JPH08113596A - Carpine bonding antigen for diagnosis of alzheimer's disease - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To readily diagnose Alzheimer's diseases in human patients by measuring calpain I of the isoform activated in the biological sample originating form human patients or measuring a protein of a specific molecular weight by means of the antibody binding to calpain.

SOLUTION: As a biological sample originating from the patient, are used CSF of the low back of the patient, CSF of the ventricle, periphery blood tissue as lymphoblast tissue, the brain tissue homogenate and the like. This sample is treated and subjected to the electrophoresis with the polyacrylamide gel. As a parameter accompanied by Alzheimer's disease, activated isoform calpain I or a 70 kDa protein are determined to readily diagnose Alzheimer's disease by the increase of the patients of more than 50% in comparison with the control samples from the healthy persons.

COPYRIGHT: (C)1996,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はアルツハイマー病の
診断に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to diagnosis of Alzheimer's disease.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アルツハイマー病（ＡＤ）は一般に４５
才以上の個体に起る認識機能の荒廃的損傷である。この
病気による犠牲にかかわらず、この病気はあまり理解さ
れていないままである。ＡＤにおける痴呆の程度は、Ａ
Ｄ患者の大脳皮質に見出される老化したプラーク（ＳＰ
s）の数に関係づけられている。組織学的にはＳＰsは変
質している神経突起および反応性の神経膠星状細胞によ
り取り囲まれており、生化学的にはＳＰsはβ−アミロ
イドと呼ばれる小さい不溶性の繊維状タンパク質を含
む。正常な胎児の組織（Ｋang等、Ｎature、３２５巻、
７３３〜７３６頁、１９８７）およびＡＤの脳組織（Ｚ
ain等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８５巻、９２
９〜９３３頁、１９８８）からのβ−アミロイド遺伝子
の分子クローニングから、β−アミロイドはより大きい
前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰ
Ｐ）から誘導されることがわかった。老化したプラーク
の他に、アルツハイマー病は、神経perikaryaおよび基
部の樹状突起における豊富な神経原繊維のもつれ、およ
び海馬の錐状細胞における顆粒空胞性の変質により特徴
づけられる。Alzheimer's disease (AD) is commonly 45
It is a devastating impairment of cognitive function in individuals over the age of 20. Despite the cost of this disease, it remains poorly understood. The degree of dementia in AD is A
Aged plaque found in the cerebral cortex of patient D (SP
s). Histologically, SPs are surrounded by altered neurites and reactive astrocytes, and biochemically they contain small insoluble fibrillar proteins called β-amyloid. Normal fetal tissue (Kang et al., Nature, volume 325,
733-736, 1987) and AD brain tissue (Z
Ain et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 92
From the molecular cloning of the β-amyloid gene from pages 9-933, 1988), β-amyloid is a larger precursor protein, amyloid precursor protein (AP
It was found to be derived from P). In addition to aging plaques, Alzheimer's disease is characterized by abundant neurofibrillary tangles in neuronal perikarya and basal dendrites and granular vacuolar alterations in hippocampal pyramidal cells.

【０００３】ＡＤの原因は知られていないし、ＡＤに対
する治療法もない。さらに、前徴または症状のある患者
におけるＡＤについての診断的試験もない。ＡＤを診断
するのに用いる現在の方法は死後の患者から得た脳組織
を含む。The cause of AD is unknown and there is no cure for AD. Furthermore, there are no diagnostic tests for AD in patients with aura or symptoms. Current methods used to diagnose AD include brain tissue obtained from post-mortem patients.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】カルパインＩのドメイン
IIIと免疫複合体を形成する抗体が、アルツハイマー病
を有する個体における高レベルの活性化された形のカル
パインＩおよび７０kＤaタンパク質を検出することを我
々は見出した。[Means for Solving the Problems] Domain of Calpain I
We have found that antibodies that form immune complexes with III detect high levels of the activated form of calpain I and the 70 kDa protein in individuals with Alzheimer's disease.

【０００５】従って第１の要旨において本発明は人の患
者におけるアルツハイマー病を診断する方法を提供す
る。この方法においては、患者からの生化学的試料中の
活性化されたアイソ形（isoform）のカルパインＩまた
は７０kＤaタンパク質の量を、病気にかかっていない人
からの同じタイプの（例えば腰部または心室のＣＳＦ、
末梢血液組織、繊維芽細胞組織、脳ホモジネートまたは
皮質薄切片）対照試料中の存在する活性化されたアイソ
形のカルパインＩまたは７０kＤaの量と比較して測定す
る。対照試料のレベルより５０％、より好ましくは１５
０％、最も好ましくは３００％大きい、患者からの試料
中の活性化アイソ形カルパインＩまたは７０kＤaタンパ
ク質の相対レベルはアルツハイマー病の診断を示す。Accordingly, in a first aspect, the present invention provides a method of diagnosing Alzheimer's disease in a human patient. In this method, the amount of activated isoform of calpain I or 70 kDa protein in a biochemical sample from a patient is compared to the same type (eg, lumbar or ventricular) from an unaffected person. CSF,
Peripheral blood tissue, fibroblast tissue, brain homogenate or cortical slices) measured relative to the amount of activated isoform calpain I or 70 kDa present in control samples. 50% above control sample level, more preferably 15%
A relative level of activated isoform calpain I or 70 kDa protein in samples from patients that is 0%, most preferably 300% greater, is indicative of a diagnosis of Alzheimer's disease.

【０００６】活性化アイソ形カルパインＩのレベルまた
は７０kＤaタンパク質のレベルの測定は、活性化アイソ
形カルパインＩおよび／または７０kＤaとカルパインＩ
のドメインIIIに対する抗体との間の結合の検出を可能
にする免疫アッセイの使用により達成される。最も好ま
しくは該抗体はカルパインＩのアミノ酸３４６〜３６１
（配列表の配列番号１）を特異的に結合し、最も好まし
くは抗体はＣ−１３抗体である。抗体および試料間の結
合の量は、カルパインＩのドメインIIIを結合する抗
体、またはカルパインＩのドメインIIIを結合する抗体
を認識する第２抗体に結合された、酵素、クロモダイナ
ミック（chromodynamic）、放射性、または発光性ラベ
ルの分析により測定できる。使用してよい免疫学的アッ
セイには、ＥＬＩＳＡ、インヒビションＥＬＩＳＡ、ウ
ェスタンブロット、免疫沈降、スロット・オア・ドット
・ブロット・アッセイ（slot or dot blot assays）、
イムノステイニング（immunostaining）、ＲＩＡ、フル
オレセインまたはローダミン等のケイ光物質の抗体コン
ジュゲートまたは抗原コンジュゲートを用いるケイ光免
疫アッセイ、オクタロニ−２重拡散分析、およびアビジ
ン−ビオチンまたはストレプトアビジン−ビオチン検出
系を用いる免疫アッセイを含むが、これらに限定されな
い。The level of activated isoform calpain I or the level of 70 kDa protein can be determined by activating isoform calpain I and / or 70 kDa and calpain I.
It is achieved by the use of an immunoassay which allows the detection of binding between the antibody to domain III of. Most preferably, the antibody is amino acids 346-361 of calpain I.
(SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing) specifically binds, and most preferably the antibody is a C-13 antibody. The amount of binding between the antibody and the sample depends on the enzyme, chromodynamic, radioactive, bound to the antibody that binds domain III of calpain I or the second antibody that recognizes the antibody that binds domain III of calpain I Alternatively, it can be measured by analysis of a luminescent label. Immunological assays that may be used include ELISA, inhibition ELISA, western blot, immunoprecipitation, slot or dot blot assays,
Immunostaining, fluorescent immunoassays using antibody conjugates or antigen conjugates of fluorescent substances such as RIA, fluorescein or rhodamine, octaloni-2 double diffusion assay, and avidin-biotin or streptavidin-biotin detection system. , But not limited to.

【０００７】これらの方法は生物学的試料中に存在する
活性化アイソ形カルパインＩまたは７０kＤaタンパク質
の検出を可能にし、アルツハイマー診断目的用生物学的
試料としては、腰部のＣＳＦ、心室のＣＳＦ、末梢血液
組織（すなわちリンパ芽細胞）、繊維芽細胞、脳組織ホ
モジネートまたは患者から得られる薄切片を含むが、こ
れらに限定されない。変化したカルパイン活性レベルが
ＡＤ個体中の末梢血液組織および繊維芽細胞において報
告されているので、これらの組織は生きている患者の診
断用のuniquely非浸入性のサンプル源を提供する。腰部
ＣＳＦの分析も、該テストの変法も生きている患者から
得た試料を用いて行ってよいので、特に有用である。These methods enable the detection of the activated isoform calpain I or 70 kDa protein present in biological samples, and as biological samples for Alzheimer's diagnostic purposes, lumbar CSF, ventricular CSF, peripheral CSF. It includes, but is not limited to, blood tissue (ie lymphoblasts), fibroblasts, brain tissue homogenates or thin sections obtained from a patient. Since altered levels of calpain activity have been reported in peripheral blood tissues and fibroblasts in AD individuals, these tissues provide a uniquely non-invasive sample source for the diagnosis of living patients. Lumbar CSF analysis is also particularly useful as the modified version of the test may be performed using samples from living patients.

【０００８】本発明の方法に有用な抗体は、カルパイン
ＩのドメインIIIとのその結合において実質的に特異的
である抗体を含む。具体的には抗体Ｃ−１３を本発明の
方法および製造物に用いてよい。７０kＤaタンパク質ま
たはその断片に対して生ずる抗体も本発明の方法に用い
てもよい。本発明の抗体のいくつかは、活性化アイソ形
カルパインＩおよび７０kＤaタンパク質の外にタンパク
質を認識するかもしれないと理解される。そのような抗
体の場合、タンパク質の大きさおよび重量を区別できる
免疫アッセイが最も有用である。Antibodies useful in the methods of the invention include those that are substantially specific in their binding to domain III of calpain I. Specifically, antibody C-13 may be used in the methods and products of the invention. Antibodies raised against the 70 kDa protein or fragments thereof may also be used in the methods of the invention. It is understood that some of the antibodies of the present invention may recognize proteins in addition to the activated isoform calpain I and the 70 kDa protein. For such antibodies, immunoassays that can distinguish protein size and weight are most useful.

【０００９】本発明は７０kＤaタンパク質およびその断
片の実質的に純粋な製造物をも含む。これらのタンパク
質は多くの有用性を有する。例えば抗体製造方法におい
て、およびＡＤ用の有用な治療剤である化合物のスクリ
ーニング方法において使用できる。例えば細胞中のこの
タンパク質のレベルを下げるこれらの化合物。さらに７
０kＤaタンパク質およびその断片は本発明の診断方法お
よびキットにおける対照標準として使用できる。The invention also includes a substantially pure product of the 70 kDa protein and fragments thereof. These proteins have many utilities. For example, it can be used in a method for producing an antibody and in a method for screening a compound that is a useful therapeutic agent for AD. For example, these compounds that reduce the level of this protein in cells. 7 more
The 0 kDa protein and fragments thereof can be used as a control standard in the diagnostic methods and kits of the present invention.

【００１０】第２の態様において本発明は、活性化アイ
ソ形カルパインＩおよび７０kＤaタンパク質を特異的に
結合する抗体を製造する方法を提供する。この方法は哺
乳動物を実質的に純粋なカルパインＩのドメインIIIま
たはその断片（必要ならキャリアにコンジュゲートし
て）で免疫することを含む。ドメインIII断片は、精製
したカルパインＩのタンパク質分解的に解裂した断片、
組換的に合成した断片または合成ペプチドであってよ
い。免疫した後にポリクローナルな抗血清を免疫した哺
乳動物から単離し、精製できる。或いは、免疫した哺乳
動物からの抗体産生器官を取り出し、該器官から調製し
た細胞性ホモジネートを、培養したガン細胞に融合する
ことができる。カルパインＩのドメインIIIに特異的な
モノクローナル抗体を製造するハイブリッド細胞を容易
に選択できる。In a second aspect, the present invention provides a method of producing an antibody which specifically binds the activated isoform calpain I and the 70 kDa protein. The method involves immunizing a mammal with substantially pure calpain I domain III or a fragment thereof, optionally conjugated to a carrier. The domain III fragment is a purified calpain I proteolytically cleaved fragment,
It may be a recombinantly synthesized fragment or synthetic peptide. After immunization, polyclonal antisera can be isolated and purified from the immunized mammal. Alternatively, the antibody-producing organ from the immunized mammal can be removed and the cellular homogenate prepared from the organ fused to the cultured cancer cells. Hybrid cells that produce monoclonal antibodies specific for calpain I domain III can be readily selected.

【００１１】本発明の第３の態様は、患者からの生物学
的試料中の増加したレベルの活性化アイソ形カルパイン
Ｉまたは７０kＤaタンパク質の検出により、アルツハイ
マー病のインビトロ診断用のキットを提供する。活性化
アイソ形カルパインＩまたは７０kＤaタンパク質を検出
するためのキットは、（1）カルパインＩのドメインIII
に結合できる第１抗体；および（2）シグナルを作るラ
ベルに結合した第２抗体を含み、該第２抗体は、カルパ
インＩのドメインIIIまたは７０kＤaに、しかし第１の
モノクローナル抗体が結合する部位とは異なる部位（す
なわち離れた部分）に、結合できる。そのような抗体は
当該技術分野でよく知られている方法により製造でき
る。このキットは２抗体サンドイッチ免疫アッセイ、例
えば２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを行うのに最も適し
ている。A third aspect of the invention provides a kit for the in vitro diagnosis of Alzheimer's disease by the detection of increased levels of the activated isoform calpain I or 70 kDa protein in biological samples from patients. A kit for detecting activated isoform calpain I or 70 kDa protein comprises (1) domain III of calpain I
A second antibody conjugated to a label that produces a signal, the second antibody being bound to domain III or 70 kDa of calpain I, but with a site to which the first monoclonal antibody binds. Can bind to different sites (ie distant parts). Such antibodies can be produced by methods well known in the art. This kit is most suitable for performing a 2-antibody sandwich immunoassay, eg a 2-antibody sandwich ELISA.

【００１２】変化したレベルの活性化アイソ形カルパイ
ンＩまたは７０kＤaタンパク質の検出に有用であり、本
発明の一部である他のキットは、（1）ＣＡＮＰのドメ
インIIIに結合できる第１抗体；および（2）シグナルを
生成するラベルにコンジュゲートした第２抗体を含み、
該第２抗体は第１抗体に結合できる。Another kit useful for the detection of altered levels of the activated isoform calpain I or the 70 kDa protein and which is part of this invention is (1) a first antibody capable of binding to domain III of CANP; (2) comprises a second antibody conjugated to a label that produces a signal,
The second antibody can bind to the first antibody.

【００１３】上記アッセイキットのそれぞれにおいて、
第２抗体に結合したシグナルを作るラベルは、酵素（例
えばホースラディッシュパーオキシダーゼまたはアルカ
リホスホターゼ）であってよいが、これらに限定されな
い。好ましくは酵素とその基質をキットに加える。第１
抗体（上記第１のキットにおいて）またはアッセイすべ
き試料（上記第２のキットにおいて）をユーザーが固定
化できる、コートされない担体もキットに含めてよい。
そのキットはスタンダードとして使用すべき精製したタ
ンパク質、例えばＣＡＮＰのドメインIIIをも含んでも
よい。In each of the above assay kits,
The label that produces the signal bound to the second antibody can be, but is not limited to, an enzyme (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphotase). Preferably the enzyme and its substrate are added to the kit. First
An uncoated carrier on which a user can immobilize the antibody (in the first kit above) or the sample to be assayed (in the second kit above) may also be included in the kit.
The kit may also include a purified protein to be used as a standard, eg domain III of CANP.

【００１４】本発明の第４の態様は、患者に、最も好ま
しくは脳組織中に、活性化されたアイソ形のカルパイン
Ｉのレベルを低下させる化合物を導入することにより、
脳組織中の活性化アイソ形カルパインＩのレベルを下げ
る方法に特徴がある。この方法を用いることにより特定
されるそのような化合物は、アルツハイマー病の前徴の
ある、または症状のある患者を治療するのに用いること
ができる。例えばＣ−１３抗体を活性化アイソ形カルパ
インＩのレベルを低下させるために用いてよい。A fourth aspect of the invention is to introduce into the patient, most preferably brain tissue, a compound which reduces the level of the activated isoform calpain I.
It is characterized by a method of lowering the level of activated isoform calpain I in brain tissue. Such compounds identified by using this method can be used to treat patients with or without symptoms of Alzheimer's disease. For example, the C-13 antibody may be used to reduce the level of activated isoform calpain I.

【００１５】本発明の第５の態様は、活性化アイソ形カ
ルパインＩまたは７０kＤaタンパク質のレベルを低下さ
せる候補化合物の能力を測定する方法に特徴がある。こ
の方法では活性化アイソ形カルパインＩまたは７０kＤa
タンパク質を発現する細胞を候補化合物と接触させ、細
胞中の活性化アイソ形カルパインＩのレベルを測定す
る。活性化アイソ形カルパインＩのレベルのこの測定は
上記イムノアッセイのいずれを用いて行ってよい。A fifth aspect of the invention features a method of measuring the ability of a candidate compound to reduce levels of the activated isoform calpain I or 70 kDa protein. In this method, activated isoform calpain I or 70 kDa
Cells expressing the protein are contacted with a candidate compound and the level of activated isoform calpain I in the cell is measured. This measurement of the level of activated isoform calpain I may be made using any of the immunoassays described above.

【００１６】本発明は、活性化アイソ形カルパインＩの
レベルを下げる候補化合物の能力を測定する他の方法に
も特徴がある。この方法では候補化合物を、活性化され
たアイソ形のカルパインＩを発現する哺乳動物に投与す
る。活性化アイソ形カルパインＩのレベルは、上記した
イムノアッセイを用いて、マウスからの組織試料、例え
ば脳ホモジネートまたは皮質薄切片の分析により測定で
きる。The invention is also characterized by another method for measuring the ability of a candidate compound to reduce the level of activated isoform calpain I. In this method, a candidate compound is administered to a mammal expressing an activated isoform of calpain I. Levels of activated isoform calpain I can be measured by analysis of tissue samples from mice, such as brain homogenates or cortical slices, using the immunoassays described above.

【００１７】本明細書において、「実質的に純粋」の語
は天然にそれに伴う成分から分離された化合物、例えば
７０kＤaのタンパク質またはその断片を言う。典型的に
は、試料中の全物質の少なくとも１０％、より好ましく
は少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０
％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは
少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、
最も好ましくは少なくとも９９％（体積で、湿もしくは
乾燥重量で、またはモル％もしくはモル分率で）が問題
の化合物である場合に、その化合物は実質的に純粋であ
る。純度は適当な方法で、例えばタンパク質の場合に
は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により測定され得る。あ
る化合物、例えばタンパク質は天然に伴う成分を実質的
に含まない場合、または自然状態でそれに伴う天然の異
物から分離されている場合にも実質的に精製されてい
る。As used herein, the term "substantially pure" refers to a compound that is separated from the components that naturally accompany it, such as the 70 kDa protein or fragments thereof. Typically, at least 10%, more preferably at least 20%, more preferably at least 50% of the total material in the sample.
%, More preferably at least 60%, more preferably at least 75%, more preferably at least 90%,
Most preferably, a compound is substantially pure when at least 99% (by volume, wet or dry weight, or mol% or mole fraction) is the compound in question. Purity can be measured by any suitable method, eg, in the case of proteins, by column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis or HPLC analysis. A compound, eg, a protein, is also substantially purified if it is substantially free of naturally occurring components or if it is naturally separated from its naturally occurring foreign bodies.

【００１８】本発明の抗体に関して「特異的結合」と
は、抗体および抗原の相互作用（例えば、Ｃ−１３抗体
とＣＡＮＰまたは７０kＤaタンパク質との相互作用）を
言う。抗体が抗原に対して最大で１０^-7モル／ｌ、また
は好ましくは１０^-8モル／ｌの親和定数（Ｋd）を有す
る場合、抗体はその抗原に対して特異的に結合（或いは
「接触」または「結合」と言う）できると言われる。一
方、抗体が抗原に対して少なくとも１０^-2モル／ｌ以上
のＫd値を有する場合、抗体はその抗原に対して結合で
きないと言われる。本明細書において定義される抗体は
モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。"Specific binding" in the context of the antibody of the present invention refers to the interaction between the antibody and the antigen (for example, the interaction between C-13 antibody and CANP or 70 kDa protein). An antibody specifically binds (or "contacts") with an antigen if the antibody has an affinity constant (Kd) of at most 10 ^-7 mol / l, or preferably 10 ^-8 mol / l. Or called "join"). On the other hand, an antibody is said to be unable to bind to an antigen if it has a Kd value for the antigen of at least 10 ^-2 mol / l or higher. The antibody as defined herein can be monoclonal or polyclonal.

【００１９】「カルパインＩのドメインIII」とはアミ
ノ酸３１７−３５５（配列表の配列番号２）からの領域
を言う。本発明の抗体を作るのに有用なこの領域からの
断片は、活性化アイソ形カルパインＩおよび７０kＤaタ
ンパク質と特異的結合を示す抗体を引き出すこれらの断
片である。好ましくはカルパインＩのドメインIIIの断
片は、カルパインＩのアミノ酸３４６−３６１（配列表
の配列番号１）を含む。"Calpain I domain III" refers to the region from amino acids 317-355 (SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing). Fragments from this region useful in making the antibodies of the present invention are those fragments that elicit antibodies that show specific binding to the activated isoform calpain I and the 70 kDa protein. Preferably, the fragment of domain III of calpain I comprises amino acids 346-361 of calpain I (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).

【００２０】「７０kＤaタンパク質」とは、カルパイン
ＩのドメインIIIの３４６−３６１アミノ酸断片（配列
表の配列番号１）を特異的に結合するＣ−１３抗体また
は他の抗体と特異的な結合を示し、人の脳組織に存在
し、ＡＤ患者の脳組織中に高いレベルで存在し、図８お
よび９に示すプロトコールを用いて精製されてよい、８
％アクリルアミド上で７０および７４kＤaの間であるタ
ンパク質を意味する。The term "70 kDa protein" refers to specific binding to C-13 antibody or other antibody which specifically binds to the 346-361 amino acid fragment of calpain I domain III (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). , Present in human brain tissue and at high levels in brain tissue of AD patients and may be purified using the protocol shown in FIGS. 8 and 9.
Means a protein that is between 70 and 74 kDa on% acrylamide.

【００２１】本発明の有利な特徴は、症状のある、また
は症状のない患者のＡＤについて診断アッセイを提供す
ることである。本発明の診断アッセイから最も利益を享
受しそうな患者は、アルツハイマー病の初期症状、例え
ば人格の変化、言葉を見出すのが困難、記憶喪失、特に
最近の記憶の喪失、物の置き誤り、名前を忘れること、
および言葉の流暢さの進行する喪失の存在する患者であ
る。この診断は関与および多分病気にかかった個体の治
療的救済を可能にする。さらにこの診断は医師がＡＤ
と、類似した症状により特徴づけられる他の病気の間の
区別をするのを可能とする。腰部のＣＳＦの分析は生き
ている患者に対する適当な診断法である低リスクのアッ
セイである。ＣＳＦは通院患者ベースで取り出すことが
でき、結果は数時間または数日内に得られる。さらに本
発明はＡＤの死後の診断のための容易で信頼できる方法
を提供する。An advantageous feature of the present invention is to provide a diagnostic assay for AD in symptomatic or asymptomatic patients. Patients who are most likely to benefit from the diagnostic assays of the present invention will have early symptoms of Alzheimer's disease, such as altered personality, difficulty finding words, amnesia, especially recent memory loss, misplacement, and name. Forget,
And with a progressive loss of verbal fluency. This diagnosis allows involvement and possibly therapeutic relief of affected individuals. Furthermore, this diagnosis is AD
And allows to distinguish between other diseases characterized by similar symptoms. Lumbar CSF analysis is a low-risk assay that is a suitable diagnostic method for living patients. CSF can be retrieved on an outpatient basis and results are available within hours or days. The invention further provides an easy and reliable method for post-mortem diagnosis of AD.

【００２２】本発明の他の特徴および利点は以下の詳細
な記述、図面および特許請求の範囲から明らかとなろ
う。Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, drawings and claims.

【００２３】[0023]

【発明の実施の形態】カルシウム活性化中性プロティナ
ーゼ（ＣＡＮＰまたはカルパイン）はシグナルトランス
ダクションのアスペクト（aspect）の制御に関係する一
群のプロテアーゼである。ＣＡＮＰによる限定されたタ
ンパク質加水分解は、カルシウム依存性プロテインキナ
ーゼおよびプロテインホスファターゼおよび神経伝達物
質酵素を含む重要な酵素の制御、膜および膜スケルトル
の構造タンパク質の機能の修飾に関係する。エクサイタ
トキシティ（excitatoxicity）および虚血において起る
ようなＣＡＮＰの大きい活性化は急速な不可逆的なニュ
ーロンの損傷を誘導する。しかし以前の報告は全ＣＡＮ
Ｐ活性はアルツハイマーの脳では顕著に変化しないこと
を示す。カルパインＩはプロテアーゼのＣＡＮＰファミ
リーの１メンバーである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Calcium-activated neutral proteinases (CANPs or calpains) are a group of proteases involved in the control of signal transduction aspects. Limited proteolysis by CANP involves regulation of key enzymes, including calcium-dependent protein kinases and protein phosphatases and neurotransmitter enzymes, and modification of the function of membrane and membrane skeletal structural proteins. Extensive activation of CANP, as occurs in excitatoxicity and ischemia, induces rapid and irreversible neuronal damage. But the previous report was all CAN
It shows that P activity is not significantly changed in Alzheimer's brain. Calpain I is a member of the CANP family of proteases.

【００２４】カルパインＩは、カルシウムの存在下にア
ミノ末端配列の自動的タンパク質分解的解裂によって活
性化される不活性なプリカーサーアイソ形として主に細
胞中に存在する。インビボでのカルパインＩの作用はイ
ンビトロのエンザイムアッセイによりモニターするのは
困難であった。何故ならプリカーサー形はアッセイ過程
によっても活性化され、活性は酵素の不安定性により、
および細胞質ゾルの抑制性要素および活性化要素によっ
て順次影響されるからである。カルパインＩの活性化さ
れたアイソ形はアルツハイマーの脳において顕著に増加
し、プリカーサーアイソ形は顕著に減少する。我々はカ
ルパインＩの４つの機能性ドメインに対する抗体を今生
ぜしめた。ドメインIII（アミノ酸３４６〜３６１、配
列表の配列番号１）に対する抗体はカルパインＩの活性
化されたアイソ形を認識する。Calpain I exists mainly in cells as an inactive precursor isoform which is activated by the automatic proteolytic cleavage of amino terminal sequences in the presence of calcium. The effects of calpain I in vivo have been difficult to monitor by in vitro enzyme assays. Because the precursor form is also activated by the assay process, the activity is due to the instability of the enzyme,
And that are sequentially affected by the cytosolic inhibitory and activating elements. The activated isoform of calpain I is significantly increased in Alzheimer's brain and the precursor isoform is significantly decreased. We have now raised antibodies to the four functional domains of calpain I. Antibodies to domain III (amino acids 346-361, SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) recognize the activated isoform of calpain I.

【００２５】イムノブロット分析のためにＣ−１３抗体
を用いて、我々は年齢および死後間隔（Ｐ＜０.０２）
についてマッチさせた９つの正常な対照に対して、１３
人のアルツハイマー患者からの前頭葉前部の皮質におけ
る、活性化されたカルパインＩアイソ形のプリカーサー
アイソ形に対する比の、ほとんど３倍の増加を見出し
た。トリトンＸ−１００で可溶化する膜画分においては
活性化されたアイソ形のプリカーサーアイソ形に対する
比は、アルツハイマー脳で３.９倍上昇する（Ｐ＜０.０
５）。プリカーサーアイソ形に対し特異的である抗体を
含む、異なるカルパインＩ抗体についての結果は有意に
相関づけられた。カルパインＩの活性化の増加と矛盾な
しに、カルパスタティン活性のレベルは顕著に減少し
た。著しい相関が、異常なカルパインＩの活性化の程度
と可溶性ＡＰＰのレベルの減少の間に認められた。ＡＰ
ＰＳは精製したカルパインにより膜のＡＰから作られな
かった。免疫細胞化学によりカルパインＩ抗体は人、モ
ンキーおよびマウスの脳中のニューロンを優先的に染色
（stain）した。カルパインＩの免疫反応性はアルツハ
イマー脳からの前頭前方の皮質における変性的変化を示
すいくつかのニューロン中において異常に増加した。Using C-13 antibody for immunoblot analysis, we found that age and postmortem interval (P <0.02)
13 against 9 normal controls matched for
We found an almost 3-fold increase in the ratio of activated calpain I isoforms to precursor isoforms in the prefrontal cortex from human Alzheimer's patients. In the membrane fraction solubilized with Triton X-100, the ratio of activated isoforms to precursor isoforms is increased 3.9-fold in Alzheimer brain (P <0.0.
5). The results for the different calpain I antibodies, including those that are specific for the precursor isoforms, were significantly correlated. Consistent with the increased activation of calpain I, the level of calpastatin activity was significantly reduced. A striking correlation was observed between the extent of aberrant calpain I activation and the decrease in soluble APP levels. AP
PS was not made from membrane AP by purified calpain. By immunocytochemistry, the calpain I antibody preferentially stains neurons in human, monkey and mouse brains. Calpain I immunoreactivity was abnormally increased in some neurons showing degenerative changes in the prefrontal cortex from the Alzheimer brain.

【００２６】これらの結果は、カルパイン系がアルツハ
イマー病における危険な状態にあるニューロンにおいて
活性化され、神経変性に重要な役割を果す証拠を提供す
る。従ってカルパインＩの活性化されたアイソ形に特異
的な抗体は診断および治療用途を有する。以下の実施例
は本発明の方法を説明するが、限定することを意味する
ものではない。当業者に自明な他の適当な改変および免
疫診断で通常出会う条件の改変は本発明の範囲内であ
る。These results provide evidence that the calpain system is activated in at-risk neurons in Alzheimer's disease and plays an important role in neurodegeneration. Antibodies specific for the activated isoform of calpain I therefore have diagnostic and therapeutic applications. The following examples illustrate the method of the present invention, but are not meant to be limiting. Other suitable modifications and modifications of conditions normally encountered in immunodiagnosis that are obvious to those skilled in the art are within the scope of the invention.

【００２７】[0027]

【実施例】【Example】

ＣＳＦの採取 ＣＳＦを集める技術は当業界でよく知られている（例え
ばＡppleyard等、１９８７、Ｂrain １１０巻、１３０
９頁およびＷester等、１９９０、Ｊ.Ｎeurochem.，５
４巻、１１４８頁参照）。腰部のＣＳＦは類似の技術を
用いて単離できる（例えば、Ｍerck Ｍanual，１７４
６〜１７４８ページ、１２版、Ｄ.Ｎ.Ｈolvey編、Ｍerc
k，Ｓharp，and Ｄohne Ｒesearch Ｐublishing，ニ
ュージャージー、１９７２参照）。Collecting CSF Techniques for collecting CSF are well known in the art (eg, Appleyard et al., 1987, Brain 110, 130).
P. 9 and Wester et al., 1990, J. Neurochem., 5
Vol. 4, p. 1148). Lumbar CSF can be isolated using similar techniques (eg, Merck Manual, 174).
6 to 1748 pages, 12th edition, edited by DN Holvey, Merc.
k, Sharp, and Dohne Research Publishing, New Jersey, 1972).

【００２８】カルパインＩドメインI II抗体の反応性 正常な、および病的な人の脳の機能におけるカルパイン
の関わりを理解するための我々の努力は一連のカルパイ
ンＩおよびカルパインII抗体の開発に我々を導いた。こ
れ等の抗体は、天然のカルパインII、および両アイソザ
イムの大分子量サブユニットの異なった領域に対して向
けられる一連の合成ペプチドに対して生じさせる（図
１）。 Reactivity of Calpain I Domain I II Antibodies Our efforts to understand the involvement of calpain in brain function in normal and pathological humans has led us to develop a series of calpain I and calpain II antibodies. lead. These antibodies are raised against native calpain II, and a series of synthetic peptides directed against different regions of the large molecular weight subunits of both isozymes (FIG. 1).

【００２９】Ｃ−１３は標準的な技術（例えばＡntibod
ies：Ａ Ｌabaratory Ｍanual，Ｈarlow，Ｅ．および
Ｌane，Ｄ編，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabaratory
Ｐublishing，ニューヨーク、９８〜１１５ページ参
照）を用いて、動物免疫の前に牛血清アルブミンとコン
ジュゲートしたドメインIIIの残基３４６〜３６１（配
列表 １）に対して生じたカルパインＩ抗体である（図
１）。この抗体は３つのカルパインＩアイソ形および更
に７０kＤaバンドを認識する。Ｃ−１３の免疫反応性の
細胞分布を、ＡＤ脳の前頭前部皮質の細胞質ゾルおよび
膜分画をトリトン不存在下に分離し、１％トリトンＸ−
１００、０.８Ｍシュクロース、１Ｍ尿素および７Ｍ尿
素で膜を抽出した後分析した（図２）。免疫ブロットは
上清中にカルパインＩおよび７０kＤaバンドの存在を確
認するが、より重要なことはそれらが１％トリトン可溶
性膜中に存在することを示す。これらの結果は７０kＤa
バンドがカルパインＩに空間的または機能的に関係する
こと、および２つのタンパク質が細胞の膜要素と会合し
て一緒に位置することを示唆する。C-13 is a standard technology (eg Antibod)
ies: A Labaratory Manual, Harlow, E.I. And Lane, D, Cold Spring Harbor Labaratory
Calpain I antibody raised against residues 346-361 (Sequence Listing 1) of domain III conjugated with bovine serum albumin prior to animal immunization (Publishing, NY, pp. 98-115). (Fig. 1). This antibody recognizes three calpain I isoforms and an additional 70 kDa band. Immunoreactive cell distribution of C-13 was determined by separating the cytosol and membrane fractions of the prefrontal cortex of AD brain in the absence of Triton, 1% Triton X-
Membranes were extracted with 100, 0.8 M sucrose, 1 M urea and 7 M urea and then analyzed (FIG. 2). Immunoblots confirm the presence of calpain I and 70 kDa bands in the supernatant, but more importantly, they are present in 1% Triton soluble membranes. These results are 70 kDa
It suggests that the band is spatially or functionally related to calpain I and that the two proteins are co-located with the membrane elements of the cell.

【００３０】免疫細胞化学研究において、この抗体は、
数個のＡＤの脳からの新皮質薄片IIIおよびＶ内部の神
経炎プラーク、もつれおよび神経網糸を特異的に染色す
ることが見出され、一方免疫反応性は対照の脳において
はこの抗血清について陰性であった（図３、それぞれパ
ネルＢおよびＡ）。さらに、研究はＣ−１３免疫反応性
とモノクローナル抗体（cal Ｉ）の間の直接の相関を示
す。cal Ｉ抗体は、対照の脳と比較して、ＡＤにおける
Ｌ／Ｈアイソ形の比の増加を検出することが示された
（図４）。ＡＤがカルパインＩの変化を伴うことが確立
したので、１２の年齢にマッチした対照および１５のＡ
Ｄケースの、前頭前前部の皮質の異なった細胞画分につ
いて、Ｃ−１３免疫反応性の研究を我々は行った。組織
は図５に概略を記すように調製し、細胞質ゾル
（Ｓ₁）、トリトン可溶膜（Ｓ₃）、およびトリトン不溶
性細胞骨格（Ｐ₄）（発達中）をＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルで実施し、Ｃ−１３で染色した。Ｓ₁画分は、
対照およびＡＤ試料の両方で７０kＤaの存在を示し、４
５kＤaの他の分解生成物を伴った（図６）。しかし、Ａ
Ｄ試料中の含量は、対照と比較して、平均１２０％〜１
６０％増加した。結果はトリトン可溶性の膜（Ｓ₃）に
おいてより劇的であり、すべての３つのカルパインＩの
アイソ形は７０kＤaバンドと共に視覚化できる。これら
の画分において、ＡＤにおける７０kＤa免疫反応性は、
対照試料と比較して、少なくとも２倍増加した（図
６）。細胞骨格画分の染色は、Ｃ−１３およびカルパイ
ンＩ免疫反応性がこれらの３つの分画において非常に少
量しか存在しないとしても、パターンはＳ₁およびＳ₂で
認められたのと類似であることを示す。In immunocytochemistry studies, this antibody
Neocortical slices III and V from several AD brains were found to specifically stain neuritic plaques, tangles and neuropils, whereas immunoreactivity was detected in this antiserum in control brains. Was negative for (FIG. 3, panels B and A, respectively). Furthermore, studies show a direct correlation between C-13 immunoreactivity and monoclonal antibodies (cal I). The cal I antibody was shown to detect an increase in the ratio of L / H isoforms in AD compared to control brain (Fig. 4). Since it was established that AD was associated with changes in calpain I, 12 age-matched controls and 15 A
We conducted a study of C-13 immunoreactivity on different cell fractions of the prefrontal cortex in the D case. Tissues were prepared as outlined in Figure 5 and cytosolic (S ₁ ), triton soluble membrane (S ₃ ) and triton insoluble cytoskeleton (P ₄ ) (developing) were performed on SDS polyacrylamide gels. , C-13. S ₁ fraction is
Indicating the presence of 70 kDa in both control and AD samples, 4
It was accompanied by another degradation product of 5 kDa (Fig. 6). However, A
The content in the D sample is on average 120% to 1 as compared with the control.
60% increase. The result is a more dramatic in film (S ₃₎ of Triton soluble, iso-shaped all three calpain I can visualize with 70kDa band. In these fractions, the 70 kDa immunoreactivity in AD was
There was at least a 2-fold increase compared to the control sample (Figure 6). Staining of cytoskeletal fraction, C-13 and calpain I immunoreactivity even only present a very small amount in these three fractions, the pattern is the similar to that observed in S ₁ and S ₂ Indicates that.

【００３１】７０kＤaポリペプチ ドのキャラクタリゼー
ション Ｃ−１３抗体が免疫細胞化学および生化学研究の両方で
ＡＤ脳における異常性を検出するということが確立され
たので、我々は古典的なタンパク質精製技術による７０
kＤa断片の同定の解明に乗り出した。１kgの人の脳の細
胞質ゾルプール、主に灰色の物質がカルパイン源であっ
た。図８に概略を示するプロトコールは、カルパインＩ
およびカルパスタチンを精製するのに用いたのと類似で
ある。ＤＥＡＥ−アニオン交換カラムクロマトグラフィ
ーによる塩グラジエントにより、カルパインIIを他のカ
ルパイン成分から分離した。アニオン交換カラムおよび
サイズ排除カラム（ウルトラゲル）を通って共溶出した
カルパインＩおよび７０kＤa断片は、しかし、疎水性ク
ロマトグラフィ（フェニル−セファローズ）により分離
された（図８および９）。カルパインＩは塩存在下にフ
ェニル−セファローズに保持されたが、７０kＤa断片は
そのカラムに結合せず、カルパスタチンと共に回収され
た。７０kＤaバンドがフェニルセファロースに結合しな
いことは、失われる断片は疎水性であることを示唆す
る。最後にＦＰＬＣ Ｑ−セファロース−アニオン交換
カラムを用いて、７０kＤaバンドをカルパスタチンから
分離し、全タンパク質染色により分離したバンドとして
示される単一画分として回収された（クーマシー(cooma
ssie)明るいブルー、図９）。タンパク質配列決定は標
準的な技術を用いて行って良い（例えば、Ｓequencing
of Ｐrotein and Ｐeptides：Ｌabatory Ｔechni
ques in Ｂiochemistry and Ｍolecular Ｂiolog
y，第２編，Ｇ.Ａllen，Ｅlsevier Ｓcience Ｐublic
ations，アムステルダム，オランダ（１９８９)；Ｐrot
ein Ｓequencing：Ａ Ｐractical Ａpproach，Ｊ.
Ｂ.Ｃ.ＦindleyおよびＭ.Ｊ.Ｇrisow編，ＩＲＬ Ｐres
s，オックスフォード，英国（１９８９)）。The 70kDa polypeptide de character Rize over
Since it was established that the Cion C-13 antibody detects abnormalities in the AD brain in both immunocytochemistry and biochemical studies, we used 70 by classical protein purification techniques.
We have started to elucidate the identification of the kDa fragment. The source of calpain was the cytosolic pool of 1 kg of human brain, mainly gray material. The protocol outlined in Figure 8 is Calpain I
And similar to that used to purify calpastatin. Calpain II was separated from other calpain components by a salt gradient by DEAE-anion exchange column chromatography. The calpain I and 70 kDa fragments co-eluted through an anion exchange column and a size exclusion column (Ultragel) were, however, separated by hydrophobic chromatography (phenyl-Sepharose) (Figures 8 and 9). Calpain I was retained by phenyl-Sepharose in the presence of salt, but the 70 kDa fragment did not bind to the column and was recovered with calpastatin. The lack of binding of the 70 kDa band to phenyl sepharose suggests that the missing fragment is hydrophobic. Finally, the 70 kDa band was separated from calpastatin using an FPLC Q-Sepharose-anion exchange column and collected as a single fraction shown as a separated band by total protein staining (coomassie (coomasie)).
ssie) bright blue, Fig. 9). Protein sequencing may be performed using standard techniques (eg Sequencing).
of Protein and Peptides: Labatory Techni
ques in Biochemistry and Molecular Biolog
y, Volume 2, G. Allen, Elsevier Science Public
ations, Amsterdam, Netherlands (1989); Prot
ein Sequencing: A Practical Approach, J.
BC Findley and MJ Grisow, IRL Pres
S. Oxford, UK (1989)).

【００３２】[0032]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Leu Lys Ser Arg Thr Ile Arg Lys Trp Asn Thr Thr Leu Tyr Glu 1 5 10 15 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 16 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein Sequence: Ala Leu Lys Ser Arg Thr Ile Arg Lys Trp Asn Thr Thr Leu Tyr Glu 1 5 10 15

【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：２７０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Asp Pro Tyr Glu Arg Asp Asp Leu Arg Val Lys Met Glu Asp Gly Glu 1 5 10 15 Phe Trp Met Ser Phe Arg Asp Phe Met Arg Glu Phe Thr Arg Leu Glu 20 25 30 Ile Cys Asn Leu Thr Pro Asp Ala Leu Lys Ser Arg Thr Ile Arg Lys 35 40 45 Trp Asn Thr Thr Leu Xaa Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr Ala 50 55 60 Gly Gly Cys Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln Phe 65 70 75 80 Lys Ile Arg Leu Asp Glu Thr Asp Asp Pro Asp Asp Tyr Gly Asp Arg 85 90 95 Glu Ser Gly Cys Ser Phe Val Leu Ala Leu Met Gln Lys His Arg Arg 100 105 110 Arg Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe Ala Val 115 120 125 Tyr Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Ala Val His Leu Xaa 130 135 140 Arg Asp Phe Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln Phe 145 150 155 160 Ile Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly Glu 165 170 175 Tyr Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp Phe 180 185 190 Val Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Ser Ala Gly Thr Val Glu Leu Asp 195 200 205 Asp Gln Ile Gln Ala Asn Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu Glu 210 215 220 Glu Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ala Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly Glu 225 230 235 240 Asp Met Glu Ile Ser Val Lys Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg Ile 245 250 255 Ile Ser Lys Arg Xaa Asp Leu Arg Thr Lys Gly Phe Ser Leu 260 265 270SEQ ID NO: 2 Sequence length: 270 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein Sequence: Asp Pro Tyr Glu Arg Asp Asp Leu Arg Val Lys Met Glu Asp Gly Glu 1 5 10 15 Phe Trp Met Ser Phe Arg Asp Phe Met Arg Glu Phe Thr Arg Leu Glu 20 25 30 Ile Cys Asn Leu Thr Pro Asp Ala Leu Lys Ser Arg Thr Ile Arg Lys 35 40 45 Trp Asn Thr Thr Leu Xaa Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr Ala 50 55 60 Gly Gly Cys Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln Phe 65 70 75 80 Lys Ile Arg Leu Asp Glu Thr Asp Asp Pro Asp Asp Tyr Gly Asp Arg 85 90 95 Glu Ser Gly Cys Ser Phe Val Leu Ala Leu Met Gln Lys His Arg Arg 100 105 110 Arg Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe Ala Val 115 120 125 Tyr Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Ala Val His Leu Xaa 130 135 140 Arg Asp Phe Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln Phe 145 150 155 160 Ile Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly Glu 165 170 175 Tyr Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu P ro Asn Lys Glu Gly Asp Phe 180 185 190 Val Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Ser Ala Gly Thr Val Glu Leu Asp 195 200 205 Asp Gln Ile Gln Ala Asn Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu Glu 210 215 220 Glu Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ala Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly Glu 225 230 235 240 Asp Met Glu Ile Ser Val Lys Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg Ile 245 250 255 Ile Ser Lys Arg Xaa Asp Leu Arg Thr Lys Gly Phe Ser Leu 260 265 270

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 カルパインＩ抗体を生ぜしめるのに用いるド
メインを示す図である。FIG. 1 shows the domains used to generate calpain I antibodies.

【図２】 上はＣ−１３抗体を作るのに用いるドメイン
ＩＩＩの領域を示す図であり、下は脳組織の様々な画分
中の７０kＤaタンパク質およびカルパインＩの活性化さ
れたアイソ形を示す電気泳動である。FIG. 2 shows the region of domain III used to generate C-13 antibody, the lower shows the activated isoforms of 70 kDa protein and calpain I in various fractions of brain tissue. Electrophoresis.

【図３】 ＡＤ脳（パネルＢ）に存在し、対照脳（パネ
ルＢ）には存在しない、神経炎プラーク、もつれおよび
神経網糸の繊維の形状の特異的染色を示す一連の写真で
ある。FIG. 3 is a series of photographs showing specific staining of neuritic plaques, tangles and fiber morphology of neuropil, present in AD brain (panel B) but not in control brain (panel B).

【図４】 ＡＤおよび対照脳の上清液中のカルパインＩ
のドメインIIIの部分に対して生じたＣ−１３抗体の免
疫反応性を比較するグラフである。エルセ（Ｅlce）Ｉ
抗体およびＬ／Ｈ比を比較する。グラフはｒ²＝０.８７
９を示す。FIG. 4: Calpain I in supernatants of AD and control brains
3 is a graph comparing the immunoreactivity of C-13 antibody generated against the domain III portion of E. coli. Elce I
Compare antibody and L / H ratio. The graph shows r ² = 0.87
9 is shown.

【図５】 異なったカルパインエピトープに対して生ず
る抗体を用いて、カルパイン系における変化を研究する
ための、脳組織の分別に用いる方法を示す図である。FIG. 5 shows a method used to sort brain tissue to study changes in the calpain system using antibodies raised against different calpain epitopes.

【図６】 ＡＤおよび対照患者からの脳組織の画分中の
Ｃ−１３抗体の免疫反応性を示す一連のグラフである。FIG. 6 is a series of graphs showing C-13 antibody immunoreactivity in fractions of brain tissue from AD and control patients.

【図７】 ＡＤ（Ａ）および対照（Ｃ）試料中の、カル
パインＩの活性化アイソ形および７０kＤaタンパク質の
比較である。FIG. 7 is a comparison of the activated isoform of calpain I and the 70 kDa protein in AD (A) and control (C) samples.

【図８】 Ｃ−１３抗原の精製に用いる方法を示すチャ
ートである。FIG. 8 is a chart showing the method used to purify the C-13 antigen.

【図９】 ほとんど精製された７０kＤaタンパク質を作
る、脳の前頭葉前部皮質からの一連の精製された画分中
のカルパインＩの活性化されたアイソ形および７０kＤa
タンパク質の存在を示す電気泳動である。FIG. 9: Activated isoform of calpain I and 70 kDa in a series of purified fractions from the prefrontal cortex of the brain that make the most purified 70 kDa protein.
Electrophoresis showing the presence of proteins.

【図１０】 １７個のアミノ酸を有するＣ−１３抗原配
列である。第１番目のアミノ酸（かっこ内に示され
る）、システインは免疫（この場合は牛血清アルブミ
ン）に必要なキャリアタンパク質を実際のペプチドにコ
ンジュゲートするために結合させる。実際のペプチド配
列はカルパインＩのドメインIIIの１６のアミノ酸より
なる。FIG. 10 is a C-13 antigen sequence having 17 amino acids. The first amino acid (shown in brackets), cysteine, binds the carrier protein required for immunity (in this case bovine serum albumin) to conjugate the actual peptide. The actual peptide sequence consists of 16 amino acids of domain III of calpain I.

【図１１】 人のカルパインＩの配列（配列表の配列番
号２）である。FIG. 11 is a human calpain I sequence (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フリーダ・グリンスパン アメリカ合衆国02194マサチューセッツ州 ニーダム、スプリング・ロード42番 ─────────────────────────────────────────────────── ———————————————————————————————— Inventor Frida Grinspan United States 02194 No. 42 Spring Road, Needham, Mass., USA

Claims (25)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 患者由来の生物学的試料中の、アルツハ
イマー病に伴うパラメータを測定する方法であって、該
方法は該生物学的試料中に存在する活性化されたアイソ
形のカルパインＩまたは７０kＤaタンパク質の量を測定
することを含んでなる方法。1. A method for measuring a parameter associated with Alzheimer's disease in a biological sample derived from a patient, which method comprises the activated isoform of calpain I present in the biological sample or A method comprising measuring the amount of a 70 kDa protein. 【請求項２】 病気になっていない人からの対照試料に
おけるレベルより５０％以上の患者における増加がアル
ツハイマー病を示す請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein an increase in a patient of 50% or more above a level in a control sample from an unaffected person is indicative of Alzheimer's disease. 【請求項３】 該測定を、該試料をカルパインＩの領域
IIIを特異的に結合することができる抗体と接触させ、
その結合量を測定することを含んでなる免疫アッセイを
用いて行う請求項１に記載の方法。3. The measurement is performed on the sample in the region of calpain I.
Contacting with an antibody capable of specifically binding III,
The method according to claim 1, wherein the method is performed by using an immunoassay which comprises measuring the binding amount. 【請求項４】 生物学的試料が患者の腰部のＣＳＦであ
る請求項１に記載の方法。4. The method of claim 1, wherein the biological sample is CSF of a patient's lumbar region. 【請求項５】 生物学的試料が患者の心室のＣＳＦであ
る請求項１に記載の方法。5. The method of claim 1, wherein the biological sample is ventricular CSF of a patient. 【請求項６】 生物学的試料が患者の末梢血液組織であ
る請求項１に記載の方法。6. The method of claim 1, wherein the biological sample is peripheral blood tissue of a patient. 【請求項７】 末梢血液組織がリンパ芽球組織である請
求項６に記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the peripheral blood tissue is lymphoblastoid tissue. 【請求項８】 生物学的試料が患者からの繊維芽細胞試
料である請求項１に記載の方法。8. The method of claim 1, wherein the biological sample is a fibroblast sample from a patient. 【請求項９】 生物学的試料が患者の脳組織ホモジネー
トである請求項１に記載の方法。9. The method of claim 1, wherein the biological sample is brain tissue homogenate of a patient. 【請求項１０】 生物学的試料が患者の脳組織の薄切片
である請求項１に記載の方法。10. The method according to claim 1, wherein the biological sample is a thin section of brain tissue of a patient. 【請求項１１】 接触がウェスタンブロット分析による
請求項２に記載の方法。11. The method of claim 2, wherein the contacting is by Western blot analysis. 【請求項１２】 接触がイムノステイニングによる請求
項７に記載の方法。12. The method of claim 7, wherein the contacting is by immunostaining. 【請求項１３】 抗体がカルパインＩのアミノ酸３１７
〜３５５（配列表の配列番号２）を含んでなるペプチド
を特異的に結合する請求項３に記載の方法。13. The antibody is amino acid 317 of calpain I.
The method according to claim 3, which specifically binds a peptide comprising ~ 355 (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). 【請求項１４】 特異的結合がカルパインＩのアミノ酸
３４６〜３６１（配列表の配列番号１）に対してである
請求項１３に記載の方法。14. The method according to claim 13, wherein the specific binding is to amino acids 346 to 361 of calpain I (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). 【請求項１５】 抗体がＣ−１３である請求項１３に記
載の方法。15. The method of claim 13, wherein the antibody is C-13. 【請求項１６】 抗体がカルパインＩの活性化されたア
イソ形またはその断片を特異的に結合する請求項３に記
載の方法。16. The method of claim 3, wherein the antibody specifically binds an activated isoform of calpain I or a fragment thereof. 【請求項１７】 ８％アクリルアミドゲルで７０kＤaと
７４kＤaの間の分子量を有する実質的に純粋なタンパク
質であって、該タンパク質はＡＤを有する患者の脳組織
中では高いレベルで存在し、さらに該タンパク質はカル
パインＩのアミノ酸３４６〜３６１（配列表 １）また
はその断片を特異的に結合する抗体を特異的に結合する
ことができるタンパク質。17. A substantially pure protein having a molecular weight between 70 and 74 kDa on an 8% acrylamide gel, the protein being present at high levels in brain tissue of patients with AD, and wherein the protein is Is a protein capable of specifically binding an antibody that specifically binds amino acids 346 to 361 of calpain I (SEQ ID NO: 1) or a fragment thereof. 【請求項１８】 請求項１７のポリペプチドを特異的に
結合する抗体。18. An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 17. 【請求項１９】 図１０（配列表の配列番号１）に示す
カルパインＩのアミノ酸３４６〜３６１（配列表の配列
番号１）を含んでなる実質的に純粋なペプチド。19. A substantially pure peptide comprising amino acids 346 to 361 of calpain I shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 1 of the sequence listing) (SEQ ID NO: 1 of the sequence listing). 【請求項２０】 カルパインＩのドメインIIIを特異的
に結合する抗体を製造する方法であって、該方法は、
（a）哺乳動物をカルパインＩのアミノ酸３１７〜３５
５（配列表の配列番号２）を含んでなるポリペプチドで
免疫し、（b）カルパインＩの活性化されたアイソ形に
結合することができる抗体を哺乳動物から精製するこ
と、を含んでなる方法。20. A method for producing an antibody that specifically binds to domain III of calpain I, said method comprising:
(A) Amino acids 317-35 of calpain I in mammals
Immunizing with a polypeptide comprising 5 (SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing), and (b) purifying an antibody capable of binding to an activated isoform of calpain I from a mammal. Method. 【請求項２１】 アミノ酸がアミノ酸３４６〜３６１
（配列表の配列番号１）である請求項２０に記載のポリ
ペプチド。21. The amino acid is amino acid 346 to 361.
The polypeptide according to claim 20, which is (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). 【請求項２２】 アルツハイマー病のインビトロ診断用
キットであり、該キットはカルパインＩのドメインIII
を特異的に結合することができる抗体を含んでなるキッ
ト。22. A kit for in vitro diagnosis of Alzheimer's disease, which kit comprises domain III of calpain I.
A kit comprising an antibody capable of specifically binding to. 【請求項２３】 抗体がカルパインＩのアミノ酸３４６
〜３６１（配列表の配列番号１）を特異的に結合する請
求項２２に記載のキット。23. The antibody is amino acid 346 of calpain I.
23. The kit according to claim 22, which specifically binds .about. 【請求項２４】 抗体がＣ−１３である請求項２３に記
載のキット。24. The kit according to claim 23, wherein the antibody is C-13. 【請求項２５】 抗体が７０kＤaポリペプチドまたはそ
の断片を特異的に結合する請求項２２に記載のキット。25. The kit of claim 22, wherein the antibody specifically binds a 70 kDa polypeptide or fragment thereof.