JPH078298A - アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法および該測定用試薬キット - Google Patents
アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法および該測定用試薬キットInfo
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- JPH078298A JPH078298A JP5157001A JP15700193A JPH078298A JP H078298 A JPH078298 A JP H078298A JP 5157001 A JP5157001 A JP 5157001A JP 15700193 A JP15700193 A JP 15700193A JP H078298 A JPH078298 A JP H078298A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来のアンチトロンビンIII活性測定方法に
おいて、試料の希釈を必要とせず、ヘパリンコファクタ
ーIIの影響を回避できる改良法を提供する。 【構成】 ヘパリンと塩の存在下でアンチトロンビンII
Iとトロンビンとの反応を起こさせる場合に、従来０.２
Ｍの濃度で存在させていた塩を０.２〜０.９Ｍの濃度で
存在させる。
おいて、試料の希釈を必要とせず、ヘパリンコファクタ
ーIIの影響を回避できる改良法を提供する。 【構成】 ヘパリンと塩の存在下でアンチトロンビンII
Iとトロンビンとの反応を起こさせる場合に、従来０.２
Ｍの濃度で存在させていた塩を０.２〜０.９Ｍの濃度で
存在させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、体液中のアンチトロン
ビンIII（以下、ＡＴIIIと略する）の活性を測定する方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヘパリンおよ
び塩の存在下で試料とトロンビンとを反応させた後、色
原性基質を用いる呈色により残存トロンビン活性を測定
することよりなる体液中のＡＴIII活性測定方法の改良
された方法に関する。また、本発明は、該ＡＴIII活性
測定方法で用いる試薬キットに関する。
ビンIII（以下、ＡＴIIIと略する）の活性を測定する方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヘパリンおよ
び塩の存在下で試料とトロンビンとを反応させた後、色
原性基質を用いる呈色により残存トロンビン活性を測定
することよりなる体液中のＡＴIII活性測定方法の改良
された方法に関する。また、本発明は、該ＡＴIII活性
測定方法で用いる試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】ＡＴIIIは血液中に多量(２０
−３０mg／dl)に存在するセリンプロテアーゼ阻害物質
であり、血液凝固の阻害因子として知られている。血液
凝固は多くのプロテアーゼのカスケード様作用による増
幅反応によって起こる。血液凝固の最終段階では生成さ
れたトロンビンがフィブリノゲンをフィブリンとし、ま
た、トロンビンが凝固第ＸIII因子を活性化し、活性化
された第ＸIII因子がフィブリン間にクロスリンクを形
成させ、血栓を形成する。この血栓形成の最も重要な調
節剤はＡＴIIIであり、ＡＴIIIはトロンビンおよび凝固
第Ｘ因子等の凝固に関するプロテアーゼと結合し、それ
らを阻害する。血液中のＡＴIIIが低下すると血栓傾向
を示すので、その低下が問題とされる。ＡＴIIIが低下
する例としては低栄養状態、重症の肝臓病、汎発性血管
内凝固(ＤＩＣ)や急性血栓症等の凝固亢進状態、ネフロ
ーゼ症候群や先天性ＡＴIII欠乏症や異常症が知られて
いる。従って、ＡＴIIIは臨床診断学における重要な指
標である。
−３０mg／dl)に存在するセリンプロテアーゼ阻害物質
であり、血液凝固の阻害因子として知られている。血液
凝固は多くのプロテアーゼのカスケード様作用による増
幅反応によって起こる。血液凝固の最終段階では生成さ
れたトロンビンがフィブリノゲンをフィブリンとし、ま
た、トロンビンが凝固第ＸIII因子を活性化し、活性化
された第ＸIII因子がフィブリン間にクロスリンクを形
成させ、血栓を形成する。この血栓形成の最も重要な調
節剤はＡＴIIIであり、ＡＴIIIはトロンビンおよび凝固
第Ｘ因子等の凝固に関するプロテアーゼと結合し、それ
らを阻害する。血液中のＡＴIIIが低下すると血栓傾向
を示すので、その低下が問題とされる。ＡＴIIIが低下
する例としては低栄養状態、重症の肝臓病、汎発性血管
内凝固(ＤＩＣ)や急性血栓症等の凝固亢進状態、ネフロ
ーゼ症候群や先天性ＡＴIII欠乏症や異常症が知られて
いる。従って、ＡＴIIIは臨床診断学における重要な指
標である。
【０００３】ＡＴIIIの測定方法としては、既に、抗原
量測定としての免疫学的方法、活性測定法として、フィ
ブリノゲンまたは色原性基質を用いる方法やＡＴIII除
去・外因系凝固因子含有血漿を用いる方法が公知であ
る。我々が発明したＡＴIII除去・外因系凝固因子含有
血漿を用いる方法(ＰＣＴ／ＪＰ８９／００１７３、ト
ロンボシス・リサーチ(ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳ
ＥＡＲＣＨ)Ｖol５７、７２９−７３６頁(１９９０))は
ヘパリンコファクターII（以下、ＨＣIIと略する）の影
響を殆ど受けることのない凝固時間法で、簡便に、且つ
正確にＡＴIIIを測定する方法であるが、凝固時間法で
あるため、一般的な自動分析機に適応しがたい。現在、
自動分析機器に適応し易い理由により色原性基質を用い
る方法が多く利用されている。
量測定としての免疫学的方法、活性測定法として、フィ
ブリノゲンまたは色原性基質を用いる方法やＡＴIII除
去・外因系凝固因子含有血漿を用いる方法が公知であ
る。我々が発明したＡＴIII除去・外因系凝固因子含有
血漿を用いる方法(ＰＣＴ／ＪＰ８９／００１７３、ト
ロンボシス・リサーチ(ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳ
ＥＡＲＣＨ)Ｖol５７、７２９−７３６頁(１９９０))は
ヘパリンコファクターII（以下、ＨＣIIと略する）の影
響を殆ど受けることのない凝固時間法で、簡便に、且つ
正確にＡＴIIIを測定する方法であるが、凝固時間法で
あるため、一般的な自動分析機に適応しがたい。現在、
自動分析機器に適応し易い理由により色原性基質を用い
る方法が多く利用されている。
【０００４】色原性基質を用いる方法は、試料に過剰の
トロンビンを添加し、試料中のＡＴIIIとトロンビンと
をヘパリンおよび塩の存在下で反応させた後、色原性基
質を添加し、残ったトロンビン活性を生成される色の測
定により求め、間接的に、試料中のＡＴIII活性を測定
する方法である。このＡＴIII測定方法は、例えば、臨
床病理、特集第７０号、１７３−１７７頁(１９８７),
ユー・アビルドガールドら、トロンボシス・リサーチ
(Ｕ．Ａbildgaard et al．,ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ
ＲＥＳＥＡＲＣＨ)、Ｖol．１１、５４９−５５３頁(１
９７７)等に記載されている。
トロンビンを添加し、試料中のＡＴIIIとトロンビンと
をヘパリンおよび塩の存在下で反応させた後、色原性基
質を添加し、残ったトロンビン活性を生成される色の測
定により求め、間接的に、試料中のＡＴIII活性を測定
する方法である。このＡＴIII測定方法は、例えば、臨
床病理、特集第７０号、１７３−１７７頁(１９８７),
ユー・アビルドガールドら、トロンボシス・リサーチ
(Ｕ．Ａbildgaard et al．,ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ
ＲＥＳＥＡＲＣＨ)、Ｖol．１１、５４９−５５３頁(１
９７７)等に記載されている。
【０００５】この色原性基質を用いるＡＴIII測定方法
においては、二つの大きな課題がある。その一つの課題
は、試料の希釈についてである。試料は、一般に、その
固有色や濁りの測定時の影響を避けるために希釈される
必要がある。また、試料中のＡＴIII含量が多いため
に、試料を希釈しないで用いようとすると、ＡＴIIIよ
り過剰のトロンビンを必要とするため非常に多くのトロ
ンビンを添加しなくてはならない。その場合、検量線を
作成する上で必要とされるＡＴIII活性０％は添加した
トロンビン活性そのものであるので、色原性基質より遊
離される色は非常に短時間のうちに吸光度オーバーに達
してしまう。余りに短時間、例えば、１分以内に、吸光
度として２.０を超えてしまうのは、多くの自動分析機
に適応させる場合に、好ましくはない。また、試料の固
有色や濁りの測定時の影響は速度分析を行う事により回
避できるが、短時間に、吸光度オーバーに達するという
問題は残る。試料希釈を行うことは、日常検査として
は、非常に不便である。この問題解決のため、変性剤ま
たはテトラペプチドＧly−Ｐro−Ａrg−Ｐroの存在下
で、基質として、トロンビンに対する感度がＴos−Ｇly
−Ｐro−Ａrg−pＮＡと比べ１／５−１／１００低いオ
リゴペプチド基質を使用することが提案されている。
(特開平３−５３８９８)。
においては、二つの大きな課題がある。その一つの課題
は、試料の希釈についてである。試料は、一般に、その
固有色や濁りの測定時の影響を避けるために希釈される
必要がある。また、試料中のＡＴIII含量が多いため
に、試料を希釈しないで用いようとすると、ＡＴIIIよ
り過剰のトロンビンを必要とするため非常に多くのトロ
ンビンを添加しなくてはならない。その場合、検量線を
作成する上で必要とされるＡＴIII活性０％は添加した
トロンビン活性そのものであるので、色原性基質より遊
離される色は非常に短時間のうちに吸光度オーバーに達
してしまう。余りに短時間、例えば、１分以内に、吸光
度として２.０を超えてしまうのは、多くの自動分析機
に適応させる場合に、好ましくはない。また、試料の固
有色や濁りの測定時の影響は速度分析を行う事により回
避できるが、短時間に、吸光度オーバーに達するという
問題は残る。試料希釈を行うことは、日常検査として
は、非常に不便である。この問題解決のため、変性剤ま
たはテトラペプチドＧly−Ｐro−Ａrg−Ｐroの存在下
で、基質として、トロンビンに対する感度がＴos−Ｇly
−Ｐro−Ａrg−pＮＡと比べ１／５−１／１００低いオ
リゴペプチド基質を使用することが提案されている。
(特開平３−５３８９８)。
【０００６】もう１つの課題は、ＡＴIII測定はＨＣII
の影響を受けるのでそれを回避することである。ＨＣII
は正常血漿中約９mg／dlで存在し、ＡＴIIIの約１／３
である。ＨＣIIはＡＴIIIと同様にトロンビンを阻害す
るが、ＡＴIIIとは異なり他の凝固因子を阻害しない。
ＨＣIIはＡＴIIIと同様にヘパリンの添加によりアンチ
トロンビン活性が著しく促進されるが、ヘパリンの至適
濃度は１−５Ｕ／mlでＡＴIIIの場合(０.１−１Ｕ／ml)
よりも高いことや、その他の硫酸多糖の種類による活性
化のされ方に相違のある事が知られている(臨床病理、
特集第７０号、１８１−１８６頁、(１９８７)、ダグラ
ス・エム・トレフセンら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(Ｄouglas Ｍ．Ｔollefsen
et al．,Ｔhe Ｊournal of Ｂiological Ｃhemi
stry),vol．２５８、Ｎo．１１、６７１３−６７１６頁
(１９８３))。また、ヘパリン親和性において、ＨＣII
はＡＴIIIより弱い。例えば、ヘパリン−セファロース
カラムに結合後の溶出は、ＨＣIIは０.１２−０.１６Ｍ
塩化ナトリウムであり、ＡＴIIIは０.４Ｍ塩化ナトリウ
ム以上でないと溶出しない(ダグラス・エム・トレフセ
ンら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(Ｄouglas Ｍ．Ｔollefsen et al．,Ｔhe Ｊ
ournal of Ｂiological Ｃhemistry)、vol．２５
７、Ｎo．５、２１６２−２１６９頁(１９８２))。この
ヘパリン親和性に関連して、ヘパリン存在下でのＨＣII
のトロンビン阻害の速度はイオン強度に依存する事も知
られている(フランク・シィ・チャーチら、ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｆrank
Ｃ．Ｃhurch et al．,Ｔhe Ｊournal of Ｂiologi
calＣhemistry)、vol．２６４、Ｎo．６、３６１８−３
６２３頁(１９８９))。ＡＴIII測定でのＨＣIIの影響に
関し、ヒト由来トロンビンではなくウシ由来トロンビン
を用いることによりＨＣIIの影響を回避できるというこ
とが述べられている(ジャクリン・コナードら、トロン
ボシス・リサーチ(Ｊacqueline Ｃonard etal．,ＴＨ
ＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ)、vol．４１、８
７３−８７８頁、(１９８６))。
の影響を受けるのでそれを回避することである。ＨＣII
は正常血漿中約９mg／dlで存在し、ＡＴIIIの約１／３
である。ＨＣIIはＡＴIIIと同様にトロンビンを阻害す
るが、ＡＴIIIとは異なり他の凝固因子を阻害しない。
ＨＣIIはＡＴIIIと同様にヘパリンの添加によりアンチ
トロンビン活性が著しく促進されるが、ヘパリンの至適
濃度は１−５Ｕ／mlでＡＴIIIの場合(０.１−１Ｕ／ml)
よりも高いことや、その他の硫酸多糖の種類による活性
化のされ方に相違のある事が知られている(臨床病理、
特集第７０号、１８１−１８６頁、(１９８７)、ダグラ
ス・エム・トレフセンら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(Ｄouglas Ｍ．Ｔollefsen
et al．,Ｔhe Ｊournal of Ｂiological Ｃhemi
stry),vol．２５８、Ｎo．１１、６７１３−６７１６頁
(１９８３))。また、ヘパリン親和性において、ＨＣII
はＡＴIIIより弱い。例えば、ヘパリン−セファロース
カラムに結合後の溶出は、ＨＣIIは０.１２−０.１６Ｍ
塩化ナトリウムであり、ＡＴIIIは０.４Ｍ塩化ナトリウ
ム以上でないと溶出しない(ダグラス・エム・トレフセ
ンら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(Ｄouglas Ｍ．Ｔollefsen et al．,Ｔhe Ｊ
ournal of Ｂiological Ｃhemistry)、vol．２５
７、Ｎo．５、２１６２−２１６９頁(１９８２))。この
ヘパリン親和性に関連して、ヘパリン存在下でのＨＣII
のトロンビン阻害の速度はイオン強度に依存する事も知
られている(フランク・シィ・チャーチら、ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｆrank
Ｃ．Ｃhurch et al．,Ｔhe Ｊournal of Ｂiologi
calＣhemistry)、vol．２６４、Ｎo．６、３６１８−３
６２３頁(１９８９))。ＡＴIII測定でのＨＣIIの影響に
関し、ヒト由来トロンビンではなくウシ由来トロンビン
を用いることによりＨＣIIの影響を回避できるというこ
とが述べられている(ジャクリン・コナードら、トロン
ボシス・リサーチ(Ｊacqueline Ｃonard etal．,ＴＨ
ＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ)、vol．４１、８
７３−８７８頁、(１９８６))。
【０００７】しかしながら、我々は、臨床病理、特集第
７０号、１７３−１７７頁(１９８７)およびユー・アビ
ルドガールドら、トロンボシス・リサーチ(Ｕ．Ａbildg
aard et al．,ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳＥＡＲ
ＣＨ)、vol．１１、５４９−５５３頁(１９７７)に記載
のＡＴIII測定方法に従い、ウシ由来トロンビンを用
い、上記文献でＨＣIIがヘパリンとの親和性が無くなる
という塩濃度より高濃度である公知の方法の塩濃度０.
２Ｍにおいて、ＨＣIIの影響を大きく受けることを確認
した。
７０号、１７３−１７７頁(１９８７)およびユー・アビ
ルドガールドら、トロンボシス・リサーチ(Ｕ．Ａbildg
aard et al．,ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ ＲＥＳＥＡＲ
ＣＨ)、vol．１１、５４９−５５３頁(１９７７)に記載
のＡＴIII測定方法に従い、ウシ由来トロンビンを用
い、上記文献でＨＣIIがヘパリンとの親和性が無くなる
という塩濃度より高濃度である公知の方法の塩濃度０.
２Ｍにおいて、ＨＣIIの影響を大きく受けることを確認
した。
【０００８】上記述べた如く、公知のＡＴIII活性測定
方法において、ＨＣIIの影響を受けるという問題があ
り、この問題を解決することが本発明の課題である。ま
た、ＡＴIII測定に際し、試料を希釈しなくてはならな
い、もし、試料を希釈しない場合は、大過剰のトロンビ
ンを用いなければならないため、非常に短時間に吸光度
オーバーとなるという問題がある。この問題を、同時に
解決し、自動分析機器への適応を容易にし、簡便で、よ
り正確な測定方法および試薬を提供することが本発明の
もう１つの課題である。
方法において、ＨＣIIの影響を受けるという問題があ
り、この問題を解決することが本発明の課題である。ま
た、ＡＴIII測定に際し、試料を希釈しなくてはならな
い、もし、試料を希釈しない場合は、大過剰のトロンビ
ンを用いなければならないため、非常に短時間に吸光度
オーバーとなるという問題がある。この問題を、同時に
解決し、自動分析機器への適応を容易にし、簡便で、よ
り正確な測定方法および試薬を提供することが本発明の
もう１つの課題である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】このような事情に鑑み、
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、試料にトロンビ
ンを添加し、ヘパリンおよび塩の存在下で反応を行わ
せ、反応後、色原性基質を用いて、残存トロンビン活性
を測定することよりなるＡＴIII活性測定方法におい
て、反応液中の塩濃度を公知の方法より高めることによ
って、意外にも前記課題が解決できることを見い出し、
本発明を完成するに至った。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、試料にトロンビ
ンを添加し、ヘパリンおよび塩の存在下で反応を行わ
せ、反応後、色原性基質を用いて、残存トロンビン活性
を測定することよりなるＡＴIII活性測定方法におい
て、反応液中の塩濃度を公知の方法より高めることによ
って、意外にも前記課題が解決できることを見い出し、
本発明を完成するに至った。
【００１０】即ち、本発明は、試料に一定過剰のトロン
ビンを添加し、ヘパリンおよび塩の存在下で反応を行わ
せた後、トロンビンの作用により発色する色原性基質を
用いて残存トロンビン活性を測定することよりなり、塩
濃度を０.２０Ｍを超え０.９０Ｍ以下、好ましくは０.
２５Ｍ以上より０.６０Ｍまで、更に好ましくは０.３５
Ｍ以上より０.６０Ｍの濃度とすることを特徴とするア
ンチトロンビンIII活性の測定方法を提供するものであ
る。
ビンを添加し、ヘパリンおよび塩の存在下で反応を行わ
せた後、トロンビンの作用により発色する色原性基質を
用いて残存トロンビン活性を測定することよりなり、塩
濃度を０.２０Ｍを超え０.９０Ｍ以下、好ましくは０.
２５Ｍ以上より０.６０Ｍまで、更に好ましくは０.３５
Ｍ以上より０.６０Ｍの濃度とすることを特徴とするア
ンチトロンビンIII活性の測定方法を提供するものであ
る。
【００１１】公知の方法では、ヘパリン存在下での試料
とトロンビンとの反応時の塩濃度は０.２Ｍであるが、
本発明では、この塩濃度を高めるという非常に簡単で、
経済的負担を殆ど伴わない手段により、ＨＣIIの影響を
回避でき、また、用いるトロンビンを少なくすることが
でき、試料希釈を行わなくても非常に短時間に吸光度オ
ーバーすることなく、自動分析機器への適応を容易に
し、簡便で、より正確にＡＴIIIの測定が行えるという
効果が奏される。
とトロンビンとの反応時の塩濃度は０.２Ｍであるが、
本発明では、この塩濃度を高めるという非常に簡単で、
経済的負担を殆ど伴わない手段により、ＨＣIIの影響を
回避でき、また、用いるトロンビンを少なくすることが
でき、試料希釈を行わなくても非常に短時間に吸光度オ
ーバーすることなく、自動分析機器への適応を容易に
し、簡便で、より正確にＡＴIIIの測定が行えるという
効果が奏される。
【００１２】すなわち、まず、試料とトロンビンの反応
液中の塩濃度の上昇とともに、ＨＣIIの影響は減少し
た。より詳しくは、塩濃度０.２２Ｍでは約４割の回避
効果、０.２４Ｍでは約６割の回避効果、０.２６Ｍでは
約９割の回避効果、０.３Ｍ以上では影響を全く認めな
かった(実施例２)。また、ある一定活性のトロンビンお
よび一定量の試料を用いてのＡＴIII測定(実施例３)で
は、塩濃度０.３Ｍまでは、ＡＴIII活性１００％でトロ
ンビンの約９割が阻害され、検量線としての直線性はＡ
ＴIII活性７５％までであるのに対し、０.４ＭではＡＴ
III活性１００％でトロンビンの約５割の阻害であり、
直線性はＡＴIII活性１００％まであった。０.５Ｍでは
ＡＴIII活性１００％でトロンビンの約１.５割の阻害で
あった。このことは、更に多くの試料を検体とすること
が出来ること、および／または、試薬として添加するト
ロンビン活性を少なくすることが出来ることを示してい
る。試薬としてのトロンビンを少なくすることによっ
て、短時間に吸光度オーバーとなるもう一つの問題を解
決することが出来る。
液中の塩濃度の上昇とともに、ＨＣIIの影響は減少し
た。より詳しくは、塩濃度０.２２Ｍでは約４割の回避
効果、０.２４Ｍでは約６割の回避効果、０.２６Ｍでは
約９割の回避効果、０.３Ｍ以上では影響を全く認めな
かった(実施例２)。また、ある一定活性のトロンビンお
よび一定量の試料を用いてのＡＴIII測定(実施例３)で
は、塩濃度０.３Ｍまでは、ＡＴIII活性１００％でトロ
ンビンの約９割が阻害され、検量線としての直線性はＡ
ＴIII活性７５％までであるのに対し、０.４ＭではＡＴ
III活性１００％でトロンビンの約５割の阻害であり、
直線性はＡＴIII活性１００％まであった。０.５Ｍでは
ＡＴIII活性１００％でトロンビンの約１.５割の阻害で
あった。このことは、更に多くの試料を検体とすること
が出来ること、および／または、試薬として添加するト
ロンビン活性を少なくすることが出来ることを示してい
る。試薬としてのトロンビンを少なくすることによっ
て、短時間に吸光度オーバーとなるもう一つの問題を解
決することが出来る。
【００１３】また、実施例３の測定条件(反応液中のヘ
パリン濃度３Ｕ／ml)で作成した検量線(図２)では、塩
濃度０.５Ｍ以上の高濃度では測定感度として好ましく
ないが、更にヘパリン量を多くすることにより測定感度
を改善出来ること(実施例４、図３)が明らかとなった。
パリン濃度３Ｕ／ml)で作成した検量線(図２)では、塩
濃度０.５Ｍ以上の高濃度では測定感度として好ましく
ないが、更にヘパリン量を多くすることにより測定感度
を改善出来ること(実施例４、図３)が明らかとなった。
【００１４】これらより、今回、試料量と、トロンビン
活性と、塩濃度と、ヘパリン量を選択することにより、
試料希釈を行わないで、短時間に吸光度オーバーになる
ことなく、好ましい測定感度とすることが出来る事が判
明した。また、ＨＣIIの影響の回避を同時に達成するこ
とが出来る。本発明においては、反応タイムコースは直
線であり、検量線は直線関係にあり、再現性は良好であ
り、日常検査に使用し易い方法である。
活性と、塩濃度と、ヘパリン量を選択することにより、
試料希釈を行わないで、短時間に吸光度オーバーになる
ことなく、好ましい測定感度とすることが出来る事が判
明した。また、ＨＣIIの影響の回避を同時に達成するこ
とが出来る。本発明においては、反応タイムコースは直
線であり、検量線は直線関係にあり、再現性は良好であ
り、日常検査に使用し易い方法である。
【００１５】本発明の方法を従来の方法と比べると、特
開平３−５３８９８における提案は、トロンビンに対す
る感度が低い色原性基質についてであり、塩濃度につい
ての記載はなく、ＡＴIII測定の一つの大きな問題であ
るＨＣIIの影響回避については、全く考慮されていな
い。この点で、該提案は本発明の方法とは異なる。
開平３−５３８９８における提案は、トロンビンに対す
る感度が低い色原性基質についてであり、塩濃度につい
ての記載はなく、ＡＴIII測定の一つの大きな問題であ
るＨＣIIの影響回避については、全く考慮されていな
い。この点で、該提案は本発明の方法とは異なる。
【００１６】また、特開昭６２−６１６００では、試料
および基質を混合し、その後プロテアーゼを添加するこ
とにより反応を開始させ、次いで基質の加水分解速度を
測定することによりプロテアーゼ阻害剤を測定する方法
が提案されている。その方法ではＡＴIIIを測定するこ
とも示されており、中性塩好ましくは塩化ナトリウムが
０−０.５Ｍ好ましくは０.０８−０.１５Ｍの濃度で添
加されると記載されている。この方法がＡＴIII測定の
従来の方法と異なることはトロンビンを添加するよりも
前に基質を添加することで、予備加温および試料の予備
希釈を必要としないことである。
および基質を混合し、その後プロテアーゼを添加するこ
とにより反応を開始させ、次いで基質の加水分解速度を
測定することによりプロテアーゼ阻害剤を測定する方法
が提案されている。その方法ではＡＴIIIを測定するこ
とも示されており、中性塩好ましくは塩化ナトリウムが
０−０.５Ｍ好ましくは０.０８−０.１５Ｍの濃度で添
加されると記載されている。この方法がＡＴIII測定の
従来の方法と異なることはトロンビンを添加するよりも
前に基質を添加することで、予備加温および試料の予備
希釈を必要としないことである。
【００１７】実際に、特開昭６２−６１６００の実施例
１に準じた方法で、トロンビン試薬中の塩濃度０.１−
０.５ＭでＡＴIII測定を行うと、参考例に示す如く、検
量線は作成された(図１)。しかしながら、０.５Ｍの塩
濃度では測定感度が好ましくなく、０.１−０.４Ｍの塩
濃度では、その検量線は曲線であるため、日常検査では
好ましくない。その理由は、日常検査では２ポイント、
例えば、ＡＴIII活性０％と１００％で、検量線を作成
するのが好都合であるが、特開昭６２−６１６００では
検量線が曲線であるため、検量線作成に当たり、更に多
くのポイントを必要とするからである。また、特開昭６
２−６１６００では反応タイムコースは特開昭６２−６
１６００の図１に示されるごとく、非直線であるため、
自動分析機器の使用が限られる。例えば、日立７１５０
では使用できない。各塩濃度０.２Ｍ、０.３Ｍ、０.４
Ｍで正常検体と異常検体を用いての同時再現性(n＝５)
は、それらのＣＶの平均は７.７％であり(参考例)、日
常検査に使用するには測定の精度面で問題がある。これ
らの理由により、特開昭６２−６１６００の方法は日常
的なＡＴIII測定法としては好ましくない。
１に準じた方法で、トロンビン試薬中の塩濃度０.１−
０.５ＭでＡＴIII測定を行うと、参考例に示す如く、検
量線は作成された(図１)。しかしながら、０.５Ｍの塩
濃度では測定感度が好ましくなく、０.１−０.４Ｍの塩
濃度では、その検量線は曲線であるため、日常検査では
好ましくない。その理由は、日常検査では２ポイント、
例えば、ＡＴIII活性０％と１００％で、検量線を作成
するのが好都合であるが、特開昭６２−６１６００では
検量線が曲線であるため、検量線作成に当たり、更に多
くのポイントを必要とするからである。また、特開昭６
２−６１６００では反応タイムコースは特開昭６２−６
１６００の図１に示されるごとく、非直線であるため、
自動分析機器の使用が限られる。例えば、日立７１５０
では使用できない。各塩濃度０.２Ｍ、０.３Ｍ、０.４
Ｍで正常検体と異常検体を用いての同時再現性(n＝５)
は、それらのＣＶの平均は７.７％であり(参考例)、日
常検査に使用するには測定の精度面で問題がある。これ
らの理由により、特開昭６２−６１６００の方法は日常
的なＡＴIII測定法としては好ましくない。
【００１８】また、特開昭６２−６１６００には、ＨＣ
IIの影響回避についての示唆はない。さらには、本発明
では、試料とトロンビンとのあらかじめの反応は必須で
あり、測定の手順が重要である。これらの点で、特開昭
６２−６１６００に開示の方法は本発明の方法とは異な
る。
IIの影響回避についての示唆はない。さらには、本発明
では、試料とトロンビンとのあらかじめの反応は必須で
あり、測定の手順が重要である。これらの点で、特開昭
６２−６１６００に開示の方法は本発明の方法とは異な
る。
【００１９】次に、本発明の測定方法で用いる試料や試
薬等を説明する。まず、本発明での測定方法で用いる試
料は、通常、血漿であり、常法に従って被検者から採血
し、血漿を分取する。
薬等を説明する。まず、本発明での測定方法で用いる試
料は、通常、血漿であり、常法に従って被検者から採血
し、血漿を分取する。
【００２０】また、本発明の測定方法ではヒト、ウシ、
ウマ、ヤギ等由来のトロンビンが使用できる。トロンビ
ンの作用により発色する色原性基質としては、Ｓ−２２
３８(Ｈ−Ｄ−Ｐhe−Ｐip−Ａrg−pＮＡ)、Ｓpectrozym
e−ＴＨ(Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ)、Ｃhrom
ozym−ＴＨ(Ｔos−Ｇly−Ｐro−Ａrg−pＮＡ)、ＣＢＳ
−３４−４７(Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｂut−Ａrg−pＮＡ)、
２ＡcＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ等が公
知であり、これらトロンビン基質がいずれも使用でき
る。塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム等の中性
塩が好ましい。ヘパリンを含めこれらの試薬はいずれも
商業的に入手可能である。ヘパリンおよび塩をトロンビ
ン試薬と別の試薬としても良いが、トロンビン試薬に含
有させるのが望ましい。トロンビン試薬および色原性基
質試薬は必要に応じてpＨ調節し、pＨ調節の緩衝剤とし
ては、トリス、リン酸、バルビタール、イミダゾール、
ベロナール、グリシルグリシン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔ
ＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ等が挙げられ
る。これらの緩衝剤も商業的に入手可能である。
ウマ、ヤギ等由来のトロンビンが使用できる。トロンビ
ンの作用により発色する色原性基質としては、Ｓ−２２
３８(Ｈ−Ｄ−Ｐhe−Ｐip−Ａrg−pＮＡ)、Ｓpectrozym
e−ＴＨ(Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ)、Ｃhrom
ozym−ＴＨ(Ｔos−Ｇly−Ｐro−Ａrg−pＮＡ)、ＣＢＳ
−３４−４７(Ｈ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｂut−Ａrg−pＮＡ)、
２ＡcＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ等が公
知であり、これらトロンビン基質がいずれも使用でき
る。塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム等の中性
塩が好ましい。ヘパリンを含めこれらの試薬はいずれも
商業的に入手可能である。ヘパリンおよび塩をトロンビ
ン試薬と別の試薬としても良いが、トロンビン試薬に含
有させるのが望ましい。トロンビン試薬および色原性基
質試薬は必要に応じてpＨ調節し、pＨ調節の緩衝剤とし
ては、トリス、リン酸、バルビタール、イミダゾール、
ベロナール、グリシルグリシン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔ
ＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ等が挙げられ
る。これらの緩衝剤も商業的に入手可能である。
【００２１】各試薬の濃度は適時選択することが出来る
が、トロンビンは最終反応液中で、０.０１−１０ＮＩ
ＨＵ／ml、好ましくは０.２−２ＮＩＨＵ／mlが望まし
い。色原性基質は最終反応液中で、０.０１−５mＭ、好
ましくは０.１−０.５mＭが望ましい。ヘパリンは試料
とトロンビンとの混合液中で０.０２−１００,０００Ｕ
／ml、好ましくは１−１,０００Ｕ／mlが望ましい。試
料とトロンビンとの混合液中の塩濃度は０.２０Ｍを超
え０.９０Ｍまで、好ましくは０.２５Ｍ以上より０.６
０Ｍまで、更に好ましくは０.３５Ｍ以上より０.６０Ｍ
までが望ましい。試料とトロンビン混合液および最終反
応液のpＨは緩衝剤を用いて調節され、６.０−１０.０
の範囲であり、好ましくは７.５−８.５が望ましく、そ
の濃度は０.００５−１.０Ｍ、好ましくは０.０２−０.
１Ｍが望ましい。
が、トロンビンは最終反応液中で、０.０１−１０ＮＩ
ＨＵ／ml、好ましくは０.２−２ＮＩＨＵ／mlが望まし
い。色原性基質は最終反応液中で、０.０１−５mＭ、好
ましくは０.１−０.５mＭが望ましい。ヘパリンは試料
とトロンビンとの混合液中で０.０２−１００,０００Ｕ
／ml、好ましくは１−１,０００Ｕ／mlが望ましい。試
料とトロンビンとの混合液中の塩濃度は０.２０Ｍを超
え０.９０Ｍまで、好ましくは０.２５Ｍ以上より０.６
０Ｍまで、更に好ましくは０.３５Ｍ以上より０.６０Ｍ
までが望ましい。試料とトロンビン混合液および最終反
応液のpＨは緩衝剤を用いて調節され、６.０−１０.０
の範囲であり、好ましくは７.５−８.５が望ましく、そ
の濃度は０.００５−１.０Ｍ、好ましくは０.０２−０.
１Ｍが望ましい。
【００２２】なお、本発明の測定方法においては、試薬
の性能や品質の維持、製造その他を目的として、トロン
ビン試薬や色原性基質試薬に各種の物質を適時添加する
こともできる。その例としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等
のキレート剤、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキ
サム酸、アプロチニン等の抗線溶剤、ポリブレン、プロ
タミン等のヘパリン阻害物質、アジ化ナトリウム、硫酸
ゲンタマイシン、チメロサール等の防腐剤、トリトンＸ
−１００、ツイーン−２０等の界面活性剤等の他に、糖
類、アミノ酸類、アルブミン等のタンパク質、モノエチ
ルアミン等のアミン化合物、ポリエチレングリコール、
グリセロール等の物質が挙げられる。
の性能や品質の維持、製造その他を目的として、トロン
ビン試薬や色原性基質試薬に各種の物質を適時添加する
こともできる。その例としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等
のキレート剤、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキ
サム酸、アプロチニン等の抗線溶剤、ポリブレン、プロ
タミン等のヘパリン阻害物質、アジ化ナトリウム、硫酸
ゲンタマイシン、チメロサール等の防腐剤、トリトンＸ
−１００、ツイーン−２０等の界面活性剤等の他に、糖
類、アミノ酸類、アルブミン等のタンパク質、モノエチ
ルアミン等のアミン化合物、ポリエチレングリコール、
グリセロール等の物質が挙げられる。
【００２３】次に、本発明の測定方法における具体的操
作について説明する。まず、試料とトロンビン試薬を混
合する。別法として、試料とヘパリンを含む試薬とトロ
ンビン試薬を混合してもよい。この時、塩はトロンビン
試薬またはヘパリンを含む試薬の一方または両方、もし
くは希釈された試料の場合には、試料のいずれに含まれ
ていてもよい。この混合液を１５−５０℃、好ましくは
３０−４０℃で一定時間０.５−２０分、好ましくは１
−５分、加温する。この一定時間の加温で試料中のＡＴ
IIIとトロンビンを反応させる。その後、色原性基質試
薬を添加し、残存したトロンビン活性に基づき、色原性
基質より遊離される色を測定する。その測定は、時間当
りの吸光度変化として求めるレート測定、または、一定
時間後に反応停止液を添加するエンドポイント測定によ
る。その測定の値を、標準を試料としたときと比較する
ことにより、ＡＴIII活性が求まる。自動分析機器での
測定ではレート測定が望ましい。エンドポイント測定の
場合の反応停止液には、一般的に、１０−５０％酢酸や
１０−２０％クエン酸溶液を用いる。本発明の方法にお
いては最終反応液１ml当り試料を１−５０μl、好まし
くは３−１０μl用いる。
作について説明する。まず、試料とトロンビン試薬を混
合する。別法として、試料とヘパリンを含む試薬とトロ
ンビン試薬を混合してもよい。この時、塩はトロンビン
試薬またはヘパリンを含む試薬の一方または両方、もし
くは希釈された試料の場合には、試料のいずれに含まれ
ていてもよい。この混合液を１５−５０℃、好ましくは
３０−４０℃で一定時間０.５−２０分、好ましくは１
−５分、加温する。この一定時間の加温で試料中のＡＴ
IIIとトロンビンを反応させる。その後、色原性基質試
薬を添加し、残存したトロンビン活性に基づき、色原性
基質より遊離される色を測定する。その測定は、時間当
りの吸光度変化として求めるレート測定、または、一定
時間後に反応停止液を添加するエンドポイント測定によ
る。その測定の値を、標準を試料としたときと比較する
ことにより、ＡＴIII活性が求まる。自動分析機器での
測定ではレート測定が望ましい。エンドポイント測定の
場合の反応停止液には、一般的に、１０−５０％酢酸や
１０−２０％クエン酸溶液を用いる。本発明の方法にお
いては最終反応液１ml当り試料を１−５０μl、好まし
くは３−１０μl用いる。
【００２４】また、本発明は、トロンビンと、ヘパリン
と、色原性基質よりなる公知の方法の試薬に、試料とト
ロンビンの反応液中の塩濃度が０.２０Ｍを超え０.９０
Ｍまで、となる処方とする改良された試薬キットを提供
するものである。
と、色原性基質よりなる公知の方法の試薬に、試料とト
ロンビンの反応液中の塩濃度が０.２０Ｍを超え０.９０
Ｍまで、となる処方とする改良された試薬キットを提供
するものである。
【００２５】本発明のＡＴIII活性測定用試薬キット
は、構成試薬を混合したもの、あるいは各構成試薬の集
合体とすることが出来る。混合試薬、あるいは各構成試
薬は、常法に従って、賦形剤と共に反応液中で所定の濃
度になるように精製水や緩衝剤に溶解した剤形の、その
まま直接、測定に供することの出来る形態、あるいは使
用時、適時所望の濃度に希釈する濃厚液の形態、さらに
は、凍結乾燥品の形態とすることが出来る。このうち、
凍結乾燥品の形態が通常採用される形態であり、使用に
際し精製水または緩衝液で復元する。また各構成試薬は
同一の形態あるいは別の形態とすることが出来る。いず
れの場合においても、試薬キットにおける塩の量は、試
料とトロンビンの反応液中の塩濃度が０.２０Ｍを超え
０.９Ｍ以下となるような量から選択される。
は、構成試薬を混合したもの、あるいは各構成試薬の集
合体とすることが出来る。混合試薬、あるいは各構成試
薬は、常法に従って、賦形剤と共に反応液中で所定の濃
度になるように精製水や緩衝剤に溶解した剤形の、その
まま直接、測定に供することの出来る形態、あるいは使
用時、適時所望の濃度に希釈する濃厚液の形態、さらに
は、凍結乾燥品の形態とすることが出来る。このうち、
凍結乾燥品の形態が通常採用される形態であり、使用に
際し精製水または緩衝液で復元する。また各構成試薬は
同一の形態あるいは別の形態とすることが出来る。いず
れの場合においても、試薬キットにおける塩の量は、試
料とトロンビンの反応液中の塩濃度が０.２０Ｍを超え
０.９Ｍ以下となるような量から選択される。
【００２６】
【参考例および実施例】以下に参考例および実施例を挙
げて本発明を更に詳しく説明する。参考例 特開昭６２−６１６００の実施例１の方法に準じた方法
にて、検討した。検体２０μlに２mＭ色原性基質Ｓ−２
２３８ ４０μlを添加後、１ＮＩＨＵ／mlトロンビン
および２.５Ｕ／mlヘパリンを含む０.１Ｍトリス−塩酸
緩衝液pＨ８.２(トロンビン試薬)を２００μl添加し、
３７℃で１５秒後から９０秒後までの４０５nmの吸光度
変化を測定した。測定には自動分析機器コーバスファラ
(ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ)II(スイス、ロッシュ社製)を用
いた。トロンビン試薬に塩化ナトリウムを添加し、０.
１Ｍ、０.２Ｍ、０.３Ｍ、０.４Ｍ、０.５Ｍの各濃度と
した。標準品には市販正常血漿カリプラズマインデック
ス１００(フランス、ビオメリュー社製)を用い、検体の
希釈(ＡＴIII活性２５、５０、７５％)には生理的食塩
水を用い、ＡＴIII活性０％の検体は生理的食塩水とし
て、検量線を作成した。更に、各塩濃度でＡＴIII活性
１００％(正常検体)と５０％(異常検体)を５重測定し、
検量線よりＡＴIII活性を求め、同時再現性を調べた。
げて本発明を更に詳しく説明する。参考例 特開昭６２−６１６００の実施例１の方法に準じた方法
にて、検討した。検体２０μlに２mＭ色原性基質Ｓ−２
２３８ ４０μlを添加後、１ＮＩＨＵ／mlトロンビン
および２.５Ｕ／mlヘパリンを含む０.１Ｍトリス−塩酸
緩衝液pＨ８.２(トロンビン試薬)を２００μl添加し、
３７℃で１５秒後から９０秒後までの４０５nmの吸光度
変化を測定した。測定には自動分析機器コーバスファラ
(ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ)II(スイス、ロッシュ社製)を用
いた。トロンビン試薬に塩化ナトリウムを添加し、０.
１Ｍ、０.２Ｍ、０.３Ｍ、０.４Ｍ、０.５Ｍの各濃度と
した。標準品には市販正常血漿カリプラズマインデック
ス１００(フランス、ビオメリュー社製)を用い、検体の
希釈(ＡＴIII活性２５、５０、７５％)には生理的食塩
水を用い、ＡＴIII活性０％の検体は生理的食塩水とし
て、検量線を作成した。更に、各塩濃度でＡＴIII活性
１００％(正常検体)と５０％(異常検体)を５重測定し、
検量線よりＡＴIII活性を求め、同時再現性を調べた。
【００２７】図１に示すごとく、塩化ナトリウム０.１
Ｍ−０.５Ｍで検量線が作成されたが、０.５Ｍでは測定
感度として好ましくなく、０.１−０.４Ｍでの検量線は
直線でなかった。０.１Ｍ塩化ナトリウムでの同時再現
性はＣＶ７.２−１２.７％であり、０.２−０.４Ｍ塩化
ナトリウムでの各測定の同時再現性のＣＶの平均は７.
７％であった。
Ｍ−０.５Ｍで検量線が作成されたが、０.５Ｍでは測定
感度として好ましくなく、０.１−０.４Ｍでの検量線は
直線でなかった。０.１Ｍ塩化ナトリウムでの同時再現
性はＣＶ７.２−１２.７％であり、０.２−０.４Ｍ塩化
ナトリウムでの各測定の同時再現性のＣＶの平均は７.
７％であった。
【００２８】検量線は直線でなく、再現性は７％前後と
悪く、また、その反応タイムコースは特開昭６２−６１
６００の図１に示されるごとく、非直線であり、日常検
査としての使用には好ましくなく、操作手順の重要性が
実証された。
悪く、また、その反応タイムコースは特開昭６２−６１
６００の図１に示されるごとく、非直線であり、日常検
査としての使用には好ましくなく、操作手順の重要性が
実証された。
【００２９】実施例１ ＨＣII分画の調製 ヒト正常血漿(日本生物材料センターより購入)４０mlに
硫酸バリウム１０gを添加撹拌(１５分)後、３０００回
転で１５分遠心し、上清を分取した。その上清を２０m
Ｍトリス−塩酸緩衝液pＨ７.３で平衡化したヘパリンア
ガロース２５ml(米国、シグマ社製:タイプＩＩ)カラム
(プラスチック注射筒３５ml:ニブロ社製)に通し、ＡＴI
IIを吸着除去し、素通り分画を集めた。更に完全にＡＴ
IIIを除く目的で、回収した分画を、再度同カラムに通
し、素通り分画を集めた。素通り分画をセントリップレ
ップ１０(米国、アミコン社製)で約５−６倍に濃縮し、
ＨＣII分画とした。
硫酸バリウム１０gを添加撹拌(１５分)後、３０００回
転で１５分遠心し、上清を分取した。その上清を２０m
Ｍトリス−塩酸緩衝液pＨ７.３で平衡化したヘパリンア
ガロース２５ml(米国、シグマ社製:タイプＩＩ)カラム
(プラスチック注射筒３５ml:ニブロ社製)に通し、ＡＴI
IIを吸着除去し、素通り分画を集めた。更に完全にＡＴ
IIIを除く目的で、回収した分画を、再度同カラムに通
し、素通り分画を集めた。素通り分画をセントリップレ
ップ１０(米国、アミコン社製)で約５−６倍に濃縮し、
ＨＣII分画とした。
【００３０】実施例２ ３Ｕ／mlヘパリン、７.５mＭＥＤＴＡおよび０.２０Ｍ
−０.６０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０mＭトリス−塩酸
緩衝液pＨ８.４でウシトロンビン(フランス、ビオメリ
ュー社製:フィブリノゲンキットの構成品)を溶解し、３
ＮＩＨＵ／mlとした(トロンビン試薬)。色原性基質２Ａ
cＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ(ビオメリ
ュー社:ＡＴIII測定キット(ＡＴIII Ｃhrom)の構成品)
を精製水で溶解し(１.４mＭ)基質試薬とした。標準品に
は市販正常血漿カリプラズマインデックス−１００(ビ
オメリュー社製)を用い、生理的食塩水で希釈し、ＡＴI
II活性０％(生理的食塩水のみ)、２５％、５０％、１０
０％(無希釈)とし、検量線作成用とした。実施例１で調
製したＨＣII分画を検体として測定し、検量線よりＡＴ
III活性を求め、ＨＣIIの影響を評価した。測定には自
動分析機器コーバスファラを用いた。本発明の測定方法
は、検体２μlにトロンビン試薬２００μlを添加し、３
７℃で３分間加温後、基質試薬１００μlを添加し、添
加後２０秒後より９０秒後まで、４０５nmの吸光度を測
定し、１分間当りの吸光度変化を求めた。
−０.６０Ｍ塩化ナトリウムを含む５０mＭトリス−塩酸
緩衝液pＨ８.４でウシトロンビン(フランス、ビオメリ
ュー社製:フィブリノゲンキットの構成品)を溶解し、３
ＮＩＨＵ／mlとした(トロンビン試薬)。色原性基質２Ａ
cＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−Ａrg−pＮＡ(ビオメリ
ュー社:ＡＴIII測定キット(ＡＴIII Ｃhrom)の構成品)
を精製水で溶解し(１.４mＭ)基質試薬とした。標準品に
は市販正常血漿カリプラズマインデックス−１００(ビ
オメリュー社製)を用い、生理的食塩水で希釈し、ＡＴI
II活性０％(生理的食塩水のみ)、２５％、５０％、１０
０％(無希釈)とし、検量線作成用とした。実施例１で調
製したＨＣII分画を検体として測定し、検量線よりＡＴ
III活性を求め、ＨＣIIの影響を評価した。測定には自
動分析機器コーバスファラを用いた。本発明の測定方法
は、検体２μlにトロンビン試薬２００μlを添加し、３
７℃で３分間加温後、基質試薬１００μlを添加し、添
加後２０秒後より９０秒後まで、４０５nmの吸光度を測
定し、１分間当りの吸光度変化を求めた。
【００３１】ＨＣIIがＡＴIII測定に及ぼす影響を調べ
た結果、公知の方法である塩濃度０.２０Ｍで大きな影
響を認め、０.３Ｍ以上ではＨＣIIの影響を認めなかっ
た。
た結果、公知の方法である塩濃度０.２０Ｍで大きな影
響を認め、０.３Ｍ以上ではＨＣIIの影響を認めなかっ
た。
【００３２】ＨＣIIの影響を０.２０−０.３０Ｍ塩化ナ
トリウムの塩濃度で更に詳細に調べた。その結果を表１
に示す。０.２２Ｍの塩濃度では、公知の方法の約４割
の影響回避効果、０.２４Ｍの塩濃度では、約６割の影
響回避効果０.２６Ｍの塩濃度では約９割の影響回避効
果が認められ、更に塩濃度０.３０Ｍでは、ＨＣIIの影
響を全く認めなかった。試料とトロンビン試薬の反応液
中の塩濃度を調節することにより、ＨＣIIの影響回避効
果を認めた。このＨＣII影響回避方法を利用することに
より、正確にＡＴIII測定が行えることが判明した。
トリウムの塩濃度で更に詳細に調べた。その結果を表１
に示す。０.２２Ｍの塩濃度では、公知の方法の約４割
の影響回避効果、０.２４Ｍの塩濃度では、約６割の影
響回避効果０.２６Ｍの塩濃度では約９割の影響回避効
果が認められ、更に塩濃度０.３０Ｍでは、ＨＣIIの影
響を全く認めなかった。試料とトロンビン試薬の反応液
中の塩濃度を調節することにより、ＨＣIIの影響回避効
果を認めた。このＨＣII影響回避方法を利用することに
より、正確にＡＴIII測定が行えることが判明した。
【００３３】
【表１】
【００３４】実施例３ トロンビン試薬中のトロンビンを２ＮＩＨＵ／mlとし、
検量線作成用の検体をＡＴIII活性０、２５、５０、７
５、１００％とし、実施例２の方法にて測定し、塩濃度
との関係で検量線を作成した。更に、各塩濃度でＡＴII
I活性１００％(正常検体)と５０％(異常検体)を５重測
定し、検量線よりＡＴIII活性を求め、同時再現性を調
べた。各塩濃度における検量線を図２に示す。
検量線作成用の検体をＡＴIII活性０、２５、５０、７
５、１００％とし、実施例２の方法にて測定し、塩濃度
との関係で検量線を作成した。更に、各塩濃度でＡＴII
I活性１００％(正常検体)と５０％(異常検体)を５重測
定し、検量線よりＡＴIII活性を求め、同時再現性を調
べた。各塩濃度における検量線を図２に示す。
【００３５】塩濃度０.３０Ｍ濃度以下では、ＡＴIII活
性１００％では添加トロンビンの約９割は阻害され、検
量線としての直線性はＡＴIII活性７５％までであるの
に対し、０.４０Ｍではトロンビンの約５割の阻害、０.
５０Ｍでは約１.５割の阻害であり、ＡＴIII活性１００
％まで直線関係が得られた。しかし、この測定条件では
０.５０Ｍ、０.６０Ｍでは測定感度としては好ましくな
かった。０.２０−０.４０Ｍでの各測定の同時再現性の
ＣＶの平均は２.３％であった。このＣＶは日常検査と
しての使用に適している測定精度である。
性１００％では添加トロンビンの約９割は阻害され、検
量線としての直線性はＡＴIII活性７５％までであるの
に対し、０.４０Ｍではトロンビンの約５割の阻害、０.
５０Ｍでは約１.５割の阻害であり、ＡＴIII活性１００
％まで直線関係が得られた。しかし、この測定条件では
０.５０Ｍ、０.６０Ｍでは測定感度としては好ましくな
かった。０.２０−０.４０Ｍでの各測定の同時再現性の
ＣＶの平均は２.３％であった。このＣＶは日常検査と
しての使用に適している測定精度である。
【００３６】更に、同方法にて、塩濃度０.３０−０.４
０Ｍの間で、ＡＴIII活性１００％の残存トロンビン活
性の割合を求めた。その結果を表２に示す。塩濃度の増
加とともに残存トロンビン活性の割合が増加している。
これらの結果は、高塩濃度で更に多くの検体量を使用で
きる。試薬として添加するトロンビン活性を減らすこと
が出来るということを示している。
０Ｍの間で、ＡＴIII活性１００％の残存トロンビン活
性の割合を求めた。その結果を表２に示す。塩濃度の増
加とともに残存トロンビン活性の割合が増加している。
これらの結果は、高塩濃度で更に多くの検体量を使用で
きる。試薬として添加するトロンビン活性を減らすこと
が出来るということを示している。
【００３７】
【表２】
【００３８】実施例４ 実施例３の方法に準じ、ヘパリンの非常に高濃度１００
０Ｕ／mlでの、塩濃度とその検量線の関係を調べた。そ
の結果を図３に示す。この結果および実施例３の結果よ
り塩濃度とヘパリン濃度は相互に関係しており、一般的
に高塩濃度で高ヘパリン濃度を必要とするが、一定の塩
濃度に対し、好ましいヘパリン量が存在することが理解
される。実施例３で測定感度的に好ましくなかった０.
５０Ｍ以上の塩濃度においても、ヘパリン濃度の選択に
より０.５０−０.９０Ｍの塩濃度も用いることが出来る
ことを示している。
０Ｕ／mlでの、塩濃度とその検量線の関係を調べた。そ
の結果を図３に示す。この結果および実施例３の結果よ
り塩濃度とヘパリン濃度は相互に関係しており、一般的
に高塩濃度で高ヘパリン濃度を必要とするが、一定の塩
濃度に対し、好ましいヘパリン量が存在することが理解
される。実施例３で測定感度的に好ましくなかった０.
５０Ｍ以上の塩濃度においても、ヘパリン濃度の選択に
より０.５０−０.９０Ｍの塩濃度も用いることが出来る
ことを示している。
【００３９】実施例５ トロンビン１.０ＮＩＨＵ／ml、３Ｕ／mlヘパリン、７.
５mＭＥＤＴＡおよび０.４Ｍ塩化ナトリウムを含む５０
mＭトリス−塩酸緩衝液pＨ８.４よりなるトロンビン試
液と、色原性基質２ＡcＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−
Ａrg−pＮＡ １.４mＭよりなる基質試薬とを組合せて
本発明のＡＴIII活性測定用試薬キットを得た。
５mＭＥＤＴＡおよび０.４Ｍ塩化ナトリウムを含む５０
mＭトリス−塩酸緩衝液pＨ８.４よりなるトロンビン試
液と、色原性基質２ＡcＯＨ−Ｈ−Ｄ−ＨＨＴ−Ａla−
Ａrg−pＮＡ １.４mＭよりなる基質試薬とを組合せて
本発明のＡＴIII活性測定用試薬キットを得た。
【００４０】
【発明の効果】以上述べたとおり、本発明は、公知のＡ
ＴIII測定方法において、その反応液中の塩濃度を高め
るという非常に簡単で、経済的負担を殆ど伴わない方法
にて、ＨＣIIの影響を回避する方法であり、また、用い
るトロンビンを少なくすることができ、試料希釈を行わ
なくても非常に短時間に吸光度オーバーとなることな
く、自動分析機器への適応を容易にし、簡便で、より正
確にＡＴIIIの測定が行え、日常検査に適用できる有用
な方法である。
ＴIII測定方法において、その反応液中の塩濃度を高め
るという非常に簡単で、経済的負担を殆ど伴わない方法
にて、ＨＣIIの影響を回避する方法であり、また、用い
るトロンビンを少なくすることができ、試料希釈を行わ
なくても非常に短時間に吸光度オーバーとなることな
く、自動分析機器への適応を容易にし、簡便で、より正
確にＡＴIIIの測定が行え、日常検査に適用できる有用
な方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 参考例において、特開昭６２−６１６００の
方法における塩濃度０.１０−０.５０ＭでのＡＴIII測
定の検量線を示すグラフである。
方法における塩濃度０.１０−０.５０ＭでのＡＴIII測
定の検量線を示すグラフである。
【図２】 実施例３において、トロンビン試薬中(ヘパ
リン濃度３Ｕ／ml)の０.２０−０.６０Ｍ塩濃度でのＡ
ＴIII測定の検量線を示すグラフである。
リン濃度３Ｕ／ml)の０.２０−０.６０Ｍ塩濃度でのＡ
ＴIII測定の検量線を示すグラフである。
【図３】 実施例４において、ヘパリン１０００Ｕ／ml
濃度で、塩濃度とＡＴIII測定の検量線の関係を示すグ
ラフである。
濃度で、塩濃度とＡＴIII測定の検量線の関係を示すグ
ラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 試料に一定過剰のトロンビンを添加し、
ヘパリンおよび塩の存在下で反応を行わせた後、トロン
ビンの作用により発色する色原性基質を用いて残存トロ
ンビン活性を測定することよりなり、塩濃度を０.２０
Ｍを超え０.９０Ｍ以下の濃度とすることを特徴とする
アンチトロンビンIII活性の測定方法。 - 【請求項２】 トロンビン、ヘパリン、色原性基質およ
び塩よりなり、塩の量を、試料とトロンビンの反応液中
の塩濃度が０.２０を超え０.９０Ｍ以下となるような量
とすることを特徴とするアンチトロンビンIII活性測定
用試薬キット。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5157001A JPH078298A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法および該測定用試薬キット |
| PCT/JP1994/001024 WO1995000663A1 (fr) | 1993-06-28 | 1994-06-27 | Methode de titrage de l'activite de l'antithrombine iii et kit de reactifs conçu a cet effet |
| EP94918573A EP0657547B1 (en) | 1993-06-28 | 1994-06-27 | Method of assaying antithrombin iii activity |
| DE69427115T DE69427115T2 (de) | 1993-06-28 | 1994-06-27 | Verfahren zur messung der antithrombin-iii-aktivität |
| US08/381,882 US5646007A (en) | 1993-06-28 | 1994-06-27 | Method for determination of antithrombin III activity and reagent kit therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5157001A JPH078298A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法および該測定用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078298A true JPH078298A (ja) | 1995-01-13 |
Family
ID=15640022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5157001A Pending JPH078298A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法および該測定用試薬キット |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5646007A (ja) |
| EP (1) | EP0657547B1 (ja) |
| JP (1) | JPH078298A (ja) |
| DE (1) | DE69427115T2 (ja) |
| WO (1) | WO1995000663A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT825443E (pt) * | 1996-08-17 | 2001-08-30 | Aventis Behring Gmbh | Processo para a quantificacao de glicosaminoglicanos em solucoes contendo antitrombina iii |
| AU744025B2 (en) * | 1997-12-09 | 2002-02-14 | Sigma-Aldrich Co. | Plasma reference |
| US5985582A (en) * | 1997-12-09 | 1999-11-16 | Sigma-Aldrich Co. | Thrombin-based assay for antithrombin III |
| DE10239821A1 (de) * | 2002-08-29 | 2004-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Verbesserung der Spezifität bei der Bestimmung von Antithrombin |
| US20050090804A1 (en) * | 2003-10-22 | 2005-04-28 | Trivascular, Inc. | Endoluminal prosthesis endoleak management |
| DE102006035580A1 (de) * | 2006-07-27 | 2008-02-14 | Csl Behring Gmbh | Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin in AT III-haltigen Präparationen |
| WO2012016216A2 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | Shire Human Genetic Therapies | Assays for detection of glycosaminoglycans |
| WO2013116677A2 (en) * | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Assays for detection of glycosaminoglycans |
| CN102690862B (zh) * | 2012-06-08 | 2015-01-28 | 上海太阳生物技术有限公司 | 抗凝血酶ⅲ(at-ⅲ)测定试剂盒(发色底物法) |
| ES2442246B1 (es) * | 2012-08-07 | 2015-03-18 | Fundacion Para La Formacion E Investigacion Sanitarias De La Region De Murcia | Método de cuantificación de la glicoforma beta de antitrombina |
| CN103604766A (zh) * | 2013-11-25 | 2014-02-26 | 牡丹江友搏药业股份有限公司 | 一种疏血通注射液的生物学质控方法 |
| CN106153612A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-11-23 | 上海贞元诊断用品科技有限公司 | 抗凝血酶活性检测试剂及其制备方法和应用 |
| CN112662735B (zh) * | 2020-12-28 | 2022-10-14 | 北京美创新跃医疗器械有限公司 | 一种抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4473639A (en) * | 1982-09-15 | 1984-09-25 | Miles Laboratories, Inc. | Reagent strip test for antithrombin-III |
| CA1254119A (en) * | 1984-07-20 | 1989-05-16 | Lloyd A. Schick | Single step protease inhibitor assay |
| DE3572179D1 (en) * | 1984-09-21 | 1989-09-14 | Boehringer Ingelheim Int | Blood coagulation inhibiting proteins, process for preparing them and their use |
| US4948724A (en) * | 1985-09-05 | 1990-08-14 | Yin E Thye | Composition, kit and method for assaying heparin and a method for making the composition |
| DE3531778A1 (de) * | 1985-09-06 | 1987-03-12 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von proteaseinhibitoren |
| US5248596A (en) * | 1987-02-25 | 1993-09-28 | Miles Inc. | Method of detecting proteolytically modified antithrombin |
| US5221614A (en) * | 1988-03-03 | 1993-06-22 | Nippon Shoji Kabushiki Kaisha | Method and reagent for determining the biological activity of antithrombin III by measuring coagulation time |
| WO1989008150A1 (en) * | 1988-03-03 | 1989-09-08 | Nippon Shoji Kabushiki Kaisha | Method for measuring biological activity of antithrombin iii and reagents for the measurement |
| US5320945A (en) * | 1989-07-14 | 1994-06-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of antithrombin III |
| DE3923340A1 (de) * | 1989-07-14 | 1991-01-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von antithrombin iii |
-
1993
- 1993-06-28 JP JP5157001A patent/JPH078298A/ja active Pending
-
1994
- 1994-06-27 DE DE69427115T patent/DE69427115T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-27 US US08/381,882 patent/US5646007A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-27 EP EP94918573A patent/EP0657547B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-27 WO PCT/JP1994/001024 patent/WO1995000663A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69427115D1 (de) | 2001-05-23 |
| US5646007A (en) | 1997-07-08 |
| EP0657547A4 (en) | 1997-12-10 |
| WO1995000663A1 (fr) | 1995-01-05 |
| EP0657547A1 (en) | 1995-06-14 |
| DE69427115T2 (de) | 2001-08-30 |
| EP0657547B1 (en) | 2001-04-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040330 |