JPH08154684A - ワタユビキチン結合酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ワタにおけるストレス耐性個体の作成及び雄
性不稔ワタ植物作出等に有用なユビキチン結合酵素遺伝
子を提供する。 【構成】 ランダムに選択したワタcDNAクローンの塩基
配列を決定し、それらの配列と遺伝子データベース中の
既知の遺伝子配列との間でホモロジー検索を行い、デー
タベース中の遺伝子とホモロジーを有するクローンの中
から配列番号１に示す配列を有するワタユビキチン結合
酵素遺伝子を見い出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はワタの新規遺伝子に関
し、詳しくはユビキチン依存性タンパク質分解経路に関
与するユビキチン結合酵素遺伝子を提供するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ワタは繊維産業における原材料供給植物
として重要なものであるが、その生育は環境条件に大き
く影響を受け、天候により大きな被害を受けることもあ
る。また品種間での適正生育環境もそれぞれ異なってお
り、特定の地域でしか生育しない品種もある。

【０００３】一方ワタの育種において、交配による新品
種の作成は大きな課題である。ワタは自家受粉を行う植
物であり、交配を行う場合には開花前の未受粉の時期に
花のつぼみを切開して雄しべを取り除くという非常に手
間のかかる作業が必要である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ワタは、環境などのス
トレス要因によってその成育が影響を受けることは、前
記のとおりであり、ストレスに対する抵抗性を増大する
ことで異常気象などのストレスによる被害を減少させる
事ができる。

【０００５】ところで、生体内では、立体構造が間違っ
たり、変性するなどの異常を起こしたタンパク質は細胞
内ゾル内ですぐ分解される。異常なタンパク質は合成の
際の誤ったアミノ酸の取り込みやアミノ酸側鎖の酸化な
ど化学的な損傷によって、また各種ストレス等によって
作られる。このような異常なタンパク質は、選択的分解
反応によって分解される。タンパク質の選択的分解反応
においては、各種ストレスによってその発現量が増大す
る事が知られているタンパク質であるユビキチンが大き
な役割を果たしている。

【０００６】タンパク質の選択的分解を行う分解装置は
複雑で、真核細胞で使われるユビキチン依存性の経路で
は、ユビキチンが多数標的タンパクと共有結合をつく
る。この結合は、本発明によって提供される遺伝子によ
り生産される酵素（ユビキチン結合酵素）によって触媒
されるもので、そのユビキチンとタンパク質との複合体
はある種のタンパク質分解酵素により認識されて分解さ
れる。

【０００７】従ってこの酵素の発現量を増大させること
により、分解されるべきタンパク質とユビキチンとの結
合反応が活性化されストレス抵抗性が増大するものと推
定される。

【０００８】また逆に、ユビキチン結合酵素遺伝子に対
するアンチセンス遺伝子をワタに導入して、ユビキチン
結合酵素遺伝子の発現を抑えると、異常なタンパク質の
除去機構に障害が起き、ストレス抵抗性が減少すること
によって細胞の正常な生育に支障をきたすと考えられ
る。

【０００９】よってこの遺伝子を葯（花粉）特異的なプ
ロモーターにつなげてワタ植物体に導入することによ
り、葯（花粉）細胞の生育に障害を起こさせ、雄性不稔
形質を付与できることが推定され、そのような雄性不稔
体を用いることによって交配時の手間が軽減される。

【００１０】ユビキチン結合酵素遺伝子はすでに他生物
により単離されてはいるが、ワタ植物体内で発現させる
ことを考えると、ワタ本来の遺伝子配列を使うことが好
ましく、アンチセンス遺伝子を導入する場合には、ワタ
の遺伝子配列に対してより完全に相補的なものであるこ
とが望ましい。

【００１１】本発明はワタにおけるストレス耐性個体の
作成及び雄性不稔ワタ植物作出等に有用な、上記酵素の
遺伝子を提供する事を課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ワタよりcD
NAライブラリーを作製し、そのクローンをランダムに選
択した後に塩基配列を決定し、遺伝子データベース中の
既知の遺伝子配列との間でホモロジー検索を行った。通
常、遺伝子のクローニング方法として、他の生物におい
てすでに単離されている遺伝子配列の一部又は全部をプ
ローブとして用い、ライブラリーからスクリーニングを
行う方法もあるが、本発明は、cDNAライブラリーからラ
ンダムに選択されたクローンの塩基配列と遺伝子データ
ベース中の既知の遺伝子配列との間のホモロジー検索に
より、いくつかの遺伝子と相同性の高いものとして同定
された遺伝子の中から、ワタユビキチン結合酵素遺伝子
の存在を認め、完成されるに至ったものである。

【００１３】すなわち本発明は、配列番号２に示すアミ
ノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。このヌク
レオチド配列として具体的には、配列番号１においてヌ
クレオチド番号８０〜５２３の配列又はこれと実質的に
同一の配列が挙げられる。このＤＮＡは、ワタユビキチ
ン結合酵素をコードする遺伝子であり、本明細書におい
て本発明の遺伝子ともいう。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
遺伝子は、以下に記載する方法によって初めて得られた
ものであるが、本発明によってそのヌクレオチド配列が
明らかにされたので、この配列を基に当業者に周知の方
法、例えばＰＣＲ法による染色体ＤＮＡやｃＤＮＡから
の増幅、あるいはハイブリダイゼーション法によるライ
ブラリーからのスクリーニングに等よっても容易に取得
することができる。

【００１５】本発明の遺伝子の取得法の一例を、工程毎
に説明する。

【００１６】＜１＞遺伝子ライブラリーの作製 遺伝子ライブラリーは、染色体DNA、mRNAのどちらから
も作製することが可能であるが、構造遺伝子を効率よく
単離同定するためには、mRNAを材料に用いたcDNAライブ
ラリーの作製が望ましい。

【００１７】本発明の遺伝子は、生体内の殆ど全ての器
官で発現していると考えられるため、mRNAを抽出するた
めの材料としては特にその器官を限定するものではな
い。mRNAの抽出法も特に制限はなく、通常の植物からの
mRNAの抽出法を採用することができる。

【００１８】cDNAの合成は、例えば、mRNA末端に存在す
るポリＡヌクレオチドに相補的なポリＴ配列をプライマ
ーとして、逆転写酵素により相補DNAを合成し、DNAポリ
メラーゼによって二本鎖にすることによって成し得る。

【００１９】その方法は、例えばMolecular Cloning (M
aniatisら、Cold Spring Harbour Laboratory）に記載さ
れているが、各社からcDNA合成キットが多数市販されて
いるのでそれらを使用しても良い。

【００２０】ライブラリーは一般的にファージベクター
によって構築され、市販されている多数のものが使用可
能であるが、ベクターからのリクローニングの必要が無
く、すぐにシーケンス用プラスミドの調製ができるベク
ター、例えばλZAPベクター等を使用することが好まし
い。

【００２１】＜２＞遺伝子配列の決定 得られた遺伝子ライブラリーからランダムにクローンを
選択し、クローン中のインサートの塩基配列を決定す
る。塩基配列の決定は、Maxam-Gilbert 法あるいはダイ
デオキシ法によって行うことができるが、これらのうち
ではダイデオキシ法がより簡便であり好ましい。

【００２２】ダイデオキシ法による塩基配列の決定を行
うには、市販されているシーケンス決定キットを用いて
行うことができ、更にオートシーケンサーを使うことに
よって短時間に大量のクローンの配列を決定することが
できる。

【００２３】配列の決定はインサート全長について行う
必要はなく、ホモロジー検索をするのに足ると思われる
長さを決定できればよい。例えば、後記実施例では、60
塩基以上の配列を決定できた場合に、次に示すホモロジ
ーの検索を行った。

【００２４】＜３＞遺伝子データベースとのホモロジー
検索 決定された各ｃＤＮＡクローンの塩基配列を、遺伝子デ
ータベースに登録されている既知塩基配列との間で、ホ
モロジー検索を行う。

【００２５】データベースとしては、米国ロスアラモス
国立研究所、欧州分子生物学研究所、国立遺伝学研究所
などから公表されているGenBank、EMBL、DDBJなどを利
用することができ、ホモロジー検索用のプログラムとし
ては、市販のDNA解析ソフト、DNASIS（日立ソフトウエ
アエンジニアリング）、GENETYX（SDCソフトウェア開発
（株））などを購入して使用することができる。また、
国立遺伝学研究所の大型計算機と端末とを接続して、高
速なホモロジー検索を行う等の方法もある。

【００２６】ホモロジー検索は、例えば次のようなアル
ゴリズムによって行う。調べようとする配列をデータベ
ース中の遺伝子配列に対して１塩基ずつずらしながらホ
モロジーを比較していき、６塩基以上連続して塩基が一
致している場合にホモロジースコアテーブル（例えばM.
Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure,
vol.5 (1978)等参照）に従ってホモロジースコアを計
算していく。スコアが一定値以上のものをホモロジーを
有する候補として取り上げるように設定し、さらに、調
べようとする配列またはデータベース中の遺伝子配列に
ギャップを入れ、スコアが最大となるように最適化する
とよい。

【００２７】本発明の遺伝子は、後記実施例に示すよう
に、既知の遺伝子とホモロジーを有する多数の遺伝子の
うちの１つとして得られたものであり、トマト、エンド
ウ、アラビドプシス、イネ、酵母などの既知のユビキチ
ン結合酵素遺伝子とのホモロジーが認められた。その中
でも最もホモロジーの高かったのはトマトの遺伝子であ
り、コード領域の塩基の長さは両者とも終止コドンを含
めて447bpと等しく、そのうち364塩基が一致しており、
81.4%のホモロジーであった。また、塩基配列から推定
されるアミノ酸配列の比較を行なったところ、148アミ
ノ酸のうち、136アミノ酸が一致しており91.9%のホモロ
ジーであった。性質の似たアミノ酸を考慮に入れると14
6アミノ酸が実質的に一致していると考えられ、96.8%も
の高いホモロジーを有することから、本発明により得ら
れた遺伝子は、ワタにおいてユビキチン結合酵素をコー
ドしている遺伝子であると同定された。

【００２８】＜４＞遺伝子データベース中の遺伝子とホ
モロジーを有するワタ遺伝子の完全長クローンの単離 上記にようにして得られるクローンは、必ずしもその遺
伝子の全ヌクレオチド配列を含んでいるとは限らない。
その場合には、そのクローンをプローブとして用い、プ
ラークハイブリダイゼーションによるスクーリニングを
行うことにより、ライブラリーから完全長遺伝子を含む
クローンを得ることができる。具体的な方法は、Molecu
lar Cloning 第２版 (Maniatisら、Cold Spring Harbour
Laboratory)12.30〜40を参照できる。

【００２９】実施例においては、ランダムに選択したｃ
ＤＮＡクローンから完全長を持つクローンを得ることが
できたため、再スクリーニングを行う必要はなかった
が、例えば、配列表に示される５’側非コード領域（ヌ
クレオチド配列１〜７９番）中から適当なオリゴヌクレ
オチド配列を選択し、プローブとして使用することによ
って、容易に完全長を持つクローンをライブラリーより
スクリーニングする事ができる。また、部分配列を有す
る複数のクローンを連結して完全長を有するＤＮＡ断片
を得てもよい。

【００３０】上記のようにして得られた本発明の遺伝子
のヌクレオチド配列及びこの配列から予想されるアミノ
酸配列を配列表配列番号１及び２に示す。このアミノ酸
配列は新規な配列であり、このアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を有する遺伝子はすべて本発明に含まれる。
また、上記アミノ酸配列のうち、ユビキチン結合酵素の
活性に実質的に影響を与えない限り、アミノ酸残基の置
換、欠失あるいは挿入を含んでいてもよい。そのような
アミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入は、ランダムあ
るいは計画的な変異導入を行った遺伝子ＤＮＡの発現産
物のうち、酵素活性を有するものとして取得され得る。
また、ワタの品種によって、あるいは自然突然変異等に
よって、配列表に示す配列と一部異なる配列を有する酵
素あるいは遺伝子を保持するものも存在する可能性があ
るが、そのような遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。

【００３１】本発明の遺伝子は、ストレス耐性ワタの作
成及び雄性不稔ワタ植物の作出に利用できることが期待
される。

【００３２】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００３３】＜１＞ワタからの全ＲＮＡの調製 材料としてワタ(Gossypium hirsutum L.) Coker312を使
用し、その繊維細胞を液体窒素中で採取した。ワタ繊維
細胞75gを、液体窒素で凍結しながら乳鉢中で十分磨砕
した。粉末になったファイバーを蓋付きの遠心管に移
し、375mgのDTTを粉末のまま加えた後、90〜95℃に加熱
したXT緩衝液（30mM EDTA 及び １％SDSを含む0.2Mホウ
酸ナトリウムをpH9.0にあわせた後、ジエチルピロカー
ボネート処理をし、オートクレーブする。この溶液にバ
ナジルリボヌクレオシドを10mMになるように加える）を
200ml加えよく撹拌した。

【００３４】これにプロテアーゼKを100mg加え再び撹拌
し、40℃で２時間インキュベートした後16mlの２M KCl
を加えた。再びよく撹拌した後、氷中に１時間静置し、
高速冷却遠心機で20分間（４℃）12,000 gで遠心分離し
た。

【００３５】上清を濾過して浮遊物を除去し、メスシリ
ンダーに移して容量を計り、これを別の遠心管に移し、
抽出液量１ml当たり85mgの塩化リチウムを加えて最終濃
度２Mにした。この溶液を４℃で一晩静置した後、沈殿
したRNAを20分 12,000 gで遠心分離した。得られたRNA
の沈殿は、冷やした２M塩化リチウムで２回洗浄沈殿さ
せた。

【００３６】得られたRNAを、10mMトリス緩衝液（pH7.
5）で約２mg/mlになるように溶解し、5M酢酸カリウムを
200mMになるよう加えた後、エタノールを70%になるよう
に加え-80℃で10分冷やした。４℃ 15,000 rpmで、10分
間遠心分離後、適当量の滅菌水に懸濁してRNA試料とし
た。このRNA試料を定量した結果、２mgの全RNAが得られ
た。

【００３７】＜２＞mRNAの精製 上記で得られた全RNAからmRNAをポリ(A)⁺ RNA画分とし
て精製した。精製には、ポリ(A)⁺ RNA精製用オリゴ（d
T）固定化ラテックスであるOligotex-dT30<Super>（東
洋紡（株）より購入）を用いた。

【００３８】全RNA１mgの溶液にElution buffer（溶出
バッファー：10mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTA, 0.1% SD
S）を加えて全量で１mlとし、それにOligotex-dT30<Sup
er>１mlを加え、65℃で５分間加熱し、氷上で３分間急
冷した。これに５M NaCl0.2mlを加え、37℃で10分間イ
ンキュベートした後15,000 rpmで、３分間遠心分離後、
上清を注意深く除去した。

【００３９】ペレットをWashing Buffer（洗浄：バッフ
ァー10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA, 0.5M NaCl, 0.1
% SDS） 2.5mlに懸濁し、15,000 rpmで、３分間遠心分
離後、上清を注意深く除去した。ペレットをTE Buffer
１mlに懸濁して、その後65℃で５分間加熱した。これを
氷上で３分間急冷したのち、15,000 rpmで３分間遠心分
離し、上清中のポリ(A)⁺ mRNAを回収した。

【００４０】上記のようにして、１mgの全RNAから約10
μgのポリ(A)⁺ mRNAが得られた。そのうちの５μgをcDN
Aライブラリーの作製に使用した。

【００４１】＜３＞ｃＤＮＡライブラリーの作製 （１）ｃＤＮＡの合成 上記で得られたmRNAを鋳型に用い、Stratagene社製λZA
P cDNA合成キットを用いてcDNA合成を行った。

【００４２】以下の溶液をチューブ中に混合した。 5.0μl 10× 1st Strand Buffer（逆転写反応用バッフ
ァー） 3.0μl 10mM 1st Strand Methyl Nucleotide Mix（A,
G,C,U混合物） 2.0μl Linker-Primer（リンカー兼プライマー） H₂O (全体を50μlになるように調節する。) 1.0μl RNase Block II（RNAse阻害剤）

【００４３】上記の各成分はキットの内容物であり、Li
nker-Primerの配列は、配列番号３に示したとおりであ
る。尚、メチル化されたヌクレオチドを用いるのは、後
の制限酵素反応でｃＤＮＡが切断されないようにするた
めである。

【００４４】上記反応液をよく撹拌した後、ポリ(A)⁺ m
RNA 5.0μgを加え、室温で10分反応させた。さらに2.5
μl M-MuLV RTase（逆転写酵素）を加え（この時に全体
が50μlになる）、緩やかに混合した後、軽く遠心して
反応液をチューブの底部に落とし、37℃で60分反応させ
た。

【００４５】次に、以下の溶液を順序に従ってチューブ
中に混合した。 45.0μl ｃＤＮＡ一次鎖を含む反応液 40.0μl 10×2nd Strand Buffer（ポリメラーゼ反応
用バッファー） 6.0μl 2nd Strand Nucleotide Mixture（A,G,C,T混
合物） 302.0μl H₂O

【００４６】更に以下の溶液を添加したが、RNaseとDNA
ポリメラーゼが同時に働き出すようにチューブの壁に酵
素液を付着させ、その後手早くボルテックスし、遠心し
て反応液をチューブの底部に落とし、16℃で150分、ｃ
ＤＮＡ二次鎖の合成反応を行った。

【００４７】0.8μl RNase H（RNA分解酵素） 7.5μl DNAポリメラーゼＩ(10.0 u /μl)

【００４８】これに400μlのフェノール：クロロホルム
（1:1）混液を加え、よく撹拌した後室温で２分遠心し
た。上清に400μlのフェノール：クロロホルムを加え、
ボルテックスして室温で２分遠心し、その上清に以下の
溶液を加えてｃＤＮＡを沈殿させた。

【００４９】33.3μl ３M 酢酸ナトリウム溶液 867.0μl 100% エタノール

【００５０】これを-20℃で一晩放置し、室温で60分遠
心した後、80% エタノールで緩やかに洗浄し、２分遠心
した。上清を除き、ペレットを乾燥させ、43.5μlの滅
菌水に溶解した。そのうち39.0μl に以下の溶液を添加
し、ｃＤＮＡ末端を平滑化させた。

【００５１】5.0μl 10×T4 DNA Polymerase Buffer
（T4ホ゜リメラーセ゛反応用ハ゛ッファー） 2.5μl 2.5mM dNTP Mix（A,G,C,T混合物） 3.5μl T4 DNAポリメラーゼ（2.9 u /μl）

【００５２】37℃で30分反応させ、50μlの滅菌水を加
えた後100μlのフェノール：クロロホルムを加え、ボル
テックスして２分遠心した。上清に100μlのクロロホル
ムを加え、ボルテックスして２分遠心し、上清に以下の
溶液を加えてｃＤＮＡを沈殿させた。

【００５３】7.0μl 3M 酢酸ナトリウム溶液 226μl 100% エタノール

【００５４】この溶液を氷上に30分以上放置し、４℃で
60分遠心した。沈殿を150μlの80%エタノールで洗浄
し、２分遠心した後乾燥させた。このｃＤＮＡのペレッ
トを7.0μlのEcoRI Adaptor（EcoRIアダプタ：図１参
照）溶液に溶解し、更に、以下の溶液を添加してｃＤＮ
Ａの両末端にEcoRIアダプタを連結した。

【００５５】1.0μl 10×Ligation Buffer（リガー
ゼ反応用バッファー） 1.0μl 10mM ATP 1.0μl T4 DNAリガーゼ

【００５６】この反応液を軽く遠心し４℃に一晩以上放
置した。EcoRIアダプタの各々のストランドの配列を配
列番号４、５及び図１に示す。この溶液を70℃で30分処
理した後軽く遠心し、５分室温に放置し、以下の溶液を
加えて、EcoRIアダプタの５’末端をリン酸化した。

【００５７】1.0μl 10×Ligation Buffer（リガー
ゼ反応用バッファー） 2.0μl 10mM ATP 6.0μl H₂O1.0μl T4ホ゜リヌクレオチト゛キナーセ゛（10.0 u /
μl）

【００５８】37℃で30分反応させ、70℃で30分処理した
後、軽く遠心し室温に５分放置した。さらに以下の溶液
を加え、37℃で90分反応させてXhoIでLinker-Primerに
よって導入されたXhoIサイトを切断したのち室温に放置
し冷却させた。

【００５９】28.0μl XhoI Buffer 3.0μl XhoI (45 u /μl)

【００６０】この反応液に5.0μlの10×STE（10mM Tris
-HCl(pH8.0), 100mM NaCl, 1mM EDTA）を加え、ショー
トフラグメント除去用遠心カラム（Sephacryl Spin Col
umn）に添加し、600 gで２分遠心した溶出液を、フラク
ション１とした。さらにこの操作を３回繰り返し、それ
ぞれフラクション２、３及び４とした。

【００６１】フラクション３、４を合わせ、フェノー
ル：クロロホルム(1:1)を加えよく撹拌し、室温で２分
遠心した。上清に等量のクロロホルムを加えよく撹拌
し、室温で２分遠心しさらにその上清に２倍の100%エタ
ノールを加え-20℃に一晩放置した。これを４℃で60分
遠心した後等量の80%エタノールで洗浄した。さらに４
℃で60分遠心し、cDNAのペレットを10μlの滅菌水に懸
濁した。

【００６２】（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記で得られた二本鎖ｃＤＮＡをλファージ発現ベクタ
ーに連結し、組換えベクターを調製した。

【００６３】チューブに以下の溶液を混合し、１２℃で
一晩、反応させ、２時間室温で放置し、ｃＤＮＡをベク
ターに連結させた。 2.5μl ｃＤＮＡ溶液 0.5μl 10×Ligation Buffer 0.5μl 10mM ATP 1.0μl λZAPベクターＤＮＡ（１μg/μl） 0.5μl T4 DNAリガーゼ（４ Weiss u/μl）

【００６４】（３）ファージＤＮＡのファージ粒子への
パッケージング ｃＤＮＡを挿入したファージベクターを、インビトロ・
パッケージングキット（GigapackII Gold packaging ex
tract；Stratagene社製）を用いてファージ粒子にパッ
ケージングした。

【００６５】溶解した直後の凍結−融解エキス（Freeze
/ Thaw extract）に組換えファージ溶液を加え、氷上
に置き、すぐに15μlの超音波処理エキス（Sonic extra
ct）を加え、ピペッティングしてよく混合した。これを
軽く遠心して室温（22℃）に２時間放置した。

【００６６】上記反応液に500μlのファージ希釈バッフ
ァー（Phage Dilution Buffer）を加えさらに20μlのク
ロロホルムを加え、混合した。ライブラリーのタイター
を測定するために、500μlの水相の内２μlを18μlのSM
buffer（１Ｌ中、NaCl 5.8g, MgSO₄・7H₂O 2g, 1M Tris
-HCl(pH7.5) 50ml, 2% ゼラチン 5ml）で1:10に希釈し
た。１μlの希釈液と１μlのファージ原液をそれぞれ、
OD₆₀₀が0.5になるまで培養した大腸菌 PLK-F'株の培養
液200μlと共にプレーティングした。すなわち、大腸菌
PLK-F'株とファージ溶液を混合し、37℃で15分培養
し、これを２〜３mlのトップアガー（48℃）に加え、直
ちに37℃に温めたNZY アガープレートへ重層した。37℃
で一晩培養し、出現したプラークを数えてタイターを算
出した。その結果、タイターは1.2×10⁶ pfu/mlであっ
た。

【００６７】（４）ライブラリーの増幅 遠心チューブに約50,000の組み換えバクテリオファージ
を含むパッケージング溶液と、OD₆₀₀が0.5になるまで培
養した大腸菌 PLK-F'株の培養液600μlを加え、37℃で1
5分培養した。この培養液に、溶解後48℃に保っておい
た6.5mlのトップアガーを加え、約37℃に温めておいた1
50mm NZY プレートに重層し、37℃で５〜８時間培養し
た。各プレートに10mlのSM Bufferを加え、４℃で一晩
ゆっくり振とうさせながら培養した。

【００６８】各プレート中のSM Bufferを滅菌したポリ
プロピレンチューブに集め、更に各プレートを２mlのSM
bufferでリンスし、これも同チューブに集めた。全量
の５％にあたるクロロホルムを加えて混合し、室温で15
分放置し、4,000 gで５分遠心して菌体を除いた。この
上清に、全量の0.3%にあたるクロロホルムを加え、４℃
で保存した。

【００６９】こうして増幅したライブラリーのタイター
を前記と同様にして測定した結果、2.3×10⁹ pfu/mlで
あった。

【００７０】（５）ファージＤＮＡからのプラスミドの
切り出し 組換えファージＤＮＡから、プラスミド部分のインビト
ロ切りだし（In vivoExcision）を行った。50mlのコニ
カルチューブ中に以下のものを混合し、37℃で15分感染
させた。

【００７１】大腸菌XL1-Blue培養液(OD₆₀₀=0.1) 200μ
l 増幅後のファージ溶液 200μl (>1×10⁵ ファーシ゛粒子) ヘルパーファージR408 １μl (>1×10⁶ pfu/ml)

【００７２】上記混合液に５mlの２×YT培地を加え、37
℃で３時間振とう培養して、70℃で20分熱処理した後40
00 gで５分遠心した。上清をデカントし、滅菌チューブ
へ移した。これを遠心し、上清を100倍希釈した溶液20
μlとOD₆₀₀が1.0になるまで培養した大腸菌XL1-Blue の
培養液200μlを混合し、37℃で15分感染させた。

【００７３】１〜100μlの培養液を、アンピシリンを含
むLBプレートにプレーティングした後、37℃で一晩培養
した。出現したコロニーをランダムに選択して、グリセ
ロールを加えて-80℃で保存した。

【００７４】（６）プラスミドの調製 プラスミドの調製は、Promega社製のMagic mini-prepキ
ットを用いて行った。-80℃で保存しておいたプラスミ
ドを保持する大腸菌の培養液を、５mlの２×YT培地に植
菌し、37℃で一晩培養した。５分間遠心（4,000 rpm，
４℃）して上清をデカントにより除去し、菌体ペレット
にTEバッファーを１ml加えボルテックスした。菌体懸濁
液をエッペンドルフチューブに移し、５分間遠心（5,00
0 rpm,４℃）して上清をデカントにより除去した。

【００７５】菌体ペレットに300μlのCell Resuspensio
n Solution（細胞懸濁用溶液）を加えよく懸濁し、エッ
ペンドルフチューブに移した。これを２分間ミキサーで
撹拌し、300μlのCell Lysis Solution（細胞溶解用溶
液）を加え透明になるまで撹拌した。さらに300μlのNe
utralization Solution（中和用溶液）を加え、手で振
って撹拌した後、10分間遠心（15,000 rpm）した。

【００７６】上清のみを新しいエッペンドルフチューブ
（1.5ml）に移した。吸引管にコック、ミニカラム、シ
リンジ（注射器）の順で接続し、シリンジにレジンを１
ml入れた。上記上清をこのシリンジの中へ注入し良く撹
拌した後、吸引した。Column WashSolution（カラム洗
浄用溶液）を２ml加え吸引して洗浄し、乾燥のため１〜
２分そのまま吸引しておいた。ミニカラムを取り外し、
新しいエッペンドルフチューブ（1.5ml）内にセットし
た。65〜70℃に温めた滅菌水100μlをミニカラムに注入
し、１分間エッペンドルフチューブごと遠心（5,000 rp
m）した。

【００７７】溶出液をエッペンドルフチューブに移し、
３M 酢酸ナトリウム水溶液を５μl加え、冷エタノール
(99.5%)を250μl加えた。これを遠心し（15000 rpm，25
分）、上清を捨て、沈殿にエタノール (70%)を１ml加
え、再び遠心した（15000 rpm，３分）。エタノールを
完全に取り除き、チューブをデシケーター中でバキュー
ムドライした。沈澱を20μlの滅菌水に良く溶かし、-20
℃で保存した。この溶液１μlを取って、ボリュームマ
ーカーと一緒に電気泳動してプラスミドＤＮＡを定量し
た。

【００７８】＜４＞ｃＤＮＡの塩基配列の決定及び遺伝
子データベースとのホモロジー検索 （１）ｃＤＮＡの塩基配列の決定 ｃＤＮＡの塩基配列解析は、アプライドバイオシステム
ズ社（ABI）製DNAオートシーケンサー373Aを用いて行っ
た。シーケンス反応は同社製Dye Primer CycleSequenci
ngキットによりＴ３プライマーを用いて付属の説明書に
従って行った。ランダムに選択した約750個のクローン
について、塩基配列の決定を行った。

【００７９】（２）遺伝子データベースとのホモロジー
検索 決定した塩基配列について、DNA解析ソフトDNASIS（日
立ソフトウエアエンジニアリング）のホモロジー検索機
能を使って行った。データベースとしては、GenBankを
選んだ。ホモロジー検索のアルゴリズムは、調べたい配
列を、データベース中の配列に対して１塩基ずつずらし
ながら比較して行き、６塩基以上連続して塩基の一致し
ている場合にホモロジースコアテーブルに従ってホモロ
ジースコアを計算していくというものである。ホモロジ
ースコアが160ポイント以上のものを候補として取り上
げるように設定し、さらにギャップを入れることによっ
てスコアが最大になるように最適化した。

【００８０】検索を行った約750クローンの配列のう
ち、データベース中の何らかの配列とホモロジーのあっ
たものは282クローンあり、その中に植物のユビキチン
結合酵素遺伝子とホモロジーを有するクローンを見い出
した。ホモロジースコアの最も高かったのはトマトから
単離された同遺伝子であったが、得られたクローン及び
トマト遺伝子を互いに比較することによって、上記クロ
ーンが開始コドンを含んでいることがこの時点で判明し
た。

【００８１】（３）ワタユビキチン結合酵素遺伝子の完
全長塩基配列の決定 ワタユビキチン結合酵素をコードし、開始コドンを含む
ことが明らかになったクローンについて、完全長の配列
を決定すべく、３’末端側からの配列決定を行うため
に、Ｔ７のプライマーを用いて、オートシーケンサーに
よる塩基配列決定を行った。Ｔ３，Ｔ７の両プライマー
を用いることにより、配列表に示したようにすべての塩
基配列が明らかとなった。

【００８２】（４）本発明の遺伝子とトマトユビキチン
結合酵素遺伝子との比較 明らかになった本発明の遺伝子の全配列を用いて、再び
データベースとのホモロジー検索を行った。その結果、
トマト、エンドウ、アラビドプシス、イネ、酵母などの
ユビキチン結合酵素遺伝子との間にホモロジーのあるこ
とがわかった。その中でも本発明の遺伝子と最もホモロ
ジーの高かったのはトマト由来の遺伝子であった。

【００８３】コード領域の塩基の長さは両者とも終止コ
ドンを含めて447bpと等しく、そのうち364塩基が一致し
ており、81.4%のホモロジーであった（図２）。また、
遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸での比較を行
なった場合、いずれも148アミノ酸からなるが、そのう
ちの136アミノ酸が一致しており91.9%のホモロジーであ
った（図３）。性質の似たアミノ酸を考慮に入れると14
6アミノ酸が一致していると考えられ、98.6%もの高いホ
モロジーを有することから、上記で得られたクローン
は、ワタにおいてユビキチン結合酵素をコードしている
遺伝子のｃＤＮＡであると同定された。

【００８４】

【発明の効果】本発明により、ワタ由来のユビキチン結
合酵素遺伝子が初めて得られた。この遺伝子は、ストレ
ス耐性ワタの作成及び雄性不稔ワタ植物の作出に利用で
きることが期待される。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：733 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ワタ（Gossypium hirsutum L.） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：80..526 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CAACTCCACA ACGCCAAATT CAAGTTTACC AACCTTATTG TTTATTTGTT CGAGAATTAG 60 AGAGTTTTTT TGAATACCC ATG GCT TCG AAG CGG ATT AAT AAG GAG TTG AAA 112 Met Ala Ser Lys Arg Ile Asn Lys Glu Leu Lys 1 5 10 GAT CTG CAG AAG GAC CCT CCT GCA TCT TGC AGT GCT GGC CCT GTT GGT 160 Asp Leu Gln Lys Asp Pro Pro Ala Ser Cys Ser Ala Gly Pro Val Gly 15 20 25 GAT GAT ATG TTC CAC TGG CAA GCA ACA ATT ATG GGC CCA GCA GAC AGT 208 Asp Asp Met Phe His Trp Gln Ala Thr Ile Met Gly Pro Ala Asp Ser 30 35 40 CCT TTT GCT GGA GGA CTA TTT CTT GTT TCC ATT CAC TTC CCC CCA GAC 256 Pro Phe Ala Gly Gly Leu Phe Leu Val Ser Ile His Phe Pro Pro Asp 45 50 55 TAT CCA TTC AAG CCT CCC AAG GTT TCT TTC CGA ACA AAG GTT TTC CAT 304 Tyr Pro Phe Lys Pro Pro Lys Val Ser Phe Arg Thr Lys Val Phe His 60 65 70 75 CCC AAC ATC AAC AGC AAT GGA AGC ATC TGT CTT GAC ATT CTC AAG GAG 352 Pro Asn Ile Asn Ser Asn Gly Ser Ile Cys Leu Asp Ile Leu Lys Glu 80 85 90 CAG TGG AGC CCT GCC CTT ACC ATA TCC AAG GTG CTG CTT TCA ATA TGC 400 Gln Trp Ser Pro Ala Leu Thr Ile Ser Lys Val Leu Leu Ser Ile Cys 95 100 105 TCA CTT CTC ACA GAA CCA AAT CCT GAT GAC CCT CTG GTG CCT GAG ATT 448 Ser Leu Leu Thr Glu Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu Val Pro Glu Ile 110 115 120 GCT CAC ATG TAT AAG ACT GAT AGA GCC AAA TAT GAG AGC ACT GCT CGC 496 Ala His Met Tyr Lys Thr Asp Arg Ala Lys Tyr Glu Ser Thr Ala Arg 125 130 135 TCA TGG ACT CAG AAA CAT GCA ATG AAT TAAGGGTCGG TCAGGCTTAG 543 Ser Trp Thr Gln Lys His Ala Met Asn 140 145 GATGCTATGT TTGATACCTT TTACTAAATA ATAGTAGTAA TAACTTTTGT CGTTTGGATC 603 CTTTGATAAA GTGGTGGTGT GGTGTAATAA GCTCTAAAGT CTTTCAGAGG GTAATTTTTT 663 TCCAATCAAG GTACTTAAAA TTACTATTAT AAATATATTC GACAGTTCTT AAAAAAAAAA 723 AAAAAAAAAA 733

【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：148 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Ser Lys Arg Ile Asn Lys Glu Leu Lys Asp Leu Gln Lys Asp 1 5 10 15 Pro Pro Ala Ser Cys Ser Ala Gly Pro Val Gly Asp Asp Met Phe His 20 25 30 Trp Gln Ala Thr Ile Met Gly Pro Ala Asp Ser Pro Phe Ala Gly Gly 35 40 45 Leu Phe Leu Val Ser Ile His Phe Pro Pro Asp Tyr Pro Phe Lys Pro 50 55 60 Pro Lys Val Ser Phe Arg Thr Lys Val Phe His Pro Asn Ile Asn Ser 65 70 75 80 Asn Gly Ser Ile Cys Leu Asp Ile Leu Lys Glu Gln Trp Ser Pro Ala 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Lys Val Leu Leu Ser Ile Cys Ser Leu Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu Val Pro Glu Ile Ala His Met Tyr Lys 115 120 125 Thr Asp Arg Ala Lys Tyr Glu Ser Thr Ala Arg Ser Trp Thr Gln Lys 130 135 140 His Ala Met Asn 145

【００８７】配列番号：３ 配列 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGTTTTTTTT TTTTTTTTTT 54

【００８８】配列番号：４ 配列 AATTCGGCAC GAG 13

【００８９】配列番号：５ 配列 CTCGTGCCG 9

【図面の簡単な説明】

【図１】 EcoRIアダプターの構造を示す図。

【図２】 ワタとトマトとのユビキチン結合酵素遺伝子
の塩基配列の比較を示す図。＊印は、両遺伝子で一致す
る塩基を表す。

【図３】 ワタとトマトとのユビキチン結合酵素のアミ
ノ酸配列の比較を示す図。＊印は、両酵素で一致するア
ミノ酸残基を、．印は性質がよく似たアミノ酸残基を表
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹西 壮一郎 東京都足立区西新井栄町１−18−１日清紡 績株式会社東京研究センター内 (72)発明者 内宮 博文 神奈川県川崎市中原区木月1315 木月住宅 １−403

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれ
   と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
   ド配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に
   おいてヌクレオチド番号８０〜５２３の配列又はこれと
   実質的に同一の配列である請求項１記載のＤＮＡ。