【発明の詳細な説明】
この発明はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に関する開発に関する。
発明の背景
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）は個々
の分離体間で非常に変化しやすく（引用文献１）１．：、（７）変化はＨＩＶ−
１とＨＩＶ−２との間ではさらに際立っている（２）。この変化は個々の分離体
間たけてはなく、個々の患者からのウィルスの一連の分離体についても見られる
（３．４）。当然ながら、ヒト免疫不全ウィルスおよびサル免疫不全ウィルス（
ＳＩＶ）の間にも類似の連続変化か観察され、また同一種のサルから分離された
場合にもＳＩＶ内に同様の連続変化が見られた（５−７）。
この変化はＨＩＶの他の遺伝子生産物よりエンベロープ糖タンパク質において大
きいたけでなく、この１つのタンパク質内においても、この変化は特定の変化し
やすい領域（初期の遺伝子生産物のタンパク分解性成熟によって発生した大半は
表面部分（ｇｐ１２０））に集中し、他の領域はそれほと変化しやすくない（８
，９）。残念ながら、大半の変化しやすい領域はまたしばしば最も免疫原性てあ
り（１０）、その結果ウィルスは部分的に宿主の免疫応答を免れ、永続的な感染
を確実にする。
このように変化しやすいことが特異的な相互作用に基づく診断技術にとって問題
となり、別々のまたは混合された試薬が通常ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２双方に
ついてサンプルをテストするために使用される。この変化しゃすいことはまたい
かなる考えられるワクチンまたは免疫治療にとっても問題となる。なぜならば、
いがなる適切な薬剤も多くの変異ウィルス株に対するとともに、ＨＩＶ−１およ
びＨＩＶ−２に対しても応答しなければならないからである。
この発明は（ＨＩＶ−１ｅｎｖ配列の発明者らの位置決定において）位置１２２
から出発する、ｅｎｖのｇｐ１２０におけるこれまで認識されていなかった高度
に保存されるウンデカペプチドを本発明者らが発見したことに基づく。ウンデカ
ペプチドはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶにも存在する。この配列は、［
高度に分岐したＪＨＩＶ−２分離体Ｄ１９４および０２０５ （Ｉ Ｉ）を含む
、双方のタイプのＨＩＶのすへてのリストされた分離体において、Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｖａ ］−］Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｒｏＬｅｕ−Ｃｙｓ−Ｖ
ａ ］ （Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、Ｉ、配列Ａとも呼ぶ）として丸ごと保存され、
高度に分岐したアフリカマンドリル分離体（１２）の場合を除いて、ＳＩＶのす
へての分離体ではトレオニンおよび第２のバリンにおいて保存的変化か起こるだ
けである。高度に分岐したアフリカマンドリル分離体（１２）では、トレオニン
および両方のロイシンが突然変異する。
この明細書では、アミノ酸は、そのフルネーム、通常の３文字略号、または表１
に記載される通常の１文字記号のいずれかによって示される。
表２は高度に保存される共通配列と比較した、ＨｒＶ−１、ＨＴＶ−２およびＳ
ＩＶの多数の異なった分離体に対するアミノ酸配列データを与える。共通配列は
絶対多数に基づき、個々の分離体に対して、点線は共通配列との一致を示し、そ
うでない部分にはアミノ酸が示される。
遺伝子コードの冗長性は少し幅広い変化を可能にするが、このペプチドをコード
する遺伝子のヌクレオチド配列の比較においてもまた高度の保存性が見られる。
配列情報はロス・アラモス・データ・ベース（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｉａ
Ｂａ５ｅ）から得られたものである。
初期の報告によれば、ｇｐ１２０の免疫支配的な領域は大部分は可変ループ、特
にｖ３にある（たとえば１０）。
ペプチドを用いた限られた研究は我々が説明する保存領域を含んでいた（たとえ
ば１３）。これらのペプチドはほとんど免疫原性を示さなかった。これは輸送タ
ンパク質への結合においてアミノ酸側鎖を修飾から保護するために何も注意が払
われなかったからであると現在考えられている。
上述の保存配列はプロテウス・バイオテクノロジ・リミテッド（Ｐｒｏｔｅｕｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍ１ｔｅｄ ）のＥＰＯ２９８６３３にお
いて、ＨＩＶの少なくとも１つの株に対する免疫を促進するための可能なワクチ
ンベースとして言及されている。この配列はＨＩＶエンベロープタンパク質の少
なくとも１つの池の抗原決定基に対する形態学的類似性に基づいて選択されたと
記載されている。しかしながら、Ｈｌｖ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの異なっ
た株間における配列の高度な保存性の評価についてはＥＰＯ２９８６３３には何
も示されていない。
ＥＰＯ２９８６３３はまた、上述の保存配列のＣ末端を、類似の聾様で選択され
たさらなる配列に結合することを開示しており、重要でないＣ末端ジペプチドＣ
ｙｓ−Ｖａｌはおそらくは省いてもよく、配列の第１のＣｙｓ残基は分子内ジス
ルフィド架橋を経て分子の別のＣｙｓ残基に架橋結合され得ることがこの文献に
は記載されている。
この発明はさらに、保存配列の正しい提示か免疫応答を引出すために非常に重要
であるという理解に基づく。現在では、その本来の形状において、上述の保存配
列は、分子内ジスルフィド架橋を経て、ＥＰＯ２９８６３３て提案されたものと
は異なるｇｐ１２０のさらなる配列に架橋結合されることが知られる。このさら
なる配列（配列Ｂ）もまたＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の双方の採肉て高度に保
存され、２つのタイプの間には限られた突然変異しかない。
ＳＩＶ分離体＋１ＨＩ Ｖ−１（Ｓ Ｉ Ｖｃ、、 ）またＩ；ｔＨＩＶ−２（
ＳｒＶのすへての他の株）のいずれかに強い類似性を示す（表３）。現在ではさ
らに、上述の保存配列の双方のシスティン残基が、本来の配座（１４）でそれぞ
れジスルフィド架橋に関与することか理解されており、システィン残基の一方は
重要ではないというＥＰＯ２９８６３３の記載に反して、適切な免疫応答を引出
すためには双方のシスティン残基か必要であると考えられる。この第２のペプチ
ドの強い保存性は、それが保存配列とともに必要な構造上の配座を形成すること
と十分に適合する。
このことを示すために、本願発明者らは双方のシスティン残基がジスルフィド結
合のほぼ２分の１まで誘導された状悪て、上述の保存配列を使用して研究を行な
い、本来の表現形を模倣した。このペプチドに関する最初の免疫原性の研究は、
このペプチドが適切な輸送タンパク質に結合されて提示された場合に免疫原性で
あり、結果として生じる抗血清は透過性とされた細胞において本来のｇｐ１２０
と反応することを示す。適切な配向で各配列の双方のシスティン残基からジスル
フィド架橋を介してさらなる配列に結合された上述の保存配列を使用して研究か
行なわれた。
発明の概要
１つの局面において、この発明は、アミノ酸配列すシジーブロリンーシステイン
ーバリンーリシンーロイシンートレオニンーブロリンーロイシンーシステインー
バリン（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、Ｉ ）ををするペプチドを含む分子であって、各
システィン残基が、さらなるシスティン残基にジスルフィド架橋されているかま
たはジスルフィド結合の部分を模倣するように誘導化されている分子、またはＨ
ＩＶ ｅｎｖのｇｐ１２０のエピトープの免疫原的挙動を模倣する、そのような
ペプチドの機能的に等価な変形体を提供する。
関連のＳ■Ｖにおいてよく似た保存を伴う、ＨｒＶの表面エンベロープタンパク
質内でのペプチド配列の厳密な保存性は、この発明の基礎である配列がｅｎｖ−
タンパク質の機能に極めて重要であり、したがって他の今のところはまだ特徴付
けられていない分離体でもそれ以上変化しそうにないことを示唆する。研究音速
はこの配列がＥＭＢＬデータベースの他のタンパク質には存在しないことを示し
ているので、これは免疫不全ウィルスに特異的であるように思われる。したがっ
て、この発明は以下に説明する診断薬、免疫原性の薬剤および治療薬の設計に対
して多くの考えられる意味合いを持つ可能な固定配列を提供する。
上に説明したように、分子がｇｐ１２０の対応するの配列の挙動を正確に模倣す
るためには、各システィン残基がそれぞれのジスルフィド架橋（実際のまたは適
切な誘導によって模倣されたもの）に寄与していることが重要である。
これはたとえばＳ−アセタミドメチル誘導体のようなシスティン残基の適切な誘
導化によって達成できる。代替的に、これは、システィン残基をさらなるペプチ
ド配列のそれぞれのシスティン残基に架橋結合することによって達成でき、この
さらなるペプチド配列は、ペプチドの適切なリンカ−または他の特性によっであ
るａ■隔て本発明のペプチドにつながっているものであってもよいし、または別
個のペプチドてあってもよい。ｇｐ１２０で発生することが現在知られている実
際の架橋結合に基づく１つの好ましい架橋結合配列は以下のとおりである。
（配列Ａ） （Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１ ）Ｓ ＤＳＴ；Ｉ ＫＥＴ Ｄ
ある）
配列Ａはこの発明が基づくユニークに保存される配列であり、配列ＢはＨＩＶ−
１のアミノ酸２１９から２３０およびＨＩＶ−２の２１０から２２１の配列に基
づき、突然変異は頻度の順に下に示される。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対し
てさまざまな配列が最適であるかもしれないが、配列Ｂはこのようにかなり保存
性がある（表３）。
所望のペプチド配列は、たとえばＦｍｏｃ法を使用して、通常の態様で容易に合
成できる。代替的に、ペプチド配列は既知の態様て組換えＤＮＡ法によって生産
可能である。
この発明のさらなる局面は、この発明に従うペプチド分子をコードする、好まし
くは適切な発現ベクターに組込まれたＤＮＡ分子を提供する。
高度に保存される配列に基づくこの発明の分子は、その分子の機能的に重要な免
疫原性の挙動に著しく影響を及ぼすことなく、さまざまな異なった方法で修飾で
きるようである。当該ペプチド配列または各ペプチド配列に対する可能な修飾は
以下のものを含む。
１） １つ以上の個々のアミノ酸はたとえば以下のような共通の特性を有するア
ミノ酸によって置換可能である。
■を■によって置換
ＴをＳによって置換
ＫをＲによって置換
りを１、■またはＭによって置換
２） １つまたはそれ以上の通常のペプチド結合を等配電子装置き換えによって
置換可能である。可能な置き換え結合はペプチド合成の分野の当業者には周知で
あり、たとえは引用文献１５て検討することがてきる。アミノ酸のアルファ炭素
が窒素原子によって置換されるアザペプチド結合の使用（つまり−ＮＨ−ＮＲ−
Ｃｏ−） 、メチルアミンを与える還元アミド結合（つまり−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ
Ｈ。
−）、’ＣｏをＣＨ２によって、かつＭＨをＳによって置換した千オメチル基（
つまり−３−ＣＨＲ−ＣＭ、＝）、ＮＨおよびＣＯ基双方の不飽和炭素原子によ
る置換（つまり＝ｃＨｍｃＨＲ−ｃＨ＝）、またはＭＨ基のメチレンによる置換
（つまり−Ｃｌ−ｌ２−ＣＨＲ−ＣＣ）−）の例か含まれる。
３） ジスルフィド架橋されたシスティン残基（つまりノスチン残基）の一方ま
たは双方の対は以下のようなシスチン類似体によって置換可能である。
４） １つまたはそれ以上のアミノ酸を「逆−倒ＷＣｒｅｌｒｏ−ｉｎＶｅｒｓ
ｏ ） Ｊ アミノ酸、つまり、ＷＯ９１／ｌ ３９０９て論じられたアミノ酸
に対応する官能基を有する三官能アミンによって置換可能である。
５） １つまたはそれ以上の重要でないアミノ酸をけずってもよい。
６） 機能に著しく影響しない１つまたはそれ以上の付加的なアミノ酸を含むこ
とがてきる。
７） ペプチドの３次元構造を模倣した構造上の類似体をペプチドの代わりに使
用することができる。
この発明に従う分子は免疫応答を引出すことが可能であることか示された。した
かって、この分子の１つの可能な用途はＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連疾病に対し
て可能性のあるワクチンの主成分（ベース）としてのものである。
さらなる局面において、この発明はこの発明に従う分子を含むＡＩＤＳおよびＡ
ＩＤ、ｓＩ！Ｊ連疾病に対するワクチンを提供する。
この目的のために、この発明の分子は、あるいは保存配列のアミノ酸の化学基を
介して、またはＣ−もしくはＮ−末端で付加された付加的なアミノ酸を介して、
任意に担体分子に結合され得る。たとえばＴｙｒ残基の側鎖を使用する多くの適
切な結合が知られている。適切な担体は、たとえば、スカンガイのヘモシアニン
（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）
、オボアルブミン、非タンパク質担体および多くの他のものを含む。保存配列の
りシン残基はこの発明の分子において非常に重要であると考えられ、この理由の
ために、リシン残基のニブシロン−アミノ基は、結合剤の使用の前にその後再生
される基を用いて、担体を結合する反応の間望ましくない反応を防ぐため、既知
の態様で保護することが好ましい。
この発明の分子は、代替的に可能な生ワクチンとして、たとえばポリオまたはワ
タシニアなとの遺伝子的に修飾されたウィルスの被覆の一部として与えることが
できる。
この発明のワクチンは通常の態様で、たとえば注射、経口なとて投与され、フロ
イント完全アジュバントもしくは不完全アジュバントまたは水酸化アルミニウム
などの従来のアジュバントを使用してもしなくてもよく、また他の免疫強化剤を
使用してもしなくてもよい。ワクチンを投与するため処方する際に使用するのか
適した希釈剤もまた周知であり、蒸留水、リン酸塩緩衝生理的食塩水、およびク
エン酸塩緩衝液なとの緩衝溶液が含まれる。
この発明に従う分子は、ＨＩＶウィルスのヒトまたは動物の細胞への結合を外す
ように作用することによって、またはウィルスの３次元組織を乱すことによって
、ＡＩＤＳおよび関連疾病の処置（予防または治療）における用途をさらに見出
し得る。
この発明のさらなる局面はＡＩＤＳまたは関連疾病の予防または治療のための方
法を提供し、効果的な量のこの発明に従う分子を投与するステップを含む。
さらなる局面において、この発明はあるいは１つ以上の製薬的に許容されるアジ
ュバント、担体および／または賦形剤とともに、この発明に従う分子を有効成分
として含有する製薬組成物を提供する。
この発明はまたＡＩＤＳまたは関連疾病の治療または予防的処置に対する薬剤の
調製のためのこの発明に従う分子の用途を提供する。
この発明が基づく保存配列に結合する分子、特に抗体、抗体関連分子、およびそ
の構造上の類似体もまたＡＩＤＳおよび関連疾病の治療および診断における薬剤
としての使用か可能である。
さらなる局面において、この発明はこの発明のベースである保存配列に結合する
分子、特に抗体、抗体の抗原結合部位、またはその構造上の類似体を提供する。
抗体（モノクローナルおよびポリクロナール）を製造するための技術は当該技術
分野において周知である。
キメラ抗体、人体に適応させた抗体、修飾された抗体、および設計された抗体な
どの、（抗原結合部位を含む）抗体の変形物は一般にこの発明の範囲内に含まれ
る。このような変形物を生産するための技術もまた当業者には周知である。
ｇｐ１２０の保存配列の３次元構造の知識があれば、この配列に結合する合成分
子を設計しかつ構成することが可能である。この目的に適切な技術はたとえば引
用文献１６および１７に開示されており、これらはレニンに対して可能性のある
抑制剤を設計するためのコンピュータモデルの使用を含む。
この発明か基つく保存配列に結合する抗体および他の分子は以下を含む多くのさ
まざまな方法で治療（予防および治療）ならびに診断目的のために使用可能であ
る。
１） 抗体、好ましくは人体に適応させた抗体の患者への適切な投与による受動
免疫のため。
２） （おそらくは適切な抗体エンジニアリングによって入手される）適切なサ
ブクラスまたはアイソタイプの抗体を使用することによって、補体を活性化する
かまたは抗体依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介して、所望の機能を発揮さ
せることかできるようにするため。
３） たとえは抗体の結合剤および細胞毒性成分を含む免疫毒素を使用すること
によって毒素または他の薬剤の目標とする配達を行ない、ｇｐ１２０の目標とす
る保存配列に直接的または間接的に結合するため。
４） ＨＩＶ感染細胞の表面に対して高度に免疫原性の物質をねらい通りに配達
し、宿主の体液性または細胞性免疫システムのいずれかによってそのような細胞
の可能な除去をもたらすため。
５） たとえばさまざまなイムノアッセイ法を使用してＨＩＶを検出するため。
上のすへてを実行するため技術は当業者に周知である。
別の局面において、この発明は治療または診断目的のためにこの発明の保存する
配列に結合する分子の使用を含む。
この発明はまたこの発明に従う分子を使用して、ＨＩＶ、ＨＩＶに対する抗体、
またはＨＩＶによる感染を検出するための方法およびキットをその範囲内に含む
。
以下の例においてこの発明を例示としてさらに説明する。
第１の例は高度に保存される配列を組込むペプチドに関する免疫学的研究に関す
るものであり、これはペプチドが免疫原性であり、かつ抗血清は感染された細胞
において本来のｇｐ１２０と反応することを示す。この例では添付の図面の図１
から４を参照する。
図１は細胞の免疫蛍光を示す一連の写真である。ペプチドての処理の前後におい
てウサギから得られた血清で処理する。いくつかはＨＩＶ−１からｇｐ１２０を
発現している。血清はいくつかの場合には細胞への適用の前にペプチドで処理さ
れる。
図２は、ＨＩＶ−１の異なる分離体に感染されていない細胞または感染されてい
る細胞の免疫蛍光を示す一連の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後に
おいてウサギから得られた血清で処理される。
図３は、感染されていない細胞、または感染された細胞の免疫蛍光を示“す一連
の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後において２つの異なったウサギ
から得られた血清で処理される。
図４は、ＨＩＶ−２に感染されたまたは感染されていない細胞の免疫蛍光を示す
一連の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後においてウサギから得られ
た血清で処理されている。
第２の例は、適度に保存される配列Ｂと逆平行の形態でジスルフィド架橋された
高度に保存される配列Ａを組込むペプチドについての免疫学的研究に関するもの
である。このペプチドは示されるように免疫原性であり、かつその感染性を中和
するた゛めに抗血清がＨＩＶ−１と反応することを示す。この例では添付の図面
の図５を参照する。
図５は、組織培養細胞の上方にある上澄み液に存在するウィルスのグラフであり
、’ Ｈ−ｄＴＴＰを組込む際のウィルス逆転写酵素の活性によって測定され、
ＲＰＭＩ／１０％ＦＣ３て１．２０に希釈される示された血清（またはリン酸塩
緩衝生理的食塩水、ＰＢＳ）を用いて、６０分間３７°Ｃで処理されたウィルス
（’５０ ＴＣＩ Ｄｓ。）で意図的に感染させた後さまざまな時間において測
定されたものである。
分析のために用いたＨ Ｉ ＶおよびＳＩＶ配列は、ロスアラモスデータベース
（’Ｌｏｓ ＡｌａｍｏＳＤａｔａ Ｂａ５ｅ）からのものである。配列の比較
は、ニューシーラント、ダニ−ディン（Ｄｕｎｅｄｉｎ ） 、オタゴ大学（Ｏ
ｔａｇＯＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 、ＰＡストックウェル（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ
）からのＲＯＭＥＤ、バージョン３．３０を用′いてＶＡＸ８６’００コンピ
ュータで行なった。
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２分離物のエンベロープ糖タンパク質配列の位置決定
は、保存度が異なるいくつかの部位を示した。しかしながら、ＳＩＶ配列に対し
ても比較を行なうとこれらのほとんとは保存されておらず、重要なサイズの単一
の領域のみか保存された。これは、第１の超可変（Ｖｌ）ループ（９）の直前に
おいてｇｐ＋２０で起こる。保存は表２に示される。ウンデカペプチドはＨＩＶ
のすへての分離物において絶対的に保存され、ＳＩＶにおける変化はかなり保存
性かあり、はとんどの分離物ではＴがＳに、かつＶが１に変化するたけである（
他の点において高度に分岐したアフリカマンドリル分離物ＧＢＩにおいてはＬが
■に、ＴがＮに、およびＬかＹに変化する）。
１１アミノ酸の配列はＨＩＶおよびＳＩＶに独特のよってあり、ＥＭＢＯおよび
スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ）配列データベースのサーチの際に５つ
を上回る隣接した残基（またはギャップを許容する６残基）の一致は見出されな
い。他の点において高度に可変であるｇｐ１２０のこの部位の制限された配列の
変化は、これかＨＩＶの生存能力に必須であるかもしれず、したがって大きく変
化することはできず、なお感染性の後代ピリオンを維持することを示唆している
。
配列の位置決定はまた、第２の超可変（■２）ループ（９）直後の、第１の独特
に保存された部位（１４）における両方のンステイン残基に対してジスルフィド
架橋した第２の部位の高度の保存を示し、この保存は表３に示される。
保存はジスルフィド架橋を形成するシスティン残基間で最大てあり、各ＨＩＶタ
イプは、極めて高い保存性を持ってのみ突然変異し、ＳＩＶ分離物か一方または
他方のＨＩＶタイプに類似する。このことはさらに、逆平行の架橋ペプチドか、
ウィルスの生存能力にとって必須であるｇｐ１２０内の構造を形成することを示
唆している。
例１
この分析に基づいて、本発明の高度に保存される配列に基づく合成ペプチドを用
いて実験を行なった。
すべての化学物質は分析グレードのものであり、言及しない限りさらなる精製を
行なわないで用いた。
ペプチド合成
配列ＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＹ （Ｓｅｇ、［ｄ、Ｎｏ、４ ）を存するペ
プチドを自動合成機（Ｌ Ｋ Ｂバイオリンクス（Ｂｉｏ１ｙｉ＋ｘ ） ）を
用いてＦｍｏｃ連続フロー固相合成によって合成した。２．３−ジヒドロ−３−
ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジンのエステルか好ましいＴｈｒを除い
ては、Ｆｍｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをアシル化種として用
いた。キーゼルグールに支持され、ヒドロキシメチルフエノキソ酢酸結合により
機能的にされたポリジメチル−アクリルアミドを、内部標準アミノ酸とされるノ
ルロイシンとともに（１８，１９）固相支持体として用いた。
Ｃｙｓの側鎖上の酸に安定なＡｃｍ （アセタミドメチル）以外は、ｔｅｒｔ−
ブチル基側鎖保護基の同時開裂を引起こすトリフルオロ酢酸／フェノールｌ／
ｌ−リエチルシラン（５００ｍｇのペプチド−樹脂アセンブリに対して２３ｍ１
／Ｉ ｇ／１ｍ１）を用いて樹脂からペプチドを分離した。樹脂をろ過によって
除去し、少量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて洗浄した。減圧下でのロー
タリーエバポレーションによって、合わされたＴＦＡろ液から溶媒を除去した。
油状の残渣はＯ１％ａｑ、（水性）ＴＦＡ（２０ｍｌ）に溶解し、ジエチルエー
テル（５Ｘ２０ｍｌ）で抽出し、凍結乾燥によって合わされた水相から溶媒を除
去して、白色の粉末（２０，９ｕｍｏｌ、７６％収率）を生成した。
合成後ＨＰＬＣによってペプチドを分析すると、少な（とも９８％の純度である
ことがわかったため、それ以上精製することなくウサギの免疫処置のためＫＬＨ
に対する結合に用いた。
抗血清の生産
ペプチドを約３０倍モル過剰で、本質的にはバシリおよびユティガー（Ｂａｓｓ
ｉｒｉ ａｎｄ Ｕｔｉｇｅｒ）のプロトコル（２０）によって、これをキバー
ステイス（に１ｂｅｒｓｔｉｓ ）ら（２１）に従って修飾して、ＫＬＨに結合
させた。我々はできるだけ元のタンパク質に近い条件でペプチドを提供すること
に特に関心があるため、Ｃｙｓ残基をＳ−アセタミドメチル誘導体として残し、
これがジスルフィド結合の約半分に対して選択され、Ｌｙｓ残基のイプシロン−
アミノ基を、ヒドロキシル基に転換しないように、結合反応の間、結合に先立っ
てｐＨ９，０の２．３−ジメチルマレイン酸無水物（１０倍モル過剰）を用いた
修飾によって保護し、その後８時間にわたってｐＨ６，５，２０℃で脱保護した
（２２）。
３匹のニューシーラント・ホワイト・ラビット（Ｐｉｎｇ、ＰｏｎｇおよびＰａ
ｎｇとして知られている）（英国ローズミールラビット社（Ｒｏｓｅｍｅａｌ
Ｒａｂｂｉｔｓ Ｌｔｄ、 ）からの通常通りに繁殖されたもの）を、フロイン
ト完全アジュバントにおける０、６ｍｇペプチド当量で、複数回の皮下注射によ
って免疫処置し、その後不完全フロインドアジュバント中の０゜３ｍｇペプチド
当量で２回皮下的に刺激を与えた。免疫処置前、および免疫処置後の血液サンプ
ルを最終免疫の血液とともに採取し、サンプルを室温で凝固させることによって
血清を調製した。
免疫応答をＥＬＩＳＡによってマイクロタイター・プレートのウェルに結合した
ペプチドに対してモニタし、その後これらをウシ血清アルブミンでブロックした
。第２の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫ
ＯＬｉｄ、 ）を用い、基質としてｌ、２−フェニレンジアミン、ジヒドロクロ
リド（ＤＡＫＯＬｔｄ、 ）を用いた。
ウサギの免疫処置前の血清および免疫処理後の血清のＥＬＩＳＡは、スカシガイ
のヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合して与えられると、３匹のウサギすべてが免疫
原としてペプチドに応答を表わしたことを示した（表４）。１：６４００または
１ ： ３２００の希釈において、最後に採血したものでは数値が高く（免疫処
置前の血清と比較して４倍に等しいか、またはそれを上回る） 、ＫＬＨに対す
る抱合体として与えられるとペプチドが免疫原となったことを示唆している。
。
ＨＩＶ感染細胞に対する抗血清の結合に関する免疫蛍光研ウサギ血清中の抗体の
本来のｇｐ１２０への結合について、共焦点免疫蛍光顕微鏡（２３）であるバイ
オラ・ノド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ） ＭＲＣ６００共焦点顕微鏡を用いてアッセイ
を行ない、ウサギの抗体を示す第２の抗体としてフルオレセインイソチオシアネ
−１−（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） ）を用いた。本来のｇｐ１２０に対する
正のコントロールであるウサギの抗血清は、ナショナル・インステイチュート（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のロッド・ダニエル（Ｒｏｄ Ｄａｎ
ｉｅｌ）博士からロンドンのメディカル・リサーチ（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａ
ｒｃｈ）社に贈られたものであった。テスト細胞はヒトＴリンパ芽球細胞株Ｃ８
１６６であり、これはヒトＴ細胞リンパ性ウィルスタイプ−１（２４）により非
生産的に感染される。これはＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清において成長させ、
ＨＩＶ−Ｉ ＢＲＵ（２５）、ＨＩＶ−Ｉ ５Ｆ２（２６）て感染させるか、ま
たはコントロールとして感染させないようにした。細胞（１５ｕｌにおいて１０
９をポリーＬ−リシン処理された顕微鏡スライドのウェルに移し、室温で３０分
間結合させ、その後４％グルタルアルデヒドで固定させ、０．１％トリトンＸ１
００で処理して、プラズマ膜を透過性にした。ＰＢＳ中の適切な希釈の抗血清か
添加され、細胞を洗浄する前に、室温て６０分間結合させた。フルオレセイン標
識第２抗体を（供給業者が推奨する希釈で）添加し、ＰＢＳにおいて洗浄する前
に６０分間結合させた。次にスライドを共焦点顕微鏡で調べ、抗体の結合を検出
し、適当な標本を撮影した。
ＨＩＶ−１１□１８のｇｐ１２０を発現する細胞に対する免疫血清の結合が、免
疫処置前の血清およびコントロールとしての感染されていない細胞の両方を用い
て測定された。
１匹のウサギ（Ｐａｎｇ）に対する典型的な視野が図１に示される。この図の上
方のパネルでは、細胞にはｇｐ１２０を発現していないもの（ａ、ｂおよびｆ）
と、発現しているもの（その他の写真すべて）があり、免疫処置前の血清（ａお
よびｅ）で処理されたものと免疫血清で処理されたもの（その他の写真すべて）
がある。この図の下方のパネルでは、すべての細胞がｇｐ１２０を発現し、１匹
のウサギ（ｐａｎｇ）からの免疫血清で、ペプチドなしで処理されたもの（ｉお
よびｍ）、ペプチド八を用いたインキュベーションの後処理されたもの（ｊおよ
びｎ）、または別のウサギ（Ｐｉｎｇ ）からペプチドなして処理されたもの（
ｋおよび０）、ペプチド八を用いたインキュベーションの後処理されたもの（ｌ
およびｐ）かある。
図１は免疫血清とｇ１２０発現細胞との結合のみが大きく、一方非発現細胞と血
清、または感染された細胞と免疫処置前の血清については結合度が低いことを示
している。
ｇｐ１２０発現細胞に対する免疫血清の結合の分布は、発現細胞には結合するが
非発現細胞には結合しない、ｇｐ１２０て免疫処置されたウサギからのコントロ
ールの血清について示されるものと非常に類似している。さらに、感染された細
胞に対する免疫血清の結合はペプチドによってブロックされ、つまりこれがｇｐ
１２０上の特異的部位に対するものであることを示している。
感染細胞中のＨＩＶ誘導物質に対する免疫血清の結合は、免疫処置前の血清およ
びコントロールとしての感染されていない細胞の両方を用いて測定された。ＨＩ
Ｖ−ＢＲＵを用いての１匹のウサギ（Ｐｉｎｇ）に対する典型的な視野が図２に
示される。この図において、細胞は感染されていない（ａ、ｂ、ｅおよびｆ）か
、またはＨＩＶ−Ｉ ＢＲＵで感染されている（Ｃおよびｄ）もしくはＳＦ２で
感染されており（ｇおよびｈ）、一方血清は免疫処置前（ａ、Ｃ。
ｅおよびｇ）のものと免疫（ｂ、 ｄ、ｆおよびｈ）のものかある。バーは２５
ｕｍを表わす。
図２は、免疫血清と感染細胞とのみか大きく結合し、血清と感染されていない細
胞、または免疫処置前の血清と感染細胞とては結合度か低いことを示している。
感染されていない細胞に対する免疫血清の結合の分布は、感染細胞には結合する
か感染されていない細胞には結合しない、ｇｐ１２０て免疫処置されたウサギか
らのコントロールの血清について示されるものと類似している。ＨＩ’Ｖ−Ｉ
ＳＦ２て感染された細胞を用いてこれらの実験を繰返すと、非常に類似した結果
（図１のｇおよびｈ）を示し、反応が使用するＨＩＶ株に依存しないことを確か
にした。
ＨＩＶ−Ｉ ＳＦ２および別の２匹のウサギ（ＰｏｎｇおよびＰａｎｇ）からの
血清を用いて行なった同様のテストの結果か図３に示される。図３ａは、どちら
も感染された細胞を用いてＰｏｎｇからの免疫処置前の血清（左上）または免疫
血清（残りの写真）を用いた結果を示し、図３ｂは、Ｐａｎｇからの免疫血清を
用いて、感染されていない細胞（左上）または感染された細胞（残りの写真）を
用いた結果を示している。バーは２５ｕｍを表わす。
ウサギＰａｎｇからの血清でも、ＨＩＶ−Ｉ ＢＲＵまたはＳＦ２で感染された
細胞に対して同じような結合が認められた（図３ａ）。第３のウサギ（Ｐａｎｇ
）もやはり、その高度免疫血清の結合を示したが、この場合には免疫処置前の血
清もＨＩＶ−Ｉ ＢＲＵで感染された細胞に結合したため、この応答については
結論が得られなかった。しかしなから、ＨＩＶ−Ｉ ＳＦ ２で感染された細胞
は、免疫処置前の血清および免疫血清（図３ｂ）の両方について、他のウサギと
非常に類似した結果を示し、このウィルス株では、免疫処置前の血清は結合せず
、つまり結合が免疫処置の結果として生じることが示された。
図４は１匹のウサギ（Ｐｏｎｇ）からの血清のＨＩＶ−２で感染された細胞への
結合を示す。細胞は感染されていない（ａおよびｂ）か、またはＨＩｖ−２ＣＡ
Ｍ！で感染されており、免疫処置前の血清（ａおよびＣ）または免疫血清（ｂお
よびｄ）で処理した。やはり結合は感染細胞に対する免疫血ｉｎのみに見られた
。
これらの結果は、提供された形態、すなわちスカシガイのヘモシアニンに結合し
、ジスルフィド架橋を模した配置におけるシスティン残基およびリシン残基のイ
プシロンアミノ基が維持された状態でのｇｐ１２０の高度（こ保存さ第１た配列
が、テストした３匹のウサギにつし１て皇女子な免疫応答を与えたことを示して
いる。結果として生じる１几血清（よ、ＨＩＶ−２、およびＨＩＶ−１のし１く
つ力１の株力為らの本来のｇｐ＋２０に結合する。
エビｌ−−ブの表面接近が可能であるこの保存（よ、このペプチドか元のタンパ
ク質においである機台ヒ０りな役割を有し１ｒＦることを示唆している。可能な
役割の１つ（よ、よく牛！徴付けられたＣＤ４に付加的な受容体への結合であろ
う。
五
ｇｐ＋２０における天然由来の架橋配列（こ基づし１て、Ｗｌｌのペプチド（Ｂ
ｊＡペプチド）にジスルフィド′架橋した本発明の保存配列を含むペプチド（Ａ
鎖ペプチド°）を用０て、さらに実験を行なった。
Ａ ｊｌ’ｊペプチドおよびＢ鎖ペプチドの配列（架橋も示す）は以下のとおり
である。
（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、５１
本発明の配列ＡおよびＢに基づいてジスルフィド架橋ペプチドを用いた実験をさ
らに行なった。
ペプチド合成
配列ＤＱＳＬＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＹ （Ａ鎖）（Ｓｅｇ、 ｌｄ、Ｎｏ
、 ６ ）およびＬ ＩＮＣＮＲ３ＡＩＫＥＳＣＰＫＶＳＦ （Ｂ鎖） （Ｓｅ
ｇ、Ｉｄ、Ｎｏ、５ ）を有するペプチドを例１て述へたように合成したが、こ
こではＡ鎖のシスティン７についてＡｃｍおよびシスティン１４についてトリチ
ル、ならびにＢ鎖のシスティン４についてトリチルおよびシスティン１３につい
てＡｃｍによりシスティン残基を保護した。トリチル基を各ペプチドからアシド
リシス（酸分解）によって除去し、Ａ鎖において結果として生じるシスティンは
２−ジピリジルジスルフィドと反応し、ゲルろ過して過剰な試薬を除去した。活
性化されたペプチドを次に１゜５倍過剰Ｂ鎖と反応させ、単独にジスルフィド架
橋されるペプチドをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ ） ＣＭ ５２陽イオン交換
樹脂で精製した。
メタノール中ＩＯ当量の１２との反応によって第２のジスルフィド架橋が特異的
に形成された。最後にペプチドをゲルろ過によって精製した。
抗血清の生産
ジスルフィド架橋ペプチドを、リシン残基に対する同じ保護を用いて、例１て述
へたのと全く同じようにＫ Ｌ Ｈに対して結合させた。２匹のウサギ（Ｔｒｉ
ｓｔａｎおよびに５ｎｉｇＭａｒｋｅ ）をフロイント完全アジュバントにおけ
るＫＬＨ抱合体の皮下注射によって免疫処置し、フロイント不完全アジュバント
中の同じ抱合体で１回刺激を与えた。その後の刺激はフロイント不完全アジュバ
ントにおけるペプチドだけで行なった。
マイクロタイター・プレートのストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ
）被覆されたウェルに結合した、ビオチニル化ペプチドに対してＥＬＩＳＡによ
って免疫応答を分析した。
展開試薬は例１と同しものであった。
ウサギの免疫処置前の血清および免疫処置後の血清のＥＬＩＳＡは、上述のよう
に与えられると、双方のウサギとも免疫原としてのペプチドに応答を表わすこと
を示した（表５）。最終的に採血したものでは、Ｉ：１６０００の希釈において
数値が高い（免疫処置前の血清と比較して１０倍を上回る）。
抗血清によるウィルス中和の研究
ＨＩＶ−ｉ８．、のサンプル（５０組織培養感染投与量（ＴＣＩＤａｏ） ）を
、３７℃で６０分間、ＨＩＶ １ｉ＊−からのｇｐ＋２０で免疫処置したウサギ
からの血清もしくはコントロールとしてのＰＢＳと、または１匹のウサギ（Ｔｒ
ｉｓｔａｎ ）からの免疫処置前の血清もしくは免疫血清の１２０希釈とインキ
ュベートした。次に処理されたウィルスをＣ８１６６組織培養細胞を感染させる
ために用い、感染の過程は標準的な方法に従い、鋳型としてポリ−Ａを、および
プライマーとしてオリゴ−ｄＴを用いての’Ｈ−ｄＴＴＰの組込後に、トリトン
Ｘ１００によって放出される逆転写酵素活性によって細胞の上清にあるウィルス
を測定する。
図５は、ＰＢＳのコントロールとインキュベートしたウィルスでの感染後では７
日目から１２２日目間に上演のウィルスが約１０００倍に増える一方で、ｇｐ１
２０に対する抗血清を用いたウィルスのインキュベーションはいかなる感染の徴
候も妨げることを示している。免疫処置前の血清は感染に影響を及はさなかった
が、免疫血清は抗ｇｐ１２０コントロール血清と同様に感染を防ぐ効果があった
。
上述の方法による本発明のジスルフィド架橋ペプチドでの免疫処置は、したがっ
てウィルスの感染力を中和する血清中の抗体の生成をもたらした。さらに、免疫
原におけるＢ鎖の配列は、ＨＩＶ−１，。における当量のペプチドと同してはな
いが、やはり中和が見出されている。全体のペプチドがＨＩＶ−１またはＨＩＶ
−２の変異体と反応する抗体をもたらすことを示唆しているが、上述の各々１つ
のペプチド種で特定のＨＩＶタイプとよりよい反応が得られるかもしれない。
アミノ１１Ｇ し会う
Ｔミノ内賃−３文！ｐ略ｂ （え中自已５／＜’）ン Ｖａｌ １７
１区
３９ ＳＩＶ′ ｓ＋、ｔｕ−ｓ４ Ｅ工 ｌ−４ｓｕＲ０＋木 ＋Ｉ＾ＭＲ１
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すＶＥｌｌＫＭＳ（ＱＳｅｑ、二二、Ｊｉｏ、９１」Ｌユ
引出、を小木：
１、 ＲａＬｎｅｒ、Ｌ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣ＆％４ｏｎｇ−５Ｌａａｌ、Ｆ ｆ
＋９８５１ Ｎａｔｕｒｅ［Ｌｏｎｄ、ｌ ３１３，６３６−６３７゜２、 Ｃ
１ａｖｅｌ、Ｆ、 Ｇｕｙａｄｅｒ、 Ｍ、 Ｇｕｅｔａｒｄ、 Ｄｒ ５ａｌ
ｌｅ、 ＭＩＭｏｎｔａｑｎｉｅｒ、Ｌ ＆ 八１ｉｚｏｎ、Ｍ ｆ＋９Ｂ６１
Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ、ｌ ３２４． ６９＋−３、Ｈａｈｎ、Ｂ Ｈ，
Ｓｈａｗ、 Ｇ ＩＬ Ｔａｙｌｏｒ、 Ｍ Ｅ、 Ｒｅｄｆｉｅｌｄ、ＲＲｅ
Ｍａｒｋｈａｒｎ、Ｐ Ｄ、５ａＬａｈｕｄｄｉｎ、Ｓ Ｚ、Ｗｏｎｇ−５ｔａ
ａｌ、Ｆ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣ。
Ｐａｒｋｓ、ＥＳ＆ ＰａｒｋＳＩ Ｗ Ｐ ＋１９８６１５ｃｉｅｎｃｅ ＋
Ｗａｓｈ、ｌ ２３２１ ＋５４８−＋５５３゜
４、 Ｓａａｇ、Ｍ Ｓ、日ａｈｎ、Ｂ Ｈ，Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｊ、Ｌｉｔ Ｙ
、Ｐａｒｋｓ、Ｅ Ｓ。
Ｐａｒｋｓ、 Ｗ Ｐ ＆ Ｓｈａｗ、 Ｇ Ｍ ［９８Ｂ１ Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄ、） ３３４．４４０−５． Ｄａｎｉｅｌ、Ｍ Ｄ、Ｌｅｔｖｉｎ
、Ｎ Ｌ、Ｋｉｎｇ、８％４ Ｋａｎｎａｇｉ、５１Ｓｅｈｑａｌ、 Ｐ Ｋ、
Ｈｕｎｔ、 ＲＤ、 Ｋａｎｋｉ、 Ｐ Ｊ、 Ｅｓ５ｅｘ、 Ｍ ＆ Ｄｅ
ｓｒｏｇｉｅｒｓ。
Ｃｉ＋９８５１５ｃｉｅｎｃｅ （Ｗａｓｈ、） ２２Ｂ、＋２０１−１２０４
゜６ 、Ｆ ｒ ａ ｎ Ｃｈ １ｎ Ｌ ｒ Ｇ ｒ Ｇ ｕ ｒ ｑ ０１
． Ｃｒ Ｇ ｕ Ｏ＊ ＋（−Ｇ ｒ Ｇ ａ １１０ ＊@ＲＣｔ
Ｃｏｌｌａｔｉ、Ｅ＋ Ｆａｒｇｎｏｌｉ、Ｋ Ａ、■ａｌｌ、Ｌ Ｆ、Ｗｏｎ
ｇ−５ｔａａｌ、Ｆ ＆Ｒｅ１ｔｚ、 Ｍ Ｓ Ｊ Ｎ９８７１ Ｎａｔｕｒｅ
ｆＬｏｎｄ、１ ３２８．５３９−５４３゜７、 Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｌ、
Ｌｒ Ｇｕｙａｄｅｒ、ＭＩ Ａ１１ｚｏｎ、Ｍｔ Ｄａｎｚｅｌ、Ｍ ＤｒＤ
ｅＲｏｓｉｅｒｓ、ＲＣ，Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ ＆ ５ｏｎｉｑｏ、Ｐ （１
９８７１ＮａｔｕｒｅｆＬｏｎｄ、ｌ ３２Ｂ、５４３−５４７゜８、５ｊａｒ
ｃｉｃｈ＋ Ｂ Ｒ，）Ｉａｈｎ、Ｂ ）Ｉ、Ｓｈａｗ、Ｇ Ｍ、ＭｃＮｅｅｌ
ｙ、Ｐ ＤｒＭｏｄｒｏｗ、Ｓ、 Ｗｏｌｆ、Ｈ，Ｐａｒｋｓ、Ｅ Ｓ、Ｐａｒ
ｋｓ、 Ｗ Ｐ、 Ｊｏｓｅｐｈｓ、Ｓ Ｆ。
Ｇａ１ｌｏ、 ＲＣ＆ Ｗｏｎｑ−５ｔａａｌ、Ｆ Ｎ９８６１ Ｃｅ１ｌ ４
５．６３７−６４８゜９、 Ｍｏｄｒｏｗ、 Ｓｒ Ｈａｈｎ＋ Ｂ Ｈ，Ｓｈ
ａｗ、 Ｇ Ｍ、 Ｇａ１ｌｏ、 ＲＣ，Ｗｏｎｇ −５ｔａａｌ、Ｆ ｔ、Ｗ
ｏｌｆ、Ｉ（ｆ＋９８７１ Ｊ Ｖｉｒｏｌ、６１． ５７０−５７８゜１０、
Ｒ＊５ｃｈｅ、Ｊ Ｒ，Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、に、ＭｃＤａｎａｌ、ＣＩ Ｐ
ｅｔｒｏｌ Ｊ。
Ｌｙｎｎｒ Ｄ ＬＴ Ｇｌ’Ｌｍａｌｌａ＋ Ｒｒ Ｌｉ１ｎ９１０１Ｓ＋
Ａ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣｒ Ａｃｏｔｈｕｒ、ＬＯ，Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ
Ｊ、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ Ｐ、Ｐｕｔｎｅｙ、Ｓ Ｄ ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ
、Ｔ Ｊ Ｎ９ＢＢ１ Ｐｒｏｃ、Ｎａｐ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪｓＡ ８５
． ３＋９８−３２０２゜
１１− Ｋｕｈｎｅｌ、ｏ、ｖｏｎ ＢｒＬｅＳｅｎｒ ＨＨＤＬｅｔｒｉＣ１
’ｌ＋ ｕ、Ａｄａｍｓｋｉ、ＭＩＭｉＸＩ ＤＩ Ｂｉｅｓｅｒｔ、ＬＩ Ｋ
ｒｅｕｔｚ、Ｒ，ＩｍｍｅＬｍａｎｎ、Ａ、Ｈｅｎｃｏ、Ｋ。
Ｍｅｉｃｈｓｎｅｒ、Ｃ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ、Ｒ，Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、Ｈ
＆ Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ、’ Ｈｆ＋９８９１ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ＳｃＬ、 ＩＪＳＡ ８Ｌ ２３８３−２３８７゜
＋２． Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、）Ｉ、）ｌａｓｅｇａｗａ、八、Ｍａｋｉ、Ｎ、
Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍ＋１’１Ｌｕｒａ＋ ＴＴ ５Ｐｅｌｄｅｌ＋ Ｓｒ Ｃ
ｏｏｐｅｒ、ＲＷｔ Ｍｏｔ’１ｙａｍａｌ Ｅ Ｎｔ＋３． ＤａＶｉＳ、Ｄ
、５ｔｅｐｈｅｎＳＩ Ｄ Ｍ、Ｗｉｌｌｅｒｓ、Ｃ−ＬａＣｈｍａｎｎ、Ｐ
Ｊ［１９９０１Ｊ Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７１．２８８９−２８９８゜１４、Ｌ
ｅｏｎａｒｃＬ ＣＬ ５ｐｅｌｌｒｎａｎ、Ｍ Ｗ、Ｒｉｄｄｌｅ＋ ＬＩ
Ｆｌａｒｒｉｓ、Ｒ、ＬＴｈｏｒｎａｓ、 Ｊ Ｎ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｙ、
Ｔ Ｊ （１９９０１，Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２６５＋＋０３７
３−１０：１８２゜
１５、ＤａＶｌｅＳ＋ Ｊ Ｓ （１９８４１１ｎ ５ｐｅＣ０Ｐｅｒｘｏｄｉ
ｃａｌ ＲｅｐＳｌ Ａｍ１ｎＯ−Ａｃ１ｄｓ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒａｙ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、Ｌｏｎｄｏｎ。
＋６． ＢｌｕｎｄｅＬｌ、Ｔ、５ｉｂａｎｄａ、Ｂ Ｌ ａｎｄ Ｐｅａｒｌ
、Ｌ （１９８３１Ｎａｔｕｒｅ１７、 ５ｉｂａｎｄａ＋ Ｂ Ｌ、 Ｈｅｒ
ｎｍｉｎｇｓ、八Ｍ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、 Ｔ Ｌ ｆ＋９８５１ｉｎ
”Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂ、”
、Ｐｒｏｃ ＦＥＢＳ Ａｄｖ。
Ｃｏｕｒｓｅ １９８４． ｐｐ ３：＋９−３４９． Ｅｄ、Ｋｏｓｔｋａ、
Ｖ Ｐｕｂｌ、ｂｙ ｄｅＧｒｕｙＬｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ。
１８、Ａｔｈｅｒｔ、ｏｎ、Ｅ ＆ ５ｈｅｐｐａｒｄ、ＲＣＮ９Ｅ１９＋ ”
５ｏｌｉｄ ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：八ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、” ｆｏｘｆｏｒｄＬｌｎｉｖｅｒｓｉｔ−ｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄｌ。
＋９． Ｄｒｙｌａｎｄ、 Ａ ＆ ５ｈｅｐｐａｒｄ、 ＲＣ（１９８８１Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４Ｊ２０、Ｂａ５ｓｉｒｉ、 ＲＭ ＆ Ｉｊｔｉｇ
ｅｒ、 ＲＤ （１９７２１Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９０゜７２２−７２
７゜
２Ｌ Ｋｉｂｅｒｓｔｉｓ、Ｐ Ａ、Ｐｅ５ｓｉ、Ａ、八ｔｈｅｒｅｏｎ、Ｅ、
Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｒ。
ｏｕｎｔｅｒ、Ｔ ＆ Ｚｉｍｍｅｒｎ、Ｄ （１９８３１ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
、ｕ；４ｔ ３５５−３６０２２、Ｂｕｔｌｅｒ、ＰＪＧ＆Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｂ
Ｓ＋１９７２１ｉｎ”Ｍｅ（ｈｏｄｓｉｎＥｚｙｍｏｌｏｑｙ” ｆｅｄ、 Ｃ
Ｗ ）ｆｉｒｓ ａｎｄ Ｓ Ｎ Ｔｉｍａｓｈｅｆｆｌ、 Ｖｏｌ、 ２５＋
ＰＰ１９１−１９９ （八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎｌ。
２３、ＷｈｉＬｅ、Ｊ Ｇ、Ａｍｏｓ、Ｗ Ｂ ｔ、Ｆｏｒｄｈａｍ、Ｍ Ｎ９
８７１ Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１． １０５． ４１−４８゜
２４、 ５ａｌａｈｕｄｄｉｎ、Ｓ Ｚ、Ｍａｒｋｈａｍ、ＰＤ、Ｗｏｎｇ−９
ｔａａｌ、Ｆ。
Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ＋ Ｇｒ Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、Ｖ Ｓ ＆ Ｇａ１
ｌｏ、ＲＣｆ＋９ＥＤＩＶｉｒｏｌｏｑｙ二旦、 ５１−６４゜２５、Ｗａｉｎ
−Ｈｏｂｓｏｎ、ｓ、５ｏｎｉｑｏ、Ｐｒ Ｄａｎｏｓ、Ｏ，Ｃｏ１ｅｒ Ｓ
＆Ａ１１ｚｏｎ、Ｍ Ｎ９Ｅ１５）Ｃｅｌｌ ４０．９−１７゜２６、 ５ａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｅ、Ｒｒ ＰＯＷｅｌ’＋ Ｍ Ｄｒ Ｂａｒｒ、Ｐ
Ｊｒ Ｓｔ−ｅＬｍｅｒｒＫ Ｓｒ Ｓｔｅｍｐｌｅｎ、Ｍ Ｈｒ Ｂｒｏｗ
ｎ−５ｈｉｍｅｒ、５Ｔ−ｒ Ｇｅｅ、Ｗ Ｊ Ｒｅｎａｒｄ＋Ａ、 Ｒａｎｄ
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（ｉｉｌ ＩＪ−ｑ引プ ：パフ０チド（ｉｉｉｌ イη二ｔ（；゛ なし
ｆｂｘｌ Ｔｐ千℃＞λ ｊ ｒＪ（。
（ｖ）フラグｊ二Ｆ−ｔ＜プ ’ ４二９−ｆｌＶｆｘｉｌ （１ｕ４１１＊
４ｚｋ ： ＳＥＱ １０ Ｎｏ−ｔｏ：ＦｌＣｌ ５
４ ６ ８ ’１０ １２ １４
叶ｆｌ（Ｂ牧）
補正書の写しく翻訳力提出書（特許法第１８４条の７第１１１）、３平成 ７年
１月１３日 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION This invention relates to developments related to the human immunodeficiency virus (HIV). BACKGROUND OF THE INVENTION The envelope glycoprotein (env) of human immunodeficiency virus (HIV) is highly variable between individual isolates (Reference 1)1. :, (7) The changes are even more pronounced between HIV-1 and HIV-2 (2). This variation is observed not only in individual isolates but also in serial isolates of the virus from individual patients (3.4). Not surprisingly, a similar sequence of changes was observed between human immunodeficiency virus and simian immunodeficiency virus (SIV), and also within SIV when isolated from the same species of monkey. (5-7). This change is greater in envelope glycoproteins than in other gene products of HIV.
Within this single protein, as well as within this single protein, the changes are concentrated in specific, variable regions (mostly the surface region (gp120) that arose through proteolytic maturation of the early gene product) and are concentrated in other variable regions. The area is less variable (8,9). Unfortunately, most variable regions are also often the most immunogenic.
(10), as a result of which the virus partially evades the host's immune response, ensuring persistent infection. This variability poses problems for diagnostic techniques based on specific interactions, as separate or mixed reagents are usually used for both HIV-1 and HIV-2.
used to test samples for This sudden change goes beyond
This poses a problem for any possible vaccine or immunotherapy. This is because appropriate drugs are not available against many mutant virus strains, as well as against HIV-1 and HIV-1.
This is because we must also respond to HIV-2 and HIV-2. This invention demonstrates the discovery by the inventors of a previously unrecognized, highly conserved undecapeptide in gp120 of env, starting from position 122 (in our localization of the HIV-1 env sequence). Based on that. Undeca peptides are also present in HIV-1, HIV-2 and SIV. This sequence is [Lys-Pro-Cys-Va] in all listed isolates of both types of HIV, including the highly branched JHIV-2 isolates D194 and 0205 (II). -]Lys-Leu-Thr-ProLeu-Cys-Va] (also referred to as Seq, Id, No, I, Sequence A), except in the case of the highly branched African mandrill isolate (12). , conservative changes occur in threonine and the second valine in all isolates of SIV.
That's it. In the highly divergent African mandrill isolate (12), threonine and both leucines are mutated. In this specification, amino acids are designated either by their full name, their conventional three-letter abbreviation, or their conventional one-letter symbol as listed in Table 1. Table 2 provides amino acid sequence data for a number of different isolates of HrV-1, HTV-2 and SIV compared to a highly conserved consensus sequence. The common sequence is based on absolute majority, and for each isolate, the dotted line indicates a match with the common sequence;
Amino acids are shown in the blanks. Comparisons of the nucleotide sequences of the genes encoding this peptide also show a high degree of conservation, although the redundancy of the genetic code allows for a somewhat wider range of variation. Sequence information was obtained from the Los Alamos Data Base (Los Alamos Daia Ba5e). Early reports suggest that the immunodominant region of gp120 consists mostly of variable loops,
v3 (for example 10). Limited studies using peptides have included the conserved region we describe (e.g.
13). These peptides showed little immunogenicity. This is a transport type
It is currently believed that this is because no care was taken to protect the amino acid side chains from modification during binding to proteins. The above-mentioned conserved sequence has been published in EPO 298633 of Proteus Biotechnology Limited.
and potential vaccines for promoting immunity against at least one strain of HIV.
referred to as the base. This sequence is part of the HIV envelope protein.
It is stated that the selection was based on morphological similarity to at least one antigenic determinant. However, EPO 298633 is silent regarding the evaluation of the high degree of sequence conservation among different strains of Hlv-1, HIV-2 and SIV. EPO298633 also discloses joining the C-terminus of the above-mentioned conserved sequences to a similar deaf-like selected further sequence, the non-essential C-terminal dipeptide Cys-Val possibly being omitted, and the sequence The first Cys residue of
It is stated in this document that it can be cross-linked to another Cys residue of the molecule via a rufido bridge. The invention is further based on the understanding that correct presentation of conserved sequences is critical to eliciting an immune response. Currently, in its original form, the above-mentioned conservation arrangement is
The sequence is known to be cross-linked to a further sequence of gp120, different from that proposed in EPO298633, via an intramolecular disulfide bridge. This Sara
The sequence (sequence B) is also highly conserved in both HIV-1 and HIV-2.
and there are limited mutations between the two types. The SIV isolate +1 shows strong similarities to either HIV-1 (SIVc, ) or I;tHIV-2 (all other strains of SrV) (Table 3). Nowadays
In addition, both cysteine residues in the conserved sequence mentioned above are different from each other in their original conformation (14).
Contrary to the statement in EPO 298633 that one of the cysteine residues is not important, it is understood that the cysteine residues are involved in disulfide bridges and elicit an appropriate immune response.
It is thought that both cysteine residues are necessary for this purpose. This second pepti
The strong conservation of the code is well compatible with it forming the necessary structural conformation with conserved sequences. In order to demonstrate this, the present inventors demonstrated that both cysteine residues are disulfide-bonded.
Due to the poor condition in which approximately one-half of the cases were induced, research was conducted using the conserved sequence mentioned above.
It imitated the original form of expression. Initial immunogenicity studies on this peptide showed that this peptide is immunogenic when presented conjugated to an appropriate transport protein, and the resulting antiserum does not contain native gp120 in permeabilized cells. This shows that it reacts with disulfide from both cysteine residues of each sequence in the proper orientation.
Studies were carried out using the conserved sequences described above linked to further sequences via fido bridges. SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect, the invention provides the amino acid sequence cyzybrolinecysteine.
- Valine - Lysine - Leucine-Threonine - Broline - Leucine Cysteine - A molecule containing a peptide containing valine (Seq, Id, No, I), in which each cysteine residue is disulfide-bridged to a further cysteine residue. Terukama
molecules that have been derivatized to mimic the moieties of disulfide bonds or functionally equivalent variants of such peptides that mimic the immunogenic behavior of the epitope of gp120 of HIV env. . Surface envelope proteins of HrV with similar conservation in related SVs
The strict conservation of peptide sequences within proteins suggests that the sequences that are the basis of this invention are crucial for the function of env-proteins and are therefore currently uncharacterized.
This suggests that even unbroken isolates are unlikely to change further. This appears to be specific to immunodeficiency viruses, as the study Sonic shows that this sequence is not present in other proteins in the EMBL database. Therefore
Therefore, this invention is applicable to the design of diagnostic agents, immunogenic agents, and therapeutic agents as described below.
provides a possible fixed array with many possible implications. As explained above, the molecule accurately mimics the behavior of the corresponding sequence of gp120.
In order for each cysteine residue to have its own disulfide bridge (actual or
It is important that it contributes to the imitation (imitation by proper guidance). This may be achieved by using suitable inducers of cysteine residues, such as S-acetamidomethyl derivatives.
This can be achieved through enlightenment. Alternatively, this can convert cysteine residues into further peptides.
This can be achieved by cross-linking to each cysteine residue of the peptide sequence, and this additional peptide sequence can be achieved by a suitable linker or other properties of the peptide.
The a) separation may be connected to the peptide of the present invention, or another
There may be several peptides. Fruits currently known to occur in gp120
One preferred crosslinking sequence based on the actual crosslinking is as follows. (Sequence A) (Seq, Id, No, 1) S DST; I KET D) Sequence A is the uniquely conserved sequence on which this invention is based, and sequence B is the amino acid 219 to 230 of HIV-1 and HIV Based on the sequence 210 to 221 of -2
The mutations are listed below in order of frequency. Although different sequences may be optimal for HIV-1 and HIV-2, sequence B is thus fairly conserved (Table 3). Desired peptide sequences can be easily synthesized in a conventional manner, for example using the Fmoc method.
Can be done. Alternatively, peptide sequences can be produced by recombinant DNA methods in known manner. A further aspect of this invention is a preferred method encoding a peptide molecule according to the invention.
or by providing a DNA molecule incorporated into an appropriate expression vector. The molecules of this invention, which are based on highly conserved sequences, exhibit functionally important immunological properties.
can be modified in a variety of different ways without significantly affecting epidemiogenic behavior.
It seems possible. Possible modifications to the or each peptide sequence include: 1) One or more individual amino acids are amino acids that have common properties, e.g.
Can be replaced by amino acids. Substitution of T by S Substitution of K by R Substitution of 1, or by M 2) One or more normal peptide bonds can be replaced by isosteric substitution. Possible replacement linkages are well known to those skilled in the art of peptide synthesis and can be discussed, for example, in reference 15. The use of an azapeptide bond in which the alpha carbon of an amino acid is replaced by a nitrogen atom (i.e. -NH-NR-Co-), a reduced amide bond (i.e. -NH-CHR-C H.-) to give methylamine, 'Co by CH2 and MH by S (i.e. -3-CHR-CM, =), by unsaturated carbon atoms of both NH and CO groups.
(i.e., =cHmcHR-cH=), or substitution of the MH group with methylene (i.e., -Cl-12-CHR-CC)-). 3) One of the disulfide-bridged cysteine residues (i.e. nostine residues)
or both pairs can be replaced by cystine analogs such as: 4) One or more amino acids can be replaced by a trifunctional amine with a functional group corresponding to the amino acids discussed in WO 91/1 3909. ) may omit one or more non-essential amino acids; 6) may include one or more additional amino acids that do not significantly affect function.
It's coming. 7) Using structural analogues that mimic the three-dimensional structure of peptides in place of peptides.
can be used. It has been shown that molecules according to the invention are capable of eliciting an immune response. Therefore, one possible use of this molecule is as the base of a potential vaccine against AIDS and AIDS-related diseases. In a further aspect, the invention provides AIDS and AID, sI! containing molecules according to the invention. Provide vaccines against J-series diseases. For this purpose, the molecules of the invention are optionally linked to a carrier molecule, alternatively via chemical groups of amino acids of conserved sequence or via additional amino acids added at the C- or N-terminus. obtain. For example, many applications using the side chains of Tyr residues
A strong bond is known. Suitable carriers include, for example, Skangai hemocyanin (KLH), serum albumin, purified protein derivative of tuberculin (PPD), ovalbumin, non-protein carriers and many others. save array
The lysine residue is considered to be of great importance in the molecules of this invention, and for this reason the nibsilone-amino group of the lysine residue is synthesized with a group that is subsequently regenerated before use of the coupling agent. In order to prevent undesired reactions during the reaction of binding the carrier, it is preferable to protect it in a known manner. The molecules of this invention can be used as alternative possible live vaccines, such as polio or vaccine.
It can be provided as part of a genetically modified virus coat with tascinia. The vaccines of this invention are administered in the usual manner, eg by injection, orally, and
With or without the use of conventional adjuvants such as complete or incomplete adjuvants or aluminum hydroxide, and with or without the use of other immunopotentiating agents. Suitable diluents for use in formulating vaccines for administration are also well known and include distilled water, phosphate buffered saline, and
Buffer solutions such as citrate buffers are included. Molecules according to the invention have applications in the treatment (prevention or therapy) of AIDS and related diseases by acting to unbind the HIV virus from human or animal cells or by disrupting the three-dimensional organization of the virus. Further headings
It is possible. A further aspect of this invention is for the prevention or treatment of AIDS or related diseases.
method of administering an effective amount of a molecule according to the invention. In a further aspect, the invention alternatively provides one or more pharmaceutically acceptable
Pharmaceutical compositions are provided which contain the molecules according to the invention as active ingredients together with adjuvants, carriers and/or excipients. The invention also provides the use of the molecules according to the invention for the preparation of medicaments for the treatment or prophylactic treatment of AIDS or related diseases. Molecules that bind to conserved sequences on which this invention is based, in particular antibodies, antibody-related molecules, and
Structural analogs of S. cerevisiae are also of potential use as drugs in the treatment and diagnosis of AIDS and related diseases. In a further aspect, the invention provides molecules, in particular antibodies, antigen binding sites of antibodies, or structural analogs thereof, that bind to the conserved sequences on which the invention is based. Techniques for producing antibodies (monoclonal and polyclonal) are well known in the art. chimeric antibodies, human-adapted antibodies, modified antibodies, and engineered antibodies.
Variations of antibodies (including antigen-binding sites), which generally include within the scope of this invention.
Ru. Techniques for producing such variations are also well known to those skilled in the art. If you have knowledge of the three-dimensional structure of the conserved sequence of gp120, you can find a synthetic component that binds to this sequence.
It is possible to design and configure children. Techniques suitable for this purpose include e.g.
16 and 17, which involve the use of computer models to design potential inhibitors of renin. Antibodies and other molecules that bind to conserved sequences based on this invention may be used in many species, including:
It can be used for therapeutic (preventive and curative) as well as diagnostic purposes in a variety of ways.
Ru. 1) For passive immunization by appropriate administration of antibodies, preferably human-adapted antibodies, to the patient. 2) appropriate support (possibly obtained by appropriate antibody engineering);
By using antibodies of a class or isotype, the desired function can be achieved by activating complement or mediating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
To be able to do something. 3) Targeted delivery of toxins or other agents, for example by using immunotoxins containing antibody binding agents and cytotoxic components, to target gp120.
to directly or indirectly bind to conserved sequences associated with 4) Targeted delivery of highly immunogenic substances to the surface of HIV-infected cells, resulting in possible elimination of such cells by either the humoral or cellular immune system of the host. 5) For example to detect HIV using various immunoassay methods. Techniques for carrying out all of the above are well known to those skilled in the art. In another aspect, the invention includes the use of molecules that bind to the conserved sequences of this invention for therapeutic or diagnostic purposes. The invention also includes within its scope methods and kits for detecting HIV, antibodies to HIV, or infection by HIV using the molecules according to the invention. The invention is further illustrated by way of example in the following examples. The first example concerns immunological studies on peptides incorporating highly conserved sequences.
This indicates that the peptide is immunogenic and that the antiserum reacts with native gp120 in infected cells. In this example, reference is made to Figures 1 to 4 of the accompanying drawings. Figure 1 is a series of photographs showing immunofluorescence of cells. Odor before and after peptide treatment
treated with serum obtained from rabbits. Some express gp120 from HIV-1. Serum is in some cases treated with peptides before application to cells.
It will be done. Figure 2 shows cells that are uninfected or infected with different isolates of HIV-1.
Figure 2 is a series of photographs showing immunofluorescence of cells. Cells before and after treatment with peptides
treated with serum obtained from rabbits. Figure 3 is a series of photographs showing the immunofluorescence of uninfected or infected cells. Cells were treated with serum from two different rabbits before and after treatment with peptide. Figure 4 is a series of photographs showing immunofluorescence of cells infected or uninfected with HIV-2. Cells were treated with serum obtained from rabbits before and after treatment with peptides. A second example concerns immunological studies on a peptide incorporating a highly conserved sequence A disulfide-bridged in an antiparallel fashion to a moderately conserved sequence B. The antiserum reacts with HIV-1 in order to be immunogenic as shown and to neutralize its infectivity. In this example, reference is made to Figure 5 of the accompanying drawings. Figure 5 shows: Graph of virus present in the supernatant above tissue culture cells, as measured by the activity of viral reverse transcriptase in incorporating 'H-dTTP, diluted to 1.20 in RPMI/10% FC3. Measurements were made at various times after intentional infection with virus ('50 TCI Ds.) treated with purified serum (or phosphate-buffered saline, PBS) at 37°C for 60 min.
It has been established. The H IV and SIV sequences used for analysis were from the Los Alamos database ('Los AlamoSData Ba5e). Sequence comparisons were performed on a VAX 86'00 computer using ROMED, version 3.30 from NuSealant, Dunedin, Otago University, PA Stockwell.
I did it on a computer. Localization of the envelope glycoprotein sequences of HIV-1 and HIV-2 isolates revealed several sites that differ in their degree of conservation. However, when compared to the SIV sequences, most of these are not conserved, and only a single region of significant size is conserved. This is done just before the first hypervariable (Vl) loop (9).
occurs at gp+20. Storage is shown in Table 2. The undecapeptide is absolutely conserved in all isolates of HIV, and the changes in SIV are fairly conservative, with most isolates only changing T to S and V to 1. (in the otherwise highly branched African mandrill isolate GBI, L changes to, T to N, and L or Y). The 11 amino acid sequence is unique to HIV and SIV, and no matches of more than 5 contiguous residues (or 6 residues allowing gaps) were found during searches of the EMBO and SwissProt sequence databases. Don't let me out
stomach. Restricted sequence changes at this site of otherwise highly variable gp120 may be essential for HIV viability and are therefore highly variable.
This suggests that the pylons are unable to transform into pilions and still maintain infectious progeny. Sequence localization also shows that the second hypervariable (2) loop (9) is immediately followed by a second site disulfide bridged to both protein residues in the first uniquely conserved site (14). This conservation is shown in Table 3. Conservation is greatest between cysteine residues that form disulfide bridges, with each HIV protein
The types are highly conserved and only mutated and resemble SIV isolates or one or the other HIV type. This further indicates that antiparallel bridging peptides form a structure within gp120 that is essential for viral viability.
is suggesting. Example 1 Based on this analysis, synthetic peptides based on highly conserved sequences of the invention
I conducted an experiment. All chemicals were of analytical grade and were used without further purification unless noted. Peptide synthesis Peptide containing the sequence KPCVKLTPLCVTLY (Seg, [d, No, 4)
Ptide was synthesized by Fmoc continuous flow solid-phase synthesis using an automatic synthesizer (LKB Biolinx (Bio1yi+x)). The Fmoc amino acid pentafluorophenyl ester was used as the acylating species, with the exception of Thr, which is preferably an ester of 2.3-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzotriazine. Polydimethyl-acrylamide, which is supported by kieselguhr and made functional by hydroxymethylphenoxoacetic acid bonds, is used as an internal standard amino acid.
Together with leleucine (18,19), it was used as a solid phase support. Except for the acid-stable Acm (acetamidomethyl) on the side chain of Cys, trifluoroacetic acid/phenol l/l-ethylsilane (for 500 mg of peptide-resin assembly) caused simultaneous cleavage of the tert-butyl side chain protecting group. The peptide was separated from the resin using 23ml/Ig/1ml). The resin was removed by filtration and washed with a small amount of trifluoroacetic acid (TFA). Low under reduced pressure
Solvent was removed from the combined TFA filtrates by tally evaporation. The oily residue was dissolved in O1% aq, (aqueous) TFA (20 ml) and diluted with diethyl ether.
The solvent was removed from the combined aqueous phases by lyophilization.
Removal produced a white powder (20.9 umol, 76% yield). Post-synthesis analysis of the peptide by HPLC revealed a small amount (98% purity) and it was used for binding to KLH for rabbit immunization without further purification. This was carried out in a two-fold molar excess, essentially by the protocol of Basili and Utiger (20).
It was modified according to Stice et al. (21) to bind to KLH. Since we are particularly interested in providing the peptide in conditions as close to the native protein as possible, we leave the Cys residue as an S-acetamidomethyl derivative, which is chosen for about half of the disulfide bonds and the epsilon of the Lys residue. - The amino groups are protected during the coupling reaction from conversion to hydroxyl groups by modification with 2,3-dimethylmaleic anhydride (10-fold molar excess) at pH 9.0 prior to coupling and then Deprotection was performed at pH 6, 5 and 20°C for 8 hours (22). Three New Sealant White Rabbits (known as Ping, Pong and Pang) (conventionally bred from Rosemeal Rabbits Ltd, UK) were placed in a froin cage.
by multiple subcutaneous injections at 0.6 mg peptide equivalent in complete adjuvant.
The mice were then immunized twice with the equivalent of 0.3 mg peptide in incomplete Freund's adjuvant. Blood samples before and after immunization
blood from the final immunization was collected, and serum was prepared by coagulating the sample at room temperature. Immune responses were monitored by ELISA against peptides bound to the wells of microtiter plates, which were then blocked with bovine serum albumin. Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibody (DAK OLid, ) was used as the second antibody, and l,2-phenylenediamine, dihydrochloride was used as the substrate.
Lido (DAKOLtd, ) was used. ELISA of rabbit pre- and post-immunization sera showed that all three rabbits expressed a response to the peptide as an immunogen when given conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH). (Table 4). At a dilution of 1:6400 or 1:3200, the last blood sample had a high value (immunization
equal to or greater than 4 times compared to pre-operative serum), against KLH
This suggests that the peptide became an immunogen when given as a conjugate.
. Immunofluorescence research on the binding of antiserum to HIV-infected cells The binding of antibodies in rabbit serum to native gp120 was investigated using a confocal immunofluorescence microscope (23).
Assays were performed using a Bio-Rad MRC600 confocal microscope, and fluorescein isothiocyane-1-(FITC)-labeled goat anti-rabbit IgG (Sigma Chemical Co., Ltd.) was used as the second antibody to represent rabbit antibodies. Chemical Company). The rabbit antiserum, a positive control against native gp120, was a gift from Dr. Rod Daniel of the National Institute to Medical Research, London. Met. The test cells are the human T lymphoblastoid cell line C8166, which is infected nonproductively by human T cell lymphoblastic virus type-1 (24). It was grown in RPMI/10% fetal calf serum and infected with HIV-I BRU (25), HIV-I 5F2 (26), or
or as a control, to prevent infection. Transfer cells (109 in 15 ul) to wells of poly-L-lysine treated microscope slides for 30 min at room temperature.
The plasma membrane was made permeable by fixation with 4% glutaraldehyde and treatment with 0.1% Triton X100. Appropriate dilutions of antiserum in PBS were added and allowed to bind for 60 minutes at room temperature before washing the cells. fluorescein label
A secondary antibody was added (at the dilution recommended by the supplier) and allowed to bind for 60 minutes before washing in PBS. The slides were then examined under a confocal microscope to detect antibody binding and appropriate specimens were photographed. Binding of immune serum to cells expressing gp120 of HIV-1118
Measurements were made using both pre-infected serum and uninfected cells as a control. A typical field of view for one rabbit (Pang) is shown in Figure 1. Above this figure
In the first panel, some cells do not express gp120 (a, b, and f), while others do (all other photos), and some cells do not express gp120 (a, b, and f), and some cells do express gp120 (all other photos).
There are those treated with E. and e) and those treated with immune serum (all other photos). In the lower panel of this figure, all cells express gp120 and those treated with immune serum from one rabbit (pang) and without peptide (i and
and m), those treated after incubation with peptide 8 (j and
(n), or from another rabbit (Ping) treated without peptide (k and 0) or after incubation with peptide 8 (l and p). Figure 1 shows that only the binding between immune serum and g120-expressing cells is large, while the binding between non-expressing cells and blood
The degree of binding was low for infected cells and serum before immunization.
are doing. The distribution of binding of immune serum to gp120-expressing cells shows that controls from rabbits immunized with gp120 bind to expressing cells but not to non-expressing cells.
very similar to that shown for the serum of the pool. In addition, infected cells
The binding of immune serum to the cells was blocked by the peptide, indicating that it is to a specific site on gp120. The binding of immune serum to HIV inducers in infected cells is determined by the binding of immune serum to the HIV inducer in infected cells.
was determined using both 100% and uninfected cells as a control. A typical field of view for one rabbit (Ping) using HIV-BRU is shown in Figure 2. In this figure, cells are uninfected (a, b, e and f) or infected with HIV-I BRU (C and d) or SF2 (g and h), while Sera are from before immunization (a, C, e, and g) and after immunization (b, d, f, and h). Bars represent 25 um. Figure 2 shows that only the immune serum and infected cells strongly bind, and the serum and uninfected cells bind to each other.
cells, or serum before immunization and infected cells, indicating a low degree of binding. The distribution of binding of immune serum to uninfected cells shows that it binds to infected cells and does not bind to uninfected cells, whereas rabbits immunized with gp120
similar to that shown for the control serum of et al. Repeating these experiments using cells infected with HI'V-I SF2 gave very similar results (Fig. 1 g and h), confirming that the reaction was independent of the HIV strain used. did. The results of a similar test performed with HIV-I SF2 and sera from two other rabbits (Pong and Pang) are shown in FIG. Figure 3a shows the results using preimmune serum (top left) or immune serum (remaining photos) from Pong, both with infected cells, and Figure 3b shows the results using immune serum from Pang. Results are shown using uninfected cells (top left) or infected cells (remaining photos). Bars represent 25um. Similar binding was observed with serum from rabbit Pang to cells infected with HIV-I BRU or SF2 (Figure 3a). A third rabbit (Pang) also showed binding of its hyperimmune serum, but in this case the pre-immune blood
As the supernatant also bound to cells infected with HIV-I BRU, no conclusions could be drawn about this response. However, cells infected with HIV-I SF 2 showed very similar results to other rabbits for both preimmune and immune sera (Fig. 3b), and with this virus strain, immunization Pre-treatment serum did not bind, indicating that binding occurred as a result of immunization. Figure 4 shows the binding of serum from one rabbit (Pong) to cells infected with HIV-2. Cells are either uninfected (a and b) or HIv-2CA M! The sera before immunization (a and C) or the immune sera (b and
and d). Again, binding was only seen in immune cells directed against infected cells. These results demonstrate that cysteine and lysine residues are bound to keyhole limpet hemocyanin in the provided form, an arrangement that mimics disulfide bridges.
This highly conserved sequence of gp120, with the psilon amino group maintained, gave a unique immune response in every three rabbits tested. 1 liter of serum (including HIV-2 and HIV-1)
Combines with the original gp +20 of the power of 1 power. This preservation allows for surface access of the shrimp (this peptide or the original protein).
This suggests that 1rF plays an important role in the quality of the air. One of the possible roles (hey, cow! It could be binding to an additional receptor for the recruited CD4).
cormorant. 5. Based on the naturally occurring crosslinked sequence in gp+20, further experiments were conducted using a peptide (A chain peptide) containing the conserved sequence of the present invention that is disulfide bridged to the Wll peptide (BjA peptide). The sequences of the A jl'j peptide and the B chain peptide (crosslinking also indicated) are as follows: (Seq, Id, No, 51) The experiment was
I did it again. Peptide Synthesis A peptide with the sequences DQSLKPCVKLTPLCVTLY (A chain) (Seg, ld, No, 6) and LINCNR3AIKESCPKVSF (B chain) (Seg, Id, No, 5) was synthesized as described in Example 1. child
Here, Acm is used for cysteine 7 and trituration is performed for cysteine 14 in the A chain.
trityl and cysteine 13 for cysteine 4 in the B chain.
The cysteine residue was protected by Acm. Trityl group from each peptide
The resulting cysteine in the A chain was removed by lysis and reacted with 2-dipyridyl disulfide, and excess reagent was removed by gel filtration. life
The sexualized peptide was then reacted with a 1.5-fold excess of B-chain and isolated to form a disulfide bridge.
The peptides to be bridged were purified on Whatman CM 52 cation exchange resin. A second disulfide bridge was specifically formed by reaction with IO equivalents of 12 in methanol. Finally, the peptide was purified by gel filtration. Production of antiserum A disulfide bridged peptide was coupled to K L H exactly as described in Example 1, using the same protection for lysine residues. Two rabbits (Tristan and NigMarke) were incubated in complete Freund's adjuvant.
The mice were immunized with a subcutaneous injection of a KLH conjugate and challenged once with the same conjugate in Freund's incomplete adjuvant. Subsequent stimulation is Freund's incomplete adjuva.
This was done with only the peptide in the sample. Biotinylated peptides bound to Streptavidin-coated wells of microtiter plates were assayed by ELISA.
The immune response was analyzed. The developing reagents were the same as in Example 1. ELISA of rabbit pre-immunization and post-immunization sera showed that both rabbits responded to the peptide as immunogen when given as described above (Table 5). In the final blood draw, the value is high at a dilution of I:16000 (more than 10 times compared to pre-immunization serum). Study of virus neutralization using antiserum HIV-i8. Samples (50 tissue culture infectious doses (TCIDao)) were incubated for 60 min at 37°C with serum from rabbits immunized with gp+20 from HIV 1i*- or with PBS as a control, or with PBS as a control. 120 dilution of preimmune serum or immune serum from Tristan) and ink.
It was incubated. The treated virus was then used to infect C8166 tissue culture cells, and the infection process followed standard methods, using poly-A as a template and oligo-dT as a primer. After integration, the virus present in the cell supernatant is measured by reverse transcriptase activity released by Triton X100. Figure 5 shows that virus incubation with antiserum against gp120 increases approximately 1000-fold between days 7 and 122 after infection with virus incubated with PBS controls, whereas incubation of virus with antiserum against gp120 signs of infection
It has been shown that the weather is also a hindrance. Pre-immunization serum had no effect on infection, but the immune serum was as effective in preventing infection as the anti-gp120 control serum. Immunization with disulfide-bridged peptides of the invention by the method described above is therefore
This led to the production of antibodies in the serum that neutralized the infectivity of the virus. Furthermore, the sequence of the B chain in the immunogen is HIV-1. not the same as the equivalent amount of peptide in
However, neutralization has still been found. Although the entire peptide suggests that it yields antibodies that react with variants of HIV-1 or HIV-2, each one of the above
peptide species may have better reactivity with certain HIV types. Amino 11G Shiai T Mino internal rent - 3 sentences! p omitted b (Echuji 5/<') Val 17 1 section 39 SIV' s+, tu-s4 E engineering l-4suR0+Thu +I^MR1 iE Seq, ;d, NO, ε14 ko SIV MU Ql Lecture 3F4- 5--IKLIS VEllKMS (QSeq, 22, Jio, 91" L Yu drawer, Ogi: 1, RaLner, L, Ga1lo, RC&%4ong-5Laal, F f +9851 Nature [Lond, l 313, 636-637゜2, C 1avel, F, Guyader, M, Guetard, Dr 5alle, MIMontaqnier, L & 81izon, M f+9B61 Nature (Lond, l 324.69+-3, Hahn, B H, S haw, GIL Taylor, M E, Redfield, RRe Markharn, P D, 5aLahuddin, S Z, Wong-5tal, F, Ga1lo, RC. Parks, ES & ParkSI W P +198615science + Wash, l 2321 +54 8-+553° 4, Saag, MS, Japan ahn, B H, Gibbons, J, Lit Y, Parks, E S. Parks, W P & Shaw, G M [98B1 Nature (Lond,) 334.440-5. Daniel, M D, Letvin, N L, King , 8%4 Kannagi, 51Sehqal, PK, Hunt, RD, Kanki, PJ, Es5ex, M & Desrogiers.Ci+98515cience (Wash,) 22B, +201-1204
゜6, F r a n Ch 1n L r G r G u r q 01 . Cr G u O* +(-G r G a 110 *@RCt Collati, E+ Fargnoli, K A, ■all, L F, Wong-5taal, F & Re1tz, M S J N9871 Nature fLond, 1 328. 539- 543゜7, Chakrabartl, Lr Guyader, MI A11zon, Mt Danzel, M DrD eRosiers, RC, Tiolais, P & 5oniqo, P (1 9871 NaturefLond, l 32 B, 543-547°8, 5 jar cich+ B R,) Iahn, B ) I, Shaw, G M, McNeel y, P DrModrow, S, Wolf, H, Parks, E S, Parks, W P, Josephs, S F. Ga1lo, RC & Wonq-5taal, F N9861 Ce1l 4 5.637-648゜9, Modrow, Sr Hahn+ B H, Shaw, GM, Ga1lo, RC, Wong -5taal, F t, Wolf, I(f +9871 J Virol, 61.570-578゜10, R*5che, J R, Javaherian, McDanal, CI Petrol J. Lynnr D LT Gl'Lmalla+ Rr Li1n9101S+ A, Gallo, RCr Acoth ur, L.O., Fischinger, P.J. Bolognesi, D P, Putney, S D & Matthews, T J N9BB1 Proc, Nap, 8cad, Sci, IJsA 85.3+98-3202° 11- Kuhnel, O, von BrLeSenr HHDLetriC 1 'l+ u, Adamski, MIMiXI DI Biesert, LI Kreutz, R, ImmeLmann, A, Henco, K. Meichsner, C, Andreesen, R, Gelderblom, H & Rubsamen-Waigmann,' Hf+9891 Proc, Natl, Acad, ScL, IJSA 8L 2383-2387゜ +2.Tsujimoto,) I,)lasegawa, Hachi, Maki, N, Fukasawa, M+1'1Lura+ TT 5Peldel+ Sr Cooper, RWt Mot'1yamal E Nt+3. DaViS, D, 5tephenSI DM, Willers, C-LaChmann, P J [19901J Gen, Virol, 71.2889-2898°14, L eonarcL CL 5pellrnan, M W, Riddle+ LI Fl arris, R., L.Thornas, J.N. and Gregory. , T J (19901, J, Biol, Chem,, 265++037 3-10:182° 15, DaVleS+ J S (198411n 5peC0Perxodical RepSl Am1nO-Ac1ds Peptides and P roteins, Ray, Chem, Sac, London.+6.BlundeLl, T, 5ibanda, B L and Pearl, L (19831Nature17, 5ibanda+ B L, Hernmings, 8M and Blundell, T L f+9851in "Apartic Proteinases Th eir Inhib,” Proc FEBS Adv. Course 1984. pp 3:+9-349. Ed, Kostka, V Publ, by deGruyLer, Berlin. 18, Athert, on, E & 5heppard, RCN9E19+” 5solid PhasePeptide 5ynthesis: Eight practical cal appro ach, "foxford Llniversit-y Press, Oxfordl. +9. Dryland, A & 5heppard, RC (19881T etrahedron 44J20, Ba5siri, RM & Ijtiger, RD (19721Endocrinology 90°722-72 7° 2L Kiverstis, P A, Pe5si, A, 8the Leon, E., Jackson, R. Ounter, T. & Zimmern, D. 19831FEBS Lett, u; 4t 355-36022, Butler, PJG & Hartley, B S+19721in"Me (hodsinEzymoloqy" fed, C W ) firs and S N Timasheffl, Vol, 25+ PP191-199 (8 Academic Press, New York and London. 23, WhiLe, J G, Amos, W B t, Fordham, M N9 871 J, Ce1lBio1.105. 41-48° 24, 5alahuddin, S. Z., Markham, P. D., Wong-9 taal, F. Franchini+ Gr Kalyanaraman, VS & Ga1 lo, RCf+9EDI Viroloqy Fudan, 51-64°25, Wain-Hobson, s, 5oniqo, Pr Danos, O, Coler S & A11 zon, M N9E15) Cell 40.9-17°26, 5an chez-Pescadoe, Rr POWel'+ M Dr Barr, P Jr St-eLmerrK Sr Stemplen, M Hr Brow n-5himer, 5T-r Gee, W J Leonard+A, Rand olph, A, Levy, JAt 1Mna, D & Luciw, P A f+9851Yuyari゛) Enter (111JNENAL INFORMATION: (ill NUMtlERO r 5EQU2NCES: 10t2+ 5tQx-o yo, 1+-mW3+ %4G-; (11) Transmission to the legend: Pegosento 1 ( 1 River I LvL: τtshi
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