JPH08151385A - Bisabosqual derivative - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To obtain a new bisabosqual derivative useful for treating and preventing hypercholesterolemia and mycotic infection, having squalene synthesis inhibiting activity, by culturing a microorganism belonging to the genus Stachbotrys ruwenzoriensis. CONSTITUTION: This new bisabosqual derivative (e.g. bisabosqual A) is shown by formula I (R<1> is CHO or CH2 OH; R<3> is H or hydroxy; R<3> is groups of formula II to formula IV), has squalene synthesis inhibiting activity and antifungal activity and is useful for treating and preventing hypercholesterolemia and mycotic infection. The compound is obtained by inoculating a fungus [e.g. Stachbotrys ruwenzoriensis RF-6,853 strain (FERM P-14,384)] belonging to the genus Stachbotrys ruwenzoriensis, capable of producing bisabosqual into a medium, subjecting the fungus to shaking culture at 28 deg.C for 5 days, extracting the culture solution with ethyl acetate, concentrating the extracted solution, subjecting the extracted solution to silica gel chromatography, separating/ purifying.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】本発明は、新規なスクアレン合成酵素阻害
活性および抗真菌活性を有するビサボスクアール誘導体
に関する。The present invention relates to a bisavosqual derivative having novel squalene synthase inhibitory activity and antifungal activity.

【従来技術および発明が解決すべき課題】Prior Art and Problems to be Solved by the Invention

【０００２】高コレステロール血症は、動脈硬化の重要
な病因であり、その予防は様々な疾患の予防および治療
の有効な手段である。そのような目的にはコレステロー
ルの合成阻害あるいは代謝促進などの作用を有する物
質、およびコレステロールの前駆物質の合成を阻害する
物質を用いることができる。コレステロールの生合成に
おける重要な中間体であるスクアレンは、スクアレン合
成酵素の作用でファルネシル二りん酸から生成されるプ
レスクアレン二りん酸がＮＡＤＰＨにより還元されるこ
とにより合成される、イソプレン単位より成るイソプレ
ノイドである。次いで、このスクアレンは、ラノステロ
ールを経てコレステロールなどのステロールに合成され
る。従って、スクアレンの合成を阻害することは、高コ
レステロール血症の治療に有用であると考えられる。従
来、微生物由来のスクアレン合成酵素阻害剤として、ス
クアレスタチン類（Squalestatin）(WO92/12159)、ザラ
ゴジック酸類（Zaragozic acid）(WO92/20336)およびビ
リジオフンジン（Viridiofungin）(EP 526,936)、およ
びTAN−1607A（EP 568,946）等のトリカルボキシル基を
有する化合物が既知であった。しかし、より多くの有効
な物質の開発が望まれていた。Hypercholesterolemia is an important cause of arteriosclerosis, and its prevention is an effective means for the prevention and treatment of various diseases. For such purpose, a substance having an action of inhibiting the synthesis of cholesterol or promoting metabolism, and a substance inhibiting the synthesis of a precursor of cholesterol can be used. Squalene, which is an important intermediate in the biosynthesis of cholesterol, is an isoprenoid composed of isoprene units, which is synthesized by reducing presqualene diphosphate produced from farnesyl diphosphate by the action of squalene synthase with NADPH. Is. This squalene is then synthesized via lanosterol into sterols such as cholesterol. Therefore, inhibition of squalene synthesis may be useful in the treatment of hypercholesterolemia. Conventionally, as squalene synthase inhibitors derived from microorganisms, squalestatins (Squalestatin) (WO92 / 12159), Zaragozic acids (WO92 / 20336) and Viridiofungin (EP 526,936), and TAN-1607A. Compounds having a tricarboxyl group such as (EP 568,946) have been known. However, the development of more effective substances has been desired.

【０００３】[0003]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、スクアレ
ン合成酵素阻害活性を有し、医薬として利用可能な化合
物を提供することを目的として、広範な微生物由来の物
質を試験した結果、カビの１種であるスタキボトリス
（Stachybotrys）属に属する菌株が、上記の活性を有す
る物質を産生することを見出した。次いで、その物質を
単離精製し、構造決定を行い、さらに、所望により、酸
化、還元またはエポキシ化することにより、本発明の目
的を達成する上で有用な化合物を得ることに成功した。Means for Solving the Problems The present inventors have tested a wide variety of microorganism-derived substances with the purpose of providing compounds having squalene synthase inhibitory activity and usable as pharmaceuticals. It was found that a strain belonging to the genus Stachybotrys, which is one of the above, produces a substance having the above activity. Then, the substance was isolated and purified, subjected to structure determination, and further optionally oxidized, reduced or epoxidized to obtain a compound useful in achieving the object of the present invention.

【０００４】即ち、本発明は、式Ｉ：That is, the present invention provides a compound of the formula I:

【化８】 （式中、Ｒ¹は−ＣＨＯまたは−ＣＨ₂ＯＨ、Ｒ²は水素
またはヒドロキシ、Ｒ³は式：Embedded image (In the formula, R ¹ is —CHO or —CH ₂ OH, R ² is hydrogen or hydroxy, and R ³ is a formula:

【化９】 で示される基を表す）で示される化合物を提供するもの
である。本発明の式Ｉで示される化合物はビサボスクア
ール（Bisabosqual)と命名された。本発明のビサボスク
アール誘導体は、好ましくは式I'：[Chemical 9] Which represents a group represented by). The compound of formula I of the present invention has been named Bisabosqual. The bisavosqual derivatives of the invention preferably have the formula I ′:

【化１０】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は前記と同意義、Ｒ³は式：[Chemical 10] [In the formula, R ¹ and R ² have the same meanings as described above, and R ³ represents the formula:

【化１１】 （式中、波線はα結合、β結合又はそれらの混合物のい
ずれかの配置であることを表す）で示される基を表す］
で示される相対平面構造を有している。また、好ましい
ビサボスクアール誘導体は、下記の５種類である。[Chemical 11] (In the formula, the wavy line represents an arrangement of α bond, β bond, or a mixture thereof).
It has a relative plane structure shown by. In addition, the following five kinds of preferable bisavosqual derivatives are used.

【化１２】 [Chemical 12]

【０００５】本発明化合物は、該化合物を産生するスタ
キボトリス属の菌株を用いて製造することができる。特
に、本発明のStachybotrys sp.RF−7260株（FERM P−14
383)およびStachybotrys ruwenzoriensis RF−6853株(F
ERM P−14384)が好ましい。これら、新規なRF−7260株
およびRF−6853株の菌学的特性を以下に示す。RF−7260
株のコ−ンミ−ル寒天培地上でのコロニ−は不規則にひ
ろがり、その表面は湿潤し、緑黒色を呈する。分生子柄
は単生し、分枝せず、培地表面から直立する。個々の分
生子柄はほとんど無色で２〜５細胞からなり、表面は平
滑である。フィアライド（８〜10×３〜４μm）は分生
子柄先端に６〜８個生じ、単細胞で棍棒状を呈し、無色
で表面は平滑である。分生子（９〜11×３〜４μm）は
フィアライド上に球状の湿潤した光沢のある分生子塊と
して形成され、単細胞、淡緑黒色で表面は平滑であり、
長円筒形を呈する。The compound of the present invention can be produced by using a strain of Stachybotrys that produces the compound. In particular, the Stachybotrys sp. RF-7260 strain of the present invention (FERM P-14
383) and Stachybotrys ruwenzoriensis RF-6853 strain (F
ERM P-14384) is preferred. The mycological characteristics of these novel RF-7260 and RF-6853 strains are shown below. RF-7260
The colony of the strain on Cornmeal agar spreads irregularly, its surface was moist and greenish black. The conidia peduncle is single-born, does not branch, and stands upright from the medium surface. The individual conidia stalks are almost colorless and consist of 2-5 cells with a smooth surface. Six to eight phialides (8 to 10 × 3 to 4 μm) were produced at the tip of the conidia peduncle, were single-celled, club-shaped, colorless and had a smooth surface. Conidia (9-11 × 3-4 μm) are formed as spherical, moist, glossy conidia masses on the phialides, single cells, pale green-black, smooth surface,
It has a long cylindrical shape.

【０００６】RF−6853株のコーンミール寒天培地上での
コロニーは不規則にひろがり、淡黄褐色を呈し、白色で
綿毛状の気菌糸を生ずる。本菌株は分生子形成が悪く、
分生子を形成した部分は小黒点として観察される。分生
子柄は単生し、分枝せず、培地表面から直立する。個々
の分生子柄はほとんど無色で、２〜５細胞からなり、表
面は平滑である。フィアライド（８〜10×３〜４μm）
は分生子柄先端に５〜７個生じ、単細胞で棍棒状を呈
し、無色で表面は平滑である。分生子（７〜９×７〜９
μm）はフィアライド上に球状の湿潤した光沢のある分
生子塊として形成され、単細胞、黒色で球形を呈し、そ
の表面は疣状である。これら２株はいずれも子嚢果その
他の有性生殖器官を有せず、分生子柄先端のフィアライ
ド頂端に湿潤した光沢のある分生子塊として分生子を形
成する性状を有することからスタキボトリス（Stachybo
trys）属に属する株であると判断される。これら２株の
諸性状を文献［エリス（M.B.Ellis）著 Dermatiaceous
Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Instite, Ke
w, Surrey, England,542〜544,1971；エリス（M.B.Elli
s 著） More Dermatiaceous Hyphomycetes, Commonweal
th Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 46
3〜464，1976；松島 崇著 Icones Microfungorum a Mat
sushima Lectorum, Kobe, 1975；および松島 崇著Matsu
shima Mycological Memoirs 4, 1985］に記載されてい
るスタキボトリス（Stachybotrys）属の既知種と比較し
た。Colonies of the RF-6853 strain on cornmeal agar medium spread irregularly, exhibiting a light yellowish brown color, and producing white and fluffy aerial mycelia. This strain has poor conidia formation,
The conidia forming part is observed as small black dots. The conidia peduncle is single-born, does not branch, and stands upright from the medium surface. The individual conidia stalks are almost colorless, consist of 2-5 cells and have a smooth surface. Phialide (8-10 × 3-4μm)
Occurs at the tip of the conidia peduncle, is single-celled and has a club-like shape, is colorless and has a smooth surface. Conidia (7-9 x 7-9
(μm) is formed on the phialide as a spherical, moist, shiny conidial mass, which is unicellular, black and spherical, and its surface is wart-like. Since neither of these two strains has ascomycetes or other sexual reproductive organs, and has the property of forming conidia as a wet glossy conidia mass at the apical end of the phialide at the conidia stalk, Stachybotris
trys )). The characteristics of these two strains are described in the literature [Dermatiaceous by MB Ellis].
Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Instite, Ke
w, Surrey, England, 542〜544,1971; Ellis (MBElli
s) More Dermatiaceous Hyphomycetes, Commonweal
th Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 46
3-464, 1976; Takashi Matsushima, Icones Microfungorum a Mat
sushima Lectorum, Kobe, 1975; and Takashi Matsushima, Matsu
shima Mycological Memoirs 4, 1985] and compared with known species of the genus Stachybotrys .

【０００７】その結果、RF−7260株の分生子は長円筒形
で、その表面が平滑であることからStachybotrys longi
spora Matsushima 1975 と最も近縁であるが、RF−7260
では分生子の幅が３〜４μmであるのに対し、S. longis
poraでは2.0〜2.4μmと細い点で相違しており、本菌株
は既知種と一致しないことが明らかとなった。この新規
なRF−7260株は、平成６年６月24日から、Stachybotrys
sp. RF−7260として、茨城県つくば市東１−１−３の
工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P
−14383号の下で寄託されている。また、RF−6853株の
分生子は球形ないし亜球形、表面は疣状であり、その直
径は７〜９μmであり、分生子柄が分枝しないという特
徴を持っている。この性状は Stachybotrys ruwenzorie
nsis Matsushima 1985 とほぼ一致するので、Stachybot
rys ruwenzoriensisと同定された。RF−6853株は、平成
６年６月24日から、Stachybotrys ruwenzoriensis RF−
6853として、茨城県つくば市東１−１−３の工業技術院
生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P−14384号
の下で寄託されている。As a result, Stachybotrys longi conidia of the RF-7260 strain have a long cylindrical shape and have a smooth surface.
RF-7260, most closely related to spora Matsushima 1975
In contrast, the width of conidia is 3-4 μm, while S. longis
The pora had a small difference of 2.0 to 2.4 μm , which revealed that this strain did not match the known species. This new RF-7260 strain has been used by Stachybotrys since June 24, 1994.
As sp. RF-7260, contract number FERM P at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, 1-1-3 East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture.
Deposited under No. -14383. Further, the conidia of the RF-6853 strain are spherical or subspherical, the surface thereof is wart-like, the diameter is 7 to 9 μm, and the conidia stalk is not branched. This property is Stachybotrys ruwenzorie
It almost matches with nsis Matsushima 1985, so Stachybot
It was identified as rys ruwenzoriensis . The RF-6853 strain has been used for Stachybotrys ruwenzoriensis RF- since June 24, 1994 .
6853 has been deposited under the deposit number FERM P-14384 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute, 1-1-3 East, Tsukuba, Ibaraki Prefecture.

【０００８】これらRF−7260およびRF−6853株を適当な
培地で培養すると、それらの発酵液中に本発明化合物が
産生される。これを適当な方法で単離精製し、L−SIM
S、IR、¹H NMRおよび¹³C NMRにより分析することにより
その相対平面構造を決定した。その結果、本発明のビサ
ボスクアール誘導体は、上記のごとくビサボラン（bisa
bolane）型の新規セスキテルペンであることが判明し
た。Stachybotrys sp. RF−7260株を適当な培地で培養
すると、活性は菌体のアセトン抽出部と共にろ液中にも
存在する。発酵液の酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラ
ムクロマトで精製し、n−ヘキサン／アセトンから再結
晶を行ない、無色板状晶のビサボスクアールＡを得た。
L−SIMS、IR、¹H、¹³C NMRから決定したビサボスクアー
ルＡの相対的平面構造は上記の通りである。他方、Stac
hybotrys ruwenzoriensis RF−6853株は、条件に応じて
ビサボスクアールＢ、Ｃ、Ｄを産生する。即ち発酵培地
の炭素源がグルコースの場合は菌体のアセトン抽出部か
らビサボスクアールＢが同定された。炭素源がシューク
ロースの場合、菌体のアセトン抽出部にビサボスクアー
ルＣが、ろ液中にビサボスクアールＤが同定された。When these RF-7260 and RF-6853 strains are cultured in an appropriate medium, the compound of the present invention is produced in their fermentation broth. This was isolated and purified by an appropriate method, and L-SIM
Its relative planar structure was determined by analysis by S, IR, ¹ H NMR and ¹³ C NMR. As a result, the bisabosuquer derivative of the present invention has a
bolane) type sesquiterpene. When Stachybotrys sp. RF-7260 strain is cultured in an appropriate medium, the activity is present in the filtrate together with the acetone-extracted portion of the bacterial cells. The ethyl acetate extract of the fermentation broth was purified by silica gel column chromatography and recrystallized from n-hexane / acetone to obtain colorless plate-like bisavosqual A.
The relative planar structure of bisavosqual A determined from L-SIMS, IR, ¹ H, ¹³ C NMR is as described above. On the other hand, Stac
The hybotrys ruwenzoriensis RF-6853 strain produces Bisavosqual B, C, D depending on the conditions. That is, when glucose was used as the carbon source of the fermentation medium, bisavosqual B was identified from the acetone extraction part of the bacterial cells. When the carbon source was sucrose, Bisavosqual C was identified in the acetone-extracted portion of the bacterial cells, and Bisavosqual D was identified in the filtrate.

【０００９】本発明のスクアレン合成阻害物質の製造を
目的とするRF−7260およびRF−6853株の培養は、発酵学
の分野において同様の場合に用いられる培地および条件
を用いて行うことができる。また、目的化合物の分離、
精製も発酵学の分野で既知の方法に従って行うことがで
きる。後述する実施例には好適な製造方法および条件が
記載されているが、本発明はこれらに限定されるもので
はなく、RF−7260およびRF−6853株によるビサボスクア
ールの製造に適した任意の培養条件および分離精製法を
用いても目的化合物を得ることが可能である。さらに、
化学合成によっても得ることができ、本発明はこれらの
他の方法で得られる式Ｉの化合物すべてを包含するもの
である。従って、本発明はまた、スタキボトリス（Stac
hybotrys）属に属し、上記のビサボスクアールＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄを産生する微生物、とりわけ新規な株であるS．s
p.RF−7260株（FERM P−14383)およびS．ruwenzoriensi
s RF−6853株(FERM P−14384)を培養し、得られた培養
物から生成された化合物を分離、精製し、所望により酸
化、還元またはエポキシ化することからなる、化合物Ｉ
の製造方法を提供するものである。Cultivation of the RF-7260 and RF-6853 strains for the purpose of producing the squalene synthesis inhibitory substance of the present invention can be carried out using the medium and conditions used in the same cases in the field of fermentology. Also, separation of the target compound,
Purification can also be performed according to methods known in the field of fermentology. Although suitable production methods and conditions are described in the examples described below, the present invention is not limited thereto, and any culture conditions suitable for production of bisavosqual by RF-7260 and RF-6853 strains. The target compound can also be obtained by using a separation and purification method. further,
It can also be obtained by chemical synthesis and the invention includes all compounds of formula I obtained by these other methods. Therefore, the present invention also relates to Stakibotrys ( Stac
hybotrys ) belonging to the genus,
C, D producing microorganisms, especially the novel strain S. s
p.RF-7260 strain (FERM P-14383) and S. ruwenzoriensi
s RF-6853 strain (FERM P-14384) is cultivated, and the compound produced from the resulting culture is separated, purified, and optionally oxidized, reduced or epoxidized.
The present invention provides a method for manufacturing the same.

【００１０】以下に、本発明化合物の一般的製造法を記
載する。スタキボトリス属（Stachybotrys）属に属する
菌株、例えば上記のS.sp RF−7260株又は、S.ruwenzori
ensis RF−6853株を、通常の発酵生産に用いる培地組成
および培地条件で培養する。培地は原則として、炭素
源、窒素源、無機塩などを含有する。必要に応じて、ビ
タミン類、前駆物質などを加えてもよい。炭素源として
は、例えば、グルコース、シュークロース、可溶性デン
プン、デキストリン、グリセリン、糖類、有機酸などを
単独又は混合物として用いる。窒素源としては、例え
ば、大豆粉、コーンスチープリカー、牛肉エキス、酵母
エキス、綿実粉、ポリペプトン、小麦麦芽、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムなどを単独又は混合物として
用いる。無機塩としては、例えば、炭酸カルシウム、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン
酸塩などが挙げられ、必要に応じて培地に添加する。The general method for producing the compound of the present invention will be described below. Stachybotrys (Stachybotrys) strain belonging to the genus, for example, the above S .sp RF-7260 strain or, S. Ruwenzori
The ensis RF-6853 strain is cultivated in the medium composition and medium conditions used for normal fermentation production. As a rule, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like. If necessary, vitamins and precursors may be added. As the carbon source, for example, glucose, sucrose, soluble starch, dextrin, glycerin, sugars, organic acids, etc. are used alone or as a mixture. As the nitrogen source, for example, soybean flour, corn steep liquor, beef extract, yeast extract, cottonseed flour, polypeptone, wheat malt, ammonium sulfate, ammonium nitrate and the like are used alone or as a mixture. Examples of the inorganic salt include calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, copper sulfate, manganese chloride, zinc sulfate, cobalt chloride, and various phosphates, which are added to the medium as necessary.

【００１１】培養は約15〜40℃の温度で行ってよいが、
特に20〜28℃の温度が好ましい。培養時間は培地、培養
条件によって大きく左右され、約４〜14日を要する。培
養中に激しい発泡が起こる場合には、培養前又は培養中
に、例えば植物油、ラード、ポリプロピレングリコール
などの消泡剤を適宜添加するとよい。培養終了後に培養
物から本発明化合物を分離採取するには、通常の発酵生
産物を分離採取する方法を適宜用いる。例えば、濾過、
遠心分離、各種イオン交換樹脂やその他の活性吸着剤に
よる吸脱着やクロマトグラフィー、各種有機溶媒による
抽出などを適当に組み合わせるとよい。The culture may be carried out at a temperature of about 15 to 40 ° C.,
A temperature of 20 to 28 ° C is particularly preferable. The culturing time greatly depends on the medium and culturing conditions, and requires about 4 to 14 days. When vigorous foaming occurs during culture, an antifoaming agent such as vegetable oil, lard, or polypropylene glycol may be appropriately added before or during the culture. In order to separate and collect the compound of the present invention from the culture after the completion of the culture, a usual method for separating and collecting the fermentation product is appropriately used. For example, filtration,
Centrifugation, adsorption / desorption with various ion exchange resins or other active adsorbents, chromatography, extraction with various organic solvents, etc. may be appropriately combined.

【００１２】次いで、得られたいずれかのビサボスクア
ールを当業者既知の方法で酸化、還元またはエポキシ化
により、他のビサボスクアールまたはエポキシ体に変換
することができる。以下にそのような変換法を示すが、
これらは単なる例示にすぎず、本発明を限定するもので
はない。例えば、ビサボスクアールＡをメタノール、エ
タノール、１−プロパノール、エチレングリコール、テ
トラヒドロフラン等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム
（ＮａＢＨ₄）、水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ₄）、
水素化ホウ素カルシウム（Ｃａ（ＢＨ₄)₂）、水素化リ
チウムトリブトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（Ｏ^tＢｕ)
₃Ｈ₄）、ジボラン（Ｂ₂Ｈ₆）及びシアン化水素化ホウ素
ナトリウム（ＮａＢＨ₃ＣＮ）等から選択される還元剤
１〜５当量、好ましくは２当量の存在下、−７８〜２６
℃、好ましくは０℃で１０分〜４時間、好ましくは１時
間反応させ、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタ
ン等の溶媒で抽出し、溶媒を減圧留去し、得られる粗生
成物を、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィーで
精製することにより、ビサボスクアールＢを得ることが
できる。[0012] Then, any of the obtained bisavosquals can be converted into other bisavosquals or epoxies by oxidation, reduction or epoxidation by methods known to those skilled in the art. Below is such a conversion method,
These are merely examples and do not limit the present invention. For example, methanol Bisabosukuaru A, ethanol, 1-propanol, ethylene glycol, in a solvent such as tetrahydrofuran, hydrogenated sodium borohydride (NaBH _4), lithium borohydride (LiBH _4),
Calcium borohydride (Ca (BH ₄ ) ₂ ), lithium tributoxy aluminum hydride (LiAl (O ^t Bu)
₃ H ₄ ), diborane (B ₂ H ₆ ), sodium borohydride (NaBH ₃ CN) and the like in the presence of 1 to 5 equivalents, preferably 2 equivalents of -78 to 26.
The reaction is carried out at 0 ° C, preferably 0 ° C for 10 minutes to 4 hours, preferably 1 hour, extraction is performed with a solvent such as ethyl acetate, chloroform, dichloromethane and the solvent is distilled off under reduced pressure. Bisavosqual B can be obtained by purification by chromatography.

【００１３】あるいは、ビサボスクアールＢをジクロロ
メタン、クロロホルム、アセトニトリル等の溶媒中、オ
キザリルクロリド、ピリジニウムクロロメート（ＰＣ
Ｃ）、ピリジニウムジクロメート（ＰＤＣ）、クロム酸
−ピリジン（ＣｒＯ₃−Ｐｙ）、二酸化マンガン（Ｍｎ
Ｏ₂）等から選択される酸化剤１〜１０当量、好ましく
は１.１当量の存在下、−７８〜２６℃、好ましくは−
７８℃で１０分〜４時間、好ましくは２時間反応させて
酸化し、溶媒を減圧留去して得られる粗生成物を例えば
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することに
より、ビサボスクアールＡを得ることができる。さらに
は、ビサボスクアールＡを、０〜２６℃、好ましくは室
温で、ピリジンテトラヒドロフラン、２−メチル−２−
プロパノール等の溶媒中、四酸化オスミウム、４−メチ
ルモルホリンオキサイド−四酸化オスミウム、Milas 試
薬(ＯｓＯ₄−ｔ−ＢｕＯＨ）等の酸化剤１〜５当量、好
ましくは１.５当量で１〜９６時間、好ましくは１８時
間処理し、得られる粗生成物を、例えば薄層クロマトグ
ラフィーで精製することにより、ビサボスクアールＤを
得ることができる。また、ビサボスクアールＡを塩化メ
チレン、クロロホルム、ベンゼン等の溶媒中、メタクロ
ロ過安息香酸、マグネシウムモノ過フタル酸又はジメチ
ルジオキシラン等により、−２０〜２６℃、好ましくは
０℃で５分〜２４時間、好ましくは１０分間処理して得
られた粗生成物を、例えばシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーによって精製し、エポキシ体を得ることができ
る。Alternatively, bisavosqual B may be mixed with oxalyl chloride, pyridinium chloromate (PC) in a solvent such as dichloromethane, chloroform or acetonitrile.
C), pyridinium dichromate (PDC), chromic acid-pyridine (CrO ₃ -Py), manganese dioxide (Mn)
O ₂ ), and the like, in the presence of 1 to 10 equivalents, preferably 1.1 equivalents of an oxidizing agent selected from -78 to 26 ° C, preferably-
By reacting at 78 ° C. for 10 minutes to 4 hours, preferably for 2 hours to oxidize, the solvent is distilled off under reduced pressure, and the crude product obtained is purified by, for example, silica gel column chromatography to obtain bisavosqual A. . Furthermore, bisabosuquer A is treated with pyridinetetrahydrofuran, 2-methyl-2-, at 0 to 26 ° C, preferably at room temperature.
In a solvent such as propanol, an oxidizer such as osmium tetroxide, 4-methylmorpholine oxide-osmium tetroxide and Milas reagent (OsO ₄ -t-BuOH) is contained in an amount of 1 to 5 equivalents, preferably 1.5 equivalents for 1 to 96 hours. It is preferably treated for 18 hours, and the resulting crude product is purified by, for example, thin layer chromatography to obtain bisavosqual D. In addition, bisabosuquer A in a solvent such as methylene chloride, chloroform, benzene, or the like with metachloroperbenzoic acid, magnesium monoperphthalic acid, dimethyldioxirane, or the like, at -20 to 26 ° C, preferably 0 ° C for 5 minutes to 24 hours, The crude product obtained by preferably treating for 10 minutes can be purified by, for example, silica gel column chromatography to obtain an epoxy compound.

【００１４】本発明の新規なビサボスクアール誘導体
は、実験例に示すように、インビトロで酵母および各種
動物肝臓由来のスクアレン合成酵素を阻害した。従っ
て、本発明化合物は、高コレステロール血症の治療に有
効である。さらには、本発明化合物は、抗真菌活性をも
有することが示された。従って、本発明化合物は抗真菌
剤として有用である。加えて、本発明化合物は鎮痛作用
をも有することが明らかにされた。従って、本発明化合
物は鎮痛剤としても有用である。本発明化合物は、経口
的または非経口的に投与することができる。経口投与に
よる場合、本発明化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、
散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁
剤；またはシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤の
いずれかの剤形としても用いることができる。非経口投
与による場合、本発明化合物は、水性または油性懸濁注
射剤として用いることができる。その調製に際しては、
慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、
乳化剤、懸濁化剤等のいずれも用いることができ、また
他の添加剤、例えば保存剤、安定剤等を含むものであっ
てもよい。本発明化合物の投与量は、投与方法、患者の
年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なる
が、通常、経口的または非経口的に、１日あたり１mg〜
10g、好ましくは、10mg〜１gを１〜５回に分割して投与
すればよい。以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。The novel bisavosqual derivative of the present invention inhibited squalene synthase derived from yeast and various animal livers in vitro as shown in Experimental Examples. Therefore, the compound of the present invention is effective in treating hypercholesterolemia. Furthermore, it was shown that the compound of the present invention also has antifungal activity. Therefore, the compound of the present invention is useful as an antifungal agent. In addition, it was revealed that the compound of the present invention also has an analgesic effect. Therefore, the compound of the present invention is also useful as an analgesic. The compound of the present invention can be administered orally or parenterally. When administered orally, the compounds of the present invention may be formulated in conventional formulations such as tablets,
It can also be used in the form of any one of solid agents such as powders, granules and capsules; water agents; oily suspensions; and liquid agents such as syrups and elixirs. When administered parenterally, the compound of the present invention can be used as an aqueous or oily suspension injection. When preparing it,
Conventional excipients, binders, lubricants, aqueous solvents, oily solvents,
Any of an emulsifying agent, a suspending agent and the like can be used, and other additives such as preservatives and stabilizers may be contained. While the dose of the compound of the present invention varies depending on the administration method, age, weight, condition of patient and type of disease, it is usually 1 mg to 1 mg per day orally or parenterally.
10 g, preferably 10 mg to 1 g may be administered in 1 to 5 divided doses. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００１５】[0015]

【実施例】実施例１ 3−ヒドロキシ−3,9−ジメチル−9−(4−メ
チル−ペンタ−3−エニル)−2,3,3a,9,9a,9b−ヘキサヒ
ドロ−1H−4,8−ジオキサ−シクロペンタ[def]フェナン
スレン−5,6−ジカルボアルデヒド（ビサボスクアール
Ａ） （１）発酵工程 ２Ｌ容量のマイヤーフラスコにグルコース2.0％、マル
トエキストラクト3.0％および酵母エキストラクト0.5％
からなる培地800mlを注入後滅菌し、これに試験管に斜
面培養したスタキボトリス・エスピー（Stachybotrys s
p.）RF−7260を植菌した。次いで、180回転／分の回転
振盪機上、28℃で５日間培養した。50Ｌ容量のジャーフ
ァメンターにグルコース2.0％、グリセリン2.0％、ビー
フエキストラクト0.3％、酵母エキストラクト0.2％およ
び消泡剤（大日本インキ製P−2000）0.05％を加えた培
地30Ｌを調整、滅菌し、先に培養したマイヤーフラスコ
の全培養液800mlを植菌して、通気量30ＮＬ／分、攪拌
数250回転／分で28℃、６日間培養を行った。EXAMPLES Example 1 3-hydroxy-3,9-dimethyl-9- (4-methyl-pent-3-enyl) -2,3,3a, 9,9a, 9b-hexahydro-1H-4,8 -Dioxa-cyclopenta [def] phenanthrene-5,6-dicarbaldehyde (Bisavosqual A) (1) Fermentation process Glucose 2.0%, malto extract 3.0% and yeast extract 0.5% in a 2 L capacity Mayer flask.
Sterilized after injection medium 800ml consisting Stachybotrys sp that slant culture in a test tube to (Stachybotrys s
p.) RF-7260 was inoculated. Then, the cells were cultured at 28 ° C. for 5 days on a rotary shaker at 180 rpm. Prepare and sterilize 30 L of culture medium containing glucose 2.0%, glycerin 2.0%, beef extract 0.3%, yeast extract 0.2%, and antifoaming agent (Dainippon Ink P-2000) 0.05% to 50 L jar famentor. Then, 800 ml of the whole culture solution of the previously cultivated Meyer flask was inoculated and cultured at 28 ° C. for 6 days at an aeration rate of 30 NL / min and a stirring rate of 250 rpm.

【００１６】（２）分離工程 発酵工程によって得られた培養液21Ｌに酢酸エチル20Ｌ
を加えて30分攪拌した後、遠心ろ過した。ろ液をpH４に
調整後、遠心分離機によって水層と酢酸エチル層に分離
した。得られた酢酸エチル層を水５Ｌで洗浄後、濃縮
し、油状の粗物質43.8gとした後、シリカゲル１Kg(Merc
k Kieselgel 60,70〜230mesh) を充填したカラムクロマ
トグラフィーに付し、ｎ−ヘキサン／酢酸エチルの７：
３の混合溶媒で不純物を溶出した後同じく６：４の混合
溶媒で溶出、分画した。活性区分（3.4Ｌ）を集め、濃
縮して得た粉末をｎ−ヘキサン―酢酸エチルから再結晶
することでビサボスクアールＡ（4.13g）の結晶が得ら
れた。(2) Separation process 20 L of ethyl acetate was added to 21 L of the culture solution obtained by the fermentation process.
Was added, the mixture was stirred for 30 minutes, and then centrifugally filtered. After the pH of the filtrate was adjusted to pH 4, it was separated into a water layer and an ethyl acetate layer by a centrifuge. The obtained ethyl acetate layer was washed with 5 L of water and then concentrated to obtain 43.8 g of an oily crude substance, and then 1 kg of silica gel (Merc
k Kieselgel 60, 70-230 mesh), and subjected to column chromatography to obtain 7: n-hexane / ethyl acetate:
The impurities were eluted with the mixed solvent of 3 and then eluted with the mixed solvent of 6: 4 and fractionated. The active fraction (3.4 L) was collected and concentrated, and the obtained powder was recrystallized from n-hexane-ethyl acetate to obtain crystals of bisavosqual A (4.13 g).

【００１７】物理化学的性状： 外観: 無色平板状結晶 溶解性: CHCl₃、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エ
チル、メタノールに可溶性；n−ヘキサンにわずかに可
溶性；水に不溶性。 M.p.: 108〜109℃ [α]_D ²²＝ ＋37.2±0.8°（c = 1.00, CHCl₃) 元素分析（C₂₃H₂₈O₅・1/3AcOEtとして） 計算値：C，70.62％； H，7.47％ 実測値：C，70.72％； H，7.40％ HR−LSIMS, m/z : C₂₃H₂₉O₅として 計算値：385.2005 実測値：385.2013 (MH)⁺ IRλ_max CHCl₃: 3597, 3022, 2970, 1692, 1673, 1619,
1452, 1380, 1291, 1278, 1134, 1097cm^-1 UV(MeCN),nm (ε): 225 (sh, 9,300), 254(26,540), 31
0(6,390), 340(6,000)¹ H−NMR (CDCl₃, 600MHz) δ: 1.31(3H, s), 1.55(1H,
br.s), 1.46(3H, s), 1.59(3H, br.s), 1.65(3H, br.
s), 3.66(1H, d,d, J=6.6, 8.8 Hz), 4.97（1H, d,J=8.
8 Hz), 5.03(1H, t−like), 6.93(1H, s), 10.36(1H,
s), 10.46(1H, s)¹³ C−NMR (CDCl₃, 150MHz) δ：16.33(t), 17.63(q), 2
2.11(q), 22.21(t), 25.57(q), 29.53(q), 33.27(d), 3
4.93(t), 35.94(d), 38.71(t), 69.14(s), 83.52(s), 9
2.77(d), 112.08(s), 113.67(d), 117.31(s), 123.08
(d), 132.47(s), 139.26(s), 155.71(s), 165.69(s), 1
88.27(d), 192.24(d) TLC Rf値(conc.H₂SO₄試薬を用いて検出): 0.56(CH₂Cl₂:
MeOH＝10:1) HPLC分析: 保持時間; 6.0分 カラム：YMC−Pack ODS−AM,AM−302, 4.6i.d. X 150mm
(株式会社ワイエムシイ) 移動相：CH₃CN: 0.1％ トリフルオロ酢酸−H₂O＝7:3 流速：1ml/min 検出：220 nm (uv) Physicochemical properties : Appearance: colorless tabular crystals Solubility: Soluble in CHCl ₃ , diethyl ether, acetone, ethyl acetate, methanol; slightly soluble in n-hexane; insoluble in water. Mp: 108-109 ° C [α] _D ²² = ＋ 37.2 ± 0.8 ° (c = 1.00, CHCl ₃ ) Elemental analysis (as C ₂₃ H ₂₈ O ₅ · 1 / 3AcOEt) Calculated value: C, 70.62%; H , 7.47% Found: C, 70.72%; H, 7.40% HR-LSIMS, m / z: Calculated as C ₂₃ H ₂₉ O ₅ : 385.2005 Found: 385.2013 (MH) ⁺ IRλ _max CHCl ₃ : 3597, 3022 , 2970, 1692, 1673, 1619,
1452, 1380, 1291, 1278, 1134, 1097cm ^-1 UV (MeCN), nm (ε): 225 (sh, 9,300), 254 (26,540), 31
0 (6,390), 340 (6,000) ¹ H-NMR (CDCl ₃ , 600MHz) δ: 1.31 (3H, s), 1.55 (1H,
br.s), 1.46 (3H, s), 1.59 (3H, br.s), 1.65 (3H, br.
s), 3.66 (1H, d, d, J = 6.6, 8.8 Hz), 4.97 (1H, d, J = 8.
8 Hz), 5.03 (1H, t−like), 6.93 (1H, s), 10.36 (1H,
s), 10.46 (1H, s) ¹³ C-NMR (CDCl ₃ , 150MHz) δ: 16.33 (t), 17.63 (q), 2
2.11 (q), 22.21 (t), 25.57 (q), 29.53 (q), 33.27 (d), 3
4.93 (t), 35.94 (d), 38.71 (t), 69.14 (s), 83.52 (s), 9
2.77 (d), 112.08 (s), 113.67 (d), 117.31 (s), 123.08
(d), 132.47 (s), 139.26 (s), 155.71 (s), 165.69 (s), 1
88.27 (d), 192.24 (d) TLC Rf value (detected using conc.H ₂ SO ₄ reagent): 0.56 (CH ₂ Cl ₂ :
MeOH = 10: 1) HPLC analysis: retention time; 6.0 minutes Column: YMC-Pack ODS-AM, AM-302, 4.6id X 150mm
(YMC Inc.) Mobile phase: CH ₃ CN: 0.1% Trifluoroacetic acid-H ₂ O = 7: 3 Flow rate: 1 ml / min Detection: 220 nm (uv)

【００１８】実施例２ 3−ヒドロキシ−6−ヒドロキシ
メチル−3,9−ジメチル−9−(4−メチル−ペンタ−3−
エニル)−2,3,3a,9,9a,9b−ヘキサヒドロ−1H−4,8−ジ
オキサ−シクロペンタ[def]フェナンスレン−5−カルボ
アルデヒド(ビサボスクアールＢ) （１）発酵工程 ポリペプトン1.0％、グルコース2.0％、ビーフエキスト
ラクト0.3％、酵母エキストラクト0.2％、 塩化ナトリ
ウム0.1％および水道水からなる培地100ml(pH7.0、滅菌
前)を含む500ml容マイヤーフラスコに、試験管に斜面培
養したスタキボトリス・ルーウェンゾリエンシス（Stac
hybotrys ruwenzoriensis）RF−6853を植菌し、180回転
／分の回転振盪機上、25℃で５日間培養を行う。この培
養液４mlずつをグリセリン2.0％、グルコース2.0％、ビ
ーフエキストラクト0.3％、酵母エキストラクト0.2％よ
りなる発酵培地100ml(pH7.0、滅菌前)を含む500ml容マ
イヤーフラスコ30本に植菌し、180回転／分の回転振盪
機上、23℃で10日間培養を行う。 Example 2 3-Hydroxy-6-hydroxymethyl-3,9-dimethyl-9- (4-methyl-pent-3-
(Enyl) -2,3,3a, 9,9a, 9b-hexahydro-1H-4,8-dioxa-cyclopenta [def] phenanthrene-5-carbaldehyde (bisabosquel B) (1) Fermentation process Polypeptone 1.0%, glucose 2.0 %, Beef extract 0.3%, yeast extract 0.2%, sodium chloride 0.1%, and tap water in a 500 ml Meyer flask containing 100 ml of a medium (pH 7.0, before sterilization) consisting of Stachybotrys lewenzoli. Ensis ( Stac
hybotrys ruwenzoriensis ) RF-6853 is inoculated and cultivated on a rotary shaker at 180 rpm for 5 days at 25 ° C. 4 ml each of this culture was inoculated into 30 500 ml Mayer flasks containing 100 ml of fermentation medium (pH 7.0, before sterilization) consisting of 2.0% glycerin, 2.0% glucose, 0.3% beef extract and 0.2% yeast extract, Incubate at 23 ° C for 10 days on a rotary shaker at 180 rpm.

【００１９】（２）分離工程 発酵工程によって得られた培養液３Ｌを濃塩酸を加えて
pH２に調整し、吸引濾過して瀘液と菌体に分離する。菌
体部は70％アセトン−水(２Ｌ)で抽出、減圧濾過後、瀘
液を減圧下濃縮した後、酢酸エチルで抽出、減圧下溶媒
留去した残渣にn−ヘキサンを加え、不溶部として活性
分画2.53gを得た。この一部300mgをシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー(Pre−packed column size B (310−2
5), LiChroprep Si 60（40〜63μm), E.Merck)に付し、
酢酸エチル／塩化メチレン（１:３）の混合溶媒で溶
出、分画した。活性区分（240ml）を集め、濃縮後、生
じた沈殿を瀘取し無色粉末としてビサボスクアールＢ
（146mg）を得た。(2) Separation step 3 L of the culture broth obtained in the fermentation step was added with concentrated hydrochloric acid.
The pH is adjusted to 2 and suction filtration is performed to separate the filtrate and cells. The cell portion was extracted with 70% acetone-water (2 L), filtered under reduced pressure, the filtrate was concentrated under reduced pressure, extracted with ethyl acetate, and n-hexane was added to the residue obtained by distilling off the solvent under reduced pressure to obtain an insoluble portion. 2.53 g of active fraction was obtained. Pre-packed column size B (310-2
5), LiChroprep Si 60 (40 ~ 63 μm), E. Merck),
The mixture was eluted and fractionated with a mixed solvent of ethyl acetate / methylene chloride (1: 3). The active fraction (240 ml) was collected, concentrated, and the resulting precipitate was filtered to give Bisavosqual B as colorless powder.
(146 mg) was obtained.

【００２０】物理化学的性状： 外観: 無色無晶形粉末 溶解性：CHCl₃、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エ
チル、メタノールに可溶性；n−ヘキサンにわずかに可
溶性；水に不溶性。 [α]_D ²²＝ ＋25.6±1.2°(c ＝ 0.55, ジオキサン) HR−LSIMS, m/z: C₂₃H₃₁O₅として 計算値：387.2169 実測値：387.2169 (MH)⁺ IRλ_max KBr: 3436, 2967, 1651, 1618, 1449, 1430, 1
383, 1346, 1297, 1262,1186, 1165, 1137, 1059 cm^-1 UV(MeCN), nm(ε): 237(24,410), 285(16,760)¹ H−NMR (CDCl₃, 300MHz) δ: 1.31(3H, s), 1.43(3H,
s), 1.59(3H, s), 1.65(3H, s), 3.62(1H, t−like),
4.32(1H, d,d, J=6.9, 8.7 Hz), 4.53(1H, d,d, J=8.1,
12.9 Hz), 4.72(1H, d,d, J=6.9, 12.9 Hz), 4.91(1H,
d, J=8.7 Hz), 5.02(1H, t−like), 6.35(1H, s), 10.
21(1H, s)¹³ C−NMR (CDCl₃, 50.3MHz) δ: 16.2(t), 17.6(q), 2
2.1(q), 22.2(t), 25.6(t), 29.6(q), 32.9(d), 34.9
(t), 36.1(d), 38.6(t), 69.8(t), 69.1(s), 83.3(s),
92.8(d), 110.5(d), 110.6(s), 111.4(s), 123.2(d), 1
32.3(s), 144.7(s),157.2(s), 168.7(s), 187.8(d) TLC Rf値(conc.H₂SO₄試薬を用いて検出): 0.46(CH₂Cl₂:
MeOH＝10:1) HPLC分析：保持時間; 3.92分 カラム; YMC−Pack ODS−AM,AM−302, 4.6i.d. X 150mm
(株式会社ワイエムシイ) 移動相; CH₃CN: 0.1％ トリフルオロ酢酸−H₂O＝7:3 流速; 1ml/min 検出; 220nm (uv) Physicochemical properties : Appearance: colorless amorphous powder Solubility: soluble in CHCl ₃ , diethyl ether, acetone, ethyl acetate, methanol; slightly soluble in n-hexane; insoluble in water. [α] _D ²² = +25.6 ± 1.2 ° (c = 0.55, dioxane) HR-LSIMS, m / z: Calculated as C ₂₃ H ₃₁ O ₅ : 387.2169 Actual value: 387.2169 (MH) ⁺ IRλ _max KBr: 3436, 2967, 1651, 1618, 1449, 1430, 1
383, 1346, 1297, 1262, 1186, 1165, 1137, 1059 cm ^-1 UV (MeCN), nm (ε): 237 (24,410), 285 (16,760) ¹ H-NMR (CDCl ₃ , 300MHz) δ: 1.31 (3H, s), 1.43 (3H,
s), 1.59 (3H, s), 1.65 (3H, s), 3.62 (1H, t−like),
4.32 (1H, d, d, J = 6.9, 8.7 Hz), 4.53 (1H, d, d, J = 8.1,
12.9 Hz), 4.72 (1H, d, d, J = 6.9, 12.9 Hz), 4.91 (1H,
d, J = 8.7 Hz), 5.02 (1H, t−like), 6.35 (1H, s), 10.
21 (1H, s) ¹³ C-NMR (CDCl ₃ , 50.3MHz) δ: 16.2 (t), 17.6 (q), 2
2.1 (q), 22.2 (t), 25.6 (t), 29.6 (q), 32.9 (d), 34.9
(t), 36.1 (d), 38.6 (t), 69.8 (t), 69.1 (s), 83.3 (s),
92.8 (d), 110.5 (d), 110.6 (s), 111.4 (s), 123.2 (d), 1
32.3 (s), 144.7 (s ), 157.2 (s), 168.7 (s), ( detected using conc.H ₂ SO ₄ reagent) 187.8 (d) TLC Rf value: 0.46 (CH ₂ Cl _2:
MeOH = 10: 1) HPLC analysis: retention time; 3.92 min column; YMC-Pack ODS-AM, AM-302, 4.6id X 150mm
(LTD Waiemushii) mobile phase; CH ₃ CN: 0.1% trifluoroacetic acid -H ₂ O = 7: 3 flow rate; 1 ml / min Detection; 220 nm (uv)

【００２１】実施例３ 3,9b−ジヒドロキシ−3,9−ジメ
チル−9−(4−メチル−ペンタ−3−エニル)−2,3,3a,9,
9a,9b−ヘキサヒドロ−1H−4,8−ジオキサ−シクロペン
タ[def]フェナンスレン−5,6−ジカルボアルデヒド（ビ
サボスクアールＣ）および3−ヒドロキシ−3,9−ジメチ
ル−9−(3,4−ジヒドロキシ−4−メチル−ペンチル)−
2,3,3a,9,9a,9b−ヘキサヒドロ−1H−4,8−ジオキサ−
シクロペンタ[def]フェナンスレン−5,6−ジカルボアル
デヒド（ビサボスクアールＤ） （１）発酵工程 グリセリン2.0％、シュークロース2.0％、ビーフエキス
トラクト0.3％及び酵母エキストラクト0.2％よりなる培
地10ml(ｐＨ7.0、滅菌前)を含む50ml容大型試験管50本
に寒天平板上にはやしたスタキボトリス・ルーウェンゾ
リエンシス(Stachybotrys ruwenzoriensis)RF−6853を
コルクポーラーで打ち抜き、試験管１本当りその断片２
個を接種し、300回転／分の回転振盪機上、28℃で10日
間培養を行う。 Example 3 3,9b-Dihydroxy-3,9-dimethyl-9- (4-methyl-pent-3-enyl) -2,3,3a, 9,
9a, 9b-Hexahydro-1H-4,8-dioxa-cyclopenta [def] phenanthrene-5,6-dicarbaldehyde (Bisavosqual C) and 3-hydroxy-3,9-dimethyl-9- (3,4-dihydroxy -4-methyl-pentyl)-
2,3,3a, 9,9a, 9b-hexahydro-1H-4,8-dioxa-
Cyclopenta [def] phenanthrene-5,6-dicarbaldehyde (Bisavosqual D) (1) Fermentation process Glycerin 2.0%, sucrose 2.0%, beef extract 0.3% and yeast extract 0.2% 10 ml medium (pH 7.0, Stachybotrys ruwenzoriensis RF-6853 sown on agar plate in 50 large test tubes containing 50 ml containing (before sterilization) was punched out with a cork polar, and fragments 2 per 1 test tube
The seeds are inoculated and cultured at 28 ° C. for 10 days on a rotary shaker at 300 rpm.

【００２２】（２）分離工程 発酵工程によって得られた培養液500mlを吸引濾過し、
瀘液部と菌体部に分離する。菌体部からはアセトン／水
(７：３，１Ｌ)を加えて抽出後、減圧下、溶媒を留去
し、残渣の水層を酢酸エチルで抽出し、(粗分画−１）
5.97gを得た。この一部 430mgをシリカゲルカラムクロ
マトグラフィー(Pre−packed column size B(310−25),
LiChroprep Si 60(40〜63μm), E.Merck)に付し、酢酸
エチル／塩化メチレン＝１:３の混合溶媒で溶出、分画
した。活性区分（96ml）を集め、濃縮し、生じた沈殿を
瀘取し、無色粉末としてビサボスクアールＣ（67mg）を
得た。一方、濾液部は酢酸エチルで抽出し、減圧下、溶
媒を留去した後、（粗分画−２）（2.0g）を得た。この
一部400mgをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Pre
−packed column size B (310−25), LiChroprep Si 60
(40〜63μm) E.Merck)に付し、酢酸エチル／塩化メチレ
ン＝１:１の混合溶媒で溶出、分画した。活性区分（80m
l）を集め、濃縮し、生じた沈殿を瀘取し、無色粉末と
してビサボスクアールＤ（91mg）を得た。(2) Separation step 500 ml of the culture solution obtained by the fermentation step is suction filtered,
Separate into the filtrate and fungus body parts. Acetone / water from the bacterial body
(7: 3, 1 L) was added and extracted, the solvent was evaporated under reduced pressure, the residual aqueous layer was extracted with ethyl acetate, (crude fraction-1).
Obtained 5.97 g. 430 mg of this portion was subjected to silica gel column chromatography (Pre-packed column size B (310-25),
LiChroprep Si 60 (40-63 μm, E. Merck) was applied, and the mixture was eluted and fractionated with a mixed solvent of ethyl acetate / methylene chloride = 1: 3. The active fraction (96 ml) was collected, concentrated, and the resulting precipitate was filtered to obtain bisavosqual C (67 mg) as a colorless powder. On the other hand, the filtrate part was extracted with ethyl acetate, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain (crude fraction-2) (2.0 g). A 400 mg portion of this was applied to silica gel column chromatography (Pre
−packed column size B (310−25), LiChroprep Si 60
(40-63 μm) E. Merck), and eluted and fractionated with a mixed solvent of ethyl acetate / methylene chloride = 1: 1. Active category (80m
l) was collected and concentrated, and the resulting precipitate was filtered to obtain Bisavosqual D (91 mg) as a colorless powder.

【００２３】物理化学的性状：（ビサボスクアールＣ） 外観: 無色無晶形粉末 溶解性: CHCl₃、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エ
チルおよびメタノールに可溶性；n−ヘキサンにわすか
に可溶性；水に不溶性。 [α]_D ²³＝−49.7±0.9°( c＝1.00, ジオキサン) HR−LSIMS, m/z: C₂₃H₂₉O₆として 計算値； ４０１．１９６２ 実測値；４０１．１９５９ （ＭＨ）^＋ ＩＲλ_max KBr: 3433, 2966, 1681, 1606, 1451, 1433,
1382, 1340, 1278, 1229,1166, 1132, 1060 cm^-1 UV(MeCN),nm(ε)：215(11,570), 244(18,490), 295(5,4
00), 343(5,400)¹ H−NMR (CDCl₃, 300MHz)δ：1.36(3H, s), 1.48(3H,
s), 1.60(3H, s), 1.65(3H, s),2.54(1H, s), 4.77(1H,
s), 5.06(1H, t−like), 6.91(1H, s), 10.36(1H, s),
10.39(1H, s)¹³ C−NMR (CDCl₃, 50.3MHz)δ: 17.7(q), 18.0(t), 23.
7(q), 23.8(t), 25.6(q), 29.3(q), 34.1(t), 40.5(t),
41.1(t), 70.1(s), 70.9(s), 85.4(s), 101.6(d), 11
2.4(s), 113.4(d), 118.0(s), 123.5(d), 132.0(s), 14
1.2(s), 156.7(s),166.1(s), 187.9(d), 192.3(d) TLC Rf値(conc.H₂SO₄試薬で検出): 0.41(CH₂Cl₂: MeOH
＝10:1) HPLC分析:保持時間; 3.38分 カラム; YMC−Pack ODS−AM,AM−302,4.6i.d. X 150mm
(株式会社ワイエムシイ) 移動相; CH₃CN: 0.1％ トリフルオロ酢酸−H₂O＝7:3 流速; 1ml/min 検出; 220nm(uv) Physicochemical properties : (Bisavosquer C) Appearance: colorless amorphous powder Solubility: soluble in CHCl ₃ , diethyl ether, acetone, ethyl acetate and methanol; slightly soluble in n-hexane; insoluble in water. [α] _D ²³ = −49.7 ± 0.9 ° (c = 1.00, dioxane) HR-LSIMS, m / z: calculated as C ₂₃ H ₂₉ O ₆ ; 401.1962 measured value; 401.1959 (MH) ⁺ IRλ _max KBr: 3433, 2966, 1681, 1606, 1451, 1433,
1382, 1340, 1278, 1229, 1166, 1132, 1060 cm ^-1 UV (MeCN), nm (ε): 215 (11,570), 244 (18,490), 295 (5,4
00), 343 (5,400) ¹ H-NMR (CDCl ₃ , 300MHz) δ: 1.36 (3H, s), 1.48 (3H,
s), 1.60 (3H, s), 1.65 (3H, s), 2.54 (1H, s), 4.77 (1H,
s), 5.06 (1H, t−like), 6.91 (1H, s), 10.36 (1H, s),
10.39 (1H, s) ¹³ C-NMR (CDCl ₃ , 50.3MHz) δ: 17.7 (q), 18.0 (t), 23.
7 (q), 23.8 (t), 25.6 (q), 29.3 (q), 34.1 (t), 40.5 (t),
41.1 (t), 70.1 (s), 70.9 (s), 85.4 (s), 101.6 (d), 11
2.4 (s), 113.4 (d), 118.0 (s), 123.5 (d), 132.0 (s), 14
1.2 (s), 156.7 (s), 166.1 (s), 187.9 (d), 192.3 (d) TLC Rf value (detected with conc.H ₂ SO ₄ reagent): 0.41 (CH ₂ Cl ₂ : MeOH
= 10: 1) HPLC analysis: retention time; 3.38 minutes Column; YMC-Pack ODS-AM, AM-302,4.6id X 150mm
(LTD Waiemushii) mobile phase; CH ₃ CN: 0.1% trifluoroacetic acid -H ₂ O = 7: 3 flow rate; 1 ml / min Detection; 220 nm (uv)

【００２４】物理化学的性状（ビサボスクアールＤ）： 外観 : 無色無晶形粉末 溶解性 : CHCl₃、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エ
チルおよびメタノールに可溶性；n−ヘキサンにわすか
に可溶性；水に不溶性。 [α]_D ²³＝＋20.7±0.6°( c＝1.00, ジオキサン) HR−LSIMS, m/z: C₂₃H₃₁O₇として 計算値：419.2068 実測値：419.2072 (MH)⁺ IRλ_maxKBr: 3434, 2966, 1684, 1618, 1453, 1430, 13
87, 1340, 1277, 1227,1181, 1127, 1099, 1040 cm^-1 UV (MeCN), nm(ε): 254(23,200), 309(5,690), 340(5,
340)¹ H−NMR (CDCl₃,300 MHz)δ: 1.18(3H, s), 1.22(3H,
s), 1.32(3H, s), 1.44(3H, s), 3.26(1H, d, J=7.8 H
z), 3.71(1H, t−like), 4.98(1H, d, J=8.7 Hz),6.93
(1H, s), 10.37(1H, s), 10.46(1H, s)¹³ C−NMR(CDCl₃, 50.3MHz)δ: 16.3, 22.1, 23.4, 25.
4, 26.7, 29.5, 33.1, 34.9, 35.9, 36.0, 69.1, 73.1,
78.4, 83.7, 92.8, 112.2, 113.7, 117.5, 139.1, 15
5.6, 165.8, 188.4, 192.3 TLC Rf値 (conc.H₂SO₄試薬を用いて検出): 0.34 (CH₂Cl
₂:MeOH＝10:1) HPLC分析: 保持時間; 2.15 min カラム;YMC−Pack ODS−AM,AM−302,4.6 i.d. X 150mm
(株式会社ワイエムシイ) 移動相; CH₃CN : 0.1％トリフルオロ酢酸−H₂O＝7:3 流速; 1ml/min 検出; 220nm (uv) Physicochemical properties (Bisavosqual D): Appearance: colorless amorphous powder Solubility: soluble in CHCl ₃ , diethyl ether, acetone, ethyl acetate and methanol; slightly soluble in n-hexane; insoluble in water. [α] _D ²³ = + 20.7 ± 0.6 ° (c = 1.00, dioxane) HR-LSIMS, m / z: Calculated as C ₂₃ H ₃₁ O ₇ : 419.2068 Actual value: 419.2072 (MH) ⁺ IRλ _max KBr: 3434, 2966, 1684, 1618, 1453, 1430, 13
87, 1340, 1277, 1227, 1181, 1127, 1099, 1040 cm ^-1 UV (MeCN), nm (ε): 254 (23,200), 309 (5,690), 340 (5,
340) ¹ H-NMR (CDCl ₃ , 300 MHz) δ: 1.18 (3H, s), 1.22 (3H,
s), 1.32 (3H, s), 1.44 (3H, s), 3.26 (1H, d, J = 7.8 H
z), 3.71 (1H, t−like), 4.98 (1H, d, J = 8.7 Hz), 6.93
(1H, s), 10.37 (1H, s), 10.46 (1H, s) ¹³ C-NMR (CDCl ₃ , 50.3MHz) δ: 16.3, 22.1, 23.4, 25.
4, 26.7, 29.5, 33.1, 34.9, 35.9, 36.0, 69.1, 73.1,
78.4, 83.7, 92.8, 112.2, 113.7, 117.5, 139.1, 15
5.6, 165.8, 188.4, 192.3 TLC Rf value (detected using conc.H ₂ SO ₄ reagent): 0.34 (CH ₂ Cl
₂ : MeOH = 10: 1) HPLC analysis: retention time; 2.15 min column; YMC-Pack ODS-AM, AM-302,4.6 id X 150mm
(LTD Waiemushii) mobile phase; CH ₃ CN: 0.1% trifluoroacetic acid -H ₂ O = 7: 3 flow rate; 1 ml / min Detection; 220 nm (uv)

【００２５】実施例４ ビサボスクアールＡからＢへの
変換 ビサボスクアールＡを以下の方法で還元し、ビサボスク
アールＢを得た。ビサボスクアールＡ（41mg）をメタノ
ール（0.5ml)に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム(2mg,2
当量)を加え、氷冷下、1時間撹拌した。反応液を氷水中
にあけ、酢酸エチルで抽出、水洗後、溶媒を減圧留去
し、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマト
グラフィー［Pre-packed column size A (240-10), LiC
hroprep Si 60 (40〜60μｍ)，E. Merck］に付し、塩化
メチレン／酢酸エチル(4:1）の混合溶媒で分離精製し、
ビサボスクアールＢ（10mg）を得た。 Example 4 Conversion of bisavosqual A to B bisavosqual A was reduced by the following method to obtain bisavosqual B. Bisavosqual A (41mg) was dissolved in methanol (0.5ml) and sodium borohydride (2mg, 2mg) was added.
Equivalent amount) was added, and the mixture was stirred under ice cooling for 1 hour. The reaction solution was poured into ice water, extracted with ethyl acetate, washed with water, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product. Silica gel column chromatography [Pre-packed column size A (240-10), LiC
hroprep Si 60 (40-60 μm), E. Merck], separated and purified with a mixed solvent of methylene chloride / ethyl acetate (4: 1),
Bisabosquer B (10 mg) was obtained.

【００２６】実施例５ ビサボスクアールＢからＡへの
変換 ビサボスクアールＢを以下の方法で酸化し、ビサボスク
アールＡを得た。−78℃に冷却したジクロロメタン(1m
l)にオキザリルクロリド（22μｌ)、次いでジメチルス
ルホキシド(22μｌ)を加え、30分間撹拌した。この溶液
にビサボスクアールＢ（40mg）のジクロロメタン(1ml)
溶液を加え、2時間撹拌した。さらにトリエチルアミン
(43μl)を加え、−30℃で1時間撹拌後、反応液を氷水中
に空け、ジクロロメタンで抽出、水洗後、溶媒を減圧留
去し、粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー［Pre-packed column size A (240-10), L
iChroprep Si 60 (40〜60μｍ)，E. Merck］に付し、塩
化メチレン／酢酸エチル(9:1)の混合溶媒で分離精製
し、ビサボスクアールＡ（5mg）を得た。 Example 5 Conversion of bisavosqual B to A bisavosqual B was oxidized by the following method to obtain bisavosqual A. Dichloromethane (1m
Oxalyl chloride (22 μl) and then dimethyl sulfoxide (22 μl) were added to (l), and the mixture was stirred for 30 minutes. To this solution was added Bisavosqual B (40 mg) in dichloromethane (1 ml).
The solution was added and stirred for 2 hours. Further triethylamine
(43 μl) was added, and the mixture was stirred at −30 ° C. for 1 hr, the reaction mixture was poured into ice water, extracted with dichloromethane, washed with water, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give a crude product. Silica gel column chromatography [Pre-packed column size A (240-10), L
iChroprep Si 60 (40-60 μm), E. Merck] and separated and purified with a mixed solvent of methylene chloride / ethyl acetate (9: 1) to obtain bisavosqual A (5 mg).

【００２７】実施例６ ビサボスクアールＡからＤへの
変換 ビサボスクアールＡを以下の方法で酸化し、ビサボスク
アールＤを得た。ビサボスクアールＡ（20mg)をピリジ
ン（0.5ml)に溶解し、四酸化オスミウム(20mg, 1.5当
量)を加え、室温で18時間撹拌した。反応液に硫化水素
を通し、セライト瀘過後、瀘液を減圧下濃縮し、粗生成
物を得た。これを薄層クロマトグラフィー(Pre-Coated
TLC Plates, SILICA GEL F-254, E. Merck)に付し、塩
化メチレン／メタノール(10:1)の混合溶媒で分離精製
し、ビサボスクアールＤ（5mg）を得た。 Example 6 Conversion of bisavosqual A to D bisavosqual A was oxidized by the following method to obtain bisavosqual D. Bisavosqual A (20 mg) was dissolved in pyridine (0.5 ml), osmium tetroxide (20 mg, 1.5 equivalents) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Hydrogen sulfide was passed through the reaction solution, and after filtering through Celite, the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a crude product. Pre-Coated
TLC Plates, SILICA GEL F-254, E. Merck), and separated and purified with a mixed solvent of methylene chloride / methanol (10: 1) to obtain bisavosqual D (5 mg).

【００２８】実施例７ ビサボスクアールＡからエポキ
シ体への変換 ビサボスクアールＡを以下の方法でエポキシ化した。ビ
サボスクアールＡ（20mg)を塩化メチレン（１ml)に溶解
し、メタクロロ過安息香酸(12mg, 1.1当量)と炭酸水素
ナトリウム(ＮaＨＣＯ₃,12mg)を加え、氷冷下で10分間
撹拌した。反応液を氷水中に空け、塩化メチレンで抽出
後、塩化メチレン層を水洗し、減圧下濃縮し、粗生成物
を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー
［Pre-packed column size A (240-10), LiChroprep Si
60 (40〜60μｍ)，E. Merck］に付し、塩化メチレン／
酢酸エチル(4:1)の混合溶媒で分離精製し、エポキシ体
(15mg）を得た。エポキシの配位は約1:1の混合物と推定
される。エポキシ体の構造は、L-SIMSよりm/z 401 (MH)
⁺にイオンピークが観測され、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃,
δ)において、5.03(1H, t-like)のシグナルが消失し、
新たに2.61〜2.70(1H, m)のシグナルが観測されたこと
から決定した。 Example 7 Conversion of Bisavosqual A to Epoxy Form Bisavosqual A was epoxidized by the following method. Bisavosqual A (20 mg) was dissolved in methylene chloride (1 ml), metachloroperbenzoic acid (12 mg, 1.1 eq) and sodium hydrogencarbonate (NaHCO ₃ , 12 mg) were added, and the mixture was stirred under ice cooling for 10 minutes. The reaction solution was poured into ice water, extracted with methylene chloride, the methylene chloride layer was washed with water, and concentrated under reduced pressure to obtain a crude product. Silica gel column chromatography [Pre-packed column size A (240-10), LiChroprep Si
60 (40-60 μm), E. Merck] and methylene chloride /
Separated and purified with a mixed solvent of ethyl acetate (4: 1) to obtain epoxy
(15 mg) was obtained. The coordination of the epoxy is estimated to be about a 1: 1 mixture. The structure of the epoxy body is m / z 401 (MH) from L-SIMS.
^An ion peak was observed at ⁺ , and ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ ,
At δ), the 5.03 (1H, t-like) signal disappeared,
It was determined from the new signals of 2.61 to 2.70 (1H, m) observed.

【００２９】実験例１ ビサボスクアールの生物学的活
性 実施例で製造した４種のビサボスクアール化合物につい
て、そのスクアレン合成酵素阻害活性及び抗菌、抗真菌
活性を調べた。 Ｉ．検体の調製方法 検体は、すべてジメチルスルホキシド(DMSO)を用い、10
mg/mlとなるように溶解した。 ＩＩ．抗菌・抗真菌活性 真菌類 カンジダ属（Candida)：Ｃ．アルビカンス（C．albican
s)、Ｃ．クルセイ（C．krusei)、Ｃ．パラクルセイ（C.
parakrusei)、Ｃ．シュードトロピカリス(C.pseudotrop
icalis)、Ｃ．グラブラタ(C．glabrata) サッカロミセス属(Saccharomyces): Ｓ．セレビシエ
（S.cerevisiae）； クリプトコッカス属（Cryptococcus)：Ｃ．ネオフォル
マンス（C.neoformans) アスペルギルス属(Aspergillus）：Ａ．フミガタス（A.
fumigatus) トリコフィトン属(Trichophyton)：Ｔ．アステロイデス
（T.asteroides)細菌類 スタフィロコカッカス属(Staphylococcus):Ｓ．アウレ
ウス（S.aureus)、Ｓ．ピオゲネス（S.pyogenes) Experimental Example 1 Biological activity of bisavosqual The four bisavosqual compounds prepared in the examples were examined for their squalene synthase inhibitory activity, antibacterial activity and antifungal activity. I. Sample preparation method All samples used dimethyl sulfoxide (DMSO).
It dissolved so that it might become mg / ml. II. Antibacterial antifungal activity fungi Candida (Candida): C. Albicans ( C. albican
s ), C.I. C. krusei , C. Paracleuse ( C.
parakrusei ), C.I. Pseudotropicalis ( C. pseudotrop
icalis ), C.I. C. glabrata Saccharomyces : S. S. cerevisiae ; Cryptococcus: C. C. neoformans Aspergillus : A. Fumigatus ( A.
fumigatus ) Trichophyton : T. T. asteroides Bacterium Staphylococcus : S. S. aureus , S. aureus Pyogenes ( S. pyogenes ).

【００３０】各種真菌の凍結保存菌液[10％ ウシ胎児血
清を添加したサブローデキストロースブロス(Sabouraud
dextrose broth)に約２x10⁸cfu/mlになるように懸濁
し、−80℃に保存したもの]をYeast Nitrogen Base(YN
B, Difco)培地で１x10⁵cfu/mlに希釈し、96穴マイクロ
プレートの各ウェルに100μlづつ分注した。検体をこの
菌液で希釈して2倍希釈系列を作製し、真菌の増殖抑制
を調べた。抗細菌活性の測定も上述の真菌の場合と同様
に微量液体希釈法で行った。培地にはトリプチックソイ
ブロス(Tryptic soy broth，Difco)またはミューラーヒ
ントンブロス（Mueller Hinton broth，Difco)を用い
た。接種菌量は約１x10⁵cfu/mlで行った。培地に添加さ
れるDMSOの濃度は１％以下になるようにした。Cryopreserved bacterial solution of various fungi [Sabouraud dextrose broth supplemented with 10% fetal bovine serum (Sabouraud
Suspended in dextrose broth) to about 2x10 ⁸ cfu / ml and stored at -80 ° C] Yeast Nitrogen Base (YN
B, Difco) medium was diluted to 1 × 10 ⁵ cfu / ml, and 100 μl was dispensed to each well of a 96-well microplate. A sample was diluted with this bacterial solution to prepare a 2-fold dilution series, and the growth inhibition of fungi was examined. The antibacterial activity was also measured by the micro liquid dilution method as in the case of the above-mentioned fungus. Tryptic soy broth (Difco) or Mueller Hinton broth (Difco) was used as the medium. The inoculum was about 1 × 10 ⁵ cfu / ml. The concentration of DMSO added to the medium was adjusted to 1% or less.

【００３１】ＩＩＩ．培養条件と結果の判定 真菌の培養は、30℃で行った。増殖抑制の判定は、クリ
プトコッカス（Cryptococcus）、アスペルギルス（Aspe
rgillus）およびトリコフィトン（Trichophyton）属
は、48時間後に、それ以外の酵母は24時間後に行った。
すなわち、オートリーダー(BIO−RAD)を使用して595nm
の吸光度を測定し、検体非添加時の吸光度の50％ 以下
に菌の増殖を抑制している濃度を最小有効濃度（MI
C₅₀）として表した。細菌は、30℃で24時間培養後、菌
の生育が全く認められない最小濃度を求め、ＭＩＣとし
た。III. Cultivation conditions and determination of results Cultivation of fungi was performed at 30 ° C. Cryptococcus , Aspergillus ( Aspegillus )
rgillus ) and Trichophyton (genus Trichophyton ) after 48 hours and the other yeasts after 24 hours.
That is, 595 nm using an auto reader (BIO-RAD)
Absorbance is measured, and the concentration that suppresses the growth of bacteria is 50% or less of the absorbance when the sample is not added.
_C50 ). After culturing the bacteria at 30 ° C. for 24 hours, the minimum concentration at which no growth of the bacteria was observed was determined and the MIC was determined.

【００３２】ＩＶ．スクアレン合成酵素の調製法 真菌はYPD［１％バクトイーストエキストラクト（Bacto
yeast extract，Difco)、２％バクトペプトン（Bacto
peptone，Difco)および２％グルコース］培地で定常期
初期まで培養後、菌体を低速遠心(500 xg, 10分)により
集め蒸留水で洗った。 菌体を細胞破砕用バッファー
［200mM HEPES(pH7.4), ４mM MgCl₂, 10mM２−メルカプ
トエタノール, １mM EDTA, 0.1mM EGTA］に均一に懸濁
し、菌体と同量のガラスビーズ（0.45−0.50mm, Braun
社製）を加えてボルテックスミキサーで氷温下、10分
間、激しく撹拌することによって細胞を破砕した。これ
を低速遠心にかけて未破砕の菌体を取り除いた後、更に
10,000 xgの遠心にかけてその上清を分離した。これを1
00,000 xgで60分間の超遠心にかけてミクロソーム画分
を得た。IV. Preparation of squalene synthase The fungus is YPD [1% Bacto yeast extract (Bacto
yeast extract, Difco), 2% Bacto peptone (Bacto
Peptone, Difco) and 2% glucose] medium until after the stationary phase, the cells were collected by low speed centrifugation (500 xg, 10 minutes) and washed with distilled water. The cells were uniformly suspended in a cell disruption buffer [200 mM HEPES (pH7.4), 4 mM MgCl ₂ , 10 mM _2- mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA], and the same amount of glass beads (0.45-0.50) as the cells was suspended. mm, Braun
(Manufactured by Kuraray Co., Ltd.) was added and the cells were disrupted by vigorously stirring for 10 minutes under ice temperature with a vortex mixer. After centrifuging this to remove unbroken cells, further
The supernatant was separated by centrifugation at 10,000 xg. This one
The microsome fraction was obtained by ultracentrifugation at 00,000 xg for 60 minutes.

【００３３】動物の肝臓のミクロソーム画分は以下のよ
うに調製した。肝臓を摘出後、氷冷した 生理食塩水中
ではさみを用いて細かく切り刻んだ。これをルースフィ
ッティング（loose−fitting）のテフロンホモジェナイ
ザーで５往復、更にタイトフィッティング（tight−fit
ting）のテフロンホモジェナイザーで10往復することに
よりホモジェナイズした。低速遠心(350 xg, ５分)して
得られた上清を更に遠心(10,000 xg, 15分)し、その上
清を100,000 xg, 60分間の超遠心を行ってミクロソーム
画分を得た。上述のようにして得られたミクロソーム画
分は細胞破砕用バッファーで２回洗浄後、同緩衝液に均
一に懸濁した。Lowry法によってタンパク質濃度を決定
し15mg/ml 以上の濃度に調製後、−80℃に保存した。He
pG２細胞のミクロソーム画分は、細胞培養用フラスコに
confluentになるまで増殖したものを、常法に従ってト
リプシン処理により細胞を集め、その後は上述の肝臓の
ミクロソーム画分の場合と同様の方法で調製した。The microsomal fraction of animal liver was prepared as follows. After removing the liver, it was finely chopped with scissors in ice-cooled saline. 5 round trips with a loose-fitting Teflon homogenizer, followed by tight-fitting.
homogenization was repeated 10 times with a Teflon homogenizer. The supernatant obtained by low-speed centrifugation (350 xg, 5 minutes) was further centrifuged (10,000 xg, 15 minutes), and the supernatant was subjected to ultracentrifugation at 100,000 xg for 60 minutes to obtain a microsome fraction. The microsome fraction obtained as described above was washed twice with a cell disruption buffer and then uniformly suspended in the same buffer. The protein concentration was determined by the Lowry method, adjusted to a concentration of 15 mg / ml or more, and then stored at -80 ° C. He
The microsome fraction of pG2 cells was added to the cell culture flask.
The cells grown to be confluent were collected by trypsin treatment according to a conventional method, and thereafter, the cells were prepared by the same method as in the case of the above-mentioned liver microsome fraction.

【００３４】Ｖ．スクアレン合成酵素阻害活性測定法 タイト（R.M.Tait）の報告（Analytical Biochemistry
203, 310−316,(1992))に記載されているスポット−ウ
オッシュアッセイ（Spot−wash assay）法に準じて行っ
た。実際に行った方法を以下に詳述する。 (１) アッセイ条件 ａ）100mM HEPES (pH7.4)，1mM MgCl₂，1mM ジチオスレ
イトール，２mM NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸)，４mM KF，10μM [³H]−FPP（ファル
ネシルピロリン酸)，0.1mg/ml ミクロソーム画分 ｂ）反応温度および時間 哺乳類由来の酵素の場合：37℃、20分間 真菌の場合：室温、20分間 ｃ）酵素希釈用バッファー25μl：1M HEPES (pH7.4)5μ
l、1M MgCl₂ 0.05μl、1Mジチオスレイトール 0.05μ
l、0.1M NADPH 1μl、1M KF 0.2μl、蒸留水 18.7μl ｄ）基質溶液20μl：1.85 MBq/ml [³Ｈ]−FPP 0.5μl
（833 GBq/mmol: ニューイングランドニュークリア社
製)、100μMのFPP 2.14μl、蒸留水17.36μl 10倍濃度に調製した検体(50％ DMSO溶液)５μlずつを96
穴Ｕ底マイクロプレートに分注後、凍結保存したミクロ
ソーム画分を酵素希釈用バッファーを用いて用時に0.1m
g/mlに希釈したものを25μl加え、室温で10分間プレイ
ンキュベートした。これに基質溶液20μlを加えて反応
を開始した。20分後、2−プロパノールを50μl加えて反
応を停止した。この反応液を５μlのシリカゲルプレー
ト(Sigma:T 6770)にスポットし、風乾した後、１％SDS
(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む0.2M Tris塩基溶液中
で10分間洗浄した。このシリカゲルプレート上に残存し
ている反応生成物（スクアレン）のカウントを液体シン
チレーション法によって測定した。検体非添加時のカウ
ント(dpm)を50％にするために必要な検体濃度をＩＣ
_５０とした。V. Report of squalene synthase inhibitory activity assay Tit (RMTait) (Analytical Biochemistry
203, 310-316, (1992)) according to the spot-wash assay method. The method actually performed will be described in detail below. (1) Assay conditions a) 100 mM HEPES (pH7.4), 1 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol, 2 mM NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 4 mM KF, 10 μM [ ³ H] -FPP (farnesyl pyrophosphate) ), 0.1 mg / ml microsome fraction b) Reaction temperature and time For mammalian enzymes: 37 ° C, 20 minutes For fungi: Room temperature, 20 minutes c) Enzyme dilution buffer 25 μl: 1M HEPES (pH7.4) 5μ
l, 1M MgCl ₂ 0.05 μl, 1M dithiothreitol 0.05 μl
l, 0.1M NADPH 1 μl, 1M KF 0.2 μl, distilled water 18.7 μl d) Substrate solution 20 μl: 1.85 MBq / ml [ ³ H] -FPP 0.5 μl
(833 GBq / mmol: manufactured by New England Nuclear Co., Ltd.), 2.14 μl of 100 μM FPP, 17.36 μl of distilled water, and 96 μl of a 10-fold concentrated sample (50% DMSO solution).
After dispensing into a U-bottom microplate with a hole, freeze-preserve the microsome fraction with an enzyme dilution buffer at 0.1 m
25 μl of the diluted product of g / ml was added and preincubated at room temperature for 10 minutes. To this, 20 μl of the substrate solution was added to start the reaction. After 20 minutes, 50 μl of 2-propanol was added to stop the reaction. The reaction solution was spotted on a 5 μl silica gel plate (Sigma: T 6770), air-dried, and then 1% SDS was added.
It was washed for 10 minutes in a 0.2 M Tris base solution containing (sodium dodecyl sulfate). The count of the reaction product (squalene) remaining on this silica gel plate was measured by the liquid scintillation method. The sample concentration required to reach 50% of the count (dpm) when no sample is added
_{It was set to 50} .

【００３５】ＶＩ．結果 結果を下記の表１−３にまとめて示す。VI. Results Results are summarized in Tables 1-3 below.

【表１】 [Table 1]

【００３６】[0036]

【表２】 [Table 2]

【００３７】[0037]

【表３】 [Table 3]

【００３８】細胞毒性は、マウスの肥満細胞腫細胞Ｐ８
１５の増殖を抑制する最少濃度の測定により行った。結
果を表４に示す。Cytotoxicity was observed in mouse mastocytoma cell P8.
The measurement was carried out by measuring the minimum concentration that suppressed the proliferation of 15. The results are shown in Table 4.

【００３９】[0039]

【表４】 本発明のビサボスクアール誘導体の、酵母及び各種動物
の肝臓由来のスクアレン合成酵素阻害活性はビサボスク
アールＡ、Ｃ、ＤおよびＢの順に強く、種に特異的な阻
害は認められなかった（表１）。また、ビサボスクアー
ルＡは、各種酵母菌、糸状菌に対して増殖抑制作用を示
したが、ビサボスクアールＢは一部の糸状菌に対して弱
い作用を示したにとどまった。ビサボスクアールＣおよ
びＤは無効であった（表２）。またビサボスクアールＡ
およびＢは、グラム陽性菌に対して非常に弱い抗菌作用
を示したが、グラム陰性菌には作用しなかった（表
３）。ビサボスクアールＡおよびＢは、マウスの肥満細
胞腫由来の細胞であるＰ815株に対して弱い細胞増殖抑
制作用を示した（表４)。[Table 4] The squalene synthase inhibitory activity of the bisavosqual derivatives of the present invention derived from the livers of yeasts and various animals was strong in the order of bisavosqual A, C, D and B, and no species-specific inhibition was observed (Table 1). In addition, bisavosqual A showed a growth inhibitory action against various yeasts and filamentous fungi, whereas bisavosqual B showed only a weak action against some filamentous fungi. Bisavosquer C and D were ineffective (Table 2). See also Bisa Bosque A
And B showed a very weak antibacterial effect against Gram-positive bacteria, but not against Gram-negative bacteria (Table 3). Bisavosqual A and B showed a weak cytostatic effect on the P815 strain, which is a mouse mastocytoma-derived cell (Table 4).

【００４０】 ポテトスターチの加熱により10％粘稠液を製造した。ビ
サボスクアール、乳糖、および残りのポテトスターチを
混合し、製造した粘稠液と一緒にメッシュサイズ1.５mm
の篩に通して顆粒化した。顆粒を45℃で乾燥し、再び上
記篩に通して顆粒化し、ステアリン酸マグネシウムと混
合し、そして錠剤に打錠した。[0040] A 10% viscous liquid was prepared by heating potato starch. Bisa vosqual, lactose, and the rest of potato starch mixed together with the viscous liquid to produce a mesh size of 1.5 mm
And then granulated. The granules were dried at 45 ° C, passed through the above sieve again to granulate, mixed with magnesium stearate and compressed into tablets.

【００４１】 ビサボスクアール、乳糖、およびコーンスターチをポリ
ビニールピロリドンの水溶液で均一に湿らせ、メッシュ
サイズ2.0mmの篩にとおして顆粒化し、循環空気乾燥機
中50℃で乾燥した。さらにメッシュサイズ1.5mmの篩に
通して顆粒化した後、ステアリン酸マグネシウムと混合
し、そして錠剤に打錠した。[0041] Bisavosqual, lactose, and corn starch were uniformly moistened with an aqueous solution of polyvinylpyrrolidone, granulated through a 2.0 mm mesh size screen, and dried in a circulating air dryer at 50 ° C. Further, the mixture was passed through a sieve having a mesh size of 1.5 mm, granulated, mixed with magnesium stearate, and compressed into tablets.

【００４２】製剤例３ カプセル剤 ビサボスクアール60.0mgを微粉化し、カプセルに充填し
た。 Formulation Example 3 Capsule 60.0 mg of bisavosqual was pulverized into capsules.

【００４３】 微粉化したビザボスクアールを、溶融した坐剤基剤に懸
濁し、その懸濁液を40℃に冷却し、それを僅かに予冷し
た坐剤型に37℃で注入した。[0043] Micronized Visavosqual was suspended in a molten suppository base, the suspension cooled to 40 ° C and poured into slightly precooled suppository molds at 37 ° C.

【００４４】 坐剤基剤を溶融した。38℃で粉末化した活性成分を溶融
物中に均一に分散された。それを35℃に冷却し、そして
予冷した坐剤型に注入した。[0044] The suppository base was melted. The active ingredient powdered at 38 ° C. was evenly dispersed in the melt. It was cooled to 35 ° C and poured into pre-chilled suppository molds.

【００４５】 蒸留水を70℃まで加熱した。撹拌下にｐ−ヒドロキシ安
息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、グリ
セリンおよびカルボキシメチルセルロースをそれに溶か
し、ついで溶液を室温に冷却した。ビサボスクアールを
撹拌下加え、そして均一に分散させた。ショ糖、ソルビ
ット溶液および香料を加えて溶解した後、懸濁液を真空
中撹拌下に排気した。[0045] Distilled water was heated to 70 ° C. Under stirring, methyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, glycerin and carboxymethylcellulose were dissolved therein and then the solution was cooled to room temperature. Bisavosqual was added with stirring and evenly dispersed. After the addition of sucrose, sorbit solution and fragrance to dissolve, the suspension was evacuated under vacuum with stirring.

【００４６】[0046]

【発明の効果】本発明のビサボスクアール誘導体は、ス
クアレン合成酵素阻害活性を有しており、その結果、ス
クアレンの代謝産物であるコレステロールの合成を阻害
することから、高コレステロール血症の治療および予防
に有用である。また、本発明のビサボスクアール誘導体
は、抗真菌活性を有しており、真菌感染症の治療および
予防にも有用である。さらに、該誘導体には鎮痛作用も
認められており、鎮痛剤としての有用性が期待される。
さらには、本発明化合物を用いて、他のビサボスクアー
ル誘導体を製造し、さらに多くの有用な化合物を得るこ
とができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The bisabosuquer derivative of the present invention has squalene synthase inhibitory activity, and as a result, inhibits the synthesis of cholesterol which is a metabolite of squalene, it can be used for the treatment and prevention of hypercholesterolemia. It is useful. In addition, the bisavosqual derivative of the present invention has antifungal activity and is useful for treating and preventing fungal infections. Further, the derivative has been found to have an analgesic action, and is expected to be useful as an analgesic.
Further, the compounds of the present invention can be used to produce other bisavosqual derivatives to obtain more useful compounds.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｄ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location C12P 17/18 D 7432-4B // (C12N 1/14 C12R 1: 645) (C12P 17/18 C12R 1: 645)

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 （式中、Ｒ¹は−ＣＨＯまたは−ＣＨ₂ＯＨ、Ｒ²は水素
またはヒドロキシ、Ｒ³は式： 【化２】 で示される基を表す）で示される化合物。1. Formula I: (In the formula, R ¹ is —CHO or —CH ₂ OH, R ² is hydrogen or hydroxy, and R ³ is of the formula: Represents a group represented by). 【請求項２】 式I’ 【化３】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は前記と同意義、Ｒ³は式： 【化４】 （式中、波線はα結合、β結合又はそれらの混合物のい
ずれかの配置であることを表す）で示される基を表す］
で示される化合物である請求項１記載の化合物。2. The formula I ′ [Wherein R ¹ and R ² have the same meanings as described above, and R ³ is represented by the formula: (In the formula, the wavy line represents an arrangement of α bond, β bond, or a mixture thereof).
The compound according to claim 1, which is a compound represented by: 【請求項３】 請求項１または２記載の化合物の有効量
と薬学上許容される担体とを含有するスクアレン合成酵
素阻害剤。3. A squalene synthase inhibitor comprising an effective amount of the compound according to claim 1 or 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. 【請求項４】 請求項１または記載の化合物の有効量と
薬学上許容される担体とを含有する抗真菌剤。4. An antifungal agent comprising an effective amount of the compound according to claim 1 or 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. 【請求項５】 スタキボトリス・ルーウェンゾリエンシ
ス（Stachybotrys ruwenzoriensis）種に属し、式： 【化５】 から成る群から選択される化合物を産生する微生物。5. A Stachybotrys ruwenzoriensis species, which has the formula: A microorganism that produces a compound selected from the group consisting of: 【請求項６】 Stachybotrys ruwenzoriensis RF−6853
株(FERM P−14384)である請求項５記載の微生物。6. Stachybotrys ruwenzoriensis RF-6853
The microorganism according to claim 5, which is a strain (FERM P-14384). 【請求項７】 式： 【化６】 で示される化合物を産生するStachybotrys sp.RF−7260
株(FERM P−14383)。7. The formula: Stachybotrys sp. RF-7260 that produces the compound represented by
Strain (FERM P-14383). 【請求項８】 スタキボトリス属（Stachybotrys）に属
し、式： 【化７】 から成る群から選択される化合物を産生する微生物を培
養し、得られた培養物から該化合物を分離、精製し、所
望により酸化、還元またはエポキシ化することからなる
請求項１記載の化合物の製造方法。8. A member of the genus Stachybotrys , which has the formula: The method for producing a compound according to claim 1, which comprises culturing a microorganism producing a compound selected from the group consisting of, separating, purifying, and optionally oxidizing, reducing or epoxidizing the compound obtained. Method.