JPH0758291B2 - アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および／または測定するための均質方法およびその方法に使用するキット - Google Patents
アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および／または測定するための均質方法およびその方法に使用するキットInfo
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- JPH0758291B2 JPH0758291B2 JP61504184A JP50418486A JPH0758291B2 JP H0758291 B2 JPH0758291 B2 JP H0758291B2 JP 61504184 A JP61504184 A JP 61504184A JP 50418486 A JP50418486 A JP 50418486A JP H0758291 B2 JPH0758291 B2 JP H0758291B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明はアナライト（Analyte）が存在している可能
性のある媒体中で、アナライトを検出および／または測
定するための均質方法、さらには、その方法に使用する
キットに関する。
性のある媒体中で、アナライトを検出および／または測
定するための均質方法、さらには、その方法に使用する
キットに関する。
生物学的液体中で循環している有機または生物学的物質
の存在または濃度を測定することは、多数の疾病の診断
での１つの重要な段階である。
の存在または濃度を測定することは、多数の疾病の診断
での１つの重要な段階である。
この測定に通常使用される方法の１つは、アナライト、
即ち、検出または測定すべき物質と、このアナライトに
特異的に結合し得る物質であるアナライトレセプターと
の間の錯体の形成に基づいている。こうして形成された
錯体は標識した試薬によって明らかにされる。
即ち、検出または測定すべき物質と、このアナライトに
特異的に結合し得る物質であるアナライトレセプターと
の間の錯体の形成に基づいている。こうして形成された
錯体は標識した試薬によって明らかにされる。
この方法には、例えば「モノクローナル アンチボディ
ーズ アンド ディベロップメント イン イムノアッ
セイ（Monoclonal Antibodies and Development in Imm
unoassay）」、エルセビーア（Elsevier）1981年の３〜
21頁にアール エキンズ（R.EKINS）が記載した、「競
合による」または「過剰による」、所謂、免疫学的測定
方法が含まれる。使用する試薬は、特に、放射性元素，
酵素またはルミネセンス化合物、例えば、螢光，化学発
光またはりん光化合物などの助けによって標識されてい
る。それ故、ここでは、放射線免疫学的方法，免疫酵素
的方法またはルミネセンス（螢光，りん光または化学発
光）を用いる免疫学的方法を参照する。
ーズ アンド ディベロップメント イン イムノアッ
セイ（Monoclonal Antibodies and Development in Imm
unoassay）」、エルセビーア（Elsevier）1981年の３〜
21頁にアール エキンズ（R.EKINS）が記載した、「競
合による」または「過剰による」、所謂、免疫学的測定
方法が含まれる。使用する試薬は、特に、放射性元素，
酵素またはルミネセンス化合物、例えば、螢光，化学発
光またはりん光化合物などの助けによって標識されてい
る。それ故、ここでは、放射線免疫学的方法，免疫酵素
的方法またはルミネセンス（螢光，りん光または化学発
光）を用いる免疫学的方法を参照する。
所謂、競合による免疫学的測定方法では、標識アナライ
トが存在し得る媒体は、一定量の標識アナライトの存在
下，アナライトレセプターの不足下でインキュベートす
る。
トが存在し得る媒体は、一定量の標識アナライトの存在
下，アナライトレセプターの不足下でインキュベートす
る。
次いで、レセプターに対する競合が標的アナライトと標
識アナライトとの間で生起する。次いで、結合した標識
アナライトを含有するフラクションを、遊離標識アナラ
イトを含有するフラクションから分離し、１つまたは他
のフラクション中の標識アナライト量を測定する。
識アナライトとの間で生起する。次いで、結合した標識
アナライトを含有するフラクションを、遊離標識アナラ
イトを含有するフラクションから分離し、１つまたは他
のフラクション中の標識アナライト量を測定する。
所謂、過剰による測定方法では、標的アナライトに対し
て異なる特異性を有する２つのレセプターを使用し、そ
の際、レセプターの１つは標識されている。これらの方
法は、また、結合した標識レセプターを含有するフラク
ションを、遊離標識レセプターを含有するフラクション
から分離する段階も必要である。
て異なる特異性を有する２つのレセプターを使用し、そ
の際、レセプターの１つは標識されている。これらの方
法は、また、結合した標識レセプターを含有するフラク
ションを、遊離標識レセプターを含有するフラクション
から分離する段階も必要である。
このため、測定を非常に高い感度で迅速に行うべく、分
離段階を省略する種々の方法が探索され、所謂、「均
質」方法が開発された。
離段階を省略する種々の方法が探索され、所謂、「均
質」方法が開発された。
免疫学的測定の分野では、螢光を用いての均質方法はあ
まりなされていない。
まりなされていない。
各均質螢光方法は、標識レセプターとアナライトが結合
すると螢光性分子の放出特性が変更されるという事実に
基づいている。
すると螢光性分子の放出特性が変更されるという事実に
基づいている。
例えば、螢光偏光では、放出光の偏光を測定する。この
偏光は螢光分子を有する分子構造の大きさによって変動
する。
偏光は螢光分子を有する分子構造の大きさによって変動
する。
他の均質方法は、２つの発色体間のエネルギー移動の現
象に基づいており、フランス特許2282115に記載されて
いる。この方法では、供与体発色体の放出スペクトルと
受容体発色体の励起スペクトルが重複する場合（エネル
ギー適合性）および２つの発色体間の距離が一般的に10
0Å未満である場合には、供与体発色体から受容体発色
体へのエネルギー移動が生起する。同様に、フランス特
許2422165に記載されている方法は、化学発光分子が近
いが衝突を起こさない距離、即ち、一般的には100Å未
満の距離にあるとき、化学発光による光放出を変更し得
る抑制剤および化学発光トレーサを使用する。
象に基づいており、フランス特許2282115に記載されて
いる。この方法では、供与体発色体の放出スペクトルと
受容体発色体の励起スペクトルが重複する場合（エネル
ギー適合性）および２つの発色体間の距離が一般的に10
0Å未満である場合には、供与体発色体から受容体発色
体へのエネルギー移動が生起する。同様に、フランス特
許2422165に記載されている方法は、化学発光分子が近
いが衝突を起こさない距離、即ち、一般的には100Å未
満の距離にあるとき、化学発光による光放出を変更し得
る抑制剤および化学発光トレーサを使用する。
しかしながら、これらの方法には欠点がある。偏光の場
合には、標的アナライトの大きさに関連した制限があ
る。エネルギー移動を使用する方法では、アナライトと
レセプターを両方共標識しなければならず、そして、受
容体のルミネセンスの放出が供与体のルミネセンスの測
定を妨げる。更に、この場合には、すべての発色体対を
選択できるわけではない（エネルギー適合性）。
合には、標的アナライトの大きさに関連した制限があ
る。エネルギー移動を使用する方法では、アナライトと
レセプターを両方共標識しなければならず、そして、受
容体のルミネセンスの放出が供与体のルミネセンスの測
定を妨げる。更に、この場合には、すべての発色体対を
選択できるわけではない（エネルギー適合性）。
米国特許4318707およびシバ（SYVA）名義の公開ヨーロ
ッパ特許出願明細書0017908に記載されている、螢光を
用いる均質測定方法にも言及することもできる。
ッパ特許出願明細書0017908に記載されている、螢光を
用いる均質測定方法にも言及することもできる。
米国特許4318707に記載されている方法では、励起強度
を減じおよび／または電気的に励起可能な分子の放出強
度を減じ得る粒子を使用する。
を減じおよび／または電気的に励起可能な分子の放出強
度を減じ得る粒子を使用する。
公開ヨーロッパ特許出願明細書0017908による方法は、
発色物質を、発色源がその発色活性を保持しているフラ
クションと発色活性が阻止されているフラクションとに
分布させる能力に基づいており、その際、分布の程度は
測定媒体中のアナライトの濃度に依存する。
発色物質を、発色源がその発色活性を保持しているフラ
クションと発色活性が阻止されているフラクションとに
分布させる能力に基づいており、その際、分布の程度は
測定媒体中のアナライトの濃度に依存する。
更に、螢光化合物の構造の近傍または内部にヨウ素原子
のような重原子か存在すると、その螢光が減少するとい
うことが知られている。
のような重原子か存在すると、その螢光が減少するとい
うことが知られている。
この極く一般的な効果は文献、例えば、ニューヨーク州
エム デッカー（M.Dekker）の、ギルボートル（G.G.
Guilbault））編集の「フルオレセンス（Fluorescenc
e）」、1967年、中のイー エル ホエリー（E.L.WEHR
Y）によって記載されている。その技術水準によれば、
この効果は、螢光分子が天然に重原子を含有するとき、
重原子を化学的に螢光分子に導入するとき、または重原
子が測定媒体の溶液中に存在するときに観察される。こ
の重原子効果のメカニズムは、重原子が分子外にある場
合にはあまり良くは知られていない。しかしながら、螢
光分子が重原子を含有する（天然に存在するかまたは化
学的に導入した）場合、この現象は、重原子を含有して
いないホモローグと比較して上記螢光分子のスピン軌道
カップリングの増加によって説明され、そして、これは
非光放射系間遷移 および光放射系間遷移T1 *→Soの増加をもたらすが、非
光放射内部変換 の増加も生じさせる。重原子の存在による螢光の減少が
全ての場合に観察され、りん光の変更は分子および測定
条件が可能なときに観察される。この効果の具体的な例
は、フルオレセインがトリョードチロニン（T3）または
テトラヨードチロニン（T4）ような多ヨード化分子に化
学的に結合しているときに観察される、フルオレセイン
の量子生成の減少である。これは内部重原子の効果であ
る。
エム デッカー（M.Dekker）の、ギルボートル（G.G.
Guilbault））編集の「フルオレセンス（Fluorescenc
e）」、1967年、中のイー エル ホエリー（E.L.WEHR
Y）によって記載されている。その技術水準によれば、
この効果は、螢光分子が天然に重原子を含有するとき、
重原子を化学的に螢光分子に導入するとき、または重原
子が測定媒体の溶液中に存在するときに観察される。こ
の重原子効果のメカニズムは、重原子が分子外にある場
合にはあまり良くは知られていない。しかしながら、螢
光分子が重原子を含有する（天然に存在するかまたは化
学的に導入した）場合、この現象は、重原子を含有して
いないホモローグと比較して上記螢光分子のスピン軌道
カップリングの増加によって説明され、そして、これは
非光放射系間遷移 および光放射系間遷移T1 *→Soの増加をもたらすが、非
光放射内部変換 の増加も生じさせる。重原子の存在による螢光の減少が
全ての場合に観察され、りん光の変更は分子および測定
条件が可能なときに観察される。この効果の具体的な例
は、フルオレセインがトリョードチロニン（T3）または
テトラヨードチロニン（T4）ような多ヨード化分子に化
学的に結合しているときに観察される、フルオレセイン
の量子生成の減少である。これは内部重原子の効果であ
る。
重原子が化学的結合によって螢光分子に固定されている
のではなく、測定媒体の溶液中に存在している場合に
は、ルミネセンス分子のスピン軌道カップリングの上昇
は螢光分子の重原子との衝突か、または荷電移動による
弱い錯体形成のいずれかによるものと考えられている。
それは実際に、ルミネセンス分子のシステム間遷移、 およびT1 *→Soの上昇によって明らかになるので、重原
子効果はりん光分子の強度をときには上昇させ、ときに
は減少させるが、螢光分子の強度は常に減少させられ
る。
のではなく、測定媒体の溶液中に存在している場合に
は、ルミネセンス分子のスピン軌道カップリングの上昇
は螢光分子の重原子との衝突か、または荷電移動による
弱い錯体形成のいずれかによるものと考えられている。
それは実際に、ルミネセンス分子のシステム間遷移、 およびT1 *→Soの上昇によって明らかになるので、重原
子効果はりん光分子の強度をときには上昇させ、ときに
は減少させるが、螢光分子の強度は常に減少させられ
る。
この内部重原子効果は既に螢光分析法による均質測定法
で利用されている。ここで、リガンド類似体と螢光化合
物間に形成される共役体を使用するこのタイプの方法を
記載したヨーロッパ特許出願15695を引用する。その方
法では、リガンド類似体は上述の螢光分子を消滅させ得
る重原子を本来有しており、上記共役体は共有結合的に
巨大分子ポリサッカロイドに結合している。この場合に
は、重原子含有分子と抗体との特異的な結合によって阻
止が減少し、その結果螢光が上昇する。
で利用されている。ここで、リガンド類似体と螢光化合
物間に形成される共役体を使用するこのタイプの方法を
記載したヨーロッパ特許出願15695を引用する。その方
法では、リガンド類似体は上述の螢光分子を消滅させ得
る重原子を本来有しており、上記共役体は共有結合的に
巨大分子ポリサッカロイドに結合している。この場合に
は、重原子含有分子と抗体との特異的な結合によって阻
止が減少し、その結果螢光が上昇する。
重原子効果はルミネセンスを用いてアナライトを検出お
よび／または測定するための均質方法で有利に使用し得
ることがみいだされた。その際、重原子は測定媒体の溶
液中に存在せず、また、ルミネセンス分子と固定してい
ない。
よび／または測定するための均質方法で有利に使用し得
ることがみいだされた。その際、重原子は測定媒体の溶
液中に存在せず、また、ルミネセンス分子と固定してい
ない。
驚くべきことに、実際、ルミネセンス分子が使用する試
薬の１つに結合し、一方もう１つの試薬が少なくとも１
つの重原子を含有するユニットを有するときには、競合
または過剰による免疫学的測定では、系間遷移がルミネ
センス分子中で生起することがみいだされた。
薬の１つに結合し、一方もう１つの試薬が少なくとも１
つの重原子を含有するユニットを有するときには、競合
または過剰による免疫学的測定では、系間遷移がルミネ
センス分子中で生起することがみいだされた。
それ故、一般的観点から、この発明は、アナライトと少
なくとも１つの対応するレセプターとの反応生成物を明
らかにすることによって、アナライトが存在する可能性
のある媒体中でアナライトを検出および／または測定す
るための方法に関し、この方法は、アナライトについて
のレセプターからなる第１の試薬と、アナライトの反応
生成物の少なくとも１つの成分およびそれについての少
なくとも１つのレセプターからなる第２の試薬とを、そ
れらのうちの一方をルミネセンス化合物とカップリング
したものとするとともに他方を重原子または重原子含有
ユニットを有したものとして、媒体に添加し、第１およ
び第２の試薬の各々を添加した後、または、第１および
第２の試薬の両者を添加した後に、媒体をインキュベー
トし、インキュベートされて得られた媒体を励起し、媒
体が平衡状態または運動状態にあるとき、重原子または
重原子含有ユニットによる重原子効果により変化せしめ
られるものとして、ルミネセンス化合物から放出される
信号を測定する、 ことからなっている。
なくとも１つの対応するレセプターとの反応生成物を明
らかにすることによって、アナライトが存在する可能性
のある媒体中でアナライトを検出および／または測定す
るための方法に関し、この方法は、アナライトについて
のレセプターからなる第１の試薬と、アナライトの反応
生成物の少なくとも１つの成分およびそれについての少
なくとも１つのレセプターからなる第２の試薬とを、そ
れらのうちの一方をルミネセンス化合物とカップリング
したものとするとともに他方を重原子または重原子含有
ユニットを有したものとして、媒体に添加し、第１およ
び第２の試薬の各々を添加した後、または、第１および
第２の試薬の両者を添加した後に、媒体をインキュベー
トし、インキュベートされて得られた媒体を励起し、媒
体が平衡状態または運動状態にあるとき、重原子または
重原子含有ユニットによる重原子効果により変化せしめ
られるものとして、ルミネセンス化合物から放出される
信号を測定する、 ことからなっている。
この明細書では以下の定義を適用する。
−「アナライト」：検出および／または測定すべき類似
体物質の任意の物質または群。
体物質の任意の物質または群。
−「レセプター」：上記アナライト上の部位に特異的に
固定し得る任意の物質。
固定し得る任意の物質。
−「ルミネセンス化合物」：一定の波長でまたは一定の
化合物によって励起させたときに光を放出し得る任意の
物質。
化合物によって励起させたときに光を放出し得る任意の
物質。
−「重原子」：原子番号の大きい原子で、ルミネセンス
分子の近傍に存在すると、ルミネセンス分子のスピン軌
道カップリングを増加させ得る原子。この発明の目的に
適合し得る重原子と決定される例には、特に、ハロゲン
原子，水銀，タリウム，鉛および銀がある。
分子の近傍に存在すると、ルミネセンス分子のスピン軌
道カップリングを増加させ得る原子。この発明の目的に
適合し得る重原子と決定される例には、特に、ハロゲン
原子，水銀，タリウム，鉛および銀がある。
−「少なくとも１個の重原子を含有するユニット」：少
なくも１個の重原子を天然に含有するか、または、少な
くとも１個の重原子が固定し得る任意の物質。
なくも１個の重原子を天然に含有するか、または、少な
くとも１個の重原子が固定し得る任意の物質。
更に、「アナライトの反応生成物の成分および少なくと
も１つのアナライトレセプター」の表現は、使用した方
法のタイプにより、アナライトまたは少なくとも１つの
アナライトレセプターを表す。
も１つのアナライトレセプター」の表現は、使用した方
法のタイプにより、アナライトまたは少なくとも１つの
アナライトレセプターを表す。
アナライトは生物学的または非生物学的種類のものであ
り得る。アナライトは、特に、抗体，抗原，毒素，酵
素，例えば、蛋白質Ａの如くの蛋白質，ホルモン，ステ
ロイド，アビジン，ビオチン，微生物およびハプテンの
ような生物学的物質並びに医薬品のようなリガンドと特
異的に結合し得る非生物学的物質を抱合する。
り得る。アナライトは、特に、抗体，抗原，毒素，酵
素，例えば、蛋白質Ａの如くの蛋白質，ホルモン，ステ
ロイド，アビジン，ビオチン，微生物およびハプテンの
ような生物学的物質並びに医薬品のようなリガンドと特
異的に結合し得る非生物学的物質を抱合する。
この発明方法によって検出し得るアナライトの例は、参
照文献としてこの明細書に引用した公開ヨーロッパ特許
出願明細書0017908に記載されている。
照文献としてこの明細書に引用した公開ヨーロッパ特許
出願明細書0017908に記載されている。
このようなアナライトの特別の例は：副腎皮質刺激ホル
モン（ACTH），抗利尿ホルモン（ADH），アルドステロ
ン，アルブミン、環状AMP,アンドロステンジオン，アン
ジオテンシン，抗チログロブリン抗体，炭水化物抗原CA
-125,CA19−９およびCA15−3,コルチゾル，ジゴキシ
ン，ジギトキシン，エストリオール，フェリチン，ガス
トリン，成長ホルモン（HGH），胎盤性泌乳刺激ホルモ
ン（PHL），インシュリン，メソトレキセート，ミオグ
ロビン，上皮小体ホルモン，蛋白酵素原,17−アルファ
−ヒドロプロゲステロン，チログロブリン，チロキシン
結合グロブリン，グルカゴン，トリプシン,HBeおよび抗
HBe肝炎,HBsおよび抗HBs肝炎，デルタ−および抗−デル
タ−粒子，トランスフェリン,IgG,IgM,IgA,C3,ハプトグ
ロブリン，セルロプラスミン，アルファ１抗トリプシ
ン，リウマチ様因子であり、更に詳細には、癌胚性抗原
（CEA），アルファ−フィートプロティン（AFP），エス
トラジオール，プロゲステロン，テストステロン，甲状
腺刺激ホルモン（TSH），トリヨードチロシン（T3），
遊離トリヨードチロシン（FT3），チロキシン（T4），
遊離チロキシン（FT4），プロラクチン黄体化ホルモン
（LH），卵胞成熟ホルモン（SFH），総IgEである。
モン（ACTH），抗利尿ホルモン（ADH），アルドステロ
ン，アルブミン、環状AMP,アンドロステンジオン，アン
ジオテンシン，抗チログロブリン抗体，炭水化物抗原CA
-125,CA19−９およびCA15−3,コルチゾル，ジゴキシ
ン，ジギトキシン，エストリオール，フェリチン，ガス
トリン，成長ホルモン（HGH），胎盤性泌乳刺激ホルモ
ン（PHL），インシュリン，メソトレキセート，ミオグ
ロビン，上皮小体ホルモン，蛋白酵素原,17−アルファ
−ヒドロプロゲステロン，チログロブリン，チロキシン
結合グロブリン，グルカゴン，トリプシン,HBeおよび抗
HBe肝炎,HBsおよび抗HBs肝炎，デルタ−および抗−デル
タ−粒子，トランスフェリン,IgG,IgM,IgA,C3,ハプトグ
ロブリン，セルロプラスミン，アルファ１抗トリプシ
ン，リウマチ様因子であり、更に詳細には、癌胚性抗原
（CEA），アルファ−フィートプロティン（AFP），エス
トラジオール，プロゲステロン，テストステロン，甲状
腺刺激ホルモン（TSH），トリヨードチロシン（T3），
遊離トリヨードチロシン（FT3），チロキシン（T4），
遊離チロキシン（FT4），プロラクチン黄体化ホルモン
（LH），卵胞成熟ホルモン（SFH），総IgEである。
この発明の方法で使用するルミネセンス化合物は、螢
光，化学発光またはりん光化合物からなる群から選択す
ることができる。
光，化学発光またはりん光化合物からなる群から選択す
ることができる。
使用することができる螢光化合物は、300nmを越える、
好ましくは400または450nmを越える波長で光を吸収し、
400nmを越えて104より大きい吸光係数を有する任意の化
合物である。
好ましくは400または450nmを越える波長で光を吸収し、
400nmを越えて104より大きい吸光係数を有する任意の化
合物である。
この発明の目的に適合するもう１つのクラスの螢光化合
物は、ピレン誘導体のような寿命の長い螢光性有機分子
および螢光性希土類キレートとされる。
物は、ピレン誘導体のような寿命の長い螢光性有機分子
および螢光性希土類キレートとされる。
この発明の目的に適合する螢光化合物の例は、特に、ヨ
ーロッパ特許15695および米国特許3998943に記載されて
おり、これら特許は参照としてこの明細書に加える 特に好ましい螢光化合物は、本出願人によるフランス特
許出願8414799に記載されたフルオレセイン，フルオレ
セイン イソシアネート並びに希土類キレートおよび希
土類クリプテートである。
ーロッパ特許15695および米国特許3998943に記載されて
おり、これら特許は参照としてこの明細書に加える 特に好ましい螢光化合物は、本出願人によるフランス特
許出願8414799に記載されたフルオレセイン，フルオレ
セイン イソシアネート並びに希土類キレートおよび希
土類クリプテートである。
この発明による方法では、ルミネセンスおよびアクリジ
ニウムエステルのような化学ルミネセンス化合物（メソ
ッズインエンザイモロジー（MethodsinEnzymology）197
8,57,424）、または、オキサレートとヒドロジェンペリ
オキシドとの反応生成物により励起されるフルオレセイ
ンのような螢光化合物（Acc.Chem.Res.1969.280）を用
いることができる。
ニウムエステルのような化学ルミネセンス化合物（メソ
ッズインエンザイモロジー（MethodsinEnzymology）197
8,57,424）、または、オキサレートとヒドロジェンペリ
オキシドとの反応生成物により励起されるフルオレセイ
ンのような螢光化合物（Acc.Chem.Res.1969.280）を用
いることができる。
例えば、エリスロシンおよびエオシンのようなりん光化
合物（Biochem.J.1979,183,50）も、この発明の目的の
ルミネセンス化合物として適切である。
合物（Biochem.J.1979,183,50）も、この発明の目的の
ルミネセンス化合物として適切である。
ヨウ素化合物であるエリスロシンおよびエオシンも、少
なくとも１つの重原子を含有するユニットとして使用で
きることが注目される。
なくとも１つの重原子を含有するユニットとして使用で
きることが注目される。
試薬の１つとルミネセンス化合物のカップリングは、上
記試薬とルミネセンス化合物間の共有結合を生じさせる
ように、慣用のカップリング法により実施される。ルミ
ネセンス化合物を試薬の１つに、吸着によって固定させ
ることも可能である。
記試薬とルミネセンス化合物間の共有結合を生じさせる
ように、慣用のカップリング法により実施される。ルミ
ネセンス化合物を試薬の１つに、吸着によって固定させ
ることも可能である。
試薬の１つに存在する重原子は、例えば、ハロゲンの場
合の直接的置換，芳香族核のような生物学的分子中に存
在するユニットでの置換、または、重原子含有ユニット
を試薬に固定することによって導入することができる。
これらのユニットを、蛋白質に通常使用される任意のカ
ップリング法、例えば、キレート剤によってか、また
は、英国特許2109407に記載されているような水銀の場
合でのジスルフィッドブリッジとのカップリングによっ
て固定させることができる。重原子は、例えば、エー
イー ボルトン（A.E.BOLTON）およびダブリュ エヌ
ハンター（W.N.HUNTER）の方法（Biochem.J.133,529,19
73）によるヨウ素化によって、第２の試薬に導入したヨ
ウ素原子であることが好ましい。
合の直接的置換，芳香族核のような生物学的分子中に存
在するユニットでの置換、または、重原子含有ユニット
を試薬に固定することによって導入することができる。
これらのユニットを、蛋白質に通常使用される任意のカ
ップリング法、例えば、キレート剤によってか、また
は、英国特許2109407に記載されているような水銀の場
合でのジスルフィッドブリッジとのカップリングによっ
て固定させることができる。重原子は、例えば、エー
イー ボルトン（A.E.BOLTON）およびダブリュ エヌ
ハンター（W.N.HUNTER）の方法（Biochem.J.133,529,19
73）によるヨウ素化によって、第２の試薬に導入したヨ
ウ素原子であることが好ましい。
重原子または少なくとも１個の重原子を含有するユニッ
トを、試薬の１つとのカップリングに適合する機能、お
よび、重原子または少なくとも１個の重原子を含有する
ユニットとのカップリングに適合する機能を有している
適当な分子によって、その試薬に固定することもでき
る。例えば、ポリペプチドは中間体分子として使用でき
（例えば、ポリリジン）、その際、試薬と重原子、また
は、少なくとも１個の重原子を含有するユニットとのカ
ップリング反応は、慣用のカップリング法によって実施
される。
トを、試薬の１つとのカップリングに適合する機能、お
よび、重原子または少なくとも１個の重原子を含有する
ユニットとのカップリングに適合する機能を有している
適当な分子によって、その試薬に固定することもでき
る。例えば、ポリペプチドは中間体分子として使用でき
（例えば、ポリリジン）、その際、試薬と重原子、また
は、少なくとも１個の重原子を含有するユニットとのカ
ップリング反応は、慣用のカップリング法によって実施
される。
このような中間体分子を使用すると、免疫反応性にあま
り影響を与えないで、試薬近辺の重原子数を増加させ
る。
り影響を与えないで、試薬近辺の重原子数を増加させ
る。
「少なくとも１個の重原子を含有するユニット」の例に
はサクシンイミドのヨウ素誘導体、例えば、以下の誘導
体がある。
はサクシンイミドのヨウ素誘導体、例えば、以下の誘導
体がある。
−Ｎ−〔3,5−ジョード−４−ヒドロキシフェニル）プ
ロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）
プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔２−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ア
セトキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔６−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ヘ
キシロキシ〕サクシンイミドエステル、 並びに、これら化合物とポリリジンのようなポリペプチ
ドとのカップリング生成物。
ロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）
プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔２−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ア
セトキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−〔６−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ヘ
キシロキシ〕サクシンイミドエステル、 並びに、これら化合物とポリリジンのようなポリペプチ
ドとのカップリング生成物。
これらヨウ素化した有機誘導体は、この発明に従う方法
で使用する試薬の適当な緩衝溶液にその誘導体を接触さ
せることによって上記試薬と直接結合させられる。
で使用する試薬の適当な緩衝溶液にその誘導体を接触さ
せることによって上記試薬と直接結合させられる。
この発明の方法の第１および第２の試薬は、同時にまた
は段階的に添加することができる。段階的に添加する場
合、媒体は有利には各試薬を添加する間でインキュベー
トする。
は段階的に添加することができる。段階的に添加する場
合、媒体は有利には各試薬を添加する間でインキュベー
トする。
励起段階は、運動中または平衡時に測定を行った後、後
のインキュベート中またはインキュベート後に実施す
る。
のインキュベート中またはインキュベート後に実施す
る。
この励起段階は、ルミネセンス化合物が、螢光またはり
ん光化合物であるときには光エネルギーを用いて、そし
て、ルミネセンス化合物が、化学発光化合物であるとき
には適当な化学的試薬を用いて実施する。
ん光化合物であるときには光エネルギーを用いて、そし
て、ルミネセンス化合物が、化学発光化合物であるとき
には適当な化学的試薬を用いて実施する。
光エネルギーによる励起段階は、使用した螢光またはり
ん光化合物の吸収スペクトル内の波長で行う。
ん光化合物の吸収スペクトル内の波長で行う。
光励起段階は慣用方法で、または、振動化方法で、例え
ば、米国特許4.058.732でウィーダー（WIEDER）が開示
した方法に従って実施することができることに注目すべ
きである。この後者の場合には、分析すべき媒体中に含
まれる物質および分析材料のような周囲物質の衰退寿命
と比較して、ルミネセンス（螢光またはりん光）減退寿
命が長いルミネセンス化合物を使用することが必要であ
る。この減退寿命は１μsec.より長いことが好ましい。
勿論、励起期間は選択したルミネセンス化合物のルミネ
センス衰退寿命より短くすべきである。フランス特許出
願84.14.799に開示されているもののような、希土類キ
レートまたは希土類クリプテートを長い螢光衰退寿命
（または長い半減期）を有する螢光化合物として使用す
ることが有利である。
ば、米国特許4.058.732でウィーダー（WIEDER）が開示
した方法に従って実施することができることに注目すべ
きである。この後者の場合には、分析すべき媒体中に含
まれる物質および分析材料のような周囲物質の衰退寿命
と比較して、ルミネセンス（螢光またはりん光）減退寿
命が長いルミネセンス化合物を使用することが必要であ
る。この減退寿命は１μsec.より長いことが好ましい。
勿論、励起期間は選択したルミネセンス化合物のルミネ
センス衰退寿命より短くすべきである。フランス特許出
願84.14.799に開示されているもののような、希土類キ
レートまたは希土類クリプテートを長い螢光衰退寿命
（または長い半減期）を有する螢光化合物として使用す
ることが有利である。
一方、この発明の方法は液相で実施され、そして螢光ま
たはりん光の測定がストリップのような固体相、ゲルま
たは他の任意の好適な支持体に反応媒体を沈着させた後
で行われることに注目すべきである。
たはりん光の測定がストリップのような固体相、ゲルま
たは他の任意の好適な支持体に反応媒体を沈着させた後
で行われることに注目すべきである。
それ故、過剰方法の場合には、この発明の方法は、 標的アナライトを含有した媒体に、ルミネセンス化合物
とカップリングした、アナライトについてのレセプター
からなる第１の試薬を添加し、重原子または重原子含有
ユニットを有した、アナライトについての１つまたは複
数の他のレセプターからなる第２の試薬を媒体に添加
し、第１および第２の試薬の各々を添加した後、また
は、第１および第２の試薬の両者を添加した後に、媒体
をインキュベートし、インキュベートされて得られた媒
体を励起し、媒体が平衡状態または運動状態にあるとき
放出されるルミネセンス化合物からの信号を測定する、 ことからなる。
とカップリングした、アナライトについてのレセプター
からなる第１の試薬を添加し、重原子または重原子含有
ユニットを有した、アナライトについての１つまたは複
数の他のレセプターからなる第２の試薬を媒体に添加
し、第１および第２の試薬の各々を添加した後、また
は、第１および第２の試薬の両者を添加した後に、媒体
をインキュベートし、インキュベートされて得られた媒
体を励起し、媒体が平衡状態または運動状態にあるとき
放出されるルミネセンス化合物からの信号を測定する、 ことからなる。
競合方法の場合には、この発明の方法は、 標的アナライトを含有した媒体に、重原子または重原子
含有ユニットを有した、アナライトについてのレセプタ
ーからなる第１の試薬を添加し、ルミネセンス化合物と
カップリングしたアナライトからなる第２の試薬を媒体
に添加し、第１および第２の試薬の各々を添加した後、
または、第１および第２の試薬の両者を添加した後に、
媒体をインキュベートし、インキュベートされて得られ
た媒体を励起し、媒体が平衡状態または運動状態にある
とき放出されるルミネセンス化合物からの信号を測定す
る、 ことからなる。
含有ユニットを有した、アナライトについてのレセプタ
ーからなる第１の試薬を添加し、ルミネセンス化合物と
カップリングしたアナライトからなる第２の試薬を媒体
に添加し、第１および第２の試薬の各々を添加した後、
または、第１および第２の試薬の両者を添加した後に、
媒体をインキュベートし、インキュベートされて得られ
た媒体を励起し、媒体が平衡状態または運動状態にある
とき放出されるルミネセンス化合物からの信号を測定す
る、 ことからなる。
競合方法の場合のこの発明方法のもう１つの実施態様に
よれば、標的アナライトを含有する媒体を上記アナライ
トのレセプターからなる第１の試薬と共に最初にインキ
ュベートし、その際、上記レセプターは、ルミネセンス
化合物とカップリングしており、そして、重原子または
重原子を含有するユニットを有するアナライトを第２の
試薬として添加し、その後の段階は上述したものと同様
である。
よれば、標的アナライトを含有する媒体を上記アナライ
トのレセプターからなる第１の試薬と共に最初にインキ
ュベートし、その際、上記レセプターは、ルミネセンス
化合物とカップリングしており、そして、重原子または
重原子を含有するユニットを有するアナライトを第２の
試薬として添加し、その後の段階は上述したものと同様
である。
この発明に従う方法は、過剰または競合による抗原また
はハプテンの免疫学的測定に特に適している。例えば、
競合による抗原またはハプテンの測定には、第１の試薬
として、フルオレセインで標識した、もしくは、ヨウ素
化した対応する抗体、および、ヨウ素化した、もしく
は、フルオレセインで標識した一定量の抗原を使用す
る。
はハプテンの免疫学的測定に特に適している。例えば、
競合による抗原またはハプテンの測定には、第１の試薬
として、フルオレセインで標識した、もしくは、ヨウ素
化した対応する抗体、および、ヨウ素化した、もしく
は、フルオレセインで標識した一定量の抗原を使用す
る。
過剰による抗原、または、ハプテンの測定には標的抗原
またはハプテンに対して異なる特異性を有する２つの抗
体を使用し、その際、一方はフルオレセインで標識され
ており、もう一方はヨウ素化されている。勿論、このタ
イプの測定では、上述したような他の螢光化合物および
少なくとも１個の重原子を含有する他のユニットを使用
することも可能である。
またはハプテンに対して異なる特異性を有する２つの抗
体を使用し、その際、一方はフルオレセインで標識され
ており、もう一方はヨウ素化されている。勿論、このタ
イプの測定では、上述したような他の螢光化合物および
少なくとも１個の重原子を含有する他のユニットを使用
することも可能である。
この発明は更に、 測定すべきアナライトについての少なくとも１つのレセ
プターからなる第１の試薬と、アナライトの反応生成物
の少なくとも１つの成分およびそれについての少なくと
も１つのレセプターからなる第２の試薬とを、それらの
うちの一方をルミネセンス化合物とカップリングしたも
のとするとともに他方を重原子または少なくとも１つの
重原子を含有するユニットを有したものとして含むとと
もに、標準曲線を作成するための、測定すべきアナライ
トの既知量を含有する標準試薬、および、測定に必要な
稀釈剤または緩衝液を含むものとされてなるキットに関
する。
プターからなる第１の試薬と、アナライトの反応生成物
の少なくとも１つの成分およびそれについての少なくと
も１つのレセプターからなる第２の試薬とを、それらの
うちの一方をルミネセンス化合物とカップリングしたも
のとするとともに他方を重原子または少なくとも１つの
重原子を含有するユニットを有したものとして含むとと
もに、標準曲線を作成するための、測定すべきアナライ
トの既知量を含有する標準試薬、および、測定に必要な
稀釈剤または緩衝液を含むものとされてなるキットに関
する。
ルミネセンス化合物が化学発光化合物である場合、この
発明によるキットは更に、励起に必要な適当な化学的試
薬も含有する。
発明によるキットは更に、励起に必要な適当な化学的試
薬も含有する。
この発明は、ここに、下記の非制限的な実施例によって
更に詳細に説明する。その際、検出または測定すべき物
質は抗体または抗原である。
更に詳細に説明する。その際、検出または測定すべき物
質は抗体または抗原である。
これらの実施例では、次の化合物を使用した。
−マイルス（Miles）社のラビットガンマグロブリン
（γRG）、 −γRGで免疫化したシープ抗血清をDEAE−セルロースカ
ラムを通過させて得られた、抗ラビットシープガンマグ
ロブリン（γARSG）、 −pH7.4の0.1Mりん酸塩緩衝液中10mg/mlの濃度のヒュー
マン血清アルブミン（HSA）、 −３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸のリン
ゴ酸エステル（NHSPP:ボルトン（Bolton）及びハンター
（Hunter）試薬）、 −メタ重亜硫酸ナトリウム、 −ヨウ素発生剤として、1,3,4,6−テトラクロロ−3a,6a
−ジフェニルアセチレン尿素、 −イオン交換剤としてワットマン（Whatman）DE 52 DEA
E−セルロース、 −PD10ファルマシア（Pharmacia）の濾過ゲルのカラ
ム、 −りん酸塩緩衝液（PB）、 螢光測定はパーキン−エルマー（Perkin-Elmer）LS 5,
2.5/10nmのスリットで、495nmでの励起,529nmでの放出
および拡大ファクター15で行った、 −オリスインダストリ−エス エイ（ORIS INDUSTRIE S
A）社製で「エルザプロル（ELSA PROL）」の名称で市場
で入手し得るプロラクチンのイムノラジオメトリック試
薬用のキットに含まれている抗プロラクチンモノクロー
ナル抗体抗体E1および3D3、並びに、 −オリス インダストリー エス エイ社製で「エルザ
シイ（ELSA CEA）」の名称で市場で入手し得る癌胚抗
原のイムノラジオメトリック試薬用のキットに含まれて
いる抗CEAモノクローナル抗体G12,G13およびG15。
（γRG）、 −γRGで免疫化したシープ抗血清をDEAE−セルロースカ
ラムを通過させて得られた、抗ラビットシープガンマグ
ロブリン（γARSG）、 −pH7.4の0.1Mりん酸塩緩衝液中10mg/mlの濃度のヒュー
マン血清アルブミン（HSA）、 −３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸のリン
ゴ酸エステル（NHSPP:ボルトン（Bolton）及びハンター
（Hunter）試薬）、 −メタ重亜硫酸ナトリウム、 −ヨウ素発生剤として、1,3,4,6−テトラクロロ−3a,6a
−ジフェニルアセチレン尿素、 −イオン交換剤としてワットマン（Whatman）DE 52 DEA
E−セルロース、 −PD10ファルマシア（Pharmacia）の濾過ゲルのカラ
ム、 −りん酸塩緩衝液（PB）、 螢光測定はパーキン−エルマー（Perkin-Elmer）LS 5,
2.5/10nmのスリットで、495nmでの励起,529nmでの放出
および拡大ファクター15で行った、 −オリスインダストリ−エス エイ（ORIS INDUSTRIE S
A）社製で「エルザプロル（ELSA PROL）」の名称で市場
で入手し得るプロラクチンのイムノラジオメトリック試
薬用のキットに含まれている抗プロラクチンモノクロー
ナル抗体抗体E1および3D3、並びに、 −オリス インダストリー エス エイ社製で「エルザ
シイ（ELSA CEA）」の名称で市場で入手し得る癌胚抗
原のイムノラジオメトリック試薬用のキットに含まれて
いる抗CEAモノクローナル抗体G12,G13およびG15。
実施例１ 重原子効果の証明 ａ） γRGのフルオレセイン標識 螢光化合物（FITC）1.44mgを水1mlに溶解し、pHを水酸
化ナトリウムで9.5にした。
化ナトリウムで9.5にした。
γRG24mgをpH7.4の0.05Mりん酸塩緩衝液2mlに溶解し、
螢光化合物を含有する溶液200μｌを加えた。反応は室
温で２時間行い、その際、pHは希水酸化ナトリウムで9.
5に維持した。
螢光化合物を含有する溶液200μｌを加えた。反応は室
温で２時間行い、その際、pHは希水酸化ナトリウムで9.
5に維持した。
次いで、反応混合物はpH7.4の0.05Mりん酸塩緩衝液で一
夜透析した。
夜透析した。
次いで、溶液は、pH7.4の0.05Mりん酸塩緩衝液で平衡化
したワットマン DE 52 DEAE−セルロースのカラムを通
過させた。
したワットマン DE 52 DEAE−セルロースのカラムを通
過させた。
種々のフラクションは塩分上昇勾配溶出（NaCl）により
溶出させた。フルオレセイン／蛋白質（γRG）のモル比
は式 で決定した。式中、 −AXは波長Ｘでの吸収であり、 −εはモル吸収係数をあらわし、 −ε495＝72,000、そして、 −ε280は重量／容量比で0.1％に対して1.4である。
溶出させた。フルオレセイン／蛋白質（γRG）のモル比
は式 で決定した。式中、 −AXは波長Ｘでの吸収であり、 −εはモル吸収係数をあらわし、 −ε495＝72,000、そして、 −ε280は重量／容量比で0.1％に対して1.4である。
移動相の塩度に従って得られた種々のフラクションを以
下に示す。
下に示す。
ｂ） γARSGのヨウ素標識 この標識化はアール ハンター（R.Hunter）（Proc.So
c.Exp.Biol.Med.133（３）,989,1970）のクロラミンＴ
法によって行った。次のものを３分間接触させた。
c.Exp.Biol.Med.133（３）,989,1970）のクロラミンＴ
法によって行った。次のものを３分間接触させた。
−3.5mg/mlの濃度のγARSG200μｌ −水中10-3Ｍの濃度のKI 100μｌ、および、 −水中10-2Ｍの濃度のクロラミンT 200μｌ、 次いで、10-2ＭのMBS水溶液200μｌを加えた。
得られた溶液は、pH7.5の0.05Mりん酸塩緩衝液で平衡化
したPD 10カラムに入れた（ポンプ効率:16ml/時間）。
カラム出口での検出は280nmで光学的密度を測定して行
った。最初のピークの頂点に対応するフラクションを集
めた。その▲γI ARSG▼濃度は0.24mg/mlであった。
したPD 10カラムに入れた（ポンプ効率:16ml/時間）。
カラム出口での検出は280nmで光学的密度を測定して行
った。最初のピークの頂点に対応するフラクションを集
めた。その▲γI ARSG▼濃度は0.24mg/mlであった。
ｃ） ヨウ素原子効果の証明 ３つの溶液を調整した。
インキュベーションを１時間30分行い、pH7.4の0.1Mり
ん酸塩緩衝液250μｌを加え、495nmでの励起で測定し
た。
ん酸塩緩衝液250μｌを加え、495nmでの励起で測定し
た。
系間遷移効率Ｅは式 （式中、Ｉは螢光の強度である）で決定した。
フラクションF/P＝3.5で得られた結果は、下表Ｉに示
す。これらはフルオレセイン分子の放出エネルギーの16
％が非放射的に移動したことを示している。使用したγ
ARSGの量が過剰量であるから、γRGは全て結合している
と考えられる。
す。これらはフルオレセイン分子の放出エネルギーの16
％が非放射的に移動したことを示している。使用したγ
ARSGの量が過剰量であるから、γRGは全て結合している
と考えられる。
実施例２ ポリヨード化したユニットの使用 NHSPPを幾らかベンゼン／アセトアルデヒド1:1混合物に
溶解し、1.3・10-2モル/lを含有する溶液を得た。
溶解し、1.3・10-2モル/lを含有する溶液を得た。
次のものを接触させた。
−管の底で蒸発させたNHSPP 100μｌ −γARSG 200μｌ 3mg/ml 反応は氷中で15分間進行させ、その後、次のものを添加
した。
した。
−KI（５・10-1Ｍ） 20μｌ −クロラミンＴ（５・10-2Ｍ） 20μｌ そして、５・10-2ＭのMBS20μｌを１分後に加えた。
この溶液をPD 10カラムに入れ、最初のピークの頂上部
を集めた。このものは280nmで0.527の光学的密度であっ
た。実施例１と同様の条件下で調整した３つの溶液の螢
光を495nmで励起して測定した。
を集めた。このものは280nmで0.527の光学的密度であっ
た。実施例１と同様の条件下で調整した３つの溶液の螢
光を495nmで励起して測定した。
下記表Ｉに示す結果から、本方法の効率がポリヨード化
ユニットを使用することで高められることが示される。
ユニットを使用することで高められることが示される。
実施例３ ａ） ヨウ素化した試薬の調整 次の化合物を管中で接触させた。
−NHSPP （10-3Ｍ） 100μｌ −KI （10-1Ｍ） 100μｌ −クロラミン （10-2Ｍ） 100μｌ 接触３分後に、MBS（10-2Ｍ）100μｌを加えた。
次いで、ジメチルホルムアミド20μｌを含有するベンゼ
ン各2mlで２回抽出した。有機層は別の管中で蒸発さ
せ、γARSG100μｌを加えた。反応は氷中で15分間行っ
た。混合物はPD 10カラムに入れた。採集したピークの
頂上部は280nmで光学的密度が0.1であった。
ン各2mlで２回抽出した。有機層は別の管中で蒸発さ
せ、γARSG100μｌを加えた。反応は氷中で15分間行っ
た。混合物はPD 10カラムに入れた。採集したピークの
頂上部は280nmで光学的密度が0.1であった。
ｂ） 重原子効果の証明 この▲γI ARSG▼フラクションは、▲γF G▼フラクショ
ン1/400,F/P＝3.5を用いて、実施例１と同様の比率の結
合溶液を調整するために使用した。
ン1/400,F/P＝3.5を用いて、実施例１と同様の比率の結
合溶液を調整するために使用した。
参照および遊離溶液は、実施例１と同様の条件下で別々
に調整した。螢光測定の結果は表Ｉに示す。
に調整した。螢光測定の結果は表Ｉに示す。
実施例４ 次のものを接触させた。
−NHSPP 10-2Ｍ 蒸発 100μｌ −CCl4中のヨウ素発生剤 ５・10-2Ｍ 蒸発 20μｌ −KI ５・10-2Ｍ 20μｌ −りん酸塩緩衝液 0.05M pH7.4 40μｌ １分間の接触時間後、ジメチルホルムアミド中のベンゼ
ン（１％）各1mlで２回抽出した。有機層を別の管で留
去し、γARSG10μｌを加え、その後反応を氷中で15分間
進行させた。形成した▲γI ARSG▼はpH7.4の0.05Mりん
酸塩緩衝液１で透析して分離した。
ン（１％）各1mlで２回抽出した。有機層を別の管で留
去し、γARSG10μｌを加え、その後反応を氷中で15分間
進行させた。形成した▲γI ARSG▼はpH7.4の0.05Mりん
酸塩緩衝液１で透析して分離した。
▲γI ARSG▼の1/10稀釈物は遊離溶液および▲γF RG▼、
1/400、F/P＝3.5の結合溶液を製造するために使用し、
実施例１に従って調整した。
1/400、F/P＝3.5の結合溶液を製造するために使用し、
実施例１に従って調整した。
得られた結果を表１に示す。
実施例５ γRGをフルオレセインで標識した効果を評価した。実施
例４に従ってヨウ素標識し、HASで1/20に稀釈したγ
ARSGおよび実施例１で調整した種々の▲γF RG▼フラシ
ョンを使用した。
例４に従ってヨウ素標識し、HASで1/20に稀釈したγ
ARSGおよび実施例１で調整した種々の▲γF RG▼フラシ
ョンを使用した。
螢光測定は実施例１の方法に従って行った。次の結果が
得られた。
得られた。
参照溶液の螢光は26.8であった。
その効果はγRG当たりのフルオレセイン数に従って増加
することが認められる。この増加は、フルオレセイン分
子間の分子間移動によってフルオレセインの励起状態の
エネルギー移動に関連する。
することが認められる。この増加は、フルオレセイン分
子間の分子間移動によってフルオレセインの励起状態の
エネルギー移動に関連する。
実施例６ 1/400に希釈したF/P＝5.5の▲γF RG▼を用いて実施例４
の方法に従って標識した抗体γARSGの稀釈曲線を作成し
た。
の方法に従って標識した抗体γARSGの稀釈曲線を作成し
た。
次の結果が得られた。
効率は稀釈度が増加するにつれて減少することが認めら
れる。
れる。
実施例７ 過剰による測定方法でのこの発明の方法の使
用 ａ） 抗プロラクチンモノクローナル抗体E1のフルオレ
セインによる標識 9.7mg/mlのE1溶液0.5mlを水0.5ml中でFITC（分子プロー
ブ）0.2mgと混合した。pHは水酸化ナトリウムで9.3に調
節した。反応は室温で３時間進行させ、pHは一定に保っ
た。次いで、溶液をpH7に中和し、pH7.4の0.05Mりん酸
塩緩衝液2lで２回、20時間透析した。
用 ａ） 抗プロラクチンモノクローナル抗体E1のフルオレ
セインによる標識 9.7mg/mlのE1溶液0.5mlを水0.5ml中でFITC（分子プロー
ブ）0.2mgと混合した。pHは水酸化ナトリウムで9.3に調
節した。反応は室温で３時間進行させ、pHは一定に保っ
た。次いで、溶液をpH7に中和し、pH7.4の0.05Mりん酸
塩緩衝液2lで２回、20時間透析した。
pH7.4の0.05Mりん酸塩緩衝液で平衡化した約15mlのDEAE
−セルロースゲルのカラムを作った。透析した反応媒体
をカラムに入れ、溶出はNaClに関してそれぞれ0.05M,0.
1M,0.2M,0.4M,0.7Mおよび1Mの緩衝液で実施し、緩衝液
のpHは7.4であった。
−セルロースゲルのカラムを作った。透析した反応媒体
をカラムに入れ、溶出はNaClに関してそれぞれ0.05M,0.
1M,0.2M,0.4M,0.7Mおよび1Mの緩衝液で実施し、緩衝液
のpHは7.4であった。
0.4MのNaClおよび0.7MのNaCl緩衝液で溶出したピークを
集め、透析した。
集め、透析した。
0.4M NaCl緩衝液で得られたピークで観察された光学的
密度は、280nmで0.184であり、495nmで0.167であった。
これは約90μg/mlの抗体濃度および約４のF/P比に対応
する。
密度は、280nmで0.184であり、495nmで0.167であった。
これは約90μg/mlの抗体濃度および約４のF/P比に対応
する。
ｂ） モノクロナール抗体3D3のヨウ素による標識 プロトコールは実施例４と同様である。次の製品を使用
した。
した。
−NHSPP （10-2Ｍ） 200μｌ −ヨウ素発生剤 （５・10-2Ｍ） 40μｌ −KI （５・10-2Ｍ） 40μｌ −りん酸塩緩衝液、0.05M、pH7.4 40μｌ 抽出はジメチルホルムアミド中１％の濃度のベンゼン各
1mlで２回実施した。留去後、3.3mg/mlの3D3を200μｌ
加え、反応は氷中で15分間進行させた。分離はPD 10の
カラムで行い、280nmで0.485の光学的密度を有するフラ
クションを回収した。その濃度は350μg/mlであった。
1mlで２回実施した。留去後、3.3mg/mlの3D3を200μｌ
加え、反応は氷中で15分間進行させた。分離はPD 10の
カラムで行い、280nmで0.485の光学的密度を有するフラ
クションを回収した。その濃度は350μg/mlであった。
ｃ） 過剰による測定 −5mg/mlのHSA溶液中３μg/mlの濃度の螢光性 E1（▲ＥF I▼）、 −同様のHSA溶液中110μg/mlの濃度のヨウ素標識した 3D3（3D3I）、 −同様のHSA溶液中110μg/mlの濃度の3D3、 −同様のHSA溶液中0.6μg/mlの濃度のプロラクチン、PR
L。
L。
次の３つの溶液を調整した。
−参照溶液 5mg/mlのHSA 150μｌ 各溶液は室温で２時間インキュベートし、HSA 100μｌ
およびりん酸塩緩衝液250μｌを添加した。
およびりん酸塩緩衝液250μｌを添加した。
実施例１の方法に従って行った螢光測定によって次の結
果が得られた。
果が得られた。
螢光 参照溶液 29.7 結合溶液I 197.3 結合溶液 231.1 Δ 33.8 Ｅ 0.17 それ故、競合方法（実施例１〜６）の場合と同じ現象
が、異なる特異性を有する２つの抗体を標識することに
よって、過剰方法（実施例７）で観察される。
が、異なる特異性を有する２つの抗体を標識することに
よって、過剰方法（実施例７）で観察される。
実施例８ 動力学的考察 ５μg/mlのHSA100μｌ中に0.6μg/mlのプロラクチンPRL
を含有する溶液および同様ではあるが濃度を変動させた
試薬▲ＥF I▼と3D3Iを使用して実施例７の測定を室温で
繰り返した。システム間移動の効率Ｅはインキュベーシ
ョン時間の関数として測定した。
を含有する溶液および同様ではあるが濃度を変動させた
試薬▲ＥF I▼と3D3Iを使用して実施例７の測定を室温で
繰り返した。システム間移動の効率Ｅはインキュベーシ
ョン時間の関数として測定した。
次の濃度を使用した。
得られた結果を添付の図１のグラフに示す。グラフで
は、インキュベーション時間（分）を横座標に、効率Ｅ
（％）を縦座標にプロットしている。
は、インキュベーション時間（分）を横座標に、効率Ｅ
（％）を縦座標にプロットしている。
これらの結果は、この発明の方法が動力学においても使
用できることを示している。
用できることを示している。
実施例９ 標準曲線 5mg/mlのHSA溶液中、600,150,75,30,7.5および0ng/mlを
含有する６個のPRL溶液を調整した。
含有する６個のPRL溶液を調整した。
各溶液50μｌは、室温で30分間３μg/mlの▲ＥF I▼50μ
ｌおよび120μg/mlの3D3I50μｌと共に管中でインキュ
ベートし、りん酸塩緩衝液350μｌを添加した。次い
で、阻止効率Ｅは5mg/mlのHSA150μｌからなる標準媒体
の値の関数として測定した。その際、１μＵ＝30ngで
る。
ｌおよび120μg/mlの3D3I50μｌと共に管中でインキュ
ベートし、りん酸塩緩衝液350μｌを添加した。次い
で、阻止効率Ｅは5mg/mlのHSA150μｌからなる標準媒体
の値の関数として測定した。その際、１μＵ＝30ngで
る。
得られた結果は添付の図２のグラフに示す。このグラフ
では、プロラクチンPRL濃度（ng/管）を横座標に、効率
Ｅ（％）を縦座標にプロットしている。
では、プロラクチンPRL濃度（ng/管）を横座標に、効率
Ｅ（％）を縦座標にプロットしている。
かくして、測定すべき各蛋白質の標準曲線を作成するこ
とができる。
とができる。
実施例10 この実施例は、抗CEA抗体G12,G13およびG15を使用して
実施した。
実施した。
ａ） 抗CEA抗体G12のフルオレセイン標識 使用したプロトコールは実施例7aと同様であった。透析
およびカラム溶出はpH8の0.01Mトリス（TRIS）緩衝液で
実施した。0.2および0.4M NaClで溶出したピークを回収
した。0.2で溶出したピークではF/Pの値は約2.75であっ
た。集めた溶液は800μg/mlに濃縮した。
およびカラム溶出はpH8の0.01Mトリス（TRIS）緩衝液で
実施した。0.2および0.4M NaClで溶出したピークを回収
した。0.2で溶出したピークではF/Pの値は約2.75であっ
た。集めた溶液は800μg/mlに濃縮した。
ｂ） G15のヨウ素による標識 プロトコールは実施例４と同様であった。次の製品を使
用した。
用した。
NHSPP （10-2Ｍ） 200μｌ ヨウ素発生剤 （５・10-2Ｍ） 40μｌ KI （５・10-2Ｍ） 40μｌ りん酸塩緩衝液 0.05M,pH7.4 40μｌ G15（5mg/ml） 200μｌ 280nmで0.84の光学的密度を有するフラクションを集め
た。その濃度は600μg/mlであった。
た。その濃度は600μg/mlであった。
ｃ） G13のヨウ素による標識 上記の方法に従って、280nmで0.35の光学的密度を有す
るフラクションを集めた。その濃度は250μg/mlであっ
た。
るフラクションを集めた。その濃度は250μg/mlであっ
た。
1ml当たり300ngのCEAを含有する標準液を使用した。
▲ＧF 12▼は5mg/mlのHSAで1/2000に稀釈した。
▲ＧI 15▼はHSAで1/6に稀釈した。
次の３つの溶液を調整した。
−参照溶液 HSA100μｌ＋緩衝液100μｌ これらの溶液は45℃で各１時間２回インキュベートし、
りん酸塩緩衝液300μｌを添加した。
りん酸塩緩衝液300μｌを添加した。
各溶液の螢光は495nmで励起して測定し、次の結果を得
た。
た。
溶液 螢光強度 効 率 参照溶液 44.5 Ｅ＝0.16 結合溶液 90.5 ΔＦ＝8.8 遊離溶液 99.3 それ故、特異性の異なる２つの抗体が抗原に結合してい
るとき、16％の阻止がある。
るとき、16％の阻止がある。
３番目のインキュベーションでは、G12およびG15とは特
異性の異なる抗体▲ＧI 13▼を添加して同様の実験を実
施した。
異性の異なる抗体▲ＧI 13▼を添加して同様の実験を実
施した。
次の溶液を試験した。
これらの溶液を45℃で各１時間３回インキュベートし、
りん酸塩緩衝液250μｌを加えた。次の結果が得られ
た。
りん酸塩緩衝液250μｌを加えた。次の結果が得られ
た。
溶液 螢光強度 効率 参照溶液 81 0.41 結合溶液 106.7 ΔＦ＝18.2 遊離溶液 124.9 これらの結果は、抗原のもう一方の部位をヨウ素化した
別の抗体が存在すると、フルオレセインで標識した抗体
G12の螢光阻止を増加させることを示す。
別の抗体が存在すると、フルオレセインで標識した抗体
G12の螢光阻止を増加させることを示す。
実施例11 標準曲線 300,200,100および0ng/mlの４つのCEA溶液を調整した。
各溶液はHSAで1/3000に希釈した▲ＧF 12▼並びにHSA溶
液でそれぞれ1/3および1/6に希釈した▲ＧI 13▼および
▲ＧI 15▼と共にインキュベートして、螢光を測定し
た。
各溶液はHSAで1/3000に希釈した▲ＧF 12▼並びにHSA溶
液でそれぞれ1/3および1/6に希釈した▲ＧI 13▼および
▲ＧI 15▼と共にインキュベートして、螢光を測定し
た。
次の結果が得られた。
実施例12 少なくとも１個の重原子を含有するユニット
としてのサクシンイミドのヨウ素化誘導体 Ａ サクシンイミドのヨウ素化誘導体の調整 ａ） 化合物1:式 のＮ−〔３−（3,5−ジョード−４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 Ｎ−〔３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニロキ
シ〕サクシンイミドエステル（出所：フルカ（FLUK
A））１×10-4モル（26.3mg）をベンゼンおよび酢酸エ
チルの混合物（50:50V/V）2.5mlに溶解し、その後ヨー
ドゲン （Ildogen）（出所：シグマ（SIGMA）２・10-4
モル（86.4mg）を１度に添加し、続いてりん酸塩緩衝液
（0.05M）（pH7.4）100μｌの溶液中のヨウ化カリウム8
3mgを添加した。明るい紫色が直ちに発現した。反応は2
0℃で攪拌しながら15分間（アルゴン下で）続けた。次
いで、反応は、反応媒体が消色するまでメタ重亜硫酸ナ
トリウムの水性飽和溶液を加えて停止させた。有機層を
傾瀉して分離し、次いで無水MgSO4で乾燥し、そして真
空下で留去した。残渣はCH2Cl2または無水ベンゼンで取
った。
としてのサクシンイミドのヨウ素化誘導体 Ａ サクシンイミドのヨウ素化誘導体の調整 ａ） 化合物1:式 のＮ−〔３−（3,5−ジョード−４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 Ｎ−〔３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニロキ
シ〕サクシンイミドエステル（出所：フルカ（FLUK
A））１×10-4モル（26.3mg）をベンゼンおよび酢酸エ
チルの混合物（50:50V/V）2.5mlに溶解し、その後ヨー
ドゲン （Ildogen）（出所：シグマ（SIGMA）２・10-4
モル（86.4mg）を１度に添加し、続いてりん酸塩緩衝液
（0.05M）（pH7.4）100μｌの溶液中のヨウ化カリウム8
3mgを添加した。明るい紫色が直ちに発現した。反応は2
0℃で攪拌しながら15分間（アルゴン下で）続けた。次
いで、反応は、反応媒体が消色するまでメタ重亜硫酸ナ
トリウムの水性飽和溶液を加えて停止させた。有機層を
傾瀉して分離し、次いで無水MgSO4で乾燥し、そして真
空下で留去した。残渣はCH2Cl2または無水ベンゼンで取
った。
次いで生成物はシリカゲルクロマトグラフィーで精製し
た。溶出剤はベンゼン／酢酸エチルの不連続勾配であっ
た。予期した生成物はベンゼンと酢酸エチルの混合物
（90:10V/V）で溶出した。化合物１の純度はC.C.M.（溶
出剤：トルエン／酢酸エチル1/1 V/V）で確認し、対
照、RF＝0.7と比較した。元素分析および質量分析は本
製品の構造と一致していた。収量:58％ ｂ） 化合物2:式 のＮ−〔３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）
プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 この化合物は化学物１について上述したようにして、下
記成分を以下に示した比率で使用して得られた。
た。溶出剤はベンゼン／酢酸エチルの不連続勾配であっ
た。予期した生成物はベンゼンと酢酸エチルの混合物
（90:10V/V）で溶出した。化合物１の純度はC.C.M.（溶
出剤：トルエン／酢酸エチル1/1 V/V）で確認し、対
照、RF＝0.7と比較した。元素分析および質量分析は本
製品の構造と一致していた。収量:58％ ｂ） 化合物2:式 のＮ−〔３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）
プロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、 この化合物は化学物１について上述したようにして、下
記成分を以下に示した比率で使用して得られた。
−Ｎ−〔３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニロ
キシ〕サクシンイミドエスエル、２・10-3モル（0.526
g） −ヨードゲン （シグマ）２・10-3モル（0.864g） −KI ４・10-3モル（0.584g） 0.05Mのりん酸塩緩衝液（pH7.4）500μｌ中得られた生
成物は化合物１と同様の精製および確認工程に付した。
キシ〕サクシンイミドエスエル、２・10-3モル（0.526
g） −ヨードゲン （シグマ）２・10-3モル（0.864g） −KI ４・10-3モル（0.584g） 0.05Mのりん酸塩緩衝液（pH7.4）500μｌ中得られた生
成物は化合物１と同様の精製および確認工程に付した。
ｃ） 化合物3:式 のＮ−〔２−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ア
セトキシ〕サクシンイミドエステル、 化合物３は次の反応図に従って、中間生成物Ａの精製お
よび単離を経て、２つの別々の工程で合成した。
セトキシ〕サクシンイミドエステル、 化合物３は次の反応図に従って、中間生成物Ａの精製お
よび単離を経て、２つの別々の工程で合成した。
化合物３ −Ａの合成 ジオキサン5ml溶液中のｐ−ヨードフェニルスルホクロ
リド８・10-3モル（2.4g）を、予め1Mの水酸化ナトリウ
ム（10ml）でpH9に調整し、氷浴中で冷却したグリココ
ール水溶液７・10-3モル（0.525g）に滴下しながら添加
した。添加が完了したとき、氷浴を除き、反応は攪拌し
ながら20℃で１時間続行させた（pHはpH計で確認し、反
応の間中pH9に再調整した。）。
リド８・10-3モル（2.4g）を、予め1Mの水酸化ナトリウ
ム（10ml）でpH9に調整し、氷浴中で冷却したグリココ
ール水溶液７・10-3モル（0.525g）に滴下しながら添加
した。添加が完了したとき、氷浴を除き、反応は攪拌し
ながら20℃で１時間続行させた（pHはpH計で確認し、反
応の間中pH9に再調整した。）。
反応終了時に、混合物はその容量の２倍の蒸留水で希釈
した。溶液は濾過して反応不溶性物質を除去した。濾液
は攪拌しながら6N塩酸を滴下してpH2に酸性化した。予
期した縮合生成物が白片で多量に沈澱した。粗生成物は
濾過し、次いで蒸留水で数回洗浄し、次いでP2O5の存在
下乾燥器中真空で一夜乾燥した。収量:73％（1.75g） 生成物の純度はC.C.M.および慣用の分光測定法によって
確認した。
した。溶液は濾過して反応不溶性物質を除去した。濾液
は攪拌しながら6N塩酸を滴下してpH2に酸性化した。予
期した縮合生成物が白片で多量に沈澱した。粗生成物は
濾過し、次いで蒸留水で数回洗浄し、次いでP2O5の存在
下乾燥器中真空で一夜乾燥した。収量:73％（1.75g） 生成物の純度はC.C.M.および慣用の分光測定法によって
確認した。
−化合物３の合成 予め、０℃に冷却した、THF 10ml中２ミリモルのＡ（0.
682g）および２ミリモルのＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ド（0.230g）の溶液に２ミリモルのジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC）（0.412g）を１度に加えた。反応
混合物は攪拌し、０℃の温度で１時間保った。１時間
後、冷却浴を除去し、反応混合物はフリットガラスNo.3
で濾過し、過液は真空中で留去した。白い泡からなる残
渣はCH2Cl3で取り、セライト （Celite）で濾過し、次
いで真空中で再び留去した。得られた粗生成物はCH2Cl2
で再結晶した。得られた重量:0.371g、収量42％。生成
物は慣用の分光測定法によって同一のものであることを
認め、その組成は百分法分析で確認した。
682g）および２ミリモルのＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ド（0.230g）の溶液に２ミリモルのジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC）（0.412g）を１度に加えた。反応
混合物は攪拌し、０℃の温度で１時間保った。１時間
後、冷却浴を除去し、反応混合物はフリットガラスNo.3
で濾過し、過液は真空中で留去した。白い泡からなる残
渣はCH2Cl3で取り、セライト （Celite）で濾過し、次
いで真空中で再び留去した。得られた粗生成物はCH2Cl2
で再結晶した。得られた重量:0.371g、収量42％。生成
物は慣用の分光測定法によって同一のものであることを
認め、その組成は百分法分析で確認した。
化合物4: ｄ） 式 のＮ−〔６−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）ヘ
キシロキシ〕サクシンシイミドエステル、 化合物４の合成は次の反応図に従って中間生成物Ｂの単
離を経て２工程で行った。
キシロキシ〕サクシンシイミドエステル、 化合物４の合成は次の反応図に従って中間生成物Ｂの単
離を経て２工程で行った。
１） Ｂの合成： 5mlのジオキサン溶液中５ミリモル（1.52g）のｐ−ヨー
ドフェニルスルホクロリドを、予め1MNaOH 10mlでpH9に
調整し氷浴で冷却した７ミリモル（0.918g）の５−アミ
ノカプロン酸（フルカ）水溶液に滴下しながら添加し
た。
ドフェニルスルホクロリドを、予め1MNaOH 10mlでpH9に
調整し氷浴で冷却した７ミリモル（0.918g）の５−アミ
ノカプロン酸（フルカ）水溶液に滴下しながら添加し
た。
ヨウ素化した試薬を添加した後、氷浴を除去し、反応は
20℃で３時間続けた（pHはやはり上記実施例と同様に反
応の間中確認した。）。
20℃で３時間続けた（pHはやはり上記実施例と同様に反
応の間中確認した。）。
次いで、反応混合物はフリットガラスNo.3で濾過し、濾
液は12N HCl数滴でp14に酸性化した。次いで、予期した
生成物Ｂが多量沈澱した。この生成物を濾過し、濾過物
を多量の蒸留水で洗浄し、脱水し、最後に乾燥器中P2O5
で真空下で一夜乾燥した。得られた重量:1.30g、収量:6
8％。生成物の純度はC.C.M.（シリカ）で確認し、溶出
剤はCHCl3／メタノール（3:1v/v）であった。融点は154
±１℃であった。生成物の構造は百分法分析により確認
した。
液は12N HCl数滴でp14に酸性化した。次いで、予期した
生成物Ｂが多量沈澱した。この生成物を濾過し、濾過物
を多量の蒸留水で洗浄し、脱水し、最後に乾燥器中P2O5
で真空下で一夜乾燥した。得られた重量:1.30g、収量:6
8％。生成物の純度はC.C.M.（シリカ）で確認し、溶出
剤はCHCl3／メタノール（3:1v/v）であった。融点は154
±１℃であった。生成物の構造は百分法分析により確認
した。
２） 化合物４の合成 この合成は次の成分を用いて、化合物３について示した
ようにして行った。
ようにして行った。
−生成物Ｂ ２ミリモル（0.762g） −Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド３ミリモル（0.345g） −D.C.C. ３ミリモル（0.614g） −THF溶媒 10ml 反応は４℃で１時間および20℃で一夜であった。
生成物の精製は化合物３と同様であった。得られた重
量:0.840g、収量:91％。純度はC.C.M.（溶出剤、酢酸エ
チル／CH2Cl2（1:1））および百分法分析によって確認
した。生成物の構造は分光光度測定法I.R.および質量分
析によって決定した。これは記載の化合物４について予
期した構造と一致していた。
量:0.840g、収量:91％。純度はC.C.M.（溶出剤、酢酸エ
チル／CH2Cl2（1:1））および百分法分析によって確認
した。生成物の構造は分光光度測定法I.R.および質量分
析によって決定した。これは記載の化合物４について予
期した構造と一致していた。
Ｂ サクシンイミド誘導体の抗体とのカップリング 抗体3D3（抗−プロラクチン抗体）をこの実施例では使
用した。
用した。
0.05Mのりん酸塩緩衝液（pH:7.4）200μｌおよび0.01M
のホウ酸緩衝液（pH9）200μｌ溶液中の１・10-6モル3D
3（10mg/ml）を、予めCH2Cl2に溶解したヨウ素化した試
薬（化合物１）2mgに加え、蒸発させて反応管の壁上に
被覆を形成させた。カップリング反応は20℃で１時間攪
拌しながら続行させた。次いで、１時間後にヨウ素標識
した3D3はPD 10のカラムでのクロマトグラフィによって
精製し、標識抗体に相当するピーク（カラムの溶出容
量）を単離した。次いで、その濃度を280nmでの吸収度
によって測定した。
のホウ酸緩衝液（pH9）200μｌ溶液中の１・10-6モル3D
3（10mg/ml）を、予めCH2Cl2に溶解したヨウ素化した試
薬（化合物１）2mgに加え、蒸発させて反応管の壁上に
被覆を形成させた。カップリング反応は20℃で１時間攪
拌しながら続行させた。次いで、１時間後にヨウ素標識
した3D3はPD 10のカラムでのクロマトグラフィによって
精製し、標識抗体に相当するピーク（カラムの溶出容
量）を単離した。次いで、その濃度を280nmでの吸収度
によって測定した。
単離した標識抗体は150μg/mlの濃度で螢光阻止試験に
使用した。
使用した。
これは化合物３および４について示したようにして行っ
た。
た。
類似の方法に従って、化合物２は抗CEA抗体G15とカップ
リングさせた。この目的のために、抗体G15（6.5mg/ml
で200μｌ）は200μｌの化合物２（CH2Cl2 3.75ml中1.2
4mg、ついで、管の底で留去して200μｌ）および200μ
ｌのホウ酸緩衝液（pH9）と接触させた。混合物は周囲
温度で１時間30分インキュベートした。
リングさせた。この目的のために、抗体G15（6.5mg/ml
で200μｌ）は200μｌの化合物２（CH2Cl2 3.75ml中1.2
4mg、ついで、管の底で留去して200μｌ）および200μ
ｌのホウ酸緩衝液（pH9）と接触させた。混合物は周囲
温度で１時間30分インキュベートした。
Ｃ プロラクチンの過剰による用量 使用した試薬は次のとおりである。
3D3 I抗体:5g/lのHSAで希釈して150μg/ml;5mg/mlの濃度
のラビットガンマグロブリン溶液中1/100°〔１μg/m
l〕に希釈した▲ＥF 1▼抗体。
のラビットガンマグロブリン溶液中1/100°〔１μg/m
l〕に希釈した▲ＥF 1▼抗体。
プロラクチン抗原（イムノテック（Immunotech）供
給）;5g/lのHSA溶液中に0.5μg/ml。
給）;5g/lのHSA溶液中に0.5μg/ml。
−稀釈剤： −50mMのりん酸塩緩衝液（pH7.4）溶液中のラビットガ
ンマグロブリン（濃度5g/l） −50mMのりん酸塩緩衝液中のHSA（濃度5g/l） −対照:HSA（5g/l）＋精製の溶出溶液（50:50v/v） 次の３つの溶液を調整した。
ンマグロブリン（濃度5g/l） −50mMのりん酸塩緩衝液中のHSA（濃度5g/l） −対照:HSA（5g/l）＋精製の溶出溶液（50:50v/v） 次の３つの溶液を調整した。
−対照溶液 γGL 50μｌ HSA 50μｌ 対照 50μｌ −結合溶液 ▲ＥF 1▼ 50μｌ プラクチン 50μｌ 3D3 I 50μｌ −遊離溶液 E1 50μｌ HSA 50μｌ 3D3 I 50μｌ 各溶液は20℃で１時間インキュベートした。次いで、読
み取りを行う前に、0.05Mのりん酸塩緩衝液（pH7.4）35
0μｌをそれぞれに加えた。螢光測定は496nm（励起）お
よび520nm（放出）でフルオロメータを用いて行い、効
率Ｅを決定した。
み取りを行う前に、0.05Mのりん酸塩緩衝液（pH7.4）35
0μｌをそれぞれに加えた。螢光測定は496nm（励起）お
よび520nm（放出）でフルオロメータを用いて行い、効
率Ｅを決定した。
得られた結果は次表に示す。
Ｄ CEA抗原の過剰による測定 プロラクチンの代わりにCEA抗原を用い、次の試薬を使
用して上記方法を繰り返した。
用して上記方法を繰り返した。
ヨウ素化した試薬：この溶液は化合物２を用いてＢ項で
得た。溶液はPD 10で精製した後、0.10mg/mlに調整し
た。
得た。溶液はPD 10で精製した後、0.10mg/mlに調整し
た。
螢光試薬:G12の溶液はフルオレセインで標識し:1/2000
に稀釈した。
に稀釈した。
インキュベーションは45℃で２時間実施した。得られた
結果も次の表に示す。
結果も次の表に示す。
実施例13 少なくとも１個の重原子を含有するユニット
としての、ポリペプチドおよびヨウ素化有機分子間のカ
ップリング生成物の使用 この実施例では、ポリリジンおよびジョード化化合物１
間のカップリング生成物を調整した。このカップリング
生成物は、以後、試薬Ａと称する。
としての、ポリペプチドおよびヨウ素化有機分子間のカ
ップリング生成物の使用 この実施例では、ポリリジンおよびジョード化化合物１
間のカップリング生成物を調整した。このカップリング
生成物は、以後、試薬Ａと称する。
試薬Ａは次の統計的式によって示される。
式中 ｎ＝327 ｋ＝50 Ａ 試薬Ａの合成 シグマケミカルズ（Sigma Chemicals）供給のポリリジ
ン塩酸塩（分子量＝4800）5mg（1.04・10-7モル）を0.0
1Mのホウ酸塩緩衝液（pH8.9）500μｌに溶解した。その
後、得られた溶液のpHを水酸化ナトリウム（0.5M）で12
に調整し、上記化合物１のCH2Cl2溶液を留去して、予め
試験管の底部に沈着させた上記化合物12.7μｌ（5.1・1
0--6）に加えた。反応は攪拌下20℃で１時間続けた。
ン塩酸塩（分子量＝4800）5mg（1.04・10-7モル）を0.0
1Mのホウ酸塩緩衝液（pH8.9）500μｌに溶解した。その
後、得られた溶液のpHを水酸化ナトリウム（0.5M）で12
に調整し、上記化合物１のCH2Cl2溶液を留去して、予め
試験管の底部に沈着させた上記化合物12.7μｌ（5.1・1
0--6）に加えた。反応は攪拌下20℃で１時間続けた。
反応生成物は50mMのりん酸塩緩衝液を用いてPD 10（セ
ファデックス（Swphades）G25）で溶出した。回収フラ
クションは遠沈して90μｌ用量に濃縮した。
ファデックス（Swphades）G25）で溶出した。回収フラ
クションは遠沈して90μｌ用量に濃縮した。
Ｂ 試薬Ａと抗体3D3とのカップリング 25mMのりん酸塩緩衝液（pH5）120μｌを試薬A80μｌに
加え、その後、カルボジイミド溶液（2mg/水ml）100μ
ｌに加えた。
加え、その後、カルボジイミド溶液（2mg/水ml）100μ
ｌに加えた。
２〜３分後、抗体3D3溶液（50mMのりん酸塩緩衝液（pH
7.4）中9.6mg/mlの3D3200μｌ＋200mMのりん酸塩緩衝液
（pH8）200μｌ）400μｌを加えた。
7.4）中9.6mg/mlの3D3200μｌ＋200mMのりん酸塩緩衝液
（pH8）200μｌ）400μｌを加えた。
インキュベーションは、20℃で１時間、ついで、４℃で
一夜、そして20℃で１時間行った。
一夜、そして20℃で１時間行った。
分離は、溶出剤として50mMのりん酸塩緩衝液（pH7.4）
を使用してPD10のカラムで実施した。
を使用してPD10のカラムで実施した。
このカラムの溶出用量から、280nmで0.742の光学的密度
を有する溶液（1ml）を集めた。この溶液の抗体濃度は5
30μg/mlであると推計された。上記展開物を実施例12に
記載した螢光阻止試験に付した。
を有する溶液（1ml）を集めた。この溶液の抗体濃度は5
30μg/mlであると推計された。上記展開物を実施例12に
記載した螢光阻止試験に付した。
異なる溶液の螢光強度は次のとおりであった。
参照溶液 16 結合溶液 134 遊離溶液 150 効率Ｅ 11.9％
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−44628（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，23（６）, （1984），ｐ1202−７ Ｂｏｌｃｈｅｍ．Ｊ．，133．（1973）, ｐ529 Ｃａｎ．Ｊ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，28 （３），（1983），ｐ100−３
Claims (18)
- 【請求項１】アナライトと該アナライトに対応するレセ
プターとの反応生成物を明らかにすることによって、ア
ナライトが存在している可能性のある媒体中のアナライ
トを検出および／または測定する均質方法であって、 上記アナライトについてのレセプターからなる第１の試
薬と、上記アナライトの反応生成物の少なくとも１つの
成分およびそれについての少なくとも１つのレセプター
からなる第２の試薬とを、該第１および第２の試薬のう
ちの一方をルミネセンス化合物とカップリングしたもの
とするとともに他方を重原子または重原子含有ユニット
を有したものとして、上記媒体に添加し、上記第１およ
び第２の試薬の各々を添加した後、または、上記第１お
よび第２の試薬の両者を添加した後に、上記媒体をイン
キュベートし、 インキュベートされて得られた媒体を励起し、 上記媒体が平衡状態または運動状態にあるとき、上記重
原子または重原子含有ユニットによる重原子効果により
変化せしめられるものとして、上記ルミネセンス化合物
から放出される信号を測定すること、 を特徴とする方法。 - 【請求項２】過剰方法からなる特許請求の範囲第１項記
載の方法であって、 ルミネセンス化合物とカップリングした、アナライトに
ついてのレセプターからなる第１の試薬を、標的アナラ
イトを含有した媒体に添加し、 重原子または重原子含有ユニットを有した、上記アナラ
イトについての１つまたは複数の他のレセプターからな
る第２の試薬を、上記媒体に添加し、 上記第１および第２の試薬の各々を添加した後、また
は、上記第１および第２の試薬の両者を添加した後に、
上記媒体をインキュベートし、 インキュベートされて得られた媒体を励起し、 上記媒体が平衡状態または運動状態にあるとき放出され
る上記ルミネセンス化合物からの信号を測定すること、 を特徴とする方法。 - 【請求項３】競合方法からなる特許請求の範囲第１項記
載の方法であって、 標的アナライトを含有する媒体に、重原子または重原子
含有ユニットを有した、上記アナライトについてのレセ
プターからなる第１の試薬を添加し、 ルミネセンス化合物とカップリングしたアナライトから
なる第２の試薬を、上記媒体に添加し、 上記第１および第２の試薬の各々を添加した後、また
は、上記第１および第２の試薬の両者を添加した後に、
上記媒体をインキュベートし、 インキュベートされて得られた媒体を励起し、 上記媒体が平衡状態または運動状態にあるとき放出され
る上記ルミネセンス化合物からの信号を測定すること、 を特徴とする方法。 - 【請求項４】競合方法からなる特許請求の範囲第１項記
載の方法であって、 標的アナライトを含有する媒体に、上記アナライトにつ
いての、ルミネセンス化合物とカップリングしたレセプ
ターからなる第１の試薬を添加し、 重原子または重原子含有ユニットを有したアナライトか
らなる第２の試薬を、上記媒体に添加し、 上記第１および第２の試薬の各々を添加した後、また
は、上記第１および第２の試薬の両者を添加した後に、
上記媒体をインキュベートし、 インキュベートされて得られた媒体を励起し、 上記媒体が平衡状態または運動状態にあるとき放出され
る上記ルミネセンス化合物からの信号を測定すること、 を特徴とする方法。 - 【請求項５】アナライトが、生物学的または非生物学的
物質であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項か
ら４項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】アナライトが、抗体，抗原，毒素，酵素，
蛋白質，ホルモン，ステロイド，アビジン，ビオチン，
微生物およびハプテン、並びに医薬品のようなリガンド
と特異的に結合し得る非生物学的物質からなる群の中か
ら選択されることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
から４項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】アナライトがプロラクチンまたは癌胚抗原
であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項から５
項までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】ルミネセンス化合物が、螢光、化学発光ま
たはりん光化合であることを特徴とする、特許請求の範
囲第１項から６項までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】ルミネセンス化合物が、フルオレセイン並
びに希土類クリプテートおよびキレートからなる群から
選択した螢光化合物であることを特徴とする、特許請求
の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項１０】第１および第２の試薬の一方がフルオレ
セインで標識され、他方がヨウ素化されていることを特
徴とする、特許請求の範囲第１項から８項までのいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１１】ルミネセンス化合物が長い発光衰退寿命
を有し、かつ、得られた媒体の励起がパルス励起である
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項から９項まで
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】ルミネセンス化合物が希土類クリプテー
トであることを特徴とする、特許請求の範囲第10項記載
の方法。 - 【請求項１３】競合方法によって抗原またはハプテンを
測定するための、特許請求の範囲第１項および第３項か
ら12項までのいずれかに記載の方法であって、標的抗原
を含有する媒体を、一定量のヨウ素化抗原の存在下で対
応するフルオレセイン標識抗体と共にインキュベートす
ることからなることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】競合方法によって抗原またはハプテンを
測定するための、特許請求の範囲第１項および第３項か
ら13項までのいずれかに記載の方法であって、一定量の
フルオレセイン標識抗原の存在下で、標的抗原を含有す
る媒体を、対応するヨウ素化抗体と共にインキュベート
することからなることを特徴とする方法。 - 【請求項１５】過剰方法によって抗原またはハプテンを
測定するための、特許請求の範囲第１項,2項および５項
から14項までのいずれかに記載の方法であって、標識抗
原を含有する媒体を第１のフルオレセイン標識抗体と共
に、一定量の第２のヨウ素化抗体の存在下で（両抗体は
標的抗原に対し特異性が異なる）、またはその逆でイン
キュベートすることからなることを特徴とする方法。 - 【請求項１６】アナライトが存在する可能性のある媒体
中のアナライトの液相での均質的検出および／または測
定用キットであって、 測定すべきアナライトについての少なくとも１つのレセ
プターからなる第１の試薬と、上記アナライトの反応生
成物の少なくとも１つの成分およびそれについての少な
くとも１つのレセプターからなる第２の試薬とを、該第
１および第２の試薬のうちの一方をルミネセンス化合物
とカップリングしたものとするとともに他方を重原子ま
たは少なくとも１つの重原子を含有するユニットを有し
たものとして含むとともに、 標準曲線を作成するための、上記測定すべきアナライト
の既知量を含有する標準試薬、および、測定に必要な稀
釈剤または緩衝液を含むこと、 を特徴とするキット。 - 【請求項１７】ルミネセンス化合物が化学発光性化合物
であることを特徴とする、特許請求の範囲第16項記載の
キット。 - 【請求項１８】プロラクチンまたは癌胚性抗原を測定す
るためのものとされたことを特徴とする特許請求の範囲
第16項または第17項記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR85/11905 | 1985-08-02 | ||
| FR8511905A FR2585836B1 (fr) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | Procede homogene de detection et/ou de determination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir |
| PCT/FR1986/000269 WO1987000927A1 (fr) | 1985-08-02 | 1986-07-31 | Procede homogene de detection et/ou de determination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63500399A JPS63500399A (ja) | 1988-02-12 |
| JPH0758291B2 true JPH0758291B2 (ja) | 1995-06-21 |
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ID=9321947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61504184A Expired - Fee Related JPH0758291B2 (ja) | 1985-08-02 | 1986-07-31 | アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および／または測定するための均質方法およびその方法に使用するキット |
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| JP (1) | JPH0758291B2 (ja) |
| KR (1) | KR880700270A (ja) |
| AU (1) | AU595821B2 (ja) |
| CA (1) | CA1279260C (ja) |
| ES (1) | ES2000593A6 (ja) |
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| IE (1) | IE59302B1 (ja) |
| IL (1) | IL79592A0 (ja) |
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| JPH0737986B2 (ja) * | 1988-03-29 | 1995-04-26 | 松下電器産業株式会社 | 免疫的検出方法 |
| JP2599974B2 (ja) * | 1988-09-13 | 1997-04-16 | 積水化学工業株式会社 | 音声検出方式 |
| JP2559475B2 (ja) * | 1988-09-22 | 1996-12-04 | 積水化学工業株式会社 | 音声検出方式 |
| CA2384519C (en) * | 1991-03-04 | 2006-08-15 | Bayer Corporation | Automated analyzer |
| FR2768817B1 (fr) * | 1997-09-19 | 1999-12-10 | Cis Bio Int | Methode homogene pour la detection et/ou la determination de l'activite phosphorylante d'un materiel biologique |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5144628A (ja) * | 1974-08-12 | 1976-04-16 | Syva Co |
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| US4318707A (en) * | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
| CA1121345A (en) * | 1979-03-05 | 1982-04-06 | Robert A. Yoshida | Method for competitive protein binding assays inhibiting non-specific interference |
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-
1985
- 1985-08-02 FR FR8511905A patent/FR2585836B1/fr not_active Expired
-
1986
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- 1986-07-31 KR KR1019870700284A patent/KR880700270A/ko not_active Application Discontinuation
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- 1986-08-01 CA CA000515159A patent/CA1279260C/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３（６），（１９８４），ｐ１２０２−７ |
| Ｂｏｌｃｈｅｍ．Ｊ．，１３３．（１９７３），ｐ５２９ |
| Ｃａｎ．Ｊ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，２８（３），（１９８３），ｐ１００−３ |
Also Published As
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