JPH0788364B2 - A new substance, allosamizoline - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、下記式で示される新規
な化合物及びその塩に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel compound represented by the following formula and a salt thereof.

【０００２】[0002]

【化２】 [Chemical 2]

【０００３】キチンは、虫のクチクラ層の主成分であ
り、虫が脱皮を繰り返しながら成虫となる過程で、キチ
ンの合成と分解とが深く関係していることが知られてい
る。従って、キチンの生合成を阻害する物質、すなわち
キチナーゼ阻害剤は、新しいタイプの昆虫成長調節剤
（ＩＧＲ）となりえ、更には殺虫殺ダニ剤として使用し
うることが期待される。本発明者等は、カイコの中腸か
ら単離、精製されたキチナーゼを用いて、その活性阻害
度を指標としてキチナーゼ阻害物質を検索した結果、あ
る種の放線菌により生産される下記式（Ｉ）の化合物
が、この作用を強く発現することを見出した。Chitin is the main component of the cuticle layer of insects, and it is known that the synthesis and decomposition of chitin are deeply related to the process in which the insects become adults while repeatedly molting. Therefore, it is expected that a substance that inhibits chitin biosynthesis, that is, a chitinase inhibitor, can be a new type of insect growth regulator (IGR) and can be used as an insecticidal acaricide. The present inventors searched for a chitinase inhibitor using the chitinase isolated and purified from the midgut of the silkworm as an index based on its activity inhibition degree. As a result, the following formula (I It was found that the compound of 1) strongly expresses this action.

【０００４】[0004]

【化３】 [Chemical 3]

【０００５】式（Ｉ）の化合物は、ストレプトミセス属
の微生物により生産され、下記の記載のとおり実質的に
純粋な形で単離され、「アロサミジン」（Ａｌｌｏｓａ
ｍｉｄｉｎ）と命名された。アロサミジンを生産する微
生物の菌学的性状は次のとおりである。The compound of formula (I) is produced by a microorganism of the genus Streptomyces and is isolated in a substantially pure form as described below, "alosamidin" (Allosa).
midin). The mycological properties of the microorganisms that produce allosamidin are as follows.

【０００６】１．形態学的特徴 ＩＳＰ〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プ
ロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕規定の培地上、２
８℃、１４日間培養後、顕微鏡下観察では、この菌株の
基生菌糸は分枝して良く伸長し、気菌糸は単純分枝であ
る。胞子鎖の形態は多くのものは直状ないしゆるやかな
曲状を示す。胞子鎖の表面構造は平滑状（Ｓｍｏｏｔ
ｈ）を示す。また、気菌糸の車軸分枝、菌核、基生菌糸
の断裂、胞子のうなどの特殊器官は観察されなかった。1. Morphological Features ISP [International Streptomyces Project (International Strep
tomyces Project)] on the provisions of the medium, 2
After culturing at 8 ° C. for 14 days, when observed under a microscope, the basal hyphae of this strain are branched and well-extended, and the aerial hyphae are simply branched. Most of the spore chains have a straight or gently curved shape. The surface structure of the spore chain is smooth (Smoot
h) is shown. In addition, no special organs such as aerial mycelial axle branching, sclerotium, basal hypha breakage, and sporangium were observed.

【０００７】２．各種培養基上で２８℃、１４日間培養
後の性状は表１に示す通りである。2. The properties after culturing on various culture media at 28 ° C. for 14 days are as shown in Table 1.

【０００８】色調の表示は日本色彩研究所版、“標準色
票”のカラーチップ・ナンバーを表す。The display of the color tone indicates the color chip number of "Standard color chip", Japan Color Research Institute version.

【０００９】[0009]

【表１】 ─────────────────────────────────── 培地の種類 項 目 ＳＡＮＫ６２７８５株の性状 ─────────────────────────────────── シュクロース・ Ｇ 余り良くない、平坦、 硝酸塩寒天 薄黄味橙（２−９−９） ＡＭ 余り良くなくビロード状、 薄黄味橙（３−８−８） Ｒ 薄黄味橙（３−８−８） ＳＰ 産生せず ─────────────────────────────────── グルコース・ Ｇ 非常に良好、平坦、 アスパラギン寒天 薄黄味茶（４−８−９） ＡＭ 良好に形成、ビロード状、 灰色（Ｎ−７） Ｒ 鈍黄味茶（８−７−８） ＳＰ 薄黄味茶（６−８−９） ─────────────────────────────────── グリセリン・ Ｇ 良好、平坦、 アスパラギン寒天 薄黄味茶（６−８−９） （ＩＳＰ５） ＡＭ 良好に形成、ビロード状、 灰色（Ｎ−７） Ｒ 明るい茶（８−６−７） ＳＰ 鈍黄味橙（１０−７−８） ─────────────────────────────────── 澱粉・無機塩寒天 Ｇ 良好、平坦、 （ＩＳＰ４） 薄黄味橙（２−９−９） ＡＭ 良好に形成、ビロード状、 茶味白（１−６−６） Ｒ 薄黄味橙（３−８−８） ＳＰ 産生せず ─────────────────────────────────── チロシン寒天 Ｇ 非常に良好、平坦、 （ＩＳＰ７） 黄味茶（６−６−８） ＡＭ 豊富に形成、ビロード状、 明るい茶味白（１−７−６） Ｒ 灰味赤茶（４−３−６） ＳＰ 明るい茶（８−５−６） ─────────────────────────────────── ペプトン・イースト Ｇ 非常に良好、平坦、 エキス・鉄寒天 薄黄味茶（４−８−９） （ＩＳＰ６） ＡＭ 形成せず Ｒ 黄味茶（６−５−８） ＳＰ 黄味茶（６−５−８） ─────────────────────────────────── 栄養寒天 Ｇ 余り良くなく平坦、 （Ｄｉｆｃｏ） 薄黄味橙（２−９−９） ＡＭ 僅かに形成、白色 Ｒ 薄黄味茶（６−８−９） ＳＰ 産生せず ─────────────────────────────────── イーストエキス・ Ｇ 良好、平坦、 麦芽エキス寒天 薄茶（４−７−７） （ＩＳＰ２） ＡＭ 豊富に形成しビロード状、 茶味白（１−６−６） Ｒ 明るい茶（８−５−７） ＳＰ 鈍橙（８−７−７） ─────────────────────────────────── オートミール寒天 Ｇ 非常に良好、平坦、 （ＩＳＰ３） 薄黄味茶（６−８−９） ＡＭ 豊富に形成しビロード状、 明るい茶味白（１−７−６） Ｒ 茶色（４−４−６） ＳＰ 明るい茶（８−５−６） ─────────────────────────────────── 水寒天 Ｇ 僅かに生育し平坦、 黄味灰（１−９−１０） ＡＭ 僅かに形成し茶味白（１−８−６） Ｒ 茶味白（１−８−６） ＳＰ 産生せず ─────────────────────────────────── ポテトエキス・ Ｇ 僅かに生育し平坦、 ニンジンエキス寒天 黄味灰（１−９−１０） ＡＭ 余り良くなくビロード状、 明るい茶味白（１−７−６） Ｒ 茶味白（１−８−６） ＳＰ 産生せず ─────────────────────────────────── Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素 グリセリン・アスパラギン寒天、チロシン寒天、イース
トエキス・麦芽エキス寒天、オートミール寒天等の培地
に産生された鈍橙、明るい茶や鈍黄味橙等の可溶性色素
は０．０５Ｎ−ＮａＯＨを添加すると、明るい茶や明る
い橙に、また、０．０５Ｎ−ＨＣｌを添加すると、鈍黄
や薄黄味茶に変化する所謂ｐＨ依存性の性質を有する。[Table 1] ─────────────────────────────────── Type of medium Item Properties of SANK62785 strain ── ───────────────────────────────── Sucrose ・ G Not very good, flat, nitrate agar Light yellowish orange ( 2-9-9) AM Not very good, velvety, light yellowish orange (3-8-8) R light yellowish orange (3-8-8) SP not produced ─────────── ───────────────────────── Glucose ・ G Very good, flat, asparagine agar Light yellowish green tea (4-8-9) AM Good formation, Velvety, gray (N-7) R dull yellow tea (8-7-8) SP light yellow tea (6-8-9) ────────────────────── ────────────── Lyserine ・ G Good, flat, asparagine agar Light yellowish tea (6-8-9) (ISP5) AM Good formation, velvety, gray (N-7) R Light brown (8-6-7) SP Light yellowish orange (10-7-8) ─────────────────────────────────── Starch / inorganic salt agar G Good, Flat, (ISP4) Light yellowish orange (2-9-9) AM Well formed, velvety, Brownish white (1-6-6) R Light yellowish orange (3-8-8) SP Not produced ─ ────────────────────────────────── Tyrosine agar G Very good, flat, (ISP7) Yellow tea (6- 6-8) AM richly formed, velvety, light brown white (1-7-6) R gray red tea (4-3-6) SP light brown (8-5-6) ────── ─ ──────────────────────────── Peptone East G Very good, flat, extract / iron agar light yellowish tea (4-8-9) (ISP6) AM not formed R Yellow tea (6-5-8) SP Yellow tea (6-5-8) ────────────────────────── ────────── Nutrient agar G Not so good and flat, (Difco) Light yellowish orange (2-9-9) AM Slightly formed, white R Light yellowish tea (6-8-9) SP production Not ──────────────────────────────────── Yeast extract ・ G good, flat, malt extract agar light brown ( 4-7-7) (ISP2) AM Richly formed and velvety, brownish white (1-6-6) R light brown (8-5-7) SP dull orange (8-7-7) ──── ─── ──────────────────────────── Oatmeal agar G Very good, flat, (ISP3) Light yellowish tea (6-8-9) AM Richly formed and velvety, light brown taste white (1-7-6) R brown (4-4-6) SP light brown (8-5-6) ─────────────── ───────────────────── Water agar G slightly grown and flat, yellowish ash (1-9-10) AM slightly formed brownish white (1- 8-6) R tea white (1-8-6) SP not produced ───────────────────────────────── ─── Potato extract ・ G slightly grown and flat, carrot extract agar yellowish ash (1-9-10) AM not so good velvety, light brownish white (1-7-6) R brownish white (1-8 -6) SP production ─────────────────────────────────── G: Growth, AM: Aerial mycelium, R: Backside, SP : Soluble pigment Glycerin / asparagine agar, tyrosine agar, yeast extract / malt extract agar, oatmeal agar, etc. In addition, it has a so-called pH-dependent property of changing to bright brown or bright orange, and when 0.05N-HCl is added, it changes to dull yellow or light yellowish tea.

【００１０】３．生理学的性質 ＳＡＮＫ６２７８５株の生理学的性質は表２に示す通り
である。3. Physiological properties The physiological properties of the SANK62785 strain are shown in Table 2.

【００１１】[0011]

【表２】 ─────────────────────────────────── 澱粉の水解 陽 性 ゼラチンの液化 陽 性 硝酸塩の還元 陰 性 ミルクの凝固 陰 性 ミルクのペプトン化 陽 性 生育温度範囲（培地１）^* １０〜４０℃ 生育適正温度（培地１）^* １５〜３５℃ 食塩耐性（培地１）^* １０％で生育、１４％では生育せず カゼインの分解 陽 性 チロシンの分解 陽 性 キサンチンの分解 陰 性 メラニン様色素生産性（培地２）^* 陽 性 （培地３）^* 陽 性 （培地４）^* 陰 性 ─────────────────────────────────── ＊：培地１；イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ
２） 培地２；トリプトン・イーストエキス・プロス（ＩＳＰ
１） 培地３；ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ
６） 培地４；チロシン寒天（ＩＳＰ７） また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地を使用して、１
４日間培養後に観察したＳＡＮＫ６２７８５株の炭素源
の資化性は表３に示す通りである。[Table 2] ─────────────────────────────────── Hydrolysis of starch Positive liquefaction of gelatin Positive nitrate Reduction of negative milk Coagulation of negative milk Peptone of negative milk Positive growth temperature range (medium 1) ^* 10-40 ° C Optimal growth temperature (medium 1) ^* 15-35 ° C Salt tolerance (medium 1) ^* Grow at 10% , 14%, no growth in casein Decomposition of positive tyrosine Decomposition of positive tyrosine Negative melanin pigment production (medium 2) ^* positive (medium 3) ^* positive (medium 4) ^* negative ── ───────────────────────────────── *: Medium 1; Yeast extract / malt extract agar (ISP
2) Medium 2; Tryptone yeast extract pros (ISP
1) Medium 3; Peptone / Yeast Extract / Iron Agar (ISP)
6) Medium 4; Tyrosine agar (ISP7) Also, using Pridham Gottlieb agar, 1
Table 3 shows the assimilation ability of the carbon source of the SANK62785 strain observed after culturing for 4 days.

【００１２】[0012]

【表３】 ────────────────────────────── Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フルクトース − Ｌ−アラビノース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−キシロース − シュクロース − イノシトール − ラフィノース ＋ Ｄ−マンニトール − 対 照 − ────────────────────────────── ＋：利用する、−：利用しない ４．菌体成分について ＳＡＮＫ６２７８５株の細胞壁はビー・ベッカーらの方
法〔Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒｅｔ ａｌ．アプライド・マイク
ロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、１２巻、４２１−４２３頁、１９６４年〕に
従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸およびグ
リシンが検出されたことから、細胞壁タイプＩであるこ
とが確認された。またＳＡＮＫ６２７８５株の全細胞中
の糖成分をエム・ピー・レシエバリエの方法〔Ｍ．Ｐ．
Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ、ジャーナル・オブ・ラボラト
リー・アンド・クリニカル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、７１巻、９３４頁、１９６８
年〕に従い検討した結果、特徴的なパターンは認められ
なかった。[Table 3] ─────────────────────────────── D-Glucose + D-Fructose-L-Arabinose + L-Rhamnose- D-xylose-sucrose-inositol-raffinose + D-mannitol-reference-─────────────────────────────── +: Use,-: Not use 4. Regarding the cell components of the cell wall of the SANK62785 strain, the method of B. Becker et al. [B. Becker et al. Applied Microbiology
No.), 12: 421-423, 1964], and was confirmed to be cell wall type I since LL -diaminopimelic acid and glycine were detected. In addition, the sugar component in the whole cells of the SANK62785 strain was analyzed by the method of MP Resievarier [M. P.
Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine (Journa
l of Laboratory & Clinica
Medicine, 71, 934, 1968.
Yearly], no characteristic pattern was observed.

【００１３】以上のことから、本菌株は放線菌の中でも
ストレプトマイセス属に属することが判明したのでスト
レプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．）ＳＡＮＫ６２７８５と命名された。[0013] From the above, since the present strain was found to belong to the genus Streptomyces among actinomycetes Streptomyces sp. (Streptomyces
sp. ) Was named SANK62785.

【００１４】本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、その微生物受託番号は微工研
菌寄第ＦＥＲＭ Ｐ−８４４１号である。This strain has been deposited at the Institute of Microbial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, and the microorganism deposit number is FERM P-8441, Microorganisms Research Institute.

【００１５】なお、ＳＡＮＫ６２７８５株の同定はＩＳ
Ｐ〔ジ・インターナショナル・ストレプトマイセス・プ
ロジェクト（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕基準、バ
ージーズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）第８版、ジ・アクチノミセイテス（Ｔｈ
ｅ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻および放線菌
に関する最近の文献によって行った。The identification of the SANK62785 strain is IS
P [The International Streptomyces Project (The International S
Treptomyces Project] Criteria, Bergey's Manual
l of Determinative Bacter
8th edition, The Actinomycetes (Th
e Actinomycetes) Volume 2 and recent literature on actinomycetes.

【００１６】以上、アロサミジンの生産菌について説明
したが、放線菌の諸性質は一定したものではなく、自然
的、人工的に容易に変化することは周知の通りであり、
本発明で使用しうる菌株はストレプトマイセス属に属
し、アロサミジンを生産する菌株すべてを包含するもの
である。As described above, the allosamidin-producing bacterium has been described, but it is well known that the properties of actinomycetes are not constant and can easily be changed naturally or artificially.
Strains that can be used in the present invention include all strains belonging to the genus Streptomyces and producing allosamidin.

【００１７】アロサミジンを製造するには、ストレプト
ミセス属に属する同物質生産菌、たとえば、ストレプト
ミセス ＳＰ．ＳＡＮＫ６２７８５を適当な培地に培養
し、その培養物から同物質を採取することによりおこな
われる。培養方法は、通常のストレプトミセス属の培養
方法に準じて行なわれ、液体培地による深部培養法が有
利である。培地組成は特に限定はなく、同物質生産菌が
資化しうる栄養源を含有するものであれば、合成培地、
半合成培地、天然培地のいずれをも使用することができ
る。炭素源としては、たとえばグルコース、シュークロ
ース、マルトース、グリセリン、でん粉、液化でん粉等
が用いられ、窒素源としては、たとえば肉エキス、カゼ
イン加水分解物、ペプトン、グルテンミール、コーンミ
ール、棉実粕、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵
母、酵母エキス、尿素、リン酸アンモニウム等が用いら
れる。この他、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素
カリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、硫酸マ
グネシウム等の無機塩も必要に応じて培地に添加され
る。培養中の発泡を抑制するため、必要に応じて高級ア
ルコール、植物油、シリコン化合物等の消泡剤が適宜添
加され、そのうちあるものは炭素源を兼ねることができ
る。培養温度は２７℃前後が適当である。培養容量が増
大するに従って、適宜種培養を行うことにより好結果が
得られることが多い。培養時間は、培養物中のアロサミ
ジン濃度が最高に達するのを目途に適宜選択され、通常
は５０ないし１２０時間程度であるが、培地の濃厚化に
従って、更に延長してもよい。上記の培養条件は、使用
する菌株の特性に従って最適の条件が選択される。この
ように培養物中に蓄積されたアロサミジンは、主として
菌体中に存在する。従って、培養物を遠心分離または濾
過して菌体を分離したのち、抽出、分離、採取、精製等
の常法に従って、菌体からアロサミジンを得ることがで
きる。このような操作としては、たとえば、減圧濃縮、
凍結乾燥、溶媒抽出、液性変換、各種クロマトグラフィ
ー（たとえば、イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂ま
たは活性炭、けい酸、シリカゲル、アルミナ等を使用す
るもの）、結晶化、再結晶等があげられ、このような手
段は、単独もしくは任意の順序に組合せて、場合により
反復しておこなわれる。次に、アロサミジンの製造を実
施例で例示する。To produce allosamidin, a substance-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces, for example, Streptomyces SP. It is carried out by culturing SANK62785 in an appropriate medium and collecting the same substance from the culture. The culturing method is carried out in accordance with the usual culturing method of the genus Streptomyces, and the submerged culturing method using a liquid medium is advantageous. The medium composition is not particularly limited, as long as it contains a nutrient source that can be assimilated by the substance-producing bacterium, a synthetic medium,
Either a semi-synthetic medium or a natural medium can be used. As the carbon source, for example, glucose, sucrose, maltose, glycerin, starch, liquefied starch and the like are used, and as the nitrogen source, for example, meat extract, casein hydrolyzate, peptone, gluten meal, corn meal, cotton meal, Soybean powder, corn steep liquor, dry yeast, yeast extract, urea, ammonium phosphate and the like are used. In addition, inorganic salts such as disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, calcium carbonate and magnesium sulfate are also added to the medium as needed. In order to suppress foaming during culturing, an antifoaming agent such as higher alcohol, vegetable oil, or silicon compound is appropriately added as needed, and some of them can also serve as a carbon source. A suitable culture temperature is around 27 ° C. As the culture volume increases, good results are often obtained by appropriately performing seed culture. The culturing time is appropriately selected with the aim of reaching the maximum concentration of allosamidine in the culture, and is usually about 50 to 120 hours, but it may be further extended according to the concentration of the medium. Optimal conditions are selected as the above-mentioned culture conditions according to the characteristics of the strain to be used. The allosamidine thus accumulated in the culture is mainly present in the cells. Therefore, after the culture is centrifuged or filtered to separate the bacterial cells, allosamidin can be obtained from the bacterial cells by a conventional method such as extraction, separation, collection and purification. Such operations include, for example, vacuum concentration,
Lyophilization, solvent extraction, liquid conversion, various chromatographies (for example, using ion exchange resin, nonionic adsorption resin or activated carbon, silicic acid, silica gel, alumina, etc.), crystallization, recrystallization, etc. Such means may be used alone or in combination in any order, and may be repeated. Next, the production of allosamidin is illustrated in the examples.

【００１８】[0018]

【実施例】【Example】

【００１９】[0019]

【実施例１】グルコース（２０ｇ）、肉エキス（２
ｇ）、ペプトン（４ｇ）、酵母エキス（２ｇ）および水
（２Ｌ）からなる培地を調製し、このものを１Ｌの三角
フラスコ２本に７００ｍｌずつ分注した。このときの培
地のｐＨは７．２だった。１２０℃で２０分間滅菌した
のち、ストレプトミセスｓｐ．ＳＡＮＫ６２７８５株の
斜面培養菌体を１白金耳ずつ接種し、２８℃で３日間振
とう培養した。一方、上記組成の培地を１００Ｌ容タン
クに５０Ｌ注入し、１２０℃で３０分間滅菌した。これ
に、上記の培養物のうち１Ｌを加えて、２６−２７℃で
２４時間培養した。更に、上記と同一組成の培地３００
Ｌを、６００Ｌ容タンクに注入し、１２０℃で３０分間
滅菌したのち、上記の培養物のうち６Ｌを加えて、２６
−２７℃で１１０時間培養した。菌体が灰色から褐色に
変化する時点を培養の終点とした。このようにして得ら
れた培養物からのアロサミジンの単離および精製は次の
ようにしておこなわれた。Example 1 Glucose (20 g), meat extract (2
A medium consisting of g), peptone (4 g), yeast extract (2 g) and water (2 L) was prepared, and this was dispensed into two 1 L Erlenmeyer flasks by 700 ml each. The pH of the medium at this time was 7.2. After sterilizing at 120 ° C. for 20 minutes, Streptomyces sp. Slope culture cells of the SANK62785 strain were inoculated with 1 platinum loop each and cultured with shaking at 28 ° C for 3 days. On the other hand, 50 L of the medium having the above composition was poured into a 100 L tank and sterilized at 120 ° C. for 30 minutes. To this, 1 L of the above culture was added and cultured at 26-27 ° C. for 24 hours. Further, a medium 300 having the same composition as the above
L was poured into a 600 L tank and sterilized at 120 ° C. for 30 minutes, then 6 L of the above culture was added to give 26
It was cultured at -27 ° C for 110 hours. The time when the cells changed from gray to brown was the end point of the culture. Isolation and purification of allosamidin from the culture thus obtained was performed as follows.

【００２０】（１）培養液３００Ｌ（ｐＨ７．２８）を
セライトを用いて濾過し、菌体３０ｋｇと濾液２７０Ｌ
を得た。(1) 300 L of the culture broth (pH 7.28) was filtered through Celite to obtain 30 kg of cells and 270 L of filtrate.
Got

【００２１】菌体を先ずメタノール７０Ｌ、ついで８０
％メタノール６０Ｌで抽出し、抽出液を合せて、減圧濃
縮し液量を１５Ｌとした。The cells were first treated with 70 L of methanol and then 80
Extraction with 60 L of% methanol, the extracts were combined and concentrated under reduced pressure to a volume of 15 L.

【００２２】（２）上記のメタノール抽出液の全量を活
性炭カラム（径７ｃｍ、長さ４０ｃｍ、和光純薬製クロ
マトグラフ用活性炭３６０ｇ）に吸着させ、蒸溜水４．
５Ｌで洗ったのち、下記の５種類の溶媒を用いて、順次
段階溶出を行った。(2) The whole amount of the above methanol extract was adsorbed on an activated carbon column (diameter 7 cm, length 40 cm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. chromatograph activated carbon 360 g), and distilled water 4.
After washing with 5 L, stepwise elution was carried out using the following 5 kinds of solvents.

【００２３】 １０％エタノール ７．５Ｌ ２５％エタノール ７．５Ｌ ５０％エタノール ７．５Ｌ 酢酸でｐＨ３．５に調整したエタノール ７．５Ｌ ８０％エタノール ７．５Ｌ 活性はに３／４が、に１／８が、そしてに１／１
６がそれぞれ回収された。従って、以後の精製はの溶
出区について行なわれた。10% ethanol 7.5 L 25% ethanol 7.5 L 50% ethanol 7.5 L Ethanol adjusted to pH 3.5 with acetic acid 7.5 L 80% ethanol 7.5 L The activity is 3/4 and 1 /. 8 and then 1/1
6 were each recovered. Therefore, the subsequent purification was performed on the elution zone.

【００２４】（３）５０％エタノール溶出区７．５Ｌを
減圧下３．９Ｌに濃縮した。この時のｐＨは７．１２で
あった。濃縮液をＤｏｗｅｘ５０カラム（径８．４ｃ
ｍ、長さ９ｃｍ、ＨＣＲＷ２、Ｈ⁺ 型、２０〜５０メッ
シュ）に吸着させ、蒸溜水１．５Ｌで洗った。ついで、
１Ｍ酢酸アンモニウム水３Ｌ、さらに１Ｍ食塩水２．５
Ｌで順次溶出させたところ、活性は前者に１／２、後者
に１／８回収された。従って、以後の精製は１Ｍ酢酸ア
ンモニウム水溶出区について行なわれた。(3) 7.5 L of 50% ethanol eluate was concentrated to 3.9 L under reduced pressure. The pH at this time was 7.12. Concentrate the solution into a Dowex 50 column (diameter 8.4c
m, length 9 cm, HCRW2, H ⁺ type, 20 to 50 mesh), and washed with 1.5 L of distilled water. Then,
1M ammonium acetate water 3L, 1M saline solution 2.5
When eluted sequentially with L, the activity was recovered in 1/2 for the former and 1/8 for the latter. Therefore, the subsequent purification was performed on the 1M ammonium acetate water elution zone.

【００２５】（４）１Ｍ酢酸アンモニウム水溶出区３Ｌ
（ｐＨ４．８３）を活性炭カラム（径２．８ｃｍ、長さ
１９ｃｍ、活性炭２０ｇ）に吸着させ、蒸溜水３００ｍ
ｌで洗った。ついで、５０％エタノール１Ｌで溶出を行
なった。(4) 3 L of 1 M ammonium acetate water elution zone
(PH4.83) was adsorbed on an activated carbon column (diameter 2.8 cm, length 19 cm, activated carbon 20 g), and distilled water was 300 m.
washed with l. Then, elution was carried out with 1 L of 50% ethanol.

【００２６】（５）５０％エタノール溶出区１Ｌを６０
０ｍｌに濃縮した。この時のｐＨは４．０４であった。(5) 60 of 1 L of 50% ethanol elution zone
Concentrated to 0 ml. The pH at this time was 4.04.

【００２７】蒸溜水を加えて液量を１．５Ｌとし、酢酸
を加えてｐＨを３．９に調整した。あらかじめ５０ｍＭ
酢酸アンモニウム／酢酸（ｐＨ５．０）で平衡化したＳ
Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５カラム（径２．８ｃ
ｍ、長さ３０ｃｍ、２５ｇ）に上記の液を吸着させ、５
０ｍＭ酢酸アンモニウム／酢酸（ｐＨ５．０）で一段階
溶出を行い、１１ｍｌずつ分画した。フラクション４５
〜６５について、弱陽イオン交換樹脂カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、予備実
験で得られていた２種の活性物質（主成分および副成
分）の溶出状況を分析した。Distilled water was added to adjust the liquid volume to 1.5 L, and acetic acid was added to adjust the pH to 3.9. 50 mM in advance
S equilibrated with ammonium acetate / acetic acid (pH 5.0)
P-Sephadex C-25 column (diameter 2.8c
m, length 30 cm, 25 g) to adsorb the above liquid, and
One-step elution was carried out with 0 mM ammonium acetate / acetic acid (pH 5.0), and 11 ml fractions were fractionated. Fraction 45
About -65, the elution status of the two types of active substances (main component and subcomponent) obtained in the preliminary experiment was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using a weak cation exchange resin column.

【００２８】ＨＰＬＣ分析の結果を基に、以下の４区分
をプールし、それぞれ凍結乾燥した。Based on the results of the HPLC analysis, the following 4 sections were pooled and lyophilized.

【００２９】 フラクションＮｏ． 収量（ｍｇ） ４９−５３ ７０ ５４−５６ ９６ ５７−５９ ８８ ６０−６４ ２８ なお、ＨＰＬＣを行うにあたり、ＯＤＳなどの通常の逆
相系のカラムでは活性の回収が極めて悪く、その使用が
不適当であった。上記の各区分のうち、Ｎｏ．４９−５
６から得られた物質は、ＨＰＬＣ上で単一のピークを与
え、下記の物理化学的諸性状から、式（Ｉ）で表わされ
るアロサミジンであることが確認された。Fraction No. Yield (mg) 49-53 70 54-56 96 57-59 88 60-64 28 When performing HPLC, the recovery of the activity is extremely poor in a usual reversed-phase column such as ODS, and its use is inappropriate. Met. Of the above categories, No. 49-5
The substance obtained from No. 6 gave a single peak on HPLC, and was confirmed to be allosamidine represented by the formula (I) from the following physicochemical properties.

【００３０】（１）外観：白色粉末 （２）融点：２２８℃（分解） （３）〔α〕_D ：−２４．８°（ｃ＝０．５，０．１Ｍ
酢酸） （４）分子式：Ｃ₂₅Ｈ₄₂Ｎ₄ Ｏ₁₄ （５）ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ ６２３（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，グリ
セロール・マトリックス （６）赤外線吸収スペクトル（ヌジョール，ｍａｘ，ｃ
ｍ^-1）：3500，3350，3300，1640〜1660，1560 （７）紫外線吸収スペクトル：末端吸収（２２０ｎｍ） （８）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，Ｄ₂ Ｏ
＋ＣＤ₃ ＣＯ₂ Ｄ，ＷＥＦＴ法によりＨＯＤのピークを
消去） 炭素Ｎｏ． １ 5.45(dd,J=5,9) ２ 4.45(dd,J=4,9) ３ 4.35(dd,J=4,5) ４ 3.94(dd,J=5,7) ５ 2.60(m,J=5,5,7,7) ６ 3.74(dd,J=7,12),3.88(dd,J=5,12) ８ 3.14(s) ９ 3.14(s) １′ 4.84(d,J=9) ２′ 3.91(dd,J=3,9) ３′ 4.41(t,J=3) ４′ 3.79(dd,J=3,10) ５′ 3.84(ddd,J=2,5,10) ６′ 3.80(dd,J=5,12),3.93(dd,J=2,12) NCOCH₃ 2.14(s) ^* １″ 4.86(d,J=9) ２″ 3.95(dd,J=3,9) ３″ 4.12(t,J=3) ４″ ３．７５（ｄｄ，Ｊ＝３，１０） ５″ ３．９６（ｄｄｄ，Ｊ＝２，７，１０） ６″ 3.69(dd,J=7,12),3.87(dd,J=2,12) NCOCH₃ 2.12^* ＊２個のＣＨ₃ は完全にはアサインされていない。(1) Appearance: White powder (2) Melting point: 228 ° C. (decomposition) (3) [α] _D : −24.8 ° (c = 0.5, 0.1M
Acetic acid) (4) Molecular formula: C ₂₅ H ₄₂ N ₄ O ₁₄ (5) FABMS: m / z 623 (M + H) ⁺ , glycerol matrix (6) Infrared absorption spectrum (nujol, max, c)
m ⁻¹ ): 3500, 3350, 3300, 1640 to 1660, 1560 (7) Ultraviolet absorption spectrum: terminal absorption (220 nm) (8) 1H-NMR spectrum (500 MHz, D ₂ O)
+ CD ₃ CO ₂ D, HOD peak is erased by WEFT method) Carbon No. 1 5.45 (dd, J = 5,9) 2 4.45 (dd, J = 4,9) 3 4.35 (dd, J = 4,5) 4 3.94 (dd, J = 5,7) 5 2.60 (m, J = 5,5,7,7) 6 3.74 (dd, J = 7,12), 3.88 (dd, J = 5,12) 8 3.14 (s) 9 3.14 (s) 1 '4.84 (d, J = 9 ) 2'3.91 (dd, J = 3,9) 3'4.41 (t, J = 3) 4'3.79 (dd, J = 3,10) 5'3.84 (ddd, J = 2,5,10) 6 ′ 3.80 (dd, J = 5,12), 3.93 (dd, J = 2,12) NCOC H ₃ 2.14 (s) ^* 1 ″ 4.86 (d, J = 9) 2 ″ 3.95 (dd, J = 3, 9) 3 ″ 4.12 (t, J = 3) 4 ″ 3.75 (dd, J = 3,10) 5 ″ 3.96 (ddd, J = 2,7,10) 6 ″ 3.69 (dd, J = 7,12), 3.87 (dd, J = 2,12) NCOC H ₃ 2.12 ^* * 2 CH ₃ are not completely assigned.

【００３１】上記のようにして製造された、式（Ｉ）の
アロサミジンは、強力なキチナーゼ阻害活性を有してお
り、たとえば蝋化後２〜３日目のカイコ消化管から分離
したエンド型キチナーゼを５０％阻害する濃度（Ｉ
Ｄ₅₀）は０．３５〜０．３８μＭであった。アロサミジ
ンは、殺虫殺ダニ作用をも有しており、農薬として使用
されうる。The allosamidine of the formula (I) produced as described above has a strong chitinase inhibitory activity, and for example, endo-type chitinase isolated from the silkworm digestive tract 2-3 days after waxing. The concentration (I
D ₅₀₎ of 0.35～0.38MyuM. Allosamidin also has an insecticidal and acaricidal action, and can be used as a pesticide.

【００３２】アロサミジンを殺虫殺ダニ剤として使用す
るには、通常の農薬としての剤型、たとえば粉剤、水和
剤、乳剤、液剤等に調製して、適宜希釈してこれを用い
る。希釈剤等の補助剤としては、たとえば、クレー、タ
ルク、カオリン、けいそう土、ベントナイト等の固形担
体、水、キシレン、アルコール類、ジメチルホルムアミ
ド等の溶媒、種々の界面活性剤、保護コロイド剤等があ
げられる。In order to use allosamidin as an insecticidal and acaricide, it is prepared in a usual pesticide form, for example, powder, wettable powder, emulsion, liquid, etc., and appropriately diluted and used. Examples of auxiliary agents such as diluents include solid carriers such as clay, talc, kaolin, diatomaceous earth and bentonite, solvents such as water, xylene, alcohols, dimethylformamide, various surfactants, protective colloid agents and the like. Can be given.

【００３３】場合によっては、このように調製された殺
虫殺ダニ剤を、他の殺虫・殺ダニ性の化合物と配合する
ことにより効力を増強し、相乗効果を期待することもで
きるし、省力化のため、殺菌剤等の他の農薬主剤と配合
することもできる。In some cases, the insecticidal and acaricidal agent thus prepared is mixed with other insecticidal and acaricidal compounds to enhance the efficacy and expect a synergistic effect, and labor saving. Therefore, it can be blended with other main agricultural chemicals such as fungicides.

【００３４】アロサミジンを殺虫殺ダニの目的で散布剤
として使用するときは、通常は上記のように製剤された
ものを粉剤の場合はそのままで、水和剤、乳剤、液剤等
の場合は、水で希釈して、アロサミジン濃度が１０〜１
０００ｐｐｍ、好ましくは２０〜５００ｐｐｍの濃度に
調整して散布する。When allosamidine is used as a spray for the purpose of insecticidal and acaricidal treatment, the above-prepared product is usually used as it is in the case of powder, and water is used in the case of wettable powder, emulsion, liquid and the like. Diluted with, the concentration of alosamidine is 10-1
The concentration is adjusted to 000 ppm, preferably 20 to 500 ppm and sprayed.

【００３５】次に、アロサミジンを有効成分として含有
する殺虫殺ダニ剤の製剤例を例示する。Next, formulation examples of insecticides and acaricides containing allosamidin as an active ingredient will be exemplified.

【００３６】[0036]

【実施例２】アロサミジン２部、クレーとタルクの混合
物９８部を混合粉砕して粉剤が製造される。Example 2 2 parts of allosamidin and 98 parts of a mixture of clay and talc are mixed and pulverized to produce a powder.

【００３７】[0037]

【実施例３】アロサミジン２０部、アルキルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム塩３部、ポリビニルアルコール１部
およびクレー７６部を混合粉砕して水和剤が製造され
る。Example 3 20 parts of allosamidin, 3 parts of alkylbenzenesulfonic acid sodium salt, 1 part of polyvinyl alcohol and 76 parts of clay are mixed and ground to prepare a wettable powder.

【００３８】アロサミジンは、前述のとおり殺虫殺ダニ
活性を有しており、ナミハダニに対する活性を試験例に
よって説明する。As mentioned above, allosamidin has an insecticidal and acaricidal activity, and its activity against spider mites will be described with reference to test examples.

【００３９】[0039]

【実施例４】ササゲの初生葉にナミハダニ雌成虫を１区
あたり約３０頭接種し、２５℃の定温室中で１日保存し
た。所定濃度に希釈され、展着剤（新グラミン、三共株
式会社製）を０．０１％加用した薬液を、みずほ式回転
散布塔で、ダニの生育したササゲ葉に均一に散布した。
処理後、ササゲ葉は２５℃の定温室に保存され、処理か
ら１日後および３日後に生死を調査した。この結果を表
４に示す。[Example 4] About 30 adult females of the genus Acarina were inoculated into the primary leaves of cowpeas, and stored in a constant temperature room at 25 ° C for 1 day. A drug solution diluted to a predetermined concentration and containing 0.01% of a spreading agent (Shin-Gramine, manufactured by Sankyo Co., Ltd.) was uniformly sprayed on cowpea leaves on which mites had grown, using a Mizuho rotary spraying tower.
After the treatment, the cowpea leaves were stored in a constant temperature room at 25 ° C., and the viability was examined 1 day and 3 days after the treatment. The results are shown in Table 4.

【００４０】[0040]

【表４】 なお、アロサミジンを適当な条件下、たとえば４Ｎ塩酸
中１００℃で４時間程度加水分解に付することにより、
下記式を有する化合物アロサミゾリン（Ａｌｌｏｓａｍ
ｉｚｏｌｉｎｅ）が得られ、このものも昆虫成長調節剤
の合成原料として有用である。[Table 4] By subjecting allosamidin to hydrolysis under appropriate conditions, for example, in 4N hydrochloric acid at 100 ° C. for about 4 hours,
A compound having the formula: Allosamizolin
Izoline), which is also useful as a synthetic raw material for insect growth regulators.

【００４１】[0041]

【化４】 [Chemical 4]

【００４２】[0042]

【実施例５】アロサミゾリン塩酸塩 アロサミジン（23mg）の4N塩酸（5.75ml）溶液を封管中
に入れ、100 ℃で４時間加熱した。反応液を濃縮、凍結
乾燥し、得られた固体残渣を0.3N塩酸（0.5ml）に溶か
してダウエックス(Dowex) −50（H⁺型、200-400 メッシ
ュ）のカラム（1 ×23cm）に通じた。0.3N塩酸によって
カラムの溶出を行うと、D-アロサミン塩酸塩とアロサミ
ゾリン塩酸塩がこの順に分離・溶出された。溶出液分画
の一部を中和し、Nova-PAK C18 60 Å OD 210 カラム
（waters社製）を用いたHPLC（10%Pic B8-アセトニトリ
ル、流速5ml/l ）にかけ、アロサミゾリンを検出（保持
時間：5.3-5.6 分）した。アロサミゾリン塩酸塩を含有
する分画を集めて凍結乾燥し、吸湿性粉末としてアロサ
ミゾリン塩酸塩（7.5mg ）を得た。[Example 5] A solution of allosamizolin hydrochloride allosamidine (23 mg) in 4N hydrochloric acid (5.75 ml) was placed in a sealed tube and heated at 100 ° C for 4 hours. The reaction mixture was concentrated and freeze-dried, and the resulting solid residue was dissolved in 0.3N hydrochloric acid (0.5 ml) and applied to a Dowex-50 (H ⁺ type, 200-400 mesh) column (1 × 23 cm). got through. When the column was eluted with 0.3N hydrochloric acid, D-allosamine hydrochloride and allosamizolin hydrochloride were separated and eluted in this order. Part of the eluate fraction was neutralized and subjected to HPLC (10% Pic B8-acetonitrile, flow rate 5 ml / l) using a Nova-PAK C18 60 Å OD 210 column (waters) to detect (retain) allosamizoline. Time: 5.3-5.6 minutes). Fractions containing alosamizoline hydrochloride were collected and lyophilized to give arosamizoline hydrochloride (7.5 mg) as a hygroscopic powder.

【００４３】比旋光度：［α］_D ²² −22.2°（C=0.5、H₂
O ） FABMS (m/z) ：217 (M＋H)^{+ 1} HNMR (D₂O、 100 MHz)δppm ： 2.43 (1H, m, J=5, 5, 7 and 8 Hz) 3.08 (3H, s) 3.11 (3H, s) 3.72 (1H, dd, J=7 and 12 Hz) 3.83 (1H, dd, J=7 and 8 Hz) 3.92 (1H, dd, J=5 and 12 Hz) 4.14 (1H, dd, J=4 and 7 Hz) 4.34 (1H, dd, J=4 and 9 Hz) 5.37 (1H, dd, J=5 and 9 Hz)¹³ C NMR (D₂O、 25 MHz) δppm ： 37.9 ( q ) 38.1 ( q ) 51.9 ( d ) 59.9 ( t ) 64.2 ( d ) 75.4 ( d ) 82.2 ( d ) 87.2 ( d ) 161.2 ( s )Specific rotation: [α] _D ²² −22.2 ° (C = 0.5, H ₂
O) FABMS (m / z): 217 (M + H) ^{+ 1} HNMR (D ₂ O, 100 MHz) δppm: 2.43 (1H, m, J = 5, 5, 7 and 8 Hz) 3.08 (3H, s) 3.11 (3H, s) 3.72 (1H, dd, J = 7 and 12 Hz) 3.83 (1H, dd, J = 7 and 8 Hz) 3.92 (1H, dd, J = 5 and 12 Hz) 4.14 (1H, dd, J = 4 and 7 Hz) 4.34 (1H, dd, J = 4 and 9 Hz) 5.37 (1H, dd, J = 5 and 9 Hz) ¹³ C NMR (D ₂ O, 25 MHz) δppm: 37.9 (q) 38.1 (q) 51.9 (d) 59.9 (t) 64.2 (d) 75.4 (d) 82.2 (d) 87.2 (d) 161.2 (s)

【００４４】[0044]

【実施例６】アロサミゾリン アロサミジン１０ｇを水１８０ｍｌに溶かして塩酸でｐ
Ｈ２とした。更に最終濃度０．５規定となるように塩酸
を加えてオイルバス中にて１００℃、４．５時間加水分
解を行なった。ＨＰＬＣ（Waters Nova-Pak C18 60Å O
D 210 溶媒１０％アセトニトリル−Pic B8 ５ｍｌ／
ｌ）を用いてアロサミジンを測定したところアロサミジ
ンのピークは完全に消失し、新たにアロサミゾリンのピ
ークの出現が認められた。これに水酸化ナトリウムを加
えてｐＨ８に調整した。アシライザー（旭化成製）にて
脱塩後、H⁺型のＤｏｗｅｘ５０カラム（カラムサイズ：
アロサミゾリン１ｇに対して１７ｍｌ）にチャージし、
水洗後０．５Ｎアンモニアで溶出した。このうち、ＨＰ
ＬＣ（Waters Nova-Pak C18 60Å OD 210 溶媒１０％ア
セトニトリル−Pic B8 ５ｍｌ／ｌ）でアロサミゾリン
のピークが見られた画分を回収し、濃縮してアンモニア
を除去した。次にこれをアンモニア型のＣＧ−５０カラ
ム（カラムサイズ：アロサミゾリン１ｇに対し２００ｍ
ｌ）にチャージして水洗した。通過、水洗液を分画し、
アロサミゾリンのみを含む画分を集めた。凍結乾燥後、
２．５６ｇのアロサミゾリンを得た。Example 6 10 g of allosamizolin allosamidin was dissolved in 180 ml of water, and p was added with hydrochloric acid.
H2. Further, hydrochloric acid was added so that the final concentration was 0.5 N, and hydrolysis was carried out at 100 ° C. for 4.5 hours in an oil bath. HPLC (Waters Nova-Pak C18 60Å O
D 210 solvent 10% acetonitrile-Pic B8 5 ml /
When allosamidin was measured using l), the peak of allosamidin disappeared completely, and the appearance of a new peak of alosamizoline was observed. Sodium hydroxide was added to this to adjust the pH to 8. After desalting with an acylizer (Asahi Kasei), H ⁺ type Dowex 50 column (column size:
Charge 1 g of allosamizoline to 17 ml),
After washing with water, it was eluted with 0.5N ammonia. Of these, HP
The fraction in which the peak of allosamisorin was observed by LC (Waters Nova-Pak C18 60Å OD 210 solvent 10% acetonitrile-Pic B8 5 ml / l) was collected and concentrated to remove ammonia. Next, this was applied to an ammonia type CG-50 column (column size: 200 m for 1 g of allosamizolin).
It was charged with l) and washed with water. Passage, fractionate the washing solution,
Fractions containing only allosamizoline were collected. After lyophilization,
2.56 g of allosamizoline was obtained.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記式で表わされる化合物及びその塩。 【化１】 1. A compound represented by the following formula and a salt thereof. [Chemical 1]