JPH08103283A - Production of tryptophan - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To highly efficiently produce L-tryptophan at a low cost. CONSTITUTION: The characteristics of the method for producing the tryptophan by enzymatically reacting indole with L-serine in the presence of microorganisms containing tryptophan synthetase or tryptophanase or their treated products in an aqueous solution comprise maintaining the pH of the aqueous solution to 9.0 to 10.0, maintaining the L-serine in a concentration of >=30M, subjecting the indole and the L-serine to enzymatic reaction, producing and accumulating the L-tryptophan in the reaction solution up to a concentration of 3%(w/v) to 5%(w/v), and subsequently collecting the L-tryptophan from the reaction solution.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−トリプトファンの
製造法に関し、更に詳しくは、原料としてインドールお
よびＬ−セリンを用い、トリプトファンシンターゼある
いはトリプトファナーゼの酵素反応により、反応液中に
高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめるＬ−ト
リプトファンの製造法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing L-tryptophan, and more specifically, it uses indole and L-serine as raw materials and produces a high concentration in a reaction solution by an enzymatic reaction of tryptophan synthase or tryptophanase. The present invention relates to a method for producing L-tryptophan, which produces and accumulates L-tryptophan.

【０００２】[0002]

【従来の技術】固定化酵素源を用いて、インドール及び
Ｌ−セリンからＬ−トリプトファンを製造する方法に於
て、反応液中のＬ−セリンをインドールに対して、理論
当量比よりも過剰に存在させることを特徴とするＬ−ト
リプトファンの製造方法が提案されている（特開昭６３
−４９０９１号報）。該方法によれば、ｐＨ８．５の酵
素反応液を用いてＬ−トリプトファンが０．４３８％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で連続的に製造可能なことが開示され
ている。2. Description of the Related Art In a method for producing L-tryptophan from indole and L-serine using an immobilized enzyme source, the amount of L-serine in the reaction solution relative to indole is more than the theoretical equivalent ratio. A method for producing L-tryptophan, which is characterized in that it is present, has been proposed (JP-A-63-63).
-49091 report). According to this method, L-tryptophan was 0.438% in the enzyme reaction solution having a pH of 8.5.
It is disclosed that continuous production can be performed at a concentration of (W / V).

【０００３】また、本発明者らは先にエシェリヒア属に
属する微生物のトリプトファンシンターゼ又は、トリプ
トファナーゼ活性を利用してインドールとＬ−セリンか
ら酵素反応によるＬ−トリプトファンの製造法を提案
（特公平５−７９３１１、特開平１−５１０９３等）し
たが、反応液中のＬ−トリプトファン濃度には限界があ
った。Further, the present inventors have previously proposed a method for producing L-tryptophan from indole and L-serine by an enzymatic reaction utilizing tryptophan synthase or tryptophanase activity of a microorganism belonging to the genus Escherichia (Patent Literature). 5-79311, JP-A-1-51093, etc.), but the concentration of L-tryptophan in the reaction solution was limited.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】前記の如く、トリプト
ファンシンターゼ又はトリプトファナーゼ活性を利用し
てインドールとＬ−セリンからＬ−トリプトファンを生
成蓄積せしめるに際し、該酵素活性が生成したＬ−トリ
プトファンにより強い活性阻害を受ける為、Ｌ−トリプ
トファンの反応液中の濃度をある程度以上増加させるこ
とが出来なかった。しかしながら、効率よく安価なＬ−
トリプトファンの製造法を確立するために、反応液中に
より高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめる方
法の提供が求められている。As described above, when L-tryptophan is produced and accumulated from indole and L-serine by utilizing tryptophan synthase or tryptophanase activity, the L-tryptophan produced by the enzyme has a stronger activity. Due to the inhibition of the activity, the concentration of L-tryptophan in the reaction solution could not be increased to some extent. However, it is efficient and inexpensive L-
In order to establish a method for producing tryptophan, it is required to provide a method for producing and accumulating a higher concentration of L-tryptophan in a reaction solution.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決する為酵素反応液の組成等を鋭意検討した結果、
トリプトファンシンターゼまたはトリプトファナーゼ活
性に対するＬ−トリプトファンの阻害を回避することに
成功し、反応液中にＬ−トリプトファンを高濃度で生成
蓄積し得ることを見い出し本発明を完成するに到った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies on the composition of an enzyme reaction solution in order to solve the above problems,
The present inventors have succeeded in avoiding the inhibition of L-tryptophan on tryptophan synthase or tryptophanase activity, have found that L-tryptophan can be produced and accumulated at a high concentration in the reaction solution, and completed the present invention.

【０００６】すなわち、本発明はトリプトファンシンタ
ーゼまたはトリプトファナーゼを含有する微生物菌体、
または、その処理物の存在下に、インドールとＬ−セリ
ンを含有する水溶液中で酵素反応させて、Ｌ−トリプト
ファンを生成させるに際し、該水溶液中のｐＨを９．０
〜１０．０に維持し、かつ、Ｌ−セリン濃度を３０ｍＭ
以上に維持して酵素反応させ、該反応液中にＬ−トリプ
トファンを３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで
生成蓄積せしめ、該反応液からＬ−トリプトファンを採
取することを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法を
提供する。[0006] That is, the present invention is a microbial cell containing tryptophan synthase or tryptophanase,
Alternatively, when L-tryptophan is produced by enzymatic reaction in an aqueous solution containing indole and L-serine in the presence of the treated product, the pH of the aqueous solution is adjusted to 9.0.
Maintained at ~ 10.0 and L-serine concentration of 30 mM
An enzyme reaction is carried out while maintaining the above, L-tryptophan is produced and accumulated in the reaction solution to a concentration of 3% (w / v) to 5% (w / v), and L-tryptophan is collected from the reaction solution. A method for producing L-tryptophan is provided.

【０００７】さらに、本発明を詳細に説明する。本発明
に用いられるトリプトファンシンターゼを含有する微生
物としてはインドールとＬ−セリンからＬ−トリプトフ
ァンを生成しうる能力を有する微生物であれば特に限定
されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ−
１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリＹＫ
２００４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３２）、エシェリヒア
・コリＹＫ２００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４４）等が
挙げられる。Further, the present invention will be described in detail. The tryptophan synthase-containing microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing L-tryptophan from indole and L-serine. For example, Escherichia coli K-
12 (ATCC27325), Escherichia coli YK
2004 (FERM BP-1732), Escherichia coli YK2009 (FERM BP-3244) and the like.

【０００８】また、トリプトファナーゼを含有する微生
物としては、インドールとＬ−セリンからＬ−トリプト
ファンを生成しうる能力を有する微生物であれば特に限
定されるものではなく、例えば、エシェリヒア・コリＫ
−１２（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリ
ＡＴＣＣ２５０１９、エシェリヒア・コリＹ ＩＦＯ３
３０１、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２ ＹＫ３００２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３３）、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２ ＹＫ３００３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３
４）、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２ ＹＫ３００５
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３６）等が挙げられる。The microorganism containing tryptophanase is not particularly limited as long as it has the ability to produce L-tryptophan from indole and L-serine. For example, Escherichia coli K
-12 (ATCC27325), Escherichia coli
ATCC25019, Escherichia coli YIFO3
301, Escherichia coli K-12 YK3002
(FERM BP-1733), Escherichia coli
K-12 YK3003 (FERM BP-173
4), Escherichia coli K-12 YK3005
(FERM BP-1736) and the like.

【０００９】トリプトファンシンターゼまたはトリプト
ファナーゼを含有する微生物の培養は、それ自体既知の
通常用いられる、炭素源、窒素源、無機塩等を含む培地
で行うことができる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜等が、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の各種ビ
タミン等の栄養素を培地に添加することができる。Cultivation of a microorganism containing tryptophan synthase or tryptophanase can be carried out in a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt and the like which are commonly used and known per se. As the carbon source, for example, glucose, glycerol, fructose, sucrose, molasses and the like are used, and as the nitrogen source, for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium nitrate are used alone or in combination. Further, as the inorganic salt, for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like are used. In addition to this, nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, biotin and thiamine can be added to the medium.

【００１０】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気的
条件下に、培養温度は一般に２０℃〜５０℃の温度で行
うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましく
は７〜８付近とすることができ、培養中のｐＨ調整は酸
又はアルカリを添加して行うことができる。培養開始時
の炭素源濃度は、特に制限するものではないが、通常１
〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜５％（ｗ／
ｖ）である。また、培養期間は通常約５時間〜約５日間
である。Culturing can be carried out under aerobic conditions such as aeration and stirring, and generally at a culturing temperature of 20 ° C to 50 ° C. The pH during the culture can be set to 5 to 10, preferably around 7 to 8, and the pH can be adjusted during the culture by adding an acid or an alkali. The carbon source concentration at the start of culture is not particularly limited, but is usually 1
-10% (w / v), more preferably 2-5% (w /
v). The culture period is usually about 5 hours to about 5 days.

【００１１】本発明の方法は、上記の如く培養して得た
培養物、該培養物を遠心分離法等により分離して得られ
る菌体または該菌体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌
体、あるいはそれらの固定化物等の種々の形態が使用さ
れる。また、菌体破砕物、あるいはそれらを抽出・精製
して得た酵素または該酵素を固定化した固定化酵素を使
用してもよい。The method of the present invention comprises a culture obtained by culturing as described above, cells obtained by separating the culture by centrifugation or the like, or a treated product of the cells, for example, washed cells, dried. Various forms such as bacterial cells or their immobilized products are used. In addition, crushed cells, an enzyme obtained by extracting and purifying them, or an immobilized enzyme having the enzyme immobilized may be used.

【００１２】かくして得られる、トリプトファンシンタ
ーゼまたはトリプトファナーゼを含有する微生物または
その処理物をインドールとＬ−セリンを含有する水溶液
中で酵素反応させて、反応液中にＬ−トリプトファンを
生成蓄積せしめることができる。基質であるインドール
の反応液中の濃度は、特に制限はないが、好ましくは
０．５〜２ｍＭである。[0012] The thus obtained microorganism containing tryptophan synthase or tryptophanase or a treated product thereof is subjected to an enzymatic reaction in an aqueous solution containing indole and L-serine to produce and accumulate L-tryptophan in the reaction solution. You can The concentration of the substrate indole in the reaction solution is not particularly limited, but is preferably 0.5 to 2 mM.

【００１３】セリンの反応液中の濃度は、Ｌ−セリンを
用いる場合は２０ｍＭ〜２０００ｍＭ、好ましくは３０
ｍＭ〜１０００ｍＭ、Ｄ，Ｌ−セリンを用いる場合は４
０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは６０ｍＭ〜５００ｍＭ
である。反応液には、基質であるインドール、セリンの
他に、Ｌ−トリプトファンの生成率を高めるためにピリ
ドキサールリン酸（ＰＬＰ）を添加せしめることが好ま
しい。The concentration of serine in the reaction solution is 20 mM to 2000 mM, preferably 30 when L-serine is used.
mM-1000 mM, 4 when using D, L-serine
0 mM to 500 mM, preferably 60 mM to 500 mM
Is. In addition to the substrates indole and serine, which are substrates, pyridoxal phosphate (PLP) is preferably added to the reaction solution in order to increase the production rate of L-tryptophan.

【００１４】溶媒としては、一般には、水が用いられ、
必要に応じてトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン
アルキルフェノールエーテル系非イオン性界面活性
剤）、ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレイト系非イオン性界面活性剤）等の界面活性剤
を添加することもできる。反応液中のｐＨは、９〜１０
であり、ｐＨの調整は酸又はアルカリを添加して行うこ
とができる。As the solvent, water is generally used,
Add surfactants such as Triton X-100 (polyoxyethylene alkylphenol ether-based nonionic surfactant) and Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate-based nonionic surfactant) as necessary. You can also The pH of the reaction solution is 9 to 10.
The pH can be adjusted by adding an acid or an alkali.

【００１５】反応温度は１５〜６０℃、好ましくは、２
０〜５０℃である。上記の如く酵素反応させることによ
りＬ−トリプトファンを、高濃度で生成蓄積させること
ができる。さらに、本製造法は、該酵素や微生物を、膜
を利用して系内に封じ込め、反応と同時に生成物を含有
した透過液を抜き出し、菌体分離を連続的に行いＬ−ト
リプトファンを高濃度に効率よく連続製造することもで
きる。The reaction temperature is 15 to 60 ° C., preferably 2
It is 0 to 50 ° C. L-tryptophan can be produced and accumulated at a high concentration by the enzymatic reaction as described above. Furthermore, in the present production method, the enzyme or the microorganism is contained in the system by using a membrane, the permeate containing the product is extracted at the same time as the reaction, and the cells are continuously separated to obtain a high concentration of L-tryptophan. Moreover, continuous production can be performed efficiently.

【００１６】得られたＬ−トリプトファンの分離・精製
は、通常のイオン交換樹脂法、晶析法、その他の公知の
方法を組み合わせることにより、容易に行うことができ
る。Separation / purification of the obtained L-tryptophan can be easily carried out by combining an ordinary ion exchange resin method, a crystallization method and other known methods.

【００１７】[0017]

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、下記
の実施例は本発明について具体的な認識を得る一助とし
てのみ挙げるものであり、これによって本発明の範囲は
何ら限定されるものではない。The present invention has been described above, but the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are given only as an aid to gain a concrete understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby.

【００１８】実施例１ （１）トリプトファンシンターゼによるＬ−トリプトフ
ァン生成反応における、セリン濃度の影響 ＭＴＰ培地〔組成：Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７．０ｇ、ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ ２．０ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ １．０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １００ｍｇ、アデニン塩酸塩 ５０
ｍｇ、酵母エキス １ｇ、トリプトン １ｇ、グルコー
ス １．０ｇ、蒸留水 １Ｌ、ｐＨ７．２〕５０ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分
間滅菌処理したものにエシェリヒア・コリ Ｋ−１２
ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４４）株を植菌
し、３７℃にて１日振とう培養後、同様にして調製した
ＭＴＰ培地１Ｌを分注した５Ｌ容三角フラスコに、２０
ｍｌの培養液を接種し、３７℃にて１２時間振とう培養
した。また、培養開始３時間後に培地中にインドールア
クリル酸１００ｍｇを添加した。遠心分離を用いて菌体
を回収し、−２０℃で２日間凍結し保存後、以下の実験
に用いた。Example 1 (1) L-tryptophan by tryptophan synthase
Effect of Serine Concentration on Fan Formation Reaction MTP medium [composition: K ₂ HPO ₄ 7.0 g, KH ₂ P
O ₄ 2.0 g, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.0 g, Mg
SO ₄ · 7H ₂ O 100mg, adenine hydrochloride 50
50 mg of yeast extract 1 g, tryptone 1 g, glucose 1.0 g, distilled water 1 L, pH 7.2] was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. Escherichia coli K-12
The YK2009 (FERM BP-3244) strain was inoculated, shake-cultured at 37 ° C. for 1 day, and then 20 mL of a 5 L Erlenmeyer flask was prepared by dispensing 1 L of MTP medium prepared in the same manner.
A culture solution (ml) was inoculated, and the mixture was shake-cultured at 37 ° C for 12 hours. In addition, 100 mg of indole acrylic acid was added to the medium 3 hours after the start of culture. The cells were collected by centrifugation, frozen at -20 ° C for 2 days and stored, and then used in the following experiments.

【００１９】第１表に示すＬ−セリン濃度に調節した酵
素反応液〔組成：Ｌ−セリン ２０ｍＭ、３０ｍＭ、５
０ｍＭ、あるいは、１００ｍＭ、と、インドール １ｍ
Ｍ、ＰＬＰ ０．０４ｍＭ、ＮａＣｌ ４０ｍＭ、Ｌ−
トリプトファン １９６ｍＭとを含有、２５％アンモニ
ア溶液でｐＨ９．５に調整〕０．９ｍｌに希釈液〔Ｌ−
セリン ２０ｍＭ、ＰＬＰ ０．０４ｍＭ〕で適宜希釈
した上記の凍結菌体懸濁液０．１ｍｌ添加し、３０℃で
１５分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸溶液１．
０ｍｌを加え反応を停止させる。遠心（８０００×ｇ、
１０分間）した後、上清液を０．５ｍｌ分取し、０．１
ｍｌの５Ｎ ＮａＯＨ溶液とトルエン４．０ｍｌを加え
撹拌後、２分間静置し上層（トルエン層）１．０ｍｌを
呈色液〔組成：ｐ−ジメチルベンズアルデヒド ３．６
ｇ、濃塩酸 １８ｍｌ、エタノールで２８２ｍｌ〕３．
０ｍｌに加え撹拌する。４０分間放置後吸光度５４０ｎ
ｍを測定し、インドールの残量を測定し、インドールの
減少量からトリプトファン合成活性を算出した。活性測
定の結果を第１表に示す。Ｌ−セリン各濃度におけるト
リプトファン合成活性は、Ｌ−セリン３０ｍＭ添加の場
合を１００とする相対値で示した。Enzyme reaction solution adjusted to the L-serine concentration shown in Table 1 [Composition: L-serine 20 mM, 30 mM, 5
0mM or 100mM and indole 1m
M, PLP 0.04 mM, NaCl 40 mM, L-
Containing tryptophan 196 mM, adjusted to pH 9.5 with 25% ammonia solution] diluted to 0.9 ml [L-
Serine 20 mM, PLP 0.04 mM] 0.1 ml of the above-mentioned frozen bacterial cell suspension appropriately diluted and reacted at 30 ° C. for 15 minutes, and then 10% trichloroacetic acid solution 1.
Stop the reaction by adding 0 ml. Centrifuge (8000 xg,
After 10 minutes), collect 0.5 ml of the supernatant,
After adding 5 ml of 5N NaOH solution and 4.0 ml of toluene and stirring, the mixture was left standing for 2 minutes and 1.0 ml of the upper layer (toluene layer) was colored liquid [composition: p-dimethylbenzaldehyde 3.6.
g, concentrated hydrochloric acid 18 ml, ethanol 282 ml] 3.
Add to 0 ml and stir. Absorbance 540n after leaving for 40 minutes
m was measured, the residual amount of indole was measured, and the tryptophan synthesis activity was calculated from the decreased amount of indole. The results of activity measurement are shown in Table 1. The tryptophan synthesizing activity at each concentration of L-serine was shown as a relative value with 100 in the case of adding 30 mM of L-serine.

【００２０】[0020]

【表１】 第１表 Ｌ−セリン濃度 Ｌ−トリプトファン （ｍＭ） 合成活性（相対値） ２０ ５０ ３０ １００ ５０ １１５ １００ １２０ [Table 1] Table 1 L-serine concentration L-tryptophan (mM) synthesis activity (relative value) 20 50 30 100 100 50 115 115 100 120

【００２１】（２）トリプトファンシンターゼによるＬ
−トリプトファン生成反応における、セリン濃度の影響 前記実施例１の（１）と同様の方法で調製したエシェリ
ヒア・コリ Ｋ−１２ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３２４４）株の凍結菌体の１０ｇを、インドール ０．
１ｇ、Ｌ−セリン ３．１５ｇ、ＰＬＰ １００ｍｇ、
ＮａＣｌ ２．３ｇを含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ
９．５に２５％アンモニアで調整）に懸濁した後、全体
の体積を水で１０００ｍｌに調整した（調整後のＬ−セ
リン濃度：３０ｍＭ）。本懸濁液をそれぞれ３Ｌジャー
ファーメンター（エイブル社製）に仕込み、３０℃で４
８時間撹拌しながら反応を行った。反応中、反応液のｐ
Ｈを２５％アンモニアで９．５に調整した。また、３分
毎に、０．０２６ｇのインドールを継続的に添加し、総
量として２４．９６ｇのインドールを添加した。さら
に、反応液中のＬ−セリン濃度を高速液体クロマトグラ
フィー（島津製作所製）を用いてモニターしながら第２
表に示す各実験区の指定Ｌ−セリン濃度を超えることな
くＬ−セリン濃度を保てるように連続的あるいは断続的
に添加した。(2) L by tryptophan synthase
-Effect of serine concentration on tryptophan formation reaction Escherichia coli K-12YK2009 (FERM BP- prepared by the same method as in Example 1 (1))
10 g of frozen cells of the strain 3244) was added to Indole.
1 g, L-serine 3.15 g, PLP 100 mg,
500 ml of reaction solution containing 2.3 g of NaCl (pH
After suspension in 9.5 with 25% ammonia, the total volume was adjusted to 1000 ml with water (L-serine concentration after adjustment: 30 mM). Each of the suspensions was placed in a 3 L jar fermenter (manufactured by Able), and the suspension was placed at 30 ° C for 4
The reaction was carried out with stirring for 8 hours. During the reaction, p of the reaction solution
The H was adjusted to 9.5 with 25% ammonia. Further, every 3 minutes, 0.026 g of indole was continuously added, and a total amount of 24.96 g of indole was added. Furthermore, while monitoring the L-serine concentration in the reaction solution using high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation), the second
It was added continuously or intermittently so that the L-serine concentration could be maintained without exceeding the designated L-serine concentration of each experimental group shown in the table.

【００２２】同様にして、反応液中のＬ−セリン濃度を
２０、５０、および、１００ｍＭに調節し上記の方法に
より反応を行った。反応終了後、直ちに反応液を遠心分
離して得た上清液について高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析
を行った。その結果を第２表に示す。また、Ｌ−セリン
濃度２０ｍＭの反応液で行った反応では、４８時間後に
は、Ｌ−セリンの減少は見られなかった。Similarly, the L-serine concentration in the reaction solution was adjusted to 20, 50 and 100 mM, and the reaction was carried out by the above method. Immediately after completion of the reaction, the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution was analyzed for L-tryptophan produced by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). Table 2 shows the results. Further, in the reaction carried out with the reaction solution having an L-serine concentration of 20 mM, no decrease in L-serine was observed after 48 hours.

【００２３】次に、Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した
反応終了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１
０にしたのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−トリプトファンの粗結晶を析出させたのち、これを
アセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１
５．５ｇを得た。Next, an aqueous solution of NaOH was added to 500 ml of the reaction-terminated liquid which had reacted at a L-serine concentration of 30 mM to adjust the pH to 1
After setting to 0, a crude crystal of L-tryptophan was precipitated through a column of ammonia type strongly acidic ion exchange resin (Diaion SK-1B, manufactured by Mitsubishi Kasei), washed with acetone and dried to give L-tryptophan. Crystal 1
5.5 g was obtained.

【００２４】[0024]

【表２】 第２表 Ｌ−セリンの濃度 Ｌ−トリプトファン （ｍＭ） 生成濃度％（ｗ／ｖ） ２０ ２．５ ３０ ４．１ ５０ ４．１ １００ ４．１ [Table 2] Table 2 L-serine concentration L-tryptophan (mM) production concentration% (w / v) 20 2.5 30 4.1 4.1 50 4.1 100 100 4.1

【００２５】実施例２トリプトファンシンターゼによるＬ−トリプトファン生
成反応における、ｐＨの影響 エシェリヒア・コリＫ−１２ ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２４４）株を実施例１と同様に培養して得た
凍結菌体８ｇを用いて３Ｌジャーファーメンター（エイ
ブル社製）で反応を行った。反応はＬ−セリンを３０ｍ
Ｍ含有する実施例１の（２）と同様の反応液を用い、但
しｐＨを２５％アンモニア溶液で９．３、９．５、およ
び９．７に調節しながら３７℃で４８時間反応した。ま
た、３分毎に、０．０３３ｇのインドールおよび０．０
３ｇのＬ−セリンを添加した。その結果、総量３１．６
８ｇのインドールおよび２８．８ｇのＬ−セリンを添加
した。同様にして、反応終了後、直ちに反応液を遠心分
離して得た上清液について高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析
を行った結果を第３表に示す。Example 2 Production of L-tryptophan by tryptophan synthase
Effect of pH on growth reaction Escherichia coli K-12 YK2009 (FERM
The BP-3244) strain was cultured in the same manner as in Example 1, and 8 g of the frozen bacterial cells obtained were used to perform a reaction in a 3 L jar fermenter (manufactured by Able). The reaction was 30m for L-serine
Using the same reaction solution as in (2) of Example 1 containing M, the reaction was carried out at 37 ° C. for 48 hours while adjusting the pH to 9.3, 9.5, and 9.7 with a 25% ammonia solution. Also, every 3 minutes, 0.033 g of indole and 0.0
3 g L-serine was added. As a result, the total amount is 31.6
8g of indole and 28.8g of L-serine were added. Similarly, after the completion of the reaction, immediately after the reaction, the supernatant obtained by centrifugation was analyzed for L-tryptophan produced by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in Table 3.

【００２６】[0026]

【表３】 第３表 Ｌ−トリプトファン 反応液のｐＨ 生成濃度％（ｗ／ｖ） ９．３ ３．０ ９．５ ４．１ ９．７ ５．０ Table 3 Table 3 L-tryptophan reaction solution pH generation concentration% (w / v) 9.3 3.0 9.5 4.1 9.7 5.0

【００２７】実施例３ （１）トリプトファナーゼによるＬ−トリプトファン生
成反応における、セリン濃度の影響 実施例１と同様にしてエシェリヒア・コリ Ｋ−１２
ＹＫ３００５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３６）株を培養し
た後、遠心分離を用いて菌体を回収し、−２０℃で２日
間凍結し保存後、以下の実験に用いた。Example 3 (1) Production of L-tryptophan by tryptophanase
Effect of Serine Concentration on Growth Reaction Escherichia coli K-12 in the same manner as in Example 1.
After culturing the YK3005 (FERM BP-1736) strain, the cells were collected by centrifugation, frozen at -20 ° C for 2 days and stored, and then used in the following experiments.

【００２８】第３表に示すＬ−セリン濃度に調節した酵
素反応液〔組成：Ｌ−セリン ２０ｍＭ、３０ｍＭ、５
０ｍＭ、あるいは、１００ｍＭ、インドール １０ｍ
Ｍ、ＰＬＰ ０．０４ｍＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ、Ｌ−ト
リプトファン １９６ｍＭ、ＫＯＨ溶液でｐＨ９．５に
調製〕０．９ｍｌに希釈液〔Ｌ−セリン ２０ｍＭ、Ｐ
ＬＰ ０．０４ｍＭ〕で適宜希釈した上記の凍結菌体懸
濁液０．１ｍｌ添加し、３０℃で１５分間反応させた
後、５Ｎ ＮａＯＨ溶液０．１ｍｌを加え反応を停止さ
せる。遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）した上清液
を１０倍に希釈した後、０．５ｍｌ分取しトルエン４．
０ｍｌを加え撹拌後、２分間静置し上層（トルエン層）
１．０ｍｌを呈色液〔組成：ｐ−ジメチルベンズアルデ
ヒド ３．６ｇ、濃塩酸 １８ｍｌをエタノールで３０
０ｍｌにメスアップした溶液〕３．０ｍｌに加え撹拌す
る。４０分間放置後吸光度５４０ｎｍを測定し、インド
ールの残量を測定し、インドールの減少量からトリプト
ファン合成活性を算出した。活性測定の結果を第４表に
示す。Ｌ−セリン各濃度におけるトリプトファン合成活
性は、Ｌ−セリン３０ｍＭ添加の場合を１００とする相
対値で示した。Enzyme reaction solution adjusted to L-serine concentration shown in Table 3 [Composition: L-serine 20 mM, 30 mM, 5
0 mM or 100 mM, indole 10 m
M, PLP 0.04mM, KCl 50mM, L-tryptophan 196mM, adjusted to pH 9.5 with KOH solution] 0.9 ml diluted solution [L-serine 20mM, P
0.1 ml of the above-mentioned frozen cell suspension appropriately diluted with LP 0.04 mM] is added, and the mixture is reacted at 30 ° C. for 15 minutes, and then the reaction is stopped by adding 0.1 ml of 5N NaOH solution. The supernatant liquid after centrifugation (8000 × g, 10 minutes) was diluted 10 times, and then 0.5 ml was collected and toluene 4.
After adding 0 ml and stirring, let stand for 2 minutes and then upper layer (toluene layer)
1.0 ml of a coloring solution [composition: 3.6 g of p-dimethylbenzaldehyde, 18 ml of concentrated hydrochloric acid was added to 30 ml of ethanol.
Solution added up to 0 ml] Add to 3.0 ml and stir. After standing for 40 minutes, the absorbance at 540 nm was measured, the remaining amount of indole was measured, and the tryptophan synthesis activity was calculated from the reduced amount of indole. The results of activity measurement are shown in Table 4. The tryptophan synthesizing activity at each concentration of L-serine was shown as a relative value with 100 in the case of adding 30 mM of L-serine.

【００２９】[0029]

【表４】 第４表 Ｌ−セリン濃度 Ｌ−トリプトファン （ｍＭ） 合成活性（相対値） ２０ ５０ ３０ １００ ５０ １３０ １００ １５０ [Table 4] Table 4 L-serine concentration L-tryptophan (mM) synthetic activity (relative value) 20 50 30 100 100 50 130 130 100 150

【００３０】（２）トリプトファナーゼによるＬ−トリ
プトファン生成反応における、セリン濃度の影響 前記と同様にして調製したエシェリヒア・コリ Ｋ−１
２ ＹＫ３００５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７３６）株の凍
結菌体を用いて以下の実験を行った。該凍結菌体の５ｇ
をインドール ５．８５ｇ、Ｌ−セリン ３．１５ｇ、
ピリドキサールリン酸 １００ｍｇ、ＫＣｌ ３．８ｇ
を含有する反応液５００ｍｌ（ｐＨ９．５にＫＯＨ溶液
で調整）に懸濁した後、全体の体積を１０００ｍｌに水
で調整した（調整後のＬ−セリン濃度：３０ｍＭ）。本
懸濁液を３Ｌジャーファーメンター（エイブル社製）に
注入し、３０℃で４８時間撹拌しながら反応を行った。
反応中、反応液のｐＨをＫＯＨ溶液で９．５に調整し
た。また、３分毎に、０．０２６ｇのインドールを添加
し、その結果、総量２４．９６ｇのインドールを添加し
た。同様にして、反応液中のＬ−セリン濃度を２０、５
０、および、１００ｍＭに調節し上記の方法により反応
を行った。反応終了後、直ちに反応液を遠心分離して得
た上清液について高速液体クロマトグラフィー（島津製
作所製）で生成したＬ−トリプトファンの分析を行っ
た。その結果を第５表に示す。(2) L-tris with tryptophanase
Effect of Serine Concentration on Ptophan Production Reaction Escherichia coli K-1 prepared in the same manner as above
The following experiment was carried out using frozen cells of the 2YK3005 (FERM BP-1736) strain. 5 g of the frozen cells
5.85 g of indole, 3.15 g of L-serine,
Pyridoxal phosphate 100 mg, KCl 3.8 g
After suspending in 500 ml of a reaction solution containing (adjusted to pH 9.5 with KOH solution), the total volume was adjusted to 1000 ml with water (L-serine concentration after adjustment: 30 mM). This suspension was poured into a 3 L jar fermenter (manufactured by Able) and reacted at 30 ° C. for 48 hours while stirring.
During the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 9.5 with a KOH solution. Also, every 3 minutes, 0.026 g of indole was added, resulting in a total of 24.96 g of indole. Similarly, the L-serine concentration in the reaction solution was adjusted to 20, 5
It was adjusted to 0 and 100 mM and the reaction was carried out by the above method. Immediately after completion of the reaction, the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution was analyzed for L-tryptophan produced by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). Table 5 shows the results.

【００３１】Ｌ−セリン濃度３０ｍＭで反応した反応終
了液５００ｍｌにＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１０にし
たのち、アンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイ
オンＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−ト
リプトファンの粗結晶を析出させたのち、これをアセト
ンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶１５．７
ｇを得た。An aqueous solution of NaOH was added to 500 ml of the reaction-completed solution reacted at an L-serine concentration of 30 mM to adjust the pH to 10, and then L-tryptophan was passed through a column of ammonia type strongly acidic ion exchange resin (Diaion SK-1B, manufactured by Mitsubishi Kasei). After precipitating the crude crystals of L-tryptophan, the crystals were washed with acetone and dried to give 15.7 crystals of L-tryptophan.
g was obtained.

【００３２】[0032]

【表５】 第５表 Ｌ−セリンの濃度 Ｌ−トリプトファン （ｍＭ） 生成濃度％（ｗ／ｖ） ２０ ２．２ ３０ ４．０ ５０ ４．１ １００ ４．１ [Table 5] Table 5 L-serine concentration L-tryptophan (mM) generation concentration% (w / v) 20 2.2 30 4.0 50 50 4.1 100 100 4.1

【００３３】実施例４トリプトファナーゼによるＬ−トリプトファン生成反応
における、ｐＨの影響 エシェリヒア・コリ Ｋ−１２ ＹＫ３００５（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１７３６）株を実施例３と同様に培養して得
た菌体５ｇを用いて３Ｌジャーファーメンター（エイブ
ル社製）で反応を行った。反応はＬ−セリン３０ｍＭを
含有する実施例３の（２）と同様の反応液を用い、但
し、ｐＨをＫＯＨ水溶液で９．３、９．５、および９．
７に調節しながら３７℃で４８時間反応した。また、３
分毎に、０．０３３ｇのインドールを添加し、その結
果、総量３１．６８ｇのインドールを添加した。反応終
了後、直ちに反応液を遠心分離して得た上清液について
高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）で生成し
たＬ−トリプトファンの分析を行った。その結果を第６
表に示す。Example 4 L-tryptophan production reaction by tryptophanase
Effect of pH on Escherichia coli K-12 YK3005 (FER
The MBP-1736) strain was cultured in the same manner as in Example 3 and 5 g of the obtained bacterial cells was used to carry out a reaction with a 3 L jar fermenter (manufactured by Able). For the reaction, the same reaction solution as in (3) of Example 3 containing 30 mM of L-serine was used, except that the pH was adjusted to 9.3, 9.5, and 9.
While adjusting to 7, the reaction was carried out at 37 ° C for 48 hours. Also, 3
Every minute, 0.033 g of indole was added, resulting in a total of 31.68 g of indole. Immediately after completion of the reaction, the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution was analyzed for L-tryptophan produced by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). The result is No. 6
Shown in the table.

【００３４】[0034]

【表６】 第６表 Ｌ−トリプトファン 反応液のｐＨ 生成濃度％（ｗ／ｖ） ９．３ ３．０ ９．５ ４．０ ９．７ ５．０ [Table 6] Table 6 L-tryptophan reaction solution pH generation concentration% (w / v) 9.3 3.0 9.5 4.0 9.7 5.0

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明によれば、酵素反応液中のＬ−ト
リプトファンを３％（Ｗ／Ｖ）〜５％（Ｗ／Ｖ）の高濃
度で生成させることが可能であり、効率良く安価にＬ−
トリプトファンを製造することが出来る。According to the present invention, L-tryptophan in an enzyme reaction solution can be produced at a high concentration of 3% (W / V) to 5% (W / V), which is efficient and inexpensive. To L-
Tryptophan can be produced.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI technical display location C12R 1: 185) (72) Inventor Hideaki Yukawa 8-3-1, Ami-cho, Inashiki-gun, Ibaraki Mitsubishi Chemical Corporation Tsukuba Research Center

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 トリプトファンシンターゼまたはトリプ
トファナーゼを含有する微生物、または、その処理物の
存在下に、インドールとＬ−セリンを含有する水溶液中
で酵素反応させて、Ｌ−トリプトファンを生成させるに
際し、該水溶液中のｐＨを９．０〜１０．０に維持し、
かつ、Ｌ−セリン濃度を３０ｍＭ以上に維持して酵素反
応させ、該反応液中にＬ−トリプトファンを３％（ｗ／
ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積せしめ、該反
応液からＬ−トリプトファンを採取することを特徴とす
るＬ−トリプトファンの製造法。1. When L-tryptophan is produced by enzymatic reaction in an aqueous solution containing indole and L-serine in the presence of a microorganism containing tryptophan synthase or tryptophanase, or a treated product thereof, Maintaining the pH in the aqueous solution at 9.0 to 10.0,
At the same time, the L-serine concentration was maintained at 30 mM or more for enzymatic reaction, and 3% (w / w) of L-tryptophan was added to the reaction solution.
v) A method for producing L-tryptophan, which is characterized in that L-tryptophan is collected from the reaction solution by being produced and accumulated up to a concentration of 5% (w / v). 【請求項２】 トリプトファンシンターゼまたはトリプ
トファナーゼが、エシェリヒア属に属する細菌に由来す
るトリプトファンシンターゼまたはトリプトファナーゼ
である請求項１に記載のＬ−トリプトファンの製造法。2. The method for producing L-tryptophan according to claim 1, wherein the tryptophan synthase or tryptophanase is tryptophan synthase or tryptophanase derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia.