JPH08116998A - Nucleic acid fragment having reverse complementary chain base sequence of paptial sequence of bordetella bronchiseptica 23s ribosome rna gene and detection of bordetella bronchiseptica using the same fragment - Google Patents
Nucleic acid fragment having reverse complementary chain base sequence of paptial sequence of bordetella bronchiseptica 23s ribosome rna gene and detection of bordetella bronchiseptica using the same fragmentInfo
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- JPH08116998A JPH08116998A JP6255654A JP25565494A JPH08116998A JP H08116998 A JPH08116998 A JP H08116998A JP 6255654 A JP6255654 A JP 6255654A JP 25565494 A JP25565494 A JP 25565494A JP H08116998 A JPH08116998 A JP H08116998A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はボルデテラ・ブロンキセ
プチカの２３ＳリボゾームＲＮＡ（以下、２３Ｓ rＲＮ
Ａと記す）遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有す
る核酸断片、及びそれらを用いるボルデテラ・ブロンキ
セプチカの検出法及び検出用キットに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to 23S ribosomal RNA of Bordetella bronchiseptica (hereinafter 23S rRN).
(A) A nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of a gene, a method for detecting Bordetella bronchiseptica using the same, and a detection kit.
【０００２】[0002]
【従来技術】ボルデテラ・ブロンキセプチカは豚、犬、
ウサギ、モルモット、ラット及び七面鳥等の多種の動物
に感染し、保菌されている。とりわけ、豚においてはそ
の養豚規模が拡大するにつれ各種の慢性呼吸器疾患の発
生が増加しており、その最大の特徴である萎縮性鼻炎
(Atrophic rhinitis;以下ＡＲと略す) は、我国のみな
らず世界の豚群で広く発生している。本病は、鼻甲介骨
の萎縮・欠損及び顔面の変形のみならず、二次的に他の
呼吸器感染症の誘発、発育の遅延などにより、大きな経
済的損失を招いている。本菌感染の診断法としては、動
物の患部からの直接分離法、あるいは対象動物から凝集
抗体を検出する血清学的診断方法が行われている。しか
し、血清学的診断方法では、ワクチンを接種した対象動
物では用いることができず、診断的意義は小さい。確実
な診断法は本菌を直接分離・同定する方法である。本菌
は、グラム陰性の小桿菌で、主な生化学的性状としては
ブドウ糖分解能陰性、尿素分解能陽性、クエン酸塩利用
能陽性などがあげられる。但し、これらの性状の検査に
は熟練と日数を必要とすることから、本発明者は新たな
方法を模索し、リボゾームRNA （以下rRNAと略す）を対
象としたハイブリダイゼーション法によりボルデテラ・
ブロンキセプチカの高感度・特異的検出に成功した（隣
接ハイブリダイゼーション法、特願平６−０６１４６７
号）。本方法は操作性・信頼性ともに非常に優れている
ことが様々な試験で立証されている。BACKGROUND OF THE INVENTION Bordetella Bronchiseptica is a pig, dog,
It has been infected with various animals such as rabbits, guinea pigs, rats and turkeys and is colonized. In particular, the number of chronic respiratory diseases in pigs is increasing as the scale of pig farming expands, and the most characteristic feature is atrophic rhinitis.
(Atrophic rhinitis; hereinafter abbreviated as AR) has widely occurred not only in Japan but also in the world herds. This disease causes not only atrophy / deficiency of the turbinate bone and deformity of the face, but also secondary induction of other respiratory infections, delay of growth, and the like, which causes a large economic loss. As a method for diagnosing the infection of the present bacterium, a method for direct isolation from an affected part of an animal or a serological method for detecting an aggregated antibody in a target animal is performed. However, the serological diagnosis method cannot be used in a vaccinated target animal, and its diagnostic significance is small. A reliable diagnostic method is a method of directly isolating and identifying this bacterium. This bacterium is a Gram-negative bacillus, and its major biochemical properties include glucose degrading negative, urea degrading positive, and citrate utilization positive. However, since the examination of these properties requires skill and days, the present inventor sought a new method, and performed a hybridization method for ribosomal RNA (hereinafter, abbreviated as rRNA) by the Bordetella
We succeeded in highly sensitive and specific detection of Bronchiseptica (adjacent hybridization method, Japanese Patent Application No. 6-061467).
issue). Various tests have proved that this method is very excellent in operability and reliability.
【０００３】しかしながら、上記方法に於いて用いた特
異的検出用プローブを使用する際にわずかに問題点が見
出された。非常にまれなケースであったが、ある種の細
菌、具体的にはアルカリゲネス・シュードアルカリゲネ
ス（以下 A. pseudoalcaligenes と略す）の野外分離菌
の一部でわずかに交叉性が示されたのである。検出感度
の上からはボルデテラ・ブロンキセプチカに比べ１／２
０以下と非常に低いので比較検討は容易であるが、多量
の混在菌の影響をなくすために、本発明者は上記方法に
おいては、相当量の菌体を用いても検出値がバックグラ
ウンドレベルであるということを「交叉しない」という
定義として用いているため、用いたプローブには若干の
問題があるといえる。However, a slight problem was found when using the specific detection probe used in the above method. Although it was an extremely rare case, some cross-reactivity was shown in some of the field isolates of certain bacteria, specifically Alcaligenes pseudoalcaligenes (hereinafter abbreviated as A. pseudoalcaligenes). 1/2 compared to Bordetella bronchiseptica in terms of detection sensitivity
Since it is very low as 0 or less, comparative examination is easy, but in order to eliminate the influence of a large amount of mixed bacteria, the present inventor used the above method in which the detected value was at a background level even when a considerable amount of bacterial cells was used. Since it is used as the definition of "no crossover", it can be said that the probe used has some problems.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ボル
デテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺伝子の部分
配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカを特異的にかつ高感度で検
出することができる核酸断片、及びそれらを用いてボル
デテラ・ブロンキセプチカを特異的に高感度で検出する
方法、さらに検出用キットを提供することである。The object of the present invention is a nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S rRNA gene, which specifically detects with high sensitivity. The present invention provides a nucleic acid fragment which can be used, a method for specifically detecting Bordetella bronchiseptica with high sensitivity, and a detection kit.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者は上記問題を解
決するために、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓr
ＲＮＡに対する新たなプローブを模索し研究を行なっ
た。その結果、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ r
ＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する特
定の核酸断片を見出し、該核酸断片をプローブとして用
いることによって、A. pseudoalcaligenesとの交叉性を
完全にバックグラウンドレベルに落とすことに成功し
た。さらに他の菌との交叉性がなく、かつ偽陰性が出な
いという条件も満たすものである。従って本発明は、ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺伝子の部
分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、
下記の式Ｉで表される配列のうち連続した少なくとも10
塩基を含む核酸断片である。 式Ｉ 5'-CTCTGCATTC GTCTACAGGG 本発明の核酸断片の１具体例として、下記配列番号１で
示されるＤＮＡ断片が挙げられる。 配列番号１ CTCTGCATTC GTCTACAGGG 本発明はまた、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ r
ＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核
酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ
rＲＮＡ上で上記核酸断片の3'側もしくは5'側に隣接し
てハイブリダイゼーションする核酸断片である。このよ
うな核酸断片の１具体例として、上記配列番号１のＤＮ
Ａ断片に隣接してハイブリダイゼーションする下記配列
番号２で示されるＤＮＡ断片が挙げられる。 配列番号２ TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C 本発明の核酸断片は１０塩基以上で、好ましくは１５〜
５０塩基である。In order to solve the above problems, the present inventor has developed a Bordetella bronchiseptica 23Sr.
Research was conducted in search of a new probe for RNA. As a result, Bordetella bronchiseptica 23S r
By finding a specific nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of the RNA gene and using the nucleic acid fragment as a probe, the crossability with A. pseudoalcaligenes was successfully reduced to the background level. Furthermore, it also satisfies the conditions that there is no crossability with other bacteria and that no false negatives occur. Therefore, the present invention provides a nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S rRNA gene,
At least 10 contiguous sequences of formula I below
A nucleic acid fragment containing a base. Formula I 5′-CTCTGCATTC GTCTACAGGG One specific example of the nucleic acid fragment of the present invention is the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 1 below. SEQ ID NO: 1 CTCTGCATTC GTCTACAGGG The present invention also provides Bordetella bronchiseptica 23S r.
A nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence of a partial sequence of an RNA gene, which comprises Bordetella bronchiseptica 23S
It is a nucleic acid fragment which hybridizes on rRNA adjacent to the 3'side or 5'side of the above nucleic acid fragment. As one specific example of such a nucleic acid fragment, DN of the above SEQ ID NO: 1
An example is a DNA fragment represented by the following SEQ ID NO: 2 which hybridizes adjacent to the A fragment. SEQ ID NO: 2 TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C The nucleic acid fragment of the present invention has 10 bases or more, preferably 15 to
It has 50 bases.
【０００６】本発明の核酸断片は、本発明者らが先に開
発した隣接ハイブリダイゼーション法（特願平６−０６
１４６７号明細書）に使用することができる。この隣接
ハイブリダイゼーション法とは、２種の核酸プローブを
用いたＲＮＡの検出方法において、被検ＲＮＡの塩基配
列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆
相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列
（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）
の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プロ
ーブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標
識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プロー
ブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検
ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズ
させ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を
検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出することを
特徴とする方法である。上記配列（Ａ）と配列（Ｂ）が
完全に隣接していることが最も好ましい。The nucleic acid fragment of the present invention is obtained by the adjacent hybridization method previously developed by the present inventors (Japanese Patent Application No. 6-06).
1467). The adjacent hybridization method is a method of detecting RNA using two kinds of nucleic acid probes, and is a reverse complementary strand DNA or RNA of a partial sequence (A) of 10 or more specific bases of the base sequence of the test RNA. And a partial sequence (B) of 10 bases or more existing in the vicinity of the partial sequence (A) on the test RNA
The reverse complementary strand DNA or RNA of 1 is prepared, one is immobilized on a carrier as a capture probe, the other is labeled with a labeling substance to form a labeled probe, and a sample containing a test RNA and a labeled probe are immobilized on the carrier. A method comprising detecting the presence of the test RNA by contacting the probe with the test RNA to hybridize the capture probe and the labeled probe, and detecting the labeling substance of the labeled probe bound to the test RNA. is there. Most preferably, the sequences (A) and (B) are completely adjacent to each other.
【０００７】従って本発明はまた、上記２種の核酸断片
の一方を標識プローブとして、もう一方を担体に固定し
た捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーション法
を行いボルデテラ・ブロンキセプチカを検出することを
特徴とするボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法に関
し、さらに具体的には上記配列番号１で表わされるＤＮ
Ａを標識プローブとして、上記配列番号２で表わされる
ＤＮＡを捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーシ
ョン法を行いボルデテラ・ブロンキセプチカを検出する
ことを特徴とするボルデテラ・ブロンキセプチカの検出
法を提供する。Therefore, the present invention is also characterized in that one of the above-mentioned two nucleic acid fragments is used as a labeled probe and the other is used as a capture probe immobilized on a carrier to carry out a hybridization method to detect Bordetella bronchiseptica. Regarding a method for detecting Bordetella bronchiseptica, more specifically, DN represented by SEQ ID NO: 1 above
Provided is a method for detecting Bordetella bronchiseptica, which comprises performing hybridization using A as a labeled probe and the DNA represented by SEQ ID NO: 2 as a capture probe to detect Bordetella bronchiseptica.
【０００８】本発明はまた、下記の成分を含む、上記方
法に使用するための検出用キットを提供する。 （イ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺
伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片で
あって、上記式Ｉで表される配列のうち連続した少なく
とも10塩基を含む核酸断片を固定化した担体； （ロ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺
伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片で
あって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ
上で上記（イ）の核酸断片の3'側もしくは5'側に隣接し
てハイブリダイゼーションする核酸断片であって、標識
物質で標識された核酸断片； （ハ）標識物質を検出するための試薬；及び （ニ）ハイブリダイゼーション溶液The present invention also provides a detection kit for use in the above method, which comprises the following components. (A) A carrier having a nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S rRNA gene, wherein the nucleic acid fragment containing at least 10 consecutive bases in the sequence represented by the above formula I is immobilized. (B) a nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S rRNA, the Bordetella bronchiseptica 23S rRNA
A nucleic acid fragment which is hybridized adjacent to the 3'side or 5'side of the nucleic acid fragment of (a) above and is labeled with a labeling substance; (c) a reagent for detecting a labeling substance And (d) hybridization solution
【０００９】本発明はまた、下記の成分を含む、上記方
法に使用するための検出用キットを提供する。 （イ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺
伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片で
あって、上記式Ｉで表される配列のうち連続した少なく
とも10塩基を含む核酸断片であって、標識物質で標識さ
れた核酸断片； （ロ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ遺
伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片で
あって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ rＲＮＡ
上で上記（イ）の核酸断片の3'側もしくは5'側に隣接し
てハイブリダイゼーションする核酸断片を固定化した担
体； （ハ）標識物質を検出するための試薬；及び （ニ）ハイブリダイゼーション溶液 これらの検出用キットにおいて使用する核酸断片の好ま
しい例として、配列番号１のＤＮＡと配列番号２のＤＮ
Ａが挙げられ、さらに好ましくは配列番号１のＤＮＡが
標識プローブとして、配列番号２のＤＮＡが担体に固定
した捕捉プローブとして使用される。The present invention also provides a detection kit for use in the above method, which comprises the following components. (A) A nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S rRNA gene, which comprises at least 10 consecutive bases of the sequence represented by the above formula I, and is labeled A nucleic acid fragment labeled with a substance; (b) a nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of the Bordetella bronchiseptica 23S rRNA gene, the Bordetella bronchiseptica 23S rRNA
A carrier on which a nucleic acid fragment that hybridizes adjacent to the 3'side or 5'side of the nucleic acid fragment of (a) above is immobilized; (c) a reagent for detecting a labeling substance; and (d) hybridization. Solution Preferred examples of the nucleic acid fragment used in these detection kits include DNA of SEQ ID NO: 1 and DN of SEQ ID NO: 2.
A is more preferable, and the DNA of SEQ ID NO: 1 is more preferably used as a labeled probe, and the DNA of SEQ ID NO: 2 is used as a capture probe fixed to a carrier.
【００１０】標識プローブの調製法は特定されるもので
はなく、標識物質としては、例えばジゴキシゲニン、ビ
オチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等
が挙げられる。捕捉プローブは適当な担体に固定すれば
よく、担体としては、例えば核酸との結合性が高い有機
ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを
用いることができる。捕捉プローブの固定法は特に限定
されるものでないが、例えば、上記のプレートに捕捉プ
ローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照
射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデ
ヒド法などの共有結合法を用いてもよい。次に被検 rＲ
ＮＡを含む試料と標識プローブを該担体に固定された捕
捉プローブと接触させて被検 rＲＮＡと捕捉プローブ及
び標識プローブをハイブリダイズさせる。次いで被検 r
ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出するこ
とにより被検 rＲＮＡを検出する。The method for preparing the labeled probe is not specified, and examples of the labeling substance include digoxigenin, biotin, deoxyuridine bromide, fluoroescein and the like. The capture probe may be immobilized on a suitable carrier, and as the carrier, for example, a microtiter plate made of an organic polymer having a high binding property to a nucleic acid can be used. The method of immobilizing the capture probe is not particularly limited. For example, a method of placing the capture probe DNA or RNA solution in the above plate, drying it, and then immobilizing it by ultraviolet irradiation, or a covalent bond method such as the glutaraldehyde method. May be used. Next to be tested rR
The sample containing NA and the labeled probe are brought into contact with the capture probe immobilized on the carrier to hybridize the test rRNA with the capture probe and the labeled probe. Then test r
The test rRNA is detected by detecting the labeling substance of the labeled probe bound to RNA.
【００１１】被検 rＲＮＡの調製法は、特定されるもの
ではないが、安全かつ簡便におこなるためには、例えば
水酸化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸
などで中和すればよい。調製された rＲＮＡ溶液を、標
識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加
え、一般に１５〜６０℃で３分〜１８時間程度ハイブリ
ダイゼーションを行う。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄
し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたもの
を加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質
は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビ
オチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサ
ビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、ジゴキ
シゲニン(Dig) で標識されている場合には抗Dig 免疫グ
ロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用い
ることができる。適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適
当な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものでは
ないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場
合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質と
することによって青色の反応産物を得ることができる。
勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもできる。
洗浄液１、２は特定されるものではないが、例えば0.05
% 程度の界面活性剤を含む生理食塩水などを用いること
ができる。The method for preparing the test rRNA is not specified, but in order to perform it safely and simply, for example, cells may be lysed with an aqueous solution of sodium hydroxide and then neutralized with hydrochloric acid or the like. . The prepared rRNA solution is added together with the labeled probe onto the carrier on which the capture probe has been immobilized, and hybridization is generally performed at 15 to 60 ° C. for about 3 minutes to 18 hours. After washing with an appropriate solution (washing solution 1), a substance that binds to the labeled compound and an enzyme bound thereto are added and reacted for a certain period of time. The substance that binds to the labeled compound is not specified.For example, when the labeled probe is labeled with biotin, a mixture of biotin-conjugated horseradish peroxidase and avidin, or when labeled with digoxigenin (Dig). Can be a conjugate of anti-Dig immunoglobulin and horseradish peroxidase. After washing with an appropriate solution (washing solution 2), an appropriate enzyme substrate is added. The enzyme substrate is not specified. For example, when horseradish peroxidase is used, a blue reaction product can be obtained by using tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide as substrates.
Of course, a fluorescent substrate, a luminescent substrate, etc. can also be used.
The cleaning liquids 1 and 2 are not specified, but are, for example, 0.05
It is possible to use a physiological saline solution or the like containing a surfactant of about%.
【００１２】以下、例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例１ ボルデテラ・ブロンキセプチカ特異プローブ
の作製とハイブリダイゼーションによる検出 配列番号１、２、３及び４で示されるＤＮＡをＤＮＡ合
成装置(PCR−MATE モデル391 、ＡＢＩ社）を用いて合
成した。配列番号２及び４のＤＮＡは担体への捕捉用プ
ローブ、配列番号１及び３は標識プローブとして用い
た。配列番号２のＤＮＡはボルデテラ・ブロンキセプチ
カ２３Ｓ rＲＮＡ上で配列番号１の5'側に隣接してハイ
ブリダイゼーションする配列である。また、配列番号３
及び４のセットは特願平６−０６１４６７号で実施例と
して示した配列のＤＮＡである。 配列番号３ CTTTCCTGCC AAAAGTGCTT TCCAA 配列番号４ GGATATTAGC CCGTGCCGTT T 捕捉用ＤＮＡとして使用する配列番号２及び４のＤＮＡ
ををれぞれ、0.02μg/μl になるように50mM リン酸ナ
トリウムバッファー,pH8.0に溶かし、これをマイクロタ
イタープレート（住友ベークライト製、MS-3608FA)の各
ウェルに50μl加え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ
/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM 塩
化ナトリウム(2xSSC) 200 μl で３、４回洗浄し乾燥さ
せた。標識プローブは配列番号１及び配列番号３のＤＮ
Ａを各々、下記表１の組成の反応液でジゴキシゲニン
（Dig)標識したものを用いた。The present invention will be described in more detail below with reference to examples. Example 1 Preparation of Bordetella bronchiseptica-specific probe and detection by hybridization The DNAs shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 were synthesized using a DNA synthesizer (PCR-MATE model 391, ABI). The DNAs of SEQ ID NOS: 2 and 4 were used as probes for capturing on a carrier, and the SEQ ID NOS: 1 and 3 were used as labeled probes. The DNA of SEQ ID NO: 2 is a sequence that hybridizes adjacent to the 5'side of SEQ ID NO: 1 on Bordetella bronchiseptica 23S rRNA. Also, SEQ ID NO: 3
And the set of 4 are DNAs having the sequences shown as examples in Japanese Patent Application No. 6-061467. SEQ ID NO: 3 CTTTCCTGCC AAAAGTGCTT TCCAA SEQ ID NO: 4 GGATATTAGC CCGTGCCGTT T DNAs of SEQ ID NOs: 2 and 4 used as capture DNA
Dissolve each in 0.02 μg / μl in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, add 50 μl to each well of a microtiter plate (Sumitomo Bakelite, MS-3608FA), and add at 80 ° C. dry. 120mJ UV
After irradiation with / cm 2, the cells were washed 3 and 4 times with 200 μl of 30 mM sodium citrate / 300 mM sodium chloride (2xSSC) and dried. The labeled probe is DN of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
Each A was labeled with digoxigenin (Dig) with the reaction solution having the composition shown in Table 1 below.
【００１３】[0013]
【表１】 ────────────────────────────────── カコジル酸カリウム緩衝液、pH7.2 0.1M 塩化コバルト 2mM ジチオスレイトール 0.2mM デオキシアデノシン３リン酸ナトリウム 1mM ジゴキシゲニン化デオキシウリジン３リン酸 0.2mM プローブ用ＤＮＡ ３μg ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 50-100U 反応液量 20μl ──────────────────────────────────[Table 1] ────────────────────────────────── Potassium cacodylate buffer, pH 7.2 0.1M Chloride Cobalt 2mM Dithiothreitol 0.2mM Deoxyadenosine triphosphate 1mM Digoxigenated deoxyuridine triphosphate 0.2mM Probe DNA 3μg Terminal deoxynucleotidyl transferase 50-100U Reaction volume 20μl ──────────── ───────────────────────
【００１４】標識後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容の4M
LiCl 、３μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタノー
ルを加え-80 ℃、一晩放置した。遠心分離により沈殿を
集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、100 μl
の10mM Tris 塩酸,pH8/1mMエチレンジアミンテトラ四酢
酸ナトリウム塩 (TE) に溶かした。得られた標識プロー
ブの一定量を表２に示すハイブリダイゼーションバッフ
ァーと混合した（標識プローブ液）。After labeling, 1/10 volume of 0.2M EDTA, 1/10 volume of 4M
LiCl, 3 μg of glycogen and 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was left at -80 ° C. overnight. The precipitate was collected by centrifugation, washed with 70% ethanol and dried, then 100 μl
Was dissolved in 10 mM Tris hydrochloric acid, pH 8/1 mM ethylenediaminetetratetraacetic acid sodium salt (TE). A certain amount of the obtained labeled probe was mixed with the hybridization buffer shown in Table 2 (labeled probe solution).
【００１５】[0015]
【表２】 ハイブリダイゼーションバッファー ────────────────────────────────── SSC (*) 2x ホルムアミド 30% ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社) 1% ドデシル硫酸ナトリウム 0.2% イースト 転移RNA 100μg/ml 鮭*** DNA (**) 100μg/ml 標識プローブ 37.5ng/50μl となるように 加える ────────────────────────────────── (*) 0.15M塩化ナトリウム/0.015M クエン酸ナトリウム (**) あらかじめ100C、10分の変性処理を行う。[Table 2] Hybridization buffer ────────────────────────────────── SSC (*) 2x Formamide 30% blocking Reagent (Boehringer Mannheim) 1% Sodium dodecyl sulfate 0.2% Yeast transfer RNA 100 μg / ml Salmon sperm DNA (**) 100 μg / ml Labeled probe 37.5 ng / 50 μl Add ──────────── ──────────────────────── (*) 0.15M sodium chloride / 0.015M sodium citrate (**) Denaturation treatment at 100C for 10 minutes beforehand To do.
【００１６】各種細菌からの被検 rＲＮＡは全て平板培
地上のコロニーから調製した。即ち、ボルデテラ・ブロ
ンキセプチカ及びA. pseudoalcaligenes 野外分離株
は、ヒツジ血液加ボルデジャング寒天培地で培養しコロ
ニーを得た。他の菌については、特に記載はしないが、
それぞれの菌で通常用いられている寒天培地を用いた。
菌の集落を爪楊枝でとり、0.11mlのリン酸生理食塩水(P
BS) に懸濁した。うち10μl をとり適当に生理食塩水で
希釈し、それぞれの菌で用いられる平板培地に塗抹して
菌数を測定した。これに12.5μl の１Ｎ水酸化ナトリウ
ムを加え37℃、10分放置後、12.5μl の1N塩酸/0.2M リ
ン酸バッファーを加え中和した。ハイブリダイゼーショ
ンとその検出は以下のようにして行なった。即ち、各種
菌溶菌液50μl と標識プローブ液50μl を捕捉ＤＮＡが
固定されたマイクロタイタープレートに入れ、37℃、２
時間静置した。0.05% Tween20 を含む生理食塩水（洗浄
液）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液 (1% ブロッ
キング試薬, 20mMTris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl) で10,00
0倍に希釈した抗Dig ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ(HRP、ベーリンガーマンハイム社製) 100 μl
を加え30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液
（Ａ液：0.12% 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1
M 酢酸ナトリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ
液：0.03% 過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ
液を１：１で混合)100μl を加え5-15分放置した。得ら
れた青色液の吸光度を660nm の波長で測定した。下記表
３にその結果を示す。All test rRNAs from various bacteria were prepared from colonies on a plate medium. That is, the Bordetella bronchiseptica and A. pseudoalcaligenes field isolates were cultured in sheep blood-supplemented Bordejang agar medium to obtain colonies. About other bacteria, although not particularly described,
The agar medium commonly used for each bacterium was used.
Take the bacterial colony with a toothpick and use 0.11 ml of phosphate saline (P
BS). 10 μl of this was diluted appropriately with physiological saline, and smeared on a plate medium used for each bacterium to measure the number of bacteria. To this, 12.5 μl of 1N sodium hydroxide was added, and after standing at 37 ° C. for 10 minutes, 12.5 μl of 1N hydrochloric acid / 0.2M phosphate buffer was added to neutralize. Hybridization and its detection were performed as follows. That is, 50 μl of various bacterial lysates and 50 μl of labeled probe solution were placed in a microtiter plate on which capture DNA was immobilized, and the mixture was kept at 37 ° C. for 2 minutes.
Let stand for hours. After washing 3 times with physiological saline containing 0.05% Tween20 (washing solution), use blocking solution (1% blocking reagent, 20mM Tris-HCl, pH7.5 / 0.15M NaCl) for 10,00
Anti-Dig sheep antibody diluted 0-fold-horseradish peroxidase (HRP, Boehringer Mannheim) 100 μl
After leaving it for 30 minutes, wash it 3 times with the washing solution, and then use the coloring substrate solution (Solution A: 0.12% 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine / 0.1
M sodium acetate, pH 5/30% dimethylformamide, B
Liquid: 0.03% hydrogen peroxide / 0.2% phosphoric acid, liquids A and B when used
The solution was mixed at a ratio of 1: 1), 100 μl was added, and the mixture was allowed to stand for 5 to 15 minutes. The absorbance of the obtained blue liquid was measured at a wavelength of 660 nm. The results are shown in Table 3 below.
【００１７】[0017]
【表３】 ──────────────────────────────── 菌 名 吸光度 捕捉用DNA と標識DNA のセット 配列番号1,2 配列番号 3,4 ──────────────────────────────── B. bronchiseptica S1 >3 >3 B. bronchiseptica ATCC4617 >3 >3 A. pseudoalcaligenes 野外分離株 <0.02 0.05〜0.2 P. multocida KOBE5 <0.02 <0.02 P. multocida KOBE6 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae Shope4074 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae S1536 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae Hi-1 <0.02 <0.02 M. hyopneumoniae ST-11 <0.02 <0.02 E. coli JM109 <0.02 <0.02 E. coli NIHJ <0.02 <0.02 P. aeruginosa ATCC9721 <0.02 <0.02 K. pneumoniae ATCC10031 <0.02 <0.02 S. Typhimurium LT-2 <0.02 <0.02 S. aureus ATCC25923 <0.02 <0.02 E. cloacae ATCC 13047 <0.02 <0.02 C. freundii ATCC8090 <0.02 <0.02 S. sonnei ATCC25931 <0.02 <0.02 ──────────────────────────────── いずれの菌も菌数は1010/ml以上[Table 3] ──────────────────────────────── Bacterial name Absorbance Set of capture DNA and labeled DNA SEQ ID NO: 1 , 2 SEQ ID NO: 3,4 ──────────────────────────────── B. bronchiseptica S1> 3> 3 B. bronchiseptica ATCC4617> 3> 3 A. pseudoalcaligenes Field isolates <0.02 0.05 to 0.2 P. multocida KOBE5 <0.02 <0.02 P. multocida KOBE6 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae Shope4074 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae S1536 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae Hi-1 <0.02 <0.02 M. hyopneumoniae ST-11 <0.02 <0.02 E. coli JM109 <0.02 <0.02 E. coli NIHJ <0.02 <0.02 P. aeruginosa ATCC9721 <0.02 <0.02 K. pneumoniae ATCC10031 <0.02 <0.02 S. Typhimurium LT-2 <0.02 <0.02 S. aureus ATCC25923 <0.02 <0.02 E. cloacae ATCC 13047 <0.02 <0.02 C. freundii ATCC8090 <0.02 <0.02 S. sonnei ATCC25931 <0.02 <0.02 ─────── ─────────────────────── ── The number of bacteria is 1010 / ml or more
【００１８】表３の結果より、本発明の核酸断片を標識
プローブ、捕捉プローブとして使用することによって、
A. pseudoalcaligenes 野外分離株を含めその他の菌と
の交叉性をバックグラウンドレベルに落としてボルデテ
ラ・ブロンキセプチカを特異的に検出することができる
ことがわかる。From the results shown in Table 3, by using the nucleic acid fragment of the present invention as a labeled probe and a capture probe,
It can be seen that Bordetella bronchiseptica can be specifically detected by reducing the crossability with other bacteria including A. pseudoalcaligenes field isolates to the background level.
【００１９】実施例２ 以下の成分を含む、約５００検体分のキットを作成し
た。 ──────────────────────────────────── 変性液 １Ｍ水酸化ナトリウム ５ml 中和液 １Ｍ塩酸／０．２Ｍリン酸緩衝液 ５ml 検出用プレ−ト 〔補捉プロ−ブＤＮＡ（１μｇ／ウエル）を 固定した９６穴プレ−ト〕 ５枚＋アルファ ハイブリダイゼ−ション緩衝液 表２に記載のもの 10ml 酵素抗体 抗Ｄｉｇ抗体−パ−オキシダ−ゼ （ベ−リンガ−・マンハイム社製） 0.5ml 酵素抗体希釈液 実施例１記載のもの 50ml 酵素基質溶液 Ａ液 実施例１記載のもの 25ml 酵素基質溶液 Ｂ液 実施例１記載のもの 25ml 洗浄液 実施例１記載のもの 1000ml ジゴキシデニン標識プローブＤＮＡ 10μg ────────────────────────────────────Example 2 A kit for about 500 samples containing the following components was prepared. ──────────────────────────────────── Denaturing solution 1M Sodium hydroxide 5ml Neutralizing solution 1M Hydrochloric acid / 0 . 2M phosphate buffer 5 ml Detection plate [96-well plate on which capture probe DNA (1 µg / well) was immobilized] 5 sheets + alpha hybridization buffer 10 ml enzyme shown in Table 2 Antibody Anti-Dig antibody-peroxidase (manufactured by Behringer Mannheim) 0.5 ml Enzyme antibody diluent 50 ml Enzyme substrate solution A solution 25 ml Enzyme substrate solution B solution described in Example 1 25 ml washing solution described in Example 1 1000 ml described in Example 1 1000 ml digoxidenine-labeled probe DNA 10 μg ─────────────────────────────── ──────
【００２０】[0020]
【発明の効果】本発明の核酸断片を標識プローブ、捕捉
プローブとして用いハイブリダイゼションを行うことに
より、A. pseudoalcaligenes及びその他の菌との交叉性
をバックグラウンドレベルに落とし、かつ偽陰性もな
く、ボルデテラ・ブロンキセプチカを特異的に検出する
ことができる。EFFECTS OF THE INVENTION By carrying out hybridization using the nucleic acid fragment of the present invention as a labeled probe and a capture probe, crossability with A. pseudoalcaligenes and other bacteria is reduced to a background level, and there is no false negative. , Bordetella bronchiseptica can be specifically detected.
【００２１】[0021]
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCTGCATTC GTCTACAGGG 20 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence CTCTGCATTC GTCTACAGGG 20
【００２２】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C 21 SEQ ID NO: 2 Sequence Length: 21 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C 21
【００２３】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTCCTGCC AAAAGTGCTT TCCAA 25 SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 25 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence CTTTCCTGCC AAAAGTGCTT TCCAA 25
【００２４】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGATATTAGC CCGTGCCGTT T 21 SEQ ID NO: 4 Sequence Length: 21 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence GGATATTAGC CCGTGCCGTT T 21
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 種田 貴至 千葉県山武郡山武町椎崎968番地−18 (72)発明者 並松 孝憲 千葉県市川市若宮２−11−11 全農中山寮─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:01) (C12Q 1/04 C12R 1:01) C12R 1 : 01) (72) Inventor Takashi Taneda, 968 Shiizaki, Sanmu-cho, Sanmu-gun, Chiba Prefecture (18) (72) Takanori Namimatsu, 2-11-11 Wakamiya, Ichikawa-shi, Chiba Zenroku Nakayama Dormitory
Claims (6)
ボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を
有する核酸断片であって、下記の式Ｉで表される配列の
うち連続した少なくとも10塩基を含む核酸断片。 式Ｉ 5'-CTCTGCATTC GTCTACAGGG1. A nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S ribosomal RNA gene, which comprises at least 10 consecutive bases of the sequence represented by the following formula I. Formula I 5'-CTCTGCATTC GTCTACAGGG
ボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を
有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチ
カ２３ＳリボゾームＲＮＡ上で請求項１記載の核酸断片
の3'側もしくは5'側に隣接してハイブリダイゼーション
する核酸断片。2. A nucleic acid fragment having a reverse complementary chain base sequence of a partial sequence of Bordetella bronchiseptica 23S ribosomal RNA gene, which is 3'side or 5'of the nucleic acid fragment of claim 1 on Bordetella bronchiseptica 23S ribosomal RNA. A nucleic acid fragment that hybridizes adjacent to the 'side.
プローブとして、もう一方を担体に固定した捕捉プロー
ブとして用いてハイブリダイゼーション法を行いボルデ
テラ・ブロンキセプチカを検出することを特徴とするボ
ルデテラ・ブロンキセプチカの検出法。3. A Bordetella bronchiseptica is detected by performing a hybridization method using one of the nucleic acid fragments of claims 1 and 2 as a labeled probe and the other as a capture probe fixed to a carrier. Method for detecting Bronchiseptica.
識プローブとして、及び下記配列番号２で表わされるＤ
ＮＡを捕捉プローブとして用いることを特徴とする請求
項３記載の検出法。 配列番号１ CTCTGCATTC GTCTACAGGG 配列番号２ TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C4. A DNA represented by SEQ ID NO: 1 below as a labeled probe, and a DNA represented by SEQ ID NO: 2 below.
The detection method according to claim 3, wherein NA is used as a capture probe. SEQ ID NO: 1 CTCTGCATTC GTCTACAGGG SEQ ID NO: 2 TTCTCTTACG CCTAGTTCCA C
に使用するための検出用キット。 （イ）請求項１記載の核酸断片を固定化した担体； （ロ）標識物質で標識された請求項２記載の核酸断片； （ハ）標識物質を検出するための試薬；及び （ニ）ハイブリダイゼーション溶液5. A detection kit for use in the method according to claim 3, which comprises the following components. (A) A carrier on which the nucleic acid fragment according to claim 1 is immobilized; (b) a nucleic acid fragment according to claim 2 labeled with a labeling substance; (c) a reagent for detecting the labeling substance; and (d) high. Hybridization solution
に使用するための検出用キット。 （イ）標識物質で標識された請求項１記載の核酸断片； （ロ）請求項２記載の核酸断片を固定化した担体； （ハ）標識物質を検出するための試薬；及び （ニ）ハイブリダイゼーション溶液6. A detection kit for use in the method according to claim 3, which comprises the following components. (A) the nucleic acid fragment according to claim 1 labeled with a labeling substance; (b) a carrier on which the nucleic acid fragment according to claim 2 is immobilized; (c) a reagent for detecting the labeling substance; and (d) high. Hybridization solution
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- 1994-10-20 JP JP25565494A patent/JP3589714B2/en not_active Expired - Lifetime
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