JPH0799996A - パーオキシダーゼ活性測定用試薬及びそれを用いた測定方法 - Google Patents
パーオキシダーゼ活性測定用試薬及びそれを用いた測定方法Info
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- JPH0799996A JPH0799996A JP26781393A JP26781393A JPH0799996A JP H0799996 A JPH0799996 A JP H0799996A JP 26781393 A JP26781393 A JP 26781393A JP 26781393 A JP26781393 A JP 26781393A JP H0799996 A JPH0799996 A JP H0799996A
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Abstract
質と、(ロ)一般式 【化1】 (式中、R1 及びR2 は水素原子又は低級アルキル基、
R3 は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、水酸
基又はアミノ基である。)で表されるピリジン化合物と
一般式 【化2】 (式中、Xは水素原子、アルカリ金属又はアルカリ土類
金属である。)で表されるフェノチアジン化合物とから
なる活性増幅物質と、からなるパーオキシダーゼ活性測
定用試薬、及びパーオキシダーゼと、ルミノールと過酸
化水素とからなる基質と、前記一般式(I)で表される
ピリジン化合物と前記一般式(II)で表されるフェノチ
アジン化合物とからなる活性増幅物質とにより発生する
化学発光を測定することからなるパーオキシダーゼ活性
の測定方法である。 【効果】 本発明の活性増幅物質を用いることにより、
今まで測定することができなかった極微量のパーオキシ
ダーゼの活性を測定することができる。さらに本発明を
EIAに用いると従来の測定法に比べ高感度な測定が可
能である。
Description
測定用試薬及びその試薬を用いた測定方法に関する。更
に詳しくは、(イ)ルミノールと過酸化水素とからなる
基質と、(ロ)一般式
あり、R3 は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、水酸基又はアミノ基である。)で表されるピリジン
化合物と一般式
金属である。)で表されるフェノチアジン化合物とから
なる活性増幅物質と、からなるパーオキシダーゼ活性測
定用試薬、及びパーオキシダーゼと、ルミノールと過酸
化水素とからなる基質と、前記一般式(I)で表される
ピリジン化合物と前記一般式(II)で表されるフェノチ
アジン化合物とからなる活性増幅物質とにより発生する
化学発光を測定することからなるパーオキシダーゼ活性
の測定方法である。
測定法として技術開発が行われている。中でも化学発光
基質を用いる測定法は、高感度化の達成のために有力な
手段であり、例えばルミノールを用いた化学発光法では
比色法の10-14 molに比べパーオキシダーゼの検出
感度が10-16 molであるとの報告がなされている
(蛋白質核酸酵素、別冊No.31,p51〜63,1
987年参照)。しかし化学発光法は、発光時間が短い
などの欠点を有しているため汎用されていなかった。そ
こでこの欠点を補う試みがなされ、p−ヨードフェノー
ルを活性増幅物質として用いた化学発光法(H.All
an,J.Microbiology Apr.,63
0〜636,35,(1988)参照)、あるいはイン
ドフェノール誘導体とフェノチアジン誘導体とを組み合
せて活性増幅物質として用いたパーオキシダーゼ活性の
化学発光測定法(特開平2−174694号参照)等が
見い出された。
の活性増幅物質を用いる化学発光法は、持続した発光が
得られ、ある程度の高感度化が達成されたものの、微量
成分の測定には更なる感度が要求されているのが現状で
ある。そして有効な測定方法の出現が久しく期待されて
いた。
度を求めて鋭意研究した結果、化学発光を利用しパーオ
キシダーゼ活性を測定するためルミノールと過酸化水素
とを基質として用いる方法において、前記一般式(I)
で表されるピリジン化合物と前記一般式(II)で表され
るフェノチアジン化合物とがパーオキシダーゼの活性増
幅物質となることを見い出し、本発明を完成した。
物において、R1 及びR2 は水素原子又は低級アルキル
基であり、この低級アルキル基としては炭素数1〜4の
低級アルキル基であり、例えばメチル基、エチル基、プ
ロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル
基、t−ブチル基等を挙げることができる。
キル基、水酸基又はアミノ基である。ハロゲン原子とし
ては、例えば塩素、臭素、ヨウ素等を挙げることができ
る。低級アルキル基としては、前記R1 及びR2 と同じ
炭素数1〜4の低級アルキル基の他、アミノ基、ジメチ
ルアミノ基、ピペリジノ基等で置換されたアルキル基を
挙げることができる。またアミノ基としては、無置換の
アミノ基の他、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジメ
チルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ
基、1−ピロリジニル基、ピペリジノ基、4−メチルピ
ペリジノ基、4−エチルピペリジノ基、フェニルアミノ
基等の置換アミノ基を挙げることができる。
物としては、例えばピリジン、2−メチルピリジン、3
−メチルピリジン、4−メチルピリジン、4−ヒドロキ
シピリジン、2−ヒドロキシピリジン、4−クロロピリ
ジン、4−アミノピリジン、4−ジメチルアミノピリジ
ン、4−ジエチルアミノピリジン、4−ピペリジノピリ
ジン、4−(2−ピペリジノエチル)ピリジン、4−
(N−メチルアミノ)ピリジン、コリジン等を挙げるこ
とができる。
ン化合物において、Xは水素原子、アルカリ金属又はア
ルカリ土類金属である。アルカリ金属としては、例えば
ナトリウム、カリウム等を、さらにアルカリ土類金属と
してはカルシウム、バリウム等を挙げることができる。
ン化合物としては、例えば3−(10−フェノチアジニ
ル)プロパンスルホン酸、3−(10−フェノチアジニ
ル)プロパンスルホン酸ナトリウム、3−(10−フェ
ノチアジニル)プロパンスルホン酸カリウム等を挙げる
ことができる。
被検液と、ルミノールと過酸化水素とからなるパーオキ
シダーゼの基質と、前記一般式(I)で表されるピリジ
ン化合物及び一般式(II)で表されるフェノチアジン化
合物とからなる活性増幅物質とにより発生する化学発光
を測定することにより行うことができる。
(I)で表されるピリジン化合物及び前記一般式(II)
で表されるフェノチアジン化合物は、それぞれ10〜5
000μM用いることができるが、反応を効率よく行う
ためには100〜1000μM用いることが好ましい。
測定に用いる基質は、ルミノールを100〜1000μ
M、好ましくは200〜400μM用い、さらに過酸化
水素を100〜1000μM、好ましくは200〜50
0μM用いることが経済的にも有利である。
例えばトリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩
酸緩衝液、トリス−コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液等を
挙げることができる。緩衝液は、pHが7.0〜9.0
のものを用いることができる。測定は、10〜40℃で
行うことができるが、効率よく行うためには20〜30
℃で実施することが好ましい。
ゼを含む被検液と共に前記一般式(I)で表されるピリ
ジン化合物、前記一般式(II)で表されるフェノチアジ
ン化合物および前記基質を含む試験液を入れた試験管を
フォトンカウンターの中に入れ測定を行なうことができ
る。
は、通常測定に用いられるポリスチレンビーズ、磁性粒
子、容器の壁等の固相上にサンドイッチ法、競合法等の
免疫測定法により補足されたパーオキシダーゼ標識体の
活性を上記方法に従い測定することにより達成される。
細に説明する。
スルホン酸ナトリウムを含むトリシン−水酸化ナトリウ
ム増幅物質緩衝液pH=8.3(50mM)、及び1.
0mM過酸化水素と0.75mMルミノールとを含むト
リシン−水酸化ナトリウム基質緩衝液pH=8.3(5
0mM)をそれぞれ作成した。
キシダーゼ(1ng/ml)10μlを加え、更に参考
例1で作成した基質緩衝液135μlを加え、5秒間の
発光を添加直後(0分)から2分おきに10分までクリ
ニルーマット(ベルトールド社製フォトンカウンター)
で測定した。その結果を図1に示す。
スルホン酸ナトリウムを含むトリシン−水酸化ナトリウ
ム増幅物質緩衝液に表1に示すピリジン化合物1.0m
Mを加え増幅物質緩衝液を作成した。この増幅物質緩衝
液200μlにパーオキシダーゼ(1ng/ml)10
μlを加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135
μlを加え、6分後クリニルーマットで5秒間の発光を
測定した。ピリジン化合物を添加しない増幅物質緩衝液
を用いて測定を行った結果を基準としてその相対活性を
求めた。その結果を表1に示す。
た増幅物質緩衝液200μlにパーオキシダーゼ(1n
g/ml)10μlを加え、更に参考例1で作成した基
質緩衝液135μlを加え、5秒間の発光を添加直後
(0分)から2分おきに10分までクリニルーマットで
測定した。その結果を図2に示す。
ル、1.0mM過酸化水素を含むトリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液200μlを4本の試験管に入れ、パーオ
キシダーゼ(0ng/ml,1ng/ml,0.1ng
/ml,0.01ng/ml)をそれぞれ10μlづつ
加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135μlを
加え6分後の5秒間の発光をクリニルーマットで測定し
た。その結果を図3に示す。
ロパンスルホン酸ナトリウム及び4−ジメチルアミノピ
リジンを含む増幅物質緩衝液200μlを4本の試験管
に入れ、パーオキシダーゼ(0ng/ml,1ng/m
l,0.1ng/ml,0.01ng/ml)各10μ
lを加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135μ
lを加え6分後5秒間の発光をクリニルーマットで測定
した。その結果を図4に示す。
スルホン酸ナトリウム、0.067mMフェノールイン
ドフェノールを含むトリシン−水酸化ナトリウム増幅物
質緩衝液に表2に示すピリジン化合物1.0mMを加え
た増幅物質緩衝液200μlにパーオキシダーゼ(0.
1ng/ml)10μlを加え、さらに参考例1で作成
した基質緩衝液135μlを加え、6分後5秒間の発光
をクリニルーマットで測定した。その結果を表2に示
す。
発光量又は発光信号(シグナル)/バックグラウンド比
を大きくする。そこで本発明の活性増幅物質を用いるこ
とにより、今まで測定することができなかった極微量の
パーオキシダーゼの活性を測定することができる。さら
に本発明をEIAに用いると従来の測定法に比べ高感度
な測定が可能である。
ホン酸ナトリウムを増幅物質として用い、発光を測定し
た図である。
ェノチアジニル)プロパンスルホン酸ナトリウムとを増
幅物質として用い、発光を測定した図である。
て用いたときのパーオキシダーゼの検量線である。
ェノチアジニル)プロパンスルホン酸ナトリウムを増幅
物質として用いたときのパーオキシダーゼの検量線であ
る。
Claims (2)
- 【請求項1】 (イ)ルミノールと過酸化水素とからな
る基質と、 (ロ)一般式 【化1】 で表されるピリジン化合物(式中、R1 及びR2 は水素
原子又は低級アルキル基であり、R3 は水素原子、ハロ
ゲン原子、低級アルキル基、水酸基又はアミノ基であ
る。)と一般式 【化2】 で表されるフェノチアジン化合物(式中、Xは水素原
子、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である。)とか
らなる活性増幅物質と、からなるパーオキシダーゼ活性
測定用試薬。 - 【請求項2】 パーオキシダーゼと、ルミノールと過酸
化水素とからなる基質と、一般式 【化3】 で表されるピリジン化合物と一般式 【化4】 で表されるフェノチアジン化合物とからなる活性増幅物
質とにより発生する化学発光を測定することからなるパ
ーオキシダーゼ活性の測定方法(式中、R1 及びR2 は
水素原子又は低級アルキル基、R3 は水素原子、ハロゲ
ン原子、低級アルキル基、水酸基又はアミノ基であり、
Xは水素原子、アルカリ金属又はアルカリ土類金属であ
る。)。
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JPH0799996A true JPH0799996A (ja) | 1995-04-18 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7622486B2 (en) | 2004-09-23 | 2009-11-24 | Reddy Us Therapeutics, Inc. | Pyridine compounds, process for their preparation and compositions containing them |
US7803573B2 (en) * | 2007-02-23 | 2010-09-28 | Cyanagen Srl | Method for increasing light emission from a chemiluminescent reaction |
-
1993
- 1993-10-01 JP JP05267813A patent/JP3102228B2/ja not_active Expired - Fee Related
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