎖及び、式； 【化５２】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_B 鎖からなる群から
選択される鎖のホモ二量体ポリペプチド、又は該アミノ
酸配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によるアミノ
酸配列の変異体のホモ二量体ポリペプチド（上記変異体
は、実質上、該アミノ酸配列を有するポリペプチドとホ
モローガスであり、さらに該変異体は、（１）該ヒトの
インヒビンβ_A 鎖とβ_A 鎖の二量体、該ヒトのインヒビ
ンβ_B 鎖とβ_B 鎖の二量体、該ブタのβ_A 鎖とβ_A 鎖の
二量体、該ブタのインヒビンβ_B 鎖とβ_B 鎖の二量体、
該ヒトのインヒビンβ_A 鎖と該ブタのインヒビンβ_A 鎖
の二量体、及び該ヒトのインヒビンβ_B 鎖と該ヒトのイ
ンヒビンβ_B 鎖の二量体からなる群から選択されるポリ
ペプチドに対して生じる抗体と交差反応性があるか又
は、（２）該ヒトのインヒビンβ_A 鎖とβ_A 鎖の二量
体、該ヒトのインヒビンβ_B 鎖とβ_B 鎖の二量体、該ブ
タのβ_A 鎖とβ_A 鎖の二量体、該ブタのインヒビンβ_B
鎖とβ_B 鎖の二量体、該ヒトのインヒビンβ_A 鎖と該ブ
タのインヒビンβ_A 鎖の二量体、及び該ヒトのインヒビ
ンβ_B 鎖と該ヒトのインヒビンβ_B 鎖の二量体からなる
群から選択されるインヒビンのアミノ酸配列のポリペプ
チドに対する細胞表面受容体と交差反応性があるか又
は、（３）卵胞刺激ホルモンの遊離を促進するアクチビ
ンの生物活性を有していることを特徴とする)。18. A polypeptide free of inhibin α chain, which has the formula: Human mature inhibin β _A chain represented by the formula: Human mature inhibin β _B chain represented by the formula: The porcine mature inhibin β _A chain represented by: and a formula; A homodimer polypeptide of a chain selected from the group consisting of the porcine mature inhibin β _B chain, or a homodimer of a variant of an amino acid sequence due to insertion, deletion or substitution of amino acids in the amino acid sequence Somatic polypeptide (the above-mentioned mutant is substantially homologous to the polypeptide having the amino acid sequence, and the mutant is (1) a dimer of the human inhibin β _A chain and β _A chain, Human inhibin β _B chain and β _B chain dimer, the pig β _A chain and β _A chain dimer, the pig inhibin β _B chain and β _B chain dimer,
_A polypeptide selected from the group consisting of a dimer of the human inhibin β _A chain and the porcine inhibin β _A chain, and a dimer of the human inhibin β _B chain and the human inhibin β _B chain. Cross-reacting with an antibody raised against it, or (2) the human inhibin β _A chain and β _A chain dimer, the human inhibin β _B chain and β _B chain dimer, the pig Β _A chain and β _A chain dimer of porcine inhibin β _B
Chain and β _B chain dimer, the human inhibin β _A chain and the pig inhibin β _A chain dimer, and the human inhibin β _B chain and the human inhibin β _B chain dimer Cross-reacting with a cell surface receptor for a polypeptide having an amino acid sequence of inhibin selected from the group consisting of (3) having activin bioactivity that promotes the release of follicle-stimulating hormone; Feature). 【請求項１９】 ヒトの成熟インヒビンβ_B 鎖及びブタ
の成熟インヒビンβ_B 鎖からなる群から選択されるイン
ヒビンβ_B 鎖又はそのアミノ酸変異体の請求項１８に記
載のホモ二量体ポリペプチド。19. homodimer polypeptide according to claim 18 of inhibin beta _B chain or an amino acid variants are selected from the group consisting of mature inhibin beta _B chains of mature inhibin beta _B chain and porcine human. 【請求項２０】 インヒビンα鎖不含のヘテロ二量体ポ
リペプチドであって、式； 【化５３】 で示されるヒトの成熟インヒビンβ_A 鎖、式； 【化５４】 で示されるヒトの成熟インヒビンβ_B 鎖、式； 【化５５】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_A 鎖及び、式； 【化５６】 で示されるブタの成熟インヒビンβ_B 鎖から選択される
アミノ酸配列を有するヒトの成熟インヒビンβ_A 鎖とヒ
トの成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体、ブタの成熟インヒ
ビンβ_A 鎖とブタの成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体、ブ
タの成熟インヒビンβ_A 鎖とヒトの成熟インヒビンβ_B
鎖の二量体、及びヒトの成熟インヒビンβ _A 鎖とブタの
成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体からなる群から選択され
る鎖のヘテロ二量体ポリペプチド、又は該アミノ酸配列
中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によるアミノ酸配列
の変異体のヘテロ二量体ポリペプチド（上記変異体は、
実質上、該アミノ酸配列を有するポリペプチドとホモロ
ーガスであり、さらに該変異体は、（１）該ヒトの成熟
インヒビンβ_A 鎖とヒトの成熟インヒビンβ_B 鎖の二量
体、ブタの成熟インヒビンβ_A 鎖とブタの成熟インヒビ
ンβ_B 鎖の二量体、ブタの成熟インヒビンβ_A 鎖とヒト
の成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体、及びヒトの成熟イン
ヒビンβ_A 鎖とブタの成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体か
らなる群から選択されるポリペプチドに対して生じる抗
体と交差反応性があるか又は、（２）該ヒトの成熟イン
ヒビンβ_A 鎖とヒトの成熟インヒビンβ_B鎖の二量体、
ブタの成熟インヒビンβ_A 鎖とブタの成熟インヒビンβ
_B 鎖の二量体、ブタの成熟インヒビンβ_A 鎖とヒトの成
熟インヒビンβ_B 鎖の二量体、及びヒトの成熟インヒビ
ンβ_A 鎖とブタの成熟インヒビンβ_B 鎖の二量体からな
る群から選択されるインヒビンのアミノ酸配列のポリペ
プチドに対する細胞表面受容体と交差反応性があるか又
は、（３）卵胞刺激ホルモンの遊離を促進するアクチビ
ンの生物活性を有していることを特徴とする)。20. Inhibin α chain-free heterodimeric por
A polypeptide of the formula;Human mature inhibin β_A Chain, formula;Human mature inhibin β_B Chain, formula;Porcine mature inhibin β_A A chain and a formula;Porcine mature inhibin β_B Selected from chains
Human mature inhibin β having an amino acid sequence_A Chains and hi
Mature inhibin β_B Chain dimer, porcine mature kidney
Bin β_A Chains and porcine mature inhibin β_B The chain dimer, b
Maturation inhibin β_A Chain and human mature inhibin β_B 
Chain dimers, and human mature inhibin β _A Chains and pigs
Mature inhibin β_B Selected from the group consisting of chain dimers
Chain heterodimer polypeptide or amino acid sequence thereof
Sequence by insertion, deletion or substitution of amino acids in
A heterodimeric polypeptide of a variant of
In essence, a polypeptide having the amino acid sequence and a homologue
Gas, and the mutant further comprises (1) the maturation of the human.
Inhibin β_A Chain and human mature inhibin β_B Chain dimer
Body and porcine mature inhibin β_A Chain and pig maturity inhibitor
Β_B Chain dimer, porcine mature inhibin β_A Chain and human
Of mature inhibin β_B Chain dimers, and human mature
Hibin β_A Chains and porcine mature inhibin β_B Is it a chain dimer?
Anti-antigenic effect against a polypeptide selected from the group consisting of
Cross-reactive with the body, or (2) the human mature
Hibin β_A Chain and human mature inhibin β_BA chain dimer,
Pig mature inhibin β_A Chains and porcine mature inhibin β
_B Chain dimer, porcine mature inhibin β_A Chain and human growth
Ripe inhibin β_B Chain dimers, and human mature inhibitors
Β_A Chains and porcine mature inhibin β_B From chain dimers
Polypeptide of amino acid sequence of inhibin selected from the group
Is it cross-reactive with cell surface receptors for peptides?
(3) Activator that promotes the release of follicle-stimulating hormone
It has the biological activity of