JPH07505886A - Method for producing macrocyclic chelating agent, formation of chelate, and conjugate thereof - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 マクロ環状キレート化剤の製造方法及びキレートの形成並びにその結合体 本発明はイソチオシアナト官能化マクロキレート化剤の製造方法及びマクロ環状 キレート化剤の生体分子への結合方法に関する。[Detailed description of the invention] Method for producing macrocyclic chelating agent, formation of chelate, and conjugate thereof The present invention provides a method for producing isothiocyanato-functionalized macrochelating agents and macrocyclic This invention relates to a method for binding a chelating agent to a biomolecule.

金属イオンは二官能性キレート化剤の手段により生体分子に結合しつる。このよ うなキレート化剤は、金属イオンとキレートを形成する金属結合部分、及び、元 来化学反応性であり且つ生体分子と共有結合を形成しつる第二の官能基を含む化 合物である。反応性の官能基は、通常、ブロモアセチル基、ジアゾニウムイオン 、イソチオンアネート又はカルボン酸誘導体のような多（の既知の有用な化学反 応性基のうちの１ってあり、反応性の官能基はタンパク質のアミノ酸（抗体のり シン部分）に結合することができる。生体分子は、通常、明確な内部又は外部細 胞マーカーを認識し、このようにして、金属イオンの標的指向基（ｔａｒｇｅｔ 　ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）として作用する。Metal ions are attached to biomolecules by means of bifunctional chelators. This way A chelating agent has a metal binding moiety that forms a chelate with a metal ion, and a metal binding moiety that forms a chelate with a metal ion. A compound containing a second functional group that is chemically reactive and forms a covalent bond with a biomolecule. It is a compound. Reactive functional groups are usually bromoacetyl groups, diazonium ions , isothionanates or carboxylic acid derivatives. There is one reactive group, and the reactive functional group is the amino acid of the protein (antibody glue). thin part). Biomolecules usually have distinct internal or external structures. the target group of the metal ion. directing group).

二官能性キレート化剤がガン又は腫瘍細胞エピトープ又は抗原に特異性を有する 抗体に共有結合するときに、このような抗体／キレート化剤結合体の放射性核種 キレートは放射性核種をガン又は腫瘍細胞に輸送する手段として診断及び／又は 治療用途において有用である。例えば、ＭｅａｒｅｓらのＡｎａｌ、Ｂ！ＯＣｔ ｌｅｍ、、　１４２．６８〜７８　（１９８４）：及びＫｒｅｊｃａｒｅｋらの Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　７７ 、５８１〜５８５　（１９７７）を参照されたい。Bifunctional chelators have specificity for cancer or tumor cell epitopes or antigens When covalently attached to an antibody, the radionuclide of such antibody/chelator conjugate Chelates are used in diagnostic and/or Useful in therapeutic applications. For example, Meares et al.'s Anal, B! OCt lem, 142.68-78 (1984): and Krejcarek et al. Biochem, and Biophys, Res, Comm,, 77 , 581-585 (1977).

エチレンジアミンテトう酢酸（ＥＤＴＡ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸 （ＤＴＰＡ）のイソチオシアナト官能化誘導体は文献中に報告されており、放射 性アイソトープを抗体に結合するために使用されている。例えば、Ｇａｎｓｏｗ らのＩｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、２５．２７７２〜２７８１　（１９８６）；Ｍｅ ａｒｅｓらのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１４２．６８〜７８　（１９８ ４）；及び米国特許第４、４５４．１０６号を参照されたい。Ethylenediaminetetoacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid Isothiocyanato-functionalized derivatives of (DTPA) have been reported in the literature and used to attach sexual isotopes to antibodies. For example, Gansow et al. Inorg, Chem, 25.2772-2781 (1986); Me Ares et al., Anal, Biochem, 142.68-78 (198 4); and U.S. Pat. No. 4,454.106.

短寿命の放射性核種を使用するときに、最大の特異的活性及び放射性免疫グロブ リンの最小の劣化を提供するように、患者への注入時にからなるべく速く放射性 核種を標的指向基にキレート化することが望ましい。ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡのよ うなキレート化剤を使用するときに、これらのキレート化剤による金属イオンの 急速な隔離は、キレート化剤を活性化すること、キレート化剤と抗体とを反応さ せること、及び、その後、放射性核種をキレート化することで錯体を形成し、次 いて二の錯体を精製することにより製造されるべき放射性核種／抗体／キレート 化剤結合体（ここでは結合体と呼ぶ）の製造を可能にする。Maximum specific activity and radioimmunoglobulin when using short-lived radionuclides radioactive as quickly as possible during injection into the patient so as to provide minimal degradation of the phosphorus It is desirable to chelate the nuclide to the targeting group. Like EDTA and DTPA When using chelating agents such as Rapid sequestration activates the chelator and allows the chelator to react with the antibody. and then chelate the radionuclide to form a complex and then The radionuclide/antibody/chelate to be produced by purifying the two complexes This allows for the production of binding agent conjugates (referred to herein as conjugates).

しかし、ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡのようなキレート化剤は放射性核種を急速にキレ ート化するが、それらはこのような結合が動的に不安定であるという欠点がある 。更に、抗体ラベリングへの不安定な放射性核種をこのように使用するにより、 置換に不安定な少量の金属（放射性でなくてよい）はキレート中に取り込まれつ る。このような不活性の少量の金属の競争は、より少量の放射性核種が標的サイ トに輸送されるので、抗体／キレート錯体の生体効率を減じる。However, chelating agents such as EDTA and DTPA rapidly clear radionuclides. However, they have the disadvantage that such bonds are dynamically unstable. . Additionally, this use of labile radionuclides for antibody labeling Small amounts of substitution-labile metals (which do not have to be radioactive) may be incorporated into the chelate. Ru. Competition for such small amounts of inert metals means that smaller amounts of radionuclides are at the target site. This reduces the bioefficiency of the antibody/chelate complex.

ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡのようなキレート化剤に関する欠点はキレート化した放射 性アイソトープの早期放出である。生体内での金属放出の速度を低下させるため に、マクロ環状リガンドを基礎とする二官能性キレート化剤、例えば、ＤＯＴＡ （１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ、　Ｎ’　Ｎ“、Ｎ“°− テトラ酢酸）は使用されてきた。例えば、ＭｉｒｚａｄｅｈらのＢｉｏｃｏｎｊ ｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、ｌ、５９〜６５　（＋９９６）；及びＤｅｓｈｐａｎ ｄｅらのＪ。A drawback with chelating agents such as EDTA and DTPA is that the chelated radiation early release of sexual isotopes. To reduce the rate of metal release in vivo In addition, bifunctional chelators based on macrocyclic ligands, such as DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N'N", N"°- tetraacetic acid) has been used. For example, Mirzadeh et al.'s Bioconj ugate Chem, 59-65 (+996); and Deshpan J of de et al.

Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、、　３１．　４７３〜４７９　（１９９０）を参照された い。Nucl, Med, 31. Referenced 473-479 (1990) stomach.

マクロ環状キレ−１・化剤の使用での欠点は室温で起こる比較的低いキレ−１・ 化速度であり、ＭｉｒｚａｄｅｈらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、 ｌ。The disadvantage of using macrocyclic cleavage agents is the relatively low cleavage rate that occurs at room temperature. Bioconjugate Chem by Mirzadeh et al. l.

５９〜６５　（１９９０）を参照されたい。長いキレート化時間で起こる放射線 分解を減じるために、キレート化を行う媒体はしばしばキレート化速度を増加さ せるために加熱される。イソチオシアネート基は感熱性であるので、米国特許第 ５．００６．６４３号は、先ず、キレート化剤をロジウムと反応させ、その後、 キレートを活性化させることによる、第一もしくは第二アミン含有のイソチオシ アナト官能化マクロ環状分子の製造を開示している。米国特許第４．８８５．３ ６３号は、イソチオシアネート化合物で活性化させる前に、第三アミン含有テト ラアサマクロ環状分子にガドリニウムをキレート化させることを開示している。59-65 (1990). Radiation caused by long chelation times To reduce degradation, chelating media are often used to increase the chelation rate. It is heated to make it cool. Since isothiocyanate groups are heat sensitive, U.S. Pat. No. 5.006.643 first reacts a chelating agent with rhodium, then primary or secondary amine-containing isothiocysts by activating chelates. The production of anato-functionalized macrocyclic molecules is disclosed. U.S. Patent No. 4.885.3 No. 63 is a tertiary amine-containing tetamine prior to activation with an isothiocyanate compound. discloses the chelation of gadolinium to Rasa macrocyclic molecules.

放射線免疫治療又は放射線診断に使用されるへき金属キレートルタンパク質結合 体の製造手順を使用することは、実質的な活性の損失を避けるために、短時間で キレートの形成、キレートの活性化、及び、その後、活性化されたキレートの抗 体への結合を必要とする。Metal chelator protein binding used in radioimmunotherapy or radiodiagnosis Using in-body manufacturing procedures can be done in a short time to avoid substantial loss of activity. Formation of chelate, activation of chelate, and subsequent inhibition of activated chelate Requires attachment to the body.

マクロ環状キレート化剤の使用での別の欠点は、それらの合成及び精製の間に、 使用される試薬及び物質は過度の金属イオンを含んではいけないことである。こ れらの工程の間に存在する金属イオン汚染物はマクロ環状分子と強く結合し、所 望の金属イオンのキレート化の間に容易に脱離しなくなる。合成及び精製の間の 金属イオン汚染物は所望の金属イオンのキレート化の間に得られる生成物の純度 を減し、そして、結合体を生じる次の工程で得られる生成物の純度を減じるてあ ろう。Another drawback in the use of macrocyclic chelators is that during their synthesis and purification, The reagents and substances used must not contain excessive metal ions. child Metal ion contaminants present during these processes bind strongly to macrocyclic molecules and cause It is not easily desorbed during chelation of the desired metal ion. during synthesis and purification Metal ion contaminants affect the purity of the product obtained during chelation of the desired metal ion. and reduce the purity of the product obtained in the next step producing the conjugate. Dew.

結果的に、汚染金属イオンを実質的に含まない精製されたマクロ環状キレート化 剤を製造する方法があることは有利であろう。The result is a purified macrocyclic chelate that is virtually free of contaminating metal ions. It would be advantageous to have a method of making the agent.

有機溶剤／水中で反応を行ったときに製造されるよりも増加した収率及びより高 い純度で、水性環境中で、イソチオシアネート活性化キレート化剤を製造する方 法があることも有利であろう。Increased yields and higher For producing isothiocyanate-activated chelating agents in an aqueous environment with high purity. Having a law would also be advantageous.

室温て放射性核種と急速に反応して、容易に解離しないキレートを形成するキレ ート化剤を提供することは望ましいであろう。これは、キレート化剤がキレート 形成前にイソチオシアネートに活性化されることを可能にする。金属イオンのキ レート化前にキレート化剤を活性化することにより、二官能性キレート化剤は、 結合体を製造する必要がある時より前に活性化された形で製造されうる。A chelate that reacts rapidly with radionuclides at room temperature to form a chelate that does not easily dissociate. It would be desirable to provide a softening agent. This means that the chelating agent chelates Allows to be activated to isothiocyanates prior to formation. metal ion key By activating the chelating agent prior to chelation, the bifunctional chelating agent can The conjugate can be manufactured in an activated form prior to the time it is needed to be manufactured.

キレートの抗体との急速な結合が放射線分解及び抗体凝集体形成を減じることが できる方法があることは更に有利であろう。望ましくない反応を減少させ、結合 体を急速に形成することは、より完全な結合反応をもたらし、より容易な生成物 精製をもたらす。また、各工程の収率及び純度を増加する方法を有することは、 医薬品組成物は米国食品及び医薬品協会（Ｕ、Ｓ、　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕ ｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により定められた純度規格を満たさなければ ならないような医薬用途に使用されるであろう化合物及び組成物を製造するとき に特に有利である。Rapid binding of chelates to antibodies may reduce radiolysis and antibody aggregate formation. It would be even more advantageous to have a way to do this. Reduces undesirable reactions and binding Forming the body rapidly results in a more complete binding reaction and an easier product brings about purification. Also, having a method to increase the yield and purity of each step is Pharmaceutical compositions are approved by the United States Food and Drug Association (U, S, Food and Dru). gAdministration). When manufacturing compounds and compositions that will be used for pharmaceutical purposes where is particularly advantageous.

本発明は、精製の間にマクロ環状キレート化剤への過度の金属イオンの混入を防 ぐためのクロマトグラフ法を提供する。本方法は、数グラムの量の二価のカチオ ンを含まないキレート化剤が単一装置操作で生じ、そして精製される点で既存の 手順よりも有利である。The present invention prevents excessive metal ion contamination into the macrocyclic chelating agent during purification. provides a chromatographic method for The method involves the use of divalent cations in quantities of several grams. existing chelators are produced and purified in a single equipment operation It is more advantageous than the procedure.

本発明は、また、イソチオシアナト誘導化ポリアザキレート化剤を形成するため に、有機溶剤の非存在下で、水性環境中でチオホスゲンとポリアザキレート化剤 を反応させることを含む、イソチオシアネート化合物を製造する方法を提供し、 ここで、ポリアザキレート化剤は、式 （式中、各Ｑは独立に水素、（ＣＨＲ’）、　ＧＯ，Ｒ又ｆｔ（ＣＨＲ’）、　 ＰＯ，Ｈ２テアリ； Ｑ’Ｌｔ水素又１ｔ（ＣＨＲ’）＝　Ｃ０２Ｒテアリ各Ｒは独立に水素、ベンジ ル又はＣｌ−Ｃ４アルキルであり。The present invention also provides methods for forming isothiocyanato-derivatized polyazchelating agents. thiophosgene and polyazchelating agent in an aqueous environment in the absence of organic solvents. Provided is a method for producing an isothiocyanate compound, the method comprising: Here, the polyazachelating agent has the formula (In the formula, each Q is independently hydrogen, (CHR'), GO, R or ft(CHR'), PO, H2teari; Q’Lt hydrogen or 1t(CHR’) = C02Rteari Each R is independently hydrogen, benzene or Cl-C4 alkyl.

但し、全Ｑ及びＱｌの少なくとも２個は水素以外でなければならず：各Ｒ５は各 々独立に、水素、Ｃ，−Ｃ，アルキル又は−（ＣＩ−Ｃ２アルキル）フェニルで あり： Ｘ及びＹは各々独立に水素であるか、又は、隣接のＸ及びＹはともに別の炭素− 炭素結合を形成してもよく。However, at least two of all Q and Ql must be other than hydrogen: each R5 is each independently hydrogen, C, -C, alkyl or -(CI-C2alkyl)phenyl can be: X and Y are each independently hydrogen, or adjacent X and Y are both different carbon- May form carbon bonds.

ｎはＯ又はｌてあり。n is O or l.

ｍは０〜１０の整数てあり。m is an integer from 0 to 10.

ｐはｌ又は２てあり。p is l or 2.

ｒは０又は１であり。r is 0 or 1.

Ｗは０又はｌてあり。W is 0 or l.

但し、Ｘ及び／又はＹか別の炭素−炭素結合を形成し、且つ、ｒ及びＷの合計が ０又はＩであるときにはｎは１だけてあり：Ｒ２及びＲ４は独立に水素又はアミ ノであり：Ｒ３はＣｌ−Ｃ４アルコキン、−０Ｃ８２ＣＯ□Ｈ、ヒドロキシ及び 水素であり、但し、Ｒ２及びＲ４は両方とも水素であることができないが、Ｒ２ 及びＲ４の片方は水素でなければならない。）である。However, X and/or Y form another carbon-carbon bond, and the sum of r and W is When 0 or I, n is 1: R2 and R4 are independently hydrogen or amino. R3 is Cl-C4 alkokene, -0C82CO□H, hydroxy and hydrogen, provided that R2 and R4 cannot both be hydrogen, but R2 and one of R4 must be hydrogen. ).

本発明は、また、イソチオシアナト活性化されたキレートと抗体を２５°Ｃ〜４ ０°Ｃで反応させることを含む、結合体を製造する方法を記載し、ここで、キレ ートは金属イオンて錯体化されたキレート化剤であり、キレート化剤は式Ｉに記 載されたようであり、そして、金属イオンは１＠３Ｓｍ、…Ｈｏ　、”’Ｙｂ　 、”７ＬＵ　ｓ　Ｉｓ＠Ｇｄ　、”°Ｌａ　、目２ｐ、　、　＋４＠ｐｍ、　９ ０Ｙ又はｌ　ｌ　ｌ　ｌｎである。The present invention also provides isothiocyanate-activated chelates and antibodies at 25°C to 4°C. A method of making the conjugate is described, comprising reacting at 0°C, wherein The chelating agent is a chelating agent complexed with a metal ion, and the chelating agent is described in Formula I. It seems that the metal ions are 1@3Sm,...Ho,”’Yb , "7LU　s　Is@Gd　,"°La, 2p, , +4@pm, 9 0Y or l l l l ln.

本発明はキレート−抗体結合体の生成の向上した方法をも提供し、ここで、向上 した方法は抗体とキレート化剤とを２５°Ｃ〜約４０″Ｃで接触させることを含 む。The present invention also provides improved methods of producing chelate-antibody conjugates, wherein improved The method involves contacting the antibody with a chelating agent at 25°C to about 40"C. nothing.

本発明はポリアザ金属結合体を製造するための向上した方法を提供する。特に、 本発明は少なくとも、 （ａ）ポリアザキレート化剤（ポリアザキレート化剤は式Ｉに規定した通りであ る）を精製すること、 （ｂ）イソチオシアナト活性化したポリアザキレート化剤が形成するように、精 製したポリアザキレート化剤をチオホスゲンと接触させ、そしてイソチオシアナ ト活性化したポリアザキレート化剤を回収すること、 （Ｃ）イソチオシアナト活性化したポリアザキレートが形成するように、イソチ オシアナト活性化したポリアザキレート化剤に金属イオンを加えること、及び、 （ｄ）結合体が形成するようにイソチオシアナトで活性化したポリアザキレート を生体分子と接触させること、の工程を存し、 向上した方法は、 工程（ａ）において、ポリアザキレート化剤をシリカゲルカラム上でクロマトグ ラフィーにより精製すること（ここで、ポリアザキレート化剤をカラム上に入れ る前にシリカゲルを酸洗浄する。）、工程（ｂ）において、有機溶剤の非存在下 でｐＨ１〜５て、精製したポリアザキレート化剤をチオホスゲンと接触させるこ と、及び、工程（ｄ）において、２５°Ｃ〜４０°Ｃてイソチオシアナト活性化 したポリアサ金属キレートを生体分子と接触させること、を含む、結合体を製造 する方法である。The present invention provides an improved method for making polyaza metal composites. especially, The present invention includes at least (a) a polyazchelating agent (the polyazchelating agent is as defined in Formula I); refining) (b) refined so that an isothiocyanate-activated polyazchelating agent is formed; The prepared polyazacylating agent is contacted with thiophosgene and isothiocyana recovering the activated polyazchelating agent; (C) isothiocyanate such that an isothiocyanate-activated polyazchelate is formed; adding metal ions to the oceanato-activated polyazchelating agent; and (d) polyazchelate activated with an isothiocyanate such that a conjugate is formed. the step of contacting the biomolecule with the biomolecule; The improved method is In step (a), the polyazchelating agent is chromatographed on a silica gel column. purification by roughy (here, a polyazchelating agent is placed on the column) Wash the silica gel with acid before washing. ), in step (b), in the absence of an organic solvent The purified polyazchelating agent is brought into contact with thiophosgene at pH 1 to 5. and, in step (d), isothiocyanate activation at 25°C to 40°C. contacting a polyasulfate metal chelate with a biomolecule. This is the way to do it.

ここで使用するときに、用語「キレート化剤」又は「リガンド」とは金属イオン をキレート化する、又は、隔離することができる化合物を意味する。用語「キレ ート」とは隔離した金属イオンを有するキレート化剤を意味する。As used herein, the term "chelating agent" or "ligand" refers to a metal ion. means a compound that can chelate or sequester. The term “kire” "Set" means a chelating agent with sequestered metal ions.

用語「二官能性キレート化剤」とは金属をキレート化することかできる部分、及 び、生体分子と共存結合する手段として働くように活性化され又は官能化されう るキレート化する部分に共有結合したリンカ−／スペーサ一部分を有する化合物 を意味する。The term "bifunctional chelating agent" refers to moieties that are capable of chelating metals; and activated or functionalized to serve as a means of co-binding with biomolecules. Compounds with a linker/spacer moiety covalently attached to the chelating moiety means.

用語「生体分子」とは、特異的な生体標的サイトを認識するように機能するあら ゆるタンパク質、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、抗原又はハブテンを意味 する。官能化したキレートに結合されるどきに、このような生体分子は特異的な 標的組織に結合された金属を輸送するように機能する。好ましくは、生体物質は 抗体又は抗体フラグメントである。The term "biomolecule" refers to a compound that functions to recognize a specific biological target site. protein, antibody, antibody fragment, hormone, antigen or hubten do. When attached to a functionalized chelate, such biomolecules exhibit specific Functions to transport bound metals to target tissues. Preferably, the biological material is An antibody or antibody fragment.

ここで使用するときに、「抗体」とはあらゆるポリクロナール、モノクロナール 、キメラ抗体、異種抗体、またはその組換体もしくは誘導体を意味し、好ましく は、モノクロナール抗体を意味する。As used herein, "antibody" refers to any polyclonal or monoclonal antibody. , refers to chimeric antibodies, xenoantibodies, or recombinant or derivatives thereof, preferably means monoclonal antibody.

ここで使用するときに、用語「抗体フラグメント」は所望のエピトープに特異性 を有するＦａｂフラグメント及びＰ（ａｂ’　）　２フラグメント、並ひにその 組換体及び誘導体を含めた抗体のあらゆる部分を含む。抗体フラグメントは、従 来の酵素法により、又は、遺伝子もしくはタンバク工学技術、例えば、単一鎖抗 体の製造法により製造されうる。As used herein, the term "antibody fragment" refers to Fab fragments and P(ab')2 fragments with Includes all parts of antibodies, including recombinant and derivatives. Antibody fragments or by conventional enzymatic methods, or by genetic or protein engineering techniques, e.g. single chain antibodies. It can be manufactured using a body manufacturing method.

キレート化剤に関する用語「活性化（した）」又は「活性化（する）」はキレー ト化剤が生体分子と共有結合することができる官能基により修飾されたことを意 味する。The term ``activated'' or ``activated'' regarding chelating agents refers to chelating agents. This means that the oxidizing agent has been modified with a functional group that can covalently bond to biomolecules. Taste.

ここで、使用するときに、用語「結合体」とは二官能性キレート化剤もしくは二 官能性キレートに結合した生体物質の錯体を意味する。用語「抗体／キレート／ 結合体ｊとは二官能性キレート（即ち、キレート化された金属イオンを有する二 官能性キレート化剤）に共有結合した抗体を意味する。As used herein, the term "conjugate" refers to a difunctional chelating agent or Refers to a complex of biological material bound to a functional chelate. The term “antibody/chelate/ Conjugate j is a difunctional chelate (i.e., a difunctional chelate with a chelated metal ion). refers to an antibody covalently linked to a functional chelator).

結合体を製造するだめの工程を提供する、本発明に使用する一般的な全体の手順 を次のスキームＩに与える。プロセススキームの工程（ｂ）及び（Ｃ）は逆でも よい。短い半減期を存する放射性核種である金属イオンを隔離するときに、続い て行う活性化工程及び続いて行ういずれかの精製の間に起こるであろう放射線分 解を避けるように、活性化はキレートの生成前に行うことが好ましい。General overall procedure used in the present invention, providing a final step for producing the conjugate is given in the following Scheme I. Steps (b) and (C) of the process scheme can also be reversed. good. When isolating metal ions, which are radionuclides with short half-lives, radiation exposure that may occur during the activation step and any subsequent purification. Activation is preferably carried out before the formation of the chelate to avoid decomposition.

スキーム１ キレート化剤の合成 ↓ キレート化剤のシリカゲル上での精製 工程（ａ） ↓ キレート化剤の活性化 工程Ｃｂ’） ↓ キレートを形成するだめの、活性化されたキレ−１・他剤による金属イオンのキ レート化 工程（ｃ） 結合体を形成するための、生体物質へのキレートの結合工程（ｄ） ↓ 結合体の精製 本発明は、シリカゲルを使用したフラッシュクロマトグラフィーによるマクロ環 状キレート化剤の精製の間の、過度の金属イオン、詳細にはカルシウムイオンｃ ｃａ”　）を滅しる方法を提供する。マクロ環状キレート化剤を精製するために 使用した市販のシリカゲルは、精製の間にキレート化剤と強固に結合する、望ま しくない金属イオン、特にカルシウムのような二価の金属イオンの源を予期せず に含んでいることが分かった。使用前に、強鉱酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、 過塩素酸または臭化水素酸によりシリカゲルを洗浄することは、精製過程の間に キレート化剤と結合する、望ましくない金属イオンの量を実質的に減じる。好ま しくは、シリカゲルを洗浄するために使用する鉱酸は、塩酸である。不純物を除 去するための強酸によるシリカゲルの洗浄の手順は当業界に知られ、例えば、Ｒ ａｌρｈ　Ｋ。Scheme 1 Synthesis of chelating agents ↓ Purification of chelating agents on silica gel Process (a) ↓ Activation of chelating agents Process Cb’) ↓ Metal ion chelation by activated chelate-1 and other agents to form chelates rate Process (c) step (d) of binding the chelate to the biological material to form a conjugate; ↓ Purification of the conjugate The present invention is a macrocyclic ring analysis method using flash chromatography using silica gel. During the purification of chelating agents, excessive metal ions, in particular calcium ions, ca”).To purify macrocyclic chelating agents. The commercially available silica gel used has the desired silica gel that binds tightly to the chelating agent during purification. Unexpected sources of unwanted metal ions, especially divalent metal ions such as calcium. It was found that it contains. Before use, add strong mineral acids such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, Cleaning silica gel with perchloric acid or hydrobromic acid is recommended during the purification process. Substantially reduces the amount of undesirable metal ions that bind to the chelating agent. Like Alternatively, the mineral acid used to wash the silica gel is hydrochloric acid. Remove impurities Procedures for washing silica gel with strong acids to remove alρh　K.

［１ｅｒのＴｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｉｌｉｃａ、　Ｊｏｈｎ　Ｗ ｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　（１９７９）を参照されたい。[1er's The Chemistry of 5ilica, John W See Iley & 5ons (1979).

初期精製の間におけるマクロ環状キレート化剤からの望ましくない金属イオンの 排除は、結合体を形成するために続いて行う工程において幾つかの利点を有する 。マクロ環状キレート化剤からの望ましくない結合した金属イオンの排除は、カ ルシウムを置換するために必要な加熱又は長時間と対照的に、室温で所望の金属 イオンの急速なキレート化を可能にする。官能基を破壊する温度でなく室温でキ レート化工程を行えることにより、金属イオンのキレート化の前にマクロ環状二 官能性キレート化剤の活性化が可能になる。金属イオンのキレート化の前にマク ロ環状キレート化剤を官能化することかできることは、活性化キレ−１・色剤か 合成され、貯蔵され、そして、その後、生体物質との結合の直前に金属イオンを 隔離することができるので特に有利である。このことは金属がｌＯ日間以内の半 減期を有する放射線核種であるときに有用である。というのは、キレートの官能 化、結合、及び各工程からの生成物の精製に必要な時間の間に実質的な量の放射 線分解が起こりつるからである。望ましくない金属イオンの予備除去はランタノ イド（Ｉｎ系列の放射性金属の吸収において特に重要である。キレート化剤の活 性化後に放射性核種を急速にキレート化することができることは、結合体の製造 に使用される精製手順を、より単純に、そして効率的にする。Elimination of unwanted metal ions from macrocyclic chelators during initial purification Exclusion has several advantages in subsequent steps to form conjugates. . Exclusion of undesired bound metal ions from macrocyclic chelators is a the desired metal at room temperature, as opposed to the heating or long periods of time required to displace lucium. Allows rapid chelation of ions. Keying is done at room temperature, not at a temperature that would destroy functional groups. The ability to carry out the chelation step allows macrocyclic molecules to be added prior to metal ion chelation. Activation of functional chelating agents is enabled. Mac prior to metal ion chelation Cyclic chelating agents can be functionalized using activated chelators or colorants. Synthesized, stored, and then loaded with metal ions just prior to binding with biological materials This is particularly advantageous since it can be isolated. This means that the metal is Useful when radionuclides have a shelf life. Because the sensuality of chelate Substantial amounts of radiation during the time required for conjugation, binding, and purification of the products from each step. This is because line decomposition occurs. Preliminary removal of undesired metal ions is performed using lanthanide. (particularly important in the absorption of radioactive metals of the In series.The activity of chelating agents The ability to rapidly chelate radionuclides after sexualization indicates that the production of conjugates make the purification procedures used in the process simpler and more efficient.

二官能性キレート化剤を精製する本方法はあらゆるトリもしくはヘキサ−（カル ボキシル化）、−（ホスホノメチル化）、又は−（ホスフィンメチル化）ポリア ザマクロ環状分子を含む多くのクラスのりガントのために使用されうる。ここで 、ポリアザマクロ環状分子は環中に３〜６個の窒素原子を有し、そして環中の原 子の総数は９〜２４個である。第二及び第三アミンを含むポリアザキレート化剤 、アミノカルボン酸キレート化剤及びアミノ燐酸キレート化剤は特に興味深い。This method of purifying bifunctional chelating agents is suitable for any tri- or hexa(cal) boxylated), -(phosphonomethylated), or -(phosphinemethylated) polyamines Many classes of adhesives can be used for Gantts, including macrocyclic molecules. here , polyazamacrocyclic molecules have 3 to 6 nitrogen atoms in the ring, and The total number of children is 9-24. Polyazchelating agents containing secondary and tertiary amines , aminocarboxylic acid chelators, and aminophosphoric acid chelators are of particular interest.

好ましいポリアザマクロ環状キレート化剤は式（式中、各Ｑは独立に水素、（Ｃ ＨＲ’）、　Ｃ０２Ｒ又は（ＣＨＲ’）、　ＰＯ３Ｈ２であり： Ｑ’は水素又は（ＣＨＲ’）、　ＣＯ，Ｒてあり各Ｒは独立に水素、ベンジル又 はＣ，−Ｃ，アルキルであり。Preferred polyazamacrocyclic chelators have the formula (wherein each Q is independently hydrogen, (C HR'), C02R or (CHR'), PO3H2: Q' is hydrogen, (CHR'), CO, R, and each R is independently hydrogen, benzyl, or is C, -C, alkyl.

但し、全Ｑ及びＱｌの少なくとも２個は水氷以外でなければならず。However, at least two of the total Q and Ql must be other than water ice.

各Ｒ′は各々独立に、水素、Ｃ＋−Ｃ４アルキル又は−（Ｃ，−Ｃ２アルキル） フェニルであり： Ｘ及びＹは各々独立に水素であるか、又は、隣接のＸ及びＹはともに別の炭素− 炭素結合を形成してもよく：ｎは０又はｌであり： ｍはＯ〜１０の整数てあり： ｐはｌ又は２であり。Each R' is independently hydrogen, C+-C4 alkyl or -(C, -C2 alkyl) It is phenyl: X and Y are each independently hydrogen, or adjacent X and Y are both different carbon- Carbon bonds may be formed: n is 0 or l; m is an integer from 0 to 10: p is l or 2.

「は０又はｌてあり。``is 0 or l.

Ｗは０又はｌであり： 但し、Ｘ及び／又はＹが別の炭素−炭素結合を形成し、且つ、ｒ及びＷの合計が ０又はｌであるときにはｎは１だけであり；Ｒ２及びＲ４は独立に水素又はアミ ノであり。W is 0 or l: However, X and/or Y form another carbon-carbon bond, and the sum of r and W is When 0 or l, n is only 1; R2 and R4 are independently hydrogen or amino. It's no.

Ｒ３はＣ，−Ｃ，アルコキン、−０ＣＨ，ＣＯ，Ｈ、ヒドロキシ及び水素であり 、但し、Ｒ２及びＲ４は両方とも水素であることができないが、Ｒ２及びＲ４の 片方は水素てなければならない。）である。R3 is C, -C, alkokene, -0CH, CO, H, hydroxy and hydrogen , provided that R2 and R4 cannot both be hydrogen, but R2 and R4 One side must be hydrogen. ).

式１のポリアザキレート化剤の好ましいアミンは第三アミンであり、好ましくは ｒがＯてあり、そしてＱが（ＣＨＲｓ）、　ＣＯ□Ｒである。Preferred amines of the polyazachilating agent of formula 1 are tertiary amines, preferably r is O, and Q is (CHRs), CO□R.

ポリアザマクロ環状分子を合成する手順は当業界によく知られる。Procedures for synthesizing polyazamacrocycles are well known in the art.

好ましいキレート化剤の例を表１に与え、それらは次のような名称である。Examples of preferred chelating agents are given in Table 1 and are named as follows.

ＩＡはト（４−アミノフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ ン−１，４，７，ＩＯ−テトラ酢酸であり：］８は１−［２−（４−アミノフェ ニル）エチル１−１．４．７．１０−テトラアザシクロドデカン−４，７，１０ −トリ酢酸であり：ＩＣは！−［２−（４−アミノフェニル）エチル］−１，４ ゜７．１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸であり ：ＩＤは１−（５−アミノ−２−メトキシベンジル）−１，４，’７．１０−テ トラアザシクロドデカン−１，４，７，ｉｏ−テトう酢酸であり。IA is to(4-aminophenyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododeca ]8 is 1-[2-(4-aminophene). ethyl) 1-1.4.7.10-tetraazacyclododecane-4,7,10 -It is triacetic acid: IC is! -[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4 ゜7.10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid : ID is 1-(5-amino-2-methoxybenzyl)-1,4,'7.10-te It is tolazacyclododecane-1,4,7,io-tetoacetic acid.

ＩＥは１−（５−アミノ−２−ヒドロキシベンジル）−１，４，７，１叶テトラ アサシクロドデカン−４，７，１０−トリ酢酸であり：ＩＦは１−［２−（４− アミノフェニル）エチル）　］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン −１−（Ｒ，Ｓ−酢酸−４，７，１０−トリス（Ｓ−メチル酢酸）であり、その 製造法は１９９１年４月ＩＯ日発行の欧州特許公開公報第０４２０９４２号に与 えられている。ＩＡ−ＩＰの製造法は１９９０年２月７日公開の欧州特許公開公 報第０３５３４５９０号及び１９９１年４月１０日発行の欧州特許公開公報第０ ４２０９４２号に与えられている。IE is 1-(5-amino-2-hydroxybenzyl)-1,4,7,1 leaf tetra Asacyclododecane-4,7,10-triacetic acid: IF is 1-[2-(4- aminophenyl)ethyl)]-1,4,7,10-tetraazacyclododecane -1-(R,S-acetic acid-4,7,10-tris(S-methylacetic acid), The manufacturing method is given in European Patent Publication No. 0420942, published on IO April 1991. is being given. The production method for IA-IP is described in the European Patent Publication published on February 7, 1990. European Patent Publication No. 03534590 and European Patent Publication No. 0 published April 10, 1991 No. 420942.

表１ カルボキシアルキル基を含むアミン誘導体を提供するへきリガンドのアミンのカ ルボキシル化法はよく知られ、アミン窒素上にアルキル燐酸及びヒドロキシアル キル置換基を与える方法と同様である（例えば、米国特許第３．７２６．９１２ 号及び第３．３９８．１９８号を参照）。Table 1 The amine moiety of the ligand provides an amine derivative containing a carboxyalkyl group. The carboxylation process is well known and involves the formation of alkyl phosphates and hydroxyalkyl phosphates on the amine nitrogen. Similar methods for providing kill substituents (e.g., U.S. Pat. No. 3,726,912 3.398.198).

リガントのアミノ燐酸誘導体は多数の既知の合成技術により製造されつる。少な くとも１個の反応性アミン水素を含む化合物とカルボニル化合物（アルデヒド又 はケトン）及び燐酸もしくはその誘導体との反応は特に重要である（Ｍｏｅｏｒ ｉｔｚｅｒ及びＩｒａｎｉの手順、Ｊ。Aminophosphoric acid derivatives of ligands can be prepared by a number of known synthetic techniques. little Compounds containing at least one reactive amine hydrogen and carbonyl compounds (aldehydes or is a ketone) and phosphoric acid or its derivatives are of particular interest (Moeor et al. Itzer and Irani procedure, J.

Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　３１．１６０３　（１９６６）を参照されたい。）。See Org, Chem, 31.1603 (1966). ).

酸洗浄したシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製された、本 発明のポリアザキレート化剤は生体分子と共有結合を形成しつるいかなる既知の 官能基によっても活性化されうる。このような官能基の例はイソチオシアネート 、ブロモアセトアミド、マレイミド、イミドエステル、チオフタルアミド、ジア ゾニウム及びカルボキシルである。望ましくない金属イオンを本質的に含まない ポリアザキレート化剤の使用は、イソチオシアネートのようなｐ）１及び／又は 熱的に不安定な官能基を使用するときには、特に重要である。活性化する官能基 はマクロ環状キレート化削土で式ＩのＲ２又はＲ４に位置する。This product was purified by flash chromatography on acid-washed silica gel. The polyazachelating agent of the invention can be any of the known polyazacylating agents that form covalent bonds with biomolecules. It can also be activated by functional groups. An example of such a functional group is isothiocyanate , bromoacetamide, maleimide, imidoester, thiophthalamide, dia Zonium and carboxyl. Essentially free of undesirable metal ions The use of polyaza chelating agents includes p)1 and/or This is particularly important when using thermally labile functional groups. Functional group to activate is located at R2 or R4 of formula I in the macrocyclic chelating excavation.

ポリアザキレート化剤とチオホスゲンを反応させて、キレート化剤をイソチオシ アネート基により活性化させるときに、反応を水性環境中、好ましくは希酸中で 激しい混合の下で、有機溶剤の非存在下で行うことは有機溶剤の存在下で得られ るものより高い純度の活性化キレート化剤をもたらすということが予期せずに発 見された。By reacting the polyaza chelating agent with thiophosgene, the chelating agent is converted into an isothiocyst. When activated by an anate group, the reaction is carried out in an aqueous environment, preferably in a dilute acid. Under vigorous mixing, what is done in the absence of organic solvents is obtained in the presence of organic solvents. An unexpected occurrence that results in an activated chelator of higher purity than that of It was seen.

これは有機溶剤の存在下でｐＨ８，５を使用し、及び／又はチオホスゲンを加え る既知の手順と対照的である。例えば、Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ　らのＩｎｏｒｇ、 　Ｃｈｅｍ、、　２５．２７７２〜２７８１　（１９８６）；Ｋｅａｎａ及びＭ ａｎｎのＪ、　Ｏｒｇ。This is done using a pH of 8.5 in the presence of organic solvents and/or adding thiophosgene. This is in contrast to known procedures. For example, Inorg of Brechbiel et al. Chem, 25.2772-2781 (1986); Keana and M. Ann's J, Org.

Ｃｈｅｍ、、５５．　２８６８〜２８７１　（１９９０）：Ｗｅｓｔｅｒｂｅｒ ｇらのＪ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、。Chem,,55. 2868-2871 (1990): Westerber J, Med, Chem, et al.

３２、２３６〜２４３　（１９８９）；及びＫ１１ｎｅらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇ ａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、　２゜２６〜３１　（１９９１）を参照されたい。チオホ スゲンとキレート化剤の反応はＩ）Ｈ１〜７である。好ましくはｐＨは１〜５で ある。より好ましくは、ｐＨは１〜３である。32, 236-243 (1989); and Bioconjug of K11ne et al. See ate Chem, 2.26-31 (1991). Cioho The reaction between sugene and a chelating agent is I) H1-7. Preferably the pH is between 1 and 5. be. More preferably the pH is 1-3.

キレート化剤とチオホスゲンとの反応は、約０．００５〜約０．５規定（Ｎ）、 好ましくは０．０１〜０，２Ｎの酸濃度を有する水性環境中で行われる。酸はあ らゆる鉱酸であることができ、好ましくは塩酸である。The reaction between the chelating agent and thiophosgene is about 0.005 to about 0.5 normal (N), Preferably it is carried out in an aqueous environment with an acid concentration of 0.01 to 0.2N. Acid huh It can be any mineral acid, preferably hydrochloric acid.

希酸中、激しい混合及び過剰のホスゲンでのキレート化剤とチオホスゲンとの反 応は、非常に速く、通常、室温（１５°Ｃ〜２５°Ｃ）において５分以内に完了 する。より高い又はより低い温度（例えば、０″Ｃ〜５０°Ｃ）は使用されつる が、室温が好ましい。Reaction of chelating agent with thiophosgene in dilute acid, vigorous mixing and excess phosgene. The reaction is very fast, typically completed within 5 minutes at room temperature (15°C to 25°C) do. Higher or lower temperatures (e.g. 0″C to 50°C) may be used However, room temperature is preferred.

混合物へ加えられる過剰のチオホスゲンの量はポリアザキレ−１・色剤の濃度に 依存する。キレート化剤の濃度が低ければ、アミンのイソチオンアネートへの変 換を急速でかつ完全にするように過剰のチオホスゲンは多量になる。例えば、も しキレート化剤の濃度が１０−３Ｍであるならば、チオホスゲン／キレート化剤 の比は５〜２０．１である。もしキレート化剤の濃度が１０−８λ１であるなら ば、チオホスゲン／キ１．−　＋−化剤の比は数千倍大きい（即ち、１０’　： Ｉである）。The amount of excess thiophosgene added to the mixture depends on the concentration of polyazacyl-1 colorant. Dependent. At low concentrations of chelating agent, conversion of amines to isothionanates is possible. The excess thiophosgene is large so that the conversion is rapid and complete. For example, also If the concentration of the chelating agent is 10-3 M, then the thiophosgene/chelating agent The ratio is between 5 and 20.1. If the concentration of chelating agent is 10-8λ1 For example, thiophosgene/K1. - The ratio of +-izing agents is several thousand times larger (i.e. 10': I).

蒸発、クロマトグラフィー又は抽出のような従来の方法により過剰のチオホスゲ ンは除去される。Remove excess thiophosge by conventional methods such as evaporation, chromatography or extraction. is removed.

チオホスゲンの水性溶液との急速な混合は、水性溶液中にチオホスゲンの分散液 を製造するために充分な剪断を生じることができる、当業界に知られる従来の装 置を使用して達成される。Rapid mixing of thiophosgene with an aqueous solution creates a dispersion of thiophosgene in the aqueous solution. Conventional equipment known in the art that can generate sufficient shear to produce This is accomplished using

このような混合手段の例は、大規模製造にはワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレン ダー、及び、小規模製造にはＡ１１ｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、がら入手可能なＭｉｘｘ ｏｒ　（商標）型ミキサーの使用である。Examples of such mixing means include Waring blends for large scale production. Mixx, available from A11tech Inc. or (trademark) type mixer.

上記に記載のように、キレート化剤とチオホスゲンとの反応を行うことにより、 イソチオシアナト活性化されたキレート化剤の得られる純度は高性能液体クロマ トグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定して約９０〜約９５％である。By carrying out the reaction of the chelating agent with thiophosgene, as described above, The resulting purity of isothiocyanate-activated chelators is determined by high-performance liquid chromatography. from about 90 to about 95% as determined by HPLC.

キレート化剤が活性化された後、活性化されたキレート化剤を金属イオンと接触 させ、キレート化剤／金属イオンキレートを形成させる。放射性金属イオンであ ろうがなかろうが、キレート化剤により隔離されるあらゆる金属イオンは使用さ れつるが、形成したキレートは金属錯体が容易に解離しないように合理的な安定 性を有するへきである。治療及び／又は診断用の放射性医薬となる製品の使用の ために、放射性核種の使用は好ましい。特に好ましい放射性同位体はサマリウム （Ｓｍ−１５３）、ホルミウム（Ｈｏ−１６６）、イッテルビウム（Ｙｂ−１７ ５）、ルテニウム（ＬＬＩ−１７７）、ガドリニウム（Ｇｄ−１５９）、ランタ ニウム（Ｌａ−１４０）、プラセオジム（Ｐｒ−１４２）、プロメチウム（Ｐｍ −１４９）、イツトリウム（Ｙ−９０）及びインジウム（Ｉｎ−Ｉｌｌ）の放射 性同位体である。After the chelating agent is activated, contacting the activated chelating agent with the metal ion to form a chelating agent/metal ion chelate. Radioactive metal ions Any metal ion sequestered by a chelating agent, wax or not, should not be used. However, the formed chelate is reasonably stable so that the metal complex does not dissociate easily. It is a place with a sexual nature. Use of products as radiopharmaceuticals for therapeutic and/or diagnostic purposes Therefore, the use of radionuclides is preferred. A particularly preferred radioisotope is samarium (Sm-153), holmium (Ho-166), ytterbium (Yb-17) 5), Ruthenium (LLI-177), Gadolinium (Gd-159), Lantha Ni (La-140), praseodymium (Pr-142), promethium (Pm -149), yttrium (Y-90) and indium (In-Ill) radiation It is a sexual isotope.

放射性核種は数種類の方法で製造されつる。核反応話中、核種は中性子で衝撃さ れ、放射性核種、例えば、Ｓｍ−１５２＋　中性子　→Ｓｍ−１５３＋ガンマを 得る。放射性核種を得る別の方法は直線加速器又はサイクロトロンにより生した 粒子で核種を衝撃するとである。更に別の方法は***生成物混合物から放射性核 種を分離することである。本発明に使用する核種を得る方法は問題ではない。Radionuclides can be produced in several ways. During a nuclear reaction, nuclides are bombarded with neutrons. and radionuclides, for example, Sm-152 + neutron → Sm-153 + gamma. obtain. Another way to obtain radionuclides is to obtain radionuclides produced by linear accelerators or cyclotrons. This occurs when particles bombard a nuclide. Yet another method is to extract radioactive nuclei from the fission product mixture. It is to separate the seeds. The method of obtaining the nuclides used in the present invention does not matter.

放射性核種は、二官能性キレート化剤を放射性核種の溶液に加えることにより二 官能性キレート化剤て錯体化されうる。キレートは１）Ｈ１〜１０て水性溶液中 で混合されたときに容易に形成する。好ましくは、ｐＨ１〜７、より好ましくは ５〜７を有する媒体中で反応を行う。約１０〜約４０°Ｃの周囲温度は金属イオ ンキレート化のために容易に使用されうる。使用される金属イオンの量はトレー ス量〜キレートとモル等量より過剰の量でありうる。好ましくはキレートの形成 は室温、１５°Ｃ〜２５°Ｃで起こる。Radionuclides can be dioxidized by adding a bifunctional chelating agent to a solution of radionuclides. It can be complexed with a functional chelating agent. Chelate is 1) H1-10 in aqueous solution. Forms easily when mixed with. Preferably pH 1-7, more preferably The reaction is carried out in a medium with 5-7. Ambient temperatures of about 10 to about 40°C can be easily used for chelation. The amount of metal ions used is The amount may be in excess of the molar equivalent of the chelate. Preferably chelate formation occurs at room temperature, 15°C to 25°C.

所望の金属イオンのキレート化の前に、実質的にカルシウムイオンを含まないシ リカゲル上で最初に精製し、チオホスゲンで活性化したキレート化剤を使用する ときに、キレート化は急速に進行し、そして、高性能液体クロマトグラフィーで 測定して約９５％以上の収率を得る。Prior to chelation of the desired metal ions, a substantially calcium ion-free system is Using a chelator that is first purified on lycagel and activated with thiophosgene Sometimes chelation proceeds rapidly and can be detected by high performance liquid chromatography. A yield of about 95% or more is obtained as measured.

広いｐＨ範囲にわたって急速にキレートを形成する能力は所望の金属イオンの高 いキレート化収率を得るために有利である。所望の金属イオンのキレート化の前 にカルシウムのような二価のカチオンを脱離させる必要があるときには、脱離反 応のｐＨ感受性のために収率は変化する。カルシウムイオンの脱離はカルシウム を脱離するために充分に低いｐＨで反応を行う必要があるが、ｐＨは所望の金属 イオンのキレート化に悪影響を及はすほと低くてはならない。本発明の手順を使 用することにより、キレート化反応は広いｐＨ範囲にわたって高い収率で進行す ることができる。The ability to rapidly chelate over a wide pH range allows for high concentration of desired metal ions. This is advantageous in order to obtain high chelation yields. Before chelation of desired metal ions When it is necessary to desorb divalent cations such as calcium, the desorption reaction is Yields will vary due to the pH sensitivity of the reaction. Desorption of calcium ions is calcium The reaction needs to be carried out at a sufficiently low pH to eliminate the desired metal, but the pH It must not be so low that it adversely affects ion chelation. Using the procedure of the invention The chelation reaction can proceed in high yield over a wide pH range. can be done.

キレートを形成させる前にキレート化剤を活性化する能力及び高収率てのキレー トの急速な形成は、結合工程の前に必要な精製を減じるという利点をも有する。Ability to activate chelating agent prior to chelate formation and high yield of chelate The rapid formation of the conjugate also has the advantage of reducing the purification required before the conjugation step.

チオホスゲンを使用して活性化する前に金属がキレート化するときには、有機溶 剤で未反応チオホスゲンを抽出し、そして、その後、結合の前にキレートを精製 する必要がある。イオン交換カラムを使用して精製後に得られる溶出液体積にお けるキレートの低い濃度は、結合前のキレートの濃縮を必要にする。チオホスゲ ンの抽出、および、減圧及び／又は加熱による溶出液の濃縮の過程の間に、生成 物のある程度の劣化は、放射線分解が作る更なる不純物とともに起こる。本発明 のキレート化工程に次いで、活性化したキレートはカラムクロマトグラフィーに より急速に精製され、そして、溶出液は結合工程の前に濃縮なしに直接、使用さ れうる。When metals are chelated prior to activation using thiophosgene, the organic solvent Extract unreacted thiophosgene with reagent and then purify the chelate before conjugation There is a need to. The eluate volume obtained after purification using an ion exchange column The low concentration of chelate used requires concentration of the chelate before binding. Thiophosge During the process of extracting the sample and concentrating the eluate by vacuum and/or heating, Some degradation of the material occurs with additional impurities created by radiolysis. present invention Following the chelation step, the activated chelate is subjected to column chromatography. is purified more rapidly, and the eluate is used directly without concentration before the binding step. It can be done.

二官能性キレートは好ましくは、特異的な標的機能を実行する生体分子と結合す る。好ましい態様において、生体分子は、選択された細胞表面の標的サイトに特 異的であるモノクロナール抗体又はそのフラグメントである。このような抗体は 市販され、又は、標準的な身体細胞複合化技術により製造されうる。適切なモノ クロナール抗体の例は、ＰＣＴ国際公開出願第ＷＯ３９１００６９２号（１９８ ９年１月２６日）及び、ＰＣＴｌ際公開出願第ＷＯ９０１０４４１０号（１９９ ０年５月３日）に記載のＴＡＧ−７２（腫瘍に結合した糖タンパク）に特異性の 一連のモノクロナール抗体、ＣＣ４９である。一般に、キレート及びタンパク質 は、タンパク質及びタンパク質濃度により、１：１０より大きく、そして、約１ ００：１より小さいモル比で混合される。０．５：１〜４：１の比は好ましい。Bifunctional chelates are preferably used to bind biomolecules that perform specific targeting functions. Ru. In a preferred embodiment, the biomolecule is specific to a selected cell surface target site. A monoclonal antibody or a fragment thereof that is heterologous. Such antibodies They are commercially available or can be manufactured by standard somatic cell conjugation techniques. appropriate things Examples of clonal antibodies are described in PCT International Publication No. WO39100692 (198 January 26, 2009) and PCT International Publication Application No. WO90104410 (January 26, 1999) specific for TAG-72 (a tumor-bound glycoprotein) described in A series of monoclonal antibodies, CC49. Generally, chelates and proteins is greater than 1:10 and approximately 1:1, depending on the protein and protein concentration. Mixed in a molar ratio of less than 00:1. A ratio of 0.5:1 to 4:1 is preferred.

チオイソシアネート誘導キレートを抗体に結合させる方法は当業界によく知られ る。この手順は、一般に、官能化されたキレート化剤又はキレートを、室温にお いてｐＨ６〜ｌＯで水性緩衝溶液中で２〜１６時間、抗体と反応させることを含 む。Methods for attaching thioisocyanate-derived chelates to antibodies are well known in the art. Ru. This procedure generally involves placing the functionalized chelating agent or chelate at room temperature. and reacting with the antibody in an aqueous buffer solution at pH 6-10 for 2-16 hours. nothing.

本発明の方法により得られるキレートの純度の増加により、２５°Ｃ〜４０°Ｃ １好ましくは３０°Ｃ〜４０°Ｃにおいて、キレートは生体物質、好ましくはタ ンパク質と結合することができ、それにより、キレート活性化基の劣化（即ち、 イソシアネートの加水分解）又はタンパク質の劣化の期待される増加なしに、１ ｇのタンパク質量たり０．５〜３０ミリキユリーの活性を有するタンパク質／キ レートを得る。キレート化反応の温度が増加するにつれ、タンパク質凝集体形成 及びキレート活性化基の加水分解の速度の増加か結合速度の増加に加えて期待さ れる。予想に反し、高温は望ましくない副生成物（例えば、キレート加水分解物 及びタンパク質凝集体）の増加速度と比較して、よりいっそう速い結合速度の増 加をもたらす。約ｐｉ（９，５及び３７°Ｃにおいて結合を行うならば、反応は １時間で約９２％完了し、タンパク質凝集体に４％より低い放射性物質か結合す る。Due to the increased purity of the chelate obtained by the method of the present invention, it is possible to 1 Preferably at 30°C to 40°C, the chelate is a biological material, preferably a can bind to proteins, thereby causing degradation of the chelate activating group (i.e. 1 without the expected increase in isocyanate hydrolysis) or protein degradation. Protein/kg with activity of 0.5 to 30 milliquiries per g of protein Get a rate. Protein aggregate formation as the temperature of the chelation reaction increases and the expected increase in the rate of hydrolysis of the chelate-activating group or in addition to the increase in the rate of association. It will be done. Unexpectedly, high temperatures can lead to unwanted by-products (e.g. chelate hydrolysates). and protein aggregates). bring about addition. If the coupling is carried out at about pi (9, 5 and 37 °C, the reaction is Approximately 92% complete in 1 hour, with less than 4% radioactivity bound to protein aggregates. Ru.

結合の間のより少量の副生成物の生成及びより完全な反応により、より容易な生 成物の精製、より高い純度の生成物の製造が可能になり、そして、より高い初期 放射能の全体での回収率を提供する。３７°Ｃの結合温度の使用は、また、結合 か２０°Ｃて行われたときの約８０％放射線化学収率と比較して、カラムクロマ トグラフィーによる＋７４製の間に９０％より高い放射線化学収率を得ることを 可能にする。Easier production due to formation of smaller amounts of by-products and more complete reaction during bonding. purification of the product, the production of products of higher purity, and higher initial Provides overall recovery of radioactivity. The use of a bonding temperature of 37°C also Column chromatography compared to approximately 80% radiochemical yield when carried out at Obtaining radiochemical yields higher than 90% during +74 production by tography enable.

本発明は次の実施例を考慮して更に明確にされるでろう。それらは本発明の純粋 な例示であることか意図される。The invention will be further clarified in consideration of the following examples. They are pure according to the invention It is intended to be illustrative.

次の実施例において次の用語を使用する。The following terminology is used in the following examples.

ＢＦＣは二官能性キレート化剤であり、ＰＡ−ＤＯＴＡはＩ［２−（４−アミノ フェニル）エチル］−１，４，７，１０−テトラアサノクロドデカン−１，４， ７，１０−テトラ酢酸であり、ＨＥＰＥＳはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジ ン−Ｎ−２−エタンスルホン酸である。BFC is a difunctional chelator and PA-DOTA is a difunctional chelator, and PA-DOTA is phenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraasanochlorododecane-1,4, 7,10-tetraacetic acid and HEPES is N-2-hydroxyethylpiperazide. N-N-2-ethanesulfonic acid.

一般的な実験 質量スペクトル（キセノンによる高速原子衝撃）はバキュームジェネレーターＺ ＡＢ　Ｈ３質量スペクトルメーター上で得られた。質量スペクトル分析用試料は 、特に指示がないかぎり、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトールの３．１ 混合物中に溶解して製造された（マジックブレット（ｍａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔ ））。common experiments Mass spectrum (high-speed atom bombardment by xenon) is generated by vacuum generator Z Obtained on an AB H3 mass spectrometer. Samples for mass spectrometry analysis , 3.1 of dithiothreitol and dithioerythritol unless otherwise specified. Manufactured by dissolving in a mixture (magic bullet )).

非放射性試料の分析の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、２５４ｎ ｍての検出、１ｍＬ／分の流速で、４．６ｘ１００ｍｍ　Ａ１１ｔｅｃｈＥｃｏ ｎｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ＋８３　ｕカラムで、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　 １０９０液体クロマトグラフ上で行った。試料は、試料に提供したときに０．０ ５Ｍ、ｐＨ６，０、酢酸すトリウム／アセトニトリルで、勾配溶出された。High performance liquid chromatography (HPLC) for the analysis of non-radioactive samples uses 254n m detection, 1 mL/min flow rate, 4.6 x 100 mm A11techEco nosphere C+83 u column, Hewlett Packard Performed on a 1090 liquid chromatograph. 0.0 when the sample is provided to the sample Gradient elution was with 5M, pH 6.0, sodium acetate/acetonitrile.

放射性試料（即ち、＋７７１ｕが取り込まれたもの）のＩ（ＰＬＣはＤｕＰｏｎ 　ｔＺｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０（９，４ｘ２５０　ｍｍ）カラムを使用して、 １．５ｍＬ／分の流速で、放射線検知して行われた。移動相は０．２５！ｔｌ　 、ｐ）１６．０　、クエン酸ナトリウム／１０％アセトニトリルてあった。I (PLC is DuPon Using a Zorbax GF-250 (9,4x250 mm) column, A flow rate of 1.5 mL/min was performed with radiation detection. Mobile phase is 0.25! tl , p) 16.0, sodium citrate/10% acetonitrile.

より既に酸洗浄されたの２３０〜４００メツシユ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌＣｏ、　）である１７．０ｇのＭｅｒｃｋ　６０Ａソリカゲルにより充填 された。粗ＰＡ−Ｈ４ＤＯＴＡ・３Ｈｃｌ（３，２ｇ　、　ＨＰＬＣ分析で７５ ％純度）をカラムに入れ、２：２：Ｉ　クロロホルム、メタノール：濃水酸化ア ンモニウムの移動相により溶出された。薄層クロマトグラフィーにより分析され てＰＡ−ＤＯＴＡ（ＮＨ，）　２のみを含む留分を回収し、そして、プールし、 ＨＰＬＣで測定して９８％より高い純度のＰＡ−ＤＯＴＡ（ＮＨ４）　ｔを提供 した。回収したＰＡ−ＤＯＴＡ（ＮＨ４）ｚ中にカルシウムがないことが質量ス ペクトル法及び１５分間で９５７５酢酸ナトリウム（０，０５Ｍ、　ｐＨ・６） ／アセトニトリル−３０／フ０の溶出勾配を使用したＨＰＬＣにより確認された 。230 to 400 meshes (Aldrich Chemi filled with 17.0 g of Merck 60A solica gel, calCo, ) It was done. Crude PA-H4DOTA・3Hcl (3.2g, 75% by HPLC analysis) % purity) into the column, 2:2:I chloroform, methanol:concentrated hydroxide solution. eluted with ammonium mobile phase. analyzed by thin layer chromatography Collect fractions containing only PA-DOTA(NH,)2 and pool them, Provides PA-DOTA(NH4)t with purity higher than 98% as measured by HPLC did. The absence of calcium in the recovered PA-DOTA(NH4) Spectral method and 15 minutes of 9575 sodium acetate (0.05M, pH 6) Confirmed by HPLC using an elution gradient of /acetonitrile-30/fu0 .

上記のように得たＰＡ−ＤＯＴＡへのイツトリウムのキレート化は、３ｍｇのＰ Ａ−ＤＯＴＡを釦Ｉの０．５酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）及び０、２ｍＬ の４０ミリモルのＹ（ＯＡＣ）　２　・４Ｈ２０に溶解することにより行われた 。これは約５倍のイツトリウム過剰であることを示す。キレート化度は上記のＨ ＰＬＣでモニターした。Chelation of yttrium to PA-DOTA obtained as above was performed using 3 mg P Add A-DOTA to 0.5 sodium acetate buffer (pH=6) and 0.2 mL of button I. This was done by dissolving 40 mmol of Y(OAC)2.4H20 in . This represents an approximately 5-fold excess of yttrium. The degree of chelation is H as above. Monitored with PLC.

酸洗浄したシリカゲルを使用して精製したＰＡ−ＤＯＴＡてのキレートは室温（ １８〜２５°Ｃ）において５分以内に完了した。PA-DOTA chelates purified using acid-washed silica gel were stored at room temperature ( 18-25°C) within 5 minutes.

比較例Ａ 酸洗浄しなかったシリカゲルを使用して精製したＰＡ−ＤＯＴＡてのキレート化 は室温において１５分間で４％完了し、９０°Ｃて１０分間で８６％完了した。Comparative example A Chelation of purified PA-DOTA using silica gel without acid washing was 4% complete in 15 minutes at room temperature and 86% complete in 10 minutes at 90°C.

これらの結果は、キレート化剤精製のための使用前に、過剰の金属イオンを除去 するためにシリカゲルを酸洗浄することは、所望の金属が室温で隔離される速度 を高く向上することを示す。These results indicate that excess metal ions were removed before use for chelating agent purification. Acid washing the silica gel in order to increase the rate at which the desired metal is isolated at room temperature It shows that the results are highly improved.

実施例２ ＩｏｏｍＬの０．０１λ１塩酸に、実施例１のように製造した、２５０ｍｇのカ ルシウムを含まないＰＡ−８２（ＮＨ，）２　ＤＯＴＡ（０，４４８ミリモル、 ２個のカルボキシル化した基がプロトンされ、２個のカルボキシル化した基がア ンモニウム塩である。）を加え、この溶液を４０−ｏｚＷａｒｉｎｇブレンダー に入れた。チオホスゲン（１７０マイクロリツトル、２．２３　ミリモル）を加 え、そして素早くブレンダーを開始した。混合の２分後、混合物を分液漏斗に加 え、過剰のチオホスゲンを５０ｍ１のクロロホルムで３回抽出した。水層にＩｏ ｏｍＬのアセトニトリルを加え、溶液を室温においてロータリーエバポレーター （真空ポンプを備えている）で乾燥するまで減圧した。得た固体を真空ライン中 で室温において２時間更に乾燥した。回収量は黄色がかった白色固体３２１ｍｇ （９０％収率）であった。Example 2 250 mg of the solution prepared as in Example 1 was added to IoomL of 0.01λ1 hydrochloric acid. Lucium-free PA-82 (NH,)2 DOTA (0,448 mmol, Two carboxylated groups are protonated and two carboxylated groups are It is an ammonium salt. ) and blend this solution in a 40-oz Waring blender. I put it in. Thiophosgene (170 microliters, 2.23 mmol) was added. Oh, and I quickly started the blender. After 2 minutes of mixing, add the mixture to the separatory funnel. Then, excess thiophosgene was extracted three times with 50 ml of chloroform. Io in the aqueous layer omL of acetonitrile was added and the solution was rotary evaporated at room temperature. (equipped with a vacuum pump) to dryness. The obtained solid is placed in a vacuum line. Further drying was performed for 2 hours at room temperature. The amount recovered was 321 mg of yellowish white solid. (90% yield).

質量スペクトル及びＨＰＬＣによる生成物の特徴は、生成物が９６重量％　（７ ）イソチオシアーｔ　−ＩＪ！ｊ４ＰＡ−ＤＯＴＡ　（ＳＣＮ−ＰＡ−Ｈ，ＤＯ ＴＡ−２８Ｃ１−２ｔＪ１．ＣＩ）であった。ＨＰＣＬ溶出勾配は酢酸ナトリウ ム／アセトニトリルは１５分間で９５１５〜７０／３０であり、その後、２０分 間で４０／６０であった。The mass spectrum and HPLC characteristics of the product indicate that the product is 96% by weight (7 ) Isothiothiat -IJ! j4PA-DOTA (SCN-PA-H, DO TA-28C1-2tJ1. CI). HPLC elution gradient is sodium acetate 9515 to 70/30 for 15 minutes, then 20 minutes It was 40/60 between.

比較例Ｂ 混合前に２０〜５０体積％のクロロホルムの添加により反応を行ったことを除い て同一の方法で製造した試料はＨＰＬＣにより測定して８４〜８９％純度であっ た。Comparative example B Except that the reaction was carried out by addition of 20-50% by volume of chloroform before mixing. Samples prepared in the same manner were 84-89% pure as determined by HPLC. Ta.

これらの結果は、高純度のイソチオシアナト活性化キレート化剤が有機溶剤の存 在しない水性の系においてチオホスゲンとキレート化剤を混合することにより得 られうろことを示す。These results demonstrate that highly purified isothiocyanate-activated chelating agents can be used in the presence of organic solvents. obtained by mixing thiophosgene and a chelating agent in an aqueous system free of Shows scales.

実施例３　［＋７７Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ月の製造実施例２　ｔニー　 記ｅ、（Ｄ　ヨウ＋：、、製造しり２０μＬ　（７）ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ（ ４，８８ｘｌＯ−１モル）に１００μしのＬｕ−１７７（５０フィクロキュリー ）を加えて約ｌ：１のモル比のキレート化剤：Ｌｕ−１７７を提供した。この溶 液をポルテックスミキサーで約５秒間混合し、１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ ０，５Ｍ、ｐ）１７）を加え、溶液を５分間混合した。ｐＨを測定し、必要に応 じてＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ６〜７に調整した。反応を室温において更に５分間 進行サセ、［”’Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ）］ｃ７）収量ハＨＰＬｃテ決 定しテ９１．４％であった。Example 3 [+77Lu (SCN-PA-DOTA month manufacturing example 2 t knee (D) 20 μL of manufacturing volume (7) SCN-PA-DOTA ( 100μ of Lu-177 (50 phycloccuries) ) was added to provide a molar ratio of about 1:1 chelating agent:Lu-177. This melt Mix the solution with a portex mixer for about 5 seconds and add 100 μL of HEPES buffer ( 0.5M, p) 17) was added and the solution was mixed for 5 minutes. Measure the pH and adjust as necessary. The pH was then adjusted to 6-7 with HEPES buffer. The reaction was continued for an additional 5 minutes at room temperature. Progress, [”’Lu(SCN-PA-DOTA)] c7) Yield HPLc Te determination It was 91.4%.

［Ｉ７’Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ月錯体は、試料をＰＰＰ−１ミニクリー ン（商ｍ）（８０μし）カラムに入れることにより精製された。カラムは８００ μＬのアセトニトリル、４００μＬの水及び、２０ｍＭ炭酸塩緩衝液中の１０％ アセトニトリル８００μＬ　、　ｐＨ９，５で予備処理されていた。船体をカラ ムに充填した後、反応バイアルを２００μＬ体積の炭酸塩緩衝液中の１０％アセ トニトリルでリンスし、その後、６００μしてリンスし、洗浄物もカラムに入れ た。炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ、　ｐＨ９，５）・アセトニトリル１．２の比を用 いてカラムから錯体を溶出させた。約８０％の放射性物質が二回目の５０μし溶 出液体積で回収された。[I7'Lu(SCN-PA-DOTA complex) It was purified by applying it to a column (80μ). column is 800 μL acetonitrile, 400 μL water and 10% in 20mM carbonate buffer It was pretreated with 800 μL of acetonitrile, pH 9.5. Color the hull After filling the reaction vial with 200 μL volume of 10% acetate in carbonate buffer, Rinse with tonitrile, then rinse with 600μ, and put the washings into the column. Ta. Use a carbonate buffer (20mM, pH 9.5)/acetonitrile ratio of 1.2. The complex was eluted from the column. Approximately 80% of the radioactive material is dissolved in the second 50μ Recovered in the effluent volume.

実施例４室温（２１〜２２°Ｃ）でのＩｇＧ　ＣＣ４９と［１７７Ｌｕ（ＳＣＮ −ＰＡ−ＤＯＴＡ）］の結合 ２５７μＬの抗体溶液（Ｉｇ　ＣＣ−４９，５０ｍＭの炭酸塩緩衝液ｐＨ９，５ 中の１４、５ｍｇ／ｍＬ）に上記のように製造した２５μＬの［１７７Ｌｕ（Ｓ ＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ）］を加え、ＢＦＧ　：抗体モル比約１．３６を提供した 。活性化したキレート及び抗体溶液をポルテックスミキサーで約ｌＯ秒間混合し 、室温で２時間、約１０〜１５分間毎に混合しながら放置した。）ＩＰＬｃで［ ”’Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ）　］の消失を観測した。１２０分後、約６ ２％の１７７Ｌｕ活性体は抗体に結合し、約７％は非抗体不純物に結合し、そし て未反応［１７７Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ）　］は約３０％であった。Example 4 IgG CC49 and [177Lu (SCN) at room temperature (21-22 °C) -PA-DOTA)] combination 257 μL of antibody solution (Ig CC-49, 50 mM carbonate buffer pH 9.5) 14.5 mg/mL) was added with 25 μL of [177Lu (S CN-PA-DOTA)] to provide a BFG:antibody molar ratio of approximately 1.36. . Mix the activated chelate and antibody solutions in a portex mixer for approximately 10 seconds. , at room temperature for 2 hours, stirring approximately every 10-15 minutes. ) in IPLc [ “’Lu(SCN-PA-DOTA)] was observed to disappear. After 120 minutes, about 6 2% of the 177Lu active binds to antibodies, approximately 7% binds to non-antibody impurities, and The amount of unreacted [177Lu (SCN-PA-DOTA)] was about 30%.

実施例５３７°ＣでのＩｇＧ　ＣＣ４９と［１７７Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴ Ａ））の結合抗体溶液（炭酸塩緩衝液、２０　ｍＭ、ｐＨ９，５中の１５．７ｍ ｇのＣＣ４９１ＣＣ４９ｌナノモル）に、実施例３からの溶出液１１μＬ中の２ １ナノモルの［１７７Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ−ＤＯＴＡ）］錯体（９，７ミリキユ リーの活性）を加えた。Example 5 IgG CC49 and [177Lu (SCN-PA-DOT) at 37°C A)) Conjugated antibody solution (15.7mM in carbonate buffer, 20mM, pH 9.5) g of CC491CC49l nanomoles) in 11 μL of the eluate from Example 3. 1 nanomole of [177Lu(SCN-PA-DOTA)] complex (9.7 milliquity) activity) was added.

この混合物をポルテックスミキサーで混合し、約１０〜１５分間毎に混合しなか ら３７°Ｃて１時間放置した。実施例４に記載のような錯体の消失を調へるため に反応の進行をＨＰＬＣ分析でモニターした。１時間後、ＨＰＬＣで測定して抗 体に結合した＋７７Ｌｕ活性体は約９１％であり、不純物と結合した１７７Ｌｕ 活性体は約７％未満であり、そして５％が未反応［１７７Ｌｕ（ＳＣＮ−ＰＡ− ＤＯＴＡ）］てあった。Mix this mixture in a portex mixer, stirring every 10-15 minutes or so. The mixture was left at 37°C for 1 hour. To control the disappearance of the complex as described in Example 4 The progress of the reaction was monitored by HPLC analysis. After 1 hour, the anti-antibiotics were measured by HPLC. The +77Lu active form bound to the body is approximately 91%, and the 177Lu active body bound to impurities is approximately 91%. The active form is less than about 7% and 5% is unreacted [177Lu(SCN-PA- DOTA)].

結合反応はＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５、ミディアム、９ｍ Ｌ）での結合体の単離及び精製により停止され、そして、それは燐酸塩緩衝サリ ンで平衡していた。The binding reaction was performed using a PD-10 column (Sephadex G-25, medium, 9 m L) is terminated by isolation and purification of the conjugate, and it is purified by phosphate buffered saline. It was in equilibrium at

ラベル化した抗体の均質性はＨＰＬＣ及び自動放射線透過写真に結合したＳＤＳ 　ＰＡＧＥ　電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動 ）により調へた。免疫反応性はＩＲＭＡ及び親和性カラム結合により決定し、そ して２５°Ｃで結合したものに匹敵することが分かった。結合体の生体内分散（ ラットにおける）は２５°Ｃで製造したものと実質的に異ならなかった。Homogeneity of labeled antibodies was determined by HPLC and SDS coupled to automated radiography. PAGE electrophoresis (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis ). Immunoreactivity was determined by IRMA and affinity column binding; It was found to be comparable to that bonded at 25°C. Biodispersion of the conjugate ( in rats) were not substantially different from those produced at 25°C.

結果は、キレートは結合体の免疫反応性又は生体分散に悪影響なしに３７°Ｃで 急速に抗体に結合されうることを示す。The results show that the chelate can be incubated at 37°C without adversely affecting the immunoreactivity or biodispersion of the conjugate. Shows that it can be rapidly bound to antibodies.

本発明の別の態様は本明細書から考えて、又は、ここに開示した本発明を実施し て当業者に明らかであろう。明細書及び実施例は例示の目的だけであり、本発明 の真の範囲及び内容は次の請求の範囲により示されることが意図される。Other aspects of the invention may be learned from consideration of this specification or practice of the invention disclosed herein. will be clear to those skilled in the art. The specification and examples are for illustrative purposes only and do not reflect the present invention. It is intended that the true scope and content of the following be indicated by the following claims.

Ｔ０ｎ　ＰＣＴ／ＬＩ５　９３１０３４８３フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｆ　９／６５２ ４　９１５５−４ＨＣＯ７Ｋ　１４１００　８３１８−４Ｈ／／　Ｃ１２Ｐ　２ １１０８　９１６１−４Ｂ（７２）発明者　クルパー、ウィリアム　ジエイ、、 ジュニア アメリカ合衆国、ミシガン　４８６５７．サンフォード、バーデン　ロード　２ ３０ Ｉ （７２）発明者　リドウィンスキ、ジョージ　アール。T0n PCT/LI5 93103483Continuation of front page (51) Int, C1,' Identification symbol Internal office reference number C07F 9/652 4 9155-4HCO7K 14100 8318-4H // C12P 2 1108 9161-4B (72) Inventor Kulper, William J.A. junior Michigan, USA 48657. Sanford, Baden Road 2 30 I (72) Inventor Lidwinski, George Earl.

アメリカ合衆国、ミシガン　４８６４２．ミツドランド、アートモア　１９１１Michigan, USA 48642. Midland, Artmore 1911

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] １．キレートー抗体結合体を製造する方法であって、前記方法はイソチオシアネ ート活性化したキレートと抗体とを３０〜４０℃で反応させることを含み、 ここで、前記キレートは金属イオンと錯体化されたキレート化剤であり；キレー ト化剤は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｑは独立に水素、（ＣＨＲ５）ｐＣＯ２Ｒ又は（ＣＨＲ５）ｐＰＯ２ Ｈ２であり： Ｑ１は水素又は（ＣＨＲ５）ｗＣＯ２Ｒであり：各Ｒは独立に水素、ベンジル又 はＣ１−Ｃ４アルキルであり：但し、全てのＱ及びＱ１のうちの少なくとも２個 は水素以外でなければならず： 各Ｒ５は独立に、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル又は−（Ｃ１−Ｃ２アルキル）フェ ニルであり； Ｘ及びＹは各々独立に水素であるか、又は、隣接のＸ及びＹはともに別の炭素− 炭素結合を形成してもよく；ｎは０又は１であり； ｍは０〜１０の整数であり； ｐは１又は２であり； ｒは０又は１であり； ｗは０又は１であり； 但し、Ｘ及び／又はＹが別の炭素−炭素結合を形成し、且つ、ｒ及びｗの合計が ０又は１であるときにはｎは１だけであり；Ｒ２及びＲ４は独立に水素又はアミ ノであり；Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルコキシ、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ヒドロキシ及び 水素からなる群より選ばれ、但し、Ｒ２及びＲ４は両方とも水素であることがで きないが、Ｒ２及びＲ４の片方は水素でなければならなない。）であり；そして 、 金属イオンは１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、 １４０Ｌａ、１４２Ｐｒ、１４９Ｐｍ、９０Ｙ及び１１１Ｉｎからなる群より選 ばれる、方法。1. A method of producing a chelate-antibody conjugate, the method comprising: Reacting an activated chelate with an antibody at 30 to 40°C, Here, the chelate is a chelating agent complexed with a metal ion; The oxidizing agent has the formula ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (where each Q is independently hydrogen, (CHR5)pCO2R or (CHR5)pPO2 H2 and: Q1 is hydrogen or (CHR5)wCO2R: each R is independently hydrogen, benzyl or is C1-C4 alkyl, provided that all Q and at least two of Q1 must be other than hydrogen: Each R5 is independently hydrogen, C1-C4 alkyl or -(C1-C2 alkyl)phenylene Nil; X and Y are each independently hydrogen, or adjacent X and Y are both different carbon- may form a carbon bond; n is 0 or 1; m is an integer from 0 to 10; p is 1 or 2; r is 0 or 1; w is 0 or 1; However, X and/or Y form another carbon-carbon bond, and the sum of r and w is When n is 0 or 1, n is only 1; R2 and R4 are independently hydrogen or amino. R3 is C1-C4 alkoxy, -OCH2CO2H, hydroxy and selected from the group consisting of hydrogen, with the proviso that R2 and R4 can both be hydrogen; However, one of R2 and R4 must be hydrogen. ); and , The metal ions are 153Sm, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 159Gd, Selected from the group consisting of 140La, 142Pr, 149Pm, 90Y and 111In. How to be found out. ２．金属イオンが１７７Ｌｕである請求の範囲１の方法。2. The method of claim 1, wherein the metal ion is 177Lu. ３．キレート化剤が１−［２−（４−アミノフェニル）エチル］−１，４，７， １０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸である請求の 範囲１又は２の方法。3. The chelating agent is 1-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7, The claimed compound is 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid. Methods in scope 1 or 2. ４．少なくとも工程、 （ａ）ポリアザキレート化剤を精製すること（ポリアザキレート化剤は式（Ｉ） に規定した通りである）、 （ｂ）イソチオシアナト活性化したポリアザキレート化剤が形成するように精製 されたポリアザキレート化剤とチオホスゲンとを接触させ、そして、イソチオシ アナト活性化したポリアザキレート化剤を回収すること、 （ｃ）イソチアナト活性化したポリアザキレートが形成するようにイシチオシア ナト活性化したポリアザキレート化剤に金属イオンを加えること、及び、 （ｄ）結合体が形成するようにイソチオシアナト活性化したポリアザキレートと 生体分子とを接触させること、を含むポリアザ結合体を製造する方法において、 工程（ａ）において、ポリアザキレート化剤をシリカゲルカラム上でクロマトグ ラフィーにより精製すること（ここで、カラム上にポリアザキレート化剤を装填 する前にシリカゲルは酸洗浄されている。 ）、 工程（ｂ）において、ｐＨ１〜５において、有機溶剤の非存在下で水性環境中で 、チオホスゲンと精製されたポリアザキレート化剤とを接触させること、及び 工程（ｄ）において、２５℃〜４０℃において、生体分子と、イソチオシアナト 活性化したポリアザキレート化剤とを接触させること、を含む、改善した方法。4. At least the process (a) Purifying the polyazchelating agent (the polyazchelating agent has the formula (I) (as stipulated in ), (b) Purification to form an isothiocyanato-activated polyazchelating agent. The polyazacylated agent and thiophosgene are brought into contact with each other, and recovering the anato-activated polyazchelating agent; (c) Isithiocya so that an isothyanato-activated polyazchelate is formed. adding metal ions to the nato-activated polyazchelating agent; and (d) an isothiocyanate-activated polyazchelate such that a conjugate is formed; A method of producing a polyaza conjugate comprising contacting with a biomolecule, In step (a), the polyazchelating agent is chromatographed on a silica gel column. Purification by roughy (where a polyazchelating agent is loaded onto the column) Before washing, the silica gel is acid washed. ), In step (b), in an aqueous environment at pH 1 to 5 in the absence of organic solvents. , contacting thiophosgene with a purified polyazchelating agent, and In step (d), at 25°C to 40°C, the biomolecule and isothiocyanate An improved method comprising: contacting an activated polyazchelating agent. ５．生体分子がタンパク質であり、且つ、金属イオンが１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ 、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１５８Ｇｄ、１４０Ｌａ、１４２Ｐｒ、１４９Ｐｍ 、９０Ｙ又は１１１Ｉｎである請求の範囲４の方法。5. The biomolecule is a protein, and the metal ions are 153Sm and 166Ho. , 175Yb, 177Lu, 158Gd, 140La, 142Pr, 149Pm , 90Y or 111In. ６．タンパク質が抗体である請求の範囲５の方法。6. 6. The method of claim 5, wherein the protein is an antibody. ７．式Ｉのｒが０であり、且つ、各Ｑが（ＣＨＲ５）ｐＣＯ２Ｒである請求の範 囲４、５又は６の方法。7. Claims in which r in formula I is 0 and each Q is (CHR5)pCO2R Method of Box 4, 5 or 6. ８．キレート化剤がα−［２−（４−アミノフェニル）エチル］−１，４，７， １０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸であり、且つ 、金属イオンが１７７Ｌｕである請求の範囲７の方法。8. The chelating agent is α-[2-(4-aminophenyl)ethyl]-1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, and 8. The method of claim 7, wherein the metal ion is 177Lu. ９．少なくとも工程、 （ａ）ポリアザキレート化剤を精製すること（前記ポリアザキレート化剤は式（ Ｉ）に規定した通りである。）、（ｂ）ポリアザキレートが形成するようにポリ アザキレート化剤に金属イオンを加えること、 （ｃ）イソチオシアナト活性化したキレートが形成するようにキレートとチオホ スゲンとを接触させること、（ｄ）結合体が形成するようにイソチオシアナト活 性化したキレートと生体分子とを接触させること、 を含むポリアザ結合体を製造する方法において、工程（ａ）において、シリカゲ ルカラム上でクロマトグラフィーによりポリアザキレート化剤を精製すること（ ここで、シリカゲルはカラム上にポリアザキレート化剤を装填する前に酸洗浄さ れている。 ）、 工程（ｃ）において、ｐＨ１〜５において、有機溶剤の非存在下で水性環境中で チオホスゲンとキレートとを接触させること、及び工程（ｄ）において、２５℃ 〜４０℃において、生体分子とイソチオシアナト活性化したポリアザキレートと を接触させること、を含む、改善した方法。9. At least the process (a) Purifying the polyazchelating agent (the polyazchelating agent has the formula ( As specified in I). ), (b) polyazacylate is formed. adding metal ions to the azachelating agent; (c) the chelate and thiophosate such that an isothiocyanate-activated chelate is formed; (d) isothiocyanate activity such that a conjugate is formed; contacting the sexualized chelate with a biomolecule; In the method for producing a polyaza conjugate containing silica gel, in step (a) Purifying the polyazchelating agent by chromatography on a column ( Here, the silica gel is acid washed before loading the polyazchelator onto the column. It is. ), In step (c), in an aqueous environment at pH 1 to 5 in the absence of organic solvents. contacting the thiophosgene and the chelate, and in step (d), at 25°C. At ~40°C, biomolecules and isothiocyanate-activated polyazchelate An improved method, including contacting. １０．トリ〜ヘキサ（カルボキシル化）、−（ホスホノメチル化）、又は、−（ ホスフィノメチル化）ポリアザマクロ環状キレート化剤を精製する方法であって 、前記方法は金属イオンを実質的に含まないポリアザマクロ環状キレート化剤を 提供するように、酸洗浄したシリカゲル上でポリアザマクロ環状キレート化剤を フラッシュクロマトグラフィーにかけることを含み、ここで、ポリアザマクロ環 状キレート化剤が環中に３〜６個の窒素原子を有し、且つ、環中の総原子数が９ 〜２４原子である方法。10. Tri-hexa(carboxylation), -(phosphonomethylation), or -( phosphinomethylated) polyazamacrocyclic chelating agent, , the method uses a polyazamacrocyclic chelating agent substantially free of metal ions. Polyazamacrocyclic chelating agent on acid-washed silica gel as provided. flash chromatography, where the polyazamacrocycle is The chelating agent has 3 to 6 nitrogen atoms in the ring, and the total number of atoms in the ring is 9. ~24 atoms.