JPH08128987A - Biosensor and its manufacture - Google Patents
Biosensor and its manufactureInfo
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- JPH08128987A JPH08128987A JP6267169A JP26716994A JPH08128987A JP H08128987 A JPH08128987 A JP H08128987A JP 6267169 A JP6267169 A JP 6267169A JP 26716994 A JP26716994 A JP 26716994A JP H08128987 A JPH08128987 A JP H08128987A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、バイオセンサー及びそ
の製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biosensor and a method for manufacturing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】バイオセンサーは、生体内に含まれてい
る酵素、抗体等のタンパク質が特定の有機分子のみと反
応する性質を利用したセンサーであり、医療分野におけ
る血液検査、食品産業分野における工程管理、環境測定
等に広く応用される可能性を持っている。バイオセンサ
ーは、測定分子と特異的に反応するタンパク質、及び、
この反応を電流や電圧等の物理的信号に変える変換器か
ら構成されている。2. Description of the Related Art Biosensors are sensors that utilize the property that proteins contained in the body such as enzymes and antibodies react only with specific organic molecules, and are used in blood tests in the medical field and processes in the food industry field. It has the potential to be widely applied to management and environmental measurement. A biosensor is a protein that specifically reacts with a measurement molecule, and
It consists of a converter that converts this reaction into a physical signal such as current or voltage.
【０００３】バイオセンサーは、コンパクトであり、何
回もの測定に耐え得ることが実用上好ましく、そのため
には、タンパク質が担体に固定されている必要がある。
現在までに用いられているタンパク質の固定法には、物
理吸着法、化学固定法がある。It is practically preferable for a biosensor to be compact and capable of withstanding many measurements. For that purpose, it is necessary that the protein is immobilized on a carrier.
The protein immobilization methods that have been used so far include a physical adsorption method and a chemical immobilization method.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】物理吸着法は基板をタ
ンパク質溶液に浸漬しタンパク質を固定する方法で、操
作が簡便ある。しかし、タンパク質は基板と弱く物理吸
着しているだけなので、時間が経過すると基板から剥が
れてしまう。これに対して、化学固定法はタンパク質を
基板に化学結合により固定する方法であり、タンパク質
は、基板と強固に固定されるので、基板から剥がれてし
まうことはない。しかし、タンパク質を基板に共有結合
させるためにタンパク質を化学修飾する必要がある。こ
のため、タンパク質の変性が起こり、活性が低下すると
いう欠点を持つ。The physical adsorption method is a method of immersing a substrate in a protein solution to immobilize the protein, and the operation is simple. However, since the protein is only weakly physically adsorbed to the substrate, it will peel off from the substrate over time. On the other hand, the chemical immobilization method is a method of immobilizing a protein on a substrate by a chemical bond, and since the protein is firmly immobilized on the substrate, it is not peeled off from the substrate. However, it is necessary to chemically modify the protein to covalently attach it to the substrate. Therefore, it has a drawback that protein denaturation occurs and the activity is reduced.
【０００５】本発明は、タンパク質が基板に強固に固定
され、しかもほとんどタンパク質の変性の無いバイオセ
ンサー、及びその製造方法を提供することを目的とす
る。It is an object of the present invention to provide a biosensor in which a protein is firmly fixed on a substrate and which has almost no protein denaturation, and a method for producing the biosensor.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】かかる問題を解決するた
めに、本発明のバイオセンサーは、センサー分子である
タンパク質と有機薄膜が基板上に固定されており、前記
センサー分子が前記有機薄膜内の穴に固定されているこ
とを特徴とする。In order to solve such a problem, in the biosensor of the present invention, a sensor molecule protein and an organic thin film are immobilized on a substrate, and the sensor molecule is contained in the organic thin film. It is characterized by being fixed in the hole.
【０００７】また、前記構成のバイオセンサーにおいて
は、有機薄膜が基板とＳｉ−０結合により固定されてい
ることが望ましい。In the biosensor having the above structure, it is desirable that the organic thin film is fixed to the substrate by Si-0 bond.
【０００８】また、本発明のバイオセンサーの製造方法
は、電極表面にピンホールを持つ有機薄膜を固定し、こ
の電極をタンパク質溶液に浸漬しながら前記電極に一定
電圧を印加することを特徴とする。The biosensor manufacturing method of the present invention is characterized in that an organic thin film having pinholes is fixed on the surface of an electrode, and a constant voltage is applied to the electrode while the electrode is immersed in a protein solution. .
【０００９】[0009]
【作用】タンパク質は無極性の官能基、もしくは極性の
官能基持ったアミノ酸が多数個重合した高分子であり、
そのため、分子内には、無極性の部分と極性の部分を持
っている。図４は細胞膜に固定されているタンパク質を
示した模式図であり、膜外に出ている部分は極性であ
り、膜内に埋まっている部分は無極性である。細胞膜内
部は無極性であるので、タンパク質は、このタンパク質
の無極性部分と膜の無極性部分との相互作用（水溶液中
では特に、疎水結合という）により強固に、しかも活性
を保ったまま細胞膜に固定されている。[Function] A protein is a polymer in which a large number of amino acids having non-polar functional groups or polar functional groups are polymerized,
Therefore, it has a non-polar part and a polar part in the molecule. FIG. 4 is a schematic diagram showing a protein immobilized on a cell membrane, in which the portion outside the membrane is polar and the portion buried inside the membrane is non-polar. Since the inside of the cell membrane is non-polar, the protein is strongly bound to the cell membrane while maintaining its activity by the interaction between the non-polar part of this protein and the non-polar part of the membrane. It is fixed.
【００１０】本発明のバイオセンサーのタンパク質の固
定のされ方は、細胞膜よるタンパク質の固定方法と原理
的に同じである。The method of immobilizing the protein of the biosensor of the present invention is the same as the method of immobilizing the protein by the cell membrane in principle.
【００１１】図２で示すように、タンパク質は有機薄膜
の穴に存在するので、四方の膜からしっかり固定されて
いる。また、タンパク質の化学修飾の必要はなく、その
ため、タンパク質が変性することが無い。As shown in FIG. 2, since the protein exists in the holes of the organic thin film, it is firmly fixed from the four sides of the membrane. Further, it is not necessary to chemically modify the protein, and therefore the protein is not denatured.
【００１２】さらに、膜が基板とＳｉ−Ｏ結合している
ので、膜が基板から剥がれ落ち、それに伴い、タンパク
質が剥がれ落ちることがない。Furthermore, since the film is Si—O bonded to the substrate, the film is not peeled off from the substrate and the protein is not peeled off accordingly.
【００１３】また、タンパク質は溶液中でプラスもしく
はマイナスのイオンを持つため、基板として電極を用
い、この電極表面にピンホールを有する有機薄膜を固定
し、タンパク質溶液に浸漬しながら前記電極に一定電圧
を印加することにより、タンパク質分子が電極に引きつ
けられ、膜内のピンホール内に固定される。Since proteins have positive or negative ions in a solution, an electrode is used as a substrate, an organic thin film having pinholes is fixed on the surface of the electrode, and a constant voltage is applied to the electrode while being immersed in the protein solution. By applying, the protein molecule is attracted to the electrode and fixed in the pinhole in the membrane.
【００１４】[0014]
【実施例】以下本発明の一実施例について、図面を参照
しながら説明する。An embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
【００１５】本実施例では、基板とＳｉ−Ｏ結合した有
機薄膜を形成するために、シラン系界面活性剤を用い
た。以下に、シラン系界面活性剤の種類、固体表面への
形成方法、及び特性を簡単に示しておく。In this example, a silane-based surfactant was used to form an organic thin film that was Si—O bonded to the substrate. The type of silane-based surfactant, the method for forming it on the solid surface, and the characteristics will be briefly described below.
【００１６】固体表面とＳｉ−Ｏ結合を介して結合する
するシラン系界面活性剤としてはアルキル鎖を含むもの
があり、ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉＣｌ3 のようなトリク
ロロシラン系化合物、ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＣＨ3ＳｉＣｌ2
ＣＨ3、ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉＣｌ2Ｃ2Ｈ5のようなジク
ロロシラン系化合物、もしくはＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉＣ
ｌ（ＣＨ3）2、ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉＣｌ（Ｃ2Ｈ5）2
のようなモノクロロシラン系化合物などがある。ここで
ｎは０〜２５で可能であるが、１０〜２０が好都合であ
る。これらの中でも特にトリクロロシラン系化合物は、
シロキサン結合が固体表面および隣合う分子同士で形成
されるので、より強固な膜となる。Silane-based surfactants which bond to the solid surface through Si--O bonds include those containing an alkyl chain, and trichlorosilane-based compounds such as CH3 (CH2) nSiCl3 and CH3 (CH2) nCH3SiCl2.
Dichlorosilane compounds such as CH3, CH3 (CH2) nSiCl2C2H5, or CH3 (CH2) nSiC
l (CH3) 2, CH3 (CH2) nSiCl (C2H5) 2
There are monochlorosilane compounds such as. Here, n can be 0 to 25, but 10 to 20 is convenient. Among these, especially trichlorosilane compounds,
Since a siloxane bond is formed on the solid surface and adjacent molecules, a stronger film is obtained.
【００１７】また、固体表面とＳｉ−０結合する試薬と
しては、フッ素アルキル鎖を含むシラン系界面活性剤が
あり、例えば、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2ＳｉＣｌ3、
ＣＦ3ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）15ＳｉＣｌ3、ＣＦ3（ＣＨ2）2
Ｓｉ（ＣＨ3）2（ＣＨ2）15ＳｉＣｌ3、ＣＦ3（ＣＦ2）
3（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＣＨ3）2（ＣＨ2）9ＳｉＣｌ3、Ｆ
（ＣＦ2）8（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＣＨ3）2（ＣＨ2）9ＳｉＣ
ｌ3、ＣＦ3ＣＯＯ（ＣＨ2）15ＳｉＣｌ3、ＣＦ3（ＣＦ
2）5（ＣＨ2）2ＳｉＣｌ3等のようなトリクロロシラン
系化合物を始め、例えば、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2
ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）
2ＳｉＣｌｎ（Ｃ2Ｈ5）3−ｎ、ＣＦ3ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）1
5ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ、ＣＦ3ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）15
ＳｉＣｌｎ（Ｃ2Ｈ5）3−ｎ、ＣＦ3（ＣＨ2）2Ｓｉ（Ｃ
Ｈ3）2（ＣＨ2）15ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ、Ｆ（Ｃ
Ｆ2）4（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＣＨ3）2（ＣＨ2）9ＳｉＣｌｎ
（Ｃ2Ｈ5）3−ｎ、Ｆ（ＣＦ2）8（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＣＨ
3）2（ＣＨ2）9ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ、ＣＦ3ＣＯ
Ｏ（ＣＨ2）15ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ、ＣＦ3（ＣＦ
2）5（ＣＨ2）2ＳｉＣｌｎ（ＣＨ3）3−ｎ（但し式中の
ｎは何れも１または２）等のような低級アルキル基置換
のモノクロロシラン系あるいはジクロロシラン系化合物
がある。これらの中でも特にトリクロロシラン系界面活
性剤は、シロキサン結合が固体表面および隣合う分子同
士で形成されるので、より強固な膜となる。As a reagent for forming a Si-0 bond with a solid surface, there is a silane-based surfactant containing a fluoroalkyl chain, such as CF3 (CF2) 7 (CH2) 2SiCl3,
CF3CH2O (CH2) 15SiCl3, CF3 (CH2) 2
Si (CH3) 2 (CH2) 15SiCl3, CF3 (CF2)
3 (CH2) 2Si (CH3) 2 (CH2) 9SiCl3, F
(CF2) 8 (CH2) 2Si (CH3) 2 (CH2) 9SiC
l3, CF3COO (CH2) 15SiCl3, CF3 (CF
2) Trichlorosilane compounds such as 5 (CH2) 2SiCl3, etc., such as CF3 (CF2) 7 (CH2) 2
SiCln (CH3) 3-n, CF3 (CF2) 7 (CH2)
2SiCln (C2H5) 3-n, CF3CH2O (CH2) 1
5SiCln (CH3) 3-n, CF3CH2O (CH2) 15
SiCln (C2H5) 3-n, CF3 (CH2) 2Si (C
H3) 2 (CH2) 15SiCln (CH3) 3-n, F (C
F2) 4 (CH2) 2Si (CH3) 2 (CH2) 9SiCln
(C2H5) 3-n, F (CF2) 8 (CH2) 2Si (CH
3) 2 (CH2) 9SiCln (CH3) 3-n, CF3CO
O (CH2) 15SiCln (CH3) 3-n, CF3 (CF
2) Lower alkyl group-substituted monochlorosilane-based or dichlorosilane-based compounds such as 5 (CH2) 2SiCln (CH3) 3-n (where n is 1 or 2 in the formula). Among these, particularly, the trichlorosilane-based surfactant has a stronger film since the siloxane bond is formed on the solid surface and adjacent molecules.
【００１８】さらにまた、アルキル基もしくはフッ化ア
ルキル基部分にビニル基（Ｃ＝Ｃ）やアセチル基（エチ
ニル基）を組み込んでおけば、膜形成後５メガラド程度
の電子線照射で架橋できるのでさらに膜自体の強度を向
上させることも可能である。本発明に供されるクロロシ
ラン系化合物は、上述に例示したように直線状だけでな
く分岐した形状でも、または末端の珪素にフッ化アルキ
ル基もしくは炭化水素基が置換した形状（例えばＲ、Ｒ
1、Ｒ2、Ｒ3をフッ化アルキル基または炭化水素基とし
て一般式Ｒ2ＳｉＣｌ3、Ｒ3ＳｉＣｌ、Ｒ1Ｒ2ＳｉＣｌ
2、Ｒ3Ｒ1Ｒ2Ｒ3ＳｉＣｌ等）であっても良いが、膜密
度を高めるためには一般に直線状が好ましい。Furthermore, if a vinyl group (C = C) or an acetyl group (ethynyl group) is incorporated in the alkyl group or the fluorinated alkyl group portion, it can be crosslinked by electron beam irradiation of about 5 megarads after the film formation, so It is also possible to improve the strength of the film itself. The chlorosilane-based compound used in the present invention is not only linear as described above but also branched, or has a terminal silicon substituted with a fluorinated alkyl group or a hydrocarbon group (for example, R, R).
1, R 2, generally the R 3 as alkyl fluoride group or a hydrocarbon group equation R2SiCl3, R3SiCl, R 1 R 2 SiCl
2, R 3 R 1 R 2 R 3 SiCl, etc.), but a linear shape is generally preferable in order to increase the film density.
【００１９】固体表面にＳｉ−Ｏ結合を介してアルキル
鎖もしくはフッ化アルキル鎖を含む膜を形成するための
非水溶媒は、クロロシラン系界面活性剤と反応する活性
水素を持たない有機溶媒であればよい。その例として例
えば１、１ージクロロ、１ーフルオロエタン、または
１、１ージクロロ２、２、２ートリフルオロエタン、ま
たは１、１ージクロロ、２、２、３、３、３ーペンタフ
ルオロプロパン、または１、３ージクロロ、１、１、
２、２、３ーペンタフルオロプロパン、またはトリフッ
化アルキルアミン、またはパーフルオロフランおよびそ
のフッ化アルキル誘導体等のフッ素系溶媒、例えばヘキ
サン、オクタン、ヘキサデカン、シクロヘキサン等の炭
化水素系溶媒、例えばジブチルエーテル、ジベンジルエ
ーテル等のエーテル系溶媒、例えば酢酸メチル、酢酸エ
チル、酢酸イソプロピル、酢酸アミル等のエステル系溶
媒のいずれかが好ましい。The non-aqueous solvent for forming a film containing an alkyl chain or a fluorinated alkyl chain on the solid surface via Si--O bonds may be an organic solvent having no active hydrogen that reacts with the chlorosilane-based surfactant. Good. For example, 1,1-dichloro, 1-fluoroethane, or 1,1-dichloro 2,2,2-trifluoroethane, or 1,1-dichloro, 2,2,3,3,3-pentafluoropropane, or 1, 3-dichloro, 1, 1,
Fluorine-based solvents such as 2,2,3-pentafluoropropane, or trifluoroalkylamines, or perfluorofuran and its fluorinated alkyl derivatives, for example, hydrocarbon solvents such as hexane, octane, hexadecane, cyclohexane, such as dibutyl ether. , An ether solvent such as dibenzyl ether, or an ester solvent such as methyl acetate, ethyl acetate, isopropyl acetate or amyl acetate is preferable.
【００２０】これらの有機薄膜は、以下の方法を用いれ
ば、基板上に単分子膜を形成する。すなわち、非水系有
機溶媒にクロロシラン系界面活性剤溶かし、これに膜を
形成したい基板を浸積して化学反応を行わせた後、水分
に接触させないで非水系の溶剤で洗浄することにより、
基板上に単分子膜が形成される。本実施例では、特に、
単分子膜を用いた。These organic thin films form a monomolecular film on a substrate by using the following method. That is, a chlorosilane-based surfactant is dissolved in a non-aqueous organic solvent, a substrate on which a film is to be formed is immersed in the chemical reaction, and then washed with a non-aqueous solvent without contact with water,
A monomolecular film is formed on the substrate. In this embodiment, in particular,
A monolayer was used.
【００２１】（実施例１）白雲母基板に酵母菌から抽出
されたグルコースオキシターゼ（以下ＧＯＤと略記）を
固定し、ＧＯＤの酵素活性、及び、基板との結合力を調
べた。Example 1 Glucose oxidase (hereinafter abbreviated as GOD) extracted from yeast was immobilized on a muscovite substrate, and the enzyme activity of GOD and the binding force to the substrate were examined.
【００２２】白雲母基板をへき開して清浄な面を出し
た。次に、この雲母基板表面を水蒸気プラズマに曝し、
水酸基を導入した。プラズマ処理条件は、１．０ Ｔｏ
ｒｒ、５０Ｗ、１５分である。次に、０．０３ｍｍｏｌ
／ｌのオクタデシルトリクロロシラン（以下ＯＴＳと記
す）を溶解した溶液（溶媒は、ノルマルヘキサデカン、
クロロホルム、四塩化炭素の混合溶液で、容量比で、８
０：８：１２とする）中に雲母基板を約２時間浸漬し
た。その後、クロロホルム溶液で未反応物質を洗浄・除
去した。さらに、この雲母基板を、１０ｍｇ／ｍｌのＧ
ＯＤが溶解した燐酸緩衝溶液（ｐＨ＝７、０．１ｍｏｌ
／ｌ）に１時間浸漬した後、ｐＨ＝７、１ｍｏｌ／ｌの
燐酸緩衝溶液で洗浄した。The muscovite mica substrate was cleaved to expose a clean surface. Next, expose the surface of this mica substrate to steam plasma,
A hydroxyl group was introduced. Plasma processing conditions are 1.0 To
rr, 50W, 15 minutes. Next, 0.03 mmol
/ L octadecyltrichlorosilane (hereinafter referred to as OTS) solution (solvent is normal hexadecane,
A mixed solution of chloroform and carbon tetrachloride at a volume ratio of 8
0: 8: 12), and the mica substrate was immersed for about 2 hours. Then, unreacted substances were washed and removed with a chloroform solution. Furthermore, this mica substrate was mixed with 10 mg / ml G
Phosphate buffer solution in which OD is dissolved (pH = 7, 0.1 mol
/ L) for 1 hour and then washed with a phosphate buffer solution of pH = 7, 1 mol / l.
【００２３】ＧＯＤ固定前の雲母基板上のＯＴＳ、ＧＯ
Ｄ固定後のＯＴＳを原子間力顕微鏡（以下ＡＦＭと略記
する）で観察した。測定は、デジタルインスツルメンツ
社製のＮａｎｏｓｃｏｐｅを用いて、エタノール中で行
った。ＡＦＭ測定中は、ＡＦＭの探針と試料との間にか
かる斥力を０．１ｎＮと一定にした。その結果、ＧＯＤ
固定前のＯＴＳ膜には、直径５ｎｍ〜５０ｎｍのピンホ
ールが観察された。OTS and GO on the mica substrate before fixing the GOD
The OTS after D fixation was observed with an atomic force microscope (hereinafter abbreviated as AFM). The measurement was performed in ethanol using Nanoscope made by Digital Instruments. During the AFM measurement, the repulsive force applied between the AFM probe and the sample was kept constant at 0.1 nN. As a result, GOD
A pinhole having a diameter of 5 nm to 50 nm was observed on the OTS film before fixation.
【００２４】また、ＧＯＤ固定後のＯＴＳ膜を観察した
ところ、直径１０ｎｍ程度のピンホール中にＧＯＤが存
在していることが分かった。ＡＦＭ像からＧＯＤの密度
を計算すると、１０10個／ｃｍ2であった。以上の結果
から、基板上のＧＯＤは、図１で示されるような状態
で、固定されていると考えられる。Observation of the OTS film after fixing the GOD revealed that the GOD was present in the pinhole having a diameter of about 10 nm. The density of GOD calculated from the AFM image was 10 10 particles / cm 2 . From the above results, it is considered that the GOD on the substrate is fixed in the state shown in FIG.
【００２５】次に、O-dianisidine 0.2 mg, peroxidase
0.02 mg, グルコース27 mg をｐＨ＝７、０．１ｍｏｌ
／ｌの燐酸緩衝溶液５ｍｌに溶解し、ＧＯＤの固定され
た総面積１ｃｍ2の雲母基板を浸漬し、波長４６０ｎｍ
の吸光度の時間変化からＧＯＤの酵素活性を評価した。
その結果、雲母基板に固定されたＧＯＤの酵素活性は、
５０Ｕ／ｍｇであった。溶液中でのＧＯＤの酵素活性
は、６０Ｕ／ｍｇであったので、雲母基板上のタンパク
質は変性しないで、酵素活性を保ったまま固定されいる
と考えられる。Next, O-dianisidine 0.2 mg, peroxidase
0.02 mg, glucose 27 mg, pH = 7, 0.1 mol
Dissolved in 5 ml of 1 / l phosphate buffer solution, immersed a mica substrate with a total area of 1 cm 2 on which GOD was fixed, and wavelength 460 nm
The enzyme activity of GOD was evaluated from the change with time of the absorbance of GOD.
As a result, the enzyme activity of GOD immobilized on the mica substrate was
It was 50 U / mg. Since the enzyme activity of GOD in the solution was 60 U / mg, it is considered that the protein on the mica substrate was not denatured and was immobilized while maintaining the enzyme activity.
【００２６】つぎに、ＧＯＤの固定された雲母基板をｐ
Ｈ＝７、０．１ｍｏｌ／ｌの燐酸緩衝溶液に一週間浸漬
した後上述の方法で酵素活性を測定したところ、４８Ｕ
／ｍｇであった。従って、ＧＯＤは水溶液中でも雲母基
板からはがれること無く強く固定されていると考えられ
る。Next, the mica substrate with the fixed GOD is
After immersing in H = 7, 0.1 mol / l phosphate buffer solution for 1 week and then measuring enzyme activity by the above-mentioned method, 48 U was obtained.
/ Mg. Therefore, it is considered that GOD is strongly fixed in an aqueous solution without peeling off from the mica substrate.
【００２７】本実施例では、タンパク質を固定する有機
薄膜として単分子膜を用いているので、有機薄膜の膜厚
が良くコントロールされ、タンパク質分子全てが有機薄
膜に埋まって酵素の活性部位が隠れてしまうことがない
ので、反応性の高いバイオセンサーを作製できる。In this embodiment, since the monomolecular film is used as the organic thin film for immobilizing the protein, the film thickness of the organic thin film is well controlled, and all the protein molecules are buried in the organic thin film to hide the active site of the enzyme. Since it does not happen, a highly reactive biosensor can be manufactured.
【００２８】また、本発明においては、ＯＴＳの濃度を
０．０３ｍｍｏｌ／ｌとして、膜内にピンホールを形成
したが、この条件に限定されないことは勿論である。例
えば、ＯＴＳの濃度を大きくして、基板との反応時間を
短くすることによっても膜内にピンホールを形成するこ
とができる。Further, in the present invention, the pinholes were formed in the film with the OTS concentration of 0.03 mmol / l, but it is needless to say that the conditions are not limited to this. For example, the pinholes can be formed in the film by increasing the concentration of OTS and shortening the reaction time with the substrate.
【００２９】（実施例２）酸化スズ電極上に馬の心臓か
ら抽出されたチトクロームＣを固定し、このタンパク質
の活性、及び、基板との結合力を調べた。(Example 2) Cytochrome C extracted from horse heart was immobilized on a tin oxide electrode, and the activity of this protein and its binding force to the substrate were examined.
【００３０】酸化スズが約２０００オングストロームの
厚さに真空蒸着されたガラス基板を水蒸気プラズマに曝
し、水酸基を導入した。プラズマ処理条件は、１．０
Ｔｏｒｒ、１５０Ｗ、１５分である。次に、３０ｍｍｏ
ｌ／ｌのＯＴＳ、及び（化１）に示す化合物５μM/L を
溶解した溶液（溶媒は、ノルマルヘキサデカン、クロロ
ホルム、四塩化炭素の混合溶液で、容量比で、８０：
８：１２とする）中に基板を２時間浸漬する。その後、
クロロホルム溶液で未反応物質を洗浄・除去した。A glass substrate on which tin oxide was vacuum deposited to a thickness of about 2000 angstrom was exposed to steam plasma to introduce a hydroxyl group. Plasma processing condition is 1.0
Torr, 150W, 15 minutes. Next, 30mmo
A solution in which 1 / l of OTS and 5 μM / L of the compound shown in (Chemical Formula 1) were dissolved (solvent was a mixed solution of normal hexadecane, chloroform and carbon tetrachloride, and the volume ratio was 80:
The substrate is soaked in 8:12) for 2 hours. afterwards,
Unreacted substances were washed and removed with a chloroform solution.
【００３１】[0031]
【化１】 Embedded image
【００３２】以上の処理によって、クロロホルム洗浄前
においては、ＯＴＳ１１は基板上に化学結合し、（化
１）化合物１１、１２は物理吸着する（図３ａ）。その
後クロロホルム洗浄をする事により、物理吸着していた
（化１）化合物１１、１２だけが除去される。その結
果、（化１）化合物１１、１２の存在していた部分に穴
１４が開く。By the above treatment, before washing with chloroform, the OTS 11 is chemically bonded to the substrate, and the compounds 11 and 12 (chemical formula 1) are physically adsorbed (FIG. 3a). Then, by washing with chloroform, only the compounds 11 and 12 (chemical formula 1) physically adsorbed are removed. As a result, holes 14 are opened in the portions where the compounds 11 and 12 of (Chemical Formula 1) were present.
【００３３】次に、この基板を、１０ｍｇ／ｍｌのチト
クロームＣが溶解した燐酸緩衝溶液（ｐＨ＝７、０．１
ｍｏｌ／ｌ）に３時間浸漬した後、ｐＨ＝７、１ｍｏｌ
／ｌの燐酸緩衝溶液で基板を洗浄して、電極に弱く吸着
したタンパク質を洗い流した。この操作により、チトク
ロームＣは、単分子膜内の穴に固定されると考えられ
る。Next, this substrate was placed on a phosphate buffer solution (pH = 7, 0.1) in which 10 mg / ml of cytochrome C was dissolved.
(mol / l) for 3 hours, pH = 7, 1 mol
The substrate was washed with a 1 / l phosphate buffer solution to wash away the proteins weakly adsorbed on the electrodes. By this operation, cytochrome C is considered to be fixed in the hole in the monolayer.
【００３４】次に、チトクロームＣが酸化スズ電極と電
子授受を行うことを利用して（E.F.Bowden, F.M.Hawkri
dge, H.N.Blount J. Electroanal. Chem.,161巻335〜37
6ペーシ、1984年）、電極に固定されたタンパク質の活
性を電気化学的に評価した。すなわち、上述の方法によ
ってチトクロームＣの固定された電極を作用電極、白金
電極を対極、銀・塩化銀電極を参照電極として、サイク
リックボルタモメトリー法により、チトクロームＣと電
極との電子授受を調べた。なお、電位走引速度は１０ｍ
Ｖ／ｓとした。図５に、サイクリックボルタモグラムを
示す。０．５Ｖ付近に酸化、還元によるピークが観測さ
れる。これは、チトクロームＣと電極との間に電子授受
が行われていることを示し、このタンパク質が活性を保
っていることを示す。Next, utilizing the fact that cytochrome C exchanges electrons with the tin oxide electrode (EF Bowden, FM Hawkri
dge, HNBlount J. Electroanal. Chem., 161, 335-37
6 p.s., 1984), the activity of the protein immobilized on the electrode was evaluated electrochemically. That is, the electron transfer between the cytochrome C and the electrode was examined by the cyclic voltammetry method using the electrode on which cytochrome C was immobilized by the above-mentioned method as the working electrode, the platinum electrode as the counter electrode, and the silver / silver chloride electrode as the reference electrode. It was Note that the potential sweep speed is 10 m
V / s. FIG. 5 shows a cyclic voltammogram. Peaks due to oxidation and reduction are observed near 0.5V. This indicates that electrons are transferred between the cytochrome C and the electrode, indicating that this protein retains its activity.
【００３５】次に、この電極をｐＨ＝７、０．１ｍｏｌ
／ｌの燐酸緩衝溶液に一週間浸漬した後上述の方法で、
タンパク質の活性を調べたところ、酸化、還元のピーク
値は、初期値の９５％であり、チトクロームＣは水溶液
中でも基板からはがれること無く強く固定されていると
考えられる。Next, the electrode was adjusted to pH = 7, 0.1 mol.
/ L phosphate buffer solution for 1 week and then as described above,
When the activity of the protein was examined, the peak values of oxidation and reduction were 95% of the initial values, and it is considered that cytochrome C is strongly fixed without peeling from the substrate even in an aqueous solution.
【００３６】本実施例では、（化１）の様なマスク分子
を利用しているので、有機薄膜内へピンホールを制御良
く形成することが可能である。なお、本実施例では、
（化１）のマスク分子を用いたが、これに限定されるこ
とはなく、クロロシリル基と反応しない両親媒性の分子
ならなんでもよく、例えば、（化２）で示すようなマス
ク分子等、固定するタンパク質の大きさにより選べばよ
い。In this embodiment, since the mask molecule as shown in (Chemical Formula 1) is used, it is possible to form pinholes in the organic thin film with good control. In this example,
Although the mask molecule of (Chemical formula 1) was used, the present invention is not limited to this, and any amphipathic molecule that does not react with a chlorosilyl group may be used. For example, a mask molecule such as that shown in (Chemical formula 2) may be immobilized. It may be selected according to the size of the protein to be used.
【００３７】[0037]
【化２】 Embedded image
【００３８】（実施例３）酸化スズ電極上に馬の心臓か
ら抽出されたチトクロームＣを固定し、このタンパク質
の活性、及び、基板との結合力を調べた。Example 3 Cytochrome C extracted from horse heart was immobilized on a tin oxide electrode, and the activity of this protein and its binding force to the substrate were examined.
【００３９】酸化スズが約２０００オングストロームの
厚さに真空蒸着されたガラス基板を水蒸気プラズマに曝
し、水酸基を導入した。プラズマ処理条件は、１．０
Ｔｏｒｒ、１５０Ｗ、１５分である。次に、０．０３ｍ
ｍｏｌ／ｌのオクタデシルトリクロロシラン（以下ＯＴ
Ｓと記す）を溶解した溶液（溶媒は、ノルマルヘキサデ
カン、クロロホルム、四塩化炭素の混合溶液で、容量比
で、８０：８：１２とする）中に基板を２時間浸漬し
た。その後、クロロホルム溶液で未反応物質を洗浄・除
去した。A glass substrate on which tin oxide was vacuum-deposited to a thickness of about 2000 angstrom was exposed to steam plasma to introduce a hydroxyl group. Plasma processing condition is 1.0
Torr, 150W, 15 minutes. Next, 0.03m
mol / l octadecyltrichlorosilane (hereinafter OT
The substrate was immersed for 2 hours in a solution in which S) was dissolved (the solvent was a mixed solution of normal hexadecane, chloroform, and carbon tetrachloride, and the volume ratio was 80: 8: 12). Then, unreacted substances were washed and removed with a chloroform solution.
【００４０】次に、この基板を、１０ｍｇ／ｍｌのチト
クロームＣが溶解した燐酸緩衝溶液（ｐＨ＝７、０．１
ｍｏｌ／ｌ）に浸漬した後、この基板に−０．７Ｖの電
位（銀・塩化銀参照電極に対して）を１０分間印加し
た。この操作により、チトクロームＣは電極に固定され
る。なぜなら、チトクロームＣの等電点は１０前後であ
るので、ｐＨ＝７においてタンパク質はプラスに帯電し
ている。そこで、電極を負電位に保つことにより、タン
パク質は電極上に引きつけられるからである。その後、
ｐＨ＝７、１ｍｏｌ／ｌの燐酸緩衝溶液で基板を洗浄し
て、電極に弱く吸着したタンパク質を洗い流した。Next, this substrate was placed on a phosphate buffer solution (pH = 7, 0.1) in which 10 mg / ml of cytochrome C was dissolved.
mol / l), a potential of −0.7 V (with respect to a silver / silver chloride reference electrode) was applied to this substrate for 10 minutes. By this operation, cytochrome C is fixed to the electrode. Because the isoelectric point of cytochrome C is around 10, the protein is positively charged at pH = 7. Therefore, the protein is attracted onto the electrode by keeping the electrode at a negative potential. afterwards,
The substrate was washed with a pH = 7, 1 mol / l phosphate buffer solution to wash away the protein weakly adsorbed on the electrode.
【００４１】次に、実施例２と同様に、電極に固定され
たタンパク質の活性を電気化学的に評価した。すなわ
ち、上述の方法によってチトクロームＣの固定された電
極を作用電極、白金電極を対極、銀・塩化銀電極を参照
電極として、サイクリックボルタモメトリー法により、
チトクロームＣと電極との電子授受を調べた。なお、電
位走引速度は１０ｍＶ／ｓとした。図６に、サイクリッ
クボルタモグラムを示す。０．５Ｖ付近に酸化、還元に
よるピークが観測される。これは、チトクロームＣと電
極との間に電子授受が行われていることを示し、このタ
ンパク質が活性を保っていることを示す。Next, as in Example 2, the activity of the protein immobilized on the electrode was electrochemically evaluated. That is, by the cyclic voltammetry method using the electrode on which cytochrome C is immobilized by the above-mentioned method as a working electrode, the platinum electrode as a counter electrode, and the silver / silver chloride electrode as a reference electrode,
The electron transfer between the cytochrome C and the electrode was examined. The potential sweep speed was 10 mV / s. FIG. 6 shows a cyclic voltammogram. Peaks due to oxidation and reduction are observed near 0.5V. This indicates that electrons are transferred between the cytochrome C and the electrode, indicating that this protein retains its activity.
【００４２】次に、この電極をｐＨ＝７、０．１ｍｏｌ
／ｌの燐酸緩衝溶液に一週間浸漬した後上述の方法で、
タンパク質の活性を調べたところ、酸化、還元のピーク
値は、初期値の９８％であり、チトクロームＣは水溶液
中でも基板からはがれること無く強く固定されていると
考えられる。Next, this electrode was adjusted to pH = 7, 0.1 mol.
/ L phosphate buffer solution for 1 week and then as described above,
When the activity of the protein was examined, the peak values of oxidation and reduction were 98% of the initial values, and it is considered that cytochrome C is strongly fixed without peeling from the substrate even in an aqueous solution.
【００４３】この様に、基板に電界を加えることによ
り、外力（クーロン力）によりタンパク質が電極に引き
つけられるので、電界を加えないときに比べて短時間に
タンパク質を電極に固定することができる。Thus, by applying an electric field to the substrate, the protein is attracted to the electrode by an external force (Coulomb force), so that the protein can be fixed to the electrode in a shorter time than when the electric field is not applied.
【００４４】[0044]
【発明の効果】以上説明したように、本発明は、基板に
強固された、活性の高いタンパク質から構成されるバイ
オセンサーを提供する。さらに、溌水性の単分子膜を使
用した場合、測定溶液中の不純物がバイオセンサーに固
着することを防ぐという効果を持つ。また、本発明のバ
イオセンサーの製造方法は、化学固定法の時の様なタン
パク質の化学修飾がいらなく、簡便であるので、歩留ま
り良くバイオセンサーを製造できる。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the present invention provides a biosensor composed of a highly active protein, which is immobilized on a substrate. Furthermore, when a water-repellent monolayer is used, it has the effect of preventing impurities in the measurement solution from sticking to the biosensor. Further, the method for producing a biosensor of the present invention does not require chemical modification of proteins as in the case of the chemical immobilization method and is simple, and therefore the biosensor can be produced with good yield.
【図１】本発明のバイオセンサーの概念図FIG. 1 is a conceptual diagram of a biosensor of the present invention.
【図２】本発明のバイオセンサーの概念図FIG. 2 is a conceptual diagram of the biosensor of the present invention.
【図３】（ａ）は基板にクロロシラン分子とマスク分子
の固定された状態を示す概念図 （ｂ）はマスク分子が除去された状態を示す概念図FIG. 3A is a conceptual diagram showing a state in which chlorosilane molecules and mask molecules are fixed on a substrate, and FIG. 3B is a conceptual diagram showing a state in which mask molecules are removed.
【図４】細胞膜に固定されたタンパク質を示す概念図FIG. 4 is a conceptual diagram showing proteins immobilized on cell membranes.
【図５】チトクロームＣの固定された電極を用いて測定
したサイクリックボルタモブラムを示す図FIG. 5 is a diagram showing cyclic voltamobram measured using an electrode on which cytochrome C is immobilized.
【図６】チトクロームＣの固定された電極を用いて測定
したサイクリックボルタモブラムを示す図FIG. 6 is a diagram showing cyclic voltamobram measured using an electrode on which cytochrome C is immobilized.
１ タンパク質 ２ 基板に結合したＯＴＳ ３ 基板 ４ 有機薄膜 １１ マスク分子の疎水性部分 １２ マスク分子の親水性部分 １３ 基板に結合したＯＴＳ １４ ピンホール ２０ タンパク質 ２１ 細胞膜を形成する分子の親水性の部分 ２２ 細胞膜を形成する分子の疎水性の部分 1 protein 2 OTS 3 substrate bound to substrate 4 organic thin film 11 hydrophobic part of mask molecule 12 hydrophilic part of mask molecule 13 OTS 14 bound to substrate pinhole 20 protein 21 hydrophilic part of molecule forming cell membrane 22 The hydrophobic part of the molecule that forms the cell membrane
Claims (3)
が基板上に固定されたバイオセンサーにおいて、前記セ
ンサー分子が前記有機薄膜内の穴に固定されていること
を特徴とするバイオセンサー。1. A biosensor in which a protein as a sensor molecule and an organic thin film are immobilized on a substrate, wherein the sensor molecule is immobilized in a hole in the organic thin film.
されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセン
サー。2. The biosensor according to claim 1, wherein the organic thin film is fixed to the substrate by Si-0 bond.
し、前記電極をタンパク質溶液に浸漬しながら前記電極
に一定電圧を印加することを特徴とするバイオセンサー
の製造方法。3. A method for manufacturing a biosensor, comprising fixing an organic thin film having a pinhole on an electrode and applying a constant voltage to the electrode while immersing the electrode in a protein solution.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6267169A JPH08128987A (en) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Biosensor and its manufacture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6267169A JPH08128987A (en) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Biosensor and its manufacture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08128987A true JPH08128987A (en) | 1996-05-21 |
Family
ID=17441067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6267169A Pending JPH08128987A (en) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Biosensor and its manufacture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08128987A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7223330B2 (en) | 2000-03-30 | 2007-05-29 | Siemens Aktiengesellschaft | Biosensor, biosensor array and method for detecting macromolecular biopolymers with a biosensor |
-
1994
- 1994-10-31 JP JP6267169A patent/JPH08128987A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7223330B2 (en) | 2000-03-30 | 2007-05-29 | Siemens Aktiengesellschaft | Biosensor, biosensor array and method for detecting macromolecular biopolymers with a biosensor |
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