JPH08169900A - Reshaped human antibody against human medulloblastoma cell - Google Patents

Reshaped human antibody against human medulloblastoma cell

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JPH08169900A
JPH08169900A JP6285057A JP28505794A JPH08169900A JP H08169900 A JPH08169900 A JP H08169900A JP 6285057 A JP6285057 A JP 6285057A JP 28505794 A JP28505794 A JP 28505794A JP H08169900 A JPH08169900 A JP H08169900A
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gly
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俊彦 大友
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Abstract

PURPOSE: To obtain an L chain variable region of an antibody against a human medulloblastoma cell useful for preparation, etc., of a chimera antibody useful for treatment, diagnosis, etc., of cerebral tumor, containing plural complementarity determining regions and framework regions having a specific amino acid sequence and having low antigenicity. CONSTITUTION: This L chain variable region(V region) of an antibody against a new cell of a human medulloblastoma containing three complementarity determining regions(CDR) comprising amino acid sequences represented by formulas I to III or a part thereof and four framework regions(FR). The L chain V region is obtained from an L chain CDR of an anti-human medulloblastoma cell monoclonal antibody ONS-M21 prepared by immunizing a mouse with the human medulloblastoma cell. A reshaped human antibody is prepared by binding an L chain V region comprising the murine L chain CDR to a human L chain C region and a human L chain FR, reshaping the L chain, binding a human H chain C region to a human H chain FR and an H chain V region comprising an H chain CDR of a murine monoclonal antibody against the human medulloblastoma cell and binding the resultant reshaped H chain to the reshaped L chain. The reshaped human antibody is useful for treatment, diagnosis, etc., of cerebral tumor.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト髄芽腫細胞に対す
るマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の可変領域
（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）とから成る
ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及び
ヒト重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が
ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮ
Ｓ−Ｍ２１のＣＤＲにより置き換えられている再構成
（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体およびそれらの抗体を構
成するＬ鎖またはＨ鎖に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a human / mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells and a constant region (C region) of a human antibody, human. The light chain (L chain) V region and the human heavy chain (H chain) V region complementarity determining regions (CDRs) are mouse monoclonal antibodies ON to human medulloblastoma cells.
It relates to reshaped human antibodies that have been replaced by the CDRs of S-M21 and the L or H chains that make up those antibodies.

【０００２】本発明はさらに、上記の抗体特にそのＶ領
域をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前
記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並
びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本
発明はさらに、ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗体の製
造方法、及びヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体の
製造方法を提供する。The present invention further provides the above-mentioned antibodies, especially the DNA encoding the V region thereof. The invention further relates to a vector, in particular an expression vector, which comprises said DNA, as well as a host transformed with said vector. The present invention further provides methods for producing chimeric antibodies against human medulloblastoma cells and methods for producing reshaped human antibodies against human medulloblastoma cells.

【０００３】本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再
構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域と該抗体のＬ鎖Ｖ領域とを連
結して成る一本鎖Ｆｖ領域に関する。本発明はまた、該
一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで
成る組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換
された宿主、及び該宿主を用いる、前記一本鎖Ｆｖ領域
の製造方法に関する。The present invention also relates to a single chain Fv region obtained by linking the H chain V region of a reshaped human antibody against human medulloblastoma cells and the L chain V region of the antibody. The present invention also provides a DNA encoding the single-chain Fv region, a recombinant vector comprising the DNA, a host transformed with the recombinant vector, and a single-chain Fv region using the host. It relates to a manufacturing method.

【０００４】[0004]

【従来の技術】髄芽腫は、グリオーマと共に脳腫瘍の４
０％を占める、原始神経外胚葉性腫瘍の一つであり、１
０才未満の小児、特に、５〜１０才の間で好発する悪性
脳腫瘍である。この腫瘍は胎生期の髄質上皮および基質
層を構成する未分化な細胞の形態と配列のパターンを模
倣する代表的な未分化腫瘍であり、神経細胞とグリア細
胞の両方に分化する可能性を持つ未成熟な腫瘍であると
されている（Ｔａｍｕｒａ，Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．，４９：５３８０−５３８４（１９８９））。この
ような悪性脳腫瘍は、放射線、化学療法剤に感受性を示
すことから、放射線療法および化学療法、さらには外科
的療法が治療として行われる。BACKGROUND OF THE INVENTION Medulloblastoma is a brain tumor together with glioma.
It is one of the primitive neuroectodermal tumors that occupy 0%.
It is a malignant brain tumor that is common among children under the age of 0, especially between the ages of 5 and 10. This tumor is a typical undifferentiated tumor that mimics the morphology and arrangement pattern of undifferentiated cells that make up the embryonic medullary epithelium and matrix layer, and has the potential to differentiate into both neuronal and glial cells. It is said to be an immature tumor (Tamura, K et al., Cancer Re
s. , 49 : 5380-5384 (1989)). Since such a malignant brain tumor is sensitive to radiation and chemotherapeutic agents, radiation therapy, chemotherapy, and surgical therapy are used as treatments.

【０００５】しかしながら、これらの治療法では、一時
的な症状の緩解はみられるものの、数年以内に再発死亡
するものが多く、平均生存日数は１５カ月である。この
原因は再発ガンが化学療法剤、放射線に耐性を持つよう
になるためであると考えられている。一方、脳腫瘍の正
確な判断は、組織学的手法に負うところが大きく、非常
に高度な専門的知識と補助的診断技術が必要である。[0005] However, although these treatments show a temporary remission of symptoms, many of them relapse and die within a few years, and the average survival time is 15 months. It is believed that this is because the recurrent cancer becomes resistant to chemotherapeutic agents and radiation. On the other hand, accurate determination of brain tumors depends largely on histological techniques, and requires highly advanced specialized knowledge and auxiliary diagnostic techniques.

【０００６】従って、早期に診断し、根本的な治療をす
るための診断薬、治療薬の開発が急務とされている。従
来においても、いくつかの髄芽腫を認識するモノクロー
ナル抗体による治療の試みがされている（Ｋｅｍｓｈｅ
ａｄ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１，
１８７−１９５（１９８３）、Ａｌｌａｎ，Ｐ．Ｍ．
ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１，５９１−５９８
（１９８３）、Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．，５７，６２１−６３１（１９８４）、Ｇｒ
ｏｓｓ，Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，２９
９８−２９９４（１９８６）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，
Ｃ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，５９３３
−５９４０（１９８６）、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｆ．Ｍ．ら、
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９，５５４−５５９（１
９８７）、Ｆｅｉｃｋｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．，４９，４３３８−４３４３（１９８
９）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．Ｓｃｉ．，８９，６３−７８（１９８９）、Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ，Ｈ．らＮｅｕｒｏｓｕｒｇ．，２７，９
７−１０２（１９９０）を参照）。[0006] Therefore, there is an urgent need to develop a diagnostic agent and a therapeutic agent for early diagnosis and fundamental treatment. In the past, attempts have been made to treat monoclonal antibodies that recognize some medulloblastomas (Kemshe.
ad, J .; T. Et al., Int. J. Cancer, 31 ,
187-195 (1983), Allan, P .; M.
Et al., Int. J. Cancer, 31 , 591-598
(1983), Jones, D.M. Br. J. Hem
atol. , 57 , 621-631 (1984), Gr.
Oss, N.M. Et al., Cancer Res. , 46 , 29
98-2994 (1986), Wikstrand,
C. D. Et al., Cancer Res. , 46 , 5933
-5940 (1986), Gibson, F .; M. ,
Int. J. Cancer, 39 , 554-559 (1
987), Feickert, H .; J. Et al, Cancer
r Res. , 49 , 4338-4343 (198).
9), Jennings, M .; T. Et al., J. Neuro
l. Sci. , 89 , 63-78 (1989), Tak.
ahashi, H .; Neurosurg. , 27 , 9
7-102 (1990)).

【０００７】しかしながら、これらの抗体のほとんど
は、正常組織や他の腫瘍をも認識するために、髄芽腫の
診断・治療薬としては不適である等の問題がある。最
近、ヒトグリオーマに反応し、ＡＤＣＣ活性を示すヒト
由来のモノクローナル抗体を用いた脳腫瘍の免疫療法
（特開昭５８−２０１９９４、特開昭５９−１３７４９
７、特開平４−３４６７９２を参照）が報告されてい
る。However, since most of these antibodies recognize normal tissues and other tumors, there is a problem that they are not suitable as a diagnostic / therapeutic drug for medulloblastoma. Recently, immunotherapy of a brain tumor using a human-derived monoclonal antibody that exhibits ADCC activity in response to human glioma (Japanese Patent Laid-Open Nos. 58-201994 and 59-13749).
7, refer to JP-A-4-346792).

【０００８】マウスのモノクローナル抗体はヒトにおい
て高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があ
り、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法
的価値は制限される。さらに、マウス抗体は、予定され
た効果を妨害するのみならず、患者における不都合なア
レルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起すること
なくして頻回投与することはできない。Mouse monoclonal antibodies are highly immunogenic in humans (sometimes referred to as "antigenic"), and for this reason their therapeutic value in humans is limited. Furthermore, mouse antibodies cannot be given frequently without interfering with their intended effects and without inducing an immune response that poses a risk of adverse allergic response in the patient.

【０００９】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクロー
ナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメ
ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、
そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に
結合することを期待することができる。In order to solve these problems, a method for producing a humanized antibody has been developed.
Mouse antibodies can be humanized in two ways.
A simpler method is to make a chimeric antibody in which the variable regions are derived from the original mouse monoclonal antibody and the constant regions are derived from the appropriate human antibody. The resulting chimeric antibody contains the complete variable region of the original mouse antibody,
It can then be expected to bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody.

【００１０】さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来す
る蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそ
れ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想
される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性
が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず
る可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４
２２０−４２２４，１９８９）。Furthermore, the chimeric antibody has a substantially reduced proportion of non-human derived protein sequences and is therefore expected to be less immunogenic than the original murine antibody. Although the chimeric antibody binds well to the antigen and is poorly immunogenic, it is possible that an immune response to the murine variable region may still occur (LoBuglio, AF et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 , 4
220-4224,1989).

【００１１】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト抗体可変領域
に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体可
変領域を作製する。The second method for humanizing mouse antibodies is more complex, but it greatly reduces the potential immunogenicity of mouse antibodies. In this method, the complementarity determining regions (complementarity determining regions) from the variable regions of the mouse antibody are used.
CDRs) are grafted onto human antibody variable regions to create "reshaped" human antibody variable regions.

【００１２】次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト
抗体定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型
抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと
極く一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲ
は超可変蛋白質配列により構成されている。これらは種
特異的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣ
ＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含
有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずで
ある。Next, these reshaped human variable regions are ligated to human antibody constant regions. The portion of the finally reconstituted human antibody derived from the protein sequence other than human is CDR and only a part of framework (FR). CDR
Is composed of a hypervariable protein sequence. These do not show species-specific sequences. For these reasons, mouse C
The reshaped human antibody carrying the DR should no longer be more immunogenic than the natural human antibody containing the human CDRs.

【００１３】再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３
−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８
８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４，７７３−７８３，１９９
１；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１
３４，１９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１
８１−４１８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７
１，１９９１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８
７３，１９９１；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−
４２８９，１９９２；Ｃｏ．Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４８，１１４９−１１５４，１９９２；及び
Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，８５
１−８５６，１９９３を参照のこと。For the reshaped human antibody, Rie is further described.
chmann, L .; Et al., Nature, 332 , 323.
-327, 1988; Verhoeyen, M .; And S
science, 239 , 1534-1536, 198.
8; Kettleboroh, C .; A. Et al, Pro
tain Enng. 4 , 773-783, 199
1; Maeda, H .; Et al, Human Antibod
ies and Hybridoma, 2 , 124-1
34, 1991; Gorman, S .; D. Et al, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 88 , 41
81-4185, 1991; Tempest, P .; R.
Et al., Bio / Technology, 9 , 266-27.
1, 1991; Co, M .; S. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 88 , 2869-28.
73, 1991; Carter, P .; Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 89 , 4285-.
4289, 1992; Co. M. S. Et al., J. Immu
nol. 148 , 1149-1154, 1992; and Sato, K .; Et al., Cancer Res. 53, 85
1-856, 1993.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】前記のごとく、再構成
ヒト抗体は治療目的のために有用であると予想される
が、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体は知られて
いない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任
意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しな
い。従って、特定の抗原に対して十分に活性がある再構
成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である
（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５
３，８５１−８５６（１９９３））。As mentioned above, reshaped human antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, but reshaped human antibodies against human medulloblastoma cells are not known. Furthermore, there is no method for producing reshaped human antibodies that is universally applicable to any particular antibody. Therefore, in order to produce a reshaped human antibody that is sufficiently active against a specific antigen, various efforts are required (for example, Sato, K. et al., Cancer Res. 5 ).
3 , 851-856 (1993)).

【００１５】本発明者等は、髄芽腫患者の小脳より髄芽
腫細胞株（ＯＮＳ−７６）を分離・確立した（Ｔａｍｕ
ｒａ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４９，５３８
０−５３８４（１９８９））。そして、該髄芽腫細胞株
ＯＮＳ−７６をマウスに免疫することによりヒト髄芽腫
を特異的に認識するが、正常な脳組織と末梢血球細胞と
は交差反応しないマウスモノクローナル抗体（ＯＮＳ−
Ｍ２１）を見い出した（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．らＢ
ｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，８３１−８３７（１９９
３））。本抗体が認識する抗原は髄芽腫をはじめ一部の
グリオーマ等の脳腫瘍に強く発現していることより、本
抗体の診断薬としての利用、さらにはＡＤＣＣ，ＣＤＣ
の誘導あるいはトキシン、ラジオアイソトープ結合体に
よる癌細胞の直接の破壊が期待される。The present inventors isolated and established a medulloblastoma cell line (ONS-76) from the cerebellum of a patient with medulloblastoma (Tamu).
ra, K.I. Et al., Cancer Res. , 49 , 538
0-5384 (1989)). A mouse monoclonal antibody (ONS-) which specifically recognizes human medulloblastoma by immunizing a mouse with the medulloblastoma cell line ONS-76 but does not cross-react with normal brain tissue and peripheral blood cells.
M21) was found (Moruchi, S. et al. B)
r. J. Cancer, 68 , 831-837 (199
3)). Since the antigen recognized by this antibody is strongly expressed in some brain tumors such as glioma including medulloblastoma, it can be used as a diagnostic agent for ADCC and CDC.
It is expected that the induction of the cancer or the direct destruction of cancer cells by the toxin-radioisotope conjugate.

【００１６】[0016]

【課題を解決するための手段】従って、本発明はヒト髄
芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ
２１の再構成ヒト抗体に関する。本発明はまた、該再構
成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マウスキメラ抗
体を提供する。本発明はさらに、マウスモノクローナル
抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の再構成ヒト抗体並びにキメラ抗体
の製造のための遺伝子工学的方法に関する。Accordingly, the present invention provides a mouse monoclonal antibody ONS-M against human medulloblastoma cells.
21 reconstituted human antibodies. The present invention also provides a human / mouse chimeric antibody useful in the process of producing the reshaped human antibody. The invention further relates to genetic engineering methods for the production of reshaped human antibodies of the mouse monoclonal antibody ONS-M21 as well as chimeric antibodies.

【００１７】具体的には、本発明は、（１）ヒト髄芽腫
細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１
のＬ鎖Ｖ領域；並びに（２）ヒト髄芽腫細胞に対するマ
ウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域、
または（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、及び前記ヒト髄芽腫
細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１
のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒト抗体
Ｈ鎖Ｃ領域、及びヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノク
ローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域を含んで成る
Ｈ鎖；を含んで成る、ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗
体、さらには、Specifically, the present invention provides (1) mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells.
L chain V region of H.V., and (2) H chain V region of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells,
Or (1) human antibody L chain C region and mouse monoclonal antibody ONS-M21 against the human medulloblastoma cells
An L chain comprising the L chain V region of H.V., and (2) a human antibody H chain C region and an H chain comprising the H chain V region of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells; A chimeric antibody against human medulloblastoma cells, further comprising

【００１８】（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワー
ク領域（ＦＲ）、及び（２）ヒト髄芽腫細胞に対するマ
ウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域の
ＣＤＲ、を含んで成る、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び（２）ヒト髄芽
腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２
１のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域から構成されるヒト髄芽腫細胞に対するマウス
モノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の再構成ヒト抗体に
関する。(1) A framework region (FR) of human antibody L chain V region, and (2) CDR of L chain V region of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells. Component human L chain V region; and (1) FR of human antibody H chain V region, and (2) mouse monoclonal antibody ONS-M2 against human medulloblastoma cells.
Reconstituted human H comprising the CDR of the V region of H chain 1
It relates to a reconstituted human antibody of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma cells composed of chain V regions.

【００１９】本発明はまた、前記種々の抗体を構成する
Ｌ鎖またはＨ鎖のポリペプチド、およびそれらをコード
するＤＮＡに関する。さらに、本発明は、上記ＤＮＡを
含んで成る発現ベクターおよびそれら発現ベクターによ
り形質転換された宿主に関する。本発明はさらにまた、
ヒト髄芽腫細胞に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒ
ト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト抗体の製造方法に関す
る。本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再構成ヒト
抗体のＨ鎖Ｖ領域と該モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域
とを連結して成る一本鎖Ｆｖ領域に関する。本発明はさ
らに、上記一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含んで成る組換えベクター、及び該組換えベクター
により形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、
上記の宿主を培養し、該培養物から一本鎖Ｆｖ領域を採
取することを特徴とする、一本鎖Ｆｖ領域の製造方法に
関する。The present invention also relates to L chain or H chain polypeptides constituting the various antibodies, and DNAs encoding them. Furthermore, the present invention relates to an expression vector comprising the above DNA and a host transformed with the expression vector. The present invention also provides
The present invention relates to a method for producing a chimeric antibody against human medulloblastoma cells and a method for producing a reshaped human antibody against human medulloblastoma cells. The present invention also relates to a single chain Fv region formed by linking the H chain V region of a reshaped human antibody against human medulloblastoma cells and the L chain V region of the monoclonal antibody. The present invention further provides a DNA encoding the above single-stranded Fv region, said DN
A recombinant vector comprising A, and a host transformed with the recombinant vector. The invention further comprises
It relates to a method for producing a single-chain Fv region, which comprises culturing the above host and collecting the single-chain Fv region from the culture.

【００２０】[0020]

【具体的な説明】マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニング ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体のＶ
領域をコードするＤＮＡをクローン化するためには、マ
ウスモノクローナル抗体産生細胞からｍＲＮＡを調製し
た後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的とするＤ
ＮＡを増幅することで得られる。このｍＲＮＡの供給源
として、ヒト髄芽腫細胞に対するモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマを作製することが必要である。
この様なハイブリドーマとして、ＯＮＳ−Ｍ２１を挙げ
ることができる。ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１の作製
方法を参考例１に後記する。[Detailed Description] Cloning of DNA encoding mouse antibody V region V of mouse monoclonal antibody against human medulloblastoma cells
In order to clone the DNA encoding the region, mRNA is prepared from mouse monoclonal antibody-producing cells, converted into double-stranded cDNA by a known method, and then the polymerase chain reaction (PCR) method is used. Do D
Obtained by amplifying NA. As a source of this mRNA, it is necessary to prepare a hybridoma that produces a monoclonal antibody against human medulloblastoma cells.
ONS-M21 can be mentioned as such a hybridoma. A method for producing the hybridoma ONS-M21 will be described later in Reference Example 1.

【００２１】（１）全ＲＮＡの採取 本発明において、全ＲＮＡを採取するため、ハイブリド
ーマ細胞を破壊し、グアニジンチオシアネート処理後、
塩化セシウム密度勾配遠心を行った（Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５
２９４−５２９９，１９７９）が、すでに他の蛋白質の
遺伝子をクローニングする際に用いられた方法、例えば
バナジウム複合体等のリボヌクレアーゼインヒビター存
在下に界面活性剤処理、フェノール処理を行う（Ｂｅｒ
ｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３−５１４９，１９７９）方法を用いること
ができる。(1) Collection of total RNA In the present invention, to collect total RNA, hybridoma cells are disrupted and treated with guanidine thiocyanate.
Cesium chloride density gradient centrifugation was performed (Chirgwi
n, J. M. Et al., Biochemistry, 18 , 5
294-5299, 1979) already used for cloning genes of other proteins, for example, treatment with a surfactant and phenol in the presence of a ribonuclease inhibitor such as vanadium complex (Ber).
ger, S.M. L. Et al., Biochemistry, 1
8 , 5143-5149, 1979) method can be used.

【００２２】（２）二本鎖ｃＤＮＡの採取 上記の如くして得た全ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得るに
は、全ＲＮＡを鋳型にして、その３′末端にあるｐｏｌ
ｙＡ鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆
転写酵素で処理して全ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４−９３
８，１９８９）ことができる。また、その時に、ランダ
ムプライマーを用いてもよい。(2) Collection of double-stranded cDNA To obtain single-stranded DNA from the total RNA obtained as described above, using the total RNA as a template, the pol at the 3'end
Single-stranded DNA complementary to total RNA by treating with reverse transcriptase using oligo (dT) complementary to yA chain as a primer
(CDNA) is synthesized (Larrick, JW.
Et al., Bio / Technology, 7 , 934-93.
8, 1989). At that time, a random primer may be used.

【００２３】（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
によるマウス抗体Ｖ領域の増幅 次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記ｃ
ＤＮＡからマウス抗体Ｖ領域の特異的増幅を行う。マウ
ス抗体Ｖ領域の増幅には、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．らＢｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１
に記載されているプライマーを用いることができる。ハ
イブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１が産生するマウスモノクロ
ーナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のクローニングに用いるプラ
イマーを決定するにあたり、Ｈ鎖およびＬ鎖のタイピン
グをして両鎖の型を決める必要がある。(3) Amplification of V Region of Mouse Antibody by Polymerase Chain Reaction (PCR) Method Next, by using the polymerase chain reaction (PCR) method, the above-mentioned c
Specific amplification of the mouse antibody V region is performed from DNA. For amplification of mouse antibody V regions, see Jones, S. et al. T. Et Bi
o / Technology, 9 , 88-89, 1991.
The primers described in 1. can be used. In determining the primer used for cloning the mouse monoclonal antibody ONS-M21 produced by the hybridoma ONS-M21, it is necessary to type the H chain and the L chain to determine the type of both chains.

【００２４】マウスモノクローナル抗体アイソタイピン
グキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）
を用いて、ＯＮＳ−Ｍ２１抗体のタイピングを行った結
果、ＯＮＳ−Ｍ２１抗体はＣκ型Ｌ鎖およびγ−１Ｃ型
のＨ鎖を有することが明らかになった。ＯＮＳ−Ｍ２１
のタイピングについて参考例２に後記する。次に、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてマウスモノクロ
ーナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域を増幅するた
め、配列番号：１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオ
チドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａ
ｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌク
レオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｃｏｎ
ｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー
及び３′−末端プライマーとして使用する。Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Amersham International plc)
As a result of typing of the ONS-M21 antibody using, it was revealed that the ONS-M21 antibody has a Cκ type L chain and a γ-1C type H chain. ONS-M21
The typing will be described later in Reference Example 2. Next, in order to amplify the kappa (κ) type L chain V region of the mouse monoclonal antibody using the polymerase chain reaction (PCR) method, 11 kinds of oligonucleotide primers (Mouse Kappa Varia) shown in SEQ ID NOs: 1 to 11 were used.
ble; MKV) and the oligonucleotide primer shown in SEQ ID NO: 12 (Mouse Kappa Con)
stant; MKC) is used as the 5'-end primer and the 3'-end primer, respectively.

【００２５】前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイ
ズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズす
る。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉ
ａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌ
クレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏ
ｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマ
ー及び３′−末端プライマーとして使用する。The MKV primer is a mouse kappa type L
Hybridizes to a DNA sequence encoding a chain leader sequence, and the MKC primer is mouse kappa type L
It hybridizes to the DNA sequence encoding the chain C region. 12 kinds of oligonucleotide primers (Mouse Heavy Vari) shown in SEQ ID NOs: 13 to 24 for amplification of H chain V region of mouse monoclonal antibody.
able; MHV) and the oligonucleotide primer shown in SEQ ID NO: 25 (Mouse Heavy Co)
nstant; MHC) is used as the 5'-end primer and the 3'-end primer, respectively.

【００２６】なお、本実施例では５′−末端プライマー
はその５′−末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提
供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プ
ライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断
部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有す
るものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可
変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベ
クターにサブクローニングするために用いられる限り、
他の制限酵素切断部位でもよい。In this example, the 5'-terminal primer contains the sequence GTCGAC which provides a restriction enzyme SalI cleavage site near its 5'-end, and the 3'-terminal primer is near its 5'-end. The one containing the nucleotide sequence CCCGGG which provides the restriction enzyme XmaI cleavage site is used. As long as these restriction enzyme cleavage sites are used for subcloning a DNA fragment of interest encoding a variable region into a cloning vector,
Other restriction enzyme cleavage sites may be used.

【００２７】次に、マウスモノクローナル抗体の目的と
する可変領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、増
幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩで切断した
後、低融点アガロースまたはカラム〔ＰＣＲ産物精製用
キット（ＱＩＡＧＥＮ等）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮII等）など〕により、分離・精製を行
う。他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクロー
ニングベクターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩに
より切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結
することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とす
る可変領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを
得る。Next, in order to obtain a DNA fragment encoding the desired variable region of the mouse monoclonal antibody, the amplification product was cleaved with restriction enzymes SalI and XmaI, and then a low melting point agarose or column [PCR product purification kit was used. (QIAGEN, etc.), DNA purification kit (GE
NECLEAN II) etc.]] for separation and purification. On the other hand, a plasmid containing a DNA fragment encoding the target variable region of a mouse monoclonal antibody by cutting an appropriate cloning vector such as plasmid pUC19 with the same restriction enzymes SalI and XmaI, and ligating the DNA fragment to this pUC19. To get

【００２８】クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意
の常法例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）を用いて行
うことができる。目的とするＤＮＡのクローン化及びそ
の配列決定を実施例１及び２に具体的に記載する。Sequencing of cloned DNA can be performed by any conventional method, such as an automated DNA sequencer (Appli).
ed Biosystems Inc. Manufactured). The cloning of the DNA of interest and its sequencing is specifically described in Examples 1 and 2.

【００２９】相補性決定領域（ＣＤＲ） Ｌ鎖及びＨ鎖の各対のＶ領域は抗原結合部位を形成す
る。Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保
存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補
性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Ｋａｂａ
ｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ
ｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎ
ｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ １９８３）。 Complementarity Determining Regions (CDRs) The V regions of each pair of L and H chains form the antigen binding site. The variable regions on the light and heavy chains are linked by four common, relatively conserved frameworks and three hypervariable or complementarity determining regions (CDRs) (Kaba).
t, E. A. Et al., “Sequences of Pro
tains of Immunological In
terest ", US Dept. Health an
d Human Services 1983).

【００３０】前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の
多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣ
ＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シ
ート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲ
はＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持さ
れ、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合
部位の形成に寄与する。Most of the four framework regions (FR) have a β-sheet structure, and as a result, three C regions.
DR forms a loop. The CDRs may in some cases form part of the β-sheet structure. 3 CDRs
Are held sterically very close to each other by the FRs and together with the three CDRs of the paired regions contribute to the formation of the antigen binding site.

【００３１】これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ
領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸
配列とを照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．
ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ
ｔ」の経験則から見出すことができ、実施例３において
具体的に説明する。These CDR regions correspond to the V of the obtained antibody.
By comparing the amino acid sequence of the region with the known amino acid sequence of the V region of a known antibody, Kabat, E., et al. A.
Et al., “Sequences of Proteins
of Immunological Interes
It can be found from the empirical rule of “t”, which will be specifically described in Example 3.

【００３２】キメラ抗体の作製 ヒト髄芽腫細胞に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計
するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域
を形成することを確かめる必要がある。この目的のた
め、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１に記載され
るモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のクローン化され
たＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒ
ト髄芽腫細胞抗体のアミノ酸配列を既知のマウス及びヒ
トの抗体のＶ領域と比較した。Preparation of chimeric antibody Prior to designing the reshaped human V region of the antibody against human medulloblastoma cells, it is necessary to confirm that the CDRs used actually form the antigen binding region. For this purpose chimeric antibodies were produced. Furthermore, the amino acid sequence of the mouse anti-human medulloblastoma cell antibody deduced from the nucleotide sequence of the cloned DNA of the monoclonal antibody ONS-M21 described in Example 1 is compared with the V regions of known mouse and human antibodies. did.

【００３３】モノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のマウ
スＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクロー
ニングされれば、これらのマウスＶ領域をヒト抗体定常
領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによ
ってキメラ抗ヒト髄芽腫細胞抗体が得られる。キメラ抗
体を作製するための基本的な方法は、クローン化された
ｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列
を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒト抗
体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んで成
る。Once the DNA fragments encoding the mouse L chain and H chain V regions of the monoclonal antibody ONS-M21 have been cloned, these mouse V regions can be expressed by linking them with the DNA encoding the human antibody constant region. Chimeric anti-human medulloblastoma cell antibodies are obtained. The basic method for making chimeric antibodies is to ligate the mouse leader sequence and V region sequences present in the cloned cDNA to sequences encoding the human antibody C region that are already present in the mammalian cell expression vector. Comprising that.

【００３４】前記ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領
域およびヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒト
Ｌ鎖ＣκあるいはＨ鎖γ−１Ｃやγ−４Ｃを各々挙げる
ことができる。キメラ抗体の製造のためには２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領
域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る
発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒト
Ｈ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクタ
ーを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳
類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質
転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養し
てキメラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−１６９２
８）。The human antibody C region may be any human L chain C region and human H chain C region, and examples thereof include human L chain Cκ or H chain γ-1C and γ-4C, respectively. For the production of chimeric antibodies, two types of expression vectors, ie, an expression comprising DNA encoding mouse L chain V region and human L chain C region under the control of expression control regions such as enhancer / promoter system. An expression vector comprising a vector and a DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region under an expression control region such as an enhancer / promoter system is prepared. Next, host cells such as mammalian cells are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric antibody (eg, WO91-1692).
8).

【００３５】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及び
ヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又は
イン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産さ
せる。Alternatively, the DNA encoding the mouse L chain V region and the human L chain C region and the DNA encoding the mouse H chain V region and the human H chain C region are introduced into a single expression vector, and the vector is introduced. It is used to transform a host cell and then the transformed host is cultured in vivo or in vitro to produce the desired chimeric antibody.

【００３６】キメラ抗体の作製を実施例４に記載する。
マウスＯＮＳ−Ｍ２１κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域
をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてサブクローン
し、ヒトゲノムＬ鎖Ｃκ鎖領域をコードするＤＮＡを含
有する発現ベクターに連結する。マウスＯＮＳ−Ｍ２１
抗体のγ１型Ｈ鎖リーダー及びＶ領域をコードするｃＤ
ＮＡを、ＰＣＲ法を用いてサブクローン化し、ヒトγ−
１Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベク
ターに連結する。The production of chimeric antibodies is described in Example 4.
A cDNA encoding the mouse ONS-M21 κ type L chain leader region and V region is subcloned using the PCR method and ligated to an expression vector containing a DNA encoding the human genomic L chain C κ chain region. Mouse ONS-M21
CD encoding γ1 type H chain leader and V region of antibody
NA was subcloned using the PCR method and human γ-
It is ligated to an expression vector containing genomic DNA encoding the 1C region.

【００３７】特に設計されたＰＣＲプライマーを用い
て、マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＶ領域をコードするｃＤＮ
Ａをそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基
配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入さ
れるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機
能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列
の導入により転写効率を上げるように工夫されてい
る）。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより
増幅して得たマウスＯＮＳ−Ｍ２１のＶ領域を、所望の
ヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（図
１）に挿入した。これらのベクターは、種々の哺乳類細
胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。CDN coding for the V region of mouse ONS-M21 using specifically designed PCR primers
A was introduced with appropriate base sequences at their 5'- and 3'-ends so that they would be easily inserted into the expression vector and that they would function properly in the expression vector. (For example, in the present invention, it is devised to increase transcription efficiency by introducing a Kozak sequence). Next, the V region of mouse ONS-M21 obtained by PCR amplification using these primers was inserted into the HEF expression vector (FIG. 1) which already contains the desired human C region. These vectors provide transient (tran) for genetically engineered antibodies in various mammalian cell lines.
suitable for stable or stable expression.

【００３８】キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体はヒト髄芽腫細
胞に結合する活性を示した。従って正しいマウスＶ領域
がクローン化されそして配列が決定されていたことが示
された。再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域の設計 マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植さ
れている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモ
ノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い
相同性が存在することが望ましい。従って、マウスＯＮ
Ｓ−Ｍ２１抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋを用いて構造が解明されてい
るすべての既知抗体のＶ領域と比較した。The chimeric ONS-M21 antibody showed an activity of binding to human medulloblastoma cells. It was therefore shown that the correct mouse V region had been cloned and sequenced. Design of V region of reshaped human ONS-M21 antibody In order to prepare a reshaped human antibody in which CDR of mouse monoclonal antibody is transplanted to human antibody, it is high between FR of mouse monoclonal antibody and FR of human antibody. It is desirable that there is homology. Therefore, mouse ON
The V regions of the L chain and H chain of the S-M21 antibody were labeled with Prote
Comparisons were made with the V regions of all known antibodies whose structure was elucidated using in Data Bank.

【００３９】マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域はヒト
Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループIV（ＨＳＧIV）のコンセンサ
ス配列に最も類似しており、６１．９％の相同性が存在
する。マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒ
ト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＬ鎖Ｖ領域の
サブグループＩの１構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩ
に６０．４％の類似性を示した。従って、再構成ヒトＯ
ＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料と
してＲＥＩのＦＲを使用した。The L chain V region of mouse ONS-M21 is most similar to the consensus sequence of human L chain V region subgroup IV (HSGIV), and there is 61.9% homology. The L chain V region of the mouse ONS-M21 antibody is a human L chain V region REI that is a member of subgroup I of the human L chain V region in comparison with the known human antibody L chain V region.
Showed a similarity of 60.4%. Therefore, reconstructed human O
FR of REI was used as a starting material for the production of NS-M21 antibody L chain V region.

【００４０】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域
の１６のバージョン「ａ」〜「ｐ」を設計した。第一の
バージョン（バージョン「ａ」）においては、ヒトＦＲ
は再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲ
ＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３２，３２３−３２７，（１９８８））（Ｗ
Ｏ９２−１９７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１のＬ鎖
Ｖ領域のバージョン「ａ」）と同一であり、そしてマウ
スＣＤＲはマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の
ＣＤＲと同一とした。Sixteen versions "a" to "p" of the reshaped human ONS-M21 antibody L chain V region were designed. In the first version (version "a"), human FR
Is the R present in the reshaped human CAMPATH-1H antibody
FR based on EI (Riechmann, L. et al., Nat
ure 332 , 323-327, (1988)) (W
O92-19759 and was identical to the reshaped human PM-1 L chain V region version "a") and the mouse CDRs were identical to the CDRs in the mouse ONS-M21 antibody L chain V region.

【００４１】表１，２は、マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体の
Ｌ鎖Ｖ領域、ＲＥＩのＦＲ及び１６バージョンの再構成
ＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を示
す。Tables 1 and 2 show the amino acid sequences of the L chain V region of the mouse ONS-M21 antibody, the FR of REI and the L chain V region of the 16-version reconstituted ONS-M21 antibody.

【００４２】[0042]

【表１】 [Table 1]

【００４３】[0043]

【表２】 [Table 2]

【００４４】注：ＲＥＩのＦＲ中の下線を付したアミノ
酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐａｌｍ，Ｗ．ら、Ｈ
ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５）とは異
なるアミノ酸の位置を示す。マウスＯＮＳ−Ｍ２１のＨ
鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧ
Ｉ）のコンセンサス配列に最も類似しており、５７．９
％の相同性が存在する。マウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ
鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較におい
て、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグ
ループＩの１構成員であるヒト抗体ＥｕのＨ鎖Ｖ領域
（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ９，３１６１，１９７０）に非常に類似し
ていた。さらには、ＣＤＲのサイズもマウスＯＮＳ−Ｍ
２１抗体とヒト抗体Ｅｕとの間で非常に類似していた。Note: The underlined amino acids in the FRs of REI are the amino acid sequences of human REI (Palm, W. et al., H.
oppe-Seyler's, Z. Physiol. C
hem. , 356 , 167-191, 1975). Mouse ONS-M21 H
The chain V region is a subgroup I (HSG) of the human H chain V region.
Most similar to the consensus sequence of I), 57.9
There is% homology. H of mouse ONS-M21 antibody
In comparison with the known human antibody H chain V region, the chain V region shows that from FR1 to FR3, the H chain V region of human antibody Eu (Cunningham, B) is a member of subgroup I of the human H chain V region. J. et al., Biochem.
Istry 9 , 3161, 1970). Furthermore, the size of CDR is mouse ONS-M
There was very similar between the 21 antibody and the human antibody Eu.

【００４５】このため、ヒト抗体ＥｕのＦＲを、再構成
ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出
発材料として用いた。しかしながら、ヒト抗体ＥｕのＦ
Ｒ４のアミノ酸配列は、ヒト抗体のサブグループＩコン
センサス配列と異った配列を有しているために、今回Ｆ
Ｒ４に関してはヒトＨ鎖Ｖ領域がサブグループＩに属す
るヒト抗体ＮＤ（Ｋｅｎｔｅｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
９，６６６１−６６６５（１９８２））のＦＲ４のアミ
ノ酸配列を用いることとした。Therefore, the FR of the human antibody Eu was used as a starting material for the production of the H chain V region of the reshaped human ONS-M21 antibody. However, the F of the human antibody Eu
Since the amino acid sequence of R4 has a sequence different from the subgroup I consensus sequence of human antibodies, this time F
Regarding R4, a human antibody ND in which the human H chain V region belongs to subgroup I (Kenten, JH, et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 7
9 , 6666-1665 (1982)) FR4 amino acid sequence.

【００４６】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＨ鎖Ｖ領
域を設計した。ヒトＦＲ１中の２７位、２８位、２９
位、３０位およびＦＲ３中の９４位のアミノ酸をマウス
ＯＮＳ−Ｍ２１のアミノ酸と同一とした。The V region of the H chain of the reshaped human ONS-M21 antibody was designed. 27th, 28th, 29th in human FR1
Amino acid at position 30, position 30 and position 94 in FR3 was made identical to the amino acid of mouse ONS-M21.

【００４７】[0047]

【表３】 [Table 3]

【００４８】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製 再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域の作製を実施例５
に具体的に記載する。本発明の再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２
１抗体は、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒト髄芽腫に対するマウスモノクローナル抗体
ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ
領域、を含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒト髄芽腫に対するマウスモノクローナル抗体
ＯＮＳ−Ｍ２１のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ
領域、を含んで成るＨ鎖；から構成される。 Preparation of Reshaped Human ONS-M21 Antibody Preparation of Reshaped Human ONS-M21 Antibody V Region Example 5
It will be specifically described in. Reconstituted human ONS-M2 of the present invention
1 antibody comprises (A) (1) human L chain C region and (2) human L chain F
R, and L chain V comprising the L chain V region CDR of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma
Region, and (B) (1) human H chain C region, and (2) human H chain F
R, and H chain V comprising the H chain V region CDRs of mouse monoclonal antibody ONS-M21 against human medulloblastoma
A heavy chain comprising a region;

【００４９】特定の抗原に対して十分に活性がある再構
成ヒト型化抗体を作成するために、前記ヒトＦＲのアミ
ノ酸配列の一部を置換することが望ましい。好ましい態
様においては、前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲ２の４６位のアミ
ノ酸がプロリンであること、または、４２，４３，４６
位のアミノ酸が各々、グルタミン、セリン、プロリンの
如きマウスＦＲ由来のアミノ酸を有するものがよく、さ
らに好ましくは、表１、表２に於けるＲＶＬｉ，ＲＶＬ
ｊ，ＲＶＬｌ，ＲＶＬｍ，ＲＶＬｏ，ＲＶＬｐのアミノ
酸配列を有するものである。In order to generate a reshaped humanized antibody which is sufficiently active against a specific antigen, it is desirable to replace a part of the amino acid sequence of the human FR. In a preferred embodiment, the amino acid at position 46 of FR2 of the L chain V region is proline, or 42, 43, 46
It is preferable that the amino acids at positions have amino acids derived from mouse FR such as glutamine, serine and proline, and more preferably RVLi and RVL in Table 1 and Table 2.
j, RVLl, RVLm, RVLo, RVLp.

【００５０】前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領
域であることができ、例えばヒトκＣ領域であり；そし
て前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であるこ
とができ、例えばヒトγ−１Ｃ領域、ヒトγ−４Ｃ領域
等である。あるいは、前記ヒトＬ鎖Ｃ領域および／また
は前記ヒトＨ鎖Ｃ領域のかわりにトキシン、ラジオアイ
ソトープを結合させてもよい。The human L chain C region can be any human L chain C region, such as a human kappa C region; and the human H chain C region can be any human H chain C region. , Human γ-1C region, human γ-4C region and the like. Alternatively, a toxin or radioisotope may be bound instead of the human L chain C region and / or the human H chain C region.

【００５１】再構成抗体の製造のためには、２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる（例えば、ＷＯ９１−１
６９２７）。For the production of the reshaped antibody, two types of expression vectors, that is, a DNA encoding the reshaped human L chain defined above under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system are included. And another expression vector comprising a DNA encoding a reshaped human heavy chain as defined above under an expression control region such as an enhancer / promoter system. These expression vectors are then used to co-transform host cells, such as mammalian cells, and the transformed cells are cultured in-vivo or in-vitro to produce reconstituted human antibodies (eg, , WO91-1
6927).

【００５２】あるいは、再構成Ｌ鎖をコードするＤＮＡ
及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベ
クターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形
質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビ
ボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗
体を生産せしめる。さらには、ＦａｂあるいはＦｖを、
またはＦｖを連結させたシングルチェインＦｖを適当な
宿主で産生させ、前述の目的に使用することができる
（例えばＢｉｒｄ等、ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−１
３７，（１９９１）を参照）。Alternatively, DNA encoding the reconstructed L chain
And a DNA encoding the reshaped human heavy chain is introduced into a single expression vector, and the vector is used to transform a host, which is then transformed in vitro or in vitro. The desired reshaped human antibody is produced by culturing. Furthermore, Fab or Fv
Alternatively, a single chain Fv in which Fv is linked can be produced in an appropriate host and used for the above-mentioned purpose (for example, Bird et al., TIBTECH, 9 , 132-1).
37, (1991)).

【００５３】以上のようにして目的とするキメラ抗体あ
るいはヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転換した
形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体あるいはヒト
型化抗体は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで
精製することができる。なお、本発明の目的蛋白質であ
るキメラ抗体あるいはヒト型化抗体の分離・精製を、プ
ロテインＡアガロースカラムを用いて行うことができ
る。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・
精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではな
い。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、
透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体あるいはヒ
ト型化抗体は分離・精製することができる。As described above, the transformant transformed with the gene encoding the desired chimeric antibody or humanized antibody is cultured, and the produced chimeric antibody or humanized antibody is produced inside or outside the cell. It can be separated and purified to homogeneity. The chimeric antibody or humanized antibody that is the target protein of the present invention can be separated and purified using a protein A agarose column. In addition, the separation and
Any purification method may be used without any limitation. For example, various chromatography, ultrafiltration, salt folding,
The chimeric antibody or humanized antibody can be separated and purified by appropriately selecting and combining dialysis and the like.

【００５４】ヒト髄芽腫細胞に対する本発明のキメラ抗
体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例
えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳
類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細
胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用するこ
とができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構
成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞
中で発現される。Any expression system for the production of chimeric or reconstituted human antibodies of the invention against human medulloblastoma cells, eg eukaryotic cells, eg animal cells, eg established mammalian cell lines, filamentous fungal cells. , And yeast cells, and prokaryotic cells such as bacterial cells such as E. coli cells and the like can be used. Preferably, the chimeric or reconstituted antibody of the invention is expressed in mammalian cells, such as COS cells or CHO cells.

【００５５】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−Ｖ
L −ＨＣK 等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９参照）が含まれ
る。In these cases, a conventional promoter useful for expression in mammalian cells can be used. For example, human cytomegalovirus
cytomegalovirus immediate
It is preferred to use the early; HCMV) promoter. Examples of expression vectors containing the HCMV promoter include HCMV-V H -HCγ1, HCMV-V
L- HC K and the like derived from pSV2neo (see International Publication WO 92-19759) are included.

【００５６】また、その他に、本発明のために用いるこ
とのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモー
ターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など
のウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェー
ン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いれば
よい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合
は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２７７
１０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモー
ターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，１８，５３２２，（１９９０））に従えば容易に実
施することができる。In addition, promoters for gene expression in mammalian cells that can be used for the present invention include viral promoters such as retrovirus, polyoma virus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) and human promoters. Polypeptide chain elongation factor 1α (HEF-1
A promoter derived from a mammalian cell such as α) may be used. For example, when the SV40 promoter is used, the method of Mulligan et al. (Nature 277
108 (1979)), or when using the HEF-1α promoter, see Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research
h, 18 , 5322, (1990)).

【００５７】複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主
細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター
は選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰ
Ｈ（３′）IIあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝
子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含む
ことができる。Origins of replication include SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (B
PV) etc. can be used, and the expression vector is used as a selectable marker for phosphotransferase AP in order to amplify the gene copy number in the host cell system.
It may include H (3 ′) II or I (neo) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene and the like.

【００５８】本発明はまた、ヒト髄芽腫細胞に対する再
構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結して成
る一本鎖Ｆｖ領域を提供する。このＦｖポリペプチドに
おいてＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は好ましくはリンカー、
好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている。
一本鎖Ｆｖ領域におけるＨ鎖Ｖ領域は、再構成ヒト抗体
のＨ鎖Ｖ領域として前記記載したもののいずれであって
もよい。このＨ鎖Ｖ領域は、下記に定義されるアミノ酸
配列：The present invention also provides a single chain Fv region formed by linking the H chain V region and L chain V region of a reshaped human antibody against human medulloblastoma cells. In this Fv polypeptide, the H chain V region and the L chain V region are preferably linkers,
Preferably, they are linked via a peptide linker.
The H chain V region in the single chain Fv region may be any of those described above as the H chain V region of the reshaped human antibody. This H chain V region has the amino acid sequence defined below:

【００５９】CDR1：Asp Thr Tyr Ile His CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr
Asp Pro Lys Phe GlnGly CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr またはその一部から成る３個のＣＤＲ、および４個のＦ
Ｒを含む。CDR1: Asp Thr Tyr Ile His CDR2: Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr
Asp Pro Lys Phe GlnGly CDR3: 3 CDRs consisting of Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr or part thereof, and 4 F
Contains R.

【００６０】また、Ｌ鎖Ｖ領域は、下記に定義されるア
ミノ酸配列： CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala またはその一部から成る３個のＣＤＲ、および４個のＦ
Ｒを含む。The L chain V region has an amino acid sequence defined as follows: CDR1: Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala CDR2: Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser CDR3: Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 3 CDRs consisting of Arg Ala or part thereof, and 4 Fs
Contains R.

【００６１】具体例として、配列番号：８０に記載のア
ミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１１６までのアミノ
酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：４０，４３，
４６，４７，５０，５１，５４，５５，５８，６１，６
２，６３，６６，６９，７０又は７３の内のいずれかに
記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１から１０６まで
のアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域を含んで成る一本鎖
Ｆｖ領域が挙げられる。また、好ましい１例として配列
番号：８０に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１か
ら１１６までのアミノ酸配列から成るＨ鎖Ｖ領域と配列
番号：７３に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１か
ら１０６までのアミノ酸配列から成るＬ鎖Ｖ領域とを含
んで成る一本鎖Ｆｖ領域が挙げられる。As a specific example, an H chain V region consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 116 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, and SEQ ID NOs: 40, 43,
46, 47, 50, 51, 54, 55, 58, 61, 6
A single chain Fv region comprising an L chain V region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 106 in the amino acid sequence of any of 2, 63, 66, 69, 70 or 73. . Also, as a preferred example, an H chain V region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 116 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80 and the amino acid numbers 1 to 106 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 And a single chain Fv region comprising the L chain V region consisting of the amino acid sequence of.

【００６２】これらのＶ領域は好ましくはペプチドリン
カーにより連結されている。ペプチドリンカーとして
は、例えばアミノ酸１２〜１９個から成る任意の一本鎖
Ｆｖ領域が挙げられるが、具体的な一例としてGly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser
（配列番号：９０）から成るペプチド断片が用いられ
る。一本鎖Ｆｖ領域の一例のアミノ酸配列を配列番号：
８９に示し、このアミノ酸配列を有する一本鎖Ｆｖ領域
を、本発明においてｓｃＦｖ−ｈＭ２１と称し、実施例
６において詳細に説明する。These V regions are preferably linked by a peptide linker. The peptide linker includes, for example, an arbitrary single-chain Fv region consisting of 12 to 19 amino acids, and as a specific example, Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser
A peptide fragment consisting of (SEQ ID NO: 90) is used. The amino acid sequence of an example of the single chain Fv region is shown in SEQ ID NO :.
The single-chain Fv region shown in 89 and having this amino acid sequence is referred to as scFv-hM21 in the present invention, and will be described in detail in Example 6.

【００６３】本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮ
Ａは、すでに詳細に説明した再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１
抗体のＨ鎖、又はＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、及び
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖、又はＬ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡを鎖型とし、それらの配列の内の所
望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端
を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅す
ることにより得られる。DN encoding the single chain Fv region of the present invention
A is the reconstituted human ONS-M21 described in detail above.
The DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and the L chain of the reshaped human ONS-M21 antibody or the DNA encoding the V region of the L chain are chained, and the desired amino acids in their sequences It is obtained by amplifying the DNA portion encoding the sequence by the PCR method using a pair of primers defining both ends thereof.

【００６４】実施例６において、Ｈ鎖Ｖ領域と、Ｌ鎖Ｖ
領域バージョンｐとを含んで成る一本鎖Ｆｖ領域をコー
ドするＤＮＡの作製方法を具体的に記載するが、Ｌ鎖Ｖ
領域のバージョンａ〜ｏのアミノ酸配列及びそれをコー
ドするＤＮＡの作製方法が詳細に記載されているから、
それらにバージョンｐにおいて用いた方法を適用するこ
とにより、本発明の種々の一本鎖Ｆｖ領域をコードする
ＤＮＡを作製することができる。In Example 6, the H chain V region and the L chain V region
A method for constructing a DNA encoding a single-chain Fv region comprising the region version p will be specifically described.
Since the amino acid sequences of the region versions a to o and the method for constructing the DNA encoding the same have been described in detail,
By applying the method used in version p to them, DNAs encoding various single-chain Fv regions of the present invention can be prepared.

【００６５】また、一旦一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤ
ＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、
及び該発現ベクターにより形質転換された宿主は常法に
従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に
従って、一本鎖Ｆｖ領域を得ることができる。これらの
具体例を実施例６に詳細に記載する。ＯＮＳ−７６細胞
に対するマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体の結合阻害能を指標
にしてｓｃＦｖ−ｈＭ２１の抗原結合活性をヒト型化Ｏ
ＮＳ−Ｍ２１抗体、およびＦａｂ断片と比較した結果、
ｓｃＦｖ−ｈＭ２１はＦａｂ断片と同等の結合阻害能を
示した。以上より、オリジナルの抗体と同程度のアフィ
ニティーを持つ一本鎖Ｆｖ領域の構築に成功した。D, which once encodes a single-chain Fv region,
Once NAs are created, expression vectors containing them,
And a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method, and a single chain Fv region can be obtained according to a conventional method using the host. Specific examples of these are described in detail in Example 6. The antigen-binding activity of scFv-hM21 was humanized O using the binding inhibitory ability of mouse ONS-M21 antibody to ONS-76 cells as an index.
As a result of comparison with NS-M21 antibody and Fab fragment,
scFv-hM21 showed the same binding inhibitory ability as Fab fragment. From the above, we succeeded in constructing a single-chain Fv region having the same affinity as the original antibody.

【００６６】一般に、一本鎖Ｆｖ領域はｗｈｏｌｅ Ｉ
ｇＧに比べ組織、腫瘍への移行性が優れており、今回構
築したｓｃＦｖ−ｈＭ２１は今後ＲＩ標識によるイメー
ジングへの利用、およびトキシン、ＲＩと結合させる事
により治療薬としての利用が期待される。In general, the single-chain Fv region is the whole I
Since it has better transferability to tissues and tumors than gG, the scFv-hM21 constructed this time is expected to be used for imaging by RI labeling and as a therapeutic drug by combining with toxin and RI.

【００６７】[0067]

【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１ ．ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナ
ル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化 ヒト髄芽腫細胞に対するマウスモノクローナル抗体ＯＮ
Ｓ−Ｍ２１の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にし
てクローン化した。EXAMPLES Next, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the present invention. Example 1 . Mouse monoclonal for human medulloblastoma cells
Mouse monoclonal antibody ON against the cloned human medulloblastoma cells of DNA encoding the V region of Le antibodies
The DNA encoding the variable region of S-M21 was cloned as follows.

【００６８】１．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の
調整 ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１からのｍＲＮＡを、Ｆａ
ｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）を用いて調整した。1. Of messenger RNA (mRNA)
The mRNA from the adjusted hybridoma ONS-M21 was expressed as Fa
st Track mRNA Isolation K
it Version 3.2 (Invitrogen
(Made by the company).

【００６９】２．二本鎖ｃＤＮＡの合成 約４μｇのｍＲＮＡよりＴＨＥ ＣＯＰＹ ＫＩＴ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合
成した。 ３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による
増幅 Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を用いてＰＣＲ法を行なった。2. From mRNA synthesis approximately 4μg of a double-stranded cDNA THE COPY KIT (I
Double-stranded cDNA was synthesized using Nvitrogen). 3. By PCR method of gene encoding antibody variable region
Amplification Thermal Cycler (Perkin Elm
er Cetus).

【００７０】（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝
子の増幅 ＰＣＲ法に使用するプライマーは、マウスカッパ型Ｌ鎖
リーダー配列とハイブリダイズする配列番号：１〜１１
に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，（１９９
１））を用いた。(1) Inheritance encoding mouse L chain V region
The primers used in the offspring amplification PCR method are SEQ ID NOs: 1 to 11 which hybridize with the mouse kappa type L chain leader sequence.
MKV (Mouse Kappa Variab shown in
le) primer (Jones, ST, et al., Bio /
Technology, 9 , 88-89, (199
1)) was used.

【００７１】ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，０．１mM ｄ
ＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）、１．５mM ＭｇＣｌ2 ，５ユニットのＤＮＡポリ
メラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社）、０．１μＭの配列番号１〜１１に示
すＭＫＶプライマーと０．４μＭの配列番号１２に示す
ＭＫＣプライマー及び二本鎖ｃＤＮＡ０．１μｇを含有
し、各々のＭＫＣ１〜１２プライマーについて別々に増
幅した。これを５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初
期温度にて３分間そして次に９４℃にて１分間、５０℃
にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱し
た。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物
をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。100 μl of the PCR solution is 10 mM Tri
s-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.1 mM d
NTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTT
P), 1.5 mM MgCl 2 , 5 units of DNA polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer
Cetus) containing 0.1 μM of the MKV primer shown in SEQ ID NOS: 1-11, 0.4 μM of the MKC primer shown in SEQ ID NO: 12 and 0.1 μg of double-stranded cDNA, and amplifying each MKC1-12 primer separately. did. This was covered with 50 μl of mineral oil, then at an initial temperature of 94 ° C. for 3 minutes and then at 94 ° C. for 1 minute at 50 ° C.
For 1 minute and 72 ° C. for 1 minute in that order. After repeating this temperature cycle 30 times, the reaction mixture was further incubated at 72 ° C. for 10 minutes.

【００７２】（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡの増幅 ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２４
に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示す
ＭＨＣ−Ｇ１（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏｎｓｔａ
ｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，（１９９
１））を使用した。(2) cD encoding the V region of mouse H chain
Amplification of NA SEQ ID NOs: 13-24 as primers for PCR
MHV (Mouse Heavy Variab)
le) Primers 1 to 12 and MHC-G1 (Mouse Heavy Consta shown in SEQ ID NO: 25)
nt) primer (Jones, ST et al., Bio /
Technology, 9 , 88-89, (199
1)) was used.

【００７３】ｃＤＮＡの増幅は、０．２５μＭのそれぞ
れのＭＨＶプライマーと２．５μＭのＭＨＣ−Ｇ１プラ
イマーの混合物を用いて増幅した点を除いて、前記３．
（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載し
たのと同じ方法により増幅を行なった。 ４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化 前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）にて精製し、そし
て１０mM ＭｇＣｌ2 及び１mMジスレイトールを含有す
る１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．９）中で５ユニッ
トの制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。Amplification of cDNA was carried out in the above 3. except that a mixture of 0.25 μM of each MHV primer and 2.5 μM of MHC-G1 primer was used for amplification.
Amplification was performed by the same method as described for the amplification of the L chain V region gene in (1). 4. Purification and Fragmentation of PCR Product The DNA fragment amplified by the PCR method as described above was purified by low melting point agarose (manufactured by Sigma), and 10 mM Tris-HCl (pH 7 containing 10 mM MgCl 2 and 1 mM disthritol). .9) 5 units of the restriction enzyme XmaI (New England Bi)
It was digested for 3 hours at 37 ° C. using oLabs.

【００７４】次に、４０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ
（宝酒造社製）により３７℃にて２時間消化し、そして
生ずるＤＮＡ断片を、１．５％低融点アガロース（Ｓｉ
ｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分
離した。約４５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロー
ス片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そ
してこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び２００mM Ｎａ
Ｃｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）
を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムに
より抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により
回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。Next, 40 units of the restriction enzyme SalI
(Manufactured by Takara Shuzo) at 37 ° C. for 2 hours, and the resulting DNA fragment was digested with 1.5% low melting point agarose (Si
Separation was carried out by agarose gel electrophoresis using GMA. Agarose pieces containing a DNA fragment of about 450 bp in length were cut out and melted for 5 minutes at 65 ° C. and an equal volume of 2 mM EDTA and 200 mM Na.
20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing Cl
Was added. The mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation and 10 mM Tr containing 1 mM EDTA.
It was dissolved in is-HCl (pH 7.5).

【００７５】こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウス
Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断
片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端に
ＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａ
Ｉ接着末端を有する。 ５．連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩ Ｄ
ＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ及びＸｍａＩで消化
することにより調製したｐＵＣ１９ベクター約０．１μ
ｇと、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６），１０mM
ＭｇＣｌ2 、１０mMジチオスレイトール、１mM ＡＴ
Ｐ，５０mg／mlのポリエチレングリコール（８０００）
及び１ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ Ｂ
ＲＬ製）を含有する反応混合物中で、１６℃にて４時間
反応させ連結した。Thus, a DNA fragment containing the gene encoding the mouse kappa type L chain variable region and a DNA fragment containing the gene encoding the mouse H chain variable region were obtained. Each of the above DNA fragments has a SalI sticky end at its 5'-end and an Xma at its 3'-end.
I with cohesive ends. 5. Ligation and transformation SalI-XmaID containing a gene encoding mouse kappa L chain V region prepared as described above
About 0.1 μ of pUC19 vector prepared by digesting about 0.3 μg of NA fragment with SalI and XmaI
g, 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM
MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, 1 mM AT
P, 50 mg / ml polyethylene glycol (8000)
And 1 unit T4 DNA ligase (GIBCO B
(Manufactured by RL) and reacted at 16 ° C. for 4 hours for ligation.

【００７６】次に、１０μｌの上記連結混合物を大腸菌
ＤＨ５αのコンピテント細胞５０μｌに加え、そしてこ
の細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び
氷上で１分間静置した。次いで４００μｌの２×ＹＴ培
地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））を加え、３７℃
にて１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））上にこの大腸菌を
まき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転
換体を得た。10 μl of the above ligation mixture was then added to 50 μl of E. coli DH5α competent cells and the cells were left on ice for 30 minutes, 42 ° C. for 1 minute and again on ice for 1 minute. Then 400 μl of 2 × YT medium (Molecular Cloning: A Lab)
oratory Manual, Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Labora
tory Press, (1989)), and added at 37 ° C.
After incubating for 1 hour at 2 × YT agar medium (Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual, Sambrook et al., C
old Spring Harbor Laborat
ory Press, (1989)) and this E. coli was seeded and incubated overnight at 37 ° C. to obtain an E. coli transformant.

【００７７】この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ培地１０ml中で３７℃にて一
夜培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ，（１９８９））に従ってプラスミドＤＮＡを
調製した。The transformants were grown overnight at 37 ° C. in 10 ml of 2 × YT medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and from this culture the alkaline method (Mol.
eco Cloning: A Laborato
ry Manual, Sambrook et al., Cold
Spring Harbor Laboratory P
The plasmid DNA was prepared according to res, (1989)).

【００７８】こうして得られた、ハイブリドーマＯＮＳ
−Ｍ２１に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣ−Ｍ２１−Ｖ
L と命名した。上記の同じ方法に従って、ハイブリドー
マＯＮＳ−Ｍ２１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ
ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH
と命名した。The hybridoma ONS thus obtained
The plasmid containing the gene encoding the mouse kappa type L chain V region derived from -M21 was designated as pUC-M21-V.
I named it L. According to the same method described above, a plasmid containing a gene encoding the mouse H chain V region derived from the hybridoma ONS-M21 was cloned into SalI-XmaI.
Made from DNA fragments and pUC-M21- VH
I named it.

【００７９】実施例２．ＤＮＡの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ製）およびＴａｑ Ｄｙｅ Ｄ
ｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ Ｉｎｃ製）を用いて、メーカー指定のプロトコ
ールに従って塩基配列を決定した。 Example 2 Determination of DNA base sequence The base sequence of the cDNA coding region in the above-mentioned plasmid was analyzed by an automatic DNA sequencer (Applied Bi).
ossystem Inc) and Taq Dye D
eoxy Terminator Cycle Seq
ueningKit (Applied Biosys
The nucleotide sequence was determined using tem Inc.) according to the protocol specified by the manufacturer.

【００８０】プラスミドｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL に含まれ
るマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする
遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示す。また、プラス
ミドｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH に含まれるマウスＯＮＳ−Ｍ
２１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を
配列番号２７に示す。実施例３ ．ＣＤＲの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を
有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、
「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｕ
Ｓ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。The nucleotide sequence of the gene encoding the L chain V region of the mouse ONS-M21 antibody contained in the plasmid pUC-M21- VL is shown in SEQ ID NO: 26. In addition, mouse ONS-M contained in the plasmid pUC-M21-V H
The nucleotide sequence of the gene encoding the H chain V region of 21 antibody is shown in SEQ ID NO: 27. Example 3 . CDR Determining The overall structure of the V regions of the light and heavy chains share similarities, with four framework portions each linked by three hypervariable regions, the complementarity determining regions (CDRs). ing. The amino acid sequence of the framework is relatively well conserved, while the variability of the amino acid sequence in the CDR regions is extremely high (Kabat, EA et al.,
"Sequences of Proteins of
Immunological Interest "U
S Dept. Health and Human S
services, 1983).

【００８１】この様な事実に基づき、ヒト髄芽腫細胞に
対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸
配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配
列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることに
よりＣＤＲ領域を表４に示す如く決定した。Based on the above facts, the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human medulloblastoma cells was applied to the amino acid sequence database of the antibody prepared by Kabat et al. Was determined as shown in Table 4.

【００８２】[0082]

【表４】 [Table 4]

【００８３】実施例４．クローン化ｃＤＮＡの発現の確
認（キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製） 発現ベクターの作製 キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体を発現するベクターを作製す
るため、それぞれマウスＯＮＳ−Ｍ２１κＬ鎖及びＨ鎖
Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＵＣ−Ｍ２１−
ＶL 及びｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH をＰＣＲ法により修飾し
た。そしてＨＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９
７５９参照）（図１を参照のこと）に導入した。 Example 4 Confirmation of expression of cloned cDNA
( Preparation of chimeric ONS-M21 antibody ) Preparation of expression vector In order to prepare a vector expressing the chimeric ONS-M21 antibody, cDNA clone pUC-M21- encoding mouse ONS-M21κ L chain and H chain V region, respectively.
VL and pUC-M21- VH were modified by the PCR method. And HEF expression vector (above, WO92-19
759) (see Figure 1).

【００８４】Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＯＮＳ
−Ｌ７２２Ｓ（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のため
の後方プライマーＯＮＳ−Ｈ３．２Ｓ（配列番号：２
９）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードす
るＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサ
ス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄIII
制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための
前方プライマーＯＮＳ−Ｌ７２２Ａ（配列番号：３０）
及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＯＮＳ−Ｈ３．
２Ａ（配列番号：３１）は、Ｊ領域の末端をコードする
ＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配
列及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように設計した。Rear primer ONS for the L chain V region
-L722S (SEQ ID NO: 28) and back primer ONS-H3.2S (SEQ ID NO: 2) for the H chain V region.
9) hybridizes to the DNA encoding the beginning of the leader sequence of each V region and is a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol.
196 , 947-950, 1987) and HindIII.
Designed to have a restriction site. Forward primer ONS-L722A (SEQ ID NO: 30) for L chain V region
And forward primers ONS-H3.
2A (SEQ ID NO: 31) was designed to hybridize to the DNA sequence encoding the end of the J region and have a splice donor sequence and a BamHI restriction site.

【００８５】１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），
５０mM ＫＣｌ，１００μＭ ｄＮＴＰｓ，１．５mM
ＭｇＣｌ2 、１００pmole ずつの各プライマー、１００
ngの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL 又はｐＵＣ−Ｍ
２１−ＶH ）、及び５ｕのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ酵素を含
有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油
で覆い、９４℃にて最初の変性の後、９４℃にて１分
間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを
３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベート
した。10 mM Tris-HCl (pH 8.3),
50 mM KCl, 100 μM dNTPs, 1.5 mM
MgCl 2 , 100 pmole each primer, 100
ng template DNA (pUC-M21- VL or pUC-M
21-V H ), and 100 μl of PCR reaction mixture containing 5 u of Ampli Taq enzyme were covered with 50 μl of mineral oil, followed by initial denaturation at 94 ° C. for 1 min at 94 ° C. for 1 min at 55 ° C. A cycle of 1 minute at 72 ° C was repeated 30 times, and finally, incubation was performed at 72 ° C for 10 minutes.

【００８６】ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース
ゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで消
化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクタ
ーＨＥＦ−ＶL −ｇκに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ
発現ベクターＨＥＦ−ＶH −ｇγにそれぞれクローニン
グした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有す
るＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ２
１Ｌ−ｇκ，ＨＥＦ−Ｍ２１Ｈ−ｇγ１と命名した。The PCR product was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, digested with HindIII and BamHI, and for the L chain V region into the HEF expression vector HEF- VL- gκ, the H chain V. HEF for the area
Each was cloned into the expression vector HEF- VH- gγ. After DNA sequencing, plasmids containing DNA fragments having the correct DNA sequences were each subjected to HEF-M2.
It was named 1L-gκ, HEF-M21H-gγ1.

【００８７】ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体の一過性発現を観察するた
め、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。
ＨＥＦ−Ｍ２１Ｌ−ｇκと、ＨＥＦ−Ｍ２１Ｈ−ｇγ１
Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を
用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時
形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×
１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１，９
００Ｖ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。 Transfection into COS cells To observe the transient expression of chimeric ONS-M21 antibody, the expression vector was tested in COS cells.
HEF-M21L-gκ and HEF-M21H-gγ1
COS cells were co-transformed by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad). 1x each DNA (10 μg) in PBS
Add to a 0.8 ml aliquot of 10 7 cells / ml to add 1,9
A pulse was applied with a capacity of 00 V and 25 μF.

【００８８】室温にて１０分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロ
ブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液
（ＧＩＢＣＯ社製）に加えた。７２時間のインキュベー
ションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片
を除去し、５倍量の結合緩衝液で平衡化したプロテイン
Ａアガロースカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ａ ＭＡＰＳIIキット、ＢｉｏＲａｄ）に適用し
た。カラムを１５倍量の結合緩衝液で洗浄し、次に５倍
量の溶出緩衝液で溶出した。溶出液を濃縮し、そしてマ
イクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０
０，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩衝液をＰＢＳに変え
た。After a 10-minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were added to DMEM culture medium (GIBCO) containing 10% γ-globulin-free fetal bovine serum. After 72 hours of incubation, the culture supernatant was collected, the cell debris was removed by centrifugation, and the protein A agarose column (Affi-Gel Protei) equilibrated with 5 volumes of binding buffer was used.
n A MAPSII kit, BioRad). The column was washed with 15 volumes of binding buffer and then eluted with 5 volumes of elution buffer. The eluate was concentrated and a microconcentrator (Centricon 10
0, manufactured by Amicon), and the buffer solution was changed to PBS.

【００８９】Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ 抗原結合測定のためのＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートを
次のようにして調整した。９６穴プレートに１０％のウ
シ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培養液により１×１０6
細胞／mlに調整したヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６（Ｔ
ａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，
４９，５３８０−５３８４，（１９８９））を加え、一
晩培養した後、０．１％グルタルアルデヒド（半井化学
薬品社製）にて固定した。ブロッキングの後、キメラＯ
ＮＳ−Ｍ２１抗体を順次希釈して、各穴に加え、室温に
てインキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファ
ターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）
を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液
を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。 Cell-ELISA A Cell-ELISA plate for measuring antigen binding was prepared as follows. 1 × 10 6 with a 96-well plate containing RPMI medium containing 10% fetal bovine serum
Human medulloblastoma cell line ONS-76 (T
amura et al. , Cancer Res. ,
49 , 5380-5384, (1989)), and after culturing overnight, it was fixed with 0.1% glutaraldehyde (manufactured by Hanai Chemical Co., Ltd.). After blocking, Chimera O
NS-M21 antibody was serially diluted, added to each well, incubated and washed at room temperature, and then alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (manufactured by Sigma).
Was added. After incubation and washing, the substrate solution was added and then the absorbance at 405 nm was measured.

【００９０】その結果、キメラ抗体ＯＮＳ−Ｍ２１は、
髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６と特異的に結合したことによ
り、このキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＯＮＳ
−Ｍ２１のＶ領域の正しい構造を有することが示唆され
た（図２を参照のこと）。実施例５ ．再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の作製 再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製 再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法による
ＣＤＲ−グラフティングにより作製した。この方法を図
３に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する
再構成ヒト抗体ＯＮＳ−Ｍ２１（バージョン「ａ」）の
作製のために８個のＰＣＲプライマーを使用した。外部
プライマーＡ（配列番号：３２）及びＨ（配列番号：３
３）は、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶL −ｇｋのＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズするように設計された。As a result, the chimeric antibody ONS-M21 was
This chimeric antibody is a mouse monoclonal antibody ONS due to its specific binding to the medulloblastoma cell line ONS-76.
It was suggested to have the correct structure of the V region of -M21 (see Figure 2). Example 5 . Preparation of reshaped human ONS-M21 antibody Preparation of reshaped human ONS-M21 antibody L chain V region Reshaped human ONS-M21 antibody L chain was prepared by CDR-grafting by the PCR method. This method is schematically shown in FIG. Eight PCR primers were used for the production of reshaped human antibody ONS-M21 (version "a") with FRs derived from human antibody REI. External primers A (SEQ ID NO: 32) and H (SEQ ID NO: 3)
3) is the DN of the HEF expression vector HEF- VL- gk
It was designed to hybridize with the A sequence.

【００９１】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＢ（配
列番号：３４）、Ｃ（配列番号：３５）及びＤ（配列番
号：３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲ−
グラフティングプライマーＥ（配列番号：３７）、Ｆ
（配列番号：３８）及びＧ（配列番号：３９）はアンチ
−センスＤＮＡ配列を有しそしてそれぞれプライマー
Ｂ，Ｃ及びＤの５′−末端のＤＮＡ配列に対する相補的
ＤＮＡ配列（２３〜３５bp）を有する。CDR-grafting primers B (SEQ ID NO: 34), C (SEQ ID NO: 35) and D (SEQ ID NO: 36) have a sense DNA sequence, and CDR-
Grafting primer E (SEQ ID NO: 37), F
(SEQ ID NO: 38) and G (SEQ ID NO: 39) have anti-sense DNA sequences and contain complementary DNA sequences (23-35 bp) to the 5'-terminal DNA sequences of primers B, C and D, respectively. Have.

【００９２】第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−
Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｇ、及びＤ−Ｈを行い、そして各ＰＣ
Ｒ生成物を精製した。第一ＰＣＲからの４つのＰＣＲ生
成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた
（ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマー
Ａ及びＨを加えて、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増幅した（第２ＰＣ
Ｒ）。前記ＰＣＲにおいては、ヒト抗体ＲＥＩからのＦ
Ｒに基く再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」をコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶL −ＳＫ２
ａ（特願平５−１２９７８７を参照）を鋳型として用い
た。Four reactions A- in the first PCR step
E, BF, CG, and DH, and each PC
The R product was purified. The four PCR products from the first PCR were assembled by their own complementarity (see WO92-19759). Next, external primers A and H were added to amplify the full-length DNA encoding the reshaped human ONS-M21 antibody L chain V region (second PC).
R). In the PCR, F from human antibody REI
Plasmid HEF-RV L -SK2 encoding reshaped human SK2 antibody L chain V region version "a" based on the R
a (see Japanese Patent Application No. 5-129787) was used as a template.

【００９３】第一ＰＣＲ段階においては、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，１００μＭ
ｄＮＴＰｓ，１．５mM ＭｇＣｌ2 、１００ngの鋳型
ＤＮＡ、１００pmole の各プライマー及び５ｕのＡｍｐ
ｌｉ Ｔａｑを含有する１００μｌのＰＣＲ混合物を用
いた。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆膜した。
最初に９４℃で変性した後、９４℃にて１分間、５５℃
にて１分間及び７２℃にて１分間の反応サイクルを行
い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。In the first PCR step, 10 mM Tr
is-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 100 μM
dNTPs, 1.5 mM MgCl 2 , 100 ng of template DNA, 100 pmole of each primer and 5 u of Amp.
100 μl of PCR mix containing Li Taq was used. Each PCR tube was covered with 50 μl of mineral oil.
First denature at 94 ° C, then at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C
The reaction cycle was 1 minute at 72 ° C. and 1 minute at 72 ° C., then incubated at 72 ° C. for 10 minutes.

【００９４】ＰＣＲ生成物Ａ−Ｅ（２１８bp），Ｂ−Ｆ
（１０１bp），Ｃ−Ｇ（１３１bp）及びＤ−Ｈ（１４７
bp）を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、
第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて
は、１μｇの各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐ
ｌｉ Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９
４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分
間で２サイクルインキュベートし、そして次に１００pm
ole の各外部プライマー（Ａ及びＨ）を加えた。ＰＣＲ
チューブを５０μｌの鉱油で覆い、そして前記と同一の
条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。PCR products AE (218 bp), BF
(101 bp), CG (131 bp) and DH (147
bp) was purified using a 1.5% low melting point agarose gel,
It was assembled by the second PCR. In the second PCR, 1 μg of each first PCR product and 5u of Amp
98 μl PCR mix containing Li Taq was added to 9
Incubate for 2 cycles at 4 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 2 minutes, and then 100 pm
ole of each external primer (A and H) was added. PCR
The tube was covered with 50 μl of mineral oil and 30 cycles of PCR were performed under the same conditions as above.

【００９５】第二ＰＣＲにより生じた５１６bpのＤＮＡ
断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、Ｂａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片を
ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶL −ｇｋにクローニング
した。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１
抗体Ｌ鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−
ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１
ａ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩
基配列を配列番号：４０に示す。516 bp DNA generated by the second PCR
The fragment was purified on a 1.5% low melting point agarose gel and Bam
After digestion with HI and HindIII, the obtained DNA fragment was cloned into HEF expression vector HEF- VL- gk. Reconstituted human ONS-M21 after DNA sequencing
DN encoding the correct amino acid sequence of antibody L chain V region
The plasmid containing the A fragment was designated HEF-RVL-M21a-
It was named gκ. This plasmid HEF-RVL-M21
The amino acid sequence and nucleotide sequence of the L chain V region contained in a-gκ are shown in SEQ ID NO: 40.

【００９６】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域
のバージョン「ｂ」を、ＰＣＲを用いる変異誘発法によ
って作製した。変異原プライマーＦＴＹ−１（配列番
号：４１）およびＦＴＹ−２（配列番号：４２）は、７
１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設
計した。プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを
鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終生
成物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII で消化
し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−
ＶＬ−ｇκにクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｂ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｂ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配
列および塩基配列を配列番号４３に示す。Reconstituted human ONS-M21 antibody L chain V region version "b" was generated by mutagenesis using PCR. Mutagenic primers FTY-1 (SEQ ID NO: 41) and FTY-2 (SEQ ID NO: 42) were 7
The phenylalanine at position 1 was designed to mutate to tyrosine. Amplification was carried out using the plasmid HEF-RVL-M21a-gκ as a template and the above primers, followed by purification of the final product and digestion with BamHI and HindIII, and the resulting DNA fragment was used as a HEF expression vector HEF-.
Cloning into VL-gκ and plasmid HEF-RV
L-M21b-gκ was obtained. This plasmid HEF-RV
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in L-M21b-gκ are shown in SEQ ID NO: 43.

【００９７】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域
の各バージョン「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，
「ｇ」，「ｈ」，「ｉ」，「ｊ」，「ｋ」，「ｌ」，
「ｍ」，「ｎ」，「ｏ」，「ｐ」を以下のようにして作
製した。バージョン「ｃ」は、変異原プライマーとして
８７位のチロシンがフェニルアラニンに変異するように
設計したＭ２１Ｍ２Ｓ（配列番号：４４）およびＭ２１
Ｍ２Ａ（配列番号：４５）を用い、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法
により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−
ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−
ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配
列を配列番号４６に示す。Each version of reshaped human ONS-M21 antibody L chain V region "c", "d", "e", "f",
"G", "h", "i", "j", "k", "l",
"M", "n", "o", and "p" were produced as follows. Version "c" is a mutagenized primer designed to mutate the tyrosine at position 87 to phenylalanine, M21M2S (SEQ ID NO: 44) and M21.
Using M2A (SEQ ID NO: 45), plasmid HEF-
The plasmid HEF-RVL-M21c- was amplified by PCR using RVL-M21a-gκ as a template DNA.
g k was obtained. This plasmid HEF-RVL-M21c-
The amino acid sequence and nucleotide sequence of the L chain V region contained in gκ are shown in SEQ ID NO: 46.

【００９８】バージョン「ｄ」は、変異原プライマーと
してＦＴＹ−１およびＦＴＹ−２とＭ２１Ｍ２Ｓおよび
Ｍ２１Ｍ２Ａを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２
１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｄ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｄ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配
列および塩基配列を配列番号４７に示す。Version "d" uses plasmids HEF-RVL-M2 using FTY-1 and FTY-2 and M21M2S and M21M2A as mutagenic primers.
Plasmid HEF-RV using 1a-gκ as a template DNA
L-M21d-gκ was obtained. This plasmid HEF-RV
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in L-M21d-gκ are shown in SEQ ID NO: 47.

【００９９】バージョン「ｅ」は、変異原プライマーと
して２０位のスレオニンがセリンに、２１位のイソロイ
シンがバリンに変異するように設計したＭ２１Ｍ３Ｓ
（配列番号：４８）およびＭ２１Ｍ３Ａ（配列番号：４
９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａを鋳
型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ
２１ｅ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ
２１ｅ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号５０に示す。Version "e" is a mutagenized primer designed to mutate threonine at position 20 to serine and isoleucine at position 21 to valine.
(SEQ ID NO: 48) and M21M3A (SEQ ID NO: 4)
9) was used to amplify the plasmid HEF-RVL-M21a as a template DNA to obtain the plasmid HEF-RVL-M.
21e-gκ was obtained. This plasmid HEF-RVL-M
The amino acid sequence and the base sequence contained in the L chain V region contained in 21e-gκ are shown in SEQ ID NO: 50.

【０１００】バージョン「ｆ」は、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｆＩ
で、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｅ−ｇκをＨｉ
ｎｄIII およびＨｉｎｆＩで各々消化し、１５２bpおよ
び２５０bpのＤＮＡ断片を得た。これらＤＮＡ断片を１
５％低融点アガロースゲルを用いて分離、精製した後、
連結し、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ｇκに挿
入して、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκを
得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκに
含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号５１に示す。Version "f" is the plasmid HEF-
RVL-M21c-gκ was treated with BamHI and HinfI
The plasmid HEF-RVL-M21e-gκ with Hi.
Digestion with ndIII and HinfI gave 152 bp and 250 bp DNA fragments, respectively. 1 of these DNA fragments
After separation and purification using a 5% low melting point agarose gel,
It was ligated and inserted into the HEF expression vector HEF-RVL-gκ to obtain the plasmid HEF-RVL-M21f-gκ. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-M21f-gκ are shown in SEQ ID NO: 51.

【０１０１】バージョン「ｇ」は、変異原プライマーと
して７３位のフェニルアラニンがロイシンに変異するよ
うに設計したＭ２１Ｍ４Ｓ（配列番号：５２）およびＭ
２１Ｍ４Ａ（配列番号：５３）を用い、プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅
し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを得
た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκに含
まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列
番号５４に示す。Version "g" is a mutagenized primer designed to mutate phenylalanine at position 73 into leucine, M21M4S (SEQ ID NO: 52) and M21.
Using 21M4A (SEQ ID NO: 53), plasmid HE
F-RVL-M21f-gκ was amplified as a template DNA to obtain a plasmid HEF-RVL-M21g-gκ. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-M21g-gκ are shown in SEQ ID NO: 54.

【０１０２】バージョン「ｈ」は、変異原プライマーと
してＭ２１Ｍ４ＳおよびＭ２１Ｍ４Ａを用い、プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして
増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｈ−ｇκを
得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｈ−ｇκに
含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号５５に示す。For version "h", M21M4S and M21M4A were used as mutagenic primers, and plasmid HEF-RVL-M21a-gκ was amplified as a template DNA to obtain plasmid HEF-RVL-M21h-gκ. The amino acid sequence and nucleotide sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-M21h-gκ are shown in SEQ ID NO: 55.

【０１０３】バージョン「ｉ」は、変異原プライマーと
して４２位のリジンがグルタミンに、４３位のアラニン
がセリンに、４６位のロイシンがプロリンに変異するよ
うに設計したＭ２１Ｍ５Ｓ（配列番号：５６）およびＭ
２１Ｍ５Ａ（配列番号：５７）を用い、プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅
し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκを得
た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκに含
まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列
番号５８に示す。Version "i" was designed so that lysine at position 42 was mutated to glutamine, alanine at position 43 was serine, and leucine at position 46 was proline as a mutagenesis primer, and M21M5S (SEQ ID NO: 56) and M
Using 21M5A (SEQ ID NO: 57), plasmid HE
F-RVL-M21g-gκ was amplified as a template DNA to obtain a plasmid HEF-RVL-M21i-gκ. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-M21i-gκ are shown in SEQ ID NO: 58.

【０１０４】バージョン「ｊ」は、変異原プライマーと
してＭ２１Ｍ５Ｓ，Ｍ２１Ｍ５Ａおよび８５位のスレオ
ニンがアスパラギン酸に変異するように設計したＭ２１
Ｍ６Ｓ（配列番号：５９）とＭ２１Ｍ６Ａ（配列番号：
６０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−
ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−Ｒ
ＶＬ−Ｍ２１ｊ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−Ｒ
ＶＬ−Ｍ２１ｊ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号６１に示す。Version "j" is a mutagenized primer designed to mutate M21M5S, M21M5A and threonine at position 85 to aspartic acid.
M6S (SEQ ID NO: 59) and M21M6A (SEQ ID NO:
60) using the plasmid HEF-RVL-M21i-
Amplification was performed using gκ as a template DNA, and plasmid HEF-R
VL-M21j-gκ was obtained. This plasmid HEF-R
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in VL-M21j-gκ are shown in SEQ ID NO: 61.

【０１０５】バージョン「ｋ」は、変異原プライマーと
してＭ２１Ｍ６ＳおよびＭ２１Ｍ６Ａを用い、プラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして
増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｋ−ｇκを
得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｋ−ｇκに
含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号６２に示す。For version "k", M21M6S and M21M6A were used as mutagenic primers and the plasmid HEF-RVL-M21g-gκ was amplified as a template DNA to obtain a plasmid HEF-RVL-M21k-gκ. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in this plasmid HEF-RVL-M21k-gκ are shown in SEQ ID NO: 62.

【０１０６】バージョン「ｌ」は、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＳｆａＮＩ
で、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκをＨｉ
ｎｄIII およびＳｆａＮＩで各々消化し、２２７bpおよ
び１６９bpのＤＮＡ断片を分離、精製した。得られたＤ
ＮＡ断片を連結し、発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ｇκ
に挿入し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｌ−ｇκ
を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｌ−ｇκ
に含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を
配列番号６３に示す。Version "l" is the plasmid HEF-
RVL-M21a-gκ was treated with BamHI and SfaNI
And the plasmid HEF-RVL-M21i-gκ was
Digested with ndIII and SfaNI, respectively, and DNA fragments of 227 bp and 169 bp were separated and purified. Obtained D
The NA fragment was ligated and the expression vector HEF-RVL-gκ
Inserted into the plasmid HEF-RVL-M211-gκ.
I got This plasmid HEF-RVL-M211-gκ
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in are shown in SEQ ID NO: 63.

【０１０７】バージョン「ｍ」は、変異原プライマーと
してＭ２１Ｍ５Ｓ，Ｍ２１Ｍ５Ａおよび８位のプロリン
がグルタミン酸に、９位のセリンがリジンに、１０位の
セリンがフェニルアラニンに変異するように設計したＭ
２１Ｍ７Ｓ（配列番号：６４）とＭ２１Ｍ７Ａ（配列番
号：６５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１
ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＬ−Ｍ２１ｍ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＬ−Ｍ２１ｍ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列番号６６に示す。Version "m" was designed so that M21M5S, M21M5A as the mutagenic primer and proline at position 8 were mutated to glutamic acid, serine at position 9 was lysine, and serine at position 10 was phenylalanine.
Using 21M7S (SEQ ID NO: 64) and M21M7A (SEQ ID NO: 65), plasmid HEF-RVL-M21.
Amplification was carried out using a-gκ as a template DNA, and
-RVL-M21m-gκ was obtained. This plasmid HEF
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in -RVL-M21m-gκ are shown in SEQ ID NO: 66.

【０１０８】バージョン「ｎ」は、変異原プライマーと
して４２位のリジンがグルタミン酸に、４３位のアラニ
ンがセリンに変異するように設計したＭ２１Ｍ８Ｓ（配
列番号：６７）およびＭ２１Ｍ８Ａ（配列番号：６８）
を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκを
鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｎ
−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｎ
−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基
配列を配列番号６９に示す。The version "n" was designed so that lysine at position 42 was mutated to glutamic acid and alanine at position 43 was mutated to serine as mutagenesis primers. M21M8S (SEQ ID NO: 67) and M21M8A (SEQ ID NO: 68)
Using the plasmid HEF-RVL-M21a-gκ as a template DNA.
-Gκ was obtained. This plasmid HEF-RVL-M21n
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in -gκ are shown in SEQ ID NO: 69.

【０１０９】バージョン「ｏ」は、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＬ−Ｍ２１ｂ−ｇκをＢａｍＨＩおよびＢｓｒＩ
で、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκをＨｉ
ｎｄIII およびＢｓｒＩで各々消化し、各プラスミドか
ら２５１bpおよび１４２bpのＤＮＡ断片を分離、精製し
た。得られた各々のＤＮＡ断片を連結し、発現ベクター
ＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに挿入し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｏ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶ
Ｌ−Ｍ２１ｏ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配
列および塩基配列を配列番号７０に示す。Version "o" is the plasmid HEF-
RVL-M21b-gκ was treated with BamHI and BsrI
The plasmid HEF-RVL-M21a-gκ with Hi.
Digested with ndIII and BsrI respectively, DNA fragments of 251 bp and 142 bp were separated and purified from each plasmid. The obtained DNA fragments were ligated and inserted into the expression vector HEF-VL-gκ, and the plasmid HEF-RV was inserted.
L-M21o-gκ was obtained. This plasmid HEF-RV
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in L-M21o-gκ are shown in SEQ ID NO: 70.

【０１１０】バージョン「ｐ」は、４６位のロイシンを
プロリンに変更するように設計した変異原プライマーＭ
２１Ｍ９Ｓ（配列番号：７１）およびＭ２１Ｍ９Ａ（配
列番号：７２）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ
２１ａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして用い、プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列および塩基配列を配列番号７３に示す。Version "p" is a mutagenic primer M designed to change leucine at position 46 to proline.
Using 21M9S (SEQ ID NO: 71) and M21M9A (SEQ ID NO: 72), plasmid HEF-RVL-M
Plasmid HE using 21a-gκ as template DNA
F-RVL-M21p-gκ was obtained. This plasmid HE
The amino acid sequence and the nucleotide sequence of the L chain V region contained in F-RVL-M21p-gκ are shown in SEQ ID NO: 73.

【０１１１】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域
の作製 再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＥｕのＦＲ１
〜３およびヒト抗体ＮＤのＦＲ４をコードするＤＮＡ配
列をＶ領域（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ Ｄｅｐｔ
Ｈｅａｌｔｈａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｓ，ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ
Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）の「ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇ
ｅ」に基いて設計し、そしてマウスＯＮＳ−Ｍ２１抗体
Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつなげる
ことにより、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域
をコードする全長ＤＮＡを設計した。Reshaped human ONS-M21 antibody H chain V region
The DNA encoding the reshaped human ONS-M21 antibody H chain V region was designed as follows. FR1 of human antibody Eu
~ 3 and the DNA sequence encoding FR4 of the human antibody ND was added to the V region (Kabat, EA et al., US Dept.
Healthand Human Service
s, US Governance Printing
Offices, 1991) "codon usag
The full-length DNA encoding the reshaped human ONS-M21 antibody H chain V region was designed by ligating to the DNA sequence encoding the CDR of the mouse ONS-M21 antibody H chain V region based on "e".

【０１１２】次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′−側
及び３′−側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコン
センサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナ
ー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるよ
うにした。こうして設計したＤＮＡ配列を４個のオリゴ
ヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌク
レオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴ
ヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析
した。Next, a HindIII recognition site / KOZAK consensus sequence and a BamHI recognition site / splice donor sequence were added to the 5'-side and 3'-side of this DNA sequence so that they could be inserted into the HEF expression vector. . The DNA sequence thus designed was divided into four oligonucleotides, and then computerized for secondary structure in the oligonucleotides that could interfere with the assembly of these oligonucleotides.

【０１１３】４個のオリゴヌクレオチド配列を配列番
号：７４〜７７に示す。これらのオリゴヌクレオチドは
１１１〜１３７塩基の長さを有し、２３〜２６bpのオー
バラップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内のＶＨ
２（配列番号：７４）、ＲＶＨ４（配列番号：７５）は
センスＤＮＡ配列を有し、そして他のＶＨ１（配列番
号：７６）、ＲＶＨ３（配列番号：７７）はアンチセン
スＤＮＡ配列を有する。これら４個のオリゴヌクレオチ
ドのＰＣＲ法によるアセンブリーの方法を図に示す。
（図４参照）The four oligonucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 74-77. These oligonucleotides have a length of 111 to 137 bases and an overlapping region of 23 to 26 bp. VH among oligonucleotides
2 (SEQ ID NO: 74), RVH4 (SEQ ID NO: 75) have a sense DNA sequence, and the other VH1 (SEQ ID NO: 76), RVH3 (SEQ ID NO: 77) have an antisense DNA sequence. The method of assembling these four oligonucleotides by the PCR method is shown in the figure.
(See Fig. 4)

【０１１４】１００ngずつの４種のオリゴヌクレオチド
及び５ｕのＡｍｐｌｉ Ｔａｑを含有する９８μｌのＰ
ＣＲ混合物を、９４℃にて２分間の最初の変性の後、９
４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分
間のから成る２サイクルのインキュベーションを行っ
た。１００ｐmoleずつのＲＨＰ１（配列番号：７８）及
びＲＨＰ２（配列番号：７９）を外部プライマーとして
添加した後、ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、
そして９４℃にて１分間の最初の変性の後、９４℃にて
１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３８
サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキ
ュベートした。98 μl of P containing 100 ng of each of the four oligonucleotides and 5 u of Ampli Taq
The CR mixture was subjected to an initial denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by 9
Two cycles of incubation were performed consisting of 2 minutes at 4 ° C, 2 minutes at 55 ° C and 2 minutes at 72 ° C. After adding RHP1 (SEQ ID NO: 78) and RHP2 (SEQ ID NO: 79) of 100 pmol each as an external primer, the PCR tube was covered with 50 μl of mineral oil,
Then, after the first denaturation at 94 ° C. for 1 minute, 38 at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute.
Cycled and then incubated at 72 ° C for 10 minutes.

【０１１５】４３８bpのＤＮＡ断片を１．５％低融点ア
ガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍ
ＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥ
Ｆ−ＶH −ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定
の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−
ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２
１−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および
塩基配列を配列番号：８０に示す。The 438 bp DNA fragment was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, HindIII and Bam.
Digested with HI and then HEF expression vector HE
It was cloned into F- VH- gγ1. D that encodes the correct H chain V region amino acid sequence after DNA sequencing
The plasmid containing the NA fragment was designated HEF-RVH-M21-
It was named gγ1. This plasmid HEF-RVH-M2
The amino acid sequence and the base sequence of the H chain V region contained in 1-gγ1 are shown in SEQ ID NO: 80.

【０１１６】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体の各鎖を評
価するため、まず、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖
のための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１
とキメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖のための発現ベクター
ＨＥＦ−Ｍ２１Ｌ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞を前記の
ようにして同時トランスフェクションし、前記のように
して抗体生成物を回収した後、前記のようにして抗原結
合測定にかけた。In order to evaluate each chain of the reshaped human ONS-M21 antibody, first, the expression vector HEF-RVH-M21-gγ1 for the reshaped human ONS-M21 antibody H chain was used.
And COS cells were co-transfected as described above with the expression vector HEF-M21L-gγ1 for the chimeric ONS-M21 antibody L chain and the antibody product was recovered as described above and then as described above. Antigen binding assay.

【０１１７】この結果を図５に示す。図５に示すように
陽性対照としてのキメラ抗体（ＣｈＭ２１）および再構
成Ｈ鎖とキメラＬ鎖とからなる抗体（ＣｈＬ／ＲＶＨ）
との間には抗原結合性に差がないことが確認された。次
に、再構成ヒト化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖の「ａ」から
「ｐ」の各バージョンと再構成ヒト化ＯＮＳ−Ｍ２１抗
体Ｈ鎖との組み合せを評価するため、Ｌ鎖の各バージョ
ンの発現プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκか
らＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκの内のいずれか一つ
とＨ鎖発現プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨとをＣＯＳ細胞に
同時トランスフェクションし、前記実施例４のＣｅｌｌ
ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、得られた
抗体について抗原結合測定を行った。その結果Ｌ鎖のバ
ージョン「ａ」から「ｈ」を有する抗体には抗原結合活
性が見られなかった（図６を参照のこと）。The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, a chimeric antibody (ChM21) as a positive control and an antibody composed of a reconstituted H chain and a chimeric L chain (ChL / RVH)
It was confirmed that there was no difference in the antigen-binding property between and. Next, in order to evaluate the combination of each of the "a" to "p" versions of the reshaped humanized ONS-M21 antibody L chain with the reshaped humanized ONS-M21 antibody H chain, expression of each version of the L chain was performed. COS cells were co-transfected with any one of the plasmids HEF-RVL-M21a-gκ to HEF-RVL-M21p-gκ and the H chain expression plasmid HEF-RVH, and the cells of Example 4 were transfected.
Antigen binding measurements were performed on the resulting antibodies using the method as described in ELISA. As a result, no antigen-binding activity was found in the antibodies having L chain versions “a” to “h” (see FIG. 6).

【０１１８】一方、「ｉ」，「ｊ」，「ｌ」，「ｍ」，
「ｏ」，「ｐ」の各Ｌ鎖バージョンを有する抗体は、陽
性対照であるキメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体（ＣｈＭ２１）
に匹敵する程度の良好な抗原結合性を示し、この組み合
せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成するこ
とが示唆された。なお、Ｌ鎖バージョン「ｋ」および
「ｎ」を有する抗体には抗原結合活性が見られなかった
（図７を参照のこと）。このことから、Ｌ鎖ＦＲ２の４
６位にプロリンを有する抗体は、良好な抗原結合性を示
す機能的抗原結合部位を再形成することが示唆された
（表１，２を参照）。On the other hand, "i", "j", "l", "m",
An antibody having each L chain version of "o" and "p" is a chimeric ONS-M21 antibody (ChM21) which is a positive control.
It showed a good antigen-binding property comparable to that of the above, suggesting that this combination forms a functional antigen-binding site in human antibody. Antigen-binding activity was not found in the antibodies having L chain versions "k" and "n" (see FIG. 7). From this, 4 of L chain FR2
It was suggested that an antibody having proline at the 6-position reforms a functional antigen-binding site showing good antigen-binding properties (see Tables 1 and 2).

【０１１９】実施例６．再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域の作成リンカー領域の構築 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gl
y Gly Ser （配列番号：９０）からなるリンカー領域を
コードするＤＮＡを次のようにして設計した。リンカー
領域をコードするＤＮＡ配列（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５，５８７９−５８８３，（１９８８））の５′−側
にＨ鎖Ｖ領域のＦＲ４のＣ末端の５アミノ酸残基をコー
ドする１５bpのＤＮＡ配列を、３′−側にＬ鎖Ｖ領域の
ＦＲ１領域のＮ末端の５アミノ酸残基をコードする１５
bpのＤＮＡ配列を付加し、さらにｐＵＣ１９ベクターに
挿入できるように、それぞれ５′−側及び３′−側にＨ
ｉｎｄIII 認識部位及びＥｃｏＲＩ認識部位を付加し
た。 Example 6 Reconstituted human ONS-M21 antibody
Construction of single chain Fv (scFv) region Construction of linker region Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gl
A DNA encoding a linker region consisting of y Gly Ser (SEQ ID NO: 90) was designed as follows. A DNA sequence encoding the linker region (Huston, JS.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85, 5879-5883, (1988)) and a 15 bp DNA sequence encoding 5 amino acid residues at the C-terminus of FR4 of the H chain V region at the 5'-side, and FR1 of the L chain V region at the 3'-side. 15 encoding 5 amino acid residues at the N-terminus of the region
A bp DNA sequence was added, and H's were added to the 5'-side and 3'-side, respectively, so that they could be inserted into pUC19 vector.
An indIII recognition site and an EcoRI recognition site were added.

【０１２０】こうして設計したＤＮＡ配列を基にセンス
及びアンチセンス方向の２個のオリゴヌクレオチドｓｃ
Ｆｖ−ＳおよびｓｃＦｖ−Ａを合成した。２個のオリゴ
ヌクレオチド配列を各々配列番号：８１及び８２に示
す。これらのオリゴヌクレオチドは８４塩基の長さを有
し、８１bpのオーバーラップ領域を有する。Based on the DNA sequence thus designed, two oligonucleotides sc in the sense and antisense directions were prepared.
Fv-S and scFv-A were synthesized. The two oligonucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 81 and 82, respectively. These oligonucleotides are 84 bases long and have an 81 bp overlap region.

【０１２１】１００pmole ずつの２種のオリゴヌクレオ
チドを、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）、１０
mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ジチオスレイトール、１mM
ＡＴＰ、５０mg／mlのポリエチレングリコール（８００
０）を含有する反応混合物２０μｌ中で、９６℃にて５
分、６５℃まで２０分かけ温度を下げた後、６５℃にて
１０分、３７℃まで２０分かけ温度を下げた後、３７℃
にて１０分、さらに７℃まで２０分かけ温度を下げた
後、７℃にて１夜インキュベートしてアニーリングを行
った。Two oligonucleotides of 100 pmole each were added to 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM.
mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, 1 mM
ATP, 50 mg / ml polyethylene glycol (800
5) at 20 ° C in a reaction mixture containing 0) at 96 ° C.
Min., After lowering the temperature to 65 ° C over 20 minutes, then at 65 ° C for 10 minutes, then lowering the temperature to 37 ° C over 20 minutes, then 37 ° C
The temperature was lowered at 10 ° C. for 20 minutes and further to 7 ° C. for 20 minutes, and then incubated at 7 ° C. overnight for annealing.

【０１２２】上記のようにアニーリングしたＤＮＡを、
ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで消化することにより調製
したｐＵＣ１９ベクターと連結した。ＤＮＡ配列決定の
後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラス
ミドをｐＵＣ−ｓｃＦｖ−５と命名した。The DNA annealed as described above was
It was ligated with pUC19 vector prepared by digestion with HindIII and EcoRI. After DNA sequencing, the plasmid containing the DNA fragment with the correct DNA sequence was named pUC-scFv-5.

【０１２３】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ
領域の作製 再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域を次の様
にして作製した。再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ
領域、及びリンカー領域、及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、
連結することにより、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一
本鎖Ｆｖ領域を作製した。この方法を図８に模式的に示
す。再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域の作
製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ−Ｅ）を使用し
た。プライマーＡ，ＣおよびＥはセンス配列を有し、プ
ライマーＢ，ＤおよびＦはアンチセンス配列を有する。Reconstituted human ONS-M21 antibody single chain Fv
Preparation of Region Reconstituted human ONS-M21 antibody single chain Fv region was prepared as follows. Reconstituted human ONS-M21 antibody H chain V
Region and linker region, and reshaped human ONS-M2
1 antibody L chain V region was amplified using the PCR method, respectively,
By ligation, a reconstituted human ONS-M21 antibody single chain Fv region was prepared. This method is schematically shown in FIG. Six PCR primers (AE) were used to generate the reshaped human ONS-M21 antibody single chain Fv region. Primers A, C and E have a sense sequence and primers B, D and F have an antisense sequence.

【０１２４】Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＣＰ
１（プライマーＡ、配列番号：８３）は、Ｈ鎖Ｖ領域の
Ｎ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＮｃ
ｏＩ認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のた
めの前方プライマーＳＣＰ２（プライマーＢ、配列番
号：８４）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡ
にハイブリダイズし且つリンカーにオーバーラップする
ように設計した。リンカーのための後方プライマーＳＣ
Ｐ３（プライマーＣ、配列番号：８５）は、リンカーの
Ｎ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＨ
鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップ
するように設計した。Rear primer SCP for the H chain V region
1 (primer A, SEQ ID NO: 83) hybridizes to DNA encoding the N-terminus of the H chain V region and Nc
It was designed to have an oI recognition site. The forward primer SCP2 for the H chain V region (primer B, SEQ ID NO: 84) is a DNA encoding the C terminus of the H chain V region.
Was designed to hybridize to and overlap the linker. Rear primer SC for linker
P3 (primer C, SEQ ID NO: 85) hybridizes to the DNA encoding the N-terminus of the linker and is H
It was designed to overlap the DNA encoding the C-terminus of the chain V region.

【０１２５】リンカーのための前方プライマーＳＣＰ４
（プライマーＤ、配列番号：８６）は、リンカーのＣ末
端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつＬ鎖Ｖ
領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップする
ように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳ
ＣＰ４（プライマーＥ、配列番号：８７）は、リンカー
のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、かつ
Ｌ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラッ
プするように設計した。Forward primer SCP4 for the linker
(Primer D, SEQ ID NO: 86) hybridizes to the DNA encoding the C-terminus of the linker and binds to the L chain V
It was designed to overlap the DNA encoding the N-terminus of the region. Rear primer S for L chain V region
CP4 (Primer E, SEQ ID NO: 87) was designed to hybridize to the DNA encoding the C-terminus of the linker and overlap with the DNA encoding the N-terminus of the L chain V region.

【０１２６】Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＷＳ４
−２（プライマーＦ、配列番号：８８）は、Ｌ鎖Ｖ領域
Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬ
ＡＧペプチドをコードする配列（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４−１
２１０，１９８８）、２個の転写停止コドン及びＥｃｏ
ＲＩ認識部位を有するように設計した。Forward primer WS4 for the L chain V region
-2 (Primer F, SEQ ID NO: 88) hybridizes to DNA encoding the C-terminus of the L chain V region and FL
A sequence encoding an AG peptide (Hopp, TP.
Et al., Bio / Technology, 6, 1204-1.
210, 1988), two transcription stop codons and Eco
It was designed to have a RI recognition site.

【０１２７】第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−
Ｂ，Ｃ−Ｄ、及びＥ−Ｆを行い、そして各ＰＣＲ生成物
を精製した。第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成
物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次
に、プライマーＡ及びＦを加えて、再構成ヒトＯＮＳ−
Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増
幅した（第２ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１（実施例５
を参照）、リンカー領域をコードするプラスミドｐＵＣ
−ｓｃＦｖ−５、及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域バージョン「ｐ」をコードするプラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκ（実施例５を参照）をそれ
ぞれ鋳型として用いた。Three reactions A- in the first PCR step
B, CD, and EF were performed and each PCR product was purified. The three PCR products obtained from the first PCR were assembled by their own complementarity. Next, primers A and F are added to reconstitute human ONS-
The full-length DNA encoding the single-chain Fv region of the M21 antibody was amplified (second PCR). In the first PCR,
A plasmid HEF-RVH-M21-gγ1 encoding the reshaped human ONS-M21 antibody H chain V region (Example 5)
Plasmid) which encodes the linker region.
-ScFv-5, and reconstituted human ONS-M21 antibody L
Plasmid HE encoding chain V region version "p"
F-RVL-M21p-gκ (see Example 5) was used as the template, respectively.

【０１２８】第一ＰＣＲ段階においては、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mMＫＣｌ、１００μＭ
ｄＮＴＰｓ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、１００ngの各鋳
型ＤＮＡ、１００pmole の各ＰＣＲプライマー及び５ユ
ニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を含有する１０
０μｌのＰＣＲ混合物を用いた。各ＰＣＲチューブは５
０μｌの鉱油で覆った後、９４℃にて１分間、５５℃に
て１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。
この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさ
らに７２℃にて１０分間インキュベートした。In the first PCR step, 10 mM Tr
is-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 100 μM
dNTPs, 1.5 mM MgCl 2 , 100 ng of each template DNA, 100 pmole of each PCR primer, and 5 units of DNA polymerase Ampli Taq (Pe
10 containing rkin Elmer Cetus)
0 μl of PCR mix was used. 5 for each PCR tube
After covering with 0 μl of mineral oil, heating was at 94 ° C. for 1 min, 55 ° C. for 1 min and 72 ° C. for 1 min, in that order.
After repeating this temperature cycle 30 times, the reaction mixture was further incubated at 72 ° C. for 10 minutes.

【０１２９】ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（３８２bp）、Ｃ−Ｄ
（９２bp）、及びＥ−Ｆ（３６３bp）を１．５％低融点
アガロースゲルを用いて精製し、第２ＰＣＲでアッセン
ブルした。第２ＰＣＲにおいては、鋳型として１μｇの
各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ
を含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて２
分、５５℃にて２分及び７２℃にて２分間で２サイクル
インキュベートし、そして次にそれぞれ１００pmole の
プライマーＡ及びＦを加えた。ＰＣＲチューブを５０μ
ｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１分、５５℃にて１
分及び７２℃にて２分間で３０サイクルのＰＣＲを行っ
た。PCR products AB (382 bp), CD
(92 bp) and EF (363 bp) were purified using 1.5% low melting point agarose gel and assembled in the second PCR. In the second PCR, 1 μg of the product of each first PCR and 5 u of Ampli Taq as template
PCR mixture containing 98 μl of 2 at 94 ° C.
Min, 55 ° C. for 2 minutes and 72 ° C. for 2 minutes for 2 cycles, and then 100 pmole of primer A and F respectively was added. PCR tube 50μ
Cover with 1 l of mineral oil and 1 min at 94 ° C, 1 at 55 ° C
PCR was performed for 30 minutes and 72 ° C. for 2 minutes.

【０１３０】第二ＰＣＲにより生じた７６７bpのＤＮＡ
断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、Ｎｃｏ
Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を発現
ベクターｐＳＣＦＶＴ７にクローニングした。なお、本
発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７は、大腸菌ペリプラズム分
泌発現系に適するｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．
Ｐ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９，４３
７９−４３８３，１９８７）を含んでいる。ＤＮＡ配列
決定の後、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領
域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含む
プラスミドをｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１と命名した（図
９を参照のこと）。本プラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ
２１に含まれる再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆ
ｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：８９に
示す。767 bp DNA generated by the second PCR
The fragment was purified on a 1.5% low melting point agarose gel and Nco
After digestion with I and EcoRI, the resulting DNA fragment was cloned into the expression vector pSCFVT7. The expression vector pSCFVT7 is a pelB signal sequence suitable for the Escherichia coli periplasmic secretion expression system (Lei, S. et al.
P. Et al., J. Bacteriology, 169, 43
79-4383, 1987). After DNA sequencing, the plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the reshaped human ONS-M21 antibody single chain Fv region was designated pSCFVT7-hM21 (see Figure 9). This plasmid pSCFVT7-hM
Reconstituted human ONS-M21 antibody single chain F contained in 21
The amino acid sequence and base sequence of the v region are shown in SEQ ID NO: 89.

【０１３１】大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換 １０ngの上記プラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１を大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞５０μｌに
加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて９
０秒間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００
μｌの２×ＹＴ培地を加え、３７℃にて１時間インキュ
ベートした後、２×ＹＴ寒天培地上にこの大腸菌をま
き、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換
体を得た。 Transformation of E. coli strain BL21 (DE3) 10 ng of the above plasmid pSCFVT7-hM21 was added to 50 μl of competent cells of E. coli BL21 (DE3) and the cells were incubated on ice for 30 minutes at 42 ° C.
Let stand for 0 seconds and again on ice for 1 minute. Then 400
After adding 1 μl of 2 × YT medium and incubating at 37 ° C. for 1 hour, this E. coli was spread on 2 × YT agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant.

【０１３２】再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ
領域の発現誘導 この形質転換体を、１％グルコース及び５０μｇ／mlの
アンピシリンを含有するＬＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１
９８９））３０ml中で３７℃にて一夜培養した。次に、
５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地で１０
０倍に希釈し、３７℃にて培養した。６５０nmでの吸光
度が０．３程度に達したところで、最終濃度が０．５mM
になる様にｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、Ｔ７プロモ
ーターの発現を誘導した。Reconstituted human ONS-M21 antibody single chain Fv
Induction of Region Expression This transformant was transformed into LB medium (Molecular) containing 1% glucose and 50 μg / ml ampicillin.
Cloning: A Laboratory Manual
al, Sambrook et al., Cold Spring.
Harbor Laboratory Press, (1
989)) Incubated in 30 ml at 37 ° C. overnight. next,
10 in LB medium containing 50 μg / ml ampicillin
It was diluted 0 times and cultured at 37 ° C. When the absorbance at 650 nm reached about 0.3, the final concentration was 0.5 mM.
To become isoprophylthio-β-D-ga
Lactoside (IPTG) was added to induce expression of the T7 promoter.

【０１３３】３７℃にてさらに一夜培養した後、培地を
回収し、遠心分離により細胞破片を除去し、等量のＰＢ
Ｓを加え、１５mlの０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ
（pH３．０）で平衡化した後、等量のＰＢＳにて中和し
た抗ＦＬＡＧアフィニティーカラム（Ａｎｔｉ−ＦＬＡ
ＧＭ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ，ＩＢＩ）に適用し
た。カラムを３倍量のＰＢＳで洗浄し、次に６mlの０．
１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（pH３．０）で溶出し
た。溶出液を濃縮し、マイクロコンセントレーター（Ｃ
ｅｎｔｒｉｃｏｎ１０，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩
衝液をＰＢＳに変えた。After further culturing at 37 ° C. overnight, the medium was collected and the cell debris was removed by centrifugation to remove an equal amount of PB.
S was added and 15 ml of 0.1M Glycine-HCl was added.
After equilibration with (pH 3.0), an anti-FLAG affinity column (Anti-FLA) neutralized with an equal volume of PBS was used.
GM2 Affinity Gel, IBI). The column was washed with 3 volumes of PBS, then 6 ml of 0.
Elution was performed with 1M Glycine-HCl (pH 3.0). The eluate is concentrated, and the microconcentrator (C
The buffer solution was changed to PBS using Entricon10 (manufactured by Amicon).

【０１３４】Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ マウスモノクローナルＯＮＳ−Ｍ２１抗体の抗原結合に
対する阻害活性を指標に再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体
一本鎖Ｆｖ領域の抗原結合活性を測定した。前記のよう
にして調整したＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートをブロッ
キングの後、５００ng／mlの濃度のマウスモノクローナ
ルＯＮＳ−Ｍ２１抗体と一緒に順次希釈した再構成ヒト
ＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆｖ領域、再構成ヒトＯＮＳ
−Ｍ２１抗体及び再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体より調
整したＦａｂ断片を各穴に加え、室温にてインキュベー
ション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ
抗−マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を加えた。イ
ンキュベーション及び洗浄の後、基質溶液を加え、次に
４０５nmでの吸光度を測定した。The antigen-binding activity of the single-chain Fv region of the reconstituted human ONS-M21 antibody was measured using the inhibitory activity against the antigen binding of the Cell-ELISA mouse monoclonal ONS-M21 antibody as an index. After blocking the Cell-ELISA plate prepared as described above, the reconstituted human ONS-M21 antibody single chain Fv region and reconstituted human were serially diluted with a mouse monoclonal ONS-M21 antibody at a concentration of 500 ng / ml. ONS
Fab fragment prepared from -M21 antibody and reconstituted human ONS-M21 antibody was added to each well, and after incubation and washing at room temperature, alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by ZYMED) was added. After incubation and washing, the substrate solution was added and then the absorbance at 405 nm was measured.

【０１３５】その結果、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体
一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ−ｈＭ２１）は再構成ヒトＯ
ＮＳ−Ｍ２１抗体（ｈＭ２１）に比べ約１／１０程度に
阻害活性が減少していたものの、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ
２１抗体より調整したＦａｂ断片（ｈＭ２１−Ｆａｂ）
と同程度の阻害活性を示した（図１０を参照のこと）。
このことから、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体一本鎖Ｆ
ｖ領域は、オリジナルの再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体
と同程度のアフィニティーを示すことが示唆された。As a result, the reshaped human ONS-M21 antibody single chain Fv region (scFv-hM21) was reconstituted human O.
Although the inhibitory activity was reduced to about 1/10 of that of NS-M21 antibody (hM21), reconstituted human ONS-M
Fab fragment prepared from 21 antibody (hM21-Fab)
It exhibited the same level of inhibitory activity as that of (see FIG. 10).
From this, the reconstituted human ONS-M21 antibody single chain F
It was suggested that the v region exhibits a similar affinity as the original reshaped human ONS-M21 antibody.

【０１３６】なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ
２１ｐ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇ
κ）、およびプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ
１を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１）とし
て工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市
東１丁目１番３号）に、平成５年１１月１８日に、各々
ＦＥＲＭ ＢＰ−４４７２および、ＦＥＲＭＢＰ−４４
７１としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。The above plasmid HEF-RVL-M is used.
Escherichia coli having 21p-gκ is Escherichia
E. coli DH5α (HEF-RVL-M21p-g
κ), and the plasmid HEF-RVH-M21-gγ.
E. coli containing 1 is Escherichia col
As DH5α (HEF-RVH-M21-gγ1), FERM BP-4472 and FERM BP-4472 on November 18, 1993, at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology (1-3, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture), respectively. , FERMBP-44
71 was deposited internationally under the Budapest Treaty.

【０１３７】参考例１．ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１
の作製 抗ヒト髄芽腫細胞モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマは、ヒト髄芽腫細胞ＯＮＳ−７６で免役したＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ
１をポリエチレングリコールを用いた常法により融合し
て作製した。髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６と結合する活性
を指標としたスクリーニングを行い、ハイブリドーマＯ
ＮＳ−Ｍ２１を樹立した（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．ら、
Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，８３１−８３７（１９
９３））。 Reference Example 1 Hybridoma ONS-M21
The hybridoma producing the anti-human medulloblastoma cell monoclonal antibody was immunized with human medulloblastoma cells ONS-76 B.
ALB / c mouse spleen cells and mouse myeloma cells P3U
1 was fused and prepared by a conventional method using polyethylene glycol. Hybridoma O was screened using the activity of binding to the medulloblastoma cell line ONS-76 as an index.
NS-M21 was established (Moruchi, S. et al.,
Br. J. Cancer, 68 , 831-837 (19
93)).

【０１３８】参考例２．マウスモノクローナル抗体ＯＮ
Ｓ−Ｍ２１のタイピング ハイブリドーマＯＮＳ−Ｍ２１をマウス腹腔に移植し、
得られた腹水をプロテインＡアガロースカラムにかけ、
精製マウスモノクローナル抗体を得た。得られたマウス
モノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１のＬ鎖およびＨ鎖の
タイプを調べるために、マウスモノクローナル抗体アイ
ソタイピングキット（アマシャムインターナショナルｐ
ｌｃ社製）を用いてタイピングを行った。その結果、Ｏ
ＮＳ−Ｍ２１抗体はκ型Ｌ鎖およびγ１型Ｈ鎖を有する
ことが明らかになった。 Reference Example 2 Mouse monoclonal antibody ON
S-M21 typing hybridoma ONS-M21 was transplanted into the abdominal cavity of a mouse,
The obtained ascites fluid was applied to a protein A agarose column,
A purified mouse monoclonal antibody was obtained. In order to examine the type of L chain and H chain of the obtained mouse monoclonal antibody ONS-M21, a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham International p.
(manufactured by lc) was used for typing. As a result, O
It was revealed that the NS-M21 antibody has a κ type L chain and a γ1 type H chain.

【０１３９】[0139]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40 配列番号：２ SEQ ID NO: 1 Sequence length: 40 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40 SEQ ID NO: 2

【０１４０】配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39Sequence Length: 39 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39

【０１４１】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 40 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40

【０１４２】配列番号：４ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43SEQ ID NO: 4 Sequence Length: 43 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43

【０１４３】配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40SEQ ID NO: 5 Sequence Length: 40 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40

【０１４４】配列番号：６ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37SEQ ID NO: 6 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37

【０１４５】配列番号：７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41SEQ ID NO: 7 Sequence Length: 41 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41

【０１４６】配列番号：８ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41SEQ ID NO: 8 Sequence Length: 41 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41

【０１４７】配列番号：９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35SEQ ID NO: 9 Sequence Length: 35 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35

【０１４８】配列番号：１０ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37SEQ ID NO: 10 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37

【０１４９】配列番号：１１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38SEQ ID NO: 11 Sequence Length: 38 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38

【０１５０】配列番号：１２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27SEQ ID NO: 12 Sequence length: 27 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27

【０１５１】配列番号：１３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37SEQ ID NO: 13 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37

【０１５２】配列番号：１４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36SEQ ID NO: 14 Sequence Length: 36 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36

【０１５３】配列番号：１５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37SEQ ID NO: 15 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37

【０１５４】配列番号：１６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35SEQ ID NO: 16 Sequence Length: 35 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35

【０１５５】配列番号：１７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40SEQ ID NO: 17 Sequence Length: 40 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40

【０１５６】配列番号：１８ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37SEQ ID NO: 18 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37

【０１５７】配列番号：１９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36SEQ ID NO: 19 Sequence Length: 36 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36

【０１５８】配列番号：２０ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33SEQ ID NO: 20 Sequence Length: 33 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33

【０１５９】配列番号：２１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40SEQ ID NO: 21 Sequence Length: 40 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40

【０１６０】配列番号：２２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37SEQ ID NO: 22 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37

【０１６１】配列番号：２３ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38SEQ ID NO: 23 Sequence Length: 38 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38

【０１６２】配列番号：２４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37SEQ ID NO: 24 Sequence Length: 37 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37

【０１６３】配列番号：２５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28SEQ ID NO: 25 Sequence Length: 28 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

【０１６４】配列番号：２６ 配列の長さ：３８２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：ｐＵＣ−Ｍ２１−ＶL 特徴： １．．７２ ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ７３．．３８２ ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 配列SEQ ID NO: 26 Sequence length: 382 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: cDNA Origin organism name: Mouse Direct origin Clone: pUC-M21-V L features: 1. ． 72 sig peptide 73. ． 382 mat peptide array

【０１６５】 ATG GAG TCA CAT ATT CAG GTC TTT GTA TAC ATG TTG CTG TGG TTG 45 Met Glu Ser His Ile Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu 5 10 15 TCT GGT GTT GAT GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAA AAA TTC 90 Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe 20 25 30 ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC 135 Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala 35 40 45 AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA 180 Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 GGG CAA TCT CCT AAA CCA CTG ATT TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC 225 Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr 65 70 75 AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT 270 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 TTC ACT CTC ACC ATC ACC AAT GTG CAG TCT GAA GAC TTG GCA GAC 315 Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp 95 100 105 TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGT GGA 360 Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gly 110 115 120 GGC ACC AAA CTG GAA ATC AAA C 382 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 125 ATG GAG TCA CAT ATT CAG GTC TTT GTA TAC ATG TTG CTG TGG TTG 45 Met Glu Ser His Ile Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu 5 10 15 TCT GGT GTT GAT GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAA AAA TTC 90 Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe 20 25 30 ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC 135 Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala 35 40 45 AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA 180 Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 GGG CAA TCT CCT AAA CCA CTG ATT TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC 225 Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr 65 70 75 AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT 270 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 TTC ACT CTC ACC ATC ACC AAT GTG CAG TCT GAA GAC TTG GCA GAC 315 Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp 95 100 105 TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TT C GGT GGA 360 Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gly 110 115 120 GGC ACC AAA CTG GAA ATC AAA C 382 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 125

【０１６６】配列番号：２７ 配列の長さ：４０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：ｐＵＣ−Ｍ２１−ＶH 特徴： １．．５７ ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ５８．．４０９ ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 配列SEQ ID NO: 27 Sequence length: 409 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: cDNA Origin organism name: Mouse Direct origin Clone: pUC-M21-V H features: 1. ． 57 sig peptide 58. ． 409 mat peptide array

【０１６７】 ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 Met Lys Cys Ser Trp Val Met Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr 5 10 15 GGG GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT 90 Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 35 40 45 TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GCG AAG CAG AGG CCT 180 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro 50 55 60 GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT 225 Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly 65 70 75 AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA 270 Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr 80 85 90 GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG 315 Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu 95 100 105 ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT TCG GCC TAC TAT 360 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ala Tyr Tyr 110 115 120 GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 405 Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 125 130 135 TCA G 409 Ser ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 Met Lys Cys Ser Trp Val Met Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr 5 10 15 GGG GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT 90 Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC 135 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 35 40 45 TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GCG AAG CAG AGG CCT 180 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro 50 55 60 GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT 225 Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly 65 70 75 AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA 270 Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr 80 85 90 GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG 315 Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu 95 100 105 ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT TCG GCC TAC TAT 360 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ala Tyr Tyr 110 115 120 GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 405 Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 125 130 135 TCA G 409 Ser

【０１６８】配列番号：２８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGGGC TTCAAGATGG AGTC 34SEQ ID NO: 28 Sequence length: 34 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GATAAGCTTC CACCATGGGC TTCAAGATGG AGTC 34

【０１６９】配列番号：２９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCCAGTT TGGT 34SEQ ID NO: 29 Sequence length: 34 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GGCGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCCAGTT TGGT 34

【０１７０】配列番号：３０ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGAAA TGCAGCTGGG TCATGTTCTT CCT 43SEQ ID NO: 30 Sequence Length: 43 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GATAAGCTTC CACCATGAAA TGCAGCTGGG TCATGTTCTT CCT 43

【０１７１】配列番号：３１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA CTGA 34SEQ ID NO: 31 Sequence Length: 34 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA CTGA 34

【０１７２】配列番号：３２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGACAGTGG TTCAAAGT 18SEQ ID NO: 32 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence CAGACAGTGG TTCAAAGT 18

【０１７３】配列番号：３３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26SEQ ID NO: 33 Sequence Length: 26 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26

【０１７４】配列番号：３４ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGTCAGAATG TGGGTACTAA TGTAGCCTGG TACCAGCAGA AGCC 44SEQ ID NO: 34 Sequence Length: 44 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence AGTCAGAATG TGGGTACTAA TGTAGCCTGG TACCAGCAGA AGCC 44

【０１７５】配列番号：３５ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCTATCGGT ACAGTGGTGT GCCAAGCAGA TTCAGCGG 38SEQ ID NO: 35 Sequence Length: 38 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TCCTATCGGT ACAGTGGTGT GCCAAGCAGA TTCAGCGG 38

【０１７６】配列番号：３６ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTACCTACT ACTGCCAGCA ATATAACAGC TATCCTCGGG CGTTCGG 47SEQ ID NO: 36 Sequence Length: 47 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GCTACCTACT ACTGCCAGCA ATATAACAGC TATCCTCGGG CGTTCGG 47

【０１７７】配列番号：３７ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACATTAGTAC CCACATTCTG ACTGGCCTTA CAGGTGATGG TCAC 44SEQ ID NO: 37 Sequence Length: 44 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACATTAGTAC CCACATTCTG ACTGGCCTTA CAGGTGATGG TCAC 44

【０１７８】配列番号：３８ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCACACCAC TGTACCGATA GGATGCCGAG TAGATCAGCA GCTTTGG 47SEQ ID NO: 38 Sequence Length: 47 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGCACACCAC TGTACCGATA GGATGCCGAG TAGATCAGCA GCTTTGG 47

【０１７９】配列番号：３９ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATAGCTGT TATATTGCTG GCAGTAGTAG GTAGCGATGT CCTC 44SEQ ID NO: 39 Sequence Length: 44 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGATAGCTGT TATATTGCTG GCAGTAGTAG GTAGCGATGT CCTC 44

【０１８０】配列番号：４０ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 40 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21a-g [kappa] amino acid-19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１８１】配列番号：４１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31SEQ ID NO: 41 Sequence Length: 31 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31

【０１８２】配列番号：４２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31SEQ ID NO: 42 Sequence length: 31 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31

【０１８３】配列番号：４３ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｂ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGT GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 43 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21b-gκ amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGT GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１８４】配列番号：４４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTACCTACT TCTGCCAGCA ATATAACAG 29SEQ ID NO: 44 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GCTACCTACT TCTGCCAGCA ATATAACAG 29

【０１８５】配列番号：４５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGCTGGCAGA AGTAGGTAGC GATGTCCTC 29SEQ ID NO: 45 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TGCTGGCAGA AGTAGGTAGC GATGTCCTC 29

【０１８６】配列番号：４６ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｃ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 46 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21c-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１８７】配列番号：４７ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｄ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 47 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21d-g [kappa] amino acid-19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Ar g Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１８８】配列番号：４８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGACAGAGTG TCCGTCACCT GTAAGGCCA 29SEQ ID NO: 48 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TGACAGAGTG TCCGTCACCT GTAAGGCCA 29

【０１８９】配列番号：４９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTACAGGTGA CGGACACTCT GTCACCCAC 29SEQ ID NO: 49 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence TTACAGGTGA CGGACACTCT GTCACCCAC 29

【０１９０】配列番号：５０ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｅ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 50 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21e-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１９１】配列番号：５１ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｆ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 51 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21f-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１９２】配列番号：５２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACTTCACCT TGACCATCAG CAGCCT 26SEQ ID NO: 52 Sequence Length: 26 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GACTTCACCT TGACCATCAG CAGCCT 26

【０１９３】配列番号：５３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTGCTGATGG TCAAGGTGAA GTCGGT 26SEQ ID NO: 53 Sequence Length: 26 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence CTGCTGATGG TCAAGGTGAA GTCGGT 26

【０１９４】配列番号：５４ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｇ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 54 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21g-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１９５】配列番号：５５ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｈ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 55 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21h-g? Amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１９６】配列番号：５６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGACAGAGTC CAAAGCCGCT GATCTACTC 29SEQ ID NO: 56 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGACAGAGTC CAAAGCCGCT GATCTACTC 29

【０１９７】配列番号：５７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCAGCGGCT TTGGACTCTG TCCTGGCTT 29SEQ ID NO: 57 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ATCAGCGGCT TTGGACTCTG TCCTGGCTT 29

【０１９８】配列番号：５８ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｉ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 58 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21i-g [kappa] amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１９９】配列番号：５９ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGGACATCG CTGACTACTT CTGCCA 26SEQ ID NO: 59 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GAGGACATCG CTGACTACTT CTGCCA 26

【０２００】配列番号：６０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGTAGTCAG CGATGTCCTC TGGCTG 26SEQ ID NO: 60 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence AAGTAGTCAG CGATGTCCTC TGGCTG 26

【０２０１】配列番号：６１ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｊ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC GAC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Asp Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 61 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21j-gκ amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC GAC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Asp Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２０２】配列番号：６２ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｋ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC GAC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Asp Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 62 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21k-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTG ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC GAC TAC 315 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Asp Tyr 75 80 85 TTC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２０３】配列番号：６３ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｌ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 63 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M211-gκ amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG TCC GTC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２０４】配列番号：６４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGAGCCAAA AGTTCCTGAG CGCCAG 26SEQ ID NO: 64 Sequence Length: 26 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence CAGAGCCAAA AGTTCCTGAG CGCCAG 26

【０２０５】配列番号：６５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCAGGAACT TTTGGCTCTG GGTCAT 26SEQ ID NO: 65 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence CTCAGGAACT TTTGGCTCTG GGTCAT 26

【０２０６】配列番号：６６ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｍ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CAA AAG TTC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 66 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strands Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21m-g [kappa] amino acid -19-: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CAA AAG TTC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２０７】配列番号：６７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGACAGAGTC CAAAGCTGCT GATCTACTC 29SEQ ID NO: 67 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence GGACAGAGTC CAAAGCTGCT GATCTACTC 29

【０２０８】配列番号：６８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCAGCAGCTT TGGACTCTG TCCTGGCTT 29SEQ ID NO: 68 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence ATCAGCAGCTT TGGACTCTG TCCTGGCTT 29

【０２０９】配列番号：６９ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｎ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 69 Sequence length: 379 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: Synthetic Origin Organism: Mouse and human Direct origin Clone: HEF-RVL -M21n-g [kappa] amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２１０】配列番号：７０ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｏ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 70 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21o-gk amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 CAG AGT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２１１】配列番号：７１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTCCAAAGC CGCTGATCTA CTC 23SEQ ID NO: 71 Sequence Length: 23 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GCTCCAAAGC CGCTGATCTA CTC 23

【０２１２】配列番号：７２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAGATCAGCG GCTTTGGAGC CTT 23SEQ ID NO: 72 Sequence Length: 23 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TAGATCAGCG GCTTTGGAGC CTT 23

【０２１３】配列番号：７３ 配列の長さ：３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ｐ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−２３：ＦＲ１ アミノ酸 ２４−３４：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３５−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−５６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ５７−８８：ＦＲ３ アミノ酸 ８９−９７：ＣＤＲ３ アミノ酸 ９８−１０７：ＦＲ４ 配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105 SEQ ID NO: 73 Sequence Length: 379 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Duplex Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVL -M21p-gκ amino acid -19--1: leader amino acid 1-23: FR1 amino acid 24-34: CDR1 amino acid 35-49: FR2 amino acid 50-56: CDR2 amino acid 57-88: FR3 amino acid 89-97: CDR3 amino acid 98 -107: FR4 sequence ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr -19 -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 15 20 25 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 225 Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 360 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 90 95 100 ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379 Thr Lys Val Glu Ile Lys 105

【０２１４】配列番号：７４ 配列の長さ：１３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAGAAGCCTG GGTCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGCTTCAA 50 CATTAAAGAC ACCTATATAC ACTGGGTGCG CCAGGCTCCA GGACAGGGCC 100 TGGAGTGGAT GGGAAGGATT GATCCTGAGG ATGGTAA 137SEQ ID NO: 74 Sequence Length: 137 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence AAGAAGCCTG GGTCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGCTTCAA 50 CATTAAAGAC ACCTATATAC ACTGGGTGCG CCAGGCTCCA GGACGTGGCCAG 100GGACGTGGCCAT GGGAAGGATT GATCCTGAGG ATGGTAA 137

【０２１５】配列番号：７５ 配列の長さ：１１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGAGATCTGA GGACACAGCC TTTTATTTCT GTGCAAGTGC CTACTATGTT 50 AACCAGGACT ACTGGGGCCA AGGGACCACT GTCACCGTCT CCTCAGGTGA 100 GTGGATCCGA C 111SEQ ID NO: 75 Sequence Length: 111 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TGAGATCTGA GGACACAGCC TTTTATTTCT GTGCAAGTGC CTACTATGTT 50 AACCAGGACT ACTGGGGCCA AGGGACCACT GTCACCGTCT CCTCAGGTGA 100 GT C 111

【０２１６】配列番号：７６ 配列の長さ：１３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACCTTCACTG AGGACCCAGG CTTCTTCACC TCAGCTCCAG ACTGCACCAG 50 CTGCACCTGG GAGTGAGCAC CTGGAGCTAC AGCCAGCAAG AAGAAGACCC 100 TCCAGGTCCA GTCCATGGTG GAAGCTTATC 130SEQ ID NO: 76 Sequence Length: 130 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence ACCTTCACTG AGGACCCAGG CTTCTTCACC TCAGCTCCAG ACTGCACCAG 50 CTGCACCTGG GAGTGAGCAC CTGGAGCTAC AGCCAGCAAG AAGAAGACCC 100 TC GTCCATGGTG GAAGCTTATC 130

【０２１７】配列番号：７７ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAGGCTGTG TCCTCAGATC TCAGGCTGCT GAGCTCCATG TAGGCTGTGT 50 TCGTGGATTC GTCTGCAGTG ATTGTGACTC GGCCCTGGAA CTTCGGGTCA 100 TATTTAGTAT TACCATCCGC AGGATCAATC CT 132SEQ ID NO: 77 Sequence Length: 132 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence AAAGGCTGTG TCCTCAGATC TCAGGCTGCT GAGCTCCATG TAGGCTGTGT 50 TCGTGGATTC GTCTGCGCTGTGTGTGACTC GGCCCTGGAA CTTCGGGTCA 100 T TACCATCCGC AGGATCAATC CT 132

【０２１８】配列番号：７８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATAAGCTTC CACCATGGAC TGGAC 25SEQ ID NO: 78 Sequence Length: 25 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GATAAGCTTC CACCATGGAC TGGAC 25

【０２１９】配列番号：７９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGAC 25SEQ ID NO: 79 sequence length: 25 sequence type: nucleic acid number of strands: single-stranded topology: linear sequence type: synthetic DNA sequence GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGAC 25

【０２２０】配列番号：８０ 配列の長さ：４０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨ−Ｍ２１−ｇγ１ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 １−３０：ＦＲ１ アミノ酸 ３１−３５：ＣＤＲ１ アミノ酸 ３６−４９：ＦＲ２ アミノ酸 ５０−６６：ＣＤＲ２ アミノ酸 ６７−９８：ＦＲ３ アミノ酸 ９９−１０６：ＣＤＲ３ アミノ酸 １０７−１１７：ＦＲ４ 配列 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 GGT GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG 90 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val -1 1 5 10 AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC 135 Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTG CGC CAG GCT CCA 180 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 GGA CAG GGC CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT 225 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly 45 50 55 AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGA GTC ACA ATC ACT 270 Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr 60 65 70 GCA GAC GAA TCC ACG AAC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG 315 Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 AGA TCT GAG GAC ACA GCC TTT TAT TTC TGT GCA AGT GCC TAC TAT 360 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser Ala Tyr Tyr 90 95 100 GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACT GTC ACC GTC TCC 405 Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 105 110 115 TCA G 409 Ser SEQ ID NO: 80 Sequence Length: 409 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strands Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: HEF-RVH -M21-gγ1 amino acid -19--1: leader amino acid 1-30: FR1 amino acid 31-35: CDR1 amino acid 36-49: FR2 amino acid 50-66: CDR2 amino acid 67-98: FR3 amino acid 99-106: CDR3 amino acid 107 -117: FR4 sequence ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 GGT GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG 90 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val -1 1 5 10 AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC 135 Lys Lys Pro Gly Ser S er Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTG CGC CAG GCT CCA 180 Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 GGA CAG GGC CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT GCG GAT GGT 225 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly 45 50 55 AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGA GTC ACA ATC ACT 270 Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr 60 65 70 GCA GAC GAA TCC ACG AAC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG 315 Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 AGA TCT GAG GAC ACA GCC TTT TAT TTC TGT GCA AGT GCC TAC TAT 360 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser Ala Tyr Tyr 90 95 100 GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACT GTC ACC GTC TCC 405 Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 105 110 115 TCA G 409 Ser

【０２２１】配列番号：８１ 配列の長さ：８４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCTTGTCAC CGTCTCCTCA GGTGGTGGTG GTTCGGGTGG TGGTGGTTCG 50 GGTGGTGGCG GATCGGACAT CCAGATGACC CAGG 84SEQ ID NO: 81 Sequence Length: 84 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence AGCTTGTCAC CGTCTCCTCA GGTGGTGGTG GTTCGGGTGG TGGTGGTTCG 50 GGTGGTGGCG GATCGGACAT CCAGATGACC CAGG 84

【０２２２】配列番号：８２ 配列の長さ：８４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCCTGGG CCATCTGGAT GTCCGATCCG CCACCACCCG AACCACCACC 50 ACCCGAACCA CCACCACCTG AGGAGACGGT GACA 84SEQ ID NO: 82 Sequence Length: 84 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence AATTCCTGGG CCATCTGGAT GTCCGATCCG CCACCACCCG AACCACCACC 50 ACCCGAACCA CCACCACCTG AGGAGACGGT GACA 84

【０２２３】配列番号：８３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGCCATGGC GCAGTGTGCA GCTGGTGCAG TCTG 34SEQ ID NO: 83 Sequence Length: 34 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence CAGCCATGGC GCAGTGTGCA GCTGGTGCAG TCTG 34

【０２２４】配列番号：８４ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCACCCGAAC CACCACCACC TGAGGAGACG GTGACAGTGG T 41SEQ ID NO: 84 Sequence Length: 41 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence CCACCCGAAC CACCACCACC TGAGGAGACG GTGACAGTGG T 41

【０２２５】配列番号：８５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGACCACTG TCACCGTCTC CTCAGGTGGT GGTGGTTCGG G 41SEQ ID NO: 85 Sequence Length: 41 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGGACCACTG TCACCGTCTC CTCAGGTGGT GGTGGTTCGG G 41

【０２２６】配列番号：８６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGCTCTGGG TCATCTGGAT GTCCGATCCG CCACCACCCG A 41SEQ ID NO: 86 Sequence length: 41 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA sequence GGGCTCTGGG TCATCTGGAT GTCCGATCCG CCACCACCCG A 41

【０２２７】配列番号：８７ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGGACATCC AGATGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG CCAG 44SEQ ID NO: 87 Sequence Length: 44 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence TCGGACATCC AGATGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG CCAG 44

【０２２８】配列番号：８８ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAAGAATTCT TATTATTTAT CGTCATCGTC TTTGTAGTCT TTGATTTCGA 50 CCTTGGT 57SEQ ID NO: 88 Sequence Length: 57 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence CAAGAATTCT TATTATTTAT CGTCATCGTC TTTGTAGTCT TTGATTTCGA 50 CCTTGGT 57

【０２２９】配列番号：８９ 配列の長さ：８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：ｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１ 配列の特徴： アミノ酸 １−２２：ｌｅａｄｅｒ アミノ酸 ２３−１３９：Ｈ鎖Ｖ領域 アミノ酸 １４０−１５４：リンカー アミノ酸 １５５−２６１：Ｌ鎖Ｖ領域 アミノ酸 ２６２−２６９：ＦＬＡＧ ＦｖポリペプチドｓｃＦｖ−ｈＭ２１のアミノ酸配列及
びそれをコードするヌクレオチド配列。 配列 ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC 45 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu 5 10 15 GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA 90 Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 20 25 30 GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG 135 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 35 40 45 GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTG CGC 180 Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 50 55 60 CAG GCT CCA GGA CAG GGC CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT 225 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro 65 70 75 GCG GAT GGT AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGA GTC 270 Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val 80 85 90 ACA ATC ACT GCA GAC GAA TCC ACG AAC ACA GCC TAC ATG GAG CTC 315 Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu 95 100 105 AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACA GCC TTT TAT TTC TGT GCA AGT 360 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser 110 115 120 GCC TAC TAT GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACT GTC 405 Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 125 130 135 ACC GTC TCC TCA GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGT GGT TCG GGT 450 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 140 145 150 GGT GGC GGA TCG GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 495 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 155 160 165 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 540 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 170 175 180 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 585 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 185 190 195 AAG GCT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 630 Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 200 205 210 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 675 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 215 220 225 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 720 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 230 235 240 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 765 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 245 250 255 ACC AAG GTC GAA ATC AAA GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA 807 Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 265 TAATAAGAAT TCTTG 822SEQ ID NO: 89 Sequence Length: 822 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic Origin Organism Name: Mouse and Human Direct Origin Clone: pSCFVT7-hM21 Sequence features: Amino acid 1-22: leader amino acid 23-139: H chain V region amino acid 140-154: linker amino acid 155-261: L chain V region amino acid 262-269: FLAG Fv polypeptide scFv-hM21 amino acid sequence and The nucleotide sequence that encodes it. Sequence ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC 45 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu 5 10 15 GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA 90 Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 20 25 30 GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG 135 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 35 40 45 GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTG CGC 180 Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 50 55 60 CAG GCT CCA GGA CAG GGC CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT 225 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro 65 70 75 GCG GAT GGT AAT ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGA GTC 270 Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val 80 85 90 ACA ATC ACT GCA GAC GAA TCC ACG AAC ACA GCC TAC ATG GAG CTC 315 Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu 95 100 105 AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACA GCC TTT TAT TTC TGT GCA AGT 360 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser 110 115 120 GCC TAC TAT GTT AAC CAG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACT GTC 405 Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 125 130 135 ACC GTC TCC TCA GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGT GGT TCG GGT 450 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 140 145 150 GGT GGC GGA TCG GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 495 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 155 160 165 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGT 540 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 170 175 180 CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 585 Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 185 190 195 AAG GCT CCA AAG CCG CTG ATC TAC TCG GCA TCC TAT CGG TAC AGT 630 Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 200 205 210 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 675 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 215 220 225 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 720 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 230 235 240 TAC TGC CAG CAA TAT AAC AGC TAT CCT CGG GCG TTC GGC CAA GGG 765 Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala Phe Gly Gln Gly 245 250 255 ACC AAG GTC GAA ATC AAA GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA 807 Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 265 TAATAAGAAT TCTTG 822

【０２３０】配列番号：９０ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 特徴：Ｆｖポリペプチドのリンカー部分のアミノ酸配列
及びそれをコードするヌクレオチド配列 配列 GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGC GGA TCG 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 5 10 15SEQ ID NO: 90 Sequence length: 45 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic characteristics: Amino acid sequence of linker portion of Fv polypeptide and its coding Nucleotide sequence Sequence GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGT GGT TCG GGT GGT GGC GGA TCG 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 5 10 15

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は、それぞれＬ鎖およびＨ鎖の発現のため
に有用な、ヒトＥＦ１−αプロモーター／エンハンサー
を含んでなる発現プラスミドＨＥＦ−ＶＬ−ｇκおよび
ＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１を示す。FIG. 1 shows expression plasmids HEF-VL-gκ and HEF-VH-gγ1 comprising the human EF1-α promoter / enhancer, useful for the expression of L and H chains, respectively.

【図２】図２は、キメラＯＮＳ−Ｍ２１抗体（ＣｈＭ２
１）のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を
示すグラフである。FIG. 2 shows a chimeric ONS-M21 antibody (ChM2
It is a graph which shows the binding ability to human medulloblastoma cell line ONS-76 of 1).

【図３】図３は、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ
領域の第１バージョン（バージョン「ａ」）の作製ダイ
ヤグラムである。FIG. 3 shows reshaped human ONS-M21 antibody L chain V
3 is a fabrication diagram of a first version of a region (version “a”).

【図４】図４は、再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｖ領域
の作製のダイヤグラムである。FIG. 4 is a diagram of the production of reshaped human ONS-M21 antibody V region.

【図５】図５は、再構成ヒトＨ鎖とキメラＬ鎖からなる
抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７６に対する結合能を
示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the binding ability of an antibody composed of reshaped human H chain and chimeric L chain to human medulloblastoma cell line ONS-76.

【図６】図６は、再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒトＬ鎖のバ
ージョン「ａ」から「ｈ」の内一つとからなる８種類の
再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮ
Ｓ−７６に対する結合能を、キメラ抗体（ＣｈＭ２１）
と比較して示す図である。FIG. 6 is a human medulloblastoma cell of 8 types of reshaped human ONS-M21 antibody consisting of reshaped human H chain and one of versions “a” to “h” of reshaped human L chain. Stock ON
Chimera antibody (ChM21) has the ability to bind to S-76.
It is a figure shown in comparison with.

【図７】図７は、本発明の再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒト
Ｌ鎖のバージョン「ｉ」，「ｊ」，「ｌ」，「ｍ」，
「ｏ」および「ｐ」の内一つとからなる６種類の再構成
ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体のヒト髄芽腫細胞株ＯＮＳ−７
６に対する結合能を、キメラ抗体（ＣｈＭ２１）と再構
成Ｌ鎖バージョン「ｋ」および「ｎ」を有する抗体と比
較して示す図である。FIG. 7 shows versions “i”, “j”, “l”, “m” of reshaped human H chain and reshaped human L chain of the present invention.
Human medulloblastoma cell line ONS-7 of 6 types of reconstituted human ONS-M21 antibody consisting of one of "o" and "p"
FIG. 6 shows the binding ability to 6 in comparison with a chimeric antibody (ChM21) and an antibody having reshaped L chain versions “k” and “n”.

【図８】図８は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードする
ＤＮＡの作製過程を模式的に示す図である。FIG. 8 is a diagram schematically showing a process for producing a DNA encoding the single-stranded Fv region of the present invention.

【図９】図９は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域をコードする
ＤＮＡを発現させるために使用する発現プラスミドの一
例の構造を示す。FIG. 9 shows a structure of an example of an expression plasmid used for expressing the DNA encoding the single-chain Fv region of the present invention.

【図１０】図１０は、本発明の一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦ
ｖ−ｈＭ２１）の抗原結合活性を、再構成ヒトＯＮＳ−
Ｍ２１抗体及び該抗体のＦａｂ断片の抗原結合活性と比
較して、マウスモノクローナル抗体ＯＮＳ−Ｍ２１の抗
原結合に対する阻害を指標として示すグラフである。FIG. 10 shows the single-chain Fv region (scF) of the present invention.
v-hM21) antigen-binding activity was reconstituted with human ONS-
3 is a graph showing the inhibition of antigen binding of mouse monoclonal antibody ONS-M21 as an index, as compared with the antigen binding activity of M21 antibody and Fab fragment of the antibody.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/574 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｈ ＡＤＵ Ｔ Ｃ０７Ｋ 7/06 8318−4Ｈ 7/08 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12N 15/09 ZNA C12P 21/08 9358-4B G01N 33/531 A 33/574 D // A61K 39 / 395 H ADU T C07K 7/06 8318-4H 7/08 8318-4H G01N 33/577 B (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (39)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記に定義されるアミノ酸配列： CDR1：Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala CDR2：Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala またはその一部から成る３個の相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）および４個のフレームワーク領域（ＦＲ）を含むヒ
ト髄芽腫細胞に対する抗体のＬ鎖可変領域（Ｖ領域）。1. An amino acid sequence defined as follows: CDR1: Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala CDR2: Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser CDR3: Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Ala or a part thereof. 3 complementarity determining regions (CD
R) and the light chain variable region (V region) of the antibody to human medulloblastoma cells containing 4 framework regions (FR). 【請求項２】 請求項１のＬ鎖可変領域（Ｖ領域）、並
びにヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）から構成されるヒト髄
芽腫細胞に対する抗体のＬ鎖。2. An L chain of an antibody against human medulloblastoma cells, which comprises the L chain variable region (V region) of claim 1 and a human L chain constant region (C region). 【請求項３】 前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由来
であることを特徴とする請求項２に記載のＬ鎖。3. The L chain according to claim 2, wherein the FR of the V region of the L chain is derived from a mouse antibody. 【請求項４】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：２６に示さ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に
記載のＬ鎖。4. The L chain according to claim 2, wherein the L chain V region has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26. 【請求項５】 前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来で
あることを特徴とする請求項２に記載のＬ鎖。5. The L chain according to claim 2, wherein the FR of the L chain V region is derived from a human antibody. 【請求項６】 前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体ＲＥＩ
由来であることを特徴とする請求項２又は５に記載のＬ
鎖。6. The FR of the V region of the L chain is a human antibody REI.
6. The L according to claim 2 or 5, which is derived from
chain. 【請求項７】 前記Ｌ鎖Ｖ領域の２番目のＦＲにおいて
４６位のアミノ酸がプロリンであることを特徴とする請
求項５または６に記載のＬ鎖。7. The L chain according to claim 5, wherein the amino acid at the 46th position in the second FR of the L chain V region is proline. 【請求項８】 前記Ｌ鎖Ｖ領域の２番目のＦＲにおいて
４２位、４３位および４６位のアミノ酸が各々、グルタ
ミン、セリン、プロリンであることを特徴とする請求項
５または６に記載のＬ鎖。8. The L according to claim 5 or 6, wherein the 42nd, 43rd and 46th amino acids in the second FR of the L chain V region are glutamine, serine and proline, respectively. chain. 【請求項９】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が下記アミノ酸配列から
成る４個のＦＲのいずれか一組を含むことを特徴とする
請求項２に記載のＬ鎖。 （１）FR１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Se
r Leu Ser Ala Ser ValGly Asp Arg Val Thr Ile Thr C
ys FR２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
Pro Leu Ile Tyr FR３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp PheThr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
Glu Asp Ile Ala Thr TyrTyr Cys FR４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys （２）FR１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Se
r Leu Ser Ala Ser ValGly Asp Arg Val Thr Ile Thr C
ys FR２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
Pro Leu Ile Tyr FR３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp PheThr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
Glu Asp Ile Ala Thr TyrTyr Cys FR４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys9. The L chain according to claim 2, wherein the L chain V region contains any one set of four FRs having the following amino acid sequences. (1) FR1: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Se
r Leu Ser Ala Ser ValGly Asp Arg Val Thr Ile Thr C
ys FR2: Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
Pro Leu Ile Tyr FR3: Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp PheThr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
Glu Asp Ile Ala Thr TyrTyr Cys FR4: Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys (2) FR1: Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Se
r Leu Ser Ala Ser ValGly Asp Arg Val Thr Ile Thr C
ys FR2: Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
Pro Leu Ile Tyr FR3: Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp PheThr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
Glu Asp Ile Ala Thr TyrTyr Cys FR4: Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 【請求項１０】 前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がκＣ領域である
ことを特徴とする請求項２に記載のＬ鎖。10. The L chain according to claim 2, wherein the human L chain C region is a κC region. 【請求項１１】 下記に定義されるアミノ酸配列： CDR1：Asp Thr Tyr Ile His CDR2：Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr
Asp Pro Lys Phe GlnGly CDR3：Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr またはその一部から成る３個のＣＤＲおよび４個のＦＲ
を含むヒト髄芽腫細胞に対する抗体のＨ鎖Ｖ領域。11. An amino acid sequence defined as follows: CDR1: Asp Thr Tyr Ile His CDR2: Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Lys Tyr
Asp Pro Lys Phe GlnGly CDR3: 3 CDRs and 4 FRs consisting of Ala Tyr Tyr Val Asn Gln Asp Tyr or a part thereof
H chain V region of an antibody against human medulloblastoma cells. 【請求項１２】 請求項１１のＨ鎖Ｖ領域、並びにヒト
Ｈ鎖Ｃ領域から構成されるヒト髄芽腫細胞に対する抗体
のＨ鎖。12. An H chain of an antibody against human medulloblastoma cells, which is composed of the H chain V region of claim 11 and a human H chain C region. 【請求項１３】 前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由
来であることを特徴とする請求項１２に記載のＨ鎖。13. The H chain according to claim 12, wherein the FR of the H chain V region is derived from a mouse antibody. 【請求項１４】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示
されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１
２に記載のＨ鎖。14. The H chain V region has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27.
H chain according to 2. 【請求項１５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来
であることを特徴とする請求項１２に記載のＨ鎖。15. The H chain according to claim 12, wherein the FR of the V region of the H chain is derived from a human antibody. 【請求項１６】 前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがサブグループ
Ｉのヒト抗体由来であることを特徴とする請求項１２ま
たは１５記載のＨ鎖。16. The H chain according to claim 12 or 15, wherein the FR of the H chain V region is derived from a human antibody of subgroup I. 【請求項１７】 前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体Ｅｕ
由来であることを特徴とする請求項１２または１５に記
載のＨ鎖。17. The FR of the H chain V region is a human antibody Eu.
The H chain according to claim 12, which is derived from the above. 【請求項１８】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が下記のアミノ酸配列
から成る４個のＦＲを、含むことを特徴とする請求項１
５に記載のＨ鎖。 FR１：Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
Lys Lys Pro Gly SerSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
Ser Gly Phe Asn Ile Lys FR２：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
Trp Met Gly FR３：Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn
Thr Ala Tyr Met GluLeu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser FR４：Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser18. The H chain V region contains 4 FRs having the following amino acid sequences:
The H chain according to item 5. FR1: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
Lys Lys Pro Gly SerSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
Ser Gly Phe Asn Ile Lys FR2: Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
Trp Met Gly FR3: Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn
Thr Ala Tyr Met GluLeu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
Thr Ala Phe Tyr Phe Cys Ala Ser FR4: Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 【請求項１９】 前記ヒトＣ領域がγ−１Ｃ領域または
γ−４Ｃ領域であることを特徴とする請求項１５に記載
のＨ鎖。19. The H chain according to claim 15, wherein the human C region is a γ-1C region or a γ-4C region. 【請求項２０】 請求項２に記載のＬ鎖および請求項１
２に記載のＨ鎖からなるヒト髄芽腫細胞に対する抗体。20. The L chain according to claim 2 and claim 1.
An antibody against a human medulloblastoma cell comprising the H chain according to 2. 【請求項２１】 前記Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由来で
あることを特徴とする請求項２０に記載の抗体。21. The antibody according to claim 20, wherein the FR of the V region is derived from a mouse antibody. 【請求項２２】 前記Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来であ
ることを特徴とする請求項２０に記載の抗体。22. The antibody according to claim 20, wherein the FR of the V region is derived from a human antibody. 【請求項２３】 請求項１に記載のアミノ酸配列または
その一部からなる３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含む
Ｌ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域からなるヒト髄芽腫
細胞に対する抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡ。23. An antibody against human medulloblastoma cells comprising an L chain V region containing 3 CDRs and 4 FRs consisting of the amino acid sequence of claim 1 or a part thereof and a human L chain C region. DNA encoding the L chain. 【請求項２４】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５８，６
１，６３，６６，７０あるいは７３で示されるヌクレオ
チド配列であることを特徴とする特許請求の範囲第２３
項記載のＤＮＡ。24. The V region of the L chain is SEQ ID NO: 58,6.
24. A nucleotide sequence represented by 1, 63, 66, 70 or 73
The DNA according to the item. 【請求項２５】 請求項１１に記載のアミノ酸配列また
はその一部からなる３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含
むＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域からなるヒト髄芽
腫細胞に対する抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ。25. An antibody against human medulloblastoma cells comprising an H chain V region comprising 3 CDRs and 4 FRs comprising the amino acid sequence of claim 11 or a part thereof and a human H chain C region. DNA encoding the H chain. 【請求項２６】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号８０で示さ
れるヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項２
５に記載のＤＮＡ。26. The H chain V region is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 80.
The DNA according to 5. 【請求項２７】 請求項２３または２４に記載のＤＮＡ
またはその一部を含む組換えベクター。27. The DNA according to claim 23 or 24.
Or a recombinant vector containing a part thereof. 【請求項２８】 請求項２５または２６に記載のＤＮＡ
またはその一部を含む組換えベクター。28. The DNA according to claim 25 or 26.
Or a recombinant vector containing a part thereof. 【請求項２９】 請求項２７に記載の組換えベクターお
よび請求項２８に記載の組換えベクターにより同時形質
転換された形質転換体。29. A transformant co-transformed with the recombinant vector according to claim 27 and the recombinant vector according to claim 28. 【請求項３０】 請求項２９に記載の形質転換体を培養
し、次いで、産生された目的とする抗体を分離すること
を特徴とする遺伝子組換え技術を使用した、ヒト髄芽腫
細胞に対する抗体の製造方法。30. An antibody against human medulloblastoma cells, which is obtained by culturing the transformant according to claim 29 and then isolating the produced target antibody. Manufacturing method. 【請求項３１】 請求項１１に記載のＨ鎖Ｖ領域と請求
項１に記載のＬ鎖Ｖ領域をペプチドリンカーを介して連
結して成る一本鎖Ｆｖ領域。31. A single chain Fv region obtained by linking the H chain V region according to claim 11 and the L chain V region according to claim 1 via a peptide linker. 【請求項３２】 前記リンカーペプチドが次のアミノ酸
配列：Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
Gly Gly Gly Serを有する請求項３１に記載の一本鎖Ｆ
ｖ領域。32. The linker peptide has the following amino acid sequence: Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly.
32. The single chain F having a Gly Gly Gly Ser.
v region. 【請求項３３】 配列番号：８０に記載のアミノ酸配列
中アミノ酸番号１から１１６までのアミノ酸配列から成
るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：４０，４３，４６，４７，
５０，５１，５４，５５，５８，６１，６２，６３，６
６，６９，７０又は７３の内のいずれかに記載のアミノ
酸配列中アミノ酸番号１から１０６までのアミノ酸配列
から成るＬ鎖Ｖ領域を含んで成る請求項３１又は３２に
記載の一本鎖Ｆｖ領域。33. An H chain V region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 116 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, and SEQ ID NOs: 40, 43, 46, 47,
50, 51, 54, 55, 58, 61, 62, 63, 6
33. The single chain Fv region according to claim 31 or 32, which comprises an L chain V region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 106 in the amino acid sequence according to any of 6,69, 70 or 73. . 【請求項３４】 配列番号：８０に記載のアミノ酸配列
中アミノ酸番号１から１１６までのアミノ酸配列から成
るＨ鎖Ｖ領域と、配列番号：７３に記載のアミノ酸配列
中アミノ酸番号１から１０６までのアミノ酸配列から成
るＬ鎖Ｖ領域とを含んで成る、請求項３１又は３２に記
載の一本鎖Ｆｖ領域。34. An H chain V region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 116 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 80, and the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 106 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 73. 33. The single chain Fv region according to claim 31 or 32, comprising an L chain V region consisting of a sequence. 【請求項３５】 配列番号：８９に記載のアミノ酸配列
から成る請求項３１に記載の一本鎖Ｆｖ領域。35. The single chain Fv region according to claim 31, which consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89. 【請求項３６】 請求項３１〜３５のいずれか１項に記
載の一本鎖Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ。36. A DNA encoding the single chain Fv region according to any one of claims 31 to 35. 【請求項３７】 請求項３６に記載のＤＮＡを含んで成
る組換えベクター。37. A recombinant vector comprising the DNA of claim 36. 【請求項３８】 請求項３７に記載の組換えベクターに
より形質転換された宿主。38. A host transformed with the recombinant vector according to claim 37. 【請求項３９】 請求項３８に記載の形質転換体を培養
し、該培養物から一本鎖Ｆｖ領域を採取することを特徴
とする、一本鎖Ｆｖ領域の製造方法。39. A method for producing a single chain Fv region, which comprises culturing the transformant according to claim 38 and collecting the single chain Fv region from the culture.
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