JPH0789984A - Separation of lipoprotein and quantitative determination of lipoprotein - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a process for the separation and determination of the subclass of a lipoprotein and modified lipoprotein in a short time with a simple operation in a high accuracy by using an ion-exchange chromatography. CONSTITUTION:Spherical particles of glucomannan gel containing introduced anion-conversion group, preferably di(lower alkyl)amino-lower alkyl group (especially diethylaminoethyl group) are packed in a column, a liquid containing lipoprotein is brought into contact with the gel particles and the eluent is passed in gradient mode through the column to separate a high-specific gravity lipoprotein, a low-specific gravity lipoprotein and an ultralow-specific gravity lipoprotein in high precision. The eluent of the column is reacted with an enzyme and introduced into a detection system to quantitatively determine the individual lipoproteins. This process enables the separation and detection of modified lipoprotein attracting attention as a marker of the crisis of arteriosclerosis. The molecular weight of the glucomannan is preferably 1X10<6> to 1.5X10<6> and the average pore diameter of the glucomannan gel is preferably >=1,000Angstrom .

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明はリポタンパク質の分離方
法及びリポタンパク質の定量方法に関するものである。
さらに詳しくいえば、本発明は、特に高比重リポタンパ
ク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超
低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及び変性リポタンパ
ク質を高精度で分離する方法、及びこの方法により分離
された各リポタンパク質を効率よく定量する方法に関す
るものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for separating lipoproteins and a method for quantifying lipoproteins.
More specifically, the present invention relates to a method for separating highly dense lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and denatured lipoprotein with high accuracy, and this method The present invention relates to a method for efficiently quantifying each separated lipoprotein.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血漿や血清中にはコレステロール、リン
脂質、中性脂肪（トリグリセリド）が含まれている。こ
れらの脂質の中でコレステロールの定量は動脈硬化、肝
疾患、糖尿病や一時的な脂質代謝障害のスクリーニング
検査として使用され、中性脂肪の定量はコレステロール
とともに脂質代謝異常の鑑別に不可欠な検査となってき
ている。これらの脂質はタンパク質と会合してリポタン
パク質の状態で存在しており、親水性のあるリン脂質も
中間的に介在している。したがって、リポタンパク質は
単一のものではなく、タンパク質の種類、結合している
脂質の比率などによって性質が異なり、これを利用して
分画することによって、それぞれのリポタンパク質の量
と疾病との関係や、臨床的意義の解明が行われている。
動脈硬化性疾患と深いかかわりをもつと言われるリポタ
ンパク質は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重
リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）に分けられる。特に、低比重リポタンパク
質（ＬＤＬ）や超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の
増加が心筋梗塞や脳梗塞などの発症・進展を増長させる
ことが明らかになっており、高比重リポタンパク質（Ｈ
ＤＬ）の増加はこれら疾患に対し予防的に働くとされて
いる。このように、動脈硬化性疾患の予防・治療におい
て、これらリポタンパク質の動態を詳細に知ることは重
要なことである。前記リポタンパク質の分離定量法とし
ては、電気泳動法又は超遠心法により分画し、各画分中
のコレステロール値を定量する方法が一般である［「血
清脂質その臨床、基礎、分析法」第３７８ページ（１９
８１年）、中外医学社刊行］。しかしながら、電気泳動
法は定性的で定量性に欠けるし、一方超遠心法は比重に
より分画するため、高濃度の試料では汚染などが生じる
おそれがある。また、近年、動脈硬化病巣における脂質
蓄積のメガニズムの一つとして、変性低比重リポタンパ
ク質の関与が注目されている。これは、酸化などの変性
を受けた低比重リポタンパク質が動脈壁内において、マ
クロファージに無制限に取り込まれて泡沫化し、動脈硬
化の初期病変が形成されるとするものである。この変性
低比重リポタンパク質は、現在、種々の変性の可能性が
ｉｎ ｖｉｔｒｏで示されているにもかかわらず、生体
内で検出された例は数例あるだけである。しかも、この
検出法はモノクローン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法［「Ａ
ｍ.Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ.」第１３５巻、第８１５〜８２５
ページ（１９８９年）］であって、種特異的なモノクロ
ーン抗体の作成を必要とし、操作も煩雑である。また、
前記の電気泳動法、超遠心法及びモノクローン抗体を用
いたＥＬＩＳＡ法は、分離検出に長時間を必要とすると
いう欠点がある。そこで、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いたリポタンパク質の分離定量法も開
発されており、例えばサイズ排除カラム（Ｇ５０００Ｐ
Ｗ＋Ｇ３０００ＳＷ、東ソー製、いずれも８.０mmＩ.
Ｄ.×３０cm）を用いて分離し、さらに固定化酵素カラ
ムを用いてコレステロールを定量する自動分析法が報告
されている［「ケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」第１４８７〜１４９０ペー
ジ（１９８６年）］。しかしながら、この方法では低比
重リポタンパク質（ＬＤＬ）と超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）は分離されていない。さらに、ヒドロキシ
アパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰ ＤＮＡ−ｇ
ｒａｄｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１０mmＩ.Ｄ.×１００mm）
を用いて３種のリポタンパク質が分画されているが
［「Ｊ.Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ.」第５６６巻、第６７〜
７６ページ（１９９１年）］、この場合、１検体の分析
に８時間近くを要している。また、ＨＰＬＣによる変性
リポタンパク質の分離に関しては、これまで報告がなさ
れていない。2. Description of the Related Art Plasma and serum contain cholesterol, phospholipids, and neutral fats (triglycerides). Of these lipids, the quantification of cholesterol is used as a screening test for arteriosclerosis, liver disease, diabetes and temporary lipid metabolism disorders, and the quantification of triglyceride is an indispensable test for distinguishing abnormal lipid metabolism along with cholesterol. Is coming. These lipids are associated with proteins and exist in the form of lipoproteins, and hydrophilic phospholipids intervene therebetween. Therefore, the lipoprotein is not a single one, but its properties vary depending on the type of protein, the ratio of bound lipids, etc., and by fractionating using this, the amount of each lipoprotein and the disease Relationships and clinical significance have been elucidated.
Lipoproteins, which are said to be deeply associated with arteriosclerotic diseases, are classified into high-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL) and very low-density lipoprotein (VLDL). In particular, it has been revealed that an increase in low-density lipoprotein (LDL) or ultra-low-density lipoprotein (VLDL) enhances the onset and progress of myocardial infarction, cerebral infarction, etc., and high-density lipoprotein (H
An increase in DL) is said to act prophylactically for these diseases. Thus, it is important to know the dynamics of these lipoproteins in detail in the prevention and treatment of arteriosclerotic diseases. As a method for separating and quantifying the lipoprotein, a method in which fractionation is performed by electrophoresis or ultracentrifugation and the cholesterol level in each fraction is quantified [“serum lipid its clinical, basic, analytical method” Page 378 (19
81), published by Chugai Medical Company]. However, the electrophoretic method is qualitative and lacks quantitativeness, while the ultracentrifugation method fractionates by specific gravity, so that a sample of high concentration may be contaminated. In recent years, the involvement of denatured low-density lipoprotein has been attracting attention as one of the meganisms of lipid accumulation in atherosclerotic lesions. This is to say that low-density lipoproteins that have undergone denaturation such as oxidation are taken up by macrophages in the arterial wall without restriction and become foams, forming initial lesions of arteriosclerosis. Although this denatured low-density lipoprotein has been shown in vitro to have various denaturation possibilities, only a few cases have been detected in vivo. Moreover, this detection method is an ELISA method using a monoclonal antibody [[A
m.J. Pathol. ", Volume 135, 815-825
Page (1989)], which requires preparation of a species-specific monoclonal antibody, and the operation is complicated. Also,
The above-mentioned electrophoresis method, ultracentrifugation method and ELISA method using a monoclonal antibody have a drawback that a long time is required for separation and detection. Therefore, a method for separating and quantifying lipoproteins using high performance liquid chromatography (HPLC) has also been developed, for example, a size exclusion column (G5000P).
W + G3000SW, made by Tosoh, both 8.0mmI.
D. × 30 cm), and an automated assay method for quantifying cholesterol using an immobilized enzyme column has been reported [“Chemistry Letters (Chemis Letters
try Letters), pp. 1487-1490 (1986)]. However, this method does not separate low-density lipoprotein (LDL) and very low-density lipoprotein (VLDL). Furthermore, a hydroxyapatite column (Bio-Gel HTP DNA-g
Rade, Bio-Rad, 10 mm ID x 100 mm)
Although three kinds of lipoproteins have been fractionated by using [J. Chromatogr.] Volume 566, 67-
76 pages (1991)], in which case it takes nearly 8 hours to analyze one sample. Further, no report has been made so far regarding separation of denatured lipoprotein by HPLC.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、簡単な操作、かつ短時間で、特に高比重
リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（Ｌ
ＤＬ）及び超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を、並
びに変性リポタンパク質を高精度に分離定量する方法を
提供することを目的としてなされたものである。Under the circumstances described above, the present invention provides a simple operation and a short time, particularly high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (L).
(DL) and very low density lipoprotein (VLDL), and denatured lipoprotein with a high degree of accuracy and separation.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、イオン交換クロ
マトグラフィーにおいて、充填剤としてアニオン交換基
を導入したグルコマンナンゲルを用い、かつ溶離液をグ
ラジエントモードで通液することにより、短時間で高比
重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質
（ＬＤＬ）及び超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を
完全に分離することができ、また変性リポタンパク質も
分離検出が可能であること、そしてカラム溶出液を固定
化酵素カラム及び検出系に導入することにより、分離し
た各成分を効率よく定量しうることを見い出した。本発
明は、かかる知見に基づいて完成したものである。すな
わち、本発明は、アニオン交換基を導入したグルコマン
ナンゲルにリポタンパク質含有液を接触させたのち、溶
離液をグラジエントモードで接触させることを特徴とす
るリポタンパク質の分離方法、並びに前記方法でリポタ
ンパク質を分離したのち、カラム溶出液を酵素と反応後
検出系に導入することを特徴とするリポタンパク質の定
量方法を提供するものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that anion-exchange chromatography uses a glucomannan gel having an anion-exchange group as a packing material, and High-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL) and very low-density lipoprotein (VLDL) can be completely separated in a short time by passing the eluent in the gradient mode, and denaturation It was found that lipoproteins can also be separated and detected, and that the separated components can be efficiently quantified by introducing the column eluate into an immobilized enzyme column and a detection system. The present invention has been completed based on such findings. That is, the present invention, a lipoprotein-containing liquid is contacted with a glucomannan gel having an anion exchange group introduced therein, and then the eluent is contacted in a gradient mode. The present invention provides a method for quantifying lipoprotein, which comprises separating a protein and introducing a column eluate into a detection system after reacting with an enzyme.

【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明方
法においては、イオン交換クロマトグラフィーが用いら
れ、その充填剤としてアニオン交換基を導入したグルコ
マンナンゲルが使用される。該アニオン交換基を導入し
たグルコマンナンゲルにおけるアニオン交換基として
は、例えばジエチルアミノエチル基、ジメチルアミノエ
チル基、ジエチルアミノメチル基、ジメチルアミノプロ
ピル基などのジ低級アルキルアミノ低級アルキル基を好
ましく挙げることができるが、これらの中で特にジエチ
ルアミノエチル基が好適である。これらのアニオン交換
基はグルコマンナンゲルに直接結合していてもよいし、
適当なスペーサを介して結合していてもよい。このよう
なスペーサとしては、例えばエポキシ基などを挙げるこ
とができる。また、グルコマンナンゲルは、グルコマン
ナンから調製された架橋グルコマンナン球状粒子であっ
て、Ｄ−グルコースとＤ−マンノースを主要構成成分と
するグルコマンナンが架橋剤により架橋された親水性の
ゲル粒子である。グルコマンナンとしては、分子量が９
×１０⁵〜２.４×１０⁶、好ましくは１×１０⁶〜１.５
×１０⁶のものが好適である。このようなグルコマンナ
ンとしてコンニャクマンナンが好ましいが、もちろん、
これに限定されるものではない。The present invention will be described in detail below. In the method of the present invention, ion exchange chromatography is used, and a glucomannan gel introduced with an anion exchange group is used as the packing material. Preferred examples of the anion-exchange group in the glucomannan gel having the anion-exchange group introduced therein include di-lower alkylamino-lower alkyl groups such as diethylaminoethyl group, dimethylaminoethyl group, diethylaminomethyl group and dimethylaminopropyl group. However, among these, the diethylaminoethyl group is particularly preferable. These anion exchange groups may be directly bonded to glucomannan gel,
It may be bound via a suitable spacer. An example of such a spacer is an epoxy group. Further, glucomannan gel is a crosslinked glucomannan spherical particle prepared from glucomannan, which is a hydrophilic gel particle in which glucomannan containing D-glucose and D-mannose as main constituents is crosslinked with a crosslinking agent. is there. Glucomannan has a molecular weight of 9
× 10 ^{5 to} 2.4 × 10 ⁶ , preferably 1 × 10 ^{6 to} 1.5
Those of × 10 ⁶ are preferable. Konjac mannan is preferable as such glucomannan, but of course,
It is not limited to this.

【０００６】本発明においては、該アニオン交換基を導
入したグルコマンナンゲルとして、平均細孔径１０００
Å以上のものが好ましく用いられる。このように細孔が
十分に大きいと、分離対象であるリポタンパク質が不要
なサイズ排除を起こさず、迅速な細孔への浸透と細孔か
らの溶離がなされる。本発明で用いられるグルコマンナ
ンゲルは、物理的及び化学的に安定であって、しかも耐
圧強度が大きいので、高流速での通液、例えば０.５ml
／分以上の通液が可能であり、１検体当たり、１時間以
内という短時間で分離が達成できる。このようなグルコ
マンナンゲル（架橋グルコマンナン球状粒子）は、次に
示すようにグルコマンナンを架橋して製造することがで
きる。まず、グルコマンナンをアルコールなどで精製し
たグルコマンナン精製物を、ホルムアミドやジメチルホ
ルムアミドなどの適当な溶媒で膨潤させたのち、ピリジ
ンなどの触媒を用い、酢酸、無水酢酸、プロピオン酸、
酪酸、硝酸などの酸を加えてグルコマンナンのエステル
を生成させる。次に、このグルコマンナンのエステルを
適当な溶媒、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四
塩化炭素及びトリクロロエチレンなどの塩素化炭化水素
系有機溶媒に、濃度が通常０.０５〜２０重量％、好ま
しくは０.１〜１０重量％になるように溶解させる。な
お、この際、必要に応じ、該グルコマンナンのエステル
と共に、適当な多孔化剤を加えてもよい。この多孔化剤
は球状粒子を形成したのち、除去されて球状粒子を多孔
化するために使用されるもので、具体的にはｎ−カプリ
ン酸メチル、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフ
タレン、エチルベンゼン、ジエチルベンデン、ドデカン
酸メチル、トルエン、ヘキシルアルコール、ヘプチルア
ルコール、オクチルアルコールなどの前記溶媒より高沸
点を有し、かつグルコマンナンのエステルを溶解しない
ものなどを用いることができる。該多孔化剤の使用量
は、グルコマンナンのエステル１ｇ当たり、通常２０ml
以下、好ましくは２〜２０mlの範囲で選ばれる。In the present invention, the glucomannan gel having the anion exchange group introduced therein has an average pore diameter of 1000.
Those Å or more are preferably used. When the pores are sufficiently large as described above, the lipoprotein to be separated does not cause unnecessary size exclusion, and rapid penetration into and elution from the pores is achieved. The glucomannan gel used in the present invention is physically and chemically stable and has a large pressure resistance, so that it can be passed through at a high flow rate, for example, 0.5 ml.
It is possible to pass a flow rate of at least 1 minute / minute, and separation can be achieved in a short time of 1 hour or less per sample. Such glucomannan gel (crosslinked glucomannan spherical particles) can be produced by crosslinking glucomannan as shown below. First, a glucomannan purified product obtained by purifying glucomannan with alcohol or the like is swollen with an appropriate solvent such as formamide or dimethylformamide, and then using a catalyst such as pyridine, acetic acid, acetic anhydride, propionic acid,
Acids such as butyric acid and nitric acid are added to form esters of glucomannan. Next, this ester of glucomannan is added to a suitable solvent, for example, a chlorinated hydrocarbon organic solvent such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, and trichloroethylene at a concentration of usually 0.05 to 20% by weight, preferably 0.1. Dissolve to be 10% by weight. At this time, if necessary, a suitable porosifying agent may be added together with the ester of glucomannan. This porosifying agent is used for forming spherical particles and then removing them to make the spherical particles porous, and specifically, n-methyl caprate, tetrahydronaphthalene, decahydronaphthalene, ethylbenzene, diethylbenzene. For example, den, methyl dodecanoate, toluene, hexyl alcohol, heptyl alcohol, octyl alcohol and the like having a boiling point higher than that of the above solvent and not dissolving the ester of glucomannan can be used. The amount of the porosifying agent used is usually 20 ml per 1 g of glucomannan ester.
Below, it is preferably selected in the range of 2 to 20 ml.

【０００７】次に、このようにして調製されたグルコマ
ンナンのエステルの溶液を水性媒体中に懸濁させ、液滴
を形成させる。該水性媒体としては水、又は水に親水性
保護コロイド、例えばポリビニルアルコール、部分けん
化ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロー
ス、エチルセルロース、メチルセルロース、可溶性デン
プン、ゼラチンなどを加えたものなどが使用できる。前
記親水性保護コロイドを含む水溶液は０.１〜１０重量
％、好ましくは０.２〜５重量％水溶液が好適である。
また、水性媒体の使用量は、グルコマンナンのエステル
の溶液の１／３倍容量以上、好ましくは１〜５０倍容量
とするのが望ましい。水性媒体中に、前記グルコマンナ
ンのエステルの溶液を懸濁させる方法としては、水性媒
体中にグルコマンナンのエステルの溶液を全量加え、撹
拌して分散、懸濁する方法や、水性媒体を撹拌状態と
し、これにグルコマンナンのエステルの溶液を一度に又
は滴下状に添加する方法などが挙げられる。グルコマン
ナンのエステルは水不溶性であるため、水性媒体中に微
細に分散、懸濁する。この時粒状化と同時に溶媒の蒸発
が始まり、ついには溶媒が実質的に除去されて細孔が形
成されたグルコマンナンのエステルの球状粒子が得られ
る。液滴中の溶媒を蒸発除去する時の温度としては水性
媒体の氷点以上で溶媒の沸点以下の温度が用いられる
が、蒸発除去を促進させ、かつ粒子形状を良好に保つた
めには溶媒の沸点より１〜５℃低い温度が好ましい。球
状粒子の形状は水性媒体を撹拌することによって行われ
るが、撹拌速度やグルコマンナンのエステルの濃度など
を調節することにより任意の粒径のものが得られる。本
発明の場合には、充填剤として適当な粒径、例えば１〜
５００μｍの範囲のものが形成されるように調節すれば
よい。次に、グルコマンナンのエステルの球状粒子をけ
ん化する。この場合、球状粒子の形状を壊さずにその形
状を保ちつつ、けん化できるけん化浴を用いることが必
要である。グルコマンナンのエステルの球状粒子をけん
化浴と接触させることにより、けん化が行われる。けん
化により、球状粒子の細孔から大部分の多孔化剤が除去
される。けん化浴の例としては水酸化ナトリウム又は水
酸化カリウム水溶液とメタノールとの混合溶液や、水酸
化ナトリウム又は水酸化カリウムを硫酸ナトリウムなど
の塩類水溶液に溶解させた溶液などが挙げられる。これ
らのけん化浴のアルカリ濃度は０.４〜２０重量％程度
であり、けん化の際のアルカリ量は、グルコマンナンの
エステルに対して１０重量％以上とするのが好ましい。
また、けん化は、通常室温にて２〜２４時間程度撹拌す
ることにより行われる。The solution of the ester of glucomannan thus prepared is then suspended in an aqueous medium to form droplets. As the aqueous medium, water or a hydrophilic protective colloid such as polyvinyl alcohol, partially saponified polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, methyl cellulose, soluble starch, gelatin and the like can be used. The aqueous solution containing the hydrophilic protective colloid is preferably 0.1 to 10% by weight, more preferably 0.2 to 5% by weight.
The amount of the aqueous medium used is preferably 1/3 times the volume of the solution of the ester of glucomannan or more, preferably 1 to 50 times the volume. In the aqueous medium, as a method of suspending the solution of the ester of glucomannan, a total amount of the solution of the ester of glucomannan in the aqueous medium is added, stirred and dispersed, or a suspension method of the aqueous medium And a method of adding a solution of the ester of glucomannan to the mixture at once or in a dropwise manner. Since the ester of glucomannan is insoluble in water, it is finely dispersed and suspended in an aqueous medium. At this time, evaporation of the solvent is started at the same time as granulation, and finally the solvent is substantially removed to obtain spherical particles of glucomannan ester in which pores are formed. The temperature at which the solvent in the droplets is removed by evaporation is the temperature above the freezing point of the aqueous medium and below the boiling point of the solvent, but in order to promote evaporation removal and maintain a good particle shape, the boiling point of the solvent A temperature of 1 to 5 ° C lower is preferable. The spherical particles are formed by stirring an aqueous medium, but the particles having an arbitrary particle size can be obtained by adjusting the stirring speed and the concentration of the ester of glucomannan. In the case of the present invention, a suitable particle size as a filler, for example 1 to
It may be adjusted so that a film having a range of 500 μm is formed. Next, the spherical particles of the ester of glucomannan are saponified. In this case, it is necessary to use a saponification bath that can saponify while maintaining the shape of the spherical particles without destroying the shape. Saponification is carried out by contacting spherical particles of glucomannan ester with a saponification bath. Saponification removes most of the porosifying agent from the pores of the spherical particles. Examples of the saponification bath include a mixed solution of sodium hydroxide or potassium hydroxide aqueous solution and methanol, a solution in which sodium hydroxide or potassium hydroxide is dissolved in a salt aqueous solution such as sodium sulfate, and the like. The alkali concentration of these saponification baths is about 0.4 to 20% by weight, and the amount of alkali at the time of saponification is preferably 10% by weight or more based on the ester of glucomannan.
The saponification is usually carried out by stirring at room temperature for about 2 to 24 hours.

【０００８】次に、このようにしてけん化されたグルコ
マンナンの球状粒子を架橋する。架橋剤としては、例え
ばエピクロロヒドリン、ジエポキシブタン、トリレンジ
イソシアナート、ヘキサメチレンジイソシアナートなど
の２官能性化合物を挙げることができる。これらの架橋
剤は有機性媒体液中に溶解させて架橋剤溶液として使用
される。架橋剤の有機媒体液としては、例えば灯油や流
動パラフィン又はその混合物に、ソルビタン脂肪酸エス
テルなどの非イオン性界面活性剤を１〜２重量％程度混
合したもの、あるいはアセトンとジメチルスルホキシド
との混合液（例えば容量比２：３）、アセトンとジメチ
ルホルムアミドとの混合液（例えば容量比２：３）など
が用いられる。架橋剤の濃度は、前記架橋剤溶液に対し
て、通常０.０５〜１２.５モル／リットルの範囲であ
る。前記架橋剤溶液１００容量部に対して、けん化され
たグルコマンナンの球状粒子を１〜５０重量部程度加
え、好ましくは室温〜９０℃で１〜７２時間撹拌を続け
ることによりグルコマンナンの球状粒子は架橋される。
架橋の程度は架橋剤の濃度、架橋反応の温度及び時間な
どにより調節することができる。架橋反応粒子をろ別
し、アセトンなどで洗浄し、次いで水洗することにより
架橋されたグルコマンナンゲル球状粒子が得られる。こ
のようにして得られた架橋グルコマンナンゲル球状粒子
は耐圧性が高く、また化学的、物理的に極めて安定であ
り、例えば各種塩類溶液中でほとんど膨潤、収縮が起こ
らない。そのため、アニオン交換基導入後も粒子の細孔
構造が変化したり、粒子が変形したり、合一したりする
ことがない。したがって、十分なポアサイズと比表面
積、アニオン交換基密度、吸着容量を有する充填剤を調
製することができる。さらに、このグルコマンナンゲル
球状粒子は耐熱性に優れているため、オートクレープな
どで滅菌することもできる。Next, the thus-saponified spherical particles of glucomannan are crosslinked. Examples of the crosslinking agent include bifunctional compounds such as epichlorohydrin, diepoxybutane, tolylene diisocyanate, and hexamethylene diisocyanate. These crosslinking agents are dissolved in an organic medium liquid and used as a crosslinking agent solution. Examples of the organic medium solution of the cross-linking agent include kerosene, liquid paraffin, or a mixture thereof with a nonionic surfactant such as sorbitan fatty acid ester in an amount of about 1 to 2% by weight, or a mixed solution of acetone and dimethyl sulfoxide. (For example, the volume ratio is 2: 3), a mixed solution of acetone and dimethylformamide (for example, the volume ratio is 2: 3), and the like are used. The concentration of the cross-linking agent is usually in the range of 0.05 to 12.5 mol / liter based on the cross-linking agent solution. About 1 to 50 parts by weight of spherical particles of saponified glucomannan are added to 100 parts by volume of the cross-linking agent solution, and the spherical particles of glucomannan are preferably obtained by continuing stirring at room temperature to 90 ° C. for 1 to 72 hours. Cross-linked
The degree of crosslinking can be adjusted by the concentration of the crosslinking agent, the temperature and time of the crosslinking reaction, and the like. The crosslinked particles are filtered, washed with acetone or the like, and then washed with water to obtain crosslinked spherical glucomannan gel particles. The crosslinked glucomannan gel spherical particles thus obtained have high pressure resistance, are extremely chemically and physically stable, and hardly swell or shrink in various salt solutions. Therefore, even after the introduction of the anion exchange group, the pore structure of the particles does not change, the particles do not deform, and the particles do not coalesce. Therefore, it is possible to prepare a filler having a sufficient pore size, specific surface area, anion exchange group density, and adsorption capacity. Furthermore, since the glucomannan gel spherical particles have excellent heat resistance, they can be sterilized by an autoclave or the like.

【０００９】次に、このようにして得られたグルコマン
ナンゲル球状粒子にアニオン交換基を導入する。このア
ニオン交換基の導入方法については特に制限はなく、常
法により行うことができる。例えば、該グルコマンナン
ゲル球状粒子をアルカリ液に予め浸漬させたのち、ハロ
ゲン末端基を有し、導入すべきアニオン交換基となりう
る試薬を反応させる方法などを用いることができる。こ
の際用いられる試薬としては、例えば２−（ジエチルア
ミノ）エチルクロリド塩酸塩を好ましく挙げることがで
き、また、アルカリ液としては水酸化ナトリウムや水酸
化カリウムなどを含有する水溶液が挙げられる。前記方
法により、グルコマンナンゲル球状粒子にアニオン交換
基を導入した場合、得られる充填剤の排除限界分子量及
び比表面積はアニオン交換基導入前の値とほぼ同じであ
る。また、グルコマンナンゲル球状粒子にアニオン交換
基を導入して得られる充填剤は耐圧強度に優れているた
め、高流速で使用することができ、単位時間当たりの処
理量を多くすることができる。本発明においては、この
ようにして得られたアニオン交換基を導入したグルコマ
ンナンゲル球状粒子をカラムに充填し、これにリポタン
パク質含有液を通液したのち、溶離液をグラジエントモ
ードで通液することにより、高比重リポタンパク質（Ｈ
ＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低比重
リポタンパク質（ＶＬＤＬ）をそれぞれ高精度で分離す
ることができ、また変性リポタンパク質を分離検出する
ことができる。Then, an anion exchange group is introduced into the glucomannan gel spherical particles thus obtained. The method for introducing the anion exchange group is not particularly limited, and can be carried out by a conventional method. For example, a method may be used in which the spherical particles of glucomannan gel are soaked in an alkaline solution in advance and then reacted with a reagent having a halogen end group and capable of becoming an anion exchange group to be introduced. Preferred examples of the reagent used in this case include 2- (diethylamino) ethyl chloride hydrochloride, and examples of the alkaline solution include aqueous solutions containing sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like. When an anion exchange group is introduced into the glucomannan gel spherical particles by the above method, the exclusion limit molecular weight and the specific surface area of the obtained filler are almost the same as the values before the introduction of the anion exchange group. In addition, since the filler obtained by introducing an anion exchange group into the glucomannan gel spherical particles has excellent pressure resistance, it can be used at a high flow rate and the amount of treatment per unit time can be increased. In the present invention, the thus obtained anion-exchange group-introduced glucomannan gel spherical particles are packed in a column, and a lipoprotein-containing liquid is passed through the column, and then the eluent is passed through in a gradient mode. As a result, high density lipoprotein (H
DL), low-density lipoprotein (LDL) and ultra-low-density lipoprotein (VLDL) can be separated with high accuracy, respectively, and denatured lipoprotein can be separated and detected.

【００１０】本発明において、前記グラジエントモード
で通液する溶離液としては様々なものがあるが、その１
例を示すと、Ａ液として２０ｍＭリン酸 ナトリウム緩
衝液などを、Ｂ液として５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶
液や１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液などを挙げることができ
る。そして、本発明におけるステップグラジエントモー
ドにおいては、通常該Ａ液中にＢ液が段階的に加えられ
ていき、最終的にはＢ液のみとなる。本発明において
は、このようにしてリポタンパク質を分離したのち、カ
ラム溶出液を酵素と反応させた後検出系に導入して、分
離した各リポタンパク質を定量する。酵素はそのまま溶
液として用いてもよいし、固定化酵素として用いてもよ
い。後者の場合、該固定化酵素カラムには、通常コレス
テロールエステルヒドロラーゼ及びコレステロールオキ
シダーゼが固定化されており、該固定化酵素カラムによ
ってリポタンパク質は酵素の作用を受け、過酸化水素を
生成する。したがってこの過酸化水素量を測定すること
により、リポタンパク質を定量することができる。過酸
化水素量の測定には様々の方法があり、例えばペルオキ
シダーゼの作用により、ホモバリ酸と過酸化水素とから
生成する蛍光物質を定量する方法などを好ましく用いる
ことができる。In the present invention, there are various eluents to be passed through in the gradient mode.
For example, the solution A may be a 20 mM sodium phosphate buffer solution, and the solution B may be a 500 mM sodium chloride aqueous solution or a 1 M sodium acetate aqueous solution. Then, in the step gradient mode in the present invention, the solution B is usually added stepwise to the solution A, and finally only the solution B is obtained. In the present invention, after separating lipoproteins in this manner, the column eluate is reacted with an enzyme and then introduced into a detection system to quantify each separated lipoprotein. The enzyme may be used as a solution as it is, or may be used as an immobilized enzyme. In the latter case, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase are usually immobilized on the immobilized enzyme column, and the immobilized enzyme column causes the lipoprotein to act on the enzyme to produce hydrogen peroxide. Therefore, lipoprotein can be quantified by measuring the amount of hydrogen peroxide. There are various methods for measuring the amount of hydrogen peroxide, and for example, a method of quantifying a fluorescent substance produced from homovalic acid and hydrogen peroxide by the action of peroxidase can be preferably used.

【００１１】[0011]

【作用】イオン交換クロマトグラフィーによるリポタン
パク質の分離について、厳密な機構は不明であるが、本
発明のように、アニオン交換基を導入したグルコマンナ
ンゲルを用いることにより、各リポタンパク質を高い精
度で分離することができる。平均細孔径１０００Å以上
のグルコマンナンゲルは、細孔が十分に大きいので分離
対象であるリポタンパク質が不要なサイズ排除を起こさ
ず、迅速な細孔への浸透と細孔からの溶離がなされ、ま
た該ゲルは非特異的な吸着性の極めて小さい親水性天然
多糖類由来の充填剤であるので、疎水的な性質を示すリ
ポタンパク質に対して、不要な吸着も生じない特徴をも
つと考えられている。このため、純粋なイオン交換モー
ドでのクロマト分離が実現でき、従来分離が困難であっ
た各種リポタンパク質が容易に完全分離できる。さら
に、グルコマンナンゲルは、極めて高い耐圧強度を有し
ているので、０.５ml／分以上の通液が可能であり、１
検体当たり、１時間以内という短時間での分離が達成で
きる。[Function] Regarding the separation of lipoproteins by ion exchange chromatography, the exact mechanism is unknown, but by using glucomannan gel introduced with an anion exchange group as in the present invention, each lipoprotein can be separated with high accuracy. Can be separated. Glucomannan gel with an average pore size of 1000 Å or more does not cause unnecessary size exclusion of the lipoprotein to be separated because it has a sufficiently large pore size, allowing rapid penetration into and elution from the pore. Since the gel is a filler derived from a hydrophilic natural polysaccharide having a very small non-specific adsorptivity, it is considered to have a characteristic that unnecessary adsorption does not occur with respect to lipoprotein having a hydrophobic property. There is. Therefore, chromatographic separation in a pure ion exchange mode can be realized, and various lipoproteins, which have been difficult to separate in the past, can be easily and completely separated. Furthermore, since glucomannan gel has extremely high pressure resistance, it is possible to pass more than 0.5 ml / min.
Separation can be achieved within a short time of 1 hour per sample.

【００１２】[0012]

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。 製造例１ アニオン交換基を導入したグルコマンナンゲルの製造 コンニャクマンナン粉６０ｇを約８０℃の水道水６リッ
トルに加え、撹拌溶解した。この溶液を６リットルのエ
タノール中に少しずつ滴下し、生じた沈殿をろ別、風乾
したのち真空乾燥して精製グルコマンナン（以下、グル
コマンナンをＧＭと略す場合がある）を得た。上記精製
グルコマンナン３０ｇをホルムアミド１リットル中に入
れ、５５℃で７時間膨潤させたのち、ピリジン３００ml
を加え、さらにその２時間後に無水酢酸３００mlを加
え、５５℃で４日間反応させてエステル化した。この反
応混合物を７リットルの水中に撹拌しながら加えた。生
じた沈殿をろ別し、水洗、風乾したのち真空乾燥した。
得られた粗酢化物を１０リットルのアセトンに溶解し、
不溶解分を除いたのち、約２０リットルの水中に撹拌し
ながら加えた。生じた沈殿をろ別、風乾したのち真空乾
燥してグルコマンナンの酢化物Ａを得た。上記酢化物Ａ
１０ｇを多孔化剤のデカリン２０〜３５mlとともにクロ
ロホルム５００〜７７０mlに溶解した。この溶液を５５
℃の９０％けん化ポリビニルアルコールの１重量％水溶
液５リットル中に５００〜９００rpmの撹拌速度で撹拌
しながら滴下し、撹拌した。２４時間後徐冷し、球状粒
子をろ別し、水洗した。この球状粒子をメタノール２２
５mlと１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２５mlとの混合液
中に加え、２時間撹拌してけん化した。その後けん化球
状粒子をろ別し、アセトン２００ml、ジメチルホルムア
ミド３００ml、エピクロロヒドリン７０mlの混合物中に
加え、６０℃で２４時間反応させて架橋した。粒子を回
収し、水洗後アセトンで洗浄してグルコマンナンゲル球
状粒子ＡＩ（以下、ＧＭ−ＡＩと略す）を得た。このＧ
Ｍ−ＡＩは、粒径が２５〜５０μｍ、ポリエチレングリ
コールを用いて測定した排除限界分子量が１５０万、
０.１μｍ以上の径の細孔比表面積が４.０ｍ²／ml・ゲ
ルであった。なお、細孔比表面積は次の方法で測定し
た。すなわち多孔質体を真空乾燥し、マイクロメリティ
ックス社製のポアサイザ９３１０型を用いて水銀圧入法
で細孔分布を測定した。細孔分布測定により得られた乾
燥重量当りの表面積（ｍ²／ｇ）と、別途求めた乾燥重
量当りの湿潤容量（水中に沈降させた際のml／ｇ）の値
から湿潤容量当りの比表面積（ｍ²／ml）を求めた。The present invention will be described in more detail by way of examples, which should not be construed as limiting the invention thereto. Production Example 1 Production of Glucomannan Gel Introducing Anion Exchange Group 60 g of konjak mannan powder was added to 6 liters of tap water at about 80 ° C. and dissolved with stirring. This solution was dropped little by little into 6 liters of ethanol, the resulting precipitate was filtered off, air-dried and then vacuum-dried to obtain purified glucomannan (hereinafter, glucomannan may be abbreviated as GM). 30 g of the above purified glucomannan was put into 1 liter of formamide and swelled at 55 ° C. for 7 hours, and then 300 ml of pyridine.
And 2 hours later, 300 ml of acetic anhydride was added, and the mixture was reacted at 55 ° C. for 4 days for esterification. The reaction mixture was added to 7 liters of water with stirring. The precipitate formed was filtered off, washed with water, air-dried and then vacuum-dried.
The obtained crude acetic acid is dissolved in 10 liters of acetone,
After removing the insoluble matter, it was added to about 20 liters of water with stirring. The resulting precipitate was filtered, air-dried and then vacuum-dried to obtain glucomannan acetonate A. Acetate A above
10 g was dissolved in 500-770 ml of chloroform with 20-35 ml of decalin as a porosifying agent. 55 this solution
The mixture was added dropwise to 5 liters of a 90% saponified polyvinyl alcohol 1% by weight aqueous solution with stirring at a stirring speed of 500 to 900 rpm and stirred. After 24 hours, the mixture was gradually cooled, the spherical particles were filtered off, and washed with water. Methanol 22
The mixture was added to a mixed solution of 5 ml and 10 ml of a 10N sodium hydroxide aqueous solution and stirred for 2 hours to saponify. Thereafter, the saponified spherical particles were separated by filtration, added to a mixture of 200 ml of acetone, 300 ml of dimethylformamide and 70 ml of epichlorohydrin, and reacted at 60 ° C. for 24 hours to crosslink. The particles were collected, washed with water and then with acetone to obtain glucomannan gel spherical particles AI (hereinafter abbreviated as GM-AI). This G
M-AI has a particle size of 25 to 50 μm, an exclusion limit molecular weight of 1.5 million measured using polyethylene glycol,
The specific surface area of pores having a diameter of 0.1 μm or more was 4.0 m ² / ml · gel. The pore specific surface area was measured by the following method. That is, the porous body was dried under vacuum, and the pore distribution was measured by the mercury porosimetry method using Porosizer 9310 manufactured by Micromeritics. From the surface area per dry weight (m ² / g) obtained by measuring the pore size distribution and the separately determined wet capacity per dry weight (ml / g when settled in water), the ratio per wet capacity The surface area (m ² / ml) was determined.

【００１３】次に、前記ＧＭ−ＡＩのゲル２ｇをフラス
コに入れ、１６mlの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加
え、氷浴中で１時間緩速撹拌した。その後反応試薬の２
−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩１２ｇを５
mlの超純水で溶解した溶液を注ぎ、８０℃まで加温して
１時間緩速撹拌した。次いでゲル粒子をろ別、回収し、
さらに水洗してジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を
導入したＧＭ−ＡＩ（以下、ＤＥＡＥ−ＧＭ−ＡＩと略
す）を得た。次いでＤＥＡＥ−ＧＭ−ＡＩのゲル粒子を
２０容量倍の０.２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で遊離型
としたのち、大過剰の超純水でゲルを洗浄した。こうし
て得られた遊離型ＤＥＡＥゲルのうち、０.５ｇを２０m
lの０.１Ｎ塩酸水溶液に浸漬し、１２時間振とうしたの
ち上澄液の残留塩酸量を滴定で求め、ＤＥＡＥゲルに捕
捉された塩素イオン量からＤＥＡＥ−ＧＭ−ＡＩのイオ
ン交換容量を求めたところ、１.１５meq／ｇ・ゲルであ
った。また、該ＤＥＡＥ−ＧＭ−ＡＩのピーク細孔径は
２１００Åであり、粒径は２５〜５０μｍであった。Next, 2 g of the GM-AI gel was placed in a flask, 16 ml of 5N aqueous sodium hydroxide solution was added, and the mixture was gently stirred in an ice bath for 1 hour. Then 2 of the reaction reagents
12 g of-(diethylamino) ethyl chloride hydrochloride was added to
A solution dissolved with ml of ultrapure water was poured, the mixture was heated to 80 ° C., and gently stirred for 1 hour. Then, the gel particles are filtered and collected,
Further, it was washed with water to obtain GM-AI (hereinafter abbreviated as DEAE-GM-AI) into which a diethylaminoethyl (DEAE) group was introduced. Next, the gel particles of DEAE-GM-AI were made into a free form with a 20-fold volume of 0.2N sodium hydroxide aqueous solution, and then the gel was washed with a large excess of ultrapure water. Of the free DEAE gel thus obtained, 0.5 g of 20 m
After dipping in 0.1 N hydrochloric acid aqueous solution for 12 hours and shaking, the residual hydrochloric acid amount of the supernatant was determined by titration, and the ion exchange capacity of DEAE-GM-AI was determined from the amount of chloride ions captured in the DEAE gel. As a result, it was 1.15 meq / g · gel. The peak pore size of the DEAE-GM-AI was 2100Å and the particle size was 25 to 50 μm.

【００１４】実施例１ 試料としてＨＤＬとＬＤＬとＶＬＤＬとの混合物２０μ
ｌ（総コレステロール量として、それぞれ１００μｇ／
ml、２００μｇ／ml、１００μｇ／ml）及び日本白色家
兎血漿２０μｌを、充填剤として製造例１で得られたア
ニオン交換基を導入したグルコマンナンゲル（ＤＥＡＥ
−ＧＭ−ＡＩ）を用い、図１に示すフローシステムによ
り、リポタンパク質の分離定量実験を行った。まず、サ
ンプルインジェクター１から、試料を分離カラム（充填
剤ＤＥＡＥ−ＧＭ−ＡＩ、内径６.０mm、長さ１００m
m）２に通液したのち、溶離液Ａ（２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液、pH７.０）３及び溶離液Ｂ（５００ｍＭ
ＮａＣｌ水溶液）４を、それぞれポンプ５及び６を用い
てステップワイズグラジエントモードで通液した。溶離
液の流速は０.６ml／分であり、またグラジエントのタ
イムプログラムを図２に示す。分離カラム２からの溶出
液は固定化酵素カラム７に導入される。この固定化酵素
カラム７は、コレステロールエステルヒドロラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼを固定化したＴＲＥＳＹＬ
−５ＰＷを充填したガラスカラム（内径３.０mm、長さ
５０mm）であり、またカラム温度は室温である。該固定
化酵素カラムにおいて、過酸化水素が生成するので、酵
素溶液（ペルオキシターゼ７Ｕ／ml、ホモバリン酸１mg
／ml及び０.０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、pH７.０）８をポンプ９
により０.３ml／分の速度で供給し、反応コイル（内径
０.５mm、長さ５ｍ）１０で反応させ、さらに反応溶液
（０.１ＮＮａＯＨ水溶液）１１をポンプ１２により０.
１ml／分の速度で供給して反応コイル（内径０.５mm、
長さ０.５ｍ）１３で反応させ蛍光物質を生成させる。
この蛍光物質を検出器１４（蛍光検出：励起波長３２５
nm、測定波長４２０nm）にて定量する。図３に、ＨＤＬ
とＬＤＬとＶＬＤＬとの混合物のクロマトグラム、図４
に日本白色家兎血漿のクロマトグラムを示す。図３及び
図４から、本発明方法は、リポタンパク質を短時間で高
選択的に分離定量が可能であることが分かる。Example 1 As a sample, a mixture of HDL, LDL and VLDL 20 μ
l (100 μg / total cholesterol)
ml, 200 μg / ml, 100 μg / ml) and 20 μl of Japanese white rabbit plasma as a packing material, and the anion-exchange group-introduced glucomannan gel (DEAE) obtained in Production Example 1 was introduced.
-GM-AI), a separation and quantification experiment of lipoproteins was performed by the flow system shown in FIG. First, a sample is separated from the sample injector 1 by a column (packing agent DEAE-GM-AI, inner diameter 6.0 mm, length 100 m).
m) 2 and then eluent A (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) 3 and eluent B (500 mM
NaCl aqueous solution) 4 was passed in stepwise gradient mode using pumps 5 and 6, respectively. The flow rate of the eluent was 0.6 ml / min, and the gradient time program is shown in FIG. The eluate from the separation column 2 is introduced into the immobilized enzyme column 7. This immobilized enzyme column 7 comprises TRESYL immobilized with cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase.
A glass column (inner diameter 3.0 mm, length 50 mm) packed with -5 PW, and the column temperature is room temperature. Since hydrogen peroxide is produced in the immobilized enzyme column, the enzyme solution (peroxidase 7 U / ml, homovalic acid 1 mg
/ Ml and 0.05% Triton X-100 20
Pump 9 mM mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) 8
At a rate of 0.3 ml / min, the reaction is carried out in a reaction coil (inner diameter: 0.5 mm, length: 5 m) 10, and a reaction solution (0.1 N NaOH aqueous solution) 11 is added by a pump 12 to 0.1
The reaction coil (inner diameter 0.5 mm, supplied at a rate of 1 ml / min,
The reaction is performed at a length of 0.5 m) 13 to produce a fluorescent substance.
This fluorescent substance is detected by the detector 14 (fluorescence detection: excitation wavelength 325
nm, measurement wavelength 420 nm). In Figure 3, HDL
Chromatogram of the mixture of LDL and VLDL, FIG.
The chromatogram of Japanese white rabbit plasma is shown in FIG. From FIG. 3 and FIG. 4, it can be seen that the method of the present invention enables highly selective separation and quantification of lipoproteins in a short time.

【００１５】実施例２ 実施例１と同様にして、塩化（II）銅で酸化変性したＬ
ＤＬの分離検出を行った。なお、溶離液の通液は図２に
示すグラジエントのタイムプログラムによるが、９０分
まで溶出液Ｂを１００％でホールドした。図５に、酸化
変性ＬＤＬクロマトグラムを示す。Example 2 L was oxidized and modified with copper (II) chloride in the same manner as in Example 1.
Separate detection of DL was performed. In addition, although the eluent was passed through the time program of the gradient shown in FIG. 2, the eluent B was held at 100% until 90 minutes. FIG. 5 shows an oxidation-modified LDL chromatogram.

【００１６】[0016]

【発明の効果】以上のように、本発明方法によると、リ
ポタンパク質のサブクラスの分離、定量が可能であり、
また、動脈硬化発症のマーカーとして注目されている変
性リポタンパク質の分離、検出も可能である。その結
果、動脈硬化性疾患の診断及び予知への応用が期待でき
る。As described above, according to the method of the present invention, it is possible to separate and quantify subclasses of lipoproteins,
In addition, it is possible to separate and detect denatured lipoprotein, which is attracting attention as a marker for the development of arteriosclerosis. As a result, application to diagnosis and prediction of arteriosclerotic diseases can be expected.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は本発明方法を実施するためのフローシス
テムの１例を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an example of a flow system for carrying out the method of the present invention.

【図２】図２は、ステップワイズグラジエントモードの
タイムプログラムを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a time program in a stepwise gradient mode.

【図３】図３は、実施例１におけるＨＤＬとＬＤＬとＶ
ＬＤＬとの混合物のクロマトグラムである。FIG. 3 is a diagram illustrating HDL, LDL, and V in the first embodiment.
It is a chromatogram of the mixture with LDL.

【図４】図４は、実施例１における日本白色家兎血漿の
クロマトグラムである。FIG. 4 is a chromatogram of Japanese white rabbit plasma in Example 1.

【図５】図５は、実施例２における酸化変性ＬＤＬのク
ロマトグラムである。FIG. 5 is a chromatogram of oxidation-modified LDL in Example 2.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１ サンプルインジェクター ２ 分離カラム ３ 溶離液Ａ ４ 溶離液Ｂ ７ 固定化酵素カラム ８ 酵素溶液 １０ 反応コイル １１ 反応溶液 １３ 反応コイル １４ 検出器 1 sample injector 2 separation column 3 eluent A 4 eluent B 7 immobilized enzyme column 8 enzyme solution 10 reaction coil 11 reaction solution 13 reaction coil 14 detector

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】アニオン交換基を導入したグルコマンナン
ゲルにリポタンパク質含有液を接触させたのち、溶離液
をグラジエントモードで接触させることを特徴とするリ
ポタンパク質の分離方法。1. A method for separating lipoproteins, which comprises contacting a liquid containing lipoprotein with a glucomannan gel having an anion exchange group introduced therein, and then contacting the eluent in a gradient mode. 【請求項２】リポタンパク質が高比重リポタンパク質
（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低比
重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及び変性リポタンパク質
である請求項１記載のリポタンパク質の分離方法。2. The method for separating lipoproteins according to claim 1, wherein the lipoproteins are high density lipoproteins (HDL), low density lipoproteins (LDL), very low density lipoproteins (VLDL) and denatured lipoproteins. 【請求項３】請求項１ないし２のいずれかに記載の方法
でリポタンパク質を分離したのち、カラム溶出液を酵素
と反応後検出系に導入することを特徴とするリポタンパ
ク質の定量方法。3. A method for quantifying lipoprotein, which comprises separating a lipoprotein by the method according to claim 1 and introducing the column eluate into a detection system after reaction with an enzyme.