JPH0755961B2 - Novel hyaluronic acid derivative and method for producing the same - Google Patents
Novel hyaluronic acid derivative and method for producing the sameInfo
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- JPH0755961B2 JPH0755961B2 JP1277040A JP27704089A JPH0755961B2 JP H0755961 B2 JPH0755961 B2 JP H0755961B2 JP 1277040 A JP1277040 A JP 1277040A JP 27704089 A JP27704089 A JP 27704089A JP H0755961 B2 JPH0755961 B2 JP H0755961B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は新規なヒアルロン酸誘導体及びその製造方法
に関するものであり、更に詳細には、アシル基が導入さ
れた、Ｄ−グルコサミンを主たる構成糖とするヒアルロ
ン酸誘導体及びその製造方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel hyaluronic acid derivative and a method for producing the same, and more specifically, to an acyl group-introduced sugar containing D-glucosamine as a main constituent. And a method for producing the same.
（従来の技術及びその問題点） 薬理的又は生理体に対する各種活性物質、例えば医薬成
分や、香粧品成分を含有するリポソーム等のマイクロカ
プセルを多糖類で被覆することにより、そのカプセルに
含有された活性成分の作用を効果的に発現させると共
に、そのカプセルを安定化させる試みがなされている。(Prior art and its problems) By coating various microcapsules such as liposomes containing various active substances for pharmacological or physiological bodies, such as pharmaceutical ingredients and cosmetic ingredients with polysaccharides, they were contained in the capsules. Attempts have been made to effectively develop the action of active ingredients and to stabilize the capsules.
例えば、特開昭59−210013号公報には、レシチンを構成
成分として含むリポソームを、遊離もしくはカルボキシ
メチル化したヒアルロン酸で被覆した例が開示されてい
る。しかし、このヒアルロン酸もしくはカルボキシメチ
ル化ヒアルロン酸で被覆されたリポソームは、その被覆
がリポソームを構成するレシチンとの静電的な結合によ
るため、周囲のpHや塩濃度によりヒアルロン酸の被覆が
容易に解離してしまうという問題点があり好ましくな
い。For example, JP-A-59-210013 discloses an example in which a liposome containing lecithin as a constituent is coated with hyaluronic acid free or carboxymethylated. However, in the case of the liposome coated with hyaluronic acid or carboxymethylated hyaluronic acid, the coating is electrostatically bound to lecithin that constitutes the liposome, so that the hyaluronic acid can be easily coated depending on the surrounding pH and salt concentration. There is a problem of dissociation, which is not preferable.
特開昭58−49311号、同58−201711号及び同61−69801号
公報には、疎水基を導入した多糖誘導体でリポソームを
被覆する技術が開示されているが、これらの公報で提案
されている多糖誘導体は、プルラン、アミロース、アミ
ロペクチン、デキストラン及びマンナンに限られてい
て、ヒアルロン酸のような、Ｄ−グルコサミンを主たる
構成糖とする多糖類は一切含まれていない。その理由と
しては、最近までは純度の高いヒアルロン酸を工業的に
得ることができなかった上に、ヒアルロン酸は水及びホ
ルムアミド以外の溶媒に不溶であり、リポソーム等のマ
イクロカプセルの被覆に使用しようとしても、その疎水
基導入処理が困難であること等に起因するものと考えら
れる。JP-A-58-49311, JP-A-58-201711, and JP-A-61-69801 disclose techniques for coating liposomes with a polysaccharide derivative having a hydrophobic group introduced, but these have been proposed. The available polysaccharide derivatives are limited to pullulan, amylose, amylopectin, dextran and mannan, and do not include any polysaccharide such as hyaluronic acid having D-glucosamine as a main constituent sugar. The reason is that until recently, highly pure hyaluronic acid could not be industrially obtained, and hyaluronic acid is insoluble in solvents other than water and formamide, so it should be used for coating microcapsules such as liposomes. However, it is considered that this is because the hydrophobic group introduction process is difficult.
また特開昭61−69801号公報において提案されている疎
水基を導入する方法は、プルラン、アミロース、アミロ
ペクチン、デキストラン及びマンナンに限定された多糖
類に、３つの反応段階を経て、アミノエチルアミノカル
ボニルメチル−コレステリル基を調製してその疎水基を
導入するものであり、工業的には極めて不利である。Further, the method of introducing a hydrophobic group proposed in JP-A-61-69801 is a method in which a polysaccharide limited to pullulan, amylose, amylopectin, dextran and mannan is subjected to three reaction steps and aminoethylaminocarbonyl. This is a method for preparing a methyl-cholesteryl group and introducing the hydrophobic group, which is extremely disadvantageous industrially.
（発明の課題） この発明は、リポソーム等のマイクロカプセルの被覆材
料として好適な新規なヒアルロン酸誘導体及びその製造
方法を提供することをその課題とする。(Problem of the Invention) An object of the present invention is to provide a novel hyaluronic acid derivative suitable as a coating material for microcapsules such as liposomes and a method for producing the same.
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた
結果、多糖類としてＤ−グルコサミンを主たる構成糖と
するヒアルロン酸類を選び、これにアシル基を導入した
ものは、リポソーム等のマイクロカプセルの被覆材料と
して好適なものであることを見出し、本発明を完成する
に至った。(Means for Solving the Problems) As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors selected hyaluronic acid having D-glucosamine as a main constituent sugar as a polysaccharide, and added an acyl group to the hyaluronic acid. We have found that the introduced substance is suitable as a coating material for microcapsules such as liposomes, and completed the present invention.
この発明に係る新規なヒアルロン酸誘導体は、次の一般
式（Ｉ） 〔式中、R1はアシル基を意味し、R2はヒドロキシル基、
−OM基（式中、Ｍはアルカリ金属原子を意味する）又は
−NH2基を意味する〕 で表わされるＤ−グルコサミンを主とする構成糖からな
るものである。The novel hyaluronic acid derivative according to the present invention has the following general formula (I): [In the formula, R 1 represents an acyl group, R 2 represents a hydroxyl group,
-OM group is made of (wherein, M is an alkali metal atom means) or means the group -NH 2] with constituent sugar composed mainly of D- glucosamine represented.
上記一般式（Ｉ）において、Ｍで表わされるアルカリ金
属原子としては、例えばナトリウムが好ましい。In the above general formula (I), the alkali metal atom represented by M is preferably sodium, for example.
またR1で表わされるアシル基の炭素原子数は、２〜30、
好ましくは４〜20である。このようなアシル基として
は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ヘキシ
ロイル基等の低級アシル基の他、各種高級アシル基が包
含される。高級アシル基は、飽和又は不飽和高級脂肪
酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸等から誘導
することができる。The number of carbon atoms of the acyl group represented by R 1 is 2 to 30,
It is preferably 4 to 20. Examples of such an acyl group include lower acyl groups such as an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, and a hexyloyl group, as well as various higher acyl groups. The higher acyl groups can be derived from saturated or unsaturated higher fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid and the like.
この発明において出発物質として使用されるＤ−グルコ
サミンを主たる構成糖とするヒアルロン酸類は、次の一
般式（Ｖ） 〔式中、R3は水素原子又はアルカリ金属原子を意味し、
そしてｎは２以上の整数を意味し、その上限は約6300
（分子量約250万）である〕 で表わされるものである。Hyaluronic acids containing D-glucosamine as a main constituent sugar used as a starting material in the present invention have the following general formula (V): [In the formula, R 3 represents a hydrogen atom or an alkali metal atom,
And n means an integer of 2 or more, and the upper limit is about 6300.
It has a molecular weight of about 2.5 million].
本発明によれば、一般式（Ｉ）におけるR1がアシル基
で、R2が−OM基であるヒアルロン酸誘導体、即ち、一般
式（II） （式中、Ｍはアルカリ金属を示し、R1はアシル基を示
す） で表わされる骨格構造を有するヒアルロン酸誘導体は、
前記一般式（Ｖ）で表わされるヒアルロン酸に、 一般式（III） R1−OH （式中、R1はアシル基を示す） で表わされる脂肪酸又はそのハライドを反応させて、 一般式（VI） （式中、R1はアシル基を示す） で表わされるアシル化ヒアルロン酸誘導体にした後、水
酸化アルカリ水溶液で処理することによって得ることが
できる。According to the present invention, a hyaluronic acid derivative in which R 1 in general formula (I) is an acyl group and R 2 is —OM group, that is, general formula (II) (In the formula, M represents an alkali metal and R 1 represents an acyl group), and a hyaluronic acid derivative having a skeleton structure is
The hyaluronic acid represented by the general formula (V) is reacted with a fatty acid represented by the general formula (III) R 1 —OH (wherein R 1 represents an acyl group) or a halide thereof to give a compound represented by the general formula (VI) ) (In the formula, R 1 represents an acyl group) An acylated hyaluronic acid derivative represented by the formula ( 1 ) can be obtained, and then treated with an aqueous alkali hydroxide solution.
また、一般式（Ｉ）において、R2が−NH2基であるヒア
ルロン酸誘導体は、前記一般式（VI）の骨格構造を有す
るアシル化ヒアルロン酸誘導体をアンモニア水で処理す
ることによって得ることができる。Further, in the general formula (I), the hyaluronic acid derivative in which R 2 is a —NH 2 group can be obtained by treating the acylated hyaluronic acid derivative having the skeleton structure of the general formula (VI) with aqueous ammonia. it can.
ヒアルロン酸のアシル化反応についてより具体的に示す
と、例えば、出発物質のヒアルロン酸を無水ジメチルホ
ルムアミドなどの溶液中に例えば50℃ないし60℃の加温
下で分散させる。次に無水ピリジンと無水ジメチルホル
ムアミドなどの溶媒に脂肪酸ハライドをあらかじめ溶解
したものを加え、50〜60℃で数時間引続き室温で数時間
ないし数日間攪拌しながら反応させる。得られた反応生
成物はこれを常法により洗浄、精製することにより、前
記一般式（VI）で表わされるアシル化ヒアルロン酸誘導
体を得ることができる。More specifically, the acylation reaction of hyaluronic acid will be described. For example, the starting material hyaluronic acid is dispersed in a solution such as anhydrous dimethylformamide under heating at 50 ° C to 60 ° C. Next, a solution of a fatty acid halide dissolved in a solvent such as anhydrous pyridine and anhydrous dimethylformamide in advance is added, and the reaction is carried out at 50 to 60 ° C. for several hours and then at room temperature for several hours to several days with stirring. By washing and purifying the obtained reaction product by a conventional method, the acylated hyaluronic acid derivative represented by the general formula (VI) can be obtained.
前述したアシル化ヒアルロン酸誘導体は、これを水酸化
アルカリ又はアンモニア水で加水分解することにより、
そのCOOR1をCOOM（M:アルカリ金属）又はCONHに変える
ことができる。より具体的には、かかるアシル化ヒアル
ロン酸誘導体をクロロホルムに分散し、水酸化ナトリウ
ムなどの水酸化アルカリを少量加えて室温で数時間反応
させることによりそのCOOR1をCOOMに変えたヒアルロン
酸誘導体を得ることができる。また、この場合、水酸化
アルカリに代えてアンモニア水を用いることにより、カ
ルボン酸アミドの形態を有するヒアルロン酸誘導体を得
ることができる。このようにして得られた生成物を常法
によって精製することにより所望のヒアルロン酸誘導体
とすることができる。The acylated hyaluronic acid derivative described above is hydrolyzed with alkali hydroxide or aqueous ammonia to give
The COOR 1 can be changed to COOM (M: alkali metal) or CONH. More specifically, such an acylated hyaluronic acid derivative is dispersed in chloroform, a small amount of alkali hydroxide such as sodium hydroxide is added, and the reaction is carried out at room temperature for several hours to obtain a hyaluronic acid derivative in which COOR 1 is changed to COOM. Obtainable. Further, in this case, a hyaluronic acid derivative having a carboxylic acid amide form can be obtained by using aqueous ammonia instead of the alkali hydroxide. The product thus obtained can be purified into a desired hyaluronic acid derivative by a conventional method.
この発明によるヒアルロン酸誘導体は、赤外線吸収スペ
クトル（KBr法）、H1−NMRスペクトル（溶媒重水、内部
標準TMSP）によって同定され、また生成物中のアシル基
の含有率は反応モル比、反応温度及び反応時間、更にア
ルカリ処理条件等によって調整することができる。The hyaluronic acid derivative according to the present invention was identified by infrared absorption spectrum (KBr method) and H 1 -NMR spectrum (heavy water solvent, internal standard TMSP), and the acyl group content in the product was determined by the reaction molar ratio, reaction temperature and reaction temperature. It can be adjusted depending on the reaction time, the alkali treatment conditions and the like.
（発明の効果） 本発明のヒアルロン酸誘導体は、リポソームや、マイク
ロスフェアー、アクア及びゲルカプセル等のマイクロカ
プセルの被覆材料として用いることができる。また、乳
化作用及び乳化系の安定化作用を有するので、乳化剤や
乳化安定剤として食品、医薬、化粧品等の分野において
有利に用いられる。(Effect of the Invention) The hyaluronic acid derivative of the present invention can be used as a coating material for liposomes and microcapsules such as microspheres, aqua and gel capsules. Further, since it has an emulsifying action and a stabilizing action on the emulsion system, it is advantageously used as an emulsifier or an emulsion stabilizer in the fields of food, medicine, cosmetics and the like.
（実施例） この発明を実施例によって更に詳細に説明する。(Examples) The present invention will be described in more detail with reference to Examples.
実施例１ 500mlのナス型フラスコ中でヒアルロン酸ナトリウム
（平均分子量2,000,000）0.2g（0.2/401＝5.0×10-4モ
ル糖単位）を無水ジメチルホルムアミド200mlに50〜60
℃で加温しながら分散した。マグネチックスターラーで
攪拌しながら、無水ピリジン1.6g（2.0×10-2モル）及
びパルミトイルクロライド4.5g（2.0×10-2モル）を無
水ジメチルホルムアミドの適量に溶解したものを加え
た。これを60℃で３時間保ち、その後室温にて２ヶ月間
放置した。２ヶ月後、反応混合物を再度60℃に30分間加
温し、冷却しないうちに懸濁物を濾集した。この反応生
成物をアセトン及びクロロホルムで洗浄し、減圧下、加
熱乾燥した。Example 1 In a 500 ml eggplant-shaped flask, sodium hyaluronate (average molecular weight 2,000,000) 0.2 g (0.2 / 401 = 5.0 × 10 −4 mol sugar unit) was added to 200 ml of anhydrous dimethylformamide in an amount of 50 to 60.
Disperse while heating at ℃. With magnetic stirring, it was added a solution obtained by dissolving anhydrous pyridine 1.6g (2.0 × 10 -2 mol) and palmitoyl chloride 4.5g (2.0 × 10 -2 mol) in a suitable amount of anhydrous dimethylformamide. This was kept at 60 ° C. for 3 hours and then left at room temperature for 2 months. After 2 months, the reaction mixture was again warmed to 60 ° C. for 30 minutes and the suspension was collected by filtration before cooling. The reaction product was washed with acetone and chloroform, and dried by heating under reduced pressure.
乾燥後の反応生成物のIR及びNMRを測定した。この反応
生成物のIR分析結果においては、1740cm-1にカルボニル
基の吸収が見られ、これによりエステル形成（CH2OR1）
の確認をした。また同時に1810cm-1にも吸収を認め、グ
ルクロン酸部のカルボキシル基に酸無水物（COOR1）が
形成されていることも確認した。また、この反応生成物
のNMR分析結果においては、0.9ppm及び1.25ppmにパルミ
トイル基のプロトンのピークを確認した。IR and NMR of the reaction product after drying were measured. In the IR analysis result of this reaction product, absorption of a carbonyl group was observed at 1740 cm -1 , which resulted in ester formation (CH 2 OR 1 )
I confirmed. At the same time, absorption was observed at 1810 cm -1, and it was confirmed that an acid anhydride (COOR 1 ) was formed in the carboxyl group of the glucuronic acid moiety. Moreover, in the NMR analysis result of this reaction product, proton peaks of the palmitoyl group were confirmed at 0.9 ppm and 1.25 ppm.
また、この反応生成物における脂肪酸エステルが存在す
ることを、ヒドロキサム酸鉄法によって次のようにして
確認した。まず試料として反応生成物5mgを精秤し、エ
タノール0.6mlに懸濁した。この懸濁液に、別に調製し
たアルカリ性ヒドロキシルアミン液1.25mlを添加し、65
℃で２分間加熱した。The presence of fatty acid ester in this reaction product was confirmed by the iron hydroxamate method as follows. First, 5 mg of the reaction product was precisely weighed as a sample and suspended in 0.6 ml of ethanol. To this suspension, add 1.25 ml of a separately prepared alkaline hydroxylamine solution,
Heated at 0 ° C for 2 minutes.
なお、アルカリ性ヒドロキシルアミン液は次のようにし
て調製した。塩酸ヒドロキシルアミン2gを精製水2.5ml
に溶解し、無水エタノールで50mlとしたものをＡ液と
し、水酸化ナトリウム4gを精製水2.5mlに溶解し、無水
エタノール50mlとしたものをＢ液とした。使用直前にＡ
液とＢ液とを等量混合し、生ずる塩化ナトリウムを遠心
除去して使用液とした。The alkaline hydroxylamine solution was prepared as follows. Hydroxylamine hydrochloride 2g purified water 2.5ml
Was dissolved in 50 ml of absolute ethanol to prepare a solution A, and 4 g of sodium hydroxide was dissolved in 2.5 ml of purified water to prepare a solution of anhydrous ethanol 50 ml to prepare a solution B. Just before use A
The liquid and the liquid B were mixed in equal amounts, and sodium chloride produced was removed by centrifugation to obtain a working liquid.
次に、前記65℃で加熱した反応液を室温で５分間冷却し
た後、その反応液に過塩素酸鉄溶液（過塩素酸第二鉄六
水塩5gを70％過塩素酸10mlと精製水10mlに溶解し、冷エ
タノールで100mlとしたものを冷所保存液とし、この保
存液4mlと70％過塩素酸3mlを取り、冷エタノールで100m
lとしたもの）3.15mlを更に添加して、よく攪拌して30
分後に、530nmにおける発色吸光度を測定した。比較の
ための試料を含まないブランクの吸光度が0.072である
にのに対し、試料5mgを含有するものの吸光度は1.79で
あることが測定され、脂肪酸エステルの存在が確認され
た。Next, after cooling the reaction solution heated at 65 ° C. at room temperature for 5 minutes, an iron perchlorate solution (5 g of ferric perchlorate hexahydrate, 10% of 70% perchloric acid and purified water) was added to the reaction solution. Dissolve it in 10 ml and make it 100 ml with cold ethanol as a cold storage solution. Take 4 ml of this storage solution and 3 ml of 70% perchloric acid, and use 100 ml of cold ethanol.
1.15 ml) was added and stirred well, 30
After a minute, the color absorbance at 530 nm was measured. The absorbance of the blank containing no sample for comparison was 0.072, whereas the absorbance of the sample containing 5 mg was 1.79, confirming the presence of the fatty acid ester.
この反応生成物であるパルミトイル基導入ヒアルロン酸
誘導体（１）は次のような化合構造を有することが確認
された。またこのものは水不溶性のものであった。It was confirmed that the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1), which is the reaction product, has the following compound structure. This product was insoluble in water.
（式中、Ｒはパルミトイル基を意味する） 実施例２ パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（１）100mgを5
0ml容ナス型フラスコに取り、クロロホルム30mlに分散
した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、２規定
水酸化ナトリウム液をパスツールピペットにて３滴加え
た。室温にて攪拌を続け、12時間後、ロータリーエバポ
レーターで蒸発乾固物を得た。この乾固物に精製水30ml
を加え、マグネチックスターラーで攪拌しながら、１規
定塩酸にてpHを7.0調整した。その後、60℃で加温溶解
した。水不溶性物は濾過により除去した。濾液を加熱乾
燥し、パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（２）を
得た。 (In the formula, R means a palmitoyl group) Example 2 5 mg of hyaluronic acid derivative having palmitoyl group introduced (1)
It was taken in a 0 ml eggplant-shaped flask and dispersed in 30 ml of chloroform. While stirring with a magnetic stirrer, 3 drops of 2N sodium hydroxide solution was added with a Pasteur pipette. Stirring was continued at room temperature, and after 12 hours, a dry matter was obtained by evaporation on a rotary evaporator. 30 ml of purified water
Was added, and the pH was adjusted to 7.0 with 1N hydrochloric acid while stirring with a magnetic stirrer. Then, the mixture was heated and dissolved at 60 ° C. Water-insoluble matter was removed by filtration. The filtrate was heated and dried to obtain a palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (2).
この生成物のIR測定を行った結果、1810cm-1の吸収の消
失と1610cm-1の吸収の再出現により、酸無水物の分解と
カルボン酸ナトリウムの再生を確認した。また、1745cm
-1の吸収の減少から、酸無水物の消失とともにエステル
の部分的な分解を確認した。さらに、この生成物のヒド
ロキサム酸鉄法による発色吸光度は、試料量5mgで0.315
とパルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（１）のおよ
そ６分の１とエステルの導入比率は小さくなったことを
確認した。また、このものは1H−NMRによるパルミトイ
ル基/N−アセチル基の比率（モル比）は1/30であった。Result of IR measurement of this product, the reappearance of absorption loss and 1610 cm -1 absorption of 1810 cm -1, confirming regeneration of decomposition of sodium acid anhydrides. Also, 1745 cm
From the decrease in absorption of -1 , partial decomposition of the ester was confirmed along with disappearance of the acid anhydride. Furthermore, the color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.315 at a sample amount of 5 mg.
It was confirmed that the ratio of introduction of the ester was about 1/6 of that of the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1). In addition, the ratio (molar ratio) of palmitoyl group / N-acetyl group in this product by 1 H-NMR was 1/30.
前記パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（２）は次
のような化学構造を有することが確認した。また、この
ものは水に対して良好な水溶性を示した。It was confirmed that the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (2) had the following chemical structure. In addition, this product showed good water solubility in water.
（式中、Ｒはパルミトイル基を意味する）。 (In the formula, R means a palmitoyl group).
実施例３ パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（１）100mgに
実施例２と同様のアルカリ処理をするが、処理時間を５
時間とした。この生成物をパルミトイル基導入ヒアルロ
ン酸誘導体（３）とした。Example 3 100 mg of the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1) is treated with the same alkali as in Example 2, but the treatment time is 5
It was time. This product was used as a palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (3).
この生成物のIR測定を行った結果、実施例２と同様に酸
無水物は消失したことを確認したが、エステルの残存率
は、1745cm-1の吸収の減少の程度が実施例２より少ない
ことから高くなっていた。さらにこの生成物のヒドロキ
サム酸鉄法による発色吸光度は、試料量5mgで0.855とパ
ルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（１）のおよそ２
分１のエステル導入率を示した。また、このものは1H−
NMRによるパルミトイル基/N−アセチル基の比率は1/34
であった。As a result of IR measurement of this product, it was confirmed that the acid anhydride disappeared in the same manner as in Example 2, but the residual rate of the ester was less than in Example 2 in the degree of decrease in absorption at 1745 cm −1. It was higher than that. Furthermore, the color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.855 at a sample amount of 5 mg, which was about 2 of that of the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1).
An ester introduction rate of 1 was shown. Also, this one is 1 H-
Palmitoyl group / N-acetyl group ratio by NMR is 1/34
Met.
このヒアルロン酸誘導体（３）も、パルミトイル基導入
ヒアルロン酸誘導体（２）と同じ化学構造を有すること
が確認された。また、このものは水に対して良好な水溶
性を示した。It was confirmed that this hyaluronic acid derivative (3) also has the same chemical structure as that of the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (2). In addition, this product showed good water solubility in water.
実施例４ 500mlのナス型フラスコ中でヒアルロン酸ナトリウム
（平均分子量2,000,000）0.5g（0.5/401＝1.25×10-3モ
ル糖単位）を無水ジメチルホルムアミド200mlに50〜60
℃で加温しながら分散した。マグネチックスターラーで
攪拌しながら、無水ピリジン11.3g（５×10-2モル）及
びパルミトイルクロライド3.9g（５×10-2モル）を無水
ジメチルホルムアミドの適量に溶解したものを加えた。
これを60℃で３時間保ち、その後室温にて４日間放置し
た。４日後、反応混合物を再度60℃に30分間加温し、冷
却しないうちに懸濁物を濾集した。この反応生成物をア
セトン及びクロロホルムで洗浄し、減圧下、加熱乾燥し
た。Example 4 In a 500 ml eggplant-shaped flask, 0.5 g of sodium hyaluronate (average molecular weight 2,000,000) (0.5 / 401 = 1.25 × 10 −3 mol sugar unit) was added to 200 ml of anhydrous dimethylformamide in an amount of 50 to 60.
Disperse while heating at ℃. With magnetic stirring, it was added a solution obtained by dissolving anhydrous pyridine 11.3g (5 × 10 -2 mol) and palmitoyl chloride 3.9g (5 × 10 -2 mol) in a suitable amount of anhydrous dimethylformamide.
This was kept at 60 ° C. for 3 hours and then left at room temperature for 4 days. After 4 days, the reaction mixture was again warmed to 60 ° C. for 30 minutes and the suspension was collected by filtration before cooling. The reaction product was washed with acetone and chloroform, and dried by heating under reduced pressure.
この反応生成物のIRとNMRの測定結果から、実施例１の
パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（１）と同じ構
造のものであるが、疎水性基の導入率が明らかに低いこ
とを確認した。この生成物のヒドロキサム酸鉄法による
発色吸光度は、試料量5mgで0.360とパルミトイル基導入
ヒアルロン酸誘導体（１）のおよそ40分の１のエステル
導入率を示した。From the IR and NMR measurement results of this reaction product, it was confirmed that the reaction product had the same structure as the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1) of Example 1, but the introduction rate of the hydrophobic group was obviously low. The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.360 at a sample amount of 5 mg, and the ester introduction ratio was about 1/40 of that of the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (1).
この反応生成物をパルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導
体（４）とする。このものは水に対して不溶性を示し
た。This reaction product is used as a palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (4). This product was insoluble in water.
実施例５ パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体（４）100mgを5
0ml容ナス型フラスコに取り、クロロホルム30mlに分散
した。マグネチックスターラーで攪拌しながら、28％ア
ンモニア水をパスツールピペットにて３滴くわえた。室
温にて攪拌を続け、12時間後に、ロータリーエバポレー
ターで蒸発乾固物を得た。そこへ精製水30mlを加え、60
℃で加温溶解した。水不溶性物は濾過により除去した。
濾液を加熱乾燥し、パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘
導体（５）を得た。Example 5 Palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (4)
It was taken in a 0 ml eggplant-shaped flask and dispersed in 30 ml of chloroform. While stirring with a magnetic stirrer, 3 drops of 28% ammonia water was added with a Pasteur pipette. Stirring was continued at room temperature, and 12 hours later, a dry matter was obtained by evaporation on a rotary evaporator. Add 30 ml of purified water to it, and add 60
It melt | dissolved by heating at 0 degreeC. Water-insoluble matter was removed by filtration.
The filtrate was heated and dried to obtain a palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (5).
この生成物のIR分析結果において、1810cm-1の吸収の消
失により、酸無水物の分解を確認すると同時に、1640cm
-1から1690cm-1の吸収帯に変化があり、グルクロン酸の
カルボキシル基が一級アミド（CONH2）を形成している
ことを確認した。この生成物のヒドロキサム酸鉄法によ
る発色吸光度は、試料量5mgで0.010とパルミトイル導入
ヒアルロン酸誘導体（１）のおよそ170分の１であっ
た。また、このものの1H−NMRによるパルミトイル基/N
−アセチル基の比率は1/118であった。このパルミトイ
ル基導入ヒアルロン酸誘導体（５）は、下記化学構造を
有することが確認された。このものは水に対して良好な
溶解性を示した。In the IR analysis result of this product, the decomposition of the acid anhydride was confirmed by the disappearance of absorption at 1810 cm -1 , and at the same time 1640 cm
It was confirmed that there was a change in the absorption band from -1 to 1690 cm -1 , and that the carboxyl group of glucuronic acid formed a primary amide (CONH 2 ). The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.010 at a sample amount of 5 mg, which was about 1/170 of that of the palmitoyl-introduced hyaluronic acid derivative (1). In addition, the palmitoyl group / N by 1 H-NMR of this product
The ratio of acetyl groups was 1/118. It was confirmed that the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (5) had the following chemical structure. It showed good solubility in water.
（式中、Ｒはパルミトイル基を意味する） 実施例６ 実施例１において、ヒアルロン酸ナトリウムとして平均
分子量20,000のものを用いた以外は同様にして式（１）
で表わされるパルミトイル基導入ヒアルロン酸誘導体
（６）を得た。このもののヒドロキサム酸鉄法による発
色吸光度は、1mg当り0.083を示した。また、このものの
1H−NMRによるパルミトイル基/N−アセチル基の比率は1
/33であった。このものは水に対してやや不溶性を示し
た。 (In the formula, R means a palmitoyl group.) Example 6 The same formula (1) was used except that sodium hyaluronate having an average molecular weight of 20,000 was used.
A palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (6) represented by The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.083 per mg. Also of this thing
The ratio of palmitoyl group / N-acetyl group measured by 1 H-NMR is 1
It was / 33. This product was slightly insoluble in water.
実施例７ 実施例２において、パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘
導体として、実施例６で得られたもの（６）を用いた以
外は同様にして式（２）で表わされるパルミトイル基導
入ヒアルロン酸誘導体（７）を得た。このもののヒドロ
キサム酸鉄法による発色吸光度は、1mg当り0.006を示し
た。また、このものの1H−NMRによるパルミトイル基/N
−アセチル基の比率は1/125であった。また、このもの
は水に対して良好な溶解性を示した。Example 7 In Example 2, the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (7) was similarly expressed except that the palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (6) obtained in Example 6 was used. ) Got. The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.006 per mg. In addition, the palmitoyl group / N by 1 H-NMR of this product
The ratio of acetyl groups was 1/125. Further, this product showed good solubility in water.
実施例８ 実施例３において、パルミトイル基導入ヒアルロン酸誘
導体として、実施例６で示したもの（６）を用いた以外
は同様にして式（２）で表わされるパルミトイル基導入
ヒアルロン酸誘導体（８）を得た。このもののヒドロキ
サム酸鉄法による発色吸光度は、1mg当り0.084を示し
た。また、このもの1H−NMRによるパルミトイル基/N−
アセチル基の比率は1/55であった。このものは水に対し
て良好な溶解性を示した。Example 8 In Example 3, a palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (8) represented by formula (2) is obtained in the same manner as in Example 3, except that the one (6) shown in Example 6 is used as the palmitoyl-introduced hyaluronic acid derivative. Got The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.084 per mg. Also, this product was analyzed by 1 H-NMR for palmitoyl group / N-
The ratio of acetyl groups was 1/55. It showed good solubility in water.
実施例９ 実施例４において、ヒアルロン酸ナトリウムとして、平
均分子量約20,000のものを用いた以外は同様にして式
（１）で示される構造のパルミトイル基導入ヒアルロン
酸誘導体（９）を得た。このもののヒドロムサム酸鉄法
による発色吸光度は、1mg当り0.032を示した。また、こ
のものの1H−NMRによるパルミトイル基/N−アセチル基
の比率は1/37であった。このものは水に対してやや不溶
性を示した。Example 9 A palmitoyl group-introduced hyaluronic acid derivative (9) having a structure represented by the formula (1) was obtained in the same manner as in Example 4, except that sodium hyaluronate having an average molecular weight of about 20,000 was used. The color absorbance of this product by the iron hydromumate method was 0.032 per mg. The ratio of palmitoyl group / N-acetyl group of this product was 1/37 by 1 H-NMR. This product was slightly insoluble in water.
実施例10 200ml容ナス型フラスコ中でヒアルロン酸ナトリウム
（平均分子量20,000）0.1g（0.1/401＝2.5×10-4モル糖
単位）を無水ジメチルホルムアミド50mlに50〜60℃で加
温しながら分散した。マグネチックスターラーで攪拌し
ながら、無水ピリジン0.16g（2.0×10-3モル）及びブチ
リルクロライド0.214g（2.0×10-3モル）を無水ジメチ
ルホルムアミドの適量に溶解したものを加えた。これを
60℃で１時間保ち、その後室温にて３週間放置した。３
週間後、反応混合物を再度60℃に30分間加温し、冷却し
ないうちに懸濁物を濾集した。この反応生成物をアセト
ン及びクロロホルムで洗浄し、減圧下、加熱乾燥して、
ヒアルロン酸誘導体（10）を得るとともに、その乾燥後
の反応生成物のIR及びNMRを測定した。この反応生成物
のIR分析結果においては、1740cm-1にカルボニル基の吸
収が見られ、これによりエステル形成の確認をした。ま
た同時に1810cm-1にも吸収を認め、グルクロン酸部のカ
ルボキシル基に酸無水物が形成されていることも確認し
た。また、この反応生成物のNMR分析結果においては、
0.9ppm及び1.28ppmにブチリル基のプロトンのピークを
確認した。Example 10 In a 200 ml eggplant-shaped flask, 0.1 g of sodium hyaluronate (average molecular weight 20,000) (0.1 / 401 = 2.5 × 10 −4 mol sugar unit) was dispersed in 50 ml of anhydrous dimethylformamide while heating at 50 to 60 ° C. did. With magnetic stirring, it was added a solution obtained by dissolving anhydrous pyridine 0.16g (2.0 × 10 -3 mol) and butyryl chloride 0.214g (2.0 × 10 -3 mol) in a suitable amount of anhydrous dimethylformamide. this
It was kept at 60 ° C for 1 hour and then left at room temperature for 3 weeks. Three
After a week, the reaction mixture was again warmed to 60 ° C. for 30 minutes and the suspension was collected by filtration before cooling. The reaction product was washed with acetone and chloroform, dried by heating under reduced pressure,
The hyaluronic acid derivative (10) was obtained, and the IR and NMR of the reaction product after drying were measured. In the IR analysis result of this reaction product, absorption of a carbonyl group was observed at 1740 cm -1 , which confirmed the ester formation. At the same time, absorption was observed at 1810 cm -1, and it was confirmed that an acid anhydride was formed in the carboxyl group of the glucuronic acid moiety. In addition, in the NMR analysis result of this reaction product,
Butyryl group proton peaks were confirmed at 0.9 ppm and 1.28 ppm.
また、この反応生成物における脂肪酸エステルが存在す
ることを、ヒドロキサム酸鉄法によって確認した。この
生成物のヒドロキサム酸鉄法による発色吸光度は、試料
量5mgで0.385であった。また、このものは1H−NMRによ
るブチリル基/N−アセチル基の比率は1/35であった。The presence of fatty acid ester in this reaction product was confirmed by the iron hydroxamate method. The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.385 when the sample amount was 5 mg. The ratio of the butyryl group / N-acetyl group in this product was 1/35 by 1 H-NMR.
前記で得たプチリル基導入ヒアルロン酸誘導体（10）は
次の構造式を有するものであった。このものの水に対す
る溶解性はやや小さかった。The above-obtained hyaluronic acid derivative having a styryl group introduced (10) had the following structural formula. The solubility of this product in water was slightly low.
（式中、Ｒはブチリル基を意味する） 実施例11 実施例10で得たブチリル基導入ヒアルロン酸誘導体（1
0）100mgを50ml容ナス型フラスコに取り、クロロホルム
30mlに分散した。マグネチックスターラーで攪拌しなが
ら、２規定水酸化ナトリウム液をパスツールピペットに
て３滴加えた。室温にて攪拌を続け、６時間後、ロータ
リーエバポレーターで蒸発乾固物を得た。この乾固物に
精製水30mlを加え、マグネチックスターラーで攪拌しな
がら、１規定塩酸にてpHを7.0に調整した。その後、60
℃で加温溶解した。水不溶性物は濾過により除去した。
濾液を加熱乾燥し、ブチリル基導入ヒアルロン酸誘導体
（11）を得た。 (In the formula, R means a butyryl group.) Example 11 A butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (1 obtained in Example 10
0) Transfer 100mg to a 50ml eggplant-shaped flask and add chloroform.
Dispersed in 30 ml. While stirring with a magnetic stirrer, 3 drops of 2N sodium hydroxide solution was added with a Pasteur pipette. Stirring was continued at room temperature, and after 6 hours, a dry solid was obtained by evaporation on a rotary evaporator. 30 ml of purified water was added to this dried solid, and the pH was adjusted to 7.0 with 1N hydrochloric acid while stirring with a magnetic stirrer. Then 60
It melt | dissolved by heating at 0 degreeC. Water-insoluble matter was removed by filtration.
The filtrate was dried by heating to obtain a butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (11).
この生成物のIR測定を行った結果、1810cm-1の吸収の消
失と1610cm-1の吸収の増加により、分子内に部分的に形
成されていた酸無水物の分解とカルボン酸ナトリウムの
再生を確認した。また、1740cm-1周辺の吸収の減少か
ら、酸無水物の消失とともにエステルの部分的な分解を
確認した。さらに、この生成物のヒドロキサム酸鉄法に
よる発色吸光度は、試料量10mgで0.223でブチリル基導
入ヒアルロン酸誘導体（10）のおよそ４分の１とエステ
ルの導入比率は小さくなたことを確認した。また、この
ものの1H−NMRによるブチリル基/N−アセチル基の比率
は1/140であった。Result of IR measurement of this product, an increase in the absorption loss and 1610 cm -1 absorption of 1810 cm -1, the reproduction of the decomposition of sodium carboxylate of the acid anhydride which has been partially formed in the molecule confirmed. In addition, the decrease in absorption around 1740 cm -1 confirmed the partial decomposition of the ester as well as the disappearance of the acid anhydride. Further, the color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.223 at a sample amount of 10 mg, and it was confirmed that the introduction ratio of the ester was small, which was about one-fourth of the butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (10). The ratio of butyryl group / N-acetyl group by 1 H-NMR of this product was 1/140.
前記で得たブチリル基導入ヒアルロン酸誘導体（11）は
次の構造式を有するものであった。このものは水に対し
て良好な溶解性を示した。The butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (11) obtained above had the following structural formula. It showed good solubility in water.
（式中、Ｒはブチリル基を意味する） 実施例12 ブチリル基導入ヒアルロン酸誘導体（10）100mgを50ml
容ナス型フラスコに取り、クロロホルム30mlに分散し
た。マグネチックスターラーで攪拌しながら、28％アン
モニア水をパスツールピペットにて３滴加えた。室温に
て攪拌を続け、６時間後、ロータリーエバポレーターで
蒸発乾固物を得た。そこへ精製水30mlを加え、60℃で加
温溶解した。水不溶性物は濾過により除去した。濾液を
加熱乾燥し、ブチリル基導入ヒアルロン酸誘導体（12）
を得た。 (In the formula, R means a butyryl group) Example 12 50 ml of 100 mg of a butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (10)
The mixture was placed in a round-bottomed flask and dispersed in 30 ml of chloroform. While stirring with a magnetic stirrer, 3 drops of 28% ammonia water was added with a Pasteur pipette. Stirring was continued at room temperature, and after 6 hours, a dry solid was obtained by evaporation on a rotary evaporator. 30 ml of purified water was added thereto and dissolved by heating at 60 ° C. Water-insoluble matter was removed by filtration. The filtrate is heated and dried, butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (12)
Got
この生成物のIR分析を行った結果、1810cm-1の吸収の消
失により、酸無水物の分解を確認すると同時に、1640cm
-1から1690cm-1の吸収帯に変化があり、グルクロン酸の
カルボキシル基が一級アミド（CONH2）を形成している
ことを確認した。この生成物のヒドロキサム酸鉄法によ
る発色吸光度は試料量10mgで0.285とブチリル基導入ヒ
アルロン酸誘導体（10）のおおよそ３分の１であった。
また、このものの1H−NMRによるブチリル基/N−アセチ
ル基の比率は1/105であった。このものは、ブチリル基
導入上ヒアルロン酸誘導体（11）と同様、水に対して良
好な溶解性を示した。As a result of IR analysis of this product, the decomposition of the acid anhydride was confirmed by the disappearance of absorption at 1810 cm -1 , and at the same time 1640 cm
It was confirmed that there was a change in the absorption band from -1 to 1690 cm -1 , and that the carboxyl group of glucuronic acid formed a primary amide (CONH 2 ). The color absorbance of this product by the iron hydroxamate method was 0.285 at a sample amount of 10 mg, which was about one-third that of the butyryl group-introduced hyaluronic acid derivative (10).
The ratio of butyryl group / N-acetyl group by 1 H-NMR of this product was 1/105. This product, like the hyaluronic acid derivative (11) in which a butyryl group was introduced, showed good solubility in water.
（式中、Ｒはブチリル基を意味する） 参考例１ 表−１に示すヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体の旋
光度▲〔α〕25 D▼（ｃ＝1.0、H2O;Cは溶液の濃度g/100
ml）を測定し、表−１の結果を得た。 (In the formula, R means a butyryl group) Reference Example 1 Optical rotations of hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives shown in Table 1 ▲ [α] 25 D ▼ (c = 1.0, H 2 O; C is the concentration of the solution) g / 100
ml) was measured and the results shown in Table 1 were obtained.
参考例１ 表−１に示し各種ヒアルロン誘導体の旋光度▲〔α〕25
D▼（溶媒：水、溶液濃度:1g/100ml）を測定し、その結
果を表−１に示す。Reference Example 1 Optical rotations of various hyaluronic derivatives shown in Table 1 ▲ [α] 25
D ▼ (solvent: water, solution concentration: 1 g / 100 ml) was measured, and the results are shown in Table-1.
参考例２ 各種パルミトイル化ヒアルロン酸の0.5％の水溶液を調
製し、終濃度0.5％の大豆油に対する乳化能とその経時
安定性を測定した。乳化方法は、振幅25cm、毎分60回で
３分間振盪することにより実施した。乳化物は、10ml容
ガラス製シリンジに10mlずつ入れ、シリンジの先端を下
にして放置した。その後、経時的に下層2.5mlの静かに
取り、波長600nmにおける透過率を測定した。その透過
率の経時変化が小さいほど乳化物の安定製のよいことを
示す。 Reference Example 2 A 0.5% aqueous solution of various palmitoylated hyaluronic acid was prepared, and its emulsifying ability with respect to soybean oil having a final concentration of 0.5% and its temporal stability were measured. The emulsification method was carried out by shaking at an amplitude of 25 cm and 60 times per minute for 3 minutes. The emulsion was placed in 10 ml glass syringes, 10 ml each, and left with the tip of the syringe facing down. Then, 2.5 ml of the lower layer was gently taken over time and the transmittance at a wavelength of 600 nm was measured. The smaller the change with time of the transmittance, the better the stability of the emulsion.
パルミトイル化ヒアルロン酸としてHA−Ｐ−NA、HA5−
Ｐ−NA、HA2−Ｐ−NA、HA2−Ｐの試料を用いた。また、
比較のために、未修飾ヒアルロン酸としてHA、HA5、HA2
を用い、また、Tween80を用いて同様の実験を行った。
さらに、無添加の実験も行った。その結果を表−２に示
した。HA5−Ｐ−NA、HA2−Ｐ−NA、HA2−Ｐは濁度の変
化がほとんどないのに対し、無添加及びHA5、HA2では著
しい濁度の上昇が観察された。Tween80では中程度の濁
度変化であった。なおHA及びHA−Ｐ−NAにおいては、乳
化直後の層分離が極めて早く、透過率の測定に供せなか
った。HA-P-NA, HA5-as palmitoylated hyaluronic acid
Samples of P-NA, HA2-P-NA, HA2-P were used. Also,
HA, HA5, HA2 as unmodified hyaluronic acid for comparison
And Tween 80 were used to perform the same experiment.
Furthermore, an experiment without addition was also conducted. The results are shown in Table-2. HA5-P-NA, HA2-P-NA and HA2-P showed almost no change in turbidity, whereas no addition and HA5 and HA2 showed a marked increase in turbidity. Tween 80 had a moderate change in turbidity. In HA and HA-P-NA, layer separation immediately after emulsification was extremely fast, and it could not be used for measurement of transmittance.
ここで用いたHAとは平均分子量200万、HA5とは平均分子
量５万、HA2とは平均分子量２万のヒアルロン酸を言
う。またHA−Ｐ−NA、HA5−Ｐ−NA、HA2−Ｐ−NAとは、
HA、HA5及びHA2のヒアルロン酸から誘導されたヒアルロ
ン酸誘導体のことで、ここでは、実施例２に従って得ら
れるヒアルロン酸誘導体のナトリウム塩を用いた。さら
に、HA2−Ｐとは、HA2のヒアルロン酸から誘導されたヒ
アルロン酸誘導体のことであり、実施例６で得られたも
のを用いた。以上の事から、分子量が数万程度のヒアル
ロン酸誘導体には、極めて良好な乳化能及び安定化性能
があるとされる。なお、平均分子量が200万程度のもの
については、油の選択及び乳化方法の組み合わせによ
り、良好な結果を得ることができる。As used herein, HA is hyaluronic acid having an average molecular weight of 2,000,000, HA5 is an average molecular weight of 50,000, and HA2 is an average molecular weight of 20,000. HA-P-NA, HA5-P-NA and HA2-P-NA are
A hyaluronic acid derivative derived from hyaluronic acid of HA, HA5 and HA2, wherein the sodium salt of the hyaluronic acid derivative obtained according to Example 2 was used. Further, HA2-P is a hyaluronic acid derivative of HA2 derived from hyaluronic acid, and the one obtained in Example 6 was used. From the above, it is considered that the hyaluronic acid derivative having a molecular weight of about tens of thousands has extremely good emulsifying ability and stabilizing ability. For those having an average molecular weight of about 2,000,000, good results can be obtained by a combination of oil selection and emulsification methods.
参考例３ 乳化組成物の安定化を検討する上で、乳化形態のひとつ
であるリポソームの安定化が、最近、注目されている。
そこでパルミトイル化したヒアルロン酸で被覆したレシ
チンリポソームのホスホリパーゼ作用抵抗性を検討し
た。 Reference Example 3 In studying the stabilization of an emulsified composition, stabilization of a liposome, which is one of the emulsified forms, has recently attracted attention.
Therefore, the resistance of phospholipase action of lecithin liposomes coated with palmitoylated hyaluronic acid was examined.
まず、精製卵黄レシチン（旭化成（株）製）とコレステ
ロールのクロロホルム／メタノール溶液を製し、一定量
をナス型フラスコに取り、蒸発乾固する。その後、0.4m
Mのカルセイン水溶液5mlで水和し、ボルテックス法にて
精製卵黄レシチン及びコレステロールの終濃度９マイク
ロモルとなるリポソームを調製した。次いで、セファデ
クスＧ−75カラムにて、リポソーム内水層に未封入のカ
ルセインを除去した。得られたカルセイン封入リポソー
ムへのパルミトイル化ヒアルロン酸被覆は、パルミトイ
ル化ヒアルロン酸誘導体を粉末のままリポソームへ終濃
度２〜5mg/mlとなるよう添加し、約１時間緩和に攪拌し
た。ホスホリパーゼＤに対する抵抗性の試験は、リポソ
ーム試料2mlに対し、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造
（株）製）23単位を添加し、リポソーム内水層から放出
してくる水溶性蛍光色素カルセインの蛍光を励起波長48
0nm、蛍光波長510nmにて経時的に測定した。なお、内水
層で封入されているカルセインの総量は、10％TritonX
−100の0.05mlを加え、リポソームを破壊することで求
めた。その結果を表−５に示す。この場合、パルミトイ
ル化ヒアルロン酸誘導体として、HA−Ｐ−NA、HA5−Ｐ
−NA及びHA2−Ｐ−NAを用いた。また、対照として被覆
しないリポソームも試験に供した。表−５に示した結果
からわかるように、被覆しないリポソームにおいて、内
水層中で濃度消光していたカルセインは、全封入量の90
％近くまで放出された。それに対し、パルミトイル化ヒ
アルロン酸誘導体被覆リポソームでは20〜30％までしか
放出されなかった。ホスホリパーゼＤは、レシチンのコ
リンエステルを加水分解し、リポソームの二分子膜構造
に乱れを生じされるもので、その結果、内水層封入物が
放出してくるものである。よって、パルミトイル化ヒア
ルロン酸は、リポソームを被覆することでホスホリパー
ゼＤ抵抗性を揮発し、リポソーム膜構造の安定化をもた
らすものである。First, a solution of purified egg yolk lecithin (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) and cholesterol in chloroform / methanol is prepared, and a certain amount thereof is placed in an eggplant-shaped flask and evaporated to dryness. Then 0.4m
The liposomes were hydrated with 5 ml of an aqueous calcein solution of M, and liposomes having a final concentration of purified egg yolk lecithin and cholesterol of 9 μmol were prepared by the vortex method. Then, calcein not encapsulated in the liposome inner aqueous layer was removed using a Sephadex G-75 column. To coat the obtained calcein-encapsulated liposome with palmitoylated hyaluronic acid, the palmitoylated hyaluronic acid derivative was added to the liposome as a powder at a final concentration of 2 to 5 mg / ml, and gently stirred for about 1 hour. To test the resistance to phospholipase D, 23 units of phospholipase D (manufactured by Toyo Shuzo Co., Ltd.) was added to 2 ml of the liposome sample, and the fluorescence of the water-soluble fluorescent dye calcein released from the aqueous layer in the liposome was excited at the excitation wavelength. 48
It was measured with time at 0 nm and a fluorescence wavelength of 510 nm. The total amount of calcein enclosed in the inner water layer is 10% TritonX.
It was determined by adding 0.05 ml of -100 and breaking the liposome. The results are shown in Table-5. In this case, as the palmitoylated hyaluronic acid derivative, HA-P-NA, HA5-P
-NA and HA2-P-NA were used. As a control, uncoated liposomes were also tested. As can be seen from the results shown in Table 5, calcein whose concentration was quenched in the inner water layer in the uncoated liposome was 90% of the total encapsulation amount.
Released up to near In contrast, palmitoylated hyaluronic acid derivative-coated liposomes released only up to 20-30%. Phospholipase D hydrolyzes the choline ester of lecithin to cause disorder in the bilayer membrane structure of the liposome, and as a result, the inclusion in the inner aqueous layer is released. Therefore, palmitoylated hyaluronic acid volatilizes phospholipase D resistance by coating the liposome, and stabilizes the liposome membrane structure.
フロントページの続き (72)発明者 松川 倉也 兵庫県神戸市兵庫区西柳原町５番26号 石 原薬品株式会社内 審査官 弘實 謙二 (56)参考文献 特公 昭43−17566（ＪＰ，Ｂ１)Front page continuation (72) Inventor Kuraya Matsukawa 5-26 Nishiyanagihara-cho, Hyogo-ku, Kobe-shi, Hyogo Ishihara Pharmaceutical Co., Ltd. Kenji Hiromi (56) References Japanese Patent Publication No. 43-17566 (JP, B1) )
Claims (3)
OM基（式中、Ｍはアルカリ金属原子を意味する）又は−
NH2基を意味する） で表わされる骨格構造を有するヒアルロン酸誘導体であ
って、アシル基R1の含有割合がＮ−アセチル基Ｎ−COCH
3に対するモル比で1/200〜1/20であることを特徴とする
ヒアルロン酸誘導体。1. General formula (I): (In the formula, R 1 means an acyl group, R 2 is a hydroxy group,
OM group (in the formula, M means an alkali metal atom) or-
A hyaluronic acid derivative having a skeleton structure represented by the formula: NH 2 group), wherein the content of the acyl group R 1 is N-acetyl group N-COCH.
A hyaluronic acid derivative having a molar ratio to 3 of 1/200 to 1/20.
を意味する） で表わされる骨格構造を有するヒアルロン酸誘導体であ
って、アシル基R1の含有割合がＮ−アセチル基Ｎ−COCH
3に対するモル比で1/200〜1/20であることを特徴とする
ヒアルロン酸誘導体を製造する方法において、ヒアルロ
ン酸又はそのアルカリ金属塩に、一般式（III） R1−OH （式中、R1はアシル基を示す） で表わされる脂肪酸又はそのハライドを反応させた後、
水酸化アルカリ水溶液で処理することを特徴とする方
法。2. General formula (II): (Wherein R 1 represents an acyl group and M represents an alkali metal atom), and a hyaluronic acid derivative having a skeletal structure represented by the following formula, wherein the content of the acyl group R 1 is N-acetyl group N- COCH
In the method for producing a hyaluronic acid derivative, characterized in that the molar ratio to 3 is 1/200 to 1/20, in the hyaluronic acid or an alkali metal salt thereof, the general formula (III) R 1 -OH (in the formula, R 1 represents an acyl group) and a fatty acid represented by
A method comprising treating with an alkali hydroxide aqueous solution.
って、アシル基R1の含有割合がＮ−アセチル基Ｎ−COCH
3に対するモル比で1/200〜1/20であることを特徴とする
ヒアルロン酸誘導体を製造する方法において、ヒアルロ
ン酸又はそのアルカリ金属塩に、一般式（III） HO−R1 （式中、R1はアシル基を意味する） で表わされる脂肪酸又はそのハライドを反応させた後、
アンモニア水で処理することを特徴とする方法。3. General formula (IV): (In the formula, R 1 represents an acyl group), which is a hyaluronic acid derivative having a skeleton structure, wherein the content of the acyl group R 1 is N-acetyl group N-COCH.
In the method for producing a hyaluronic acid derivative, wherein the molar ratio to 3 is 1/200 to 1/20, hyaluronic acid or an alkali metal salt thereof has the general formula (III) HO-R 1 (wherein R 1 means an acyl group) and a fatty acid represented by
A method comprising treating with ammonia water.
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- 1989-10-26 JP JP1277040A patent/JPH0755961B2/en not_active Expired - Fee Related
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