JPH0789908B2 - 動物細胞培養用無血清培地 - Google Patents

動物細胞培養用無血清培地

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JPH0789908B2
JPH0789908B2 JP3415091A JP3415091A JPH0789908B2 JP H0789908 B2 JPH0789908 B2 JP H0789908B2 JP 3415091 A JP3415091 A JP 3415091A JP 3415091 A JP3415091 A JP 3415091A JP H0789908 B2 JPH0789908 B2 JP H0789908B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒトを含む動物細
胞、特に上皮系動物細胞の培養、特に初代培養に好適な
無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞の培養用の培地には牛などの動
物血清が添加されることが多く、このため細胞が生産す
る微量の有用物質を培地から分離精製するのに極めて複
雑な操作を必要とする。また、培地に添加される動物血
清は複雑な組成を有するため、有用物質を高度の技術で
分離精製したとしても動物血清由来の成分が不純物とし
て混入してくる可能性がある。このような問題点を解決
する方法として、動物血清を含まない無血清培地で細胞
を培養しようとする試みがなされている。
【０００３】しかしながら、従来から提案されている無
血清培地は、いずれも特定動物の特定部位の細胞の培養
のみに有効であり、汎用性がないという難点がある。例
えば、完全ＭＣＤＢ１５３培地に所定量の表皮成長因子
とインスリンを添加した無血清培地は、ヒトの表皮角化
細胞の培養には有効であるが(米国特許第４,６７３,６
４９号明細書参照)、ラットやその他の動物の表皮角化
細胞や各種の角膜上皮細胞等の培養に対しては十分な増
殖効果をもたらさない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、従来の動
物細胞培養用無血清培地に比べて、極めて多種多様な動
物細胞の培養、特に初代培養に対して優れた増殖効果を
もたらす無血清培地を提供するためになされたものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、メチオ
ニン８．０〜１４．０mg／l、スレオニン５．０〜１
１．５mg／l、チロシン７．０〜１１．０mg／l、フェニ
ルアラニン９．０〜１４．５mg／l、グルタミン４０
０．０〜５５０．０mg／l、アスパラギン酸７．０〜
９．５mg／l、リジン塩酸塩１９．０〜２８．０mg／l、
セリン３３．０〜４０．０mg／lおよびＣa ０．１mＭ
(塩化カルシウムとして)以下; およびグルコース、ビタ
ミン、ミネラル、成長因子、ＨＥＰＥＳおよび前述のア
ミノ酸以外のアミノ酸から選ばれた一種以上の常用成分
を含む動物の上皮細胞培養用無血清培地に関する。
【０００６】
【０００７】本発明による無血清培地の他の配合成分
は、従来から動物細胞培養用無血清培地に使用されてい
る各種の配合成分のなかから、被培養細胞の種類を考慮
して適宜選定すればよい。このような配合成分として
は、以下のアミノ酸類、ビタミン類、ミネラル、抗生物
質、増殖因子およびその他の添加剤が例示される。これ
らの配合成分の含有量は特に限定的ではないが、通常
は、アミノ酸類７５０〜１５００mg／l、ビタミン類５
０〜１５０mg／l、ミネラル５０００〜１００００mg／l
であり、抗生物質、増殖因子およびその他の添加剤は所
望により適宜添加すればよい。
【０００８】アミノ酸 アラニン アルギニン塩酸塩 アスパラギン一水和物 アスパラギン酸 システイン塩酸塩一水和物 グルタミン酸 グルタミン グリシン ヒスチジン塩酸塩一水和物 イソロイシン ロイシン リジン塩酸塩 メチオニン フェニルアラニン プロリン セリン スレオニン トリプトファン チロシン バリン
【０００９】ビタミン ビオチン、葉酸、ＤＬ−アルファーリポ酸、ニコチン酸
アミド、Ｄ−パントテイン酸、ピリドキサミン、リポフ
ラビン、チアミン、ビタミンＡ,Ｂ12,Ｃ,Ｄ3,Ｅ、アデ
ニン、塩化コリン、イノシトール、ヒボキサンチン、プ
テリシン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム
【００１０】ミネラル カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、
銅、鉄、セレン、マンガン、珪素、モリブデン、バナジ
ウム、ニッケル、スズ、亜鉛
【００１１】抗生物質 ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲン
タマイシン、アンホテリシンＢ、タイロシン、オーレオ
マイシン、ＭＣ−２１０
【００１２】増殖因子 ＮＧＦ(神経成長因子) ＥＧＦ(上皮成長因子) Ｍilk ＧＦ(ミルク由来成長因子) ＦＧＦ(線維芽細胞成長因子) Ｂrain ＦＧＦ(脳由来線維芽細胞成長因子) Ａcidic ＦＧＦ(酸性線維芽細胞成長因子) ＰＤＧＦ(血小板由来成長因子) ＰＢＰ(結合組織活性化因子) Ｓm(ソマトメジン) ＣＳＦ(コロニー形成因子) ＥＰＯ(エリスロポエチン) スロンボポエチン ＴＣＧＦ(Ｔ細胞成長因子) ＢＣＧＦ(Ｂ細胞成長因子) ＩＬ−１．２．３(インターロイキン１．２．３) ＣＤＦ(軟骨由来因子) ＣＤＧＦ(軟骨由来成長因子) ＢＤＧＦ(骨由来成長因子) ＳＧＦ(骨格成長因子) ＥＣＧＦ(内皮細胞成長因子) ＥＣＤＧＦ(内皮細胞由来成長因子) ＥＤＧＦ(眼由来成長因子) 精巣由来成長因子 セルトリ細胞由来成長因子 ＭＳＦ(乳腺刺激因子) ＳＣＧＦ(脊髄由来成長因子) ＭＤＧＦ(マクロファージ由来成長因子) Ｒ−ＭＧＦ(リサイクル問葉成長因子) ＴＧＦ−α,β,γ２(トランスフォーミング成長因子) ＴＡＦ(腫瘍血管新生因子) ＯＤＧＦ(骨肉腫由来成長因子) ＤＳＦ(ＤＮＡ合成促進因子) ＦＤＧＦ(線維芽細胞由来成長因子) ＩＧＦ−１．２．３．４(インシュリン様成長因子) ＨＧＦ(肝細胞成長因子) ４５Ｋ−ＧＦ(血小板由来血管内皮細胞成長因子) ＬＧＦ(白血病細胞由来成長因子) ＭＧＦ(マクロファージ成長因子) トロフォブラスト由来成長因子 ハイドロコーチゾン インシュリン トランスフェリン 糖質コーチコイド ＰＧ(プロスタグランジン) Ｃyclic ＡＭＰ ＧＨ(成長ホルモン) ＡＣＴＨ(副腎皮質刺激ホルモン) ＴＳＨ(甲状腺刺激ホルモン) プロラクチン バソプレシン Ｔ4(サイロキシン) Ｔ3(トリヨードサイロニン) ＣＴ(カルシトニン) ＰＴＨ(副甲状腺ホルモン) アンドロジェン エストロジェン プロジェステロン グルカゴン アンジオテンシン ポリアミン レクチン コレラトキシン 塩化リゾチウム コルヒチン メリチン ＢＰＥ(牛脳下垂体抽出物) ＢＢＥ(牛脳抽出物)
【００１３】その他 ヘペス緩衝液、エタノールアミン、フォスフォエタノ
ールアミン
【００１４】上記のアミノ酸のうち、特に重要なもの
は、スレオニン、チロシン、フェニルアラニン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸、リジン塩酸塩およびセリンで
あり、これらの濃度は、通常は、それぞれ５．０〜１
１．５mg／l、７．０〜１１．０mg／l、９．０〜１４．
５mg／l、４００．０〜５５０．０mg／l、７．０〜９．
５mg／l、１９．０〜２８．０mg／lおよび３３．０〜４
０．０mg／lである。また、ミネラル源として特に重要
なものは塩化カルシウムであり、その配合量は通常は
０．１mＭ以下である。
【００１５】動物細胞のうちでも、特に上皮細胞、例え
ばウサギの角膜上皮細胞、ラットの表皮角化細胞および
ヒトの表皮角化細胞等の培養に好適な無血清培地として
は、以下の培地Ｉ〜ＩＩＩが例示される。
【００１６】培地Ｉ(特に明示しない限り、単位はmg／l
である) 成分 含有量 アラニン ８．９１ アルギニン ２１０．６７ アスパラギン一水和物 １５．０１ アスパラギン酸 ８．５２ システイン塩酸塩一水和物 ３８．６４ グルタミン酸 １４．７０ グルタミン ５１１．５ グリシン ７．５１ ヒスチジン塩酸塩一水和物 ４４．０２ イソロイシン ５１．１６ ロイシン ３９．３５ リジン塩酸塩 ２３．７４ メチオニン １１．１９ フェニルアラニン １２．３９ プロリン ２３．０３ セリン ３６．７８ スレオニン ７．７４ トリプトファン ６．５４ チロシン ９．０６ バリン １９．９２ ビオチン ０．０２０ 葉酸 １．０６ リポ酸 ０．２１ ニコチン酸アミド ０．３３０ パントテン酸カルシウム ０．６２０ ピリドキシン塩酸塩 ０．１４０ リボフラビン ０．２０７ チアミン塩酸塩 ０．６７５ ビタミンＢ12 ０．９２２ アデニン １２．１６ 塩化コリン ６．９８ グルコース １０８２ イノシトール １０．８１ ヒポキサンチン ２．０４ プテリシン二塩酸塩 ０．０８０５ ピルビン酸ナトリウム ５５．０ チミジン ０．７２７ 塩化カルシウム二水和物 ０．０３mＭ 塩化カリウム ２０１．２９ 塩化マグネシウム六水和物 １２４．０ 塩化ナトリウム ７５９７．２ 燐酸二水素ナトリウム 七水和物 ２９４．８ 燐酸二水素カリウム ４２．１９ 硫酸銅五水和物 ０．００２５ 硫酸鉄七水和物 １．１１ セレン酸ナトリウム ０．００１９３４ 硫酸マンガン五水和物 ０．００００６５ ケイ酸ナトリウム九水和物 ０．０７１１ モリブデン酸アンモニウム 四水和物 ０．０００６１８ アンモニアバナジウム ０．０００２９３ 塩化ニッケル六水和物 ０．００００５９ 塩化スズ二水和物 ０．００００５６ 塩化亜鉛七水和物 ０．２１５７ ヘペス ３３３６．２ 炭酸水素ナトリウム １１７６ フェノールレッドナトリウム塩 １．２４２ インスリン ５μg／ml ハイドロコーチゾン ０．５μg／ml ＥＧＦ １０ng／ml ＢＰＥ ０．４％(w／w)
【００１７】培地ＩＩ(特に明示しない限り、単位はmg
／lである) 成分 含有量 アラニン ７．１３ アルギニン １８９．５ アスパラギン一水和物 １２．１０ アスパラギン酸 ７．５１ システイン塩酸塩一水和物 ３５．１３ グルタミン酸 １４．７０ グルタミン ４００．０ グリシン ６．０６ ヒスチジン塩酸塩一水和物 １１．９３ イソロイシン ５１．１６ ロイシン ３９．３５ リジン塩酸塩 ２０．０９ メチオニン ９．００ フェニルアラニン ９．８１ プロリン ２３．０３ セリン ３３．００ スレオニン ５．９６ トリプトファン ６．１３ チロシン ７．２５ バリン １９．９２ ビオチン ０．０２０ 葉酸 １．０６ リポ酸 ０．２１ ニコチン酸アミド ０．３３０ パントテン酸カルシウム ０．６２０ ピリドキシン塩酸塩 ０．１４０ リボフラビン ０．２０７ チアミン塩酸塩 ０．６７５ ビタミンＢ12 ０．９２２ アデニン １２．１６ 塩化コリン ６．９８ グルコース １０８２ イノシトール １０．８１ ヒポキサンチン ２．０４ プテリシン二塩酸塩 ０．０８０５ ピルビン酸ナトリウム ５５．０ チミジン ０．７２７ 塩化カルシウム二水和物 ０．０３mＭ 塩化カリウム ２０１．２９ 塩化マグネシウム六水和物 １２４．０ 塩化ナトリウム ７５９７．２ 燐酸二水素ナトリウム 七水和物 ２９４．８ 燐酸二水素カリウム ４２．１９ 硫酸銅五水和物 ０．００２５ 硫酸鉄七水和物 １．１１ セレン酸ナトリウム ０．００１９３４ 硫酸マンガン五水和物 ０．００００６５ ケイ酸ナトリウム九水和物 ０．０７１１ モリブデン酸アンモニウム 四水和物 ０．０００６１８ アンモニアバナジウム ０．０００２９３ 塩化ニッケル六水和物 ０．００００５９ 塩化スズ二水和物 ０．００００５６ 塩化亜鉛七水和物 ０．２１５７ ヘペス ３３３６．２ 炭酸水素ナトリウム １７６ フェノールレッドナトリウム塩 １．２４２ インスリン ５μg／ml ハイドロコーチゾン ０．５μg／ml ＥＧＦ １０ng／ml ＢＰＥ ０．４％(w／w)
【００１８】培地ＩＩＩ(特に明示しない限り、単位はm
g／lである) 成分 含有量 アラニン ４．４６ アルギニン １６８．５４ アスパラギン一水和物 ７．５１ アスパラギン酸 ８．５２ システイン塩酸塩一水和物 ３６．８８ グルタミン酸 １４．７０ グルタミン ５５０．０ グリシン ３．７５ ヒスチジン塩酸塩一水和物 ５４．５０ イソロイシン ７７．４０ ロイシン ５９．０３ リジン塩酸塩 ２３．７４ メチオニン １３．００ フェニルアラニン １４．００ プロリン １７．２７ セリン ３１．５３ スレオニン １０．００ トリプトファン １１．２３ チロシン １１．００ バリン ４１．００ ビオチン ０．００７５ 葉酸 ０．８８ リポ酸 ０．１０ ニコチン酸アミド ０．５１３ パントテン酸カルシウム ０．７６２ ピリドキシン塩酸塩 ０．５１４ リボフラビン ０．０７５ チアミン塩酸塩 ０．６７５ ビタミンＢ12 ０．２０５ アデニン １２．１６ 塩化コリン ６．９８ グルコース １０４５ イノシトール ２１．６２ プテリシン二塩酸塩 ０．０８ チミジン ０．３６ 塩化カルシウム二水和物 ０．０３mＭ 塩化カリウム ２６０．９ 塩化マグネシウム六水和物 ６１．０ 塩化ナトリウム ７５９７．２ 燐酸二水素ナトリウム 七水和物 １４１．９６ 硫酸銅五水和物 ０．００２５ 硫酸鉄七水和物 ０．７０ セレン酸ナトリウム ０．００１９３４ 硫酸マンガン五水和物 ０．０００１２１ ケイ酸ナトリウム九水和物 ０．０７１１ モリブデン酸アンモニウム 四水和物 ０．０００６１８ アンモニアバナジウム ０．０００２９３ 塩化ニッケル六水和物 ０．００００５９ 塩化スズ二水和物 ０．００００５６ 塩化亜鉛七水和物 ０．０７２ ヘペス ３３３６．２ 炭酸水素ナトリウム １１７６ フェノールレッドナトリウム塩 １．１３ インスリン ５μg／ml ハイドロコーチゾン ０．５μg／ml ＥＧＦ １０ng／ml ＢＰＥ ０．４％(w／w)
【００１９】上記の無血清培地は、動物の上皮系細胞の
特に初代培養に極めて有効なだけでなく、従来の血清培
地等(例えば、ＤＭＥＭまたはＭＥＭ等に血清を添加し
た培地等によっては困難であったラットの表皮角化細胞
や各種の角膜上皮細胞の継代培養および凍結保存を可能
にする。
【００２０】本発明による無血清培地は、上皮系細胞の
培養に対して特に有効なものであるが、その他の細胞系
としては、内皮系細胞、線維芽様細胞、神経系細胞、神
経系細胞、免疫系細胞,内分泌系細胞等が例示される。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。実施例１ ウサギの眼球から分離した角膜上皮細胞を前記の培地
Ｉを用いて３７℃で５日間培養した後、培養プレート
(２４ウェル)に接種した(５０００個細胞／ウェル)。こ
の接種細胞を培地Ｉを用いて３７℃で５日間培養したと
ころ、顕著な増殖効果が認められた(３５,０００個細胞
／ウェル)。
【００２２】比較例１〜３ 培養プレート上での培養培地として、下記のＭＣＤＢ
１５３、ＤＭＥＭまたはＦ−１０を使用する以外は実施
例１と同様の操作をおこなったところ、いずれの場合も
ほとんど増殖効果はみられなかった(６０００〜７００
０個細胞／ウェル)。
【００２３】ＭＣＤＢ１５３培地(特に明示しない限
り、単位はmg／lである) 成分 含有量 アラニン ８．９１ アルギニン ２１０．７ アスパラギン一水和物 １５．０１ アスパラギン酸 ３．９９ システイン塩酸塩一水和物 ４２．０４ グルタミン酸 １４．７１ グルタミン ８７７．２ グリシン ７．５１ ヒスチジン塩酸塩一水和物 １６．７７ イソロイシン １．９６８ ロイシン ６５．６ リジン塩酸塩 １８．２７ メチオニン ４．４７６ フェニルアラニン ４．９５６ プロリン ３４．５４ セリン ６３．０５ スレオニン １１．９ トリプトファン ３．０６ チロシン ２．７１８ バリン ３５．１３ ビオチン ０．０１５ 葉酸 ０．７９ リポ酸 ０．２０６ ニコチン酸アミド ０．０３７ パントテン酸カルシウム ０．４７６ ピリドキシン塩酸塩 ０．０６２ リボフラビン ０．０３８ チアミン塩酸塩 ０．３３７ ビタミンＢ12 ０．４１ アデニン ２４．３２ 塩化コリン １３．９６ グルコース １０８１ イノシトール １８．０２ プテリシン二塩酸塩 ０．１６１ ピルビン酸ナトリウム ５５．０ チミジン ０．７２７ 塩化カルシウム二水和物 ０．０３mＭ 塩化カリウム １１１．８３ 塩化マグネシウム六水和物 １２２．０ 塩化ナトリウム ７５９７．２ 燐酸二水素ナトリウム 七水和物 ５３６．２ 硫酸銅五水和物 ０．００２７５ 硫酸鉄七水和物 １．３９ 亜セレン酸 ０．００３８６７ 硫酸マンガン五水和物 ０．０００２４１ ケイ酸ナトリウム九水和物 ０．１４２１ モリブデン酸アンモニウム 四水和物 ０．００１２３６ アンモニアバナジウム ０．０００５８５ 塩化ニッケル六水和物 ０．０００１１９ 塩化スズ二水和物 ０．０００１１３ 塩化亜鉛七水和物 ０．１４３８ ヘペス ６６７２．４ 炭酸水素ナトリウム １１７６ フェノールレッドナトリウム塩 １．２４２ 酢酸ナトリウム三水和物 ５００
【００２４】ＤＭＥＭ培地(特に明示しない限り、単位
はmg／lである) 成分 含有量 アルギニン ８４．０ システイン二ナトリウム ５６．８ グルタミン ５８４．０ グリシン ３０．０ ヒスチジン塩酸塩一水和物 ４２．０ イソロイシン １０４．８ ロイシン １０４．８ リジン塩酸塩 １４６．２ メチオニン ３０．０ フェニルアラニン ６６．０ セリン ４２．０ スレオニン ９５．２ トリプトファン １６．０ チロシン ７２．０ バリン ９３．６ リポ酸 ４．０ ニコチン酸アミド ４．０ パントテン酸カルシウム ４．０ ピリドキシン塩酸塩 ４．０ リボフラビン ０．４ チアミン塩酸塩 ４．０ 塩化コリン ４．０ グルコース ４５００．０ イノシトール ７．０ ピルビン酸ナトリウム １１０．０ 塩化カルシウム １．８mＭ 塩化カリウム ４００．０ 塩化マグネシウム ９７．７ 塩化ナトリウム ６８００．０ 燐酸二水素ナトリウム 一水和物 １４０．０ 炭酸水素ナトリウム ２０００．０ フェノールレッドナトリウム塩 １０．０
【００２５】Ｆ−１０培地(特に明示しない限り、単位
はmg／lである) 成分 含有量 アラニン ８．９ アルギニン ２１０．７ アスパラギン一水和物 １５．０ アスパラギン酸 １３．３ システイン塩酸塩一水和物 ３５．１ グルタミン酸 １４．７ グルタミン １４６．２ グリシン ７．５ ヒスチジン塩酸塩一水和物 ２１．０ イソロイシン ２．６ ロイシン １３．１ リジン塩酸塩 ２９．３ メチオニン ４．５ フェニルアラニン ５．０ プロリン １１．５ セリン １０．５ スレオニン ３．６ トリプトファン ０．６ チロシン １．８ バリン ３．５ ビオチン ０．０２ 葉酸 １．３２ リポ酸 ０．２１ ニコチン酸アミド ０．６１ パントテン酸カルシウム ０．７２ ピリドキシン塩酸塩 ０．２１ リボフラビン ０．３８ チアミン塩酸塩 １．０１ ビタミンＢ12 １．３６ 塩化コリン ０．７ グルコース １１００．０ イノシトール ０．５４ ヒポキサンチン ４．０８ ピルビン酸ナトリウム １１０．０ チミジン ０．７３ 塩化カルシウム二水和物 ０．３mＭ 塩化カリウム ２８５．０ 塩化マグネシウム ７４．６ 塩化ナトリウム ７４００．０ 燐酸二水素カリウム ８３．０ 硫酸銅 ０．００２ 硫酸鉄 ０．４６ 炭酸水素ナトリウム １２００．０ フェノールレッドナトリウム塩 １．２４ 燐酸水素二ナトリウム １５６．２ 硫酸亜鉛七水和物 ０．０３
【００２６】実施例２ 実施例１に準拠して得られたウサギの角膜上皮細胞を
培養プレート(２４ウェル)上に接種し(５０００個細胞
／ウェル)、この接種細胞を前述の培地ＩＩを用いて３
７℃で５日間培養したところ、顕著な増殖効果が認めら
れた(３１,０００個細胞／ウェル)。
【００２７】実施例３ 培地ＩＩの代わりに前述の培地ＩＩＩを使用する以外
は実施例２と同様にして培養をおこなったところ、顕著
な増殖効果がみられた(３２,０００個細胞／ウェル)。
【００２８】実施例４ 新生ラットの表皮から分離した表皮細胞を培地Ｉ'(コ
レラトキシンを２０ng／mlさらに含有し、塩化カルシウ
ムの含有量を０．０７５mＭにする以外は培地Ｉと同様
の組成を有する培地)を用いて培養した後、Ｔ−２５フ
ラスコに接種した(１２５,０００個細胞／フラスコ)。
この接種細胞を培地Ｉ'を用いて３７℃で７日間培養し
たところ、１,４００,０００個の細胞が得られた。
【００２９】比較例４〜５ 接種細胞の培養を、ＭＣＤＢ１５３、ＤＭＥＭまたＦ−
１０を用いておこなう以外は実施例４と同様の操作をお
こなったところ、ＭＣＤＢ１５３を用いた場合には７５
０,０００個の細胞が得られたが、ＤＭＥＭまたはＦ−
１０を用いた場合には、細胞が培養の接種面から剥離
し、増殖は認められなかった。
【００３０】実施例５ 実施例４に準拠して得られたラットの表皮角化細胞を
Ｔ−２５フラスコに１２５,０００個接種した。この接
種細胞を培地Ｉ"(ＢＰＥを含有しない以外は培地Ｉ'と
同様の組成を有する培地)を用いた３７℃で９日間培養
したところ、１,５００,０００個の細胞が得られた。
【００３１】比較例６ 培地Ｉ"の代わりにＭＣＤＢ１５３を使用する以外は
実施例５と同様の培養をおこなったところ、培養の途中
で増殖停止がみられた。
【００３２】実施例６ ヒトの表皮角化細胞を実施例５の手順に準拠して培養
したところ、実施例５と同様の増殖効果が認められた。
【００３３】
【発明の効果】本発明による無血清培地を使用すること
によって、極めて多種多様な動物細胞の培養、特に初代
培養を効果的におこなうことができるが、特に上皮系細
胞の培養において優れた増殖効果を発揮する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西野 豊和 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内 (72)発明者 坂井 史明 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内 (56)参考文献 特表 平３−504330（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．77ＮＯ．６（1980) Ｐ．3455−3459

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 メチオニン８．０〜１４．０mg／l、ス
    レオニン５．０〜１１．５mg／l、チロシン７．０〜１
    １．０mg／l、フェニルアラニン９．０〜１４．５mg／
    l、グルタミン４００．０〜５５０．０mg／l、アスパラ
    ギン酸７．０〜９．５mg／l、リジン塩酸塩１９．０〜
    ２８．０mg／l、セリン３３．０〜４０．０mg／lおよび
    Ｃa ０．１mＭ(塩化カルシウムとして)以下; およびグ
    ルコース、ビタミン、ミネラル、成長因子、ＨＥＰＥＳ
    および前述のアミノ酸以外のアミノ酸から選ばれた一種
    以上の常用成分を含む動物の上皮細胞培養用無血清培
    地。
  2. 【請求項２】 成長因子がインスリン、ハイドロコーチ
    ゾン、表皮成長因子およびウシ脳下垂体抽出物から選ば
    れる請求項１の無血清培地。
  3. 【請求項３】 メチオニン８．０〜１４．０mg／l、ス
    レオニン５．０〜１１．５mg／l、チロシン７．０〜１
    １．０mg／l、フェニルアラニン９．０〜１４．５mg／
    l、グルタミン４００．０〜５５０．０mg／l、アスパラ
    ギン酸７．０〜９．５mg／l、リジン塩酸塩１９．０〜
    ２８．０mg／l、セリン３３．０〜４０．０mg／lおよび
    塩化カルシウム０．１mＭ以下; アラニン、アルギニン
    塩酸塩、アスパラギンＨ2Ｏ、システィン塩酸塩Ｈ2Ｏ、
    グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン塩酸塩Ｈ2Ｏ、イ
    ソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、バ
    リン、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パ
    ントテン酸カルシウム、ピリドキシン塩酸塩、リボフラ
    ビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ12、アデニン、塩化
    コリン、イノシトール、ヒポキサンチン、プテリシン塩
    酸塩、ピルビン酸ナトリウム、チミジン、ＫＣl、ＭgＣ
    l2６Ｈ2Ｏ、ＮaＣl、ＮaＨ2ＰＯ4７Ｈ2Ｏ、ＫＨ2Ｐ
    Ｏ4、ＣuＳＯ4５Ｈ2Ｏ、ＦeＳＯ4７Ｈ2Ｏ、Ｎa2Ｓe
    Ｏ4、ＭnＳＯ4５Ｈ2Ｏ、Ｎa2ＳiＯ3９Ｈ2Ｏ、(ＮＨ4)6
    Ｍo7Ｏ24４Ｈ2Ｏ、ＮＨ4ＶＯ3、ＮiＣl2６Ｈ2Ｏ、ＳnＣ
    l2２Ｈ2Ｏ、ＺnＳＯ4７Ｈ2Ｏ、ＮaＨＣＯ3、グルコー
    ス、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド(Ｎa)、インスリ
    ン、ハイドロコーチゾン、表皮成長因子およびウシ脳下
    垂体抽出物を含む動物の上皮細胞培養用無血清培地。
  4. 【請求項４】 上皮細胞が表皮角化細胞または角膜上皮
    細胞である請求項１記載の無血清培地。
  5. 【請求項５】 メチオニン８．０〜１４．０mg／l、ス
    レオニン５．０〜１１．５mg／l、チロシン７．０〜１
    １．０mg／l、フェニルアラニン９．０〜１４．５mg／
    l、グルタミン４００．０〜５５０．０mg／l、アスパラ
    ギン酸７．０〜９．５mg／l、リジン塩酸塩１９．０〜
    ２８．０mg／l、セリン３３．０〜４０．０mg／lおよび
    Ｃa ０．１mＭ(塩化カルシウムとして)以下; およびグ
    ルコース、ビタミン、ミネラル、成長因子、ＨＥＰＥＳ
    および前述のアミノ酸以外のアミノ酸から選ばれた一種
    以上の成分を含む無血清培地中で角膜上皮細胞を培養す
    ることを特徴とする動物の角膜上皮細胞を培養する方
    法。
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